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WO1996011972A1 - Procede de degradation enzymatique de polymere synthetique - Google Patents

Procede de degradation enzymatique de polymere synthetique Download PDF

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WO1996011972A1
WO1996011972A1 PCT/JP1994/001714 JP9401714W WO9611972A1 WO 1996011972 A1 WO1996011972 A1 WO 1996011972A1 JP 9401714 W JP9401714 W JP 9401714W WO 9611972 A1 WO9611972 A1 WO 9611972A1
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WO
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polymer compound
enzyme
manganese
synthetic polymer
decomposing
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PCT/JP1994/001714
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Inventor
Tomoaki Nishida
Tetsuya Deguchi
Yoshimasa Takahara
Original Assignee
Kabushiki Kaisha Kobe Seiko Sho
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J11/00—Recovery or working-up of waste materials
    • C08J11/04—Recovery or working-up of waste materials of polymers
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for decomposing a synthetic polymer compound using an enzyme, and the method of the present invention provides an effective means for solving a plastic waste treatment problem which is currently a major social problem. provide.
  • the decomposition product obtained by the decomposition method of the present invention is expected to have a new industrial application. Background art
  • Synthetic polymer compounds are widely used because of their convenience, but when they are turned into waste, they are not originally incorporated into natural ecosystems, so they are hardly degraded and pose a major environmental problem. It has become.
  • a method for decomposing synthetic high-molecular compounds (1) As a method for decomposing polyamide-based high-molecular compounds, a method using bacteria (Flavobacterium sp. KI72) is known [Agr. Biol. Chem., 3 9 (6), 1 2 1 9 to 1 2 3 (1 7 7); Fermentation Engineering. 60 (5). 3 6 3 to 3 7 5 (1 9 8 2)]
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 49-55740 discloses a biodegradable composition in which starch granules are dispersed in a thermoplastic synthetic resin so as to be susceptible to biological attack.
  • the method using bacteria described in (1) above is a method for treating a water-soluble low molecular weight nylon 6 oligomer having a molecular weight of about 200 or less, for example, a water-insoluble high molecular weight nylon having a molecular weight of about 1000 or more.
  • the mouth cannot be decomposed and it is necessary to reduce the molecular weight by some method in advance.
  • wood-rotting basidiomycetes have the ability to degrade not only lignin and cellulose but also synthetic polymer compounds.
  • Japanese Unexamined Patent Application Publication Nos. Hei 5-309468 and Hei 6-77083 disclose that wood-decaying basidiomycetes, especially white-rotting basidiomycetes, that is, lignin-degrading bacteria, such as polyamide-polyolefin, etc. It describes that the synthetic polymer compound of the above is well decomposed.
  • An object of the present invention is to provide a method for studying wood-rotting basidiomycetes in more detail, and for decomposing a synthetic polymer compound to reduce the molecular weight more efficiently. Disclosure of the invention
  • Mn-P manganese-dependent peroxidase
  • the present invention is a method for decomposing a synthetic polymer compound in the presence of manganese ion using manganese-dependent peroxidase. According to this method, it is not necessary to use microorganisms that are complicated to handle, and there is no mixture of substances harmful to the enzymatic reaction. Therefore, synthetic polymer compounds (nylon, polyethylene, polyester, polystyrene) are not required. , Polyurethane, polypropylene, etc.) can be more efficiently decomposed by enzymes. Furthermore, the decomposition of the synthesized high molecular compound by Mn-P of the present invention does not require the coexistence of hydrogen peroxide, which is advantageous in terms of cost in industrial applications. In addition, although it is generally considered that hydroquinic acid is indispensable for the reaction of Mn-P, the method of the present invention does not require hydroxy acid, but rather acts as an inhibitor. .
  • the present invention is a method wherein the above-mentioned decomposition method is carried out in the presence of at least one additive selected from the group consisting of phosphoric acid, succinic acid, and fumaric acid, and salts thereof. This further promotes the decomposition of the synthetic polymer compound.
  • the concentration of manganese ions present in the reaction system is preferably 0.1 to 10 mM.
  • the concentration of phosphoric acid present in the reaction system is preferably 2 to 4 OmM, more preferably 3 to 3 OmM, and still more preferably 5 to 2 OmM. mM.
  • the concentration of succinic acid present in the reaction system is preferably 2 to 300 mM, more preferably 3 to 250 mM, and still more preferably 5 to 2 mM. 0 O m I [.
  • the present invention further provides a method for producing a reaction system comprising:
  • It is preferably 70 to 1200 mM, more preferably 100 to 200 mM.
  • the present invention exerts particularly excellent effects when the synthetic polymer compound is a boriamid-based polymer compound or a polyolefin-based polymer compound.
  • the present inventors separated and purified the components of the wood-rotting basidiomycete NK-148 strain, which are involved in the decomposition of the polyamide-based molecular compound, and studied. It was found that the decomposition of the polyamide polymer was catalyzed by Mn-P. Similarly, the components involved in the decomposition of the polyolefin-based polymer were separated and purified and examined. The decomposition of the polyolefin-based polymer was also catalyzed by Mn-P. Was found.
  • Mn-P was obtained from wood-decaying basidiomycetes such as Fanelocate chrysosporium var. Mushrooms and NK-114, a lignin-degrading bacterium that is a wood-decaying basidiomycete (FER ⁇ BP-1859). Several types are produced. The details of the bacteriological properties of the NK-1148 strain are disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-259180.
  • Mn-P has been conventionally known as an enzyme that oxidatively decomposes lignin-related substances.
  • Mn-P is used for these polyamide-based and polyolefin-based polymer compounds. Catalysis of decomposition has never been considered before It was not possible.
  • Mn - P is hydrogen peroxide, Mn S 0 4, and 2.
  • ABT S lactate 2 '- azino-bis (3 - E chill benzothiazolyl Hmm 6- Suruhone Ichito)
  • Enzyme solution 101 is added to 1 ml of a reaction solution containing 20 mM succinate buffer (pH 4.5), 50 mM sodium lactate, 80 g of ABT S. Gelatin 3 Omg, and hydrogen peroxide is added to 100 ml. And reacted at room temperature. Then, the increase in absorbance at 4 I 5 nm was measured. Enzyme activity is defined as an increase in absorbance per minute of 0.01 as one unit.
