WO1996011212A1 - Nouveau ligand de tyrosine kinase de type recepteur - Google Patents

Description

発明の名称

新規な リ セブター型チロ シンキナーゼリ ガン ド

発明の背景

技術分野

本発明は新規な リ セブタ一型チロ シンキナーゼ リ ガン ドに 関する。 更に詳細には、 本発明は、 血液未分化細胞の分化及 び増殖に関与する特定の リ セプター型チロ シンキナーゼの細 胞外部分に結合して、 その細胞内部分のチロシンキナーゼ酵 素活性を賦活化し、 該チロ シンキナーゼの リ ン酸化を引き起 こす新規な リ セプター型チロシンキナーゼ リ ガン ドに関する。 本発明はまた、 上記の新規な リ セプター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドと、 該リ ガン ド及び該リ ガン ド以外の化合物からな る群から選ばれる少なく と も 1 種とからなる複合体 ； 該リ ガ ン ドをコ一ドする D N A ； 該リ ガン ドの遺伝子工学的製造方 法 ； 及び該リ ガン ドを特異的に認識する抗体に関する。

従来技術

ヒ 卜 の血液中には多種類の細胞がぁ リ 、 それぞれが重要な 役割を担っている。 例えば、 赤血球は体内での酸素運搬を、 血小板は止血作用を、 白血球は免疫系を構成して感染を防御 している。 これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来 する。 造血幹細胞は体内の種々の造血因子や環境要因によ り 影饗を受け、 各種血液細胞、 破骨細胞、 肥満細胞などに分化 する こ とが近年明ら力、にされてきた。 こ の造血因子と して、 赤血球への分化についてはエ リ ス ロポエチン （ E P O ) が、 白血球への分化については顆粒球コ ロニ一刺激因子 （ G — C S F ) が、 血小板産生細胞である巨核球への分化については 血小板増殖因子 （m p 1 - L ) が発見され、 前者の 2つは現 在すでに臨床応用がなされている。 しかし、 造血幹細胞を含 む骨髄細胞、 末梢血細胞、 膦帯血細胞等の血液未分化細胞の 血液細胞への分化及び增殖 （pro l i f era t ion and d i f f erent i at ion) のメ カニズムについては、 未だ不明な点が多い。

タ ンパク質中に存在するア ミ ノ酸であるチロ シンを特異的 に リ ン酸化する酵素であるチロ シンキナ一ゼは、 細胞外から 細胞内へのシグナル伝達、 さ らに細胞核内における遺伝子の 転写調節を司る重要な物質である。 近年の研究から、 チロ シ ンキナーゼ及びそのチロ シンキナーゼ酵素活性を賦活化する 活性化因子が、 動物、 昆虫の発生や分化に大き く 関わってい る こ と が明らかになつてお リ 、 血液未分化細胞の分化、 増殖 においてもチロ シンキナーゼ及びその活性化因子が大き く 関 与している と考えられる。

チロ シンキナーゼの生理活性部位は約 2 5 0個のア ミ ノ酸 残基から構成されている。 また、 チロ シンキナ一ゼ群のア ミ ノ酸配列の中には、 きわめてよ く 保存された配列があ り (Hanks et a 1. Sc ience 241： 42 , 1988 ) 、 保存されたア ミ ノ酸配列に対応する D N A配列を設計し、 R T (Reverse Transcr i pt ion) 一 P C R法のプライマーと して利用すれば、 新たにチロ シンキナーゼ遺伝子断片を得る こ と ができ る

(Wi 1 ks . Methods in Enz ymo 1 ogy 200： 533, 1991 ) 。

リ セブタ一型チ口 シンキナーゼの一種であ り 血液未分化細 胞の表面に発現している c 一 k i t は、 肥満細胞増殖因子で あ リ 且つ血液未分化細胞の増殖因子の 1 つであるステムセル ファ ク ター （ S C F ) が、 その細胞外部分に結合する こ と に ょ リ活性化される こ とがわかってぉ リ （Wi t t e. Ce l l 63 : 5, 1992 ) 、 該リ セブター型チロ シンキナーゼ c 一 k i t を介し て細胞の分化が制御されている。

また、 リ セプタ一型チロ シンキナーゼである E L Kは、 リ ガン ドである L E R K— 2 (Bee km ann e t aし， EMBO J . 13： 3757 , 1994； Fletche r e t aし， Oncogene 9： 32 1 , 1994； 国 際出願公開第 W 0 9 4 Z 1 1 3 8 4 号を参照） によ リ活性化 される こ とが分かっている。

発明の概要

本発明者らはこれまでに、 血液未分化細胞の分化及び増殖 に関わリ 、 上記した リ セプター型チロ シンキナーゼ c 一 k i t と は異なる新規な リ セプター型チロ シンキナーゼ遺伝 子を、 ヒ ト巨核芽球白血病細胞株 U T — 7 からク ローニング し、 その全塩基配列を決定した。 そ して、 該リ セプタ一型チ 口 シンキナーゼの遺伝子工学的産生方法を確立した 〔国際出 願公開第 W 0 9 5 / 1 5 3 8 6 号を参照 （こ の リ セプター型 チロ シンキナーゼの塩基配列及びア ミ ノ 酸配列と実質的に同 じと考えられる配列は、 Bennet t el a 1. , J . Β i ο 1. Ch em. , 269， 14211 - 14218·, 1994 にも記載されている） 〕 。

一般に、 リ セプター型チロ シンキナーゼに対する リ ガン ド は、 或る リ セプター型チロ シンキナーゼの細胞外部分に特異 的に結合して、 その細胞内部分においてチロ シンキナーゼ酵 素活性を賦活化し、 該チロ シンキナーゼの リ ン酸化を引き起 こす性質を有する物質と して規定され、 通常、 1 種類の リ セ ブター型チロ シンキナーゼには対応する 1 種類の リ ガン ドが 生体内に存在する。 また、 リ セプタ一型チロ シンキナーゼの 発現している臓器、 またその中で発現している特定の細胞、 及びなんらかの刺激による発現変化を、 該 リ セプター型チロ シンキナーゼのアンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドを利用 した イ ンサイチュー （ in s i tu) ハイブリ ダィゼーシ ヨ ン、 ノ ザ ンブロ ッ トまたは抗体等を利用 した染色法にて検出するこ と によ リ 、 その リ ガン ドが作用する体内での部位及び細胞が特 定でき る こ とから、 リ ガン ドが有する生理作用をある程度推 定する こ とが可能である。

本発明者らが先に発見した リ セプター型チロ シンキナーゼ は、 参考例 7 に記載したよ う に、 未分化な血液由来細胞株が 刺激物質によ リ 分化して増殖能力を失う と 、 その m R N Aの 発現が認められなく なる。 従って、 この リ セプタ一型チロ シ ンキナーゼが、 特に未知の血液未分化細胞の分化 · 増殖因子 の リ セブタ一である こ とが推察される。 そこで、 本発明者ら は、 こ の リ セブター型チロ シンキナーゼの細胞外部分に特異 的に結合して、 その細胞内部分においてチロ シンキナーゼ酵 素活性を賦活化し、 該チロ シンキナーゼの リ ン酸化を引き起 こす物質 （ リ ガン ド） を発見すべく 、 鋭意研究を行った。 そ の結果、 本発明者らが先に開示した、 添付の配列表の配列番 号 1 のア ミ ノ 酸配列を含有する リ セブタ一型チ口 シンキナー ゼポリ ペプチ ドの細胞外 ドメ イ ンと特異的に結合し、 血液未 分化細胞の増殖を促進する、 新規化合物 （ リ ガン ド） の発現 細胞の同定に成功 し、 さ らにその発現細胞から該リ ガン ドを 精製し、 単離した。 そ して、 該リ ガン ドのァ ミ ノ末端 （ N末 端） のア ミ ノ酸配列を決定し、 このア ミ ノ酸配列を基にブラ イマ一を作製して、 P C R法にて c D N Aプローブを作製し 全長のア ミ ノ酸配列をコー ドする c D N Aを単離し、 この c D N Aを用いて該 リ ガン ドの発現細胞を作製し、 更にこの リ ガン ドを単離した。 本発明の リ セブタ一型チロ シンキナ一ゼ リ ガン ドは、 血液未分化細胞の増殖を有意に促進した。 また 上記の配列番号 1 で表わされる、 ア ミ ノ酸配列を含有する リ セプタ一型チ口 シンキナーゼポリ ぺプチ ドの細胞外 ドメ ィ ン に、 他の既知の リ セプター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドがほ とんど結合しないのに較べ、 本発明の リ セプター型チロ シン キナーゼ リ ガン ドは極めて強く 結合 して該チロ シンキナ一ゼ の リ ン酸化を引き起こ した。 こ の よ う に、 本発明の リ セブタ 一型チロ シンキナーゼ リ ガン ドは、 配列番号 1 のア ミ ノ酸配 列で表わされる、リ セブタ一型チ口 シンキナーゼポ リ ぺプチ ド の細胞外 ドメ ィ ンに結合して細胞内におけるチロ シンキナ一 ゼ活性を賦活化する。 従って、 本発明の リ セプタ一型チロ シ ンキナーゼリ ガン ドは、 血液未分化細胞の分化及び増殖を有 意に促進する因子の 1 つである。 また、 本発明者らは更に、 本発明の リ ガン ドの 1 分子以上と異種タ ンパク質と の複合体 又は本発明の リ ガン ドの 2分子以上からなる複合体 （ 2 量体 又はそれ以上の多量体） が、 該リ ガン ド 1 分子の生理活性と 同等又はそれ以上の活性を有する こ と を見い出 した。 また更 に、 上記の新規な リ セブタ一型チロ シンキナーゼ リ ガン ドを 特異的に認職して結合する抗体を作製した。 本発明は、 上記 の知見に基づき完成したものである。

従って、 本発明の 1 つの目的は、 血液未分化細胞の分化に 関わる特定の リ セプター型チロ シンキナーゼに特異的に結合 して、 そのチロ シンキナーゼ活性を賦活化する新規な リ ガ ン ド、 及びそれをコー ドする D N Aを提供する こ と にある。 本発明の他の 1 つの目的は、 上記の リ セブタ一型チロ シン キナーゼ リ ガン ドと 同等又はそれ以上の生理活性を有する と こ ろの、 該リ ガン ドの 1 分子以上と異種タ ンパク質との複合 体、 或いは該 リ ガン ドの 2分子以上からなる複合体を提供す る こ と にある。

本発明の更に他の 1 つの 目的は、 本発明の リ ガン ドの精製 に有利に用いる こ と のでき る、 該 リ ガン ドに特異的に結合す る抗体を提供するこ と にある。

本発明の更に他の 1 つの目的は、 本発明の リ ガン ドの遗伝 子発現の確認や、 細胞內における遺伝子発現の調整に有利に 用いる こ と のでき る、 センス D N A断片及びア ンチセ ンス D N A断片並びにそれらの誘導体、 又、 セ ンス R N A断片及び ア ンチセ ンス R N A断片並びにそれらの誘導体を提供するこ と にある。

本発明の上記及びその他の諸目的、 該特徴な らびに諸利益 は、 添付の配列表を参照 しながら述べる次の詳細な説明及び 請求の範囲の記載から明 らかになる。

配列表の簡単な説明

配列表において ：

配列番号 1 のア ミ ノ酸配列は、 本発明の リ ガン ドが特異的 に結合する リ セブタ一型チロ シンキナ一ゼの、 シグナルぺプ チ ドを除いた細胞外 ドメ イ ンの配列でぁ リ 、 配列番号 3 に示 した該 リ セプタ一型チロ シンキナーゼの全ア ミ ノ酸配列のァ ミ ノ酸番号第 1 〜 5 2 2番に相当 してお り ；

配列番号 2 のア ミ ノ酸配列は、 本発明の リ ガン ドが特異的 に結合する リ セブタ一型チ口 シンキナーゼの、 シグナルぺブ チ ドを除いた、 細胞外 ドメ イ ン、 膜透過 ドメ イ ン及び細胞内 ドメ イ ンの全 ドメ イ ンの配列でぁ リ 、 配列番号 3 に示 した該 リ セブタ一型チロ シンキナーゼの全ア ミ ノ酸配列のア ミ ノ酸 番号第 1 〜 9 7 2番に相当 してぉ リ ； 配列番号 3 は、 本発明の リ ガン ドが特異的に結合する リ セ プタ一型チロ シンキナーゼの全ア ミ ノ酸配列、 及び該 リ セプ ター型チロ シンキナーゼの全 c D N A配列でぁ リ ；

配列番号 4 は、 本発明の リ ガン ドの N末端側の 8 ア ミ ノ酸 残基の配列でぁ リ 、 配列番号 7 に示した本発明の リ ガン ドの 全ア ミ ノ酸配列のア ミ ノ酸番号第 1 〜 8番に相当 してぉ リ ； 配列番号 5 は、 本発明の リ ガン ドの、 シグナルペプチ ドを 除いた細胞外 ドメ イ ンの配列であ リ 、 配列番号 7 に示した本 発明の リ ガン ドの全ア ミ ノ酸配列のア ミ ノ酸番号第 1 〜 1 9 5番に相当 してぉ リ ；

配列番号 6 は、 本発明の リ ガン ドの、 シグナルペプチ ドを 除いた、 細胞外 ドメ イ ン、 膜透過 ドメ イ ン及び細胞内 ドメ イ ンの全 ドメ イ ンの配列であ リ 、 配列番号 7 に示した本発明の リ ガン ドの全ア ミ ノ酸配列のア ミ ノ酸番号第 1 〜 3 0 8番に 相当 してお り ；

配列番号 7 は、 本発明の リ ガン ドの全ア ミ ノ 酸配列及び全 c D N A配列でぁ リ ；

配列番号 8 は、 参考例 2 で使用するセ ンスブライマ一の塩 基配列であ リ ；

配列番号 9 は、 参考例 2 で使用するアンチセンスプライマ —の塩基配列でぁ リ ；

配列番号 1 0は、 参考例 8 で使用するブライ マ一 1 の塩基 配列であ リ ； 配列番号 1 1 は、 参考例 8 で使用するプライマー 2 の塩基 配列であ リ ；

配列番号 1 2 は、 参考例 8 で使用するプライマ ー 3 の塩基 配列であ リ ；

配列番号 1 3は、 参考例 8 で使用する塩基配列及びそれが コ ー ドするオリ ゴぺプチ ド F L A Gのア ミ ノ酸配列でぁ リ ； 配列番号 1 4 は、 参考例 8 で使用するブライマ一 4 の塩基 配列であ リ ；

配列番号 1 5 は、 参考例 8 で使用するプライマ一 5 の塩基 配列であ リ ；

配列番号 1 6 は、 参考例 8 で使用するブライマ ー 6 の塩基 配列であ リ ；

配列番号 1 7 は、 参考例 8 で使用するブライマ ー 7 の塩基 配列であ リ ；

配列番号 1 8 は、 参考例 8 で使用するプライ マ ー 8 の塩基 配列であ リ ；

配列番号 1 9 は、 実施例 9 でペプチ ドシークェンサ一によ リ 決定された、 本発明の リ ガン ドの N末端の配列であ り 、 配 列番号 7 に示した本発明の リ ガン ドの全ア ミ ノ 酸配列のア ミ ノ 酸番号第 1 〜 4 8番に相当 してぉ リ ；

配列番号 2 0 は、 実施例 1 0 で使用するプライマ一 9 の塩 基配列であ り ；

配列番号 2 1 は、 実施例 1 0で使用するプライマ一 1 0の 塩基配列でぁ リ ；

配列番号 2 2は、 実施例 1 0で作製する c D N Aプローブ の塩基配列及びそれがコー ドするア ミ ノ 酸配列でぁ リ ； 配列番号 2 3は、 実施例 1 9で L E R K— 2遺伝子のク ロ 一二ングに使用するセンスプライマーでぁ リ ； そ して

配列番号 2 4は、 実施例 1 9で L E R K— 2遺伝子のク ロ —エングに使用するアンチセンスプライマ一である。

なお、 配列番号 1 〜 4及び 7に表わされた各ア ミ ノ酸配列 の左端及び右端はそれぞれ N末端及び C末端であ り 、 又、 配 列番号 4〜 7 に表わされた塩基配列の左端及び右端はそれぞ れ 5 ' 末端及び 3 ' 末端である。

図面の簡単な説明

図 1 は、 実施例 2 における、 C 一 1 細胞 （未刺激） の細胞 上清中の リ ガン ドのチ口 シンキナーゼへの結合活性の測定結 果を示すグラ フでぁ リ ；

図 2 は、 実施例 3 におけるフ ローサイ ト メ一ターによる本 発明の リ ガン ドを発現している細胞の蛍光ピークの測定結果 を示すグラ フでぁ リ ；

図 3 は、 実施例 4 における リ ン酸化ア ツセィ によ る本発明 の リ ガン ドを発現している細胞のウェス タ ンブロ ッ トの写真 であ り ；

図 4 は、 実施例 5 において、 1 次精製された本発明の リ ガ ン ドを電気泳動した結果を示す写真であ リ ；

図 5 は、 実施例 6 におけるゲル濾過による ク ロマ ト グラフ ィ一パターンを示すグラフでぁ リ ；

図 6 は、 実施例 6 におけるゲル濾過によ る分離液の各画分 の リ ガン ドの結合活性の測定結果を示すグラ フでぁ リ ；

図 7 は、 実施例 6 において、 ゲル濾過にょ リ精製された本 発明の リ ガン ドを電気泳動 した結果を示す写真であ リ ；

図 8 は、 実施例 7 において最終的に精製された本発明の リ ガン ドを電気泳動した結果を示す写真でぁ リ ；

図 9 は、 実施例 1 9 において、 本発明の リ ガン ドと L E R K— 2 の リ ガン ド結合活性を比較 した結果を示すグラ フであ り ；そ して 図 1 0 は、 リ ン酸化活性について本発明の リ ガン ドと L E R K— 2 ·と を比較したウェスタ ンブロ ッ トの写真を示す。

