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WO1996012507A1 - Antibody reagent for detecting dissecting aortic aneurysm and use thereof - Google Patents

Antibody reagent for detecting dissecting aortic aneurysm and use thereof Download PDF

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WO1996012507A1
WO1996012507A1 PCT/JP1995/002180 JP9502180W WO9612507A1 WO 1996012507 A1 WO1996012507 A1 WO 1996012507A1 JP 9502180 W JP9502180 W JP 9502180W WO 9612507 A1 WO9612507 A1 WO 9612507A1
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antibody
smooth muscle
heavy chain
muscle myosin
myosin heavy
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PCT/JP1995/002180
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Inventor
Hirohisa Kato
Ryozo Nagai
Original Assignee
Yamasa Corporation
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/329—Diseases of the aorta or its branches, e.g. aneurysms, aortic dissection
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function

Definitions

  • the present invention relates to an antibody reagent for detecting a dissociative aortic aneurysm (recently referred to as aortic dissection) containing an antibody against a smooth muscle myosin heavy chain, and a use thereof.
  • aortic dissection a dissociative aortic aneurysm
  • a dissecting aortic aneurysm is a disease accompanied by severe chest pain, which is caused by a rupture of a part of the intima of a blood vessel and blood flowing into the intima through the intima tear to cause dissection of the wall.
  • Most of the site of onset is the aorta, but it can extend to branches.
  • Factors of onset include degeneration and weakening of the intima (“alveolar media necrosis, arteriosclerosis, etc.”), as well as aortic dilation and hypertension.
  • a typical disease that complains of chest pain is acute myocardial infarction.
  • Acute myocardial infarction can be diagnosed without much difficulty by performing ECG changes and blood chemistry tests.
  • dissociated aorta despite its high mortality, shows very few specific changes on electrocardiograms and blood tests, so its diagnosis requires careful attention.
  • an object of the present invention is to provide a method for detecting a dissecting aortic aneurysm applicable to an emergency test and a reagent used for the method. Disclosure of the invention
  • vascular disorders such as dissociative aortic aneurysms
  • vascular disorders could be diagnosed by detecting smooth muscle myosin heavy chain, which is a major constituent protein of blood vessels.
  • Smooth muscle myosin heavy chain is biochemically different from skeletal myosin heavy chain, cardiac myosin heavy chain, and non-muscle myosin heavy chain. Obtain antibodies specific to smooth muscle myosin heavy chain. Is relatively simple. Therefore, an antibody against smooth muscle myosin heavy chain was prepared, and an Atssey system capable of detecting smooth muscle myosin heavy chain in blood was established. When the serum of a healthy individual was measured using this Atsushi system, the serum smooth muscle myosin heavy chain showed only a low level. On the other hand, when the serum of patients with dissociated aortic aneurysms was measured, a significant increase in smooth muscle myosin heavy chain, which well reflects clinical symptoms, was observed. The present inventors have confirmed that the present invention is useful for detection and completed the present invention.
  • the present invention relates to an antibody reagent for detecting a dissociated aortic aneurysm, which contains an antibody against a smooth muscle myosin heavy chain.
  • the present invention relates to a kit for detecting a dissociative aortic aneurysm containing an antibody reagent for smooth muscle myosin heavy chain and a washing solution containing a surfactant. Furthermore, the present invention relates to a method for measuring a smooth muscle myosin heavy chain in a sample, and detecting a dissociative aortic aneurysm from the obtained measured value.
  • the present invention relates to the use of an antibody against a smooth muscle myosin heavy chain for detecting a dissecting aortic aneurysm.
  • Figure 1 shows the standard curve
  • Figures 2 to 7 show the results of examining the effect of the surfactant.
  • Figure 8 shows the results of examining the dilution linearity.
  • Figure 9 shows the results of examining cross-reactivity.
  • FIG. 10 shows the results of measurement of smooth muscle myosin heavy chain in patient serum.
  • FIG. 11 shows the results of measurement of smooth muscle myosin heavy chain in patient serum.
  • the antibody reagent of the present invention is used in a method for measuring smooth muscle myosin heavy chain in a test sample by using an immunoassay and detecting a dissociated aortic aneurysm from the measured value. Therefore, the antibody reagent of the present invention contains at least an antibody specific to smooth muscle myosin heavy chain.
  • the antibody used in the antibody reagent of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it specifically binds to smooth muscle myosin heavy chain, and those antibodies are known antibodies.
  • a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it specifically binds to smooth muscle myosin heavy chain, and those antibodies are known antibodies.
  • the use of a monoclonal antibody having a cross-reactivity with other myosin of less than 3%, preferably less than 1%, as shown in the examples described below, allows the weight of smooth muscle myosin in the sample to be reduced.
  • the strand can be measured specifically.
  • Such a monoclonal antibody can be easily prepared by appropriately applying a known method, as shown in Examples described later (for example, “Immunobiochemical research method (Seismogenic Chemistry Laboratory Course 5)”), Edited by The Biochemical Society of Japan, pp. 88 (1989), Biochemistry, 27, 3807-3811 (1988), Eur. J. Biochem, 179, 79-85 (1989), J. Mol. Biol., 198, 143-157 (1987), J. Biol. Chem., 264, 9734-9737 (1989), J. Biol. Chem., 264, 18272-18275 (1989), J. Biol. Chem, 266, 3768-3773 (1991), Circulation, 88, 1804-1810 (1993), etc.).
  • the antibody to be used may be the antibody itself, but it is preferable to use an active fragment of the antibody from the viewpoint of preventing non-specific adsorption.
  • the antibody activity fragment may be any as long as it retains the characteristics of the antibody (eg, various fragments such as F (a) 2 , Fab ′, and Fab).
  • Preparation of these active fragments can be performed by applying a known method such as a method in which a purified antibody is limitedly degraded using a protease such as papain, pepsin, and trypsin (for example, “Immunobiochemical research method (Seismochemical Experimental Lecture 5)), edited by The Biochemical Society of Japan, See p. 89 (1989).
  • the antibody reagent a solution or lyophilized antibody can be used, and if necessary, a reagent modified to a form suitable for the measurement system (for example, an immobilized antibody, a labeled antibody, etc.) can be used. It does not matter.
  • the modification of the antibody can be performed according to a conventional method. That is, as the material of the carrier used for preparing the solid-phased antibody, for example, polyvinyl chloride, polystyrene, styrene-divinylbenzene copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, nylon, polyvinyl alcohol, Synthetic organic polymer compounds such as polyacrylamide, polyacrylonitrile, polypropylene, and polymethylene methacrylate; dextran derivatives (such as Sephadex); agarose gels (such as Sepharose and Iogel); and cellulose (such as paper discs and filter paper).
  • polyvinyl chloride polystyrene, styrene-divinylbenzene copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer
  • nylon polyvinyl alcohol
  • Synthetic organic polymer compounds such as polyacrylamide, polyacrylonitrile, polypropylene, and poly
  • Examples thereof include inorganic high molecular compounds such as polysaccharides, glass, silica gel, and silicone. These may be those into which functional groups such as amino group, aminoalkyl group, carboxyl group, acyl group, and hydroxyl group are introduced.
