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WO1996012803A1 - Methode de traitement ex vivo de cellules tumorales de patients atteints de lmc - Google Patents

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WO1996012803A1
WO1996012803A1 PCT/FR1995/001398 FR9501398W WO9612803A1 WO 1996012803 A1 WO1996012803 A1 WO 1996012803A1 FR 9501398 W FR9501398 W FR 9501398W WO 9612803 A1 WO9612803 A1 WO 9612803A1
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Marta Blumenfeld
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    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
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Definitions

  • the present invention relates to the therapeutic use of antisense oligonucleotides specific for the bcr-abl junction, in the treatment of leukemias characterized by the presence of the Philadelphia chromosome.
  • the invention relates to the ex vivo treatment of cells of patients suffering from chronic myeloid leukemia (CML) by treatment with antisense oligonucleotides specific for the bcr-abl junction.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • Chronic myeloid leukemia is a malignant hematological disease of the hematopoietic stem cell, characterized by an initial chronic phase which invariably progresses to a blast crisis.
  • the proportion of myeloid cells both mature and immature, increases as a result of the clonal expansion of myeloid progenitors.
  • the presence of fully differentiated cells indicates that hematopoiesis associated with the chronic phase still retains certain differentiating properties.
  • the acute transformation phase the leukemia cells blocked at the blastic stage are no longer capable of arriving at terminal differentiation.
  • CML is associated with a specific genetic abnormality called the Philadelphia chromosome. It has also been shown that a contingent of normal hematopoietic cells (not containing the Philadelphia chromosome) can persist, which is easier to detect at the initial stage of the disease (Coulomel et al., N. Eng. J. Med., 1983, 308: 1493; Barnett et al., Bone Marrow Transplant., 1989, 4: 345; Verfaillie et al., Blood, 1992, 79: 1003).
  • the Philadelphia chromosome is characterized at the molecular level by the translocation of the proto-oncogene c-abl of chromosome 9, on the bcr gene of chromosome 22.
  • This translocation causes the formation of a hybrid bcr-abl gene which can be expressed.
  • the proto-oncogene c-abl covers at least 230kb on the 9q34 band. It contains 11 exons, the first having two different forms, la and lb. Two c-abl messages are therefore transcribed, differing by their 5 'ends. If the exon 1a is used, PARNm has a length of 6kb and includes the exons 1b then 2 to 11.
  • the bcr gene is located on the 22ql l band.
  • the cleavage occurs on a small 5.8kb segment of this gene, which comprises, in total, approximately 130kb (Heisterkamp et al., Nature, 1985, 315: 9758).
  • the fusion of the two genes bcr and c-abl leads to the formation of an mRNA of 8.5 kb, composed of a 5 'end coming from the bcr gene and a 3' end coming from the c-abl gene.
  • the resulting protein of molecular weight 210kDa, has an increased tyrosine kinase activity, compared to normal tyrosine kinase activity, of molecular weight 145kDa, encoded by the c-abl gene (Konopka et al., Cell, 1984, 37: 1035; Kloetzer et al., Virology, 1985, 140: 230; Konopka et al., Proc Natl Acad Sci, 1985, 82: 1810).
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • CML invariably progresses from the chronic phase to the blast crisis.
  • the first period is characterized by an increase in mature and immature myeloid cells in the bone marrow and blood (Koeffler et al., N Engl J Med, 1981, 304: 201). This increase is not due to the proliferation or faster maturation of tumor cells, but rather, to the proliferation of myeloid stem cells, in the bone marrow and in the blood.
  • the crisis is characterized by a stop of differentiation of the leukemic cells, which acquire during this phase, a "blastic" phenotype.
  • the onset of the blast crisis marks the limit of therapeutic possibilities and survival is generally less than four months.
  • the first treatments for chronic phase CML used alkylating agents, such as busulfan, or inhibitors of DNA synthesis, such as hydroxyurea. Although these substances effectively control the excessive granulopoiesis found in CML cases, they are hardly specific, inhibiting DNA synthesis in both normal and leukemic cells.
  • interferon alpha has been widely used with undeniable efficacy, at least to delay the onset of the acute phase.
  • Allogeneic bone marrow transplantation allows 40% of patients treated during the chronic phase to survive beyond five years in complete remission (Bergshell, J Cancer Res. Clin. Oncol., 1990, 116: 104), and probably to be healed. Transplantation takes place after intensive treatment, as a rule combining heavy chemotherapy and total body irradiation which aim to eliminate the leukemia cells. However, they can only be applied to patients with an identical member of their HLA siblings, which represents only a small proportion of patients. Transplantation of autologous hematopoietic cells is increasingly used in particular in patients who do not have an identical HLA donor.
  • the bone marrow cells are removed, possibly "purged" of the leukemia cells using chemical agents, then reintroduced into the patient, who has undergone heavy chemotherapy, with or without total irradiation. Even with this method, acute transformation inevitably occurs.
  • Hematopoietic "stem” cells are undifferentiated, multipotent cells, which, depending on the regulatory factor with which they will be in contact, will differentiate into red, white or platelet cells.
  • Hematopoietic cells are a subpopulation 'mononuclear cells, itself heterogeneous in its composition. Hematopoietic cells are more or less involved in the differentiation process, and can be distinguished from each other by their functional capacity in vitro, and by the expression of antigens on their surface. Some of these antigens are expressed by multiple cell populations; others are specific to a given hematopoietic line.
  • the CD34 antigen is a protein of around 115kDa, whose gene is located on chromosome l (lq) and which is expressed by hematopoietic, myeloid and lymphoid progenitors. Its role is not yet clearly elucidated, but its presence has been detected in 1 to 4% of mononuclear cells of normal bone marrow, and on leukemia cells, 30 to 60% of acute leukemias and all CMLs.
  • Antisense oligonucleotides are short synthetic DNA, RNA or mixed molecules, of sequence complementary to a target sequence belonging to a gene, to a pre-messenger RNA or to a messenger RNA. They hybridize to the sequence of which they are complementary and can thus block the expression of the gene, of the pre-messenger RNA or of the messenger RNA carrying this sequence.
  • oligonucleotide is used in general to denote a polynucleotide of 2 to 100, and more generally of 5 to 50, nucleotides in ribodeoxyribo- or mixed series.
  • Antisense oligonucleotides are synthesized chemically and may include modifications altering the very backbone of the molecule or additional reactive groups, located at their ends. The purpose of these modifications is either to increase their resistance to nucleolytic degradation, or to promote their interactions with their targets, or to allow specific degradation or modification reactions of the targets, RNA or DNA, or to increase their penetration to inside the cells.
  • Hybridization between an antisense oligonucleotide and a target mRNA can block expression in a steric manner, that is to say by creating a physical barrier preventing the fixation and progression of protein complexes necessary for translation, for maturation, to stabilize or transport mRNA, or pseudo-catalytically, by creating a substrate for RNase H, an enzyme present in all eukaryotic cells and which specifically degrades RNA when it is hybridized to l DNA (Markus-Sekura et al., Nucleic Acids Res, 1987, 15: 5749; Gagnor et al., Nucleic Acids Res, 1987, 15: 10419; Jessus et al., Gene, 1989, 72: 311). Furthermore, the antisense oligonucleotides may contain reactive groups capable of directly producing irreversible damage in the target RNA molecule.
  • Antisense oligonucleotides are therefore potential, powerful and specific pharmacological agents, making it possible to inhibit the expression of messengers coding for products exerting pathogenic effects.