発明の詳細な説明

本発明の 1 つの態様によれば、 リ セプター型チロ シンキナ ーゼ活性を有し、 且つ、 配列表の配列番号 1 及び 2 からなる 群よ リ選ばれるア ミ ノ酸配列を含有する単離されたポ リ ぺプ チ ドと 、 該ポ リ ペプチ ドの、 リ セプター型チロ シンキナ一ゼ 活性を有する相同変異体とへの結合能を有し、 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動で測定した分子量が少なく と も 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ンでぁ リ 、 ク マシ一ブ リ リ ア ン ト ブルー 染色反応を受け得る こ と を特徴とする単離された化合物が提 供される。

また、 本発明の他の 1 つの態様によれば、 配列表の配列番 号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少なく と も一 部を含有してなる単離された化合物が提供される。

また、 本発明の他の 1 つの態様によれば、 配列表の配列番 号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少なく と も一 部を含有する化合物と 、

配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少なく と も一部を含有する化合物の少なく と も 1 種と 、 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポリ べ プチ ドの少なく と も一部を含有する化合物以外の化合物から なる群から選ばれる少なく と も 1 種、 とからなる複合体が提供される。

また本発明の更に他の 1 つの態様によれば、 配列表の配列 番号 6 のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチ ドの少なく と も 一部をコー ドする単離された D N Aが提供される。

また本発明の更に他の 1 つの態様によれば、 配列表の配列 番号 6 のアミ ノ酸配列を含有するポリべプチ ドの少なく と も 一部を含有してなる単離された化合物の製造方法に して ：

( a ) 該ポリペプチ ドの少なく と も一部をコー ドする D N Aを複製可能な発現ベク ターに連結して、 該 D N Aが、 該 複製可能な発現べク タ一に発現可能に組み入れられてなる複 製可能な組換え D N Aを得て、

( b ) 真核細胞又は原核細胞を該複製可能な組換え D N Aで形質転換して、 形質転換体を形成し、

( c ) 該形質転換体を親細胞と しての該真核細胞又は原 核細胞から選別し、

( d ) 該形質転換体をインキュベー トするこ とによ リ 、 形質転換体に該 D N Aを発現させて、 該ポリべプチ ドの少な く と も一部を含有してなる化合物を生産させ、 そして

( e ) イ ンキュベー ト された形質転換体から該化合物を 単離する、

ことを特徴とする方法が提供される。

また本発明の更に他の 1 つの態様によれば、 上記した本発 明の化合物、 又は配列表の配列番号 5のアミ ノ酸配列を含有 するポ リ ペプチ ドの少なく と も一部を含有する化合物を特異 的に認識する抗体が提供される。

次に、 本発明の理解を容易にするために、 まず、 本発明の 基本的な特徴及び好ま しい態様を列挙する。

1 . リ セブター型チロ シンキナーゼ活性を有し、 且つ、 配列 表の配列番号 1 及び 2からなる群よ リ選ばれるア ミ ノ酸配列 を含有する単離されたポリ ペプチ ドと 、 該ポ リ ペプチ ドの、 リ セプタ一型チロ シンキナーゼ活性を有する相同変異体とへ の結合能を有し、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動で測定し た分子量が少なく と も 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ンでぁ リ クマシ一プ リ リ アン トブルー染色反応を受け得る こ と を特徴 とする単離された化合物。

2 . リ セブタ一型チロ シンキナーゼ活性を有し、 且つ、 配列 表の配列番号 2 のア ミ ノ酸配列を含有する単離されたポ リ べ プチ ド、 又は該ポ リ ペプチ ドの、 リ セプタ一型チロ シンキナ ーゼ活性を有する相同変異体を発現した細胞に反応させる と 該ポ リ べプチ ドの少なく と も 1 個のチロ シン残基を リ ン酸化 させる特性を有する項目 1 に記載の化合物。

3 . 配列表の配列番号 4 に記載のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ペプチ ドを包含する項目 1 に記載の化合物。

4 . 配列表の配列番号 4 に記載のア ミ ノ酸配列が該ポ リ ぺプ チ ドのア ミ ノ 末端に位置する項目 3 に記載の化合物。

5 . ク マ シ一ブ リ リ ア ン ト ブルー染色反応と P A S染色反応 の両方を受け得る項目 1 に記載の化合物。

6 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ぺプ チ ドの少なく と も一部を含有してなる項目 1 に記載の化合物,

7 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少なく と も一部が、 配列表の配列番号 5 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少な く と も一部である項 目 6 に記載の化合物。

8 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ぺプ チ ドの少なく と も一部を含有してなる単離された化合物。

9 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少なく と も一部が、 配列表の配列番号 5 のア ミ ノ酸配列を含有するポリ ペプチ ドの少な く と も一部である項 目 8 に記載の化合物。

1 0 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べ プチ ドの少なく と も一部を含有する化合物と 、

配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少なく と も一部を含有する化合物の少なく と も 1 種と 、 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べ プチ ドの少な く と も一部を含有する化合物以外の化合物から なる群から選ばれる少なく と も 1 種、

とからなる複合体。

1 1 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有する ポ リ ペプチ ドの少なく と も一部が、 配列表の配列番号 5 のァ ミ ノ酸配列を含有するポリ べプチ ドの少なく と も一部である 項目 1 0に記載の複合体。

1 2 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポリ べ プチ ドの少なく と も一部をコー ドする単離された D N A。

1 3 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有する ポリ ペプチ ドの少な く と も一部が、 配列表の配列番号 5のァ ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少な く と も一部である 項目 1 2 に記載の化合物 D N A。

1 4 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べ ブチ ドの少なく と も一部を含有してなる単離された化合物の 製造方法に して ：

( a ) 該ポリ ペプチ ドの少な く と も一部をコー ドする D N Aを複製可能な発現ベク ターに連結して、 該 D N Aが、 該 複製可能な発現べク タ一に発現可能に組み入れられてなる筏 製可能な組換え D N Aを得て、

( b ) 真核細胞又は原核細胞を該複製可能な組換え D N Aで形質転換して、 形質転換体を形成し、

( c ) 該形質転換体を親細胞と しての該真核細胞又は原 核細胞から選別 し、

( d ) 該形質転換体をイ ンキュベー トする こ と によ リ 、 形質転換体に該 D N Aを発現させて、 該ポ リ べプチ ドの少な く と も一部を含有してなる化合物を生産させ、 そ して

( e ) イ ンキュベー ト された形質転換体から該化合物を 単離する、

こ と を特徴とする方法。

1 5 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有する ポリ ペプチ ドの少な く と も一部が、 配列表の配列番号 5のァ ミ ノ酸配列を含有するポリ べプチ ドの少なく と も一部である 項目 1 4に記載の方法。

1 6 . 項目 1 に記載の化合物、 又は配列表の配列番号 5のァ ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少なく と も一部を含有 する化合物を特異的に認識する抗体。

1 7 . 配列表の配列番号 7の塩基配列の少なく と も 1 2個の 連続した塩基配列を含有するセ ンス D N A、 該セ ンス D N A に相補的なアンチセ ンス D N Aからなる群よ リ選ばれる単離 された D N A断片、 及び該センス D N A及び該ア ンチセ ンス D N Aを、 それぞれ、 メ チル化、 メ チルフ ォ ス フ ェー ト化、 チォフォ ス フ エ一ト化又は脱ア ミ ノ化する こ と によ リ 得られ る 、 該センス D N A及び該ア ンチセンス D N Aの誘導体から なる群よ リ選ばれる単離された D N A断片。

1 8 . 配列表の配列番号 7の塩基配列に相補的な少なく と も 1 2個の連続した塩基配列を含有するア ンチセ ンス R N A、 該アンチセンス R N Aに相補的なセンス R N Aからなる群よ リ選ばれる単離された R N A断片、 及び該ア ンチセ ンス R N A及び該セ ンス R N Aを、 それぞれ、 メ チル化、 メ チルフォ ス フ ェー ト化、 チォフ ォ ス フ ェー ト化又は脱ァ ミ ノ化する こ と にょ リ得られる、 該アンチセンス R N A及び該センス R N Aの誘導体からなる群よ リ選ばれる単離された R N A断片。 本発明において、 遺伝子操作に必要な c D N Aの作製、 ノ —ザンブロ ッ トによ る発現の検討、 ハイ ブリ ダィゼ一シヨ ン によるスク リ ーニング、 組換え D N Aの作製、 D N Aの塩基 配列の決定、 c D N Aライ ブラ リ 一の作製等の一連の分子生 物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によ って行う こ と ができ る。 前記の通常の実験書と しては、 たと えば、

Man i at i sらの編 した o lecul ar Clon ing, A l aboratory manua l , 1989, Eds . , Sambrook, J . , Fr i t sch, E . F . , and Ma n i a t i s , T.， Co l d Spr ing Harbor Laborator Press を挙 げる こ とができ る。

本発明の リ セプター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドは、 リ セ プタ一型チロ シンキナーゼ活性を有し、 且つ、 配列表の配列 番号 1 及び 2からなる群よ リ選ばれるア ミ ノ酸配列を含有す る単離されたポ リ ペプチ ドと、 該ポ リペプチ ドの、 リ セプタ —型チ口 シンキナーゼ活性を有する相同変異体とへの結合能 を有し、 ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動で測定した分子量 が少なく と も 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダノレ ト ンであ り 、 クマシ 一プリ リ アン トブルー染色反応を受け得る こ と を特徴とする 単雕された化合物か、 又は、 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸 配列を含有するポ リ ぺブチ ドの少なく と も一部を含有 してな る単離された化合物と定義される。 本発明において、 "リ セブター型チロ シンキナーゼ活性"と は、 チロ シンキナーゼが本来有している、 チロ シン残基を リ ん酸化する酵素活性、 リ セブター型チロ シンキナーゼにおい てその細胞外 ドメ イ ンが リ ガン ドを認識して結合する機能、 及びリ セブター型チロ シンキナーゼにおいてその細胞内 ドメ イ ン中のア ミ ノ酸残基 （主にチロ シン残基） を リ ん酸化して リ ん酸化した部位において他の細胞内タ ンパク質と結合して その細胞内タ ンパク質を結合部位において リ ん酸化する機能 の う ち少なく と も 1 つを含むもの とする。

また、 本発明において、 " リ セブタ一型チロ シンキナーゼ リ ガン ド活性" とは、 少な く と も配列表の配列番号 1 に記載 のァ ミ ノ酸配列を有する リ セプタ一型チ口 シンキナーゼポリ ペプチ ド （即ち、 該リ セブタ一型チロ シンキナーゼの細胞外 ドメ イ ン） に結合する活性、 も し く は配列表の配列番号 2 に 記載のア ミ ノ酸配列を含有する リ セプター型チロ シンキナー ゼポ リ ペプチ ド （即ち、 該リ セブター型チロ シンキナ一ゼの シグナルペプチ ドを除く 細胞外 ドメ イ ン、 膜透過 ドメ イ ン及 び細胞内 ドメ イ ンよ リ なるポ リ べプチ ド） の発現細胞に結合 する こ とによ リ 、 少なく と も当該ポリ ペプチ ドの少な く と も

1 個のチロ シン残基を リ ン酸化させる活性のいずれかを含む ものとする。

本発明においては、 自然界で生じる こ とが知 られている生 物種内変異、 ア レル変異等の突然変異及び人為的に作製可能 な点変異等の変異によって生じる、 リ セプター型チロ シンキ ナーゼ リ ガン ド活性を有する相同変異体も、 本発明の リ セプ ター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドに含まれる。 また、 ァ ミ ノ 酸レベルの変異がな く と も、 自然界から分離した、 染色体 D N Aまたは c D N Aにおいて、 遺伝コー ドの縮重によ り 、 そ の D N Aがコー ドするア ミ ノ酸配列を変化させる こ と なく D N Aの塩基配列が変異した例はしばしば認められる。 また、 5 ' 非翻訳領域及び 3 ' 非翻訳領域はポ リ ペプチ ドのァ ミ ノ 酸配列の規定には関与しないので、 それらの領域の D N A配 列は変異しやすい。 このよ う な遗伝コ一 ドの縮重や変異によ リ得られる塩基配列、 並びに上記した、 リ セブタ一型チロ シ ンキナーゼ活性を有する リ ガン ド相同変異体が有するア ミ ノ 酸配列をコ一 ドする塩基配列も、 本発明の D N Aに含まれる , 本発明で使用する リ セブタ一型チロ シンキナーゼの c D N Aを得る工程は、 後述する参考例 1 〜 6 に記載 した通 リ であ る。 即ち、 チロ シンキナーゼ遺伝子に特徴的なア ミ ノ酸配列 に対応したプライマーを用いて、 P C Rを行う。 P C R用プ ライマーの作製並びに P C Rは W i 1 k s の方法 （Proc.Nat 1. Acad. Sci. USA 86： 1603 , 1989 ) で行う こ とができ る。 具体 的には、 市販の D N A合成機でオリ ゴヌ ク レオチ ドを合成し 精製して P C R用プライマーを得る。 次いで P C R用ブライ マーを、 ヒ ト巨核芽球白血病細胞株 U T— 7 ( 日本国、 熊本 大学医学部遗伝発生医学研究施設分化制御部門、 須田年生教 授も し く は日本国、 自治医科大学血液科、 小松則夫講師よ り 入手可能） の c D N A溶液に加え P C Rを行い、 特定部位を 増幅する。 これによ リ 、 特定のチロ シンキナーゼの一部分で ある約 2 0 0 b p を增幅する こ とができ る。 こ の P C R産物 である D N A断片をァガロース電気泳動などで分離し、 精製 し回収する。 この回収 した D N A断片をク ローユングし、 遺 伝子配列を決定した と こ ろ、 配列表の配列番号 3の塩基配列 の 2 6 4 2番カ ら 2 8 1 2番に相当する。 この配列はチコ シ ンキナ一ゼ酵素活性部位の中央部分をコ一 ドしてお リ 、 細胞 内シグナル伝達に重要な役割を果たすア ミ ノ酸配列をコー ド する。

本発明で使用する リ セブタ一型チ口 シンキナーゼ c D N A 全配列のク ローニングには、 前記の方法にてク ローニングし た c D N A断片をァイ ソ トーブ標識し、 U T— 7細胞株の c D N Aライブラ リ ーをハイ ブ リ ダイゼ一ショ ンな どの方法に てスク リ ーエングするこ と によって得る こ と ができ る。 アイ ソ ト一プの標識法と しては、 たと えば [³² P ] y — A T P と T 4ポ リ ヌ ク レオチ ドキナ一ゼを用いて末端をラベルする方 法や、 他のニ ッ ク ト ラ ンス レーシ ョ ン法またはブライ マー伸 長法などによ る標識法が利用でき る。

本発明で使用する リ セプター型チロ シンキナーゼの c D N A塩基配列を、 配列表の配列番号 3 と してそれがコー ドする ア ミ ノ 酸配列と共に示 した。 塩基配列は、 4 0 9塩基よ り な る 5 ' 非翻訳領域、 それに続く 2 9 6 1 塩基よ リ なる該リ セ ブター型チロ シンキナーゼ'をコ一 ドする領域、 及びさ らにそ れに続く 9 1 9塩基よ り なる 3 ' 非翻訳領域からなる。 この リ セプター型チロ シンキナーゼのア ミ ノ酸配列は、 配列表の 配列番号 3のア ミ ノ 酸配列の一 1 5番から一 1番にあたる 1 5 ァ ミ ノ酸から構成されるシグナルぺプチ ド、 配列表の配列 番号 3 のア ミ ノ酸配列の 1番から 5 2 2番にあたる 5 2 2ァ ミ ノ酸で構成される細胞外部分、 配列表の配列番号 3のア ミ ノ酸配列の 5 2 3番から 5 4 8番にあたる 2 6 ア ミ ノ酸から 構成される細胞膜貫通部分、 配列表の配列番号 3のア ミ ノ酸 配列の 5 4 9番カゝら 9 7 2番にあたる 4 2 4ア ミ ノ酸から構 成される細胞内部分、 ょ リ構成される。 さ らに、 細胞内部分 においては配列表の配列番号 3のア ミ ノ酸配列の 6 0 0番か ら 8 5 9番にあたる 2 6 0ア ミ ノ酸はチロ シンキナーゼ酵素 活性部分である。 尚、 この リ セブタ一型チロ シンキナーゼ c D N Aの全塩基配列を含むベク ター p B S R T K F U L Lを 大腸菌 J M 1 0 9 ( 日本国東洋紡社製） に遗伝子導入した形 質転換細胞は、 日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研 究所において寄託番号 F E RM B P— 4 8 8 3 と して 1 9 9 4年 1 1 月 1 1 日 に寄託されている。

配列表の配列番号 1 で表されるア ミ ノ 酸配列を有するポリ ぺプチ ドは、 上記の リ セプタ一型チ口 シンキナーゼの細胞外 部分のシグナルぺプチ ドを除いた部分のア ミ ノ酸配列を有す るポ リ ペプチ ドに相当する。 また、 配列表の配列番号 2 で表 されるア ミ ノ酸配列を有するポ リ ペプチ ドは、 上記の リ セブ ター型チロ シンキナーゼのシグナルぺプチ ドを除く ァ ミ ノ酸 配列を有するポリ べプチ ドに相当する。

本発明で使用する リ セブター型チロ シンキナーゼは、 すで にク ローニングされている リ セプタ一型チ口 シンキナーゼで ある ヒ ト E P H (Hirai e t aに， Sc ience, 238, 1717— 1720 , 1987 ) 、 ヒ 卜 E C K (Lindberg and Hunter, Mo 1. Cel l.