  • the carrier is preferably made of a material having a high protein binding ability.
  • the shape of the carrier can be flat (microtiter plate, disk, etc.), particulate (beads, etc.), tubular (test tube, etc.), fibrous, membrane-like, particulate (latex particles, etc.), capsule-like,
  • An endoplasmic reticulum is exemplified, and a carrier having an appropriate shape according to the measurement method can be selected. Also, it can be used as a carrier for immobilizing antibodies such as ribosomes (monolayer or multilayer lipid membrane).
  • the binding between the antibody and the carrier can be performed by a known method such as a physical adsorption method, an ionic bonding method, a covalent bonding method, or an inclusive method (for example, “immobilized enzyme” (edited by Ichiro Chibatake, March 20, 1980). , Published by Kodansha)).
  • a physical adsorption method for example, “immobilized enzyme” (edited by Ichiro Chibatake, March 20, 1980). , Published by Kodansha)).
  • the physical adsorption method is preferred because it is simple.
  • the above-mentioned binding may be performed directly, or may be performed via another substance between both substances.
  • radioisotopes e.g., 3 2 P, 3 H, 'such as 4 C, 1 2 5 I
  • enzymes e.g., ⁇ one galactosidase, pel Okishidaze, alkaline phosphatase , Glucose-1-6-phosphate dehydrogenase, catalase, glucose oxidase, lactate oxidase, alcohol Oxidases, monoamine oxidases, etc.
  • coenzyme 'prosthetic groups eg, FAD, FMN, ATP, piotin, heme, etc.
  • fluorescein derivatives eg, fluorescein isothiocynate, fluorescein Mill, etc.
  • rhodamine derivatives eg, tetramethylrhodamine B isothiosinate
  • fluorescent dyes such as umbelliferone and 1-anilino-18-n
  • the detection kit of the present invention is for use in a method for measuring a smooth muscle myosin heavy chain in a test sample using an Immunity assay and detecting a dissociated aortic aneurysm from the obtained measurement value.
  • the kit is characterized in that the kit contains at least the antibody reagent of the present invention as described above, and a washing solution containing a surfactant is attached as a constituent reagent.
  • the antibody reagent attached to the detection kit of the present invention may be any one of the above-mentioned antibody reagents in a form suitable for the immunoassay method used in the kit (eg, an immobilized antibody, a labeled antibody, etc.). May be appropriately selected and attached to the kit.
  • the surfactant added to the washing solution is not particularly limited as long as it is water-soluble, and an amphoteric surfactant or a nonionic surfactant is particularly preferable. More specifically, examples of amphoteric surfactants include egg yolk lysolecithin and the like, and examples of nonionic surfactants include Tween (Tween 20, 40, 60, 80, 85). ), S pan system (S pan 20, 80, 85, 80, etc.), Brij system (Brij 35, 58, etc.), (n) p-t-octylphenyl Examples (Triton CF-10, N-101, X-100, X114, X305, X405, Nonidet P-40, etc.) be able to. The appropriate amount of surfactant added is 0.003% (wZv) or more.
  • the reagents other than those mentioned above select the appropriate reagent from the reagents (standard antigen solution, enzyme solution, substrate solution, reaction stop solution, sample diluent, etc.) that are usually used in the Atsey method used, according to the measurement system. What is necessary is just to select and attach it to the detection kit of the present invention.
  • the Atsey method employed in the detection kit of the present invention is not particularly limited as long as it is a known method employed by the Immunoassay, such as a competitive method, a sandwich method, an agglutination method, a blot overlay method, an immunochromatographic method, and the like. Either Atsey method can be adopted.
  • kit A which is one of the preferred methods among the Atsay methods, as an example, and further describing the detection kit of the present invention, for example, the following kit A can be exemplified.
  • a labeled second antibody can be used instead of the second antibody and the labeled anti-immunoglobulin antibody of the kit A, and the following kit B is exemplified as such a kit. Kit B;
  • a kit composed of such constituent reagents is suitable for, for example, a quick assay for giving a measurement result within one hour.
  • kit C is exemplified.
  • the “antibody” is an antibody against the smooth muscle myosin heavy chain
  • the “antigen” is the smooth muscle myosin heavy chain.
  • the “first antibody” and “second antibody” may recognize the same antigenic determinant on the smooth muscle myosin heavy chain, or may recognize different antigenic determinants. .
  • the method for measuring the smooth muscle myosin heavy chain in a test sample using the above-described detection kit has no difference from other known test kits employing the sandwich method. That is, the immobilized antibody reagent is reacted with the test sample, and if necessary, after BF separation, the (labeled) antibody reagent is further reacted (two-step method).
  • the immobilized antibody reagent, the test sample and ( Labeling) Antibody reagents are reacted simultaneously (one-step method). After the reaction, in any case, the smooth muscle myosin heavy chain in the sample can be detected or quantified by a method known per se depending on the labeling agent.
  • the detection method of the present invention is to measure a smooth muscle myosin heavy chain in a sample, and to detect a dissociative aortic aneurysm from the obtained measurement value.
  • the test sample to be measured is blood suspected of having a dissecting aortic aneurysm, that is, blood collected from a patient complaining of chest pain (over time), or a fraction thereof (such as serum).
  • the test sample may be diluted with an appropriate buffer such as PBS if necessary for measurement.
  • Detection or quantification of smooth muscle myosin heavy chain in a blood sample may be performed using the above-described antibody reagent or detection kit of the present invention.
  • the blood sample contains a smooth muscle myosin heavy chain that significantly exceeds the average content of healthy subjects, the patient from whom the blood sample was collected is very likely to have a dissecting aortic aneurysm. It is necessary to judge it as high and to conduct further detailed inspection. If the smooth muscle myosin heavy chain content in the blood sample is not statistically different from that in healthy subjects, it is determined that the patient who collected the blood sample is not likely to have a dissociative aortic aneurysm However, re-inspection from another angle is required.
  • Human uterine smooth muscle myosin, human aortic smooth muscle myosin, human platelet myosin, and human skeletal muscle myosin were provided by Dr. Matsumura, Saga Medical University.
  • Human cardiac myosin was purified by the method of Yazaki (Circ. Res., 36: 208, 1975). After confirming the purity of various myosins by SDS-PAGE, the protein was quantified by the Lowry method (J. Biol. Cheni, 193: 265-275, 1951) using pepsin albumin as a standard substance, and the concentrations were determined. .
  • Each myosin is composed of a heavy chain and a light chain.
  • Human uterine smooth muscle myosin (25-50 fig) was intraperitoneally administered to BALB / c mice of 6 to 8 weeks of age together with Freund's complete adjuvant 4 to 7 times every 2 to 4 weeks. Muscle myosin 10 / g was administered intravenously.
  • HAT medium 0.1 ml was added, and then every 3 to 4 days, half of the medium was replaced with fresh HAT medium.