  • a method for treating leukemias characterized by the presence of the Philadelphia chromosome has been proposed.
  • the subject of the present invention is a method of ex vivo treatment of tumor cells of patients suffering from CML, characterized in that: a) cells expressing a CD34 antigen are selected from the total mononuclear cells of patients with CML in chronic phase, and b) the selected CD34 + cells are treated with an antisense oligonucleotide complementary to the bcr-abl junction, so that the bcr-abl gene expression is suppressed.
  • the patient's cells are blood or bone marrow cells.
  • the aim is to be able to purge the hematopoietic cells of CML subjects by the oligonucleotides in order to be able to perform an autograft. This is done either from the marrow or from blood cells recovered by cytapheresis.
  • the method according to the invention makes it possible, in fact, to eliminate tumor cells from the treated cells which can then be reinjected into the patient from which they originate in an autologous manner. Previously, it is checked that the expression of the bcr-abl gene has been repressed and that no leukemia cell progenitor remains.
  • the present invention allows the elimination of tumor cells from the total mononuclear cells removed from patients with CML in chronic phase, by ex vivo administration of the antisense oligonucleotides specific for the bcr-abl junction, to the cells expressing the CD34 antigen and preselected. from the patient's total mononuclear cells.
  • antisense oligonucleotide complementary to the bcr-abl junction is intended to mean a DNA or RNA oligonucleotide complementary to the mRNA of said junction.
  • CD34 + CML cells normal CD34 cells are also purified.
  • hematopoietic stem cells which are the only ones able to reconstitute hematopoiesis in humans.
  • Current grafting techniques show the efficiency of the graft (speed of setting) from purified CD34 cells.
  • non-CD34 + tumor cells have a weak self-renewal power, they are eliminated naturally like any differentiated cell.
  • the proportion of tumor cells is greater among CD34 + cells than among total cells, so it is possible by treating only CD34 + cells to kill all the tumor cells by treatment with an antisense oligonucleotide without using toxic doses of oligonucleotides that can kill healthy cells.
  • a diagnosis establishing the presence of the Philadelphia chromosome in the patient must be made. This can be done using one or more oligonucleotide probes, specific for the bcr-abl hybrid gene, or by specific amplification of this gene using reverse PCR (RT-PCR, Kawasaki et al., Proc NatI Acad Sci, 1988 , 85: 5698).
  • RT-PCR reverse PCR
  • RNA containing the bcr-abl hybrid gene is extracted, for analysis by reverse transcription, amplification and sequencing.
  • the b2a2 junction is amplified by primers specific for exon 2 of the bcr gene and exon 2 of the c-abl gene.
  • the junction b3a2 is amplified by primers specific for exon 3 of the bcr gene and exon
  • the length of 1 oligonucleotide is preferably between
  • the antisense oligonucleotide When the antisense oligonucleotide is directed against the bcr-abl junction of the b2a2 or L6 type, it advantageously comprises the 18-mer sequence:
  • X T or U depending on whether it is a DNA or RNA sequence.
  • This sequence is complementary to the translocation of the Philadelphia chromosome associated with CML patients, which juxtaposes exon 2 of the bcr gene and exon 2 of the c-abl gene.
  • it may preferably include the 20-mer sequence:
  • This sequence is complementary to the translocation of the Philadelphia chromosome associated with CML patients, which juxtaposes exon 3 of the bcr gene and exon 2 of the c-abl gene. More particularly, it may preferably include the 20-mer sequence:
  • the antisense oligonucleotides can be synthesized by chemical methods known for this purpose.
  • the compounds mentioned above directed against the translocations b2a2 or b3a2 of the Philadelphia chromosome associated with patients suffering from CML, can be framed in 3 'and / or 5' by 1 to 15 additional nucleotides.
  • the oligonucleotide sequence is a DNA sequence because the DNA / RNA duplexes are substrates of RNase H.
  • the internucleotide links of the oligonucleotides can be of the natural type, that is to say, of the phosphodiester type or of the modified type. Mention is made in particular of oligonucleotides of the type known as phosphorothioate or methylphosphonate. However, it is preferred according to the invention when the oligonucleotide sequences are of the natural type with an internucleotide link of the phosphodiester type or of the phosphorothioate type, since they have the most reduced toxicity.
  • the compounds according to the invention can be combined with any compound promoting their cell penetration.
  • the oligonucleotides forming the subject of the present invention are composed of a nucleotide base sequence comprising in particular adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T) and uracil (U), linked together by internucleotide bonds, in particular natural, that is to say phosphodiesters.
  • A adenine
  • G guanine
  • C cytosine
  • T thymine
  • U uracil
  • oligonucleotides according to the invention can also contain rare nucleotides (Inosine, I, or ri for example) or modified nucleotides, either in deoxyribo- series or in ribo- series.
  • rare nucleotides Inosine, I, or ri for example
  • modified nucleotides either in deoxyribo- series or in ribo- series.
  • the oligonucleotides according to the invention can also comprise, at the 5 ′ end or at both 3 ′ and 5 ′ ends at the same time, additional nucleotide sequences, the nature and length of which will allow the appearance of staple or semi-structured structures. clip in the final sequence of the oligonucleotide molecule.
  • nucleotide sequences may be of two types: either they will themselves present a secondary semi-staple structure which will be transmitted to the oligonucleotide sequences of which they will be the new ends; either they will not immediately present this type of secondary structure but the nucleotide bases constituting one or the other of their ends will be able to go to pair with nucleotides located within the sequences to which they will be added, conferring thus to the final sequence a staple or semi-staple structure.
  • closed oligonucleotides characterized in that they consist of one or more sequence (s) of single-stranded oligonucleotides the ends of which are linked together by covalent, nucleotide or non-nucleotide links, to at least partially form a closed single-stranded structure.
  • oligonucleotides according to the invention may also contain reactive nucleotides, capable of establishing links with the sequence of the target molecule complementary to the oligonucleotide, or, in another application, intra-molecular links within the same. oligonucleotide.
  • the oligonucleotides according to the invention can carry reactive groups grafted onto the nucleotides, such as for example psoralen groups, or other bridging agents or intercalating agents which can react with the sequence of the target molecule complementary to the oligonucleotide.
  • reactive groups grafted onto some of the nucleotides of the oligonucleotide may induce the formation of an intramolecular bridging within the molecule itself.
  • the oligonucleotide may have internal bonds produced by reactive agents belonging to or not belonging to the structure of the molecule itself. Also part of the invention of so-called chimeric oligonucleotides, constituted by the covalent assembly of nucleotide and non-nucleotide fragments.
  • antisense oligonucleotides coupled to molecules making it possible to increase their intracellular penetration by stabilizing the oligonucleotide structure, and in particular lipophilic groups, polypeptides or proteins.
  • Adequate dosage formulations can be established to optimize delivery of these molecules to target CD34 + cells.
  • the an ⁇ isense oligonucleotides may be encapsulated in liposomes, nonaparticles, LDL particles, or in any other type of microsphere allowing adequate conservation, and promoting targeting.
  • Oligonucleotide molecules can also be combined with cationic surfactants.
  • FIG. 1 represents a fragment of 60 nucleotides of the sequence of messenger RNA centered on the bcr-abl junction associated with patients with CML which present a junction of the L6 or b2a2 type, juxtaposing the exon 2 of the bcr gene and exon 2 of the abl gene.