  • Four types of NK-4 have been found in Mn-P produced from NK-1148. Next, this purification method will be described. I do.
  • Mn-P produced by the NK-1148 strain is mainly secreted outside the cells, the culture filtrate from which the cells have been removed by centrifugation or the like in liquid culture, and from the culture in solid culture.
  • the extracted solution can be purified by treating it with ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange, or the like.
  • the metal salt solution two Application Benefits port triacetate:. 1 5 g, N a C 1:. 1 0 g, F e SO, ⁇ 7 ⁇ 2 O: l OO mg, C o S . 0.: l OO m g C a C l 2: 8 2 mg, Z n SO «: 1 0 0 mg, C u S 0 * - 5 H 2 0: 1 0 mg, A 1 K (S 0 4 ) 2 : 10 mg, NaMo 0: 10 mg dissolved in 1 liter of distilled water.
  • the vitamin solution is defined as: biotin: 2 mg, folic acid: 2 mg, thiamine hydrochloride: 5 mg, riboflavin: 5 mg, pyridin hydrochloride: 10 mg, cyanocobalamin: 0.1 mg, Nicotinic acid: 5 mg Calcium tontoate: 5 mg dissolved in 1 liter of distilled water.
  • the above medium was inoculated with NK-114, and cultured at 28 ° C for 4 hours with shaking. After completion of the culture, the culture was centrifuged to remove the cells, subjected to ultrafiltration, and strained to obtain a crude enzyme solution.
  • this crude enzyme solution was separated and purified using Fast Protein Liquid Chromatography (FPC) manufactured by Pharmacia. That is, the above crude enzyme solution was adsorbed on a Mon0Q column (manufactured by Pharmacia) buffered with 1 Oml [phosphate buffer solution (pH 6.0), and the NaCl-containing 1 OmM phosphate buffer (NaCl) was added. It was eluted with NaCl by applying an ionic strength gradient of 10 to 500 mM using pH 6.0). The flow rate at this time is 1. O ml Z minutes. By this elution, fractions 1 and 2 exhibiting Mn-P activity were collected.
  • FPC Fast Protein Liquid Chromatography
  • the molecular weight was measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the molecular weight of each of NK-1 to NK-4 was about 43000 ⁇ 5000.
  • NK-1 is at pH 4.6
  • NK-2 is at pH 4.3
  • NK-3 is at pH 3.7
  • NK-4 is at pH 3.7.
  • the pH was around 3.4.
  • NK-1, NK-2, and NK-4 showed the maximum absorption at around 407 nm, and NK-3 showed the maximum absorption at around 417 nm, respectively.
  • Met. The optimal pH is determined by measuring the activity of each of NK-1 to 4 using a 5 OmM acetate buffer (pH 3.5 to 5.0). The pH was around 4-4.5.
  • Measurement of optimum temperature is carried out more on measuring the enzyme activity by changing the temperature conditions, resulting optimum temperature rarely in even 3 0-4 around 5 e C any enzyme.
  • each enzyme of NK-1 to 4 was released in 20 mM acetate buffer (pH 4.5) at each temperature of 20 to 60 ° C for 10 minutes, and then the enzyme activity was measured. Was measured. As a result, all enzymes were stable to heat of up to 45.
  • HF IP hexafluoroisobrovanol
  • GPC gel filtration chromatography
  • the weight average molecular weight of the nylon before the enzyme treatment was 85,000, and the number average molecular weight was 500000.
  • the average molecular weight of the Niopene before the enzyme treatment was, as in Experiment 1, the weight average molecular weight was 85,000 and the number average molecular weight was 50,000.
  • the polyethylene decomposition product after the decomposition reaction was dissolved in benzene with trichloride, and the molecular weight was measured by high-temperature GPC.
  • GPC using a Waters column HT linear first and ultra Styler Jiweru 5 0 0, using trichloroacetic port benzene as the eluent, flow rate 1 m 1 Z min, carried out at a temperature 1 3 5 e C, the eluate Detected by RI.
  • the average molecular weight was calculated using a polystyrene standard.
  • Table 4 shows the average molecular weights of the polyethylene degradation products after the treatment.
  • the weight average molecular weight of the polyethylene before the enzyme treatment was 125,000, The molecular weight is 2900.
  • the average molecular weight of the polyethylene before the enzyme treatment was, as in Experiment 1, a weight average molecular weight of 1,250,000 and a number average molecular weight of 2,900,000. .
  • the enzyme that is involved in the decomposition of the synthetic polymer compound is specified, and the decomposition reaction is catalyzed by the enzyme, so that the enzyme is decomposed unlike the case where the cells are used for the decomposition. It is possible to prevent a substance that inhibits the protease-decomposition reaction from being mixed, thereby enabling the enzymatic reaction to be performed effectively.
  • the reaction conditions suitable for the enzyme can be selected regardless of the growth conditions of the bacteria, and the synthetic polymer compound can be degraded more efficiently.
  • the optimum growth temperature for viable bacteria is 28 to 37, and it was not possible to raise the temperature to the optimum for the decomposition reaction in the past, but it is possible to react at a high temperature of 40 C by using enzymes. It becomes possible.
  • the reaction mixture D shown in Table 2 above was used as the reaction solution, the NK-4 was used as Mn-P, and NK-4 was added to 0.5 ml of the reaction mixture D 1.5 and 1 respectively. It was added to give 5,150 units. These were decomposed under the same reaction conditions as in Experiment 1 above. The reaction time was 48 hours and 96 hours.
  • the higher the enzyme concentration the faster the decomposition rate of Nymouth. Therefore, the reaction rate can be improved by increasing the enzyme concentration.
  • the degradation rate can be arbitrarily selected by adjusting the enzyme concentration.
  • the concentration indicated for the substance to be added indicates the final concentration.
  • the concentrations of the respective additives were as shown in Table 7 below, and each was adjusted to pH 4.3 with Na a. To each of these additives, 1 mM of MnSO ⁇ and 1 mM of 2,6-dimethoxyphenol were added, and 0.2 unit of the enzyme NK-4 was added. Further, hydrogen peroxide was added to a concentration of 0.1 mM to start the reaction. The reaction volume is 0.5 ml.