  • Hypri-Doma 1H6 and Hypri-Doma 4E12 were approved by the Ministry of International Trade and Industry as the SMHMWl H6 and SMHMW4E12 under the Budapest Treaty as SMHMWl H6 and SMHMW4E12. It was deposited internationally on October 13, 1994, and has been assigned the accession numbers FERMBP-48029 and FERMBP-48030 on October 13, 1994.
  • Table 1 shows the ratio of obtaining the desired monoclonal antibody-producing hybridoma based on the number of cells.
  • each established hybridoma was cultured, and 3 ⁇ 10 6 mice were administered intraperitoneally to mice to which pristane had been previously administered. About 2 weeks later, 5 ml of ascites was collected per mouse. Ascites mixed with an equal volume of the same glycine hydrochloride buffer on a protein A Sepharose CL-4B (Pharmacia) column equilibrated with 1.5 M glycine hydrochloride buffer containing 3 M sodium chloride, PH 8.9 Shed. After washing with a sufficient amount of the same glycine hydrochloride buffer, the antibody was eluted with 0.1 M citrate buffer (PH 6.0). The dialyzed solution was dialyzed against PBS, and the purity was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to obtain a purified monoclonal antibody.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • Antibody isotypes were searched using the MonoAb-IDEIA kit (Zymed).
  • the coloring solution HRP coloring reagent (manufactured by Bio-Rad) 3 Omg, methanol 10 ml, TBS 5 Om 30% hydrogen peroxide solution 30%) ) And washed with distilled water.
  • Each of the above monoclonal antibodies was precipitated on a 0.1 M sodium bicarbonate solution, and then concentrated to 2 mgZm1 by Centriflow (manufactured by Amicon).
  • Piotin (long arm) NHS reagent manufactured by Vector
  • the Piochin antibody was diluted to 1 8 / / 1111 with 1% BSA-containing? 83 to afford the Piochin antibody solution.
  • Anti-smooth muscle myosin heavy chain monoclonal antibody (4E12) was diluted to 10 ⁇ gZml with PBS, and dispensed in 50 ⁇ l aliquots into a 96 ⁇ l plate (H type: manufactured by Sumitomo Beilkrite). It was left still at 4 ° C. After washing 3 times with PBS containing 0. 5% Tween 20, 0.5% skim milk is dispensed in 300 1 each, and left at room temperature for 1 hour did. The skim milk solution was removed to obtain an immobilized antibody reagent.
  • Tween 20 was dissolved in PBS to a concentration of 0.05% (w / v).
  • TMBZ 3,3 ', 5,5, -Tetramethylbenzidine dihydrochloride
  • Each of the above reagents was attached to one kit to prepare a detection kit of the present invention.
  • the base solution was dispensed in 1001 portions, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes to develop color.
  • the reaction was stopped by adding an enzyme reaction stop solution at a rate of 1001 each, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate photometer. The resulting standard curve is shown in Figure 1. You.
  • the concentration of smooth muscle myosin heavy chain in serum collected over time from the onset of the two patients with dissecting aortic aneurysm was measured.
  • a marked increase in the concentration of smooth muscle myosin heavy chain was confirmed at the onset, and the usefulness of measurement of smooth muscle myosin heavy chain in the detection or diagnosis of dissociated aortic aneurysms was confirmed. It was shown. Definitive diagnosis of dissecting aortic aneurysm was made based on intraoperative findings.
  • Dissociated aortic aneurysms can be detected by measuring smooth muscle myosin heavy chain in test samples. What can be detected is the first thing that the present inventors have found, and since it employs Imno-Assy as a detection method, unlike a conventional method, it does not require any special device, and a dissociative aortic aneurysm can be detected. It can be applied to emergency inspections.