Biol. , 10， 6316-6324, 1990 ) 、 ラ ッ ト E L K (Lho tak e t a 1. , o 1. Cel l. Biol. , 11， 2496-2502 , 1991 ) 、 ヒ ト H E K (Wicks e t a 1. , P r o c . Na t 1. Ac a d . S c i . USA. , 89, 1611- 1615， 1992 ) 、 マ ウ ス S E K (Gi 1 a r d i -He b e n s t r e i t et a 1. , Oncogene, 7 , 2499-2506 , 1992 ) 、 チキン C e k — 5

(Pasqua 1 e, Cel l Regulat ion, 2， 523-534 , 1991 ) と類似 した構造を持つが、 そのア ミ ノ酸配列のホモ ロ ジ一は最も高 い場合の E L Kで 5 6 . 3 %であ リ 、 これらの物質と は異な るア ミ ノ酸配列を有する新規な リ セブタ一型チロ シンキナー ゼであ リ 、 本願発明者らによ リ初めて明 らかにされた物質で ある。

本発明に使用する リ セプタ一型チロ シンキナーゼの遺伝子 の入手法と しては、 参考例 1〜 6 に記載の方法以外にも、 市 販の ヒ ト胎盤も しく は胎児肝臓 c D N Aも しく は c D N Aラ イブラ リ ーを直接テ ンプレー ト と して使用 し、 配列表の配列 番号 3に記載の D N A配列の 2 O m e r程度のセンスプライ マ一及びアンチセ ンスブライマーを作製し、 P C Rを行って 作製した り 、 またこ の P C R産物をプローブと して用いる こ と によ リ 、 ライブラ リ ーを参考例 1〜 6 に記載の方法でスク リ 一ユングを して得る こ とができ る。 さ らに、 本発明で使用 した リ セプタ一型チロ シンキナーゼの c D N Aは、 U T— 7 以外にも、 血液細胞株である ヒ ト慢性骨髄性白血病細胞株 K 5 6 2 (日本国理化学研究所、 細胞開発銀行よ り 入手可能、 N o . R C B 0 0 2 7 ) 及びヒ ト急性巨核芽球性白血病細胞 株 CMK (Blood 74： 42 , 1989 ) などから、 又非血液細胞株で は肝細胞ガン細胞株 H e p 3 B 〔アメ リ カン ' タイプ ' カル チヤ一 ' コ レク シ ョ ン （以下 A T C C と示す） ょ リ入手可能 H B 8 0 6 4〕 及びヒ ト胎児肺繊維芽細胞株 M R C— 5 (日 本国理化学研究所、 細胞開発銀行よ リ入手可能、 N o . R C B 0 2 1 1 ) などから、 後述する参考例 1〜 6 と実質的に同 様の操作で得るこ と ができ る。 またさ らに、 合成 D N A法で 人為的にオリ ゴヌ ク レオチ ドを作製し、 それらを連結して合 成 D N Aを調製する方法によれば、 遺伝子コー ドの縮重によ リ 、 ア ミ ノ酸配列を変える こ と なく 遺伝子配列を変化させる こ と によって 目的の組換え D N Aを調製する こ とができ る。 本発明で使用する リ セプター型チロ シンキナーゼの性質は 参考例 7に記載した通 り である。 すなわち、 未分化な血液由 来細胞株が、 刺激物質によ り分化 して増殖能力を失う と 、 該 リ セブター型チロ シンキナーゼの遺伝子の m R N Aの発現が 認められなく なる。 従って、 この リ セブター型チロ シンキナ ーゼが特に未知の血液未分化細胞の分化 · 增殖因子の リ セプ タ一である こ とが推察される。

また、 本発明で使用する リ セプタ一型チロ シンキナーゼの 遺伝子の発現方法並びに リ ガン ド同定に必要なポ リ べプチ ド の産生方法、 精製方法は参考例 8 から 1 0に記載する通 リ で ある。 すなわち、 配列表の配列番号 1及び配列番号 2のア ミ ノ酸配列をもつポリ べプチ ドをコ一 ドする D N Aを、 それぞ れ適当な発現ベク ターに組み込み、 微生物または細胞 （たと えば昆虫細胞または動物細胞） な どを宿主とする形質転換体 を得て、 その形質転換体に リ セプター型チロ シンキナーゼの ポ リ ペプチ ドを産生させる こ とができ る。 さ らに、 リ セプタ 一型チロ シンキナーゼをよ リ安定な条件で発現させる場合に は有核細胞、 特に動物培養細胞を宿主と して発現させるのが 好ま しい。 また、 細胞外部分のポ リ ペプチ ドの精製はァフ ィ 二ティ一ク ロマ ト グラ フ ィ一によ り 精製でき、 これを抗原に 用いる こ とで抗体を作製するこ とができ る。 尚、 この リ セブ タ一型チロ シンキナーゼを特異的に認識するマ ウスモノ ク 口 ーナル抗体産生ハイ ブリ ド一マの 3株、 すなわちク ローン 3 8— 1 E、 6 6 — 3 八ぉょび 6 8 — 3 八は、 日本国通産省ェ 業技術院生命工学工業技術研究所において各々寄託番号 F E R B P— 4 8 8 4、 B P— 4 8 8 5 および B P— 4 8 8 6 と して 1 9 9 4年 1 1 月 1 1 日 に寄託されている。

上記のよ う に して得られる リ セプター型チロ シンキナーゼ に特異的に結合する リ ガン ドの取得方法について、 以下に述 ベる。

まず、 上記の リ セプター型チロ シンキナーゼに特異的に結 合する リ ガン ドの産生細胞を同定し、 選択する。 その方法と しては、 実施例 1 カゝら 4 に記載するよ う に、 バイ オセ ンサー B I A c o r e (ス ウェーデン国、 フ ァ ノレマ シア社製） を用 いる方法が挙げられる。 本機は物質の表面におけるブラズモ ン共鳴の原理に基づき タ ンパク質の結合を検出する こ と がで き る。 すなわち、 各種ヒ ト細胞株の培養上淸中または細胞膜 上に存在する リ ガン ド分子と 、 配列表の配列番号 1 に記載の ア ミ ノ酸配列を含有する リ セプタ一型チロ シンキナ一ゼポ リ ペプチ ドと の結合を調べ、 該リ セブター型チロ シンキナーゼ ポ リ ペプチ ドと結合する物質を産生している細胞株を選ぶこ とができ る。

また、 別の方法と して、 各種細胞株の上清も し く は細胞そ のものと 、 配列表の配列番号 2 に記載の リ セプタ一型チ口 シ ンキナーゼポ リ べプチ ドの発現細胞株を共に培養 し、 その リ セプタ一型チ口 シンキナーゼポ リ べプチ ドの、 細胞内 ドメ イ ンにおけるチロ シン残基の リ ン酸化の有無を調べる こ と によ リ 、 該 リ セプタ一型チロ シンキナーゼに結合する リ ガン ドの 発現細胞株を選ぶこ とができ る。 また更に別の方法と して、 配列表の配列番号 1 に記載の リ セプター型チロ シンキナーゼポ リ べプチ ドも し く はこのポ リ ペプチ ドをコー ドする塩基配列に、 抗体認識部位、 例えば実 施例に記載したヒ ト I g Gの F c部分や、 I B I F L A G (米国、 K o d a k社製 ； 参考文献と して同社発行の E p i t o p e . 1 、 1 、 1 9 9 2年を参照） （ I B I F L A G は、 以下、 屡々 、 単に 「 F L A G」 と称す） 等のア ミ ノ酸配 列をコー ドする塩基配列を、 配列の読枠が合 う よ う に連結さ せた配列を発現させて融合べプチ ドを得る。 そ して リ ガン ド を発現している細胞と結合させる こ と によ リ 、 染色されたそ れらの細胞を同定でき る。

本願実施例 1 〜 4 においては、 本発明の リ ガン ド発現細胞 と して、 ヒ ト結腸ガン由来細胞株 C一 1 ( 日本国株式会社免 疫生物研究所よ リ購入可能、 参考文献と して佐藤ら . 医学 あゆみ、 9 6 : 8 7 6 、 1 9 7 6年） を同定 した _t

次いで、 本発明の リ ガン ドを、 その発現細胞から精製する 本発明における リ ガン ドの精製、 分子量の測定、 物性の評価 及び N末端ァ ミ ノ酸配列の決定によ る同定は実施例 5 から 9 に記載 した通 リ である。 すなわち、 リ ガン ド発現細胞株の培 養上清又は細胞膜画分、 或いは細胞を特定の酵素で処理 して 作製 した溶液などを、 配列表の配列番号 1 に記載のア ミ ノ酸 配列を含有するポ リ ペプチ ドを結合させたァフィ 二ティ一ゲ ル等の担体を用いて精製し、 更に配列表の配列番号 1 のァ ミ ノ酸配列を含有するポ リ ぺプチ ドに対する結合活性を指標に する力 も し く は配列表の配列番号 2 に記載のア ミ ノ 酸配列 を含有するポ リ ペプチ ドの発現細胞に反応させて、 該ポ リ べ プチ ドのチ口 シン残基を リ ン酸化させる活性を指標に して、 ゲル濂過、 イ オン交換等の分離操作にょ リ 、 本発明の リ ガン ドを精製する こ とができ る。

このよ う に して精製された本発明の化合物 （ リ ガン ド） は 配列表の配列番号 1 及び 2 からなる群よ リ選ばれるァ ミ ノ酸 配列を含有する単離されたポ リ ペプチ ドと 、 該ポ リ ペプチ ド の、 リ セブター型チロ シンキナーゼ活性を有する相同変異体 と への結合能を有し、 ポリ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動で測 定して分子量が少なく と も 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ンで ぁ リ 、 クマシ一ブリ リ アン トブル一染色反応を受け得る単離 された化合物である。 上記の物理化学的性質は、 これまでに 報告されているいかなる公知の化合物の物理化学的性質と も 異なる。

本発明の リ ガン ドと しては'、 リ セプタ一型チロ シンキナー ゼ活性を有し、 且つ、 配列表の配列番号 2 のア ミ ノ酸配列を 含有する単離されたポ リ ペプチ ド、 又は該ポリ ペプチ ドの、 リ セプター型チロ シンキナーゼ活性を有する相同変異体を発 現した細胞に反応させる と 、 該ポ リ ペプチ ドの少なく と も 1 個のチロ シン残基を リ ン酸化させる特性を有する ものが好ま しい。 本発明の リ ガン ドと してはまた、 配列表の配列番号 4 に記載のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ぺブチ ドを包含する こ とが好ま しく 、 該ア ミ ノ酸配列が上記のポ リ ペプチ ドのア ミ ノ末端に位置するこ とが更に好ま しい。 本発明の リ ガン ドと してはまた、 クマシ一ブ リ リ アン トブル一染色反応と P A S 染色反応 （糖鎖の結合の有無を検出する） の両方を受け得る こ とが好ま しい。 配列表の配列番号 4 に記載したア ミ ノ酸配列は、 プロティ ンシークェンサ一 （米国アプライ ドバイ オシステム社製） に て決定された、 精製された本発明の リ ガン ドのア ミ ノ末端 ( N末端） 部の配列のア ミ ノ酸番号第 1番から第 8番のア ミ ノ 酸配列を示す。 この配列表の配列番号 4のア ミ ノ酸配列を タ ンパク質データベースである N B R F — P D B (ナショ ナ ノレ ' バイオメディ 力ノレ ' リ サーチ ' ファ ウンデーショ ン、 リ リ ース 4 0 . 0、 1 9 9 4年 3月 ） 及び S W I S S — P R O T (ユーロ ビア ン ' モ レキュ ラー ' バイ オロ ジー ' ラボラ ト リ 一、 リ リ ース 2 9 . 0、 1 9 9 4年 6月 ） において検索を 行った と ころ、 同一の配列を有する公知のタンパク質は見い だされず、 新規なア ミ ノ酸配列であった。

上記のこ とから、 本発明の リ ガン ド、 すなわち、 配列表の 配列番号 1及び 2からなる群よ リ 選ばれるア ミ ノ 酸配列を含 有する単離されたポ リ ペプチ ドと 、 該ポ リ ペプチ ドの、 リ セ プタ一型チロ シンキナーゼ活性を有する相同変異体とへの結 合能を有し、 ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動で測定した分 子量が少なく と も 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ンでぁ リ 、 ク マ シ一プ リ リ アン トブル一染色を受け得る化合物であって、 さ らに Ν末端のア ミ ノ酸配列が配列表の配列番号 4に記載の 配列であるポ リ べプチ ドを含有する化合物が、 公知化合物と は異なる新規化合物である こ とが実証された。

また、 配列表の配列番号 1 9に、 精製された本発明の リ ガ ン ドの N末端から、 プロティ ンシークェンサ一で同定できた ア ミ ノ酸配列を示す。 後述するよ う に、 こ の配列表の配列番 号 1 9 のア ミ ノ酸配列に基きセ ンスブライマ一及びア ンチセ ンスプライマーを合成して、 本発明の リ ガン ドの全 c D N A 配列のク ローニングに用いる こ とができ る。

また、 所望であれば、 ト リ プシンなどのプロテアーゼ処理 また化学処理にょ リ リ ガン ドを断片化 して、 それらのァ ミ ノ 酸配列を決定した り 、 カルボキシル末端 （ C末端） のァ ミ ノ 酸配列を決定する こ とが可能である。

後述する よ う に、 ア ミ ノ 酸配列の解析結果から明 らかなよ う に本発明の リ ガン ドは細胞膜結合タ ンパク質であるが、 実 施例 5 から 7 に示すよ う に、 本発明の リ ガン ドをその発現細 胞の細胞培養上清から精製する こ とができ る。 これは、 メ タ ロブ口テアーゼ等のタ ンパク質分解酵素が細胞膜上のァ ミ ノ 酸配列を切断する こ と によ リ 、 細胞外 ドメ ィ ンが細胞上清中 に遊離したためと考えられる。

また、 本発明の リ ガン ド発現細胞にも配列表の配列番号 2 のア ミ ノ酸配列 （配列番号 3 のア ミ ノ酸配列を有する を リ セ プタ一型チロ シンキナーゼの、 シグナルぺプチ ドを除いた、 細胞外 ドメ イ ン、 膜透過 ドメ イ ン及び細胞内 ドメ イ ンの全 ド メ イ ンの配列） を含有するポ リ ペプチ ドが結合する こ と ； さ らに配列表の配列番号 3 (該 リ セプタ一型チロ シンキナーゼ の全ア ミ ノ酸配列） に記載のア ミ ノ酸配列を含有する リ セプ ター型チロ シンキナーゼポ リ べプチ ドの発現細胞を リ ガン ド 発現細胞と反応させる と 、 その リ セプター型チロ シンキナー ゼポ リ ペプチ ドのチロ シン残基が リ ン酸化する こ と ； また、 下記に示すよ う に該 リ ガン ドの全 c D N A配列から推定され るア ミ ノ酸配列の解析結果から、 本発明の リ ガン ドに膜貫通 部分が存在する こ と などから、 細胞膜に も該 リ ガン ドが結合 している こ と は明らかである。 従って、 本発明の リ ガン ドは 細胞膜から も精製でき る。 細胞膜から本発明の リ ガン ドを精 製する場合は、 細胞外 ドメ ィ ンに加え膜透過 ドメ ィ ン及び細 胞内 ドメ イ ンも含むため、 分子量が細胞外 ドメ イ ンのみの分 子よ リ も大き く なる。

大量にかつ安価に本発明の リ ガン ドを得るためには、 実施 例 1 0及び 1 1 に示すよ う に、 遺伝子工学的手法によ り 、 該 リ ガン ドのア ミ ノ酸配列をコ一 ドする遺伝子を取得し、 動物 細胞などの有核細胞、 又は大腸菌等の原核細胞に遺伝子導入 し、 こ の リ ガン ドを生産させ、 単離する こ と によ リ得る こ と ができ る。

まず、 例えば、 実施例 9 において決定された配列表の配列 番号 1 9 に記載のア ミ ノ酸配列に基いて、 実施例 1 0 に記載 した方法によ リ 、 オ リ ゴ D N Aプローブも し く は P C Rブラ イマ一を設計 して、 リ ガン ドを発現している細胞株の c D N A又は c D N Aライ ブラ リ ー、 或いはゲノ ム D N A又はゲノ ムラ イ ブラ リ 一力ゝら、 ハイ ブ リ ダイゼ一シ ョ ン法または P C 法、 或いは両者を組み合わせた方法な どによ り 、 リ ガン ド の全長のア ミ ノ酸配列をコー ドする遺伝子をス ク リ ーニ ング する こ とができ る。