  • the arrow indicates the position of the bcr-abl junction: the sequence derived from the bcr gene is located upstream of the junction, while the sequence derived from the abl gene is located downstream of the junction.
  • the underlined sequence corresponds to the target of the anti-b2a2 antisense oligonucleotides (FIG. 3).
  • Figure 2 represents a fragment of 60 nucleotides of the sequence of the messenger RNA centered on the bcr-abl junction associated with patients with CML which present a junction of type K-28 or b3a2, juxtaposing the exon 3 of the gene bcr and exon 2 of the abl gene.
  • the arrow indicates the position of the bcr-abl junction: the sequence derived from the bcr gene is located upstream of the junction, while the sequence derived from the abl gene is located downstream of the junction.
  • the underlined sequence corresponds to the target of the anti-b3a2 antisense oligonucleotides (FIG. 3).
  • Figure 3 represents oligonucleotides used in the tests of inhibition of the clonal proliferation of the myeloid progenitors.
  • the antisense oligonucleotide GT-1 is complementary to the bcr-abl junction of the b2a2 type ( Figure 1).
  • the antisense oligonucleotide GT-2 is complementary to the bcr-abl junction of the b3a2 type ( Figure 2).
  • the control oligonucleotide GT-3 corresponds to the sequence complementary to GT-1; the control oligonucleotide GT-4 corresponds to the sequence complementary to GT-2.
  • Figure 4 shows the effect of antisense and sense oligonucleotides (Figure 3) on the growth of granulo-macrophagic progenitors after 14 days of continuous incubation of CD34 + cells from normal bone marrow or from patients with CML type b2a2 or b3a2 in chronic phase.
  • concentration of oligonucleotides in the semi-solid incubation medium was 20 ⁇ M.
  • the results correspond to the average of triplicates of two normal marrow, each treated with the oligonucleotides corresponding to the b2a2 junction (GT-1 antisense and GT-3 control), and to the b3a2 junction (GT-2 antisense and GT-4 control ).
  • the embodiments of the invention which follow relate to the inhibition of the clonal expansion of myeloid progenitors in cases of CML in chronic phase by treatment with antisense oligonucleotides specific for the bcr-abl junction, applied exclusively to cells expressing CD34 antigen, pre-selected from total mononuclear cells in the bone marrow.
  • CML in the chronic phase is distinguished by an increase in the production of mature, morphologically normal myeloid cells, due to an unregulated self-renewal of the pluripotent stem cell compartment.
  • the result is an expansion of the multipotent (CFU-GEMM) and differentiated (CFU-GM) progenitor compartment in the marrow, spleen, and blood.
  • CFU-GEMM multipotent
  • CFU-GM differentiated progenitor compartment in the marrow, spleen, and blood.
  • the culture of hematopoietic progenitors of the CFU-GM type can be considered as a means of studying the proliferation and differentiation of CML progenitor cells.
  • the mononuclear cells of the patients' blood were removed, after consent, and purified by centrifugation on a Ficoll gradient. In the case of CML patients, the sample was taken during the chronic phase of the disease. Among the mononuclear cells thus obtained, those expressing the CD34 antigen were selected by immuno-absorption on a Ceprate column (CellPro, France SARL). The spinal or blood mononuclear cells are obtained after centrifugation of the marrow or blood sample on a density gradient, then incubated with a biotinylated anti-CD34 monoclonal antibody. The cells are then placed on an avidin column. CD34 + cells recognized by biotinylated antibodies are retained on the avidin beads.
  • CD34 + cells After washing the column, the absorbed CD34 + cells are detached from the column by adding avidin and harvested. On a sample, the purity in CD34 + cells is verified by analysis by flow cytometry (Profile II, Coultronics) after labeling the cells with a CD34 friendly antibody (My-10, Becton-Dikinson). Total mononuclear cells (2 x 105 cells / ml) or CD34 +
  • oligonucleotides, antisense or controls are added by continuous incubation at time 0 of the culture. Oligonucleotides are included in the semi-solid medium (methylcellulose) at a concentration of 20 microM The count of the number of granulocyte-macrophage colonies is done on an inverted microscope after 14 days of culture in an incubator at 37 C with 5 96 of CO 2 .
  • Example 1 Effect of antisense oligonucleotides on mononuclear cells of normal marrow.
  • the effect of the antisense oligonucleotides directed against the two types of bcr-abl junction was tested on non-leukemic mononuclear cells in continuous incubation, and compared with their respective "sense" controls, as well as with a control without oligonucleotides.
  • the oligonucleotides used are described in FIG. 3.
  • the antisense oligonucleotides used were those complementary to the sequence b2a2 and to the sequence b3a2.
  • Claim 2 Effect of antisense oligonucleotides on mononuclear cells of patients with CML Added in continuous incubation to total mononuclear cells of the blood of subjects suffering from CML b2a2 or b3a2, the sense or antisense oligonucleotides (FIG. 3) did not modify the growth of the granuloproprophagic progenitors (results not shown). Added in continuous incubation to CD34 + mononuclear cells taken from CML subjects, the antisense oligonucleotides directed against the b2a2 junction specifically inhibited the growth of granulo-macrophagic progenitors by 38% ( Figure 4). In the case of the patient with a CML type b3a2, the corresponding antisense oligonucleotides specifically inhibited the growth of granulopropropic progenitors by 70%.
  • the phosphorodiester antisense oligonucleotides containing the sequences complementary to the sequences b2a2 or b3a2 of the translocations characteristic of the Philadelphia chromosome are capable of inhibiting the growth of myeloid progenitors from the CD34 + mononuclear cells of subjects having CML.
  • the present invention therefore relates to the ex vivo treatment of CD34 + mononuclear cells from patients with CML in the chronic phase, with antisense oligonucleotides specific for the bcr-abl junction present in these patients (b2a2 or b3a2).
  • the subsequent operations consist in reinjecting the cells thus treated, from which the leukemic cells have been eliminated, by means of the method according to the invention. This reinjection is possibly done after the patient has undergone heavy chemotherapy with or without total body irradiation.
  • TYPE oligonucleotide
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Abstract

La présente invention a pour objet une méthode de traitement ex vivo de cellules tumorales de patients atteints de LMC, caractérisée en ce que: a) on sélectionne des cellules exprimant un antigène CD34 parmi les cellules mononuclées totales de patients atteints de LMC en phase chronique, et b) on traite les cellules CD34+ sélectionnées, avec un oligonucléotide antisens spécifique de la jonction bcr-abl, de sorte que l'expression du gène bcr-abl soit réprimée.

Description

METHODE DE TRAITEMENT EX VIVO DE CELLULES TUMORALES DE PATIENTS ATTEINTS DE LMC
La présente invention concerne l'utilisation thérapeutique d'oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl, dans les traitements de leucémies caractérisées par la présence du chromosome Philadelphie.
Plus particulièrement, l'invention concerne le traitement ex vivo de cellules de patients atteints de leucémie myéloïde chronique (LMC) par le traitement avec des oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl.
La leucémie myéloïde chronique est une maladie hématologique maligne de la cellule souche hématopoïétique, caractérisée par une phase initiale chronique qui progresse invariablement vers une crise blastique. Pendant la phase chronique, la proportion des cellules myéloïdes, aussi bien matures qu'immatures, augmente comme résultat de l'expansion clonale de progéniteurs myéloïdes. La présence de cellules totalement différenciées indique que l'hématopoïèse associée à la phase chronique conserve encore certaines propriétés de différenciation. Par contre, à la phase de transformation aigϋe, les cellules leucémiques bloquées au stade blastique ne sont plus capables d'arriver à la différenciation terminale.