  • the antibody reagent and the detection kit of the present invention are essential for carrying out the detection method of the present invention, and further include a monoclonal antibody as an antibody and a specific detergent as a washing solution. If used, the smooth muscle myosin heavy chain in the test sample can be detected with higher sensitivity, and it can be used not only for emergency tests, but also for follow-up during treatment and prognosis.

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Description

明 細 書 解離性大動脈瘤を検出するための抗体試薬及びその用途 技術分野
本発明は、 平滑筋ミオシン重鎖に対する抗体を含有する解離性大動脈瘤 （最近 では、 大動脈解離とも称されている。 ） を検出するための抗体試薬及びその用途 に関するものである。
背景技術
解離性大動脈瘤は、 強い胸痛を伴う疾患であって、 血管の内膜の一部が裂け、 その内膜裂孔から内膜内に血液が流入して壁の解離を生じることにより発症する。 発症部位の大部分は大動脈であるが、 分枝に及ぶこともある。 発症要因としては、 内膜の変性及び脆弱化 （窶胞状中膜壊死、 動脈硬化など） に加え、 大動脈の拡張、 高血圧なども指摘されている。
胸痛を訴える代表的な疾患としては、 急性心筋梗塞が挙げられる。 急性心筋梗 塞は、 心電図の変化や血液生化学検査を行うことによりそれほど困 ¾を伴うこと なく診断することが可能である。 これとは対称的に、 解離性大動脈 は、 致命率 が高いにもかかわらず、 心電図や血液検査では特異的な変化がほとんど観察され ないことから、 その診断には細心の注意を要求される。
従来、 解離性大動脈瘤の診断方法としては、 エコー検査、 CT (X線コンビュ —夕一トモグラフィー） 、 DSA (デジタル'サブトラクシヨン 'アンジォグラ フィ一） 、 MR I (マグネテック · レゾナンス 'イメージング） などが試みられ、 それぞれ一定の成果を挙げている （Common D i s e a s e
Se r i e s 4 ：狭心症 ·心筋梗塞、 310〜 313頁、 南江堂発行） 。 しか しな力《ら、 いずれの方法も特別の装置を必要とし、 どこでも、 いつでも行えるこ とが前提となる緊急検査に用いる方法としては必ずしも満足できるものではなか つ 7こ o
したがって、 本発明は、 緊急検査にも適用可能な解離性大動脈瘤の検出方法と それに使用する試薬の提供を主目的とするものである。 発明の開示
本発明者らは、 解離性大動脈瘤などの血管の障害を伴う疾患においては、 血管 を構成する物質が血中に遊離してくることを予想し、 詳細な検討を行った。 その 結果、 血管の主要な構成夕ンパク質である平滑筋ミォシン重鎖を検出することに より血管の障害を診断できるとの結論に至った。
平滑筋ミォシン重鎖は骨格筋ミォシン重鎖、 心筋ミォシン重鎖及び非筋型ミォ シン重鎖とは生化学的に異なること力、ら、 平滑筋ミォシン重鎖に特異的な抗体を 取得することは比較的簡単である。 そこで、 平滑筋ミオシン重鎖に対する抗体を 作製し、 血液中の平滑筋ミオシン重鎖を検出できるアツセィ系を確立した。 この アツセィ系を用いて健常人血清を測定したところ、 血清中の平滑筋ミオシン重鎖 は低値を示すに過ぎなかった。 一方、 解離性大動脈瘤の患者血清を測定したとこ ろ、 臨床症状をよく反映した平滑筋ミオシン重鎖の有意な上昇が観察され、 血液 中の平滑筋ミオシン重鎖の測定が解離性大動脈瘤の検出に有用であることを確認 し、 本発明を完成させた。
したがって、 本発明は、 平滑筋ミオシン重鎖に対する抗体を含有する、 解離性 大動脈瘤を検出するための抗体試薬に関するものである。
また、 本発明は、 平滑筋ミオシン重鎖に対する抗体試薬と、 界面活性剤を含む 洗浄液とを含有する解離性大動脈瘤を検出するためのキッ トに関するものである。 さらに、 本発明は、 サンプル中の平滑筋ミオシン重鎖を測定し、 得られた測定 値から解離性大動脈瘤を検出する方法に関するものである。
さらに、 本発明は、 解離性大動脈瘤を検出するための、 平滑筋ミオシン重鎖に 対する抗体の使用に関するものである。
図面の簡単な説明
図 1は、 標準曲線を示したものである。
図 2〜図 7は、 界面活性剤の効果を検討した結果を示したものである。
図 8は、 希釈直線性を検討した結果を示したものである。
図 9は、 交叉反応性を検討した結果を示したものである。
図 1 0は、 患者血清中の平滑筋ミオシン重鎖を測定した結果を示したものであ る。 図 1 1は、 患者血清中の平滑筋ミオシン重鎖を測定した結果を示したものであ る。
発明を実施するための最良の形態
( 1 ) 抗体試薬
本発明の抗体試薬は、 被検サンプル中の平滑筋ミオシン重鎖をィムノアッセィ により測定し、 得られた測定値から解離性大動脈瘤を検出する方法に使用するも のである。 このため、 本発明の抗体試薬は、 少なくとも平滑筋ミオシン重鎖に特 異的な抗体を含むことになる。
本発明の抗体試薬に使用する抗体としては、 平滑筋ミォシン重鎖に特異的に結 合するものであればポリクローナル抗体及びモノクロ一ナル抗体のいずれでもよ く、 またそれらの抗体は公知のものでよく、 特に限定されない。 特に、 他のミオ シンに交差反応性が小さいものを使用するのが好ましい。 具体的には、 後述の実 施例に示すような、 他のミオシンとの交叉反応性が 3 %未満、 好ましくは 1 %未 満のモノクローナル抗体を使用することにより、 サンプル中の平滑筋ミオシン重 鎖を特異的に測定することができる。
このようなモノクローナル抗体は、 後述の実施例に示すように公知の方法を適 宜応用することにより容易に調製することができる （たとえば 「免疫生化学研究 法 （続生化学実験講座 5 ) 」 、 日本生化学会編、 ！〜 8 8頁 （1 9 8 6年） 、 Bi ochemi s try, 27, 3807-3811 (1988) 、 Eur. J. Bi ochem , 179， 79- 85(1989)、 J. Mol. Bi ol. , 198, 143- 157(1987) 、 J. Bi ol. Chem. , 264, 9734-9737(1989), J. Biol. Chem. , 264, 18272-18275(1989) 、 J. Bi ol. Chem， 266， 3768- 3773(1991)、 Ci rculat ion, 88, 1804-1810(1993) など参照） 。
使用する抗体は、 抗体そのものであってもよいが、 非特異的な吸着を防止する 意味から抗体の活性フラグメントを使用するのが好ましい。 抗体の活性フラグメ ントは、 抗体の特徴を保持するもの 〔たとえば、 F ( a ） 2 、 F a b ' 、 F a bなどの各種フラグメント〕 であればいずれのものであってもよい。 これら 活性フラグメントの調製は、 精製抗体をパパイン、 ペプシン、 トリプシンなどの プロテアーゼを用いて限定分解する方法など公知の方法を適用して行うことがで きる （たとえば 「免疫生化学研究法 （続生化学実験講座 5 ) 」 、 日本生化学会編、 8 9頁 （ 1 9 8 6年） 参照） 。
抗体試薬としては、 溶液状または凍結乾燥状の抗体を使用することができ、 ま た必要により測定システムに適合した形態 （たとえば、 固相化抗体、 標識化抗体 など） に修飾したものを抗体試薬としてもかまわない。