本発明の リ ガン ドの遺伝子を取得する他の方法と して、 リ ガン ド発現細胞の c D N Aライ ブラ リ 一を適当な発現べク タ 一に組み込み、 C O S細胞などで発現させ、 目的の遺伝子を スク リ 一ユングする発現ク ローニングの手法で、 本発明の リ ガン ドの c D N Aを単離する方法を挙げる こ と ができ る。 発 現ク ローニングには、 配列表の配列番号 1 に記載のァ ミ ノ酸 配列を含有する リ セプター型チロ シ ンキナーゼポ リ べプチ ド の リ ガン ドへの結合を利用 したセルソ一ターによ る分画法、 ラ ジオアイ ソ トープを用いたフィルムェマルジ ョ ンによる検 出法等の方法、 も し く は c D N Aライブラ リ ー導入細胞株自 身も し く はその細胞培養上淸と 、 配列表の配列番号 2 のア ミ ノ酸配列を含有する リ セブター型チロ シ ンキナーゼポ リ ぺプ チ ドを発現する細胞株と の共培養によ り 、 該ポ リ ペプチ ドの チロ シ ン残基が リ ン酸化される こ と を指標に した方法を用い る こ とができ る。

このよ う に して得られた該 リ ガン ドをコ一 ドする c D N A 塩基配列を、 その前後のノ ンコーディ ング領域、 及びそれが コ一 ドするア ミ ノ酸配列と共に配列表の配列番号 7 に示 した。 該 c D N A配列から予想されるァ ミ ノ酸配列に関 して、 K y t e — D o o 1 i t t 1 e の方法 U. Mo l . B i o l . 157 : 105, 19 82 ) に従って、 疎水性部分及び親水性部分を解析した。 その 結果、 本発明の リ ガン ドは、 疎水性のア ミ ノ酸配列からなる 透過性 ドメ イ ンと 、 親水性のア ミ ノ酸配列からなる細胞内及 び細胞外 ドメ ィ ンを有するぺプチ ドアンカー型の細胞膜タ ン ノ ク質である こ とが明 らかと なった。 従って、 リ ガン ドの細 胞外 ドメ イ ンが リ セプタ一型チロ シンキナーゼの細胞外 ドメ イ ンに結合する こ と によ り 、 該 リ セプタ一型チロ シ ンキナー ゼの細胞内における リ ン酸化を引き起こすと考え られる。

具体的には、 本発明の リ ガン ドのア ミ ノ酸配列は、 配列表 の配列番号 7 のア ミ ノ酸配列の一 2 5番から— 1 番の 2 5 ァ ミ ノ酸残基からなるシグナルぺプチ ド ； 配列表の配列番号 7 のア ミ ノ酸配列の 1 番から 1 9 5番の 1 9 5 ア ミ ノ 酸残基か らなる細胞外 ドメ イ ン、 配列表の配列番号 7 のア ミ ノ 酸配列 の 1 9 6番カゝら 2 2 5番の 3 0 ア ミ ノ酸残基からなる膜透 ifi ドメ イ ン、 配列表の配列番号 7 のア ミ ノ 酸配列の 2 2 6 番か ら 3 0 8番の 8 3 ア ミ ノ酸残基からなる細胞内 ドメ イ ン、 よ リ構成される。 ただし、 シグナルペプチ ド部分以外の各部分 は、 あ く までもア ミ ノ酸配列から推定された ドメ イ ン構成で ぁ リ 、 実際の存在形態は、 上記の構成と若干異なる こ と も考 えられ、 上記に一応規定された各 ドメ ィ ンの構成ア ミ ノ酸が 5 から 1 0 ア ミ ノ酸程度前後する こ と もある。

また、 配列表の配列番号 5 に記載したア ミ ノ酸配列は、 配 列表の配列番号 7 のア ミ ノ 酸配列の 1 番から 1 9 5番のア ミ ノ酸配列、 すなわちシグナルぺプチ ドを除く 上記の細胞外 ド メ イ ンのア ミ ノ酸配列を示 し、 また、 配列表の配列番号 6 の ア ミ ノ酸配列は配列表の配列番号 7のァ ミ ノ酸配列の 1番か ら 3 0 8番のア ミ ノ酸配列、 すなわちシグナルぺブチ ドを除 く 本発明の リ ガン ド全体のァ ミ ノ 酸配列を示す。

上記したブロティ ンシークェンサ一で決定した N末端のァ ミ ノ酸配列、 すなわち配列番号 1 9 に示す 4 8 ア ミ ノ 酸残基 からなるア ミ ノ酸配列と 、 c D N A配列から推定された配列 番号 7のア ミ ノ酸配列の 1番から 4 8番のア ミ ノ酸配列は、 配列表の配列番号 1 9 のア ミ ノ酸配列において決定できなか つた 3箇所の XXX 部分を除き 、 ア ミ ノ酸配列は完全に一致し た。

尚、 本発明の リ セプタ一型チロ シンキナーゼ リ ガン ドの c D N Aの全塩基配列を含むベク タ一 p U C M E K Lを大腸菌 D H 5 α に遺伝子導入した形質転換細胞は、 日本国通産省ェ 業技術院生命工学工業技術研究所において寄託番号 F E R Μ

B P— 5 0 0 8 と して 1 9 9 5年 2月 2 1 日 に寄託されて いる。

上記したよ う に、 配列表の配列番号 1 に記載のア ミ ノ酸配 列を含有する、 リ セプタ一型チロ シンキナ一ゼの細胞外 ドメ イ ンであるポ リ ぺブチ ドには、 本発明の リ ガン ドの細胞外 ド メ イ ン、 即ち配列番号 5 に記載のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少なく と も一部が結合 し、 該 リ セプタ一型チロ シンキナーゼの リ セブター型チロ シンキナーゼ活性を賦活化 する と考えられる。 尚、 こ こでい う 「一部」 と は、 リ セプタ —型チ口 シンキナーゼ リ ガン ド活性を有する リ ガン ドの活性 中心である連続する少なく と も 1 2個のア ミ ノ酸残基でぁ リ リ セブター型チロ シンキナーゼ活性を指標に して同定する こ とが可能である。

また、 本発明の リ ガン ドのア ミ ノ酸配列から、 その幾つか のア ミ ノ酸残基に糖鎖が付加される こ とが予想される。 例え ば、 N —ァセチル一 D—ダルコサ ミ ンが N —グ リ コ シ ド結合 可能な部分と して、 配列表の配列番号 7 のア ミ ノ酸配列の 1 1 番及び 1 1 4番のァスパラギン残基が挙げられる。 しかし 該 1 1 番のァスパラギンは実施例 9 で行ったプロティ ンシー クェンサ一によるア ミ ノ酸配列解析の際には、 測定に何等影 響を与えなかったため、 少なく と も本発明で使用 した C— 1 細胞が産生している リ ガン ドにおいては、 配列番号 7 のァ ミ ノ酸配列の 1 1 番のァスパラギン残基には糖鎖が付加されて いないと考え られる。 また、 N —ァセチル一 D —ガラ ク トサ ミ ンが O—ダ リ コ シ ド結合可能な部分と して、 セ リ ンまたは ス レオニン残基の頻出する配列表の配列番号 7 のァ ミ ノ酸配 列の 1 4 4番のセ リ ン以降の細胞外 ドメ ィ ンが挙げられる。 特に、 その可能性の高い部分と して、 配列表の配列番号 7 の ア ミ ノ酸配列の 1 5 5番のス レオニン、 及び 1 6 8番のセ リ ンから 1 7 2番のセ リ ンまでのセ リ ン残基も し く はス レオニ ン残基、 及び 1 8 1 番のセ リ ンから 1 8 3番のス レオニンま でのセ リ ン残基も し く はス レオニ ン残基が挙げられる。 一般 に、 これらの糖鎖が付加されたポ リ べプチ ドの方が糖鎖の付 加していないものよ り も生体内での分解に対して安定であ り また強い生理活性を有している と考えられる。

上記したよ う に、 実施例 5 から 7では本発明の リ ガン ドを 細胞培養上清から精製しているが、 この リ ガン ドは、 メ タ 口 プロテア一ゼ等のタ ンパク質分解酵素が細胞膜上のァ ミ ノ酸 配列を切断する こ と によ リ 、 細胞外 ドメ ィ ンが細胞上清中に 遊離した分子と考えられる。 例えば、 その切断部位は上記し た細胞外 ドメ イ ン と膜透過 ドメ イ ンの間、 即ち配列表の配列 番号 7のア ミ ノ酸配列の 1 9 5番のイ ソ ロイ シンと 1 9 6番 のロ イ シンの間と考えられるが、 その他の部分において同様 にタ ンパク質分解酵素等にょ リ 消化されて切断された可能性 もある。

本発明で明 らかにされた リ ガン ドの遺伝子配列並びにア ミ ノ酸配列をジェンバンク （ G e n b a n k 、 1 9 9 4年 1 0 月 、 リ リ ース 8 5 ) において検索 したと こ ろ、 最も類似性の ある物質と して、 L E R K— 2 (Beckmann e t aし， EMBO J . 13 : 3757, 1994. , Fl et cher e t a 1. , Oncogene 9 : 324し 1994、 及び国際出願公開第 9 4 Z 1 1 3 8 4 号を参照） を挙げる こ とができ るが、 ア ミ ノ酸配列全体でホモ ロ ジ一は 5 4 %と低 く 、 本発明の リ ガン ドと L E R K — 2 と は全く 異なった物質 である。 また、 こ の L E R K— 2 は、 本発明の リ ガン ドが特 異的に結合する リ セプタ一型チロ シンキナーゼに対し比較的 ホモロ ジ一のある リ セプタ一型チコ シンキナーゼ E L Kの、 結合タ ンパク質も し く は リ ガン ドと して同定された物質であ る。

尚、 本発明の リ ガン ドの全 c D N A配列がコ一 ドするア ミ ノ 酸配列と 、 上記の L E R K— 2のア ミ ノ酸配列と の共通点 は、 以下の通り である。 まず、 ジスルフ ィ ド結合を している と予想されるシスティ ン残基 4つ、 すなわち配列表の配列番 号 7のア ミ ノ 酸配列の 3 7番、 6 4番、 7 6番及び 1 2 8番 のシスティ ン残基の、 ア ミ ノ酸配列上における位置は共通し ている。 また、 N—ァセチルー D—ダルコサミ ンが N—グ リ コ シ ド結合可能な部分、 すなわち配列表の配列番号 7のア ミ ノ酸配列の 1 1 4番のァスパラギン残基の、 ア ミ ノ 酸配列上 における位置も共通 している。 さ らに、 細胞内 ドメ イ ンであ る配列表の配列番号 7のア ミ ノ酸配列の 2 7 6番から 3 0 8 番の 3 3ア ミ ノ酸残基よ リ なる配列は、 全く 同 じである。

以上のこ とから、 本発明の リ ガン ドと L E R K— 2が同 じ 生理作用を有する可能性もあるため、 実施例 1 9に示すよ う に、 本発明の リ ガン ドと上記の L E R K— 2 を対比する 目的 で、 L E R K— 2の遺伝子を P C R法にて ヒ ト胎盤の c D N Aょ リ 取得し、 発現させて、 本発明の リ ガン ドが結合する リ セプター型チロ シンキナーゼに対する作用の解析を行った。 その結果、 該 リ セプタ一型チロ シンキナーゼに対して、 弱い ながら結合したが、 その結合は本発明の リ ガン ドょ リ はるか に弱く 、 また、 該リ セプターの リ ン酸化を引き起こす作用 も 極めて弱かった。 従って、 L E R K— 2 は本発明の リ ガン ド と構造上の類似性はあるが、 全く 違う 生理的作用を有する物 質である。

本発明の リ ガン ドは、 実施例 1 3 から 1 4 に示すよ う に、 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ド の少なく と も一部、 好ま し く は配列表の配列番号 5 のァ ミ ノ 酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少なく と も一部をコー ドす る単離された D N Aを用いて、 遺伝子工学的手法にょ リ 、 配 列番号 6又は 5 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少 な く と も一部と して作製する こ と ができ る。

即ち、 配列表の配列番号 6 のァ ミ ノ酸配列を含有するポ リ ぺプチ ドの少なく と も一部を含有してなる単離された化合物 の製造方法に して ：

( a ) 該ポリ べプチ ドの少な く と も一部をコ一 ドする D N Aを複製可能な発現ベク ターに連結 して、 該 D N Aが、 該 複製可能な発現ベク ターに発現可能に組み入れられてなる複 製可能な組換え D N Aを得て、

( b ) 真核細胞又は原核細胞を該複製可能な組換え D N Aで形質転換 して、 形質転換体を形成 し、

( c ) 該形質転換体を親細胞と しての該真核細胞又は原 核細胞から選別し、

( d ) 該形質転換体をイ ンキュベー トする こ と によ リ 、 形質転換体に該 D N Aを発現させて、 該ポ リ べプチ ドの少な く と も一部を含有してなる化合物を生産させ、 そ して

( e ) ィ ンキュベ一 ト された形質転換体から該化合物を 単離する、

こ と を特徴とする方法によれば、 本発明の リ ガン ドを遺伝子 工学的手法によ リ産生する こ とができ る。 得られた リ ガン ド は、 上記した公知の方法にょ リ精製する こ とができ る。 よ り 安定した生産条件と しては宿主と して動物細胞を用いるこ と が望ま しい。

実施例 1 3 に記載したよ う に、 本発明の リ ガン ドは、 配列 表の配列番号 6 に記載のァ ミ ノ酸配列を有するポリ べプチ ド をコー ドする c D N Aを発現させる こ と によ リ 得ても よいが この状態では膜結合型でぁ リ 、 精製及び製剤化に手間がかか る。 そこで、 精製、 製剤化をよ り 効率的に行う ために、 実施 例 1 7 および 1 8 に記載したよ う に、 生理活性中心を含む ド メ ィ ンである配列表の配列番号 5 に記載 したァ ミ ノ酸配列、 すなわち該リ ガン ドの細胞外 ドメ ィ ンのみを産生させるこ と が好ま しい。 即ち、 配列表の配列番号 5 に記載のア ミ ノ酸配 列の少なく と も一部をコー ドする D N Aを用い、 分泌型タ ン パク質と して産生させる方が好ま しい。

また、 本発明の リ ガン ドを発現させる形態と しては リ ガン ド単独の化合物でもよいが、 複合体の形態でも可能である。 本発明において、 "複合体" と は、 配列表の配列番号 6 、 好 ま しく は配列番号 5 のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ べプチ ド の少な く と も一部を含有する化合物と、

配列表の配列番号 6 、 好ま しく は配列番号 5 のァ ミ ノ酸配 列を含有するポリ べプチ ドの少な く と も一部を含有する化合 物の少なく と も 1 種と 、 上記のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ ぺプチ ドの少なく と も一部を含有する化合物以外の化合物か らなる群から選ばれる少な く と も 1 種、

とからなる複合体を意味する。 本発明の複合体は、 上記 した リ ガン ド 1 分子と比較して、 同等又はそれ以上の生理活性を 有する こ とから好ま し く 使用する こ とができ る。

本発明の複合体の例と しては、 実施例に記載している よ う に、 リ ガン ドと ヒ ト I g Gの F c 部分と のキメ ラ タ ンパク質 と して発現させて、 更にその I g G F c の ヒ ンジ領域と の間 にジスルフイ ド結合を形成させた 2 量体 ； 特定の抗原 （例え ばヒ ト I g Gの F c 部分、 F L A Gなど） を リ ガン ドのア ミ ノ 酸配列の C末端も し く は N末端側に発現させてキメ ラ タ ン パク と して得、 該抗原を特異的に認識する抗体と反応させて 抗原抗体複合体を形成させる こ と によ リ 得られる複合体 ； ヒ ト I g G F c の ヒ ンジ領域のみと のキメ ラ タ ンパク を発現さ せて、 ジスルフ ィ ド結合にて 2 量体を形成させた複合体 ； リ ガン ドの活性に何等影響を与えないぺプチ ドを、 該 リ ガン ド の C末端側、 N末端側も し く はその他の部位に発現させて最 終的にジスルフ ィ ド結合を形成する よ う に作成されたキメ ラ タ ンパク ； 配列表の配列番号 6 、 好ま しく は配列番号 5 のァ ミ ノ酸配列の少なく と も一部をコー ドする D N Aを、 翻訳の 読枠が合う よ う に 2 つ以上連結させた多量体、 などを挙げる こ とができ る。

また、 本発明の複合体と しては、 上記 したも のの他に発現 精製された該 リ ガン ドの細胞外 ドメ イ ンのポ リ べプチ ドを、 架橋剤を用いて架橘 したも の も挙げられる。 例えば、 リ シン 残基を架橘するジメ チルスべ口イ ミデー ト 2塩酸塩、 システ イ ン残基のチオール基で架橋する N— ( γ —マ レイ ミ ドブチ リ ルォキシ） ス ク シンイ ミ ド、 ァ ミ ノ基と ア ミ ノ基を架橋す るダルタールアルデヒ ドな どの架橋剤を用いて、 タ ンパク質 糖質の架橋反応を行い、 リ ガン ドの複合体を形成させる こ と ができ る。