  • ⁇ 2 ⁇ 0 Minatodo showed good degradation effects 5.
  • Nylon was decomposed most favorably when KH a PO and portability were 1 OmM.
  • the phosphates usable in the present invention include the above
  • phosphates such as sodium phosphate and ammonium phosphate can also be used.
  • Mn S 0 was fixed at a concentration of I mM, and succinic acid concentrations were set to various concentrations shown in Table 10, and a nylon decomposition experiment was performed under the same reaction conditions as in Experiment 1 described above. NK-4 was used as the enzyme. Then, under the same analysis conditions as in Experiment 1, the average molecular weight of the nylon degradation product was examined by GPC. Table 9 shows the results.
  • nS 0 was fixed at a concentration of 1 mM, and the acetic acid concentration was adjusted to various concentrations shown in Table 10; NK-4 was used as the enzyme. Then, under the same analysis conditions as in Experiment 1 above, the average molecular weight of the nylon degradation product was examined by GPC. The results are shown in Table 10.
  • the concentration of MnSO * was 0.1 mM or more, Nyopen was successfully decomposed, and when it was 1 mM, Niron was most suitably decomposed. If the concentration of MnSO is too high, the decomposition of manganese ion is worsened, so the upper limit of manganese ion is preferably set to 100 mM. The upper limit should be 1 OmM.
  • any type of manganese salt can be used as long as manganese ions are added.
  • Manganese ions usable in the present invention include manganese sulfate, manganese chloride and manganese acetate, as well as manganese carbonate and manganese phosphate. Various manganese compounds such as cancer can be used.
  • Mn-P produced by Phanerochaete chrysosporium also decomposes Naipin well.
  • Mn-P produced from NK-1148 strain was used, but as can be seen from experiment 11, the origin of Mn-P is limited to NK-1148 strain. Instead, Mn-P produced from various wood-rotting basidiomycetes may be used. Further, Mn-P produced from another bacterium may be used, and further, Mn-P synthesized may be used.
  • the use of the method for decomposing a synthetic polymer compound by the enzyme of the present invention greatly contributes to the treatment of plastic waste, which is currently a social problem.

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Description

明細害 酵素による合成高分子化合物の分解方法 技術分野
本発明は、 合成高分子化合物を酵素を用いて分解する方法に関す るものであり、 本発明の方法は、 現在大きな社会問題となっている プラスチック廃棄物の処理問題の解決に有効な手段を提供する。 ま た本発明の分解方法により得られる分解産物は、 それ自身新たなェ 業的用途が期待されるものである。 背景技術
合成高分子化合物はその利便性ゆえに広く用いられているが、 そ れが廃棄物となったとき、 元々自然の生態系に組入れられるもので はないため、 殆んど分解を受けず大きな環境問題となっている。 合成高分子化合物の分解技術のうち、 ①ポリアミ ド系高分子化合 物を分解する方法としては、 細菌 （Flavobacterium sp. KI72) を 用いて行う方法が知られている [Agr. Biol. Chem. , 3 9 ( 6 ) , 1 2 1 9〜 1 2 2 3 ( 1 9 7 5 ) ；発酵工学. 6 0 ( 5 ) . 3 6 3 〜 3 7 5 ( 1 9 8 2 ) ]