抗体の修飾は常法に従って行うことができる。 すなわち、 固相化抗体を調製す る際に使用する担体の材質としては、 たとえばポリ塩化ビニル、 ポリスチレン、 スチレンージビニルベンゼン共重合体、 スチレン一無水マレイン酸共重合体、 ナ ィロン、 ポリビニルアルコール、 ポリアクリルァミ ド、 ポリアクリロニトリル、 ポリプロピレン、 ポリメチレンメタクリレー卜などの合成有機高分子化合物、 デ キストラン誘導体 （セフアデックスなど） 、 ァガロースゲル （セファロ一ス、 ィォゲルなど） 、 セルロース （ペーパーディスク、 濾紙など） などの多糖類、 ガ ラス、 シリカゲル、 シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げられ、 これらはァ ミノ基、 アミノアルキル基、 カルボキシル基、 ァシル基、 水酸基などの官能基を 導入したものであってもよい。 なお、 担体の材質は蛋白質の結合能の高いものが 好ましい。
担体の形状は、 平板状 （マイクロタイタ一プレー卜、 ディスクなど） 、 粒子状 (ビーズなど） 、 管状 （試験管など） 、 繊維状、 膜状、 微粒子状 （ラテックス粒 子など） 、 カプセル状、 小胞体状などが例示され、 測定法に応じた適宜な形状の 担体を選択することができる。 また、 リボソーム （単層または多層の脂質膜） な ども抗体を固定するための担体として使用することもできる。
抗体と担体との結合は、 物理的吸着法、 イオン結合法、 共有結合法、 包括法な ど公知の方法 （たとえば、 「固定化酵素」 （千畑一郎編、 昭和 5 0年 3月 2 0日、 (株） 講談社発行） 参照） を採用することができる。 とりわけ、 物理的吸着法は 簡便である点で好ましい。 また、 上記結合は、 直接行ってもよく、 両物質の間に 他の物質を介して行ってもよい。
標識化抗体を調製する際に使用する標識剤としては、 放射性同位体 （たとえば 3 2 P、 3 H、 ' 4 C、 1 2 5 Iなど） 、 酵素 （たとえば ^一ガラクトシダーゼ、 ペル ォキシダーゼ、 アルカリホスファターゼ、 グルコース一 6—リン酸デヒドロゲナ —ゼ、 カタラーゼ、 グルコースォキシダーゼ、 乳酸ォキシダーゼ、 アルコールォ キシダーゼ、 モノアミンォキシダーゼなど） 、 補酵素 '補欠分子族 （たとえば、 FAD、 FMN、 ATP、 ピオチン、 ヘムなど） 、 フルォレセイン誘導体 （たと えば、 フルォレセインイソチオシァネート、 フルォレセインチオフルバミル など） 、 ローダミン誘導体 （たとえば、 テトラメチルローダミン Bイソチオシァ ネートなど） 、 ゥムベリフエロンおよび 1—ァニリノ一 8—ナフタレンスルホン 酸などの蛍光色素、 ルミノーノレ誘導体 （たとえば、 ノレミノ一ル、 イソルミノール、 N— (6—ァミノへキシル） 一N—ェチルイソルミノールなど） 、 金、 銀、 白金 またはそれらの金属の化合物などのコロイド状金属粒子などを用いることができ る。
抗体と標識剤との結合は、 成書 〔たとえば、 「続生化学実験講座 5免疫生化学 研究法」 （株） 東京化学同人、 （ 1 986年発行） 第 1 02〜 1 1 2頁〕 に記載 されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。
(2) 検出用キット
本発明の検出用キットは、 被検サンプル中の平滑筋ミオシン重鎖をィムノアツ セィにより測定し、 得られた測定値から解離性大動脈瘤を検出する方法に使用す るためのものである。 このため、 キッ卜の構成試薬としては、 少なくとも上述し た本発明の抗体試薬を含有し、 さらに界面活性剤を含む洗浄液が構成試薬として 添付されていることを特徴とする。
本発明の検出用キッ卜に添付する抗体試薬としては、 上述した抗体試薬の中か らキッ卜で採用するィムノアッセィ法に好適な形態のもの （例：固相化抗体、 標 識化抗体など） を適宜選択し、 それをキットに添付すればよい。
洗浄液に添加する界面活性剤としては、 水溶性のものであれば特に制限されず、 特に両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤が好ましい。 より具体的に両性 界面活性剤としては、 卵黄リゾレシチン等を例示することができ、 非ィォン性界 面活性剤としては、 Twe e n系 （Twe e n 20、 同 40、 同 60、 同 80、 同 85など） 、 S p a n系 （S p a n 20、 同 80、 同 85、 同 80など） 、 B r i j系 （B r i j 35、 同 58など） 、 （n) p— tーォクチルフヱニルェ 一テル系 （Tr i t o nCF— 1 0、 同 N— 1 0 1、 同 X— 1 00、 同 X— 1 1 4、 同 X— 305、 同 X— 405、 Non i d e t P— 40など） 等を例示する ことができる。 界面活性剤の添加量は、 0 . 0 0 3 % (wZ v ) 以上が適当であ る
このような界面活性剤を添加した洗浄液を本発明の検出用キッ卜に添付し、 こ れをァッセィ時に使用することにより、 サンプル中の平滑筋ミオシン重鎖をより 高感度に測定することが可能となる。
上記以外の試薬は、 採用したアツセィ法で通常使用されている試薬 （標準抗原 液、 酵素溶液、 基質溶液、 反応停止液、 検体希釈液など） の中から測定システム に応じて適当なものを適宜選択して本発明の検出用キットに添付すればよ 、。 本発明の検出用キッ卜で採用するアツセィ法としては、 ィムノアツセィで採用 されている公知方法であれば特に制限されず、 競合法、 サンドイッチ法、 凝集法、 ブロット 'オーバレイ法、 ィムノクロマ卜グラフ法などいずれのアツセィ法も採 用することができる。
採用したアツセィ法における測定手段の詳細に付いては、 たとえば下記の文献 を参照すればよい。
(a) 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （ （株） 講談社、 昭和 5 4年 5月 1 日発行）
(b) 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （ （株） 医学書院、 1 9 8 2年 1 2月 1 5日発行）
(c) 臨床病理 臨時増刊 特集第 5 3号 「臨床検査のためのィムノアツセィー技 術と応用一」 （臨床病理刊行会、 1 9 8 3年発行）
(d) 「バイオテクノロジ一事典」 （ （株） シーエムシー、 1 9 8 6年 1 0月 9日 発行）
(e) 特公平 6— 4 3 9 9 8号公報、 特開昭 5 5— 1 5 1 0 0号公報、 特公平 7 - 6 0 1 5 9号公報および特開昭 6 3— 2 5 5 5 3号公報
(f) 「Methods in ENZY 0L0GY Vol. 70」 （I腿 unochemi cal techni ques
(Part A))
(g) rMethods in ENZY 0L0GY Vol. 73j (Immunochemi cal techniques
(Part B))
(h) rMethods in ENZY 0L0GY Vol. 74 j ( Immunochemi cal techniques (Part O)
( i) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 84」 ( Immunochemi cal techniques (Part D:
Selected Immunoassay) )
(j) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 92」 ( Immunochemi cal techniques (Part E: Monoclonal Ant i bodies and General Immunoassay Methods))
[ ( f ) 〜 （ j ) はァカデミックプレス社発行]
アツセィ法の中でも好適な方法の一つであるサンドィツチ法を例に挙げ、 更に 本発明の検出用キットを説明すれば、 たとえば以下に示すキット Aを例示するこ とができる。