La LMC est associée à une anomalie génétique spécifique, appelée chromosome Philadelphie. Il a par ailleurs été montré qu'il peut persister un contingent de cellules hématopoïétiques normales (ne contenant pas de chromosome Philadelphie), plus facile à mettre en évidence au stade initial de la maladie (Coulomel et al., N. Eng. J. Med., 1983, 308: 1493; Barnett et al., Bone Marrow Transplant., 1989, 4: 345; Verfaillie et al., Blood, 1992, 79: 1003). Le chromosome Philadelphie se caractérise au niveau moléculaire par la translocation du proto-oncogène c-abl du chromosome 9, sur le gène bcr du chromosome 22. Cette translocation provoque la formation d'un gène hybride bcr-abl qui peut être exprimé. Le proto-oncogène c-abl couvre au moins 230kb sur la bande 9q34. Il contient 11 exons, le premier présentant deux formes différentes, la et lb. Deux messages c-abl sont donc transcrits, différant par leur extrémité 5'. Si l'exon la est utilisé, PARNm a une longueur de 6kb et comprend les exons lb puis 2 à 11. Les deux protéines synthétisées diffèrent de par leur extrémité N terminale (Shtivelman et al., Oeil, 1986, 47: 277; Bernards et al., Mol Cell Biol, 1987, 7: 3231; Fainstein et al, Oncogène, 1989, 4: 1481).
Le gène bcr est situé sur la bande 22ql l. La coupure se produit sur un petit segment de 5,8kb de ce gène, qui comporte, au total, environ 130kb (Heisterkamp et al., Nature, 1985, 315:9758).
La fusion des deux gènes bcr et c-abl, conduit à la formation d'un ARNm de 8,5kb, composé d'une extrémité 5' provenant du gène bcr et d'une extrémité 3' provenant du gène c-abl. La protéine résultante, de poids moléculaire 210kDa, a une activité tyrosine kinase accrue, par rapport à l'activité tyrosine kinase normale, de poids moléculaire 145kDa, codée par le gène c-abl (Konopka et al., Cell, 1984, 37: 1035; Kloetzer et al., Virology, 1985, 140: 230; Konopka et al., Proc Natl Acad Sci, 1985, 82: 1810).
Deux translocations différentes peuvent avoir lieu, provoquant les deux principaux types de jonction bcr-abl connus. La première juxtapose l'exon 2 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl ; elle a reçu les noms de "L- 6" ou "b2a2". La deuxième juxtapose l'exon 3 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl ; elle a été appelée "K-28" ou ub3a2". L'exon 3 du gène bcr code pour 25 acides aminés qui sont présents ou absents de la protéine résultante, selon le type de jonction. L'une de ces jonctions, ou les deux, sont détectées chez les patients atteints de LMC et présentant le chromosome Philadelphie (Shtivelman et al., Blook, 1986, 69: 971). Environ la moitié des patients présentent la jonction b2a2, tandis que l'autre moitié présente la jonction b3a2.
Chez les patients atteints de leucémie lymphoïde aigϋe (ALL), une troisième translocation a été mise en évidence. Elle juxtapose l'exon 1 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl, et a donc reçu le nom de "bla2" (Fanstein et al., Nature, 1987, 330: 386). Environ 50 % des patients atteints de ALL présentent la jonction bla2 ; 25 % la jonction b2a2 et 25 % la jonction b3a2. Ces trois différentes jonctions peuvent être identifiées grâce à la technique de polymérisation en chaîne (PCR) suivie d'hybridation avec des sondes spécifiques de chaque jonction (Kawasaki et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 5698).
Du point de vue clinique, la LMC progresse invariablement de la phase chronique vers la crise blastique. La première période se caractérise par l'augmentation des cellules myéloïdes matures et immatures, dans la moelle osseuse et le sang (Koeffler et al., N Engl J Med, 1981, 304: 201). Cette augmentation ne serait pas due à la prolifération ni à la maturation plus rapide des cellules tumorales, mais plutôt, à la prolifération des cellules souches myéloïdes, dans la moelle osseuse et dans le sang. La crise, ensuite, se caractérise par un arrêt de différenciation des cellules leucémiques, qui acquièrent pendant cette phase, un phénotype "blastique". Le début de la crise blastique marque la limite des possibilités thérapeutiques et la survie est, généralement, inférieure à quatre mois. Les premiers traitements de la LMC en phase chronique utilisaient des agents alkylants, comme le busulfan, ou des inhibiteurs de synthèse de l'ADN, comme l'hydroxyurée. Bien que ces substances contrôlent efficacement la granulopoïèse excessive constatée dans les cas de LMC, elles ne sont guère spécifiques, inhibant la synthèse d'ADN aussi bien dans les cellules normales que dans les cellules leucémiques.
Des efforts visant à éliminer le clone leucémique par irradiation de la rate ou par splénectomie associés à une chimiothérapie intensive, ont eu pour résultat l'élimination temporaire des cellules présentant le chromosome Philadelphie chez un tiers des patients, mais n'ont pas réussi à enrayer le cours de la maladie.
Depuis 1985, l'interféron alpha est couramment utilisé avec une efficacité indéniable, au moins pour retarder la survenue de la phase aigϋe.
La transplantation de moelle osseuse allogénique permet à 40 % des patients traités durant la phase chronique, de survivre au-delà de cinq ans en rémission complète (Bergshell, J Cancer Res. Clin. Oncol., 1990, 116: 104), et probablement d'être guéris. La transplantation s'effectue après un traitement intensif, associant en règle générale une chimiothérapie lourde et une irradiation corporelle totale qui visent à éliminer les cellules leucémiques. Elles ne peut cependant être appliquée qu'aux malades ayant un membre de sa fratrie HLA identique, ce qui ne représente qu'une faible proportion de malades. La transplantation de cellules hématopoïétiques autologues est de plus en plus utilisée en particulier chez les patients n'ayant pas de donneur HLA identique. A cet effet, les cellules de la moelle osseuse sont prélevées, éventuellement "purgées" des cellules leucémiques grâce à des agents chimiques, puis, réintroduites chez le patient, qui a subi une chimiothérapie lourde, avec ou sans une irradiation totale. Même avec cette méthode, la transformation aiguë survient inéluctablement.
Les cellules sanguines ont leur origine dans la moelle osseuse, siège, chez l'adulte de cellules "souches" hématopoïétiques. Les cellules "souches" hématopoïétiques sont des cellules indifférenciées, multipotentes, qui, selon le facteur de régulation avec lequel elles seront en contact, se différencieront en globules rouges, blancs ou plaquette. Les cellules hématopoïétiques sont une sous-population' de cellules mononucléées, elle-même hétérogène dans sa composition. Les cellules hématopoïétiques sont plus ou moins engagées dans le processus de différenciation, et peuvent être distinguées les unes des autres par leur capacité fonctionnelle in vitro, et par l'expression d'antigènes à leur surface. Certains de ces antigènes sont exprimés par plusieurs populations de cellules ; d'autres sont spécifiques d'une lignée hématopoïétique donnée.