また、 ②特開昭 4 9 - 5 5 7 4 0には、 熱可塑性合成樹脂に澱粉 粒を分散させて、 生物学的攻撃を受けやすく した生物分解性組成物 が開示されている。
しかしながら、 上記①の細菌を用いる方法は、 分子量約 2 0 0 0 以下の水溶性低分子ナイロン 6オリゴマーを処理する方法であつ て、 例えば分子量約 1 0 0 0 0以上の水不溶性の高分子ナイ口ンを 分解することはできず、 予め何らかの方法で低分子化する必要があ つ o
また、 上記②の特開昭 4 9— 5 5 7 4 0の生物分解性組成物で は、 生物分解を受けるのは澱粉粒だけであって、 合成高分子化合物 樹脂は分解されず、 単に見掛け上崩壌するに止まり、 合成樹脂その ものは微粒として残存するという問題があった。
他方、 木材腐朽性担子菌はリグニンやセルロースだけでなく合成 高分子化合物を分解する作用も有していることは既に示唆されてい る。 例えば特開平 5 - 3 0 4 9 6 8 , 特開平 6 - 7 0 7 8 3には、 木材腐朽性担子菌のうち特に白色腐朽生担子菌、 即ちリグニン分解 菌が、 ポリアミ ドゃポリオレフィ ン等の合成高分子化合物をよく分 解することが記載されている。
本発明は木材腐朽性担子菌について更に詳細に検討し、 より効率 的に合成高分子化合物を分解して低分子化する方法を提供すること を目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 木材腐朽性担子菌の産生する酵素に着目し、 合成 高分子化合物がこの酵素により良く分解されるということを見出 し、 更に種々検討の結果本発明の完成に至った。 上記有用酵素とし て特に注目されるのはマンガン依存性のパーォキシダーゼ （以下、 M n— Pと称することがある） であり、 この酵素を単離し、 以下に 示す発明を得た。
本発明は、 マンガン依存性のパーォキシダーゼを用いて、 マンガ ンイオンの存在下で合成高分子化合物を分解するという方法であ る。 この方法によれば、 取扱いが煩雑な微生物を用いなくても良 く、 また酵素反応に有害な物質の混在もなくなり、 従って合成高分 子化合物 （ナイロン. ポリエチレン. ポリエステル， ポリスチレ ン， ボリウレタン， ポリプロピレン等） の分解を酵素によってより 効率的に行うことができる。 更に、 本発明の M n— Pによる合成高 分子化合物の分解には、 過酸化水素の共存が格別必要ではないの で、 工業的応用においてコスト面で有利である。 また、 M n— Pの 反応には一般になーヒ ドロキン酸が不可欠とされているが、 本発明 の方法においてはな一ヒ ドロキシ酸を必要とせず、 むしろ阻害物質 として作用するという見地を得た。
また本発明は、 上記分解方法をリ ン酸， コハク酸. 詐酸もしくは それらの塩よりなる群から選択される少なく とも 1種の添加剤の存 在下で行うという方法である。 このことによって、 合成高分子化合 物の分解が一層促進される。
また本発明は、 木材腐朽性担子菌から分離されたマンガン依存性 のパーォキシダーゼを用いて行うと、 より良好な桔果が得られる。 更にまた本発明は、 N K— 1 1 8株から分離されたマンガン依 存性のパーォキシダーゼを用いて行うと、 特に良好な結果が得られ る。
更にまた本発明は、 phanerochaete chrysosporium から分離され たマンガン依存性のバーオキシダ一を用いて行うと、 大変良好な結 果が得られる。
更にまた本発明は、 上記反応系に存在するマンガンイオンの濃度 が 0 . 1〜 1 0 mMであるのが好ましい。
更にまた本発明は、 上記反応系に存在する リ ン酸の濃度が 2〜 4 O m Mであるのが好ましく、 より好ましく は 3〜3 O m Mであ り、 更に好ましくは 5〜2 O mMである。
或いは更に本発明は、 上記反応系に存在するコハク酸の '濃度が 2〜 3 0 0 m Mであるのが好ましく、 より好ましくは 3〜2 5 0 m Mであり、 更に好ましくは 5〜2 0 O m I [である。 もしく は更に本発明は、 上記反応系に存在する酢酸の濃度が
7 0〜 1 2 00 mMであるのが好ましく、 より好ましくは 1 00〜
8 0 OmMであり、 更に好ましくは 200〜7 0 OmMである。 更に本発明は、 上記合成高分子化合物がボリアミ ド系高分子化合 物或いはボリオレフィン系高分子化合物である場合に特に優れた効 果を発揮する。 発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 木材腐朽性担子菌の NK - 1 1 4 8株が持ってい る成分のうち、 ポリアミ ド系髙分子化合物の分解に関与する成分に ついて分離 ·精製を行い検討したところ、 ポリアミ ド系高分子化合 物の分解は Mn— Pにより触媒されていることを見いだした。 また 同様に、 ポリオレフィ ン系高分子化合物の分解に関与する成分につ いて分離 ·精製を行い検討したところ、 ポリオレフィ ン系高分子化 合物の分解も、 同じく Mn— Pにより触媒されていることを見いだ した。
以下に、 Mn— Pについて説明する。
Mn— Pは、 ファネロケーテ · クリソスポリゥムゃ力ワラタケ等 の木材腐朽性担子菌から、 又木材腐朽性担子菌であるリグニン分解 菌の NK— 1 1 48株 （F E R ^ B P - 1 8 5 9 ) から、 数種類 産生される。 尚、 N K - 1 1 4 8株の菌学的性質の詳細について は、 特開平 2 - 2 59 1 80号に開示されている。
Mn - Pはリグニン関連物質を酸化分解する酵素として従来より 知られていた。 しかしボリアミ ド系高分子化合物やポリオレフィ ン 系高分子化合物が上記リグニン関連物質とは全く異なった化学構造 を持つ物質であるので、 Mn - Pがこれらポリアミ ド系及びポリオ レフィ ン系高分子化合物の分解を触媒することは従来では全く考え られないことであった。
Mn - Pは、 過酸化水素、 Mn S 04 、 及び乳酸塩の存在下で 2. 2 '-アジノ ビス （3 -ェチルベンゾチアゾリ ンー 6—スルホネ 一ト） （以下、 ABT Sと称す） に作用させると、 4 1 5 nm付近 に極大吸収を示す着色化合物を生成するので、 この 4 1 5 nmにお ける吸光度を測定するこ とにより、 Mn— P活性の測定を行う
[Jeffrey k. Glenn and icheael H. Gold: Arch. Biochem.
Biophys. , 242,329-341 (1985) ] 。
次に、 Mn— P活性の測定法について具体的に説明する。