キット A；
①固相化第一抗体
②第二抗体
③標識化抗ィムノグロプリン抗体
④既知濃度の抗原
⑤洗浄液 （界面活性剤含有）
キット Aの第二抗体と標識化抗ィムノグロプリン抗体の代わりに標識化第二抗 体を使用することができ、 そのようなキットとしては次のキット Bが例示される。 キット B；
①固相化第一抗体
②標識化第二抗体
③既知濃度の抗原
④洗浄液 （界面活性剤含有）
このような構成試薬から構成されるキッ卜は、 例えば 1時間以内に測定結果を 出すための迅速ァッセィに好適である。
さらに、 ビォチン一アビジン法を採用した場合には、 キット Cが例示される。 キット
①固相化第一抗体
②ビォチン化第二抗体
③標識化アビジン ④既知濃度の抗原
⑤洗浄液 （界面活性剤含有）
なお、 上記の各キッ卜において、 「抗体」 とは平滑筋ミオシン重鎖に対する抗 体であり、 「抗原」 とは平滑筋ミオシン重鎖であることは言うまでもない。 また、 「第一抗体」 と 「第二抗体」 は平滑筋ミオシン重鎖上の同一の抗原決定基を認識 するものであってもよく、 異なつた抗原決定基を認識するものであってもよい。 上述の検出用キットを使用した被検サンプル中の平滑筋ミォシン重鎖の測定法 は、 サンドイッチ法を採用した他の公知の検査用キッ卜と何等変わるところがな い。 すなわち、 固相化抗体試薬と被検サンプルを反応させ、 必要により B F分離 後、 さらに （標識化） 抗体試薬を反応させる (ツーステップ法) 力、、 固相化抗体 試薬、 被検サンプル及び （標識化） 抗体試薬を同時に反応させ （ワンステップ 法） 、 反応後いずれの場合でも標識剤に応じたそれ自体公知の方法によりサンプ ル中の平滑筋ミォシン重鎖を検出または定量することができる。
( 3 ) 検出方法
本発明の検出方法は、 サンプル中の平滑筋ミオシン重鎖を測定し、 得られた測 定値から解離性大動脈瘤を検出しょうとするものである。
測定対象の被検サンプルとしては、 解離性大動脈瘤の疑いのある患者、 すなわ ち胸痛を訴える患者から （経時的に） 採血した血液、 またはその分画物 （血清な ど） である。 被検サンプルは、 必要により P B Sなどの適当な緩衝液にて希釈し て測定に使用してもかまわない。
血液サンプル中の平滑筋ミォシン重鎖の検出または定量は、 前述した本発明の 抗体試薬または検出用キットを使用して行えばよい。
測定の結果、 健常人の平均含有量を有意に越える平滑筋ミォシン重鎖が血液サ ンプル中に含まれている場合には、 血液サンプルを採血した患者は解離性大動脈 瘤である可能性が極めて高いと判断し、 更なる精密検査を行う必要がある。 また、 血液サンプル中の平滑筋ミォシン重鎖含有量が健常人の含有量と統計的に差がな い場合には、 血液サンプルを採血した患者は解離性大動脈瘤ではない可能性が高 いと判断し、 別の角度からの再検査が必要となる。
実施例 以下、 実施例を示し、 本発明を具体的に説明するが、 これにより本発明は限定 されない。
実施例 各種ミオシンの調製
ヒト子宮平滑筋ミオシン、 ヒト大動脈平滑筋ミオシン、 ヒト血小板ミオシン及 びヒト骨格筋ミオシンは佐賀医科大学、 松村先生より分与された。 ヒト心筋ミオ シンは矢崎の方法 （Circ. Res.，36:208, 1975 ) により精製した。 各種ミオシンと も SDS— PAGEにより純度を確認後、 ローリー法 （J. Biol. Cheni, 193:265- 2 75, 1951 ) によりゥシ血清アルブミンを標準物質としてタンパク定量を行い、 濃 度を求めた。 尚、 いずれのミオシンも重鎖と軽鎖から構成されているものである。 実施例 2. モノクローナル抗体の作製
1) モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマの作製
ヒト子宮平滑筋ミオシン 25〜50 fi gをフロインド完全アジュバントと共に、 6〜 8週令の B A LB/cマウスに、 2〜 4週間おきに 4〜 7回腹腔内に投与し、 最後にヒト子宮平滑筋ミオシン 1 0 / gを静脈内投与した。
最終免疫から 3日後にマウスの脾臓を摘出し、 この脾臓細胞とマウス骨髄腫細 胞 P 3 x 6 3 Ag 8 U. 1 (P 3 U 1 ) (ATCC CRL— 1 5 9 7 ) を 1 0 ： 1で混合後、 遠心分離して得たペレツ卜に、 50 %ポリエチレングリコー ル含有 RPMI 1 640溶液 1 m 1を徐々に加えて細胞融合を行った。 さらに R PM I 1 640培地を加えて 1 0 m 1とし、 遠心分離して得たぺレットを 1 0 % ゥシ胎児血清 （FCS) 含有 RPMI 1 640培地に P3 U 1として 3 x 1 04 個 /0. 1 m 1となるように懸濁させ、 96ゥヱルマイクロブレートに各ゥヱル 0. 1m lずつ分注した。
1日後、 HAT培地を0. 1ml添加し、 その後 3〜 4日おきに培地の半分量 を新しい H A T培地で交換した。
融合後？〜 1 0日目に培養上清をサンプリングし、 あらかじめヒト子宮平滑筋 ミオシンでコートし、 3%ゼラチンでブロッキングしてある 96ゥヱルポリ塩化 ビニル （PVC) プレートに 50〃 1添加し室温で 1時間反応させた。 P B Sで 3回洗浄後、 ピオチン化ゥマ抗マウス I gG (ベクター社製） を 1 %ゥシ血清ァ ルブミン （BSA) 含有 PBSで 1ノ 500に希釈した溶液を、 50〃 1ずつ分 注し室温で 1時間静置した。 PBSで 3回洗浄後、 ペルォキシダーゼ一アビジン D (ベクター社製） を 1 %BSA含有 PBSで 1ノ 2 0 0 0に希釈した溶液を、 5 0 / 1ずつ分注し室温で 1 5分間静置した。 P B Sで 3回洗浄後、 基質溶液 (4—ァミノアンチピリン， 0. 2 5 mg/m 1、 フエノール， 0. 2 5 mg/ m l, 0. 4M過酸化水素） 2 0 0〃 1を加え室温で発色させた。 マイクロプレ —トフォトメーターを用いて 5 5 0 nmにおける吸光度を測定し、 ヒ卜子宮平滑 筋ミオシンに特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを選択し ナ：。
このようにして選択した各ハイプリ ドーマは限界希釈法によりクロ一ニングを 行いヒ ト子宮平滑筋ミオシンに対する抗体産生ハイプリ ドーマ 5株 （1 H 6， 4 E 1 2, 9 A 1 2, 9 D 7, 1 0 G 2 ) を樹立した。 この中で、 ハイプリ ドーマ 1 H 6とハイプリ ドーマ 4 E 1 2は、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研 究所に SMHMWl H 6および SMHMW4 E 1 2としてブタぺスト条約に基づ き 1 9 9 4年 1 0月 1 3日に国際寄託され、 1 9 94年 1 0月 1 3日付けで受託 番号として FERMBP— 4 8 2 9および FERMBP— 4 8 3 0が付与されて いる。
上記の実験において、 目的とするモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを得 た割合いをゥヱル数に基づいて示すと表 1のようになる。
表 1 ：モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマの割合い
Figure imgf000012_0001
2) モノクローナル抗体の調製及び精製
次に、 樹立した各ハイプリ ドーマを培養し、 あらかじめプリスタンを投与して あるマウスの腹腔内に 1匹当り 3 X 1 06 個を投与した。 約 2週間後マウス 1匹 当り 5 m 1の腹水を採取した。 3 M塩化ナトリウム含有 1. 5 Mグリシン塩酸緩衝液， PH8. 9にて平衡化 した、 プロテイン Aセファロース CL— 4 B (フアルマシア社製） カラムに、 等 量の同グリシン塩酸緩衝液と混合した腹水を流した。 充分量の同グリシン塩酸緩 衝液で洗浄後、 0. 1Mクェン酸緩衝液 （PH6. 0) にて抗体を溶出した。 溶 出液を PB Sにて透析後、 SDS—ポリアクリアミ ドゲル電気泳動 （SDS -PAGE) にて純度を確認し、 精製モノクローナル抗体とした。
実施例 3. モノクローナル抗体の性質