実施例 1 3 および実施例 1 6 に示 した様に、 配列表の配列 番号 6 のア ミ ノ酸配列をコー ドする D N Aを有する発現べク ターを用いて発現させる と 、 天然の細胞膜上に存在する リ ガ ン ドと 同様の生理活性を有する リ ガン ドが得られる。 例えば. 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列、 も しく は配列表の配列 番号 5 のア ミ ノ酸配列の C末端に疎水性のア ミ ノ 酸を有する よ う なア ミ ノ 酸配列を有するポリ べプチ ドが、 Ν末端が細胞 外にでるよ う に して、 脂質、 リ ん脂質な どの生体膜などを模 倣した、 ミセルも しく は リ ポソ一ムの形態を有する物質上に 存在する形に して、 細胞膜上の分子と して発現させた場合と 同様の生理活性を発揮させる こ とができ る。

本発明の リ ガン ド及び該 リ ガン ドを含む複合体は、 血液未 分化細胞の分化及び増殖を促進する作用を有する こ とから、 白血病、 骨髄移植時の早期回復剤、 抗癌剤投与時の骨髄抑制 回復剤及びその予防剤等の医薬品の活性成分と して有用であ る。 また、 上記したよ う に、 該リ ガン ドを生体膜に類似 した 形態を有する物質 （例えば、 ミセルゃリ ボソーム） 上に存在 する形に したものも、 同様な医薬品の活性成分と して有用で ある。

本発明の リ ガン ドを ミセルゃリ ポソ一ム上に設ける方法と しては、 例えば、 リ ガン ドの一部分に リ ン脂質を共有結合さ せて、 この部分を リ ボソームゃミセルの脂質層に入れる方法 や、 α ヘ リ ッ ク スを持つペプチ ドを リ ガン ドにつなぎ、 その 部分を リ ポソ一ムゃミセルの脂質層に入れる方法がある。

また、 本発明の リ ガン ドを、 人体から摘出 した血液系細胞 を体外の培地において増殖、 活性化し、 再び体内に細胞を戻 す医療方法にも利用する こ とができ る。 その場合には、 本 ¾ 明の リ ガン ドを直接培地中に加える こ と も可能だが、 リ ガ ン ドを細胞培養容器に固定化する事が望ま しい。 固定化の方 と しては、 該 リ ガン ドのア ミ ノ基ゃカルボキシル基を利用す る と と もに適当なスぺーサーを用いる こ となどによって、 培 養容器に リ ガン ドを共有結合によ って固定化させる こ とがで き る。 リ ガン ドのァ ミ ノ基を用いる場合のスぺ—サ—の例と しては、 ω — カルボキシアルキル基誘導体、 ブロ モアセチル 誘導体、 ジァゾニゥム誘導体などが挙げられる。 リ ガン ドの カルボキシル基を用いる場合のスぺ—サ一の例と しては、 ω 一ア ミ ノ アルキル誘導体ゃヒ ドラ ジ ド誘導体が挙げられる。 また、 他の固定化方法と しては、 C N B r 活性化によ る方法 もある。 尚、 リ ガン ドの固定化方法の詳細については、 例え ば、 「実験と応用 ァフィ 二ティ 一ク ロマ ト グラ フィー」 ちばた いちろ う

千畑一郎ら、 日本国、 講談社、 1 9 7 6 年、 3 1 〜 9 5 頁を 参照する こ とができ る。 このよ う に、 固体表面に固定化され た形態を有し、 リ セブター型チロ シンキナーゼ リ ガン ド活性 を有し、 さ らに配列表の配列番号 6 又は 5 のァ ミ ノ 酸配列を 含有するポリ べプチ ドの少なく と も一部を含む化合物に関 し ても本発明に含まれる。

遺伝子工学的手法によ り 産生された本発明の リ ガン ドは、 上記 したよ う に本発明で使用する リ セプタ一型チロ シ ンキナ ーゼの細胞外部分のポリ べプチ ドを利用 して精製する こ と も でき るが、 実施例 1 5 に示 したよ う に、 該 リ ガン ドで適当な 動物を免疫する こ と によって作製されたポ リ ク 口 一ナル抗 又はモ ノ ク ロ ーナル抗体を用いたァフ ィ 二テ ィ ーク 匚 マ ト " ラ フィ ーを利用する こ と によ リ精製する こ と もでき る。

本発明の リ ガン ドはヒ ト さい帯血単核球のコ ロニ一形成を 促すこ と によ って、 血液未分化細胞の増殖を促す作用を有す ₍ 本発明の リ ガン ド及び該 リ ガン ドを含む複合体血液未分化細 胞の分化及び増殖を促進する作用を有する こ とから、 白血病 骨髄移植時の早期回復剤、 抗癌剤投与時の骨髄抑制回復剤及 びその予防剤等の医薬品の活性成分と して有用である。 本発 明の リ ガン ドを医薬品と して用いる場合は、 本発明の リ ガン ドの凍結乾燥品を、 注射用蒸留水にて溶解も し く は懸濁して 使用する こ とが望ま しい。 例えば 0 . 1 から l O O O g Z m 1 の澳度に調製した注射剤、 点滴剤と して提供する こ と が 簡便である。 さ らに、 血液細胞を体外にて増殖、 活性化させ るために用いる場合にも、 医薬品同様に凍結乾燥品や溶液剤 を作製して、 上記したよ う に培地に加えた リ 、 培養に使用す る容器に固定化して用いる こ とができ る。 また、 マウスに対 して本発明の リ ガン ド 1 μ g / k g を腹腔内投与した実験に おいて、 マウスが死ななかったこ とから、 医薬品と して使用 可能である こ とが確認された。

また、 本発明の リ ガン ドのィ ンビ ト 口 の生理活性の確認は 種々 の疾患モデルマウス、 またはそれらに準ずる疾患に似た 症状を呈するラ ッ ト 、 サル等の動物をモデルと して投与を行 い、 その身体的、 生理的な機能の回復、 異常を調べる こ と に ょ リ行う こ と ができ る。 例えば、 造血細胞に関する異常に対 する本発明の リ ガン ドの生理活性については、 5 — F U系の 抗癌剤を投与して、 骨髄抑制モデルマウスを作製し、 このマ ウスに本発明の化合物を投与した群と しなかった群を設け、 それぞれの群について骨髄細胞、 末梢血細胞の数、 生理的な 機能を調べる こ とで明 らかになる。 また更に、 体外で造血幹 細胞を含む血液未分化細胞の培養、 增殖を調べる場合には、 マウス骨髄細胞を培養器などを利用 して、 培養を行い、 その 際に本発明の化合物を加えた群と加えなかった群で培養後の 細胞を致死量放射線照射マ ウスに細胞移植を行い、 その結果 の回復の度合いを、 生存率、 血球数の変動などを指標にする こ とで調べる こ とが出来る。 これらの実験の結果は人にも外 挿でき るため、 本発明の化合物の薬効を評価するための有効 なデータ と して利用する こ とが出来る。

また、 本発明の化合物のポ リ ぺブチ ドをコ一 ド している m R N Aが どの臓器において発現されているかを示 した実施例 1 2 の結果、 並びに リ セプターの m R N Aがどの臓器におい て発現されているかを示した参考例 7 の結果を対比すれば、 本発明の化合物が何らかの生理活性またそれに準じる薬効が 生じるであろ う臓器と して肺、 腎臓が挙げられ、 この点から これらの臓器が関連する疾患が本発明の化合物を用いた治療 の対象と して予想される。 また、 肝臓に関 しては、 本発明に おける リ セプタ一型チロ シンキナーゼの遺伝子が肝臓ガンに おいて強く 発現されている こ とが本発明の参考例 7 の肝臓ガ ン細胞株 H e p 3 Bのノザンブロ ッ ト の結果、 並びに B e n n e t t らの論文 ( B e n n e t t e t a 1 . , J . B i o 1 . C h e m . , 2 6 9 , 1 4 2 1 1 - 1 4 2 1 8 , 1 9 9 4 ) 、 及び本発明者らによ る国際出願公開第 9 5 / 1 5 3 8 6 号の明細書に記載されている。 従って、 本発明 の リ ガン ドは肝臓ガンや肝臓正常組織の増殖等に関連 し、 こ れらに関連する疾患にと って有効な薬剤も し く は有効な薬剤 のスク リ 一ニング系などに応用可能である。

上記 したよ う に、 本発明の化合物を医薬品と して利用する 場合、 白血病、 骨髄移植時の早期回復剤、 抗癌剤投与時の骨 髄抑制回復剤及びその予防剤などの造血細胞に関連する疾患 に対する薬剤が考え られる。 その際の投与量と してはその医 薬品と しての形態、 リ ガン ドの活性にも よるが、 0 . l m g / k g から 1 0 O m g / k g程度投与すればよい。

また、 実施例 1 2 に示したよ う に配列表の配列番号 7 の遺 伝子配列の一部である 1 2 m e r から 1 6 m e r 以上の配列 と対をなす、 単離されたアンチセ ンス D N A断片及びアンチ セ ンス R N A断片、 及びそれらがメ チル化、 メ チルフォ ス フ ェ一 ト化、 脱ァ ミ ノ化、 またはチォフォ ス フ ェー ト化された 誘導体を用いて、 本発明の リ ガン ドの遺伝子発現をノ ーザン ブロ ッ ト によ リ調べる こ と が可能である。 実施例 1 2 に示し た方法と 同様な方法で、 マ ウス、 ラ ッ ト等の他の生物の本発 明の遺伝子のホモ口 グの検出や遺伝子ク ローニングに利用す る こ とができ る。 さ らに、 人のゲノ ムを含めたゲノ ム上の遺 伝子の検出及びク ローニングにも同様に利用可能でぁ リ 、 そ のよ う に してク ローニングされた遺伝子を用いれば、 本発明 の リ ガン ドの更に詳細な機能も明 らかにする こ とが出来る。 例えば、 近年の遺伝子操作技術を用いれば、 ト ラ ンスジェニ ッ クマ ウス、 ジータ一ゲッティ ングマウス、 また、 本発明の 遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノ ッ ク ァ ゥ トなどのあらゆる方法を用いる こ とが出来る。 また、 本発明 の遺伝子に対応するゲノ ム上の部分に異常がある場合は、 遺 伝子診断、 遺伝子治療への応用も可能である。 又、 配列表の 配列番号 7の塩基配列の一部を有する単離されたセ ンス D N A断片及びアンチセ ンス D N A断片あるいはそれらの誘導体 又それに対応する配列を有する単離されたセンス R N A断片 及びアンチセ ンス R N A断片あるいはそれらの誘導体、 によ リ細胞内の遺伝子発現を調節する事も可能である。

また、 実施例 1 5 に示した、 本発明の化合物を特異的に認 谶する抗体を用いれば、 本発明の化合物群の検出、 測定が可 能でぁ リ 、 上記に示 した疾患などの診断薬と して有用である ,

発明を実施するための最良の形態

以下参考例及び実施例によって、 本発明をよ リ 具体的に説 明するが、 本発明はこれらによって何ら限定される ものでは ない。

参考例 1 ヒ ト血液細胞株 U T— 7の P o 1 y (A) ⁺ R N

Aの調製

U T— 7細胞の培養、 継代は、 培地と して牛胎児血清 （ F C S、 以下本特許で用いた F C Sは全てオース ト ラ リ ア国、 フィノレ ト ロ ン社製） を 1 0 %含むイ スコ フ改変ダルベッ コ培 地 （ I MDM) (米国、 G I B C O— B R L社製） を用い、 ヒ ト顆粒球マ ク ロ フ ァ ージコ ロ ニー刺激因子 （ h GM— C S F ) (米国、 I n t e r g e n社製） を 2 n g /m l と なる よ う に加え、 C〇 ₂ イ ンキュベータ一にて 3 7 °Cの条件で行 つた。 未刺激細胞は、 同 じ条件で培養 した細胞を用いた。 巨 核球に分化させる際には、 細胞濃度 2 X 1 0 ⁵ c e 1 1 s / m l に希釈し、 h GM— C S Fを 2 n g Zm l と なる よ う に カロえ、 さ らに P h o r b o l 1 2 —M y r i s t a t e 1 3 — A c e t a t e ( P MA : 米国、 s i g m a社製） を 1 O n g /m 1 となるよ う に加え、 3 日 間培養後細胞を回収 した。 これらの各条件で培養 した細胞を各々細胞数 1 X 1 0 ⁸ 個回収 し、 P B S (― ) ( 日本国、 二 ッスィ株式会社） に て 3回洗浄し、 R N Aの抽出に用いた。

回収 した細胞力 ら L i t h i u m C h l o r i d e /U r e a 法 （Eur. J. Biochei 107:303 ( 1980) ) にて T o t a 1 R N Aを抽出 した。 次に、 O l i g o t e x - d T 3 0 (日本国、 宝酒造社製） にて、 P o l y ( A) + R N Aを分 離 · 精製した。

参考例 2 チロ シンキナ一ゼに特異的なプライ マ一の作成

W i 1 k s の方法 （Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA 86： 1603, 198 9 ) に従い、 チロ シンキナーゼのサブ ドメ イ ン 7 と 9 に対応 し、 かつ制限酵素の認識部位を連結した混合プライマ一、 す なわちセンスプライマー P T K I ： 5' -TTGTCGACAC (AC) G (AG) GA(CT) (CT)T(CG)GC(ACGT)GC(ACGT) (AC)G - 3'、 ( 2 7 m e r ： 制限酵素の認識部位と して S a 1 I 部位が付加されている。 配列表の配列番号 8 に記載） およびアンチセ ンスプライマー P T K I I ： 3'-CT(AG)CA(CG)ACC(AT) (CG) (AG) A (AT) ACCTTAA GGT-5' ( 2 4 m e r ： 制限酵素の認識部位と して E c o R I 部位が付加されている。 配列表の配列番号 9 に記載） を用い 以下の P C Rを行った。

合成オリ ゴヌ ク レオチ ドは固相法を原理とする全自動 D N A合成機を使用 して作成した。 全自動 D N A合成機と しては 米国のアプライ ドバイオシステム社 3 9 1 P C R -M A T E を使用 した。 ヌ ク レオチ ド、 3 '-ヌ ク レオチ ドを固定した担 体、 溶液、 および試薬は同社の指示に従って使用 した。 所定 のカ ップリ ング反応を終了 し、 ト リ ク ロ 口酢酸で 5 ' 末端の 保護基を除去 したオ リ ゴヌ ク レオチ ド担体を濃ア ンモニア中 にて室温で 1 時間放置する こ と によ り担体からオ リ ゴヌ ク レ ォチ ドを遊離させた。 次に、 核酸及びリ ン酸の保護基を遊離 させるために、 核酸を含む反応液を、 封を したバイ アル内に おいて濃アンモニア溶液中で 5 5 °Cにて 1 4時間以上放置し た。 担体及び保護基を遊離した各々 のオリ ゴヌ ク レオチ ドの 精製を米国のアプライ ドバイォシステム社の O P C力一 ト リ ッ ジを使用 して行い、 2 % ト リ フルォロ酢酸で脱 ト リ チル化 した。 精製後のプライマ一は最終濃度が 1 μ g / μ β と なる よ う に脱イオン水に溶解して P C Rに使用 した。

参考例 3 c D N Aの合成

参考例 1 によ リ得られた P o 1 y ( A ) ⁺ R N Aを用いて c D N Aの合成を行った。 すなわち、 P o l y ( A ) ⁺ R N Aの 2 g を脱イ オン水 1 2 . 3 £ に溶解し、 1 0 X緩衝 液 （ 5 0 0 m M K C 1 、 1 0 0 m M T r i s — H C 】

( p H 8 . 3 ) 、 1 5 mM M g C 1 ₂ 、 0 . 0 1 %ゼラチ ン） 2 μ β 、 d N T P M i x t u r e (日本国、 宝酒造社 製） 4 μ β 、 前述のチ ロ シンキナーゼに特異的なアンチセ ン スプライマ ー Ρ Τ Κ Ι I ( 1 μ g / μ Ά ) 1 μ β 、 ア ビア ン ミ エロ ブ'ラ ス ト シス ウイノレス逆転写酵素 ( a V i a n m y e l o b l a s t o s i s v i r u s r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e : 米国、 L i f e S c i e n c e社製 ： 3 2 υ/ μ β ) 0 . 2 μ β 、 及び R N a s e イ ン ヒ ビタ一 （独国、 B o e h r i n g e r 社製 ： 4 0 υ / μ β ) 0 . 5 μ β 加えて 3 7 °Cで 7 5分間放置後、 6 5 °Cで 1 0分 間放置した。

参考例 4 チロ シンキナーゼに特異的なプライマ一による P

C R

P C Rによ る増幅は以下のよ う に行った。 参考例 3 で得ら れた c D N A溶液 2 0 £ を使用 し、 1 0 X緩衝液 （ 5 0 0 m M K C 1 、 1 0 0 m M 丁 r i s — H C 1 ( p H 8 . 3 ) 、 1 5 mM g C 1 ₂ 、 0 . 0 1 %ゼラ チン） 8 μ β 、 d N T P M i x t u r e ( 日本国、 宝酒造社製） 6 . 4 μ Ά 、 前述のチロ シンキナーゼに特異的なセンスプライマー Ρ Τ Κ

1 ( 1 μ g / μ β ) 1 . 5 β 、 及び T a q D N Aポ リ メ ラ —ゼ （ Am p l i T a q : 米国、 P e r k i n — E l m e r 社製、 5 U/ /i £ ) 0 . 2 £ を加え、 最後に脱イ オン水を 加えて全量を 1 0 0 μ β と して、 9 4 °Cで 1 分間、 3 7 °Cで 2分間、 7 2 °Cを 3分間からなる行程を 1 サイ ク ル と して 、 こ の行程を 4 0サイ クル行い、 最後に 7 2 °Cにて 7分間放置 して P C R を行った。 こ の P C R産物の一部を 2 %ァガロー スゲル電気泳動を行い、 ェチジュ ゥムブ口マイ ド （ 日本国、 日本ジーン社製） にて染色後、 紫外線下で観察し、 約 2 1 0 b p の c D N Aが増幅されている こ と を確認した。