20 mMコハク酸緩衝液 （p H 4. 5) , 50mM乳酸ナトリウ ム， ABT S 80 g. ゼラチン 3 Omgを含む反応液 1 m 1に、 酵素液 1 0 1を加え、 過酸化水素を 1 00 となる様に添加 し、 室温で反応させた。 そして 4 I 5 nmにおける吸光度の增加を 測定した。 酵素活性は 1分間の吸光度の増加 0. 0 1を 1単位とし
N K - 1 1 4 8から産生される Mn— Pには、 NK— 1 , NK— 2, NK- 3. NK— 4の 4種が見出されているが、 次にこ の精製法について説明する。
NK- 1 1 48株が産生する Mn— Pは主として菌体外に分泌さ れることから、 液体培養においては菌体を遠心分離等で除去した培 養濾液を、 また固体培養においては培養物から抽出した抽出液を、 夫々硫安分画、 ゲル濾過、 イオン交換等の手段で処理することによ り精製できる。
次に実際に行った調製方法について説明する。
まず表 Iに示す組成の培地 1 リ ッ トルを 5リッ トル容三角フラス コに入れ、 1 20でで 1 5分間加熱殺菌した。 【表 1】
培地組成 グルコース 1 0. 0 g
KH2 P 0 , 1. 0 g
N a H 2 P O 4 0. 2 g
M g S 04 · 7 H 2 0 0. 5 S
Mn S 0 · 5 H 2 0 4 8. 0 m e
金厲塩溶液 1. 0 m 1
ビタ ミ ン溶液 0. 5 m 1
イオン交換水 9 9 8. 5 m 1
尚表 1 中、 金属塩溶液とは、 二 ト リ 口三酢酸 ： 1 . 5 g、 N a C 1 ： 1 . 0 g , F e S O , · 7 Η 2 O : l O O m g , C o S 0. ： l O O m g. C a C l 2 : 8 2 m g、 Z n S O « ： 1 0 0 mg、 C u S 0 * - 5 H 2 0 ： 1 0 mg、 A 1 K ( S 04) 2 ： 1 0mg、 N aM o 0 ： 1 0 m gを蒸留水 1 リ ッ トルに溶解し たものである。 またビタ ミ ン溶液とは、 ビォチン ： 2 mg、 葉酸 ： 2 m g、 チアミ ン塩酸塩 ： 5 m g、 リボフラビン ： 5 m g、 ピリ ジ ン塩酸塩 ： 1 0mg、 シァノ コバラ ミ ン ： 0. l mg、 ニコチン酸 ： 5 m g ノ、 'ン トテン酸カルシウム ： 5mgを蒸留水 1 リ ッ トルに 溶解したものである。
そして上記培地に NK— 1 1 4 8を接種し、 2 8 °Cで 4曰間振と う培養した。 培養終了後、 培養液を遠心分離して菌体を除去し、 限外濂過を行 つて漉縮して粗酵素液を得た。
次に、 この粗酵素液をフ アルマシア社製の F P L C (Fast Protein Liquid Chromatography:高速タンパク質分取装置） を用い て分離精製を行った。 即ち 1 Oml [リン酸緩銜液 （pH 6. 0) で 緩衝化した Mo n 0 Qカラム （フアルマシア社製） に上記粗酵素液 を吸着させ、 NaC 1を含む 1 OmMリ ン酸緩衝液 （pH6. 0) を用いて Na C lで 1 0〜500 mMのイオン強度勾配をかけて溶 出させた。 この際の流速は 1. O m l Z分である。 この溶出に より M n - P活性を示す画分 1及び画分 2を回収した。 次に、 Mo n 0 P HR 5 5カラム （フアルマシア社製） を用いたクロマ トフオーカシ ング、 即ちカラムを 25mM—ピペラジン一 HC 1 (P H 6. 0) で平衡化し、 それぞれの活性画分を吸着させ、 1 0 倍希釈 P B E 74 (Poly Buffer 74〉 （H C 1で p H 3. 0に調整） で溶出した。 この際の流速は 0. 5m lノ分で行った。 こうして 4 種類の酵素 NK - 1. NK- 2. NK- 3. NK - 4を分離精製し た。
次に NK— 1〜 4の理化学的性質について述べる。
分子量の測定は、 S D S -ボリアクリルアミ ドゲル電気泳動法に て行い、 NK— 1〜4の分子量はいずれも約 43000 ± 5000 であつた。
等電点は、 クロマ トフ オーカシ ングの溶出 p Hより測定を行 い、 NK— 1は pH 4. 6、 NK— 2は pH 4. 3、 NK— 3は P H 3. 7、 NK- 4は pH3. 4付近であった。
吸収スペク トルと しては、 NK— 1 , NK— 2 , NK- 4は 407 nm付近に、 また NK— 3は 4 1 7 nm付近に夫々極大吸収 を示し、 いずれの酵素も F e含有酵素であった。 至適 p Hの測定は、 5 OmM酢酸緩衝液 （p H 3. 5〜5. 0) を用いて NK— 1〜 4の各酵素活性を測定することにより行い、 い ずれの酵素も至適 P Hは 4〜4. 5付近であった。
p H安定性については、 2 O mM酒石酸緩衝液 （p H 2. 5〜 3. 5) 、 2 0mM酢酸緩衝液 （pH 3. 5〜5. 5) 及び 20m Mリ ン酸緩衝液 （ρ Η 5 · 8〜8) 中に ΝΚ— 1〜 4の各酵素を 4 O eCで 1 0分間放置後、 酵素活性を測定することにより判定し た。 その結果、 安定な p Hの範囲はいずれの酵素も p H 3. 5〜 5. 5付近であった。
至適温度の測定は、 温度条件を変えて酵素活性を測定することに より行い、 その結果至適温度はいずれの酵素も 3 0〜4 5eC付近で めった。
温度安定性については、 2 0〜6 0°Cの各温度で NK - 1〜4の 各酵素を 2 O mM酢酸緩衝液 （p H 4. 5) 中に I 0分間放匱後、 酵素活性を測定した。 その桔果、 いずれの酵素も 4 5でまでの熱に 安定であった。
くナイロン及びボリエチレンに対する Mn - Pの影響
(実験 1 ) 〉
次に、 Mn— Pをナイロン及びボリエチレンに反応させた場合に ついて説明する。 【表 2】 反応混合液
成分組成
A B C D n S04 (mM) 0. 0 1. 0 0. 0 1. 0
KH2 POH (mM) 0. 0 0. 0 10. 0 10. 0 ツイーン 80 (%wt/wt) 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 酢酸緩衝液 （mM) 40 40 40 40
上記表 2に示す組成の各反応混合液 A〜D 0. 5mlに、 ナイ口 ン 66膜 （ザルト リウス社製ナイロン 66メ ンブレンフィルター） またはポリエチレン膜 （旭化成社製 PE— 1 1 00) を 1 mgそれ ぞれ加え、 上記精製した酵素 NK - 1〜4を各々 し 5単位加えて 40°Cで 48時間反応させた。