L'antigène CD34 est une protéine d'environ 115kDa, dont le gène se situe sur le chromosome l( lq) et qui est exprimée par les progéniteurs hématopoïétiques, myéloïdes et lymphoïdes. Son rôle n'est pas encore clairement élucidé, mais sa présence a été détectée sur 1 à 4 % des cellules mononucléées de moelle osseuse normale, et sur les cellules leucémiques, de 30 à 60 % des leucémies aiguës et de toutes les LMC.
Les oligonucléotides antisens sont de courtes molécules synthétiques d'ADN, d'ARN ou mixtes, de séquence complémentaire à une séquence cible appartenant à un gène, à un pré-ARN messager ou à un ARN messager. Ils s'hybrident à la séquence dont ils sont complémentaires et peuvent ainsi bloquer l'expression du gène, du pré-ARN messager ou de l'ARN messager portant cette séquence.
Le terme "oligonucléotide" est utilisé de façon générale pour désiger un polynucléotide de 2 à 100, et plus généralement de 5 à 50, nucléotides en série ribo- désoxyribo- ou mixte. Les oligonucléotides antisens sont synthétisés par voie chimique et peuvent comporter des modifications altérant le squelette même de la molécule ou des groupements réactifs additionnels, localisés à leurs extrémités. Ces modifications ont pour but soit d'augmenter leur résistance à la dégradation nucléolytique, soit de favoriser leurs interactions avec leurs cibles, soit de permettre des réactions de dégradation ou de modification spécifiques des cibles, ARN ou ADN, soit d'accroître leur pénétration à l'intérieur des cellules.
L'hybridation entre un oligonucléotide antisens et un ARNm cible peut bloquer l'expression de façon stérique, c'est-à-dire en créant une barrière physique interdisant la fixation et la progression de complexes protéiques nécessaires à la traduction, à la maturation, à la stabilisation ou au transport de l'ARNm, ou bien de façon pseudo-catalytique, en créant un substrat pour la RNase H, enzyme présent dans toutes les cellules eucaryotes et qui dégrade spécifiquement l'ARN lorsqu'il est hybride à de l'ADN (Markus-Sekura et al., Nucleic Acids Res, 1987, 15: 5749; Gagnor et al., Nucleic Acids Res, 1987, 15: 10419; Jessus et al., Gène, 1989, 72: 311). Par ailleurs, les oligonucléotides antisens peuvent comporter des groupements réactifs capables de produire directement des dommages irréversibles dans la molécule d'ARN cible.
Les oligonucléotides antisens, sont donc des agents pharmacologiques potentiels, puissants et spécifiques, permettant d'inhiber l'expression de messagers codant pour des produits exerçant des effets pathogènes. Une méthode pour traiter les leucémies caractérisées par la présence du chromosome Philadelphie a été proposée.
Il a déjà été proposé dans WO 92/22303 d'effectuer un traitement ex vivo de cette forme de leucémie en traitant les cellules mononucléées totales prélevées en phase aigϋe à l'aide d'oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl.
La présente invention a pour objet une méthode de traitement ex vivo de cellules tumorales de patients atteints de LMC, caractérisée en ce que : a) on sélectionne des cellules exprimant un antigène CD34 parmi les cellules mononucléées totales de patients atteints de LMC en phase chronique, et b) on traite les cellules CD34+ sélectionnées, avec un oligonucléotide antisens complémentaire de la jonction bcr-abl, de sorte que l'expression de gène bcr-abl soit réprimée.
De préférence, les cellules du patient sont des cellules du sang ou de la moelle osseuse. En effet, le but est de pouvoir purger par les oligonucléotides les cellules hématopoïétiques des sujets LMC afin de pouvoir leur pratiquer une autogreffe. Celle-ci se pratique, soit à partir de la moelle, soit à partir de cellules du sang récupérées par cytaphérèse.
La méthode selon l'invention permet en effet, l'élimination des cellules tumorales parmi les cellules traitées lesquelles peuvent ensuite être réinjectées au patient dont elles proviennent de façon autologue. Auparavant, on contrôle que l'expression du gène bcr-abl a été réprimée et qu'il ne reste plus de progéniteur de cellules leucémiques.
La présente invention permet l'élimination de cellules tumorales parmi les cellules mononucléées totales prélevées chez les patients atteints de LMC en phase chronique, par administration ex vivo des oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl, aux cellules exprimant l'antigène CD34 et présélectionnées à partir des cellules mononucléées totales du patient.
On entend par oligonucléotide antisens complémentaire de la jonction bcr-abl, un oligonucléotide d'ADN ou ARN complémentaire de l'ARNm de ladite jonction.
L'avantage de la méthode selon l'invention repose sur la combinaison de trois opérations :
1. Le prélèvement des cellules mononucléées totales en phase chronique et, 2. La sélection des cellules exprimant l'antigène CD34 des malades
LMC en phase chronique et,
3) L'application des oligonucléotides antisens. L'efficacité des oligonucléotides antisens est plus évidente sur les cellules CD34+ que sur les cellules non purifiées. En prélevant les cellules mononucléées totales en phase chronique plutôt qu'en phase aiguë, il est possible d'obtenir l'élimination des cellules tumorales parmi les cellules traitées à réinjecter, ce qui est capital pour l'efficacité du traitement. En effet, en phase aiguë il existe des désordres génétiques supplémentaires qui ne sont pas traités par le procédé de l'invention.
En sélectionnant les cellules CD34+ des LMC, les cellules CD34 normales sont également purifiées. Or parmi ces dernières se trouvent les cellules souches hématopoïétiques, qui sont les seules à pouvoir reconstituer l'hématopoïese chez l'homme. Les techniques de greffe actuelles montrent l'efficacité de la greffe (rapidité de prise) à partir des cellules CD34 purifiées.
D'autre part, les cellules tumorales non CD34+ ont un faible pouvoir d'autorenouvellement, elles s'éliminent de façon naturelle comme toute cellule différenciée.
Enfin, chez les malades atteints de LMC, la proportion de cellules tumorales est plus importante parmi les cellules CD34+ que parmi les cellules totales, de sorte qu'il est possible en ne traitant que les cellules CD34+ de tuer toutes les cellules tumorales par un traitement avec un oligonucléotide antisens sans utiliser des doses toxiques d'oligonucléotides risquant de tuer les cellules saines.
Comme première étape, un diagnostic établissant la présence du chromosome Philadelphie chez le patient, doit être rendu. Ceci peut être fait en utilisant une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques, spécifiques du gène hybride bcr-abl, ou par l'amplification spécifique de ce gène grâce à la PCR inverse (RT-PCR, Kawasaki et al., Proc NatI Acad Sci, 1988, 85: 5698).
Ensuite, la séquence autour de la jonction bcr-abl doit être déterminée. Pour cela, des cellules leucémiques présentant le chromosome Philadelphie sont prélevées dans le sang ou dans la moelle osseuse du patient. A ce stade, une centrifugation sur Ficoll-Hypaque peut éliminer les cellules non mononucléées. L'ARN contenant le gène hybride bcr-abl est extrait, pour analyse par transcription inverse, amplification et séquençage. La jonction b2a2 est amplifiée par des amorces spécifiques de l'exon 2 du gène bcr et de l'exon 2 du gène c-abl. La jonction b3a2 est amplifiée par des amorces spécifiques de l'exon 3 du gène bcr et de l'exon
2 du gène c-abl (Shtivelman et al., Cell, 1986, 47: 277; Fainstein et al.,
Nature, 1987, 330: 386). Le séquençage peut être fait directement ou après clonage sur un vecteur approprié. Des oligonucléotides antisens dont la séquence est complémentaire à
100 % de celle de la jonction bcr-abl trouvée chez le patient, sont préparés.