参考例 5 P C R産物のク ロ ーニ ング及び塩基配列の決定

P C R産物の全量を低融点ァガロー ス （米国、 G I B C O 一 B R L社製） にて作成 した 2 %ァガロー スゲルにて電気泳 動 し、 ェチジュ ゥムブ口マイ ドにて染色後、 紫外線照射下に て約 2 1 0 b pのバン ドを切 リ 出 し、 ゲルと 同体積の蒸留水 を加え、 6 5 °Cにて 1 0分間加熱 し、 ゲルを完全に溶かした のち、 等量の T E飽和フ エ ノ ール （日本国、 日本ジー ン社製） を加えて、 1 5 0 0 0 r p m 5分間遠心分離後上清を分離し、 さ らに同様な分離作業を T E飽和フ エ ノ ール ： ク ロ ロ フ オル ム （ 1 ： 1 ) 溶液、 さ らにク ロ ロ フ オ ノレム にて行った。 最終 的に得られた溶液から c D N Aをエタ ノ ール沈澱して回収し た。 回収した c D N Aを制限酵素 E c o R I ( 日本国、 宝酒 造社製） 及び S a 1 I (日本国、 宝酒造社製） にて消化した のち、 ベク タ一への組み込みに用いた。

ベク ターと しては p B I u e s c r i p t I I K S (米国、 S t r a t a g e n e社製、 以下 p B l u e s c r i p t と示す） を用い、 先の c D N Aを組み込む前に、 制限 酵素 E c o R I 及び S a 1 I にて消化して、 上記の方法で精 製した。 これらの処理を行ったベク タ一と先の c D N Aのモ ル比力； 1 ： 5 と なる よ う に混ぜ合わせて、 米国の N e w E n g l a n d B i o L a b社製 T 4 D N A リ ガ一ゼにて ベク タ一に c D N Aを組み込んだ。 c D N Aが組み込まれた p B I u e s c r i p t を大腸菌 J M 1 0 9 ( 日本国、 東洋 紡社製） に遺伝子導入し、 アンピシ リ ン （米国、 S i g m a 社製） を 5 0 / g /m l 含む L一 B r o t h ( 日本国、 宝酒 造社製） 半固型培地のプ レー ト に蒔き 、 1 2時間程度 3 7 °C に放置し、 現れてきたコ ロニーをラ ンダムに選択 し、 c D N Aが組み込まれている こ と を制限酵素 E c o R I 及び S a 1 I にて消化して、 2 1 0 b pの c D N Aが切れ出されて く る こ と を確認し、 確認されたク ローンについて、 組み込まれて いる c D N Aの塩基配列を米国のアプライ ドバイオシステム 社の螢光シークェンサ一にて決定した。 その結果、 未刺激の U T— 7細胞からはク ローニ ングされたが、 U T— 7 を巨核 球に分化させた場合にはク ローニングされなかったチロ シン キナーゼ遺伝子断片を得た。 この遺伝子断片は配列表の配列 番号 3 の 2 6 4 2番 目カゝら 2 8 1 2番目 であった。

参考例 6 c D N Aライブラ リ ーの作成及びチロ シ ンキナー ゼ遺伝子の全長ク ローニ ング及びその解析 前述の方法にて分離精製された未刺激状態の U T— 7 ¾ の P o l y ( A ) ⁺ R N Aを用レ、て c D N Aラ イ ブラ リ ー ' 作成した。 U T— 7 c D N Aライ ブラ リ ーの作成に： i p C :' M 8ベク タ一 c D N Aライブラ リ 一作成キ ッ ト （オラ ンダ I n V i t r ο g e n社製） を用い、 添付の作成方法に従つ て作成 した。 さ らに、 前述の方法に従って ヒ ト胎盤よ リ P o 1 y ( A ) ⁺ R N Aを精製し、 c D N Aライブラ リ 一を作成 した。 ヒ ト胎盤 c D N Aライ ブラ リ 一の作成には ； L Z A P c D N Aライブラ リ ー作成キ ッ ト （米国、 S t r a t a g e n e社製） を用い、 添付の作成方法に従って作成 した。

次に、 これらの c D N Aライ ブラ リ 一力 ら コ ロニーノヽイブ リ ダイゼーショ ンも し く はプラークハイ ブ リ ダイゼーシ ョ ン にて全長 c D N Aを持ったク ロ ー ンの検索を 5 X 1 0⁵ 相当 のコ ロニ一も しく はプラークから行った。 出現したコ ロニー も し く はプラーク をナイ ロ ンフイノレター （ H y b o n d N + : 英国、 Am e r s h a m社製） に転写し、 転写したナイ ロ ンフイノレターをアルカ リ 処理 （ 1 . 5 M N a C l 、 0 .

5 M N a O Hを染み込ませたろ紙上に 7分間放置） し、 次 いで中和処理 （ 1 . 5 M N a C l 、 0 . 5 M T r i s — H C 1 ( p H 7 . 2 ) 、 I mM E D丁 Aを染み込ませたろ 紙上に 3分間放置） を 2回行い、 次に S S P E溶液 （ 0. 3

6 M N a C l 、 0 . 0 2 M リ ン酸ナ ト リ ウム （ p H 7.

7 ) 、 2 mM E D T A) の 2倍溶液中で 5分間振と う後洗 浄し、 風乾した。 その後、 0 . 4 M N a O Hを染み込ませ たろ紙上に 2 0分間放置し、 5倍濃度の S S P E溶液で 5分 間振と う後洗浄し、 再度風乾した。 こ のフ ィ ルターを用いて 放射性同位元素³² Pにて標識された c D N Aプローブにてス ク リ 一ニングを行った。

放射性同位元素³² Pにて標識された c D N Aプロ一ブは以 下のよ う に作成した。 すなわち、 チロ シンキナーゼの部分 c D N Aが組み込まれた p B 1 u e s c r i p t よ り 、 S a 1 I と E c o R I にてベク タ一よ リ 切 リ 出 し、 低融点ァガ ロ ー スゲルから D N A断片を精製回収 した。 得られた c D N A断 片を D N Aラベ リ ングキ ッ ト （M e g a p r i m e D N A l a b e l i n g s y s t e m : 英国、 A m e r s h a m社製） を用いて標識した。 すなわち、 D N A 2 5 n g にプ ライマ一液 5 μ £ 及び脱イ オン水を加えて全量を 3 3 μ β と して沸騰水浴を 5分間行い、 その後、 d N T Ρ を含む反応緩 衝液 1 0 i fi 、 α — ^{3 2} P — d C T P 5 / fi 、 及び T 4 D N A ポリ ヌ ク レオチ ドキナーゼ溶液 2 μ £ を加えて、 3 7 °Cで 1 0分間水浴し、 更にその後、 セフ アデッ ク スカ ラム （ Q u i c k S p i n C o l u m n S e p h a d e x G — 5 0 ： 独国、 ベ一 リ ンガーマ ンハイ ム社製） で精製し、 5分間 沸騰水浴を したのち、 2分間氷冷後使用 した。

前述の方法にて作成したフ ィ ルタ一を、 各々 の成分の最終 濃度が 5倍濃度の S S P E溶液、 5倍濃度のデンハル ト液

( 日本国、 和光純薬社製） 、 0 . 5 % S D S ( ドデシル硫酸 ナ ト リ ウム） 、 及び l O m g Z m l の沸縢水浴にょ リ 変性し たサケ精子 D N Aであるプレハイ ブ リ ダイゼ一シ ョ ン液中に 浸し、 6 5 °Cにて 2 時間振と う したのち、 前述の方法で³² P 標識されたプローブを含むプ レハイ プ リ ダイゼ一シ ョ ン液と 同一組成のハイ プ リ ダイゼーシ ョ ン液に浸し、 6 5 °Cにて 1 6 時間振と う し、 ハイプ リ ダイゼーシ ョ ンを行った。

次に、 フ イ ノレターを 0 . 1 % S D S を含む S S P E溶液に 浸 し、 6 5 °Cにて振と う し 2 回洗浄後、 さ らに 0 . 1 % S D S を含む 1 0倍希釈 した S S P E溶液に浸 し、 6 5 °Cにて 4 回洗浄 した。 洗浄を終了 したフ ィ ルタ一を增感ス ク リ ー ンを 使用 して、 オー ト ラ ジオグラフィ 一を行った。 その結果、 強 く 露光された部分のク ローンを拾い、 再度コ ロ ニー及びブラ ーク を蒔き直 し前述の方法にてス ク リ ーニ ングを行い、 完全 に単独のク ローンを分離した。

U T— 7のライブラ リ ーから分離されたク ローンの う ちィ ンサー トサイ ズの大きい 2 ク ローンを前掲の M a n i a t i s らの実験書に掲載の方法に従いブラ ス ミ ドを精製 し、 制限 酵素 X h o I にて消化し、 低融点ァガロース電気泳動にて c D N Aを精製し、 p B 1 u e s c r i p t に組み込んだ。 組 み込まれた c D N Aのサイ ズはおよそ 3 . O k b p及び 1 . 6 k b pであった。 また、 ヒ ト胎盤ライ ブラ リ ーから分離さ れたク ローンの う ちイ ンサ一 トサイ ズの大きい 2 ク ローンを M a n i a t i s らの実験書に掲載の方法に従いファージ D N Aを精製し、 制限酵素 E c o R I にて消化し、 同様に p B 1 u e s c r i p t に組み込んだ。 組み込まれた c D N Aの サイ ズはおよそ 3. 8 k b p ( c l o n e 2 ) 及び 3 . 5 k b p ( c l o n e 9 ) であった。

これらのク ローンの c D N Aの両端の遺伝子配列をス ゥェ —デン国、 フアルマシア社製 A L F D N Aシークェンサ一お よびス ウェーデン国、 フアルマシア社製 A L F シークェンサ —用ラベ リ ングキッ ト を用い、 添付の使用説明書に従い決定 した。 さ らに全長の塩基配列決定を行う ため 日 本国の宝酒造 株式 社製キロ シーク ェ ンス用デ リ ユ ーシ ョ ン ミ ユ ー タ ン ト キッ ト を用い、 添付の使用説明書に従い、 デ リ ュ一シ ヨ ンミ ユ タ ン ト を作成し、 c D N Aの両方向についての塩基配列を 決定した。

その結果、 全長の c D N Aがク ローニ ングされていないこ とが判明 したため、 さ らに c 1 0 n e 2 の制限酵素 X h o I サイ トから 5 ' 部分の約 2 0 0 b p (配列表の配列番号 3の 4 8 4番から 6 9 6番に当たる） を用いて、 市販のヒ ト胎児 肝臓 c D N Aライ ブラ リ 一 ； L g t 1 1 (米国、 C I o n t e c h社製） を同様な方法にてス ク リ ーニ ング した結果、 X h 0 I サイ ト ょ リ 5 ' 方向の c D N Aを含むク ローン （ c 1 0 n e M 1 、 配列表の配列番号 3 の 1番から 1 2 1 4番目 に 当たる） がク ローニ ングでき、 遺伝子配列をシーク ェ ンス し て、 本発明の全長 c D N A遺伝子の塩基配列が決定された。 全長の遺伝子配列を持った D N Aの作製は配列表の配列番 号 3 に記載の D N Aの X h o I サイ ト を用いて上記の c 1 o n e 2 と c 1 o n e M l のつなぎ、 ライ ブラ リ ーの リ ンカ一 の E c o R I サイ ト を用いて p B l u e s c r i p t の E c o R I サイ ト にサブク ローニングして作製した。 以下、 本べ ク タ一を p B S R T K F U L L と示す。

以上のよ う に して作製 した遺伝子の塩基配列を配列表の配 列番号 3に示 した。

尚、 この塩基配列から推定されるア ミ ノ酸配列を、 他の リ セブタ一型チ口 シンキナーゼである ヒ ト E P H (Hi rai el aに， Sc i ence, 238 , 1717 - 1720 , 1987 ) 、 ヒ ト E C K

(Li ndberg and Hunt er, Mo 1. Ce l l . Bio l . , 10， 6316 -6324, 1990 ) 、 ラ ッ ト E L K (Lhotak e t aに， Moに Ce l l . Bioに， 11, 2496-2502 , 1991 ) 、 ヒ ト H E K (Wi cks e t aに， Proc. Na t 1. Acad. Sc i . USA. , 89， 1611 - 1615, 1992 ) 、 マ ウ ス S E K ( G i I a r (1 i -Heb en s t r e i t e t a 1. , Oncogene, 7 , 2499-2506,

1992 ) 、 チキン C e k — 5 (Pasqua 1 e, Ce l l Regu l at ion, 2, 523-534, 1991 ) と比較した結果、 ア ミ ノ酸配列のホモ ロ ジ一は最も高い場合の E L Kで 5 6 . 3 %と低く 、 これら の物質と は異なるア ミ ノ酸配列を有する リ セプター型チロ シ ンキナーゼである こ とが分かった （以下の参考例及び実施例 では、 屡々 、 単に 「 リ セブタ一型チロ シンキナーゼ」 又は

「チロ シンキナーゼ」 と称する） 。

参考例 7_ リ セプタ一型チロ シンキナーゼ遺伝子のノ ーザン ブロ ッティ ングによる m R N Aの発現

参考例 6 で得られた リ セプタ一型チ口 シンキナーゼの m R N Aの発現を調べるため、 あらカゝじめ m R N Aが転写されて レ、るフ ィ レターである 米国、 Clont ech社 Human Mu l t i p l e Ti ssue Nor thern Blot , Human Mu l t i p l e Ti ssue Nor thern B lo t 11、 Human Fe t a l Mu l t i p le Ti ssue Nort hern Blot 並び に参考例 1 に示 した方法にて回収された m R N Aをァガロー スゲル電気泳動 し、 Z e t a — P r o b (米国、 B i o — R a d社製） に ト ラ ン ス フ ァ 一 して作成したフ ィ ルタ—を用い p B S R T K F U L Lを制限酵素 S m a I にて消化して、 1 %のァガロ ースゲルで電気泳動を行い、 7 4 6 b p の断片 (配列表の配列番号 3の 6 1 0番目から 1 3 5 5番目） を切 リ 出 し、 G e n e c l e a n I I (米国、 B I O 1 0 1社 製） を用いて精製した遺伝子断片を前掲の D N Aラベ リ ング キ ッ ト 、 M e g a P r i m e D N A l a b e l i n g s y s t e m ： 英国、 Am e r s h a m社製） にて前述の方 法で³² P標識し発現を調べた。

その結果、 ヒ ト成人組織の う ち心臓、 胎盤、 肺、 肝臓、 骨 格筋、 腎臓、 すい臓、 脾臓、 前立腺、 卵巣で発現が認められ た。 しかしながら、 脳、 胸腺、 精巣、 小腸、 大腸、 末梢血リ ンパ球においては発現が認められなかった。 また、 ヒ ト胎児 組織では心臓、 肺、 肝臓、 胬臓において発現が認められたが 脳においては発現が認められなかった。

また、 血液細胞株では、 前述の骨髄巨核芽球性白血病細胞 株 U T— 7 、 ヒ ト慢性骨髄性白血病細胞株 K 5 6 2 ( 日本国 理化学研究所、 細胞開発銀行よ り 入手可能、 N o . R C B O 0 2 7 ) 及びヒ ト急性巨核芽球性白血病細胞株 C MK (B100 d 74：42 , 1989 ) に発現されてお リ 、 非血液細胞株では肝細胞 ガン細胞株 H e p 3 B (ァ メ リ カ ン ' タ イ プ ' カルチャー ' コ レ ク シ ョ ン （以下 A T C C と示す） よ り 入手可能、 H B 8 0 6 4 ) 及びヒ ト胎児肺繊維芽細胞株 M R C— 5 (日本国、 理化学研究所、 細胞開発銀行よ リ 入手可能、 N o . R C B O 2 1 1 ) に発現が認め られた。 さ らに、 U T— 7、 K 5 6 2 C MKに於いては P MAによ る細胞分化を起こ させる とその 発現がほぼ完全に認められなく なる こ と が確認された。 しか しなが ら、 ヒ ト さい帯血から樹立された細胞株 KMT— 2

( 日本国、 理化学研究所、 細胞開発銀行よ リ 入手可能、 N o R C B 0 7 1 2 ) ， ヒ ト慢性骨髄性白血病細胞株 K G 1 a

(A T C Cょ リ入手可能、 C C L 2 4 6 . 1 〉 、 急性 リ ンパ 球性白血病細胞株 MO L T— 4 (A T C Cよ り 入手可能、 C C L 1 5 8 2 ) に於いては発現が認め られなかった。

以上のこ とから、 こ の遺伝子は血液細胞が未分化の状態に おいて発現されてお リ 、 血液細胞が分化するに と もない、 そ の発現が消失する こ とが推察された。 従って、 この リ セブタ 一型チロ シンキナーゼは血液幹細胞の維持、 巨核球分化に fV: 連する と考えられた。

参考例 8 リ セブター型チロ シンキナ一ゼポ リ ぺブチ ト ¾ ¾ 細胞株の作成

(工程 1 ) 配列表の配列番号 2のア ミ ノ 酸配列を有する リ セ プタ—型チロ シンキナーゼポ リ べプチ ドの発現細胞株 B a /

F 3 Z F U L L , B a / F 3 / F U L L F L A G , B a l b ノ F U L L及び B a 1 b Z F U L L F L A Gの作製 ：