反応終了後、 ナイ口ン分解産物をへキサフルォロイソブロバノー ル （以下、 HF I Pと称す） に溶解し、 ゲル濾過クロマトグラフィ 一 （以下、 G PCと称す） で分子量を測定した。 G PC制定に際し て、 力ラムは昭和電工製カラム H F I P— 80Mを用い、 溶離液と して H F I Pを用い、 流速 1 m 1 Zm i n、 温度 40。Cで行い、 溶 出液を示差屈折計 （R I ) にて検出した。 平均分子量は、 ポリメチ ルメタクリ レートスタンダードを用いて計算した。 表 3に処理後の ナイロン分解産物の平均分子量を示す。 尚、 酵素処理前のナイロン の重量平均分子量は 85 000、 数平均分子量は 500 00であ る。 尚、 以下に記載するナイロン分解処理の各実 においても、 酵 素処理前のナイ口ンの平均分子量は、 実験 1と同様、 重量平均分子 量が 85000、 数平均分子量が 50000である。 【表 3】
Figure imgf000012_0001
また、 分解反応処理後のポリエチレン分解産物をトリクロ口ベン ゼンに溶解し、 高温 G P Cで分子量を測定した。 G P Cに際して は、 ウォーターズ社製カラム H Tリニア一及びウルトラスタイラ ジヱル 5 0 0を用い、 溶離液としてトリクロ口ベンゼンを用いて、 流速 1 m 1 Z m i n、 温度 1 3 5 eCで行い、 溶出液を R Iにて検出 した。 平均分子量はポリスチレンスタンダードを用いて計算した。 表 4に処理後のポリエチレン分解産物の平均分子量を示す。 尚、 酵 素処理前のポリエチレンの重量平均分子量は 1 2 5 0 0 0、 数平均 分子量は 2 9 0 0 0である。 尚、 以下に記載するポリエチレン分解 処理の各実験においても、 酵素処理前のポリエチレンの平均分子量 は、 実験 1 と同様、 重量平均分子量が 1 2 5 0 0 0、 数平均分子量 が 29 0 00である。
【表 4】
Figure imgf000013_0001
表 3. 表 4から分かる様に、 ナイロン又はポリエチレンは NK— 1〜 4で処理することにより相当程度分解されている。 特に Aに対 して Bを、 また Cに対して Dを、 更に Bに対して Dを夫々比較検討 すれば、 Mn S 04 や KH2 P 0, を反応液に添加したものは、 よ り良好な分解能を発揮することが分かる。
この様に合成高分子化合物の分解に閲与する酵素を特定して、 そ の酵素によって分解反応を触媒させる様にしたので、 分解の為に菌 体を用いる場合と異なり、 当該酵素を分解するプロテアーゼゃ分解 反応を阻害する物質の混在を防ぐことができ、 酵素反応を有効に行 わせることができる。 更に菌の生育条件に左右されず、 酵素に適し た反応条件を選択でき、 より効率的に合成高分子化合物を分解する ことができる。 例えば生菌は 2 8〜3 7でが最適生育温度であり、 従来では分解反応に最適な温度に上げることができなかったが、 酵 素を用いることで 4 0 Cの高温で反応させることが可能となる。
ぐ酵素濃度の影響 （実験 2 ) >
次に、 反応液に添加する酵素 （M n - P ) 量の影饗に付いて検討 した。
反応液として上記表 2に示した反応混合液 Dを用い、 M n— Pと して上記 N K— 4を用い、 反応混合液 D 0 . 5 m lに、 N K— 4を それぞれ 1 . 5 , 1 5， 1 5 0単位になる様に添加した。 これらを 上記実験 1 と同様の反応条件でナイ口ンの分解を行った。 尚反応時 間は 4 8時間、 及び 9 6時間とした。
その後、 ナイ口ン分解産物について、 上記実験 1 と同様の分析条 件で G P Cにより平均分子量を調べた。 その結果を下記表 5に示 す。 【表 5】
Figure imgf000015_0001
上記表 5から分かる様に、 酵素濃度が高いほどナイ口ンの分解速 度が速い。 従って酵素濃度を高めることで反応速度の向上が図れ る。 また酵素濃度を加減することで、 分解速度を任意に選択するこ とができる。
ぐ各種添加剤の影簪 （実験 3 ) >
M n— Pの酵素反応には α —ヒ ドロキシ酸が必要であることが一 般に知られており、 事実、 リ グニン関連物質の分解に際しては なーヒ ドロキシ酸が不可欠である。 しかし下記に示す様に、 合成高 分子化合物の分解に際しては a -ヒ ドロキン酸は必要ではなく、 む しろ阻害的に働く ということが分かった。
実験 3では、 α —ヒ ドロキシ酸として乳酸， リンゴ酸， グリコー ル酸， クェン酸， 酒石酸を用い、 その他の酸として酢酸， コハク 酸， リ ン酸を用い、 これら添加剤の影響について調べた。
次に実験 3の方法について述べる。 以下、 加える物質について示 す濃度は終濃度を示す。
1 O m M及び 5 0 m Mの上記各種添加剤をそれぞれ N a O Hで p H 4. 3に調整した。 これらそれぞれの添加剤 0. 5m lに、 M n S 04 を I mMとなる様に加え、 更にナイ ロ ン 6 6膜を 1 mg、 及び酵素 NK - 4を 1. 5単位加えて、 40eCで 48時間 反応させた。
反応終了後、 上記実験 1と同様の分折条件による G Pじで、 ナイ ロン分解産物の平均分子量を調べた。 その結果を表 6に示す。
また良好な効果が現れたリ ン酸 1 OmMの反応液について、 更に 検討すベく、 Mn S 04 I mMを含むリ ン酸 1 0 mMに、 乳酸を 50 mMとなる様に加え、 上記と同様にナイロン 66膜に NK— 4 を加えて、 4 OeCで 48時間反応させた。 そして同様にナイロン分 解産物の平均分子量を調べた。 その結果を表 6に併せて示す。
【表 6】 添加剤 重量平均分子量 数平均分子量 乳酸 1 OmM 85000 50000
5 OmM 84000 49000 リンゴ酸 1 OmM 85000 49000
5 OmM 85000 50000 グリコール酸 1 OmM 84000 50000
5 OmM 84000 49000 クェン酸 1 OmM 84000 49000
5 OmM 85000 49000 酒石酸 1 OmM 85000 50000
5 OmM 85000 50000 酢酸 1 OmM 75000 40000
5 OmM 72000 38000 コハク酸 1 OmM 0 c ο o υ π π υ π υ ^ Q ϋ Λ U Λ U Π U