1) アイソタイプ
ヒト子宮平滑筋ミオシンをコートし、 3 %ゼラチンでプロッキング処理してあ る 96ゥヱル PVCプレートに各ハイプリ ドーマの培養上清を添加し、
MonoAb— I D E I Aキッ ト （ザィメッ ド社製） を用いて抗体のアイソタ イブの検索を行った。
結果は表 2に示した通りである。
表 2 ：モノクローナル抗体のアイソタイプ
Figure imgf000013_0001
2) ウェスタンブロッテイングによる特異性の解析
各モノクローナル抗体の特異性をウェスタンプロッティングにより解析した。 ヒト子宮平滑筋ミオシン lmgZm lを同量の還元処理液を加えて 1 00 °Cで 5分間加熱処理した。 SDS— PAGEは、 1 0%分離ゲル、 5 %濃縮ゲルを用 い、 ミニゲル電気泳動装置 （マリソル社製） で 1 0mV、 約 3時間、 行った。 ブ ロッテイングはミニゲル用ブロッテイング装置 （マリソル社製） を用い、 37V で約 1 8時間通電してニトロセルロース膜にタンパク質を転写させた。 このニト ロセルロース膜を試料の泳動ラインに沿って短冊状に切断し、 一部はアミ ドプラ ックを用いてタンパク質を染色した。 残りは 3%ゼラチンでブロッキング後、 各 ハイプリ ドーマの培養上清と室温で 1時間反応させた。
0. 0 5%ツイーン 20含有 2 OmMトリス、 5 00 mMN a C I、 pH 7. 5緩衝液 （T一 TB S) で 1 0分ずつ 2回洗浄後、 ピオチン化ゥマ抗マウス I gG (ベクタ一社製） の 1 / 5 0 0希釈液と室温で 1時間反応させた。 T 一 TBSで 1 0分ずつ 2回洗浄後、 ペルォキシダーゼ一アビジン D (ベクター社 製） の 1 2 00 0希釈液と室温で 1 5分間反応させた。 T— TBSで 1 0分ず つ 2回洗浄後、 発色液 （HRP発色試薬 （バイオラッ ド社製） 3 Omg、 メタノ ール 1 0m l、 TB S 5 Om 3 0 %過酸化水素水 3 0 〗含有） にて発色後、 蒸留水で洗浄した。
アミ ドブラックによるタンパク染色の結果、 2 0 0 K (子宮平滑筋ミオシン重 鎖） 、 1 4 0 K (子宮平滑筋ミオシン重鎖のフラグメント） 、 7 0 K (子宮平滑 筋ミオシン重鎖のフラグメント） 、 2 0 K (子宮平滑筋ミオシン軽鎖） 、 1 7 K (子宮平滑筋ミオシン軽鎖） 5本のバンドがみられた。
ウェスタンブロッテイングではいずれのモノクローナル抗体もヒ ト子宮平滑筋 ミオシン重鎖に反応し、 軽鎖には反応しないことが確認された。
実施例 4. サンドイッチ法を利用した検出用キッ ト
1) ビォチン化抗体の調製
上記各モノクローナル抗体を 0. 1M炭酸水素ナトリウム溶液に ^析後、 セン トリフロー （アミコン製） により 2 mgZm 1まで濃縮した。 ピオチン （ロング アーム） NHS試薬 （ベクター社製） を 1 OmgZm Iになるようにジメチルフ オルムアミ ドに溶解し、 その 20 ^ 1と上記抗体溶液 1 m 1を混合し、 室温で 2 時間反応させた。 エタノ一ルァミン 5 / 1を加え反応を止めた後、 1の P B Sに 2回透析し、 ピオチン化抗体を得た。 このピオチン化抗体を 1 %B S A含有 ?83で1 8//1111に希釈し、 ピオチン化抗体溶液を得た。
2) 固相化抗体の調製
抗平滑筋ミオシン重鎖モノクローナル抗体 （4 E 1 2) を PBSで 1 0〃gZ m lに希釈し、 96ゥエルプレート （Hタイプ：住友べ一クライト社製） に 50 〃 1ずつ分注し、 4 °Cでー晚静置した。 0. 0 5%Twe e n 20含有 PBSで 3回洗浄後、 0. 5%スキムミルクを 3 0 0〃 1ずつ分注し、 室温で 1時間静置 した。 スキムミルク溶液を除去し、 固相化抗体試薬を得た。
3) その他の試薬の調製およびキッ卜の調製
'平滑筋ミオシン重鎖標準液；
ヒト大動脈平滑筋ミオシンを重鎖の濃度として 2 5， 1 2. 5, 6. 2 5， 3. 1 2 5, 1. 5 63， 0. 7 8 1， 0. 3 9 1 n g/m 1となるように 1 %B S A含有 P B Sで希釈して調製した。
•洗浄液；
Twe e n 2 0を PBSに 0. 0 5% (w/v) になるように溶解させて調製 した。
·酵素標識アビジン溶液；
ペルォキシダ一ゼ標識アビジン D (A— 2 0 0 4 ：べクター社製） を 1 % 83八含有？83で1// 5 0 0 0に希釈して調製した。
•基質溶液；
0. 2Mクェン酸緩衝液 （pH 3. 8) に 3， 3' ， 5, 5， ーテトラメチル ベンチジン二塩酸塩 （TMBZ) が 0. 3mM、 過酸化水素水が 0. 0 0 5 % (w/w) になるように溶解させて調製した。
•酵素反応停止液；
1 N硫酸を用いる。
上記各試薬を 1つのキッ卜に添付し、 本発明の検出用キットを調製した。
実施例 5
1 ) 標準曲線
固相化抗体試薬 （4 E 1 2) の各ゥエルに 1 %BSA含有 PBSを 1 00 // 1 ずつ分注後、 平滑筋ミオシン重鎖標準液を 5 0 u 1ずつ分注し撹拌後、 室温で 4 時間静置した。 洗浄液で 3回洗浄後、 ピオチン化抗体 （ 1 H 6 ) 溶液を 50 ^ 1 ずつ分注し、 室温で 3 0分間静置した。 洗浄液で 3回洗浄後、 酵素標識アビジン 溶液を 5 0 1ずつ分注し、 室温で 1 5分間静置した。 洗浄液で 3回洗浄後、 基 質溶液を 1 0 0 1ずつ分注し、 室温で 1 0分間静置して発色させた。 酵素反応 停止液を 1 0 0 1ずつ加えて反応を停止させ、 マイクロプレートフオ トメータ 一を用いて 4 5 0 nmにおける吸光度を測定した。 得られた標準曲線を図 1に示 す。
2 ) 界面活性剤の効果
上記 1) の操作法において、 Twe e n 20の洗浄液への添加量につき検討し た結果、 図 2に示すように、 0. 003 % (w/v) 以上の濃度で測定感度を著 しく高めることができることが明らかとなつた。
また、 Twe e n 20以外の各種界面活性剤の効果を Tw e e n 20の場合と 比較検討した。 すなわち、 洗浄液に各種界面活性剤を 0. 05% (w/v) とな るように添加し、 標準曲線を作成した。 その結果、 図 3〜7に示されているよう に、 両性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を洗浄液に添加することにより、 Twe e n 20と同様に顕著な効果が得られることが判明した。
3) 再現性
上記 1) の操作法に準じ、 3種類の検体 （A、 B及び C) を用いて同時再現性 及び測定日間再現性を検討した。 その結果、 表 3及び 4に示すように、 いずれの 再現性においても CV値が 1 0%以内となり、 良好な再現性を示すことが明らか となった。
表 3 同時再現性
Figure imgf000017_0001
表 4 測定日間再現性
Figure imgf000017_0002
) 希釈直線性
上記 1) の操作法に準じ、 患者血清 3例 （Mi l, M2 5及び M3 2) を標準 （O nZm l ) で希釈し、 希釈直線性を検討した結果、 図 8に示すようにいず れの場合も原点を通る直線となり、 良好な希釈直線性を示すことが明らかとなつ た。
5 ) 添加回収
上記 1 ) の操作法に準じ、 患者血清 （検体 M l 4及び 2 4 ) に標準液を添加し て回収率を検討した結果、 表 5に示すように添加した量をほぼ回収できた。
表 5 添加回収試験
Figure imgf000018_0001
6 ) 交叉反応性
上記 1 ) の操作法に準じ、 各種ミオシンとの交叉反応性を検討した。 その結果、 図 9に示すように、 子宮平滑筋ミォシンおよび大動脈平滑筋ミォシンとは同等に 反応するが、 骨格筋ミオシン、 心筋ミオシンおよび血小板ミオシン （非筋型ミオ シン） とはほとんど反応しないことが確認された。
7 ) 健常人血清の測定
上記 1 ) の操作法に準じ、 健常人血清 7 5例の平滑筋ミオシン重鎖濃度を測定 した結果、 平均 0. 9 11 8 //111 1、 標準偏差0. 9 n gZm lであった。
8 ) 患者血清の測定