配列表の配列番号 2に記載の リ セプター型チロ シンキナー ゼポ リ べプチ ドをコ一 ドする D N Aおよび米国、 コ ダッ ク社 製 I B I F L A Gを用いて、 配列表の配列番号 2のァ ミ ノ 酸配列の C末端に 8 ア ミ ノ酸、 すなわちア ミ ノ 酸配列と して Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysを持つポ リ ペプチ ド （ F L A G , 配列表の配列番号 1 3 に記載） を付加 したポ リ ぺプ チ ドをコー ドする D N Aを、 S R ct のプロモーターとネオマ イ シン耐性遺伝子を含む発現べク ター p MK I T n e o (丸 山 ら、 9 1 年度日本分子生物学会予稿集、 日本国、 東京医科 歯科大学丸山よ リ入手可能） に各々別々 につなぎ、 発現べク タ一を作製した。

配列表の配列番号 2 のァ ミ ノ酸配列を含有するポ リ ぺプチ ド発現細胞の発現べク ター作製にあたって、 配列表の配列番 号 3 の 3 ' 非転写領域を除き制限酵素 E c o R I サイ ト を付 力 Uするため、 5' -AACTCGAGATCTCTGCTGAGGACCTG-3'の酉己歹 iJであ るオリ ゴ D N A (プライマ一 1 、 配列表の配列番号 1 0 に記 載） 、 5' - AAGAATTCTCAGTACTGCGGGGCCGGTC - 3'の配歹 IJであるォ リ ゴ D N A (プライマ一 2 、 配列表の配列番号 1 1 に記載） ををブ 7ラフイイ ママ一—とと しして！：用用いレヽて、、 pp B B S ϋ R K T I KK FF UU LL LL ををテア ンンプ ー ト と して用いて P C Rを行った。 およそ 1 6 0 b p の D N

Aが增幅されている こ と をァガロ ースゲル電気泳動で確認後 こ の P C R産物を参考例 5 記載の方法にて精製 して、 制限酵 素 X h o I 及び E c o R I にて処理し、 同様に処理した p B l u e s c r i p t に米国、 N e w E n g l a n d B i o L a b社製 T 4 D N A リ ガ一ゼにて こ の精製した遺伝 子をつないでサブク ロ一ユング した。 その後、 4 ク ローンの コ ロ ニーからプラス ミ ド D N Aを精製して、 シー ク ェ ンスを して遺伝子配列を確認し、 遺伝子配列に誤 り がなく 目的の遺 伝子配列、 すなわち配列表の配列番号 3 の D N A配列の 3 2 3 0番から 3 3 7 3番の配列を持ったフラ グメ ン トであるこ と を確認した。 以下、 本フラ グメ ン ト を有するベク タ一を p B S F 1 とする。

さ らに、 配列表の配列番号 2 の リ セプター型チロ シンキナ —ゼ全長ア ミ ノ酸配列のポ リ べプチ ドの C末端に 8 ア ミ ノ酸 すなわちア ミ ノ 酸配列と して Asp Ty r Ly s Asp Asp Asp Asp Lysを持つポ リ ペプチ ド （ F L A G、 配列表の配列番号 1 3 に記載） を付加したポ リ べプチ ドをコ一 ドする遺伝子配列を 持つ発現べク タ一の作製にあたって、 同様な方法で上記のプ ライマ一 1 、 5' -GGGAATTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCGTACTG CGGGGCCGGTCCTCCTGT-3' の配列であるオ リ ゴ D N A (プライ マ一 3 、 配列表の配列番号 1 2 に記載） をプライマーと して P C R を行レヽ、 p B 1 u e s c r i p t にサブク ローニ ング して、 4 ク ローンをシーク ェ ンス し、 遺伝子配列を確認して 目的の遺伝子配列、 すなわち配列表の配列番号 3 の D N A配 歹 IJの 3 2 3 0番カ ら 3 3 7 0番の酉己歹 ijの 3 ' 端に 5'— GATTATA AAGATGATGATGATAAATGA-3' (酉己歹リ表の酉己歹 IJ番号 1 3 に記載） がつながった配列を有する フ ラ グメ ン トである こ と を確認し た。 以下、 本フラ グメ ン ト を有するベク タ—を P B S F 2 と する。 次に、 p B S R T K F U L Lを制限酵素 B a m H I ( 日本 国、 宝酒造社製） で消化し、 上記と 同様な方法で精製 したお よそ 3 k b p の遺伝子断片、 すなわち配列表の配列番号 3の D N A配列の 3 8 4番から 4 2 9 0番の配列を有する遺伝子 の 3 ' 末端に え Z A P c D N Aライ ブラ リ ー作製に使用 した リ ンカ一、 すなわち 日本国の宝酒造社製 E c o R I - N o t I — B a mH I A d a p t o r の B a m H I 部分がつなが つた配列を有する D N A断片を、 同様に B a m H I で消化後 脱リ ン酸化処理を行った P U C 1 9 ( 日本国、 宝酒造社製） に T 4 D N Aリ ガーゼでつなぎ、 サブク ロ一ユング した。 遺伝子の方向は配列表の配列番号 3の D N A配列の 5 ' 方向 の B a m H I の部分が p U C 1 9 のマルチク ローニングサイ トの S a 1 I 側にぁ リ 、 3 ' 方向が E c o R I 側にある こ と を確認されたク ローンを選択 した。 以下、 こ のべク タ一を p U C R T K F U L L とする。

このよ う に して作製された P U C R T K F U L Lを制限酵 素 S a 1 I と B g 1 I I にて消化 し、 ァガロースゲル電気泳 動にておよそ 3 k b p のフラ グメ ン ト 、 すなわち配列表の配 列番号 3の D N A配列の 3 8 4番から 3 2 3 0番の配列の 5 末端の先に P U C 1 9 の制限酵素サイ 卜 の S a 1 I から B a m H I までの部分がつながったフ ラ グメ ン ト を切 リ 出 し、 前 述の方法で精製した。 この遺伝子断片を F 3 とする。 同様に p B S F l及び P B S F 2ついて制限酵素 S a 1 I 及び B g 1 I I 消化を行い、 マルチク ローユングサイ 卜の S a 1 I サ ィ トカ らベク ター中のフラ グメ ン トの B g 1 I I サイ 卜の部 分およそ 3 0 b P の遺伝子断片を除いた遺伝子断片を上記の 方法にて精製した。 これらの遺伝子断片を各々 F 1 ， F 2 と する。 そ して、 F 1 と F 3 、 F 2 と F 3 を各々前述の方法で つなぎ、 制限酵素 S a 1 I 及び N o t I で配列表の配列番号 3のポ リ べプチ ドをコ一 ドする部分の遺伝子断片が切 り 出さ れるベク タ一 p B S F U L L l及び制限酵素 S a 1 I 及び N 0 t I で配列表の配列番号 2のポ リ ペプチ ドの C末端に F L A Gァ ミ ノ酸配列を有するポ リ べプチ ドをコ一 ドする部分に 対応する遺伝子断片が切 リ 出されるべク ター P B S F U L L 2 を作製した。

このよ う に して作製されたべク タ— P B S F U L L l 、 p B S F U L L 2 を制限酵素 S a 1 I 、 N o t I 、 P v u l に て消化 し、 電気泳動にておよそ 3 k b p の遺伝子断片、 すな わち リ セプタ一型チロ シンキナーゼのァ ミ ノ酸配列をコー ド する遺伝子断片部分を含む遺伝子断片を分離し精製 した。 こ の 2種の遺伝子断片を前掲の p MK I T n e o を制限酵素 S a 1 I 及び N o t I 処理して、 ス タ ッ フ ァ一部分を除いたも のに T 4 D N A リ ガ一ゼにてつなぎ、 リ セプター型チロ シ ンキナーゼの発現べク タ一を構築 した。 以上のよ う に作製さ れた F L A G配列を含まないベク タ一を p MK F U L L、 F L A G配列を含むベク タ一を p MK F U L L F L A G とする。 遺伝子導入する細胞株はマ ウ ス p r o — B c e 1 1 1 i n e B aノ F 3 (日本国、 理化学研究所、 細胞開発銀行 ょ リ 入手可能、 N o . R C B 0 8 0 5 ) 及びマ ウス繊維芽細 胞 B a l b // 3 T 3 c l o n e A 3 1 (日本国、 理化学 研究所、 細胞開発銀行よ り 入手可能、 N o . R C B 0 0 0 5 ) に行った。 遺伝子導入前の細胞の培養は B a / F 3は R P M 1 1 6 4 0 (米国、 G I B C O— B R L社製） 、 1 0 % F C S、 l O O Ai g /m l マウス I L— 3 (米国、 I n t e r g e n社製） で培養し、 B a 1 b Z 3 T 3 は D— M E M (ダル べッ コ改編 M E M培地、 米国、 G I B C O— B R L社製） 1 0 % F C Sにて培養 した。

発現べク タ一は制限酵素 N r u I ( 日 本国、 宝酒造社製） にて消化して、 直鎖型に してから遺伝子導入 した。

B a / F 3 での遺伝子導入細胞株の作製は次のよ う に行つ た。 すなわち、 前日 に細胞の培地を交換し、 細胞数を 5 X I 0 ⁵ c e 1 1 s Zm l に して一晚培養 した。 翌日 、 遠心分離 にて細胞を沈澱させ、 P B S (—） にて 2回遠心洗浄後、 1 mM M g C 1 2 、 P B S (一） に 1 X 1 0 ⁷ e e l I s / m l と なるよ う に して細胞を調製した。 遺伝子導入は米国の B i o - R a d社製遺伝子導入装置ジー ンパルサ一を用いた エ レク ト ロ ポレーシ ヨ ン法で行った。 上記の細胞懸濁液を 5 Ο θ β エ レク ト ロ ボ レ—シ ヨ ン専用セノレ （ ◦ . 4 mm) に 取り 、 発現べク タ一を 2 0 / g加え、 氷中で 5分間放置する , その後、 1 回 目 は 6 0 0 Vの条件で電圧をかけ、 1 分間室温で放置後、 更に 2回目 は 9 6 0 F 、 2 5 0 Vの 条件で電圧をかけた。 その後、 氷中で 5分間放置後、 直径 1

0 c m細胞培養用デイ シュで上記の培地 1 0 m 1 で一晚培養 を行った。 翌日 、 遠心にて上記の培地に G 4 1 8 (米国、 S

1 g m a 社製） を l m g Zm l と なる よ う に加えた培地の 2 0 m l に懸獨 し、 2 4穴細胞培養プレー トに 1 m 1 分けて培 養 した。 l m g Zm 1 の G 4 1 8入 り の同様な培地を用いて 2 日 おきに半量の培地を交換して培養を 1 0 日 間程度ほど行 い、 細胞が増殖してきたゥエルから細胞を培地量 1 0 m 1 で 細胞濃度 1 X 1 0 ⁶ c e 1 1 s /m l 程度まで增やした後、 細胞濃度が 0 . 0 2力 ら 0 . 0 5 c e l l s /m l になるよ う 9 6 穴プレー 卜に限外希釈 して培養 し、 ク ロ一ニングをお こない . ク ローン化された遺伝子の安定発現する細胞を得た このよ う に して作製された B a / F 3 に遺伝子導入 し、 配列 表の配列番号 2 に記載のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ぺプチ ドを安定発現する細胞株を B a / F 3 / F U L L と命名 し、 配列表の配列番号 2 に記載のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べ プチ ドの C末端に F L A Gア ミ ノ酸配列を有するポ リ べプチ ド安定発現細胞株を B a ノ F 3 / F U L L F L A G と命名 し た。 また、 同 じ方法で 1^ 1： 1 丁 11 6 0 そのものを遺伝子導 入したコ ン ト ロールの形質転換細胞株を作製し、 これを B a / F 3 Z C O N と命名 した。

B a 1 b / 3 T 3 での遣伝子導入細胞株の作製は次のよ う に行った。 すなわち、 前日 に細胞の培地を交換し、 細胞数を 直径 1 0 c mの細胞培養用ディ ッ シュあた リ 5 X 1 0 ⁶ 個に して 1 0 m 1 の上記培地を加え一晩培養 した。 翌日 、 遠心分 離にて細胞を沈澱させ、 P B S (― ) にて 2 回遠心洗浄後、 1 m M M g C 1 ² 、 P B S (― ) に 1 X 1 0⁷ e e l 1 s Z m l と なる よ う に して細胞を調製した。 遺伝子導入は米国 の B i o - R a d社製遺伝子導入装置を用いたエ レク ト ロポ レ一シ ョ ン法で行った。 上記の細胞懸濁液 5 0 0 μ fi をエ レ ク ト ロ ポ レーシ ヨ ン専用セル （ 0 . 4 m m ) に取 リ 、 発現べ ク タ一を 2 0 / g加え、 氷中で 5 分間放置する。 その後、 あ いだを 1 分間室温で放置して、 2 回の 3 F、 4 5 0 Vの電 圧をかけた。 その後、 氷中で 5分間放置後、 直径 1 0 c m細 胞培養用ディ ッシュで上記の培地 1 0 m 1 で 3 日 間培養を行 つた。 3 日後、 上記の培地に G 4 1 8 (米国、 S i g m a 社 製） を 4 0 0 μ g / m \ と なるよ う に加えた培地に交換し、 その後 2 日 おきに培地の 1 Z 3 を交換して 1 0 日 間ほど培養 を続けた。 1 0 日後、 ディ ッシュ上に形成されたコ ロニーを ト リ ブシン溶液 （米国、 G I B C O — B R L社製） を使って はが し、 ク ロ ーン化された遺伝子の安定発現細胞株を得た。 このよ う に して作製された B a 1 b / 3 T 3 の配列表の配列 番号 2 に記載のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの安定 発現細胞株を B a 1 F U L L と命名 し、 配列表の配列番 号 2 に記載のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの C末端 に F L A Gア ミ ノ酸配列を有するポ リ べプチ ドの安定発現細 胞株を B a l b Z F U L L F L A G と命名 した。 また、 同 じ 方法で P M K I T n e o そのものを遺伝子導入したコ ン ト ロ —ルの形質転換細胞株を作製し、 これを B a 1 b Z C O N と 命名 した。

(工程 2 ) 配列表の配列番号 1 のア ミ ノ 酸配列を有する リ セ プター型チロ シンキナーゼポリ べプチ ドの発現細胞株の作製 また、 リ セプタ一型チロ シンキナーゼの細胞外部分、 つま リ配列表の配列番号 1 に記載のポ リ べプチ ドを含有するポ リ ぺブチ ドを動物細胞に産生させる発現べク タ一を構築 した。

すなわち、 配列表の配列番号 1 の リ セプター型チロ シンキ ナ一ゼ細胞外部分ァ ミ ノ酸配列のポ リ べプチ ドの C末端に 8 ア ミ ノ 酸、 すなわちア ミ ノ 酸配列と して Asp Ty r Lys Asp A s p Asp Asp L y sを持つポ リ ペプチ ド （ F L A G配列表の配列 番号 1 3 に記載） を付加したポ リ ペプチ ドをコー ドする遺伝 子配列を持つ発現ベク ターの作製にあたって、 全長の場合と 同様な方法で、 5' -CGGAATTCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAG-3'の配 列であるオ リ ゴ D N A (プライマ一 4 、 配列表の配列番号 1 4 に記載） 、 5' -GGGAATTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCCTGCTC CCGCCAGCCCTCGCTCTCA - 3，の配歹リであるオ リ ゴ D N A (プライ マ一 5 、 配列表の配列番号 1 5 に記載） をプライ マ一と して . 配列表の配列番号 3 の遺伝子を含む p B 1 u e s c r i p t をテ ンプ レー ト と して用いて P C Rを行った。 およそ 1 5 0 b p の D N Aが增幅されている こ と をァガロースゲル電気泳 動で確認後、 この P C R産物を参考例 5記載の方法にて精製 して、 制限酵素 E c o R I にて消化し、 同様の制限酵素処理 を し、 末端の脱 リ ン酸処理した p B 1 u e s c r i p t に米 国の N e w E n g l a n d B i o L a b 社製 T 4 D A リ ガーゼにて遺伝子をつないでサブク ローニング した _c その後、 1 0 ク ローンのコ ロニー力 らプラス ミ ド D N Aを精 製して、 シーク ェンスを して遺伝子配列を確認 し、 遺伝子配 列に誤り がな く 目的の遺伝子配列、 すなわち配列表の配列番 号 3 の D N A配列の 1 8 5 3番カゝら 2 0 2 0番の配列の 3 ' 端に 5， -GATTATAAAGATGATGATGATAAATGA-3' (酉己歹リ表の酉己歹 ,j番 号 1 3 に記載） がつながった配列を有するフ ラ グメ ン トであ る こ と を確認した。 また、 P B 1 u e s c r i p t つながつ た遺伝子断片の方向は遺伝子配列確認の際に、 配列表の配列 番号 3 に示す配列の 5 ' 末端部分の上流に P B 1 u e s c r

1 p t のマルチク ロ一ニングサイ 卜の S a 1 I サイ ト 、 また 3 ' の F L A G配列をコー ドする遺伝子配列の下流に N 0 t I サイ トが来る よ う につながったク ローンを選びだした。 以 下、 本ベク ターを p B S F 4 とする。

上記のベク ター p U C R T K F U L Lを制限酵素 S a 1 I 及び A a t I I ( 日本国、 東洋紡社製） にて消化し、 上記の 方法でおよそ 1 . 6 k b p の遺伝子断片を精製した。 本遺伝 子断片は配列表の配列番号 3の D N A配列の 3 8 4番から 1 8 5 2番までの配列を含む。 同様に、 P B S F 3 を制限酵素 S a 1 I 及び A a t I I で消化し、 上記の方法でおよそ 3 .