La longueur de 1 Oligonucléotide est de préférence comprise entre
12 et 24 nucléotides, plus particulièrement encore de 18 à 22. Des séquences de moins de 12 nucléotides seraient moins spécifiques de la région visée. Des séquences de plus de 24 nucléotides pourraient être moins efficaces en raison d'une pénétration plus difficile à l'intérieur de la cellule.
Lorsque l'oligonucléotide antisens est dirigé contre la jonction bcr- abl de type b2a2 ou L6, il comporte de façon avantageuse la séquence 18- mère :
5' GAAGGGCXXCXXCCXXAX 3' avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. Cette séquence est complémentaire de la translocation du chromosome Philadelphie associé à des patients atteints de LMC, et qui juxtapose l'exon 2 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl.
Plus particulièrement, il peut comporter de préférence la séquence 20-mère :
5' XGAAGGGCXXCXXCCXXAXX 3' ou la séquence 22-mère : 5' CXGAAGGGCXXCXXCCXXAXXG 3' avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN.
Lorsque l'oligonucléotide antisens est dirigé contre la jonction bcr- abl de type b3a2 ou K28, il comporte de façon avantageuse la séquence 18- mère : 5' GAAGGGCXXXXGAACXCX3' avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. Cette séquence est complémentaire de la translocation du chromosome Philadelphie associé à des patients atteints de LMC, et qui juxtapose l'exon 3 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl. Plus particulièrement, il peut comporter de préférence la séquence 20-mère :
5' XGAAGGGCXXXXGAACXCXG 3' ou la séquence 22-mère : 5' CXGAAGGGCXXXXGAACXCXGC 3» avec X « T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN.
Une fois la séquence définie, les oligonucléotides antisens peuvent être synthétisés par des méthodes chimiques connues à cet effet.
Les composés cités ci-dessus dirigés contre les translocations b2a2 ou b3a2 du chromosome Philadelphie associées à des patients atteints de LMC, peuvent être encadrés en 3' et/ou 5' de 1 à 15 nucléotides supplémentaires.
Dans une application antisens de préférence la séquence oligonucléotidique est une séquence d'ADN car les duplexes ADN/ARN sont substrats de la RNase H.
Les liens internucléotidiques des oligonucléotides peuvent être du type naturel, c'est-à-dire, du type phosphodiester ou de type modifié. On cite notamment les oligonucléotides du type, dit phosphorothioate ou methylphosphonate. Toutefois, on préfère selon l'invention quand les séquences oligonucléotidiques sont de type naturel à lien internucléotidique de type phosphodiester ou de type phosphorothioate, car elles présentent la toxicité la plus réduite.
Les composés selon l'invention peuvent être associés à tout composé favorisant leur pénétration cellulaire.
Différents nucléotides peuvent rentrer dans la formulation d'oligonucléotides. les oligonucléotides faisant l'objet de la présente invention sont composés par une séquence de bases nucléotidiques comportant notamment de l'adenine (A), de la guanine (G), de la cytosine (C), de la thymine (T) et de l'uracile (U), reliées entre elles par des liaisons internucléotidiques, notamment naturelles c'est-à-dire phosphodiesters.
Les oligonucléotides selon l'invention peuvent également comporter des nucléotides rares (Inosine, I, ou ri par exemple) ou des nucléotides modifiés, soit en série désoxyribo- soit en série ribo-. PCI7FR95/01398
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Les oligonucléotides selon l'invention peuvent également comporter à l'extrémité 5' ou aux deux extrémités 3' et 5' en même temps, des séquences nucléotidiques supplémentaires, dont la nature et la longueur permettront l'apparition des structures en agrafe ou semi- agrafe dans la séquence finale de la molécule oligonucléotidique. Ces séquences nucléotidiques supplémentaires pourront être de deux types : soit elles présenteront elles-mêmes une structure secondaire en semi- agrafe qui sera transmise aux séquences oligonucléotidiques dont elles seront les nouvelles extrémités ; soit elles ne présenteront pas d'emblée ce type de structure secondaire mais les bases nucléotidiques constituant l'une ou l'autre de leurs extrémités seront capables d'aller s'apparier avec des nucléotides situés au sein des séquences auxquelles elles seront ajoutées, conférant ainsi à la séquence finale une structure en agrafe ou en semi-agrafe. Font également partie de cette invention, des oligonucléotides fermés, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'une ou plusieurs séquence(s) d'oligonucléotides monocaténaires dont les extrémités sont reliées entre elles par des liens covalents, nucléotidiques ou non- nucléotidiques, pour former au moins partiellement une structure monocaténaire fermée.
Les oligonucléotides selon l'invention peuvent aussi comporter des nucléotides réactifs, capables d'établir des liens avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide, ou, dans une autre application, des liens intra-moléculaires au sein même de l'oligonucléotide.
Ainsi, les oligonucléotides selon l'invention peuvent porter des groupements réactifs greffés sur les nucléotides, comme par exemple des groupements psoralènes, ou d'autres agents de pontage ou agents intercalants pouvant réagir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide. Dans un cas particulièrement intéressant, des groupements réactifs greffés sur certains des nucléotides de l'oligonucléotide pourront induire la formation d'un pontage intramoléculaire au sein même de la molécule.
L'oligonucléotide pourra comporter des liaisons internes produites par des agents réactifs appartenant ou n'appartenant pas à la structure de la molécule elle-même. Font également partie de l'invention des oligonucléotides dits chimériques, constitués par l'assemblage covalent de fragments nucléotidiques et non-nucléotidiques.
Font également partie de l'invention des oligonucléotides antisens couplés à des molécules permettant d'accroître leur pénétration intra¬ cellulaire en stabilisant la structure oligonucléotidique, et en particulier des groupements lipophiles, des polypeptides ou des protéines.
Des formulations galéniques adéquates peuvent être établies afin d'optimiser la délivrance de ces molécules aux cellules CD34+ cibles. Ainsi, par exemple, les oligonucléotides anτisens pourront être encapsulés dans des liposomes, des nonaparticules, des particules LDL, ou dans tout autre type de microsphère permettant une conservation adéquate, et favorisant le ciblage. Les molécules oligonucléotidiques peuvent également être associées à des agents surfactants cationiques. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre en référence aux Figures 1 à 4.
La Figure 1 représente un fragment de 60 nucléotides de la séquence de l'ARN messager centré sur la jonction bcr-abl associée à des patients atteints de LMC qui présentent une jonction de type L6 ou b2a2, juxtaposant l'exon 2 du gène bcr et l'exon 2 du gène abl. La flèche indique la position de la jonction bcr-abl : la séquence dérivée du gène bcr se trouve en amont de la jonction, tandis que la séquence dérivée du gène abl se trouve en aval de la jonction. La séquence soulignée correspond à la cible des oligonucléotides antisens anti-b2a2 (Figure 3).