上記 1 ) の操作法に準じ、 解離性大動脈瘤患者 2例の発症時から経時的に採取 した血清中の平滑筋ミオシン重鎖濃度を測定した。 その結果、 図 1 0および 1 1 に示すように、 発症時に平滑筋ミォシン重鎖濃度の顕著な上昇が確認され、 解離 性大動脈瘤の検出または診断における平滑筋ミオシン重鎖の測定の有用性が示さ れた。 なお、 解離性大動脈瘤の確定診断は術中所見で行われた。
産業上の利用可能性
被検サンプル中の平滑筋ミォシン重鎖を測定することにより解離性大動脈瘤を 検出できることは、 本発明者らによって初めて見いだされたことであり、 しかも 検出方法としてィムノアツセィを採用していることから、 従来の方法とは異なり 何等特別な装置を必要とせず、 解離性大動脈瘤の緊急検査にも適用可能なもので あ
また、 本発明の抗体試薬および検出用キットは、 本発明の検出方法を実施する ために必須のものであり、 しかも抗体としてモノクローナル抗体を使用し、 洗浄 液として特定の界面活性剤を含有するものを使用するならば、 より高感度に被検 サンプル中の平滑筋ミォシン重鎖を検出することができ、 緊急検査はもとより治 療中や予後の経過観察にも利用することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
I. 平滑筋ミオシン重鎖に対する抗体を含有する、 解離性大動脈瘤 （大動脈解 離） を検出するための抗体試薬。
2. 抗体が固相化抗体である、 請求の範囲第 1項記載の試薬。
3. 抗体が標識化抗体である、 請求の範囲第 1項記載の試薬。
4. 抗体がモノクローナル抗体である、 請求の範囲第 1項記載の試薬。
5. 請求の範囲第 1項記載の抗体試薬と、 界面活性剤を含む洗浄液とを含有す る、 解離性大動脈瘤 （大動脈解離） を検出するためのキット。
6. 抗体が固相化抗体である、 請求の範囲第 5項記載のキット。
7. 抗体が標識化抗体である、 請求の範囲第 5項記載のキッ ト。
8. 抗体がモノクローナル抗体である、 請求の範囲第 5項記載のキット。
9. サンプル中の平滑筋ミオシン重鎖を測定し、 得られた測定値から解離性大 動脈瘤 （大動脈解離） を検出する方法。
10. 平滑筋ミォシン重鎖の測定に請求の範囲第 1項記載の試薬を使用する、 請 求の範囲第 9項記載の方法。
I I. 平滑筋ミオシン重鎖の測定に請求の範囲第 5項記載のキットを使用する、 請求の範囲第 9項記載の方法。
12. 解離性大動脈瘤 （大動脈解離） を検出するための、 平滑筋ミオシン重鎖に 対する抗体の使用。
13. 抗体が固相化抗体である、 請求の範囲第 1 2項記載の使用。
14. 抗体が標識化抗体である、 請求の範囲第 1 2項記載の使用。
15. 抗体がモノクローナル抗体である、 請求の範囲第 1 2項記載の使用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6270744B1 (en) 1996-02-19 2001-08-07 Yamasa Corporation Diagnostic agent for angiopathic diseases

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009091581A2 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Vatrix Medical, Inc. Diagnostic biomarkers for vascular aneurysm
JP6555711B2 (ja) * 2015-05-22 2019-08-07 公立大学法人横浜市立大学 非解離性大動脈瘤の疾患活動性の判定方法
US20190049464A1 (en) * 2016-02-16 2019-02-14 Public University Corporation Yokohama City University Blood biomarker for detecting arteriosclerosis
US20180192916A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-12 General Electric Company Imaging system for diagnosing patient condition

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60201260A (ja) * 1984-03-27 1985-10-11 Yamasa Shoyu Co Ltd 心疾患診断薬
JPH02219596A (ja) * 1989-12-09 1990-09-03 Yamasa Shoyu Co Ltd 心筋ミオシン重鎖に対する単一クローン抗体
WO1990011520A1 (fr) * 1989-03-28 1990-10-04 Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha Anticorps contre une chaine lourde de myosine des muscles lisses
JPH03505874A (ja) * 1988-06-13 1991-12-19 セントコー・インコーポレーテッド 心筋梗塞の危険決定方法
JPH05148160A (ja) * 1991-11-28 1993-06-15 Toshiba Corp 心筋特異性を有するｍｒｉ造影剤
JPH05176790A (ja) * 1990-02-21 1993-07-20 Mercian Corp 脳ミオシンに対するモノクローナル抗体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6028998A (ja) * 1983-07-06 1985-02-14 Yamasa Shoyu Co Ltd 心筋ミオシン重鎖に対する単一クロ−ン抗体
AU2696395A (en) * 1994-06-03 1996-01-04 St. Luke's-Roosevelt Hospital Center A purified 80 kda protein implicated in abdominal aortic aneurysms, antibodies directed thereto, and uses thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60201260A (ja) * 1984-03-27 1985-10-11 Yamasa Shoyu Co Ltd 心疾患診断薬
JPH03505874A (ja) * 1988-06-13 1991-12-19 セントコー・インコーポレーテッド 心筋梗塞の危険決定方法
WO1990011520A1 (fr) * 1989-03-28 1990-10-04 Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha Anticorps contre une chaine lourde de myosine des muscles lisses
JPH02219596A (ja) * 1989-12-09 1990-09-03 Yamasa Shoyu Co Ltd 心筋ミオシン重鎖に対する単一クローン抗体
JPH05176790A (ja) * 1990-02-21 1993-07-20 Mercian Corp 脳ミオシンに対するモノクローナル抗体
JPH05148160A (ja) * 1991-11-28 1993-06-15 Toshiba Corp 心筋特異性を有するｍｒｉ造影剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP0782863A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6270744B1 (en) 1996-02-19 2001-08-07 Yamasa Corporation Diagnostic agent for angiopathic diseases

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