5 OmM 45000 25000 リン酸 1 OmM 38000 22000
5 OmM 76000 42000 リン酸 10 mM
85000 50000
+乳酸 5 OmM
上記表 6から分かる様に、 ーヒ ドロキシ酸の添加はナイ口ン分 解には全く無効であり、 リン酸を 1 OmM添加した塡合が最も良好 に分解した。 またリ ン酸 1 OmMに乳酸を加えた場合はナイロンが 分解しておらず、 乳酸が阻害剤として働いていることが分かる。
< リグニン関連物質分解における各種添加剤の影響
(比較実験 4) >
上記実験 3の比校として、 リグニン関連物質である 2. 6—ジメ トキシフヱノ一ルを基質として用い、 Mn— Pによる酸化分解の際 の各種添加剤の影響について調べた。 添加剤には、 上記実験 3と同 様に、 α—ヒ ドロキン酸として乳酸， リ ンゴ酸， グリコール酸， ク ェン酸， 酒石酸を用い、 その他の酸として酢酸. コハク酸. リン酸 を用いた。
次に実験 4の方法について述べる。
上記各添加剤を下記表 7に示す濃度とし、 それぞれを N a ΟΗで p H 4. 3に調整した。 これらそれぞれの添加剤に、 Mn SO< を 1 mM、 2, 6—ジメ トキシフエノールを 1 mMとなる様に加え、 酵素 NK - 4を 0. 2単位添加した。 更に過酸化水素を 0. I mM となる様に添加し、 反応を開始した。 尚反応液は 0. 5m lであつ
2. 6—ジメ トキシフヱノールが酸化されると、 469 nmの吸 収が增加するので、 反応液の 469 nmにおける吸光度を測定し、 その増大量をもって酵素活性とした。 反応開始 5分後の反応液の吸 光度を下記表 7に示す。 尚表中、 コ ン トロールは酵素 NK— 4を添 加しない場合を示す。 【表 7】
Figure imgf000019_0001
* コ ン ト ロールは酵素無添加 上記表 7から、 リグニン関連物質を M n— Pにより分解するには α —ヒ ドロキシ酸が必要であることが分かる。 このことから合成高 分子化合物を分解する系とリグニン関連物質を分解する反応系は、 異なったものであることが分かる。
尚、 上記実験 4に際し、 反応開始剤である過酸化水素を添加しな い場合は、 4 6 9 n mでの吸収の增加はなかった。 従ってリグニン 関連物質の分解には過酸化水素も必要であることが分かる。
<リ ン酸濃度の影響 （実験 5 ) >
添加剤であるリン酸の添加濃度について検討した。 Mn S O< 濃度 I mMで固定し、 KH2 P O♦ '濃度を表 8に示 す。 種々の澳度とし、 他は上記実験 1と同様の反応条件としてナイ ロンの分解実験を行った。 そして実験 1と同様の分析条件で、 ナイ ロン分解産物の平均分子量を GP Cで調べた。 その結果を表 8に示 す。
【表 8】
Figure imgf000020_0001
上記表 8に示す結果から分かる様に、 ΚΗ2 Ρ 0 港度が 5. 1 0' 2 OmMで良好な分解効果を示した。 また KHa PO, 港度 が 1 OmMのときに最も良好にナイロンを分解した。 尚、 本発明において利用でき る リ ン酸塩と しては、 上記
KH2 P 04 の他に、 リ ン酸ナ トリウムやリ ン酸アンモニゥム等の 各種リン酸塩も利用できる。
<コハク酸濃度の影響 （実験 6) >
添加剤であるコハク酸の添加濃度について検討した。
Mn S 0 , 濃度 I mMで固定し、 コハク酸濃度を表 1 0に示す 種々の濃度とし、 他は上記実験 1 と同様の反応条件としてナイロン の分解実験を行った。 酵素には NK— 4を用いた。 そして実験 1 と 同様の分析条件で、 ナイロン分解産物の平均分子量を G P Cで調べ た。 その結果を表 9示す。
【表 9】
Figure imgf000021_0001
上記表 9から分かる様に、 実験を行った各濃度においていずれも 良好にナイロンを分解し、 1 0, 2 0, 5 0. 1 0 0, 2 0 0 mM の場合はより良好に分解し、 5 O mMの場合が最も良好にナイ口ン を分解した。 ぐ酢酸濃度の影響 （実験 7) >
添加剤である酢酸の添加濃度について検討した。
n S 0, 濃度 1 mMで固定し、 酢酸濃度を表 1 0に示す種々の 濃度とし、 他は上記実験 1 と同様の反応条件としてナイ口ンの分解 実験を行った。 酵素には NK— 4を用いた。 そして上記実験 1 と同 様の分析条件で、 ナイ ロ ン分解産物の平均分子量を G P Cで調べ た。 その桔果を表 1 0に示す。
【表 1 0】
Figure imgf000022_0001
上記表 1 0から分かる様に、 実験を行った各濃度においていずれ も良好にナイ ロ ンを分解し、 1 0 0 , 2 0 0 , 4 0 0, 8 0 0 mM の場合はより良好に分解し、 4 0 0 mMの場合が最も良好にナイ口 ンを分解した。
<マンガンイオンの影響 （実験 8) >
マンガンイオンを反応系に存在させる場合の影響について、 他の 各種金属イオンと比較して調べた。
1 0 mMの K H 2 P 0 , を含む 4 O mM酢酸緩衝液 （ p H 4. 3 ) にマンガン （Π) . 亜鉛 （Π) , コバル ト （Π) . 鉄 (Π) の各金属イオンが ImMとなる様に硫酸塩として添加し、 ナ ィロ ン 6 6膜を l mg、 及び酵素 NK - 4を 1. 5単位加えて、 40でで 48時間反応させた。 尚反応液は 0. 5mlである。
反応終了後、 上記実験 1と同様の分析条件で、 ナイ口ン分解産物 の平均分子量を G P Cで調べた。 その結果を表 1 1に示す。
【表 1 1】
Figure imgf000023_0001
上記表 1 1から明らかな様に、 マンガンイオンの存在はナイロン 分解にとって非常に重要であり、 他の金属イオンでは代替えが不可 能であった。
<マンガンイオン濃度の影響 （実験 9) >
反応液に混合するマンガンイオンの濃度の影響について検討し た。
まず KH2 P 0, 濃度を 1 OmMで固定し、 Mn S O, 濃度を下 記表 1 2に示す種々の濃度として、 他は上記実験 1と同様の反応条 件でナイ口ンの分解実験を行った。 そして実験 1と同様の分析条件 で、 ナイ ロン分解産物の平均分子量を G P Cで調べた。 その結果を 表 1 2に示す。 【表 1 2】
Figure imgf000024_0001