La Figure 2 représente un fragment de 60 nucléotides de la séquence de l'ARN messager centré sur la jonction bcr-abl associée à des patients atteints de LMC qui présentent une jonction de type K-28 ou b3a2, juxtaposant l'exon 3 du gène bcr et l'exon 2 du gène abl. La flèche indique la position de la jonction bcr-abl : la séquence dérivée du gène bcr se trouve en amont de la jonction, tandis que la séquence dérivée du gène abl se trouve en aval de la jonction. La séquence soulignée correspond à la cible des oligonucléotides antisens anti-b3a2 (Figure 3). La Figure 3 représente des oligonucléotides utilisés dans les tests d'inhibition de la prolifération clonale des progéniteurs myéloïdes. L'oligonucléotide antisens GT-1 est complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 (Figure 1 ). L'oligonucléotide antisens GT-2 est complémentaire de la jonction bcr-abl de type b3a2 (Figure 2). L'oligonucléotide contrôle GT-3 correspond à la séquence complémentaire à GT-1 ; l'oligonucléotide contrôle GT-4 correspond à la séquence complémentaire à GT-2.
La Figure 4 montre l'effet des oligonucléotides antisens et sens (Figure 3) sur la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques après 14 jours d'incubation continue des cellules CD34+ provenant de moelle osseuse normale ou de patients atteints de LMC de type b2a2 ou b3a2 en phase chronique. La concentration des oligonucléotides dans le milieu semi solide d'incubation était de 20 μM. Les résultats correspondent à la moyenne de triplicats de deux moelles normales, traitées chacune avec les oligonucléotides correspondant à la jonction b2a2 (antisens GT-1 et contrôle GT-3), et à la jonction b3a2 (antisens GT-2 et contrôle GT-4). Dans les cas de moelles provenant des patients atteints de LMC, les expériences ont été réalisées deux fois en triplicat sur chaque type de LMC, avec les oligonucléotides spécifiques de chaque LMC : antisens GT-1 et contrôle GT- 3, pour la jonction b2a2 (Figure 3) et antisens GT-2 et contrôle GT-4, pour la jonction b3a2.
Les exemples de réalisation de l'invention qui suivent concernent l'inhibition de l'expansion clonale des progéniteurs myéloïdes dans les cas de LMC en phase chronique par traitement avec des oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl, appliqués exclusivement sur des cellules exprimant l'antigène CD34, pré-sélectionnées à partir des cellules mononucléées totales de la moelle osseuse.
Les propriétés antiprolifératives des oligonucléotides antisens complémentaires de la jonction bcr-abl de type b2a2 (Figure 1) ou b3a2 (Figure 2), présentes dans les chromosomes Philadelphie associés à des patients atteints de LMC, ont été établies dans des Essais clonogéniques sur milieu semi-solide. 803 PC---7FR95/01398
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La LMC en phase chronique se distingue par une augmentation de la production de cellules myéloïdes matures, morphologiquement normales, due à un autorenouvellement non régulé du compartiment des cellules souches pluripotents. Le résultat est une expansion du compartiment des progéniteurs multipotents (CFU-GEMM) et différenciés (CFU-GM) dans la moelle, la rate, et le sang. C'est ainsi que la culture des progéniteurs hématopoïétiques de type CFU-GM peut être considérée comme un moyen d'étudier la prolifération et différenciation des cellules progénitrices LMC. L'efficacité des oligonucléotides antisens anti-bcr-abl pour inhiber la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques des patients atteints de LMC, a été comparée dans des essais clonogéniques de CFU-GM à partir des cellules mononucléées totales ou CD34+.
Les cellules mononucléées du sang des patients (normales ou LMC) ont été prélevées, après consentement, et purifiées par centrifugation sur gradient de Ficoll. Dans les cas des patients LMC, le prélèvement a été effectué lors de la phase chronique de la maladie. Parmi les cellules mononucléées ainsi obtenues, celles exprimant l'antigène CD34 ont été sélectionnées par immuno-absorption sur une colonne Ceprate (CellPro, France SARL). Les cellules mononucléées médullaires ou sanguines sont obtenues après cnetrifugation du prélèvement de moelle ou du sang sur un gradient de densité, puis incubées avec un anticorps monoclonal anti- CD34 biotinylé. Les cellules sont ensuite déposées sur une colonne d'avidine. Les cellules CD34+ reconnues par les anticorps biotinylés sont retenues sur les billes d'avidine. Après lavage de la colonne, les cellules CD34+ absorbées sont détachées de la colonne par addition d'avidine et récoltées. Sur un échantillon, la pureté en cellules CD34+ est vérifiée par analyse en cytométrie de flux (Profile II, Coultronics) après marquage des cellules avec un anticorps ami CD34 (My-10, Becton-Dikinson). Les cellules mononucléées totales (2 x 105 cellules/ml) ou CD34+
(2 x 103 cellules/ml), sont mises en culture en triplicats en milieu semi solide contenant 30 % de sérum de veau fœtal (Methocult H4230, Terry Fox
Lab, Vancouver), en présence de facteurs stimulants (Hemostim H2300,
Terry Fox Lab, Vancouver) et d'erythropoïétine (lU/ml; Boehringer). Les oligonucléotides, antisens ou contrôles (Figure 3), sont ajoutés en incubation continue au temps 0 de la culture. Les oligonucléotides sont inclus dans le milieu semi solide (methylcellulose) à une concentration de 20 μM Le décompte du nombre de colonies granulo-macrophagiques se fait sur un microscope inversé après 14 jours de culture dans un incubateur à 37,C avec 5 96 de CO2.
Exemple 1 : Effet des oligonucléotides antisens sur des cellules mononucléées de moelles normales.
L'effet des oligonucléotides antisens dirigés contre les deux types de jonction bcr-abl a été testé sur des cellules mononucléées non- leucémiques en incubation continue, et comparé à leurs contrôles "sens" respectifs, ainsi qu'à un témoin sans oligonucléotides. Les oligonucléotides utilisés sont décrits dans la Figure 3. Les oligonucléotides antisens utilisés étaient ceux complémentaires à la séquence b2a2 et à la séquence b3a2.
Ajoutés à des cellules mononucléées totales de moelle normale, les oligonucléotides sens GT-3 et GT-4, ou antisens GT-1 et GT-2 (Figure 3), ont inhibé de manière non spécifique la pousse des progéniteurs granulo- macrophagiques de 60±10 % (résultats non montrés).
L'effet de l'incubation des cellules mononucléées CD34+ avec les oligonucléotides sens GT-3 et GT-4 et antisens GT-1 et GT-2 (Figure 3), a été étudié sur deux échantillons de moelle normale. L'inhibition de la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques par les oligonucléotides antisens GT-1 ou GT-2 a été de 40 %, les contrôles sens GT-3 et GT-4 inhibant de 10 % dans les mêmes conditions (Figure 4).
L'inhibition spécifique des oligonucléotides antisens GT-1 et GT-2 sur des cellules CD34+ provenant des moelles normales, pourrait indiquer la sensibilité aux oligonucléotides antisens des ARN messagers normaux bcr et/ou abl, transcrits à partir des gènes non transloqués.
Exemnle 2 : Effet des oligonucléotides antisens sur des cellules mononucléées de patients atteints de LMC Ajoutés en incubation continue à des cellules mononucléées totales du sang de sujets atteints de LMC b2a2 ou b3a2, les oligonucléotides sens ou antisens (Figure 3) n'ont pas modifié la pousse des progéniteurs granulo- macrophagiques (résultats non montrés). Ajoutés en incubation continue à des cellules mononucléées CD34+ prélevées sur des sujets atteints de LMC, les oligonucléotides antisens dirigés contre la jonction b2a2 ont inhibé spécifiquement de 38 % la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques (Figure 4). Dans le cas du patient présentant une LMC de type b3a2, les oligonucléotides antisens correspondants ont inhibé spécifiquement de 70 96 la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques.
Il a donc été constaté que les oligonucléotides antisens phosphorodiesters contenant les séquences complémentaires aux séquences b2a2 ou b3a2 des translocations caractéristiques du chromosome Philadelphie sont capables d'inhiber la pousse des progéniteurs myéloïdes à partir des cellules mononucléées CD34+ des sujets ayant une LMC.
La présente invention concerne donc le traitement ex vivo des cellules mononucléées CD34+ provenant des patients atteints de LMC en phase chronique, avec des oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl présente dans ces patients (b2a2 ou b3a2). Une fois que les cellules CD34+ ont été traitées par l'oligonucléotide antisens de séquence appropriée, il reste à contrôler que l'expression du gène bcr-abl a été réprimée, et qu'il ne reste plus de progéniteurs de cellules leucémiques. Ceci se fait par quantification de l'expression du gène bcr- abl par PCR inverse et par vérification de la disparition de colonies leucémiques dans des tests de clonogénicité (Réf. : Metcalf, D., Nicolas, NA, Blood, 1992, 79:2861).
Les opérations ultérieures consistent à réinjecter les cellules ainsi traitées, parmi lesquelles on a éliminé les cellules leucémiques, grâce au procédé selon l'invention. Cette réinjection se fait éventuellement après que le patient ait subi une chimiothérapie lourde avec ou sans irradiation corporelle totale.
En pratique, l'utilisation d'oligonucléotides antisens dans la LMC pourra servir à éliminer la maladie résiduelle chez les patients en rémission partielle, par transfusion de cellules autologues ainsi purgées. IDENTIFICATEUR DE SEQUENCE Cl) INFORMATIONS GENERALES : i) DEPOSANT:
CA) NOM : GENSET
00 RUE : 1 Rue Robert et Sonia Delaunay
CO VILLE : PARIS
CD) ETAT OU PROVINCE :
CE) PAYS : FRANCE
CF) CODE POSTAL : 75011
CG) TELEPHONE : 43565900
CH) TELEFAX : 43562625
Cϋ) TITRE DE L'INVENTION : "METHODE DE TRAITEMENT EX VIVO DE CELLULES TUMORALES DE PATIENTS ATTEINTS DE LMC"
Ci i) NOMBRE DE SEQUENCES : 14
Civ) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR :
CA) TYPE DE SUPPORT : DISQUETTE
CB) ORDINATEUR : MAC INTOSH
CO SYSTEME D'EXPLOITATION :MAC OS - SYSTEME 7 CD) LOGICIEL : WORD PERFECT VERSION 2.0.
C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N* : 1 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 18 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 1 :
GAAGGGCTTC TTCCTTAT 18 C3) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 2 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 18 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 2 :
GAAGGGCUUC UUCCUUAU 18
C4) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 3 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 20 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cϋ) TYPE DE MOLECULE : ADN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 3 :
TGAAGGGCTT CTTCCTTATT 20
C5) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 4 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 20 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN Ciii) HYPOTHETIQUE : NON Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 4 :
UGAAGGGCUU CUUCCUUAUU 20
C6) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 5 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 22 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 5 :
CTGAAGGGCT TCTTCCTTAT TG 22
C7) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 6 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 22 nucléotides
CC) NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 6 :
CUGAAGGGCU UCUUCCUUAU UG 22 C8) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 7 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 18 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b3a2 ou K28
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 7 :
GAAGGGCTTT TGAACTCT 18
C9) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 8 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 18 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b3a2 ou K28
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 8 :
GAAGGGCUUU UGAACUCU 18
C10) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 9 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 20 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 9 :
TGAAGGGCTT TTGAACTCTG 20
Cil) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 10 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 20 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 10 :
UGAAGGGCUU UUGAACUCUG 20
C12) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 11 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 22 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémenta re de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 11 :
CTGAAGGGCT TTTGAACTCT GC 22 C13) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 12 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 22 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 12 :
CUGAAGGGCU UUUGAACUCU GC 22
C14) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N* : 13 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 60 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN messager
Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : ARN messager centré sur la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6 de patients atteints de LMC.
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 13 :
ACAGCAUUCC GCUGACCAUC AAUAAGGAAG AAGCCCUUCA GCGGCCAGUA GCAUCUGACU 60
C15) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N° : 14 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
CA) TYPE : oligonucléotide
CB) LONGUEUR : 100 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1
Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN messager Ciii) HYPOTHETIQUE : NON
Civ) ANTI-SENS : OUI
Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : ARN messager centré sur la jonction bcr-abl de type b3a2 ou K28 de patients atteints de LMC .
Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 14 :
ACUCAGCCAC UGGAUUUAAG CAGAGUUCAA AAGCCCUUCA GCGGCCAGUA CGAUCUGACU 60

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de traitement et élimination ex vivo de cellules tumorales de patients atteints de LMC, caractérisée en ce que :
a) on sélectionne des cellules exprimant un antigène CD34 parmi les cellules mononucléées totales de patients atteints de LMC en phase chronique, et
b) on traite les cellules CD34+ sélectionnées, avec un oligonucléotide antisens complémentaire de la jonction bcr-abl de sorte que l'expression du gène bcr-abl soit réprimée.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules du patient sont des cellules du sang ou de la moelle osseuse du patient.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'après traitement, on contrôle que l'expression du gène bcr-abl a été réprimée et qu'il ne reste plus de progéniteur de cellules leucémiques.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'on détermine la séquence de la jonction bcr-abl dans les cellules du patient prélevée à l'étape a), et on traite les cellules avec un oligonucléotide complémentaire de la séquence de la jonction bcr-abl des propres cellules dudit patient.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est dirigé contre la jonction bcr-abl de type b2a2.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est dirigé contre la jonction bcr-abl de type b3a2.
7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que l'oligonucléotide comporte de 12 à 24 nucléotides, plus particulièrement de 18 à 22.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'oligonucléotide comporte la séquence 18-mère : 5' GAAGGGCXXCXXCCXXAX 3' avec X « T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN.
9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'oligonucléotide comporte la séquence 20-mère : 5' XGAAGGGCXXCXXCCXXAXX 3' ou la séquence 22-mère :
5' CXGAAGGGCXXCXXCCXXAXXG 3* avec X ≈ T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN.
10. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'oligonucléotide comporte la séquence 18-mère : 5' GAAGGGCXXXXGAACXCX3' avec X - T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN.
11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'oligonucléotide comporte la séquence 20-mère :
5' XGAAGGGCXXXXGAACXCXG 3' ou la séquence 22-mère :
5* CXGAAGGGCXXXXGAACXCXGC 3' avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN.
12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que l'oligonucléotide comporte des nucléotides réactifs, capables d'établir des liens avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide, ou, des liens intra-moléculaires au sein même de l'oligonucléotide.
13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que l'oligonucléotide comporte des groupements réactifs greffés sur les nucléotides, comme des groupements psoralènes, des agents de pontage ou des agents intercalants pouvant réagir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide.
14. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est couplé à des molécules permettant d'accroître sa pénétration intra-cellulaire en stabilisant la structure oligonucléotidique, telles que des groupements lipophiles, des polypeptides ou des protéines.
15. Méthode selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est formulé dans des liposomes, des nanoparticules, des particules LDL, ou dans tout autre type de microsphère permettant une conservation adéquate et favorisant le ciblage, ou associé à des agents surfactants cationiques.
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