上記表 1 2から分かる様に、 Mn SO* 濃度が 0. 1 mM以上で あればナイ口ンを良好に分解し、 更に 1 mMの場合が最も良好にナ イロンを分解した。 尚、 Mn S O の濃度があまり高くなると、 却 つてナイ口ン分解が悪くなっていることから、 マンガンイオンの上 限は 1 0 0 mMとすると良く、 更に工業上の利用の観点からマンガ ンイオンの上限は 1 OmMとすると良い。
<各種マンガン塩の影饗 （実験 1 0 ) >
上記の様な硫酸マンガンだけでなく、 他のマンガン塩についてナ ィ口ン分解に及ぼす影響を調べた。 1 0 mM K H 2 P 0 , 及び 0. l wt/wt %ツイーン 8 0を含む 40 mM胙酸緩衝液 （p H 4. 3) に、 塩化マンガンまたは酢酸マ ンガンを下記表 1 3に示す濃度となる様に加え、 更にナイロン 6 6 膜を 1 mg、 及び酵素 NK - 4を 1. 5単位加えて、 4 0eCで 4 8 時間反応させた。 尚反応液は 0. 5m lである。
反応終了後、 上記実験 1 と同様の分析条件で、 ナイ口ン分解産物 の平均分子量を G P Cで調べた。 その桔果を表 1 3に示す。
【表 1 3】
Figure imgf000025_0001
上記表 1 3から分かる様に、 マンガンイオンを添加するのであれ ば、 そのマンガン塩の種類は問わないものである。
本発明で利用できるマンガンイオンとしては、 上記硫酸マンガ ン， 塩化マンガン. 酢酸マンガンの他、 炭酸マンガンやリン酸マン ガン等の各種のマンガン化合物が利用できる。
< N K - 1 1 4 8株以外の菌株由来の M n - P (実験 1 1 ) > Phanerochaete chrysosporium の生産する M n— P iこつ 、て、 ナ ィロ ンの分解能を調べた。
Tienzyme, INC. (Pennsylvania) から ¾|入した Phanerochaete chrysosporium 生産の M n - Pを酵素として用い、 上記実験 5及び 上記実験 9と同様の反応条件でナイ口ンの分解実験を行い、 マンガ ンイオン濃度及びリ ン酸塩濃度の影響を調べた。 その結果を下記 表 1 4 , 表 1 5に示す。
【表 1 4】
Mn S 04 '濃度 (mM)
0 0. 1 1 1 0 1 0 0 重量平均分子量 83000 70000 47000 53000 64000 数平均分子量 46000 38000 26000 30000 33000
【表 15】
Figure imgf000027_0001
上記表 1 4 ， 表 1 5 から分かる様に、 Phanerochaete chrysosporium の生産する Mn— Pも良好にナイ口ンを分解する。
上記各実験 1〜 1 0では N K - 1 1 4 8株から産生される Mn— Pを用いたが、 実験 1 1から分かる様に、 Mn— Pの起源は NK - 1 1 4 8株に限るものではなく、 種々の木材腐朽性担子菌か ら産生される Mn— Pを用いても良い。 また更に他の菌から産生さ れる Mn— Pを用いてもよく、 更には合成された Mn— Pを用いて もよい。
ぐ過酸化水素の影響 （実験 1 2) 〉
前述の様に、 一般にパーォキシダーゼ系酵素の作用は過酸化水素 の共存を必要とするが、 次に本発明における過酸化水素の影響につ いて述べる。
M n S 0 < 瀵度 1 mM、 K H 2 P◦ 4 濃度 1 0 mMで、 過酸化水 素を添加した反応液と、 添加していない反応液について、 他の反応 条件は実験 1 と同様にしてナイロンまたはポリエチレン膜を酵素処 理した。 過酸化水素の濃度については、 反応開始時に 1 00 #Mと なる様に添加した。 そして酵素処理後、 実験 1 と同様にしてナイ口 ン分解産物、 ポリエチレン分解産物の平均分子量を測定した。 ナイ ロンの結果を表 1 6に、 ポリエチレンの結果を表 1 7に示す。
【表 1 6】
O
DO ' i— o o
過 o o 酸化水素
o o
酵素種
無添加 添 加
j Cv
o o
o
N K - 1 重量平均分子量 37000
数平均分子量 21000
N K - 2 重量平均分子量
数平均分子量
N K - 3 重量平均分子量
数平均分子量
N K - 重量平均分子量 37000
数平均分子量 22000 【表 1 7】
Figure imgf000029_0001
表 1 6 . 表 1 7から分かる様に、 本発明においては、 過酸化水素 の添加の有無はナイロン， ボリェチレンの分解性に差異は生じなか つた。 従って過酸化水素の共存が格別必要ではないので、 工業的応 用においてコスト面で有利である。 産業上の利用可能性
以上の様に本発明の酵素による合成高分子化合物の分解方法を用 いれば、 現在社会問題となっているブラスチック廃棄物処理に大き く貢献する。

Claims

請求の範囲
1 . マンガン依存性のパーォキシダーゼを用いて、 マンガンイオン の存在下で合成高分子化合物を分解することを特徴とする酵素によ る合成高分子化合物の分解方法。
2 . リン酸. コハク酸， 酢酸もしくはそれらの塩よりなる群から選 択される少なく とも 1種の添加剤の存在下で分解を行う請求項 1に 記載の酵素による合成高分子化合物の分解方法。
3 . 木材腐朽性担子菌から分離されたマンガン依存性のパーォキシ ダーゼを用いて行う請求項 1または 2に記載の酵素による合成髙分 子化合物の分解方法。
4 . N K - 1 1 8株から分雠きれたマンガン依存性のパーォキシ ダーゼを用いて行う請求項 3に記載の酵素による合成高分子化合物 の分解方法。
5 . Phanerochaete chrysosporiumから分 Ifされたマンガン依 ¾F性 のパーォキシダーゼを用いて行う請求項 3に記載の酵素による合成 高分子化合物の分解方法。
6 . 上記マンガンイオンが 0 . 1〜 1 0 m Mである請求項 I または 2に記載の合成高分子化合物の分解方法。
7 . 上記リン酸を 2〜 4 O mMの濃度で添加する請求項 1または 2 に記載の合成高分子化合物の分解方法。
8 . 上記コハク酸を 2〜3 0 0 mMの濃度で添加する請求項 1また は 2に記載の合成高分子化合物の分解方法。
9 . 上記胙酸を 7 0〜 1 2 0 0 mMの澳度で添加する請求項 1また は 2に記載の合成高分子化合物の分解方法。
1 0 . 上記合成高分子化合物がポリアミ ド系高分子化合物或いはボ リオレフィ ン系髙分子化合物である請求項 1または 2に記載の酵素 による合成高分子化合物の分解方法。
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