2 k b p の遺伝子断片を精製した。 この 2つの遺伝子断片を つなぎ作製されたべク タ一を、 更に制限酵素 S a 1 I 及び N o t I にて消化して上記の発現ベク ター P MK I T n e o に つないで、 配列表の配列番号 1 のァ ミ ノ 酸配列の C末端に F L A G配列を有するポ リ べプチ ドを産生し う るべク タ一を作 製した。 この発現べク タ一を P MK E X F L A G とする。

さ らに、 同様に配列表の配列番号 1 に記載のア ミ ノ酸配列 を有するポ リ ペプチ ドの C末端にヒ トイ ムノ グロブ リ ン I g G 1 の ヒ ンジ部分以下の F c部分のア ミ ノ酸配列を有するポ リ ぺプチ ドを産生 し う るベク ターは以下のよ う に作製した。 73

すなわち、 配列表の配列番号 1 の リ セプタ一型チロ シンキナ ーゼ細胞外部分ア ミ ノ酸配列のポ リ ペプチ ドの C末端にヒ ト I g Gのヒ ンジ部分以下の F c部分のア ミ ノ酸配列を付加 し たポ リ ぺプチ ドをコ一 ドする遺伝子配列を持つ発現べク ター の作製にあたって、 上記の場合と 同様な方法で、 プライマ一 4 、 5' -AAGGATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCA-3 'の配歹りである オリ ゴ D N A (プライマ一 6 、 配列表の配列番号 1 6 に記載） をブライマーと して、 配列表の配列番号 3の遺伝子を含む P B 1 u e s c r i p t をテ ンプレー ト と して用いて P C Rを 行った。 およそ 1 5 0 b p の D N Aが增幅されてレ、る こ と を ァガロースゲル電気泳動で確認後、 こ の P C R産物を参考例 5記載の方法にて精製して、 制限酵素 E c o R I 及び B a m H I にて消化し、 同様の制限酵素処理を した P B 1 u e s c r i p t に米国の N e w E n g l a n d B i o L a 社製 T 4 D N A リ ガ一ゼにて遺伝子をつないでサブク c— ニング した。 その後、 得られた 1 0 ク ロ ーンの コ ロ ニーか プラス ミ ド D N Aを精製して、 シーク ェ ンスを して遺伝子配 列を確認した結果、 遺伝子配列に誤リ がなく 目 的の遺伝子配 列、 すなわち配列表の配列番号 3 の D N A配列の 1 8 5 3番 から 2 0 2 0番の配列を有するフ ラ グメ ン トである こ と を確 認した。 以下、 このべク タ一を P B S F 5 とする。

次に、 ィ ム ノ グロブ リ ン F c タ ンノ、。ク と の融合タ ンパク の 作製は Z e t t 1 m e i s s 1 らの方法 (Zet t lmeissl e t a 1. , DNA cel l Bioに， 9， 347-354, 1990) に従って 、 イ ン ト ロ ン を含むゲノ ム D N Aを用いた遺伝子を利用 し、 その遺伝子を P C R法を用いて作製した。 すなわち、 ヒ トゲノ ム D N Aを テ ンプ レー ト と して使用 して、 ヒ ト I g G l F c 部分をコ一 ドする遺伝子配列を制限酵素 B a m H I サイ トのついた 5' -A ACCATCCCCGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCA-3' の配歹リを有する オ リ ゴ D N A (プライマー 7 、 配列表の配列番号 1 7 に記载） 、 制限酵素 X b a I サイ トのつレ、た 5' - CCTCTAGAGTCGCGGCCGT CGCACTCATTTACC - 3， の配歹リを有するオリ ゴ D N A (プライマ — 8 、 配列表の配列番号 1 8 に記載） をプライマーと して用 いて P C Rを行い、 およそ 1 . 4 k b p のバン ドを精製し、 制限酵素 B a m H I 及び X b a I (日本国、 宝酒造社製） で 処理を して、 同様の制限酵素処理を した P B 1 u e s c r i p t に米国の N e w E n g l a n d B i o L a b社製 T 4 D N A 1 i g a s e にて遣伝子をつないでサブク ロ 一二ングした。 その後、 ブラス ミ ド D N Aを精製して、 シー クエンスを して遺伝子配列を確認し、 遺伝子配列が確かにヒ ト I g G l のへビーチェーンのヒ ンジ部分にあたるゲノ ム D N Aである こ と を確認した （その配列は K a b a t e t a I . , Seque n c e of Immunologica l Interest, N I H pub cat ion No 91-32 42, 1991を参照のこ と） 。 以下、 このべク タ一を p B S h l g F c とする。

上記のベク ター p B S F 5 を制限酵素 B a m H I 及び E c o R I にて消化し、 上記の方法にておよそ 1 5 0 b p の遺伝 子断片を精製し、 ついで上記のベク タ一 p B S h I g F c を 制限酵素 B a mH I 及び E c o R I にて消化し、 上記の方法 にておよそ 4 . 4 k b p の遺伝子断片を精製し、 この両者を 米国の N e w E n g l a n d B i o L a b社製 T 4 D Ν Α リ ガーゼにて遺伝子をつなぎ、 次にこのよ う に作製さ れたベク タ一を制限酵素 S a 1 I 及び A a t I I で消化 し、 上記の方法でおよそ 4 . 4 k b p の遺伝子断片を精製した。 また同時に、 上記のベク ター P U C R T K F U L Lを制限酵 素 S a 1 I 及び A a t I I で消化し、 上記の方法でおよそ 1 · 6 k b P の遺伝子断片を精製した。 この 2つの遺伝子断片を つなぎ作製されたベク ターを、 更に制限酵素 S a 1 I 及び N 0 t I にて消化して上記の発現ベク ター P MK I T n e o に つないで、 配列表の配列番号 1 のア ミ ノ酸配列の C末端に ヒ ト I g G l F c のア ミ ノ酸配列を有するポリ ペプチ ド産生べ ク タ一を作製した。 この発現べク タ一を p MK E X I g とす る。

発現ベク ター p MK E X F L A G、 及び p MK E X I gの 遺伝子導入は C O S— 7 (日本国、 理化学研究所、 細胞開発 銀行から入手可能、 R C B 0 5 3 9 ) にて行った。 C O S— 7の培養法並びに遺伝子導入方法は B a 1 b / 3 T 3 と同様 に行い、 遺伝子を導入した細胞を得た。

遺伝子導入の翌日 、 細胞の培養上清無血清の D— M E M (米国、 G I B C O— B R L社製） を 4 日間おきに交換し、 2週間にわたって培養上淸を分取した。 分取した培養上清を 各々セン ト リ コ ン 3 0 (米国、 ア ミ コ ン社製） にてバッファ 一を培地から P B S (—） に交換及び 1 0倍に澳縮した。

細胞上淸中に配列表の配列番号 1 に示すポリ べプチ ドを含 有するポ リ ペプチ ドが産生されている こ と を確認するため、 以下のよ う にウェス タ ンブロ ッ トにて確認した。 すなわち、 濃縮した培養上淸を 日本国の A C I ジャパン社製の S D S— P A G E用電気泳動槽及び S D S — P A G E用ポ リ アク リ ノレ ア ミ ドゲル （グラディエン トゲル 5〜 1 0 % ) を用い、 添付 の取扱い説明害に従って S D S— P A G Eを行なった。 サン ブルは 2 —メルカプ トエタ ノール （ 2 — M E ) を加え加熱処 理した還元条件下のサンブルと、 その処理を行わなかった非 還元条件下のサンプルについて行い、 マ一力一と しては英国 の Am e r s h a m社製レイ ンボーマーカ一 （高分子量用） を用い、 サンブルバッファー、 泳動ノく ッ ファーにっレ、ては添 付の取扱い説明書に従って作製した。 S D S— P A G E終了 後、 アク リ ルア ミ ドゲルを P V D Fメ ンブラ ンフイ ノレター

(米国、 B i 0 R a d社製） に米国の B i 0 R a d社製ミ ニ ト ラ ンスブロ ッ トセルによ リ転写 した。

こ の よ う に作製されたフ ィ ルタ —を 5 % B S A (米国、 S i g m a社製） 、 T B S— T ( 2 0 m M T r i s 、 1 3 7 m N a C 1 ( p H 7 . 6 ) 、 0 . 1 % T w e e m 2 0 ) に 4 °C—晚摇すり ながらブロ ッキング した。 目 的のタ ンパク 質が F L A Gキメ ラ の場合は一次抗体と してマ ウ スモ ノ ク 口 ーナル抗体 A n t i — F L A G 2 (米国、 コダッ ク社製） 、 二次抗体と してペルォキシダーゼ標識抗マウス I g羊抗体

(英国、 Am e r s h a m社製） を反応させた。 また、 I g Gキ メ ラ の場合は、 ペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト I g羊抗体

(英国、 Am e r s h a m社製） を反応させた。 抗体の反応 時間は各々室温で一時間反応させ、 各反応間は T B S 一丁に て 1 0分間室温で摇すリ 洗浄する操作を 3回づっ繰リ返した。 最後の洗浄後、 フィルターを英国の Am e r 5 3 111社製 £ C L ウェスタ ンブロ ッティ ング検出システムの反応液に五分 間浸 し、 ポリ塩化ビニ リ デンラ ップに包んで X線フ ィ ルムに 感光させた。 その結果、 F L A Gキメ ラではいずれの場合も およそ 8 0 k ダル ト ン程度のタ ンパクが、 また、 I g Gキメ ラでは 2 — M E処理の場合は 1 1 O k ダル ト ン、 未処理の場 合は 2 2 0 k ダル ト ンの蛋白が検出できた。 以上の結果から、 目的の配列表の配列番号 1 に記載のァ ミ ノ酸配列を含有する ポ リ べプチ ド産生細胞を得る こ とが出来た。 細胞外部分はァ ミ ノ酸組成から予想される分子量よ リ と もにおよそ 2 0キロ ダル ト ン大き く 、 糖鎖付加されている と予想された。

参考例 9 リ セブタ一型チロ シンキナーゼ細胞外部分蛋白の 精製

参考例 8の工程 2で得たベク ター P M K E X F L A G及び p K E X I gを用いて形質転換した細胞の培養上清を各々 5 リ ッ トル作製した。 これらの培養上清を米国、 コ ダック社 製 A n t i — F L A G M 2 A f f i n i t y G e l 力 ラムおよびス ウェーデン国のフアルマシア社製 p r 0 t e i n G セファ ロースカラ ムも し く は P r o t e i n A セフ ァ ロースカラムに通 して、 各々のタ ンパク をカ ラムに吸 着させた。 カラムのサイ ズは共に 1 c m X 3 c mで容積はお よそ 2 m l であ リ 、 流速は全て l m l Zm i n . で行った。 吸着後、 カラムを P B S (—） 2 O m l で洗浄し、 その後、 0 . 5 T r i s—グリ シン （ P H 3 . 0 ) で溶出 した。 溶 出画分を 2 m l ずつ分取し、 0. 5 MT r i s — H C I ( p H 9 . 5 ) 2 0 0 μ βづっ加えて、 各々 の画分を上記の方法 で S D S— P A G Eを行った。 泳動が終わった後、 日本国の 和光純薬社製銀染キッ ト ヮ コ一 I I で添付の説明書に従い染 色した。 その結果、 F L A Gキメ ラ、 I g G F c キメ ラ と も 参考例 8に記載したウェスタンプロ ッ 卜の結果と 同様大き さ のバン ドに精製タンパクが得られている こ とが確認できた。 この結果から、 配列表の配列番号 1記載のポ リ べプチ ドを純 品で得る こ とが出来た。 よ リ 高純度なポ リ べプチ ドを得るた めに、 上記の方法で精製された F L A Gキメ ラ 、 I g G F c キメ ラ タ ンパク を各々 のゲル濾過にて精製を行った。 ァフ ィ 二ティ 一カラムからの溶離液を米国のア ミ コ ン社製セン ト リ コ ン 3 0にて澳縮及び P B S (― ) へのバッフ ァー交換を行 い、 ゲル濂過はス ウェーデン国のフアルマシア社製 F P L C システムを用い、 同社の S u p e r o s e 1 2 カ ラムにて行 つた。 参考例 8 の 2 — M Eな しの条件のウェス タ ンブロ ッ ト 結果と同様の分子量の位置に溶離される メ イ ンピーク を分取 した。 以下、 このよ う に精製された配列表の配列番号 1 に記 載のア ミ ノ酸配列を有するポ リ べプチ ドと F L A G も し く は I g G F c と のキメ ラ タ ンパク を各々 E X F L A G — P T N . E X I g — P T Nと示す。

参考例 1 0 リ セプタ一型チ口 シンキナーゼを認識するモ ノ ク 口一ナル抗体の榭立及び リ セプター型チコ シ ンキナーゼの発現の確認

上記のよ う に精製された E X F L A G — P T Nを免疫原と して、 成書の方法に従いマウスモ ノ ク ローナル抗体を作成し た。 免疫は 3 回行い、 1 回に 1 匹あた リ 3 0 /i g を免疫 し、 3 回目 の免疫前に採血を行い、 血淸を分取して、 免疫 した E X F L A G — P T Nを用いた抗体価の測定を行い、 ス ク リ 一 ニングの際には細胞培養上清が E X F L A G — P T N、 E X I g — P T Nを共に認識する ゥエルからク ロ ーユングを行つ た。 その結果、 マウスモノ ク ローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマが 3株、 すなわちク ローン 3 8 — 1 E 、 6 6 - 3 A および 6 8 — 3 Aが、 樹立された。 以下の実験にはこの中の ク ロ ーン 3 8 - 1 E の産生するモ ノ ク ロ ーナル抗体 3 8抗体 を使用 して行った。 このよ う に して作成されたモノ ク ローナル抗体を用いて、 XJ T _ 7 、 M R C — 5 、 および上記の形質転換細胞株 B a Z F 3 / F U L L 、 B a / F 3 / F U L L F L A G , B a l b F U L L及び B a 1 b Z F U L L F L A Gを米国のコール ター社製フ ローサイ トメーター E P I C Sエ リ 一 トにて細胞 表面の抗原解析を行った。 抗体による染色は成書の方法に従 つて行った。 1 次抗体と してハイプリ ドーマ培養上清からス ゥエーデン国のフアルマシア社製 M a b t r a ρ G I I を用 い、 添付の説明書に従って精製した抗体を用い、 2次抗体と して米国のべク ト ンデッキンソ ン社製ャギ抗マ ウス I g F I T C標識で行った。 その結果、 U T — 7 、 M R C — 5及びリ セブタ一型チ口 シンキナーゼ遺伝子を導入 した細胞が上記の モノ ク 口一ナル抗体によ リ染色される こ とが確認された。

また、 B a Z F 3ノ F U L L 、 B 3 / F 3 / F U L L F L A G 、 B a 1 b / F U L L及び B a 1 b / F U L L F L A G の細胞破砕物を用いて同モ ノ ク 口 一ナル抗体によ る ゥエス タ ンブロ ッ ト を行った。

細胞破砕物の調製は以下のよ う に行った。

2 X 1 0 ⁶ 個の細胞をセル リ シスバッ ファ一 （ 5 0 mM H e p e s ( p H 7 . 5 ) 、 1 % T r i t o n X 1 0 0 、 1 0 % グリ セロール、 1 0 mM N a 4 P 407、 1 0 0 m M N a F 、 4 mM E D T A、 2 m N a 3 V O 4 , 5 0 μ g / m \ A p r o t i n i n , 1 0 0 μ M L e u p e p t i n 、 2 5 μ P e p s t a t i n A , 1 m M P M S F ) 2 0 0 / fi に懸濁し、 氷中に 2 0分間放置し、 その 1 4 0 0 0 r p mで 2 0分間遠心 し上清を取り 細胞破砕物を 得た。

こ のよ う に して得た各種細胞破砕物を同マ ウ スモ ノ ク 口一 ナル抗体を用いて、 参考例 8 に記載の方法でウェス タ ンプロ ッ ト を行った。 その結果、 1 3 0 キロ ダル ト ンのバン ドを特 異的に認識する こ とが確認できた。

以上の結果から リ セプター型チロ シンキナーゼを認識する モノ ク 口一ナル抗体を樹立し、 なおかつ配列表の配列番号 2 に記載のア ミ ノ酸配列を含有するポリべプチ ド産生細胞株が 確かに作製されている こ と を確認 した。

実施例 1 各種ヒ ト細胞培養上淸の分取及び濃縮精製

上記の方法で精製 した配列表の配列番号 1 に記載のア ミ ノ 酸配列を有する リ ガン ドの細胞外 ドメ イ ン と 、 F L A G及び I g G F c のそれぞれとのキメ ラ タ ンパク を用いて、 リ ガン ドを発現している細胞の同定をバイオセンサー B I A c 0 r e (ス ウェーデン国、 フアルマシア社製） にて行う ために、 B I A c o r e で測定するサンプルの調製を以下のよ う に行 つた。

細胞の名前、 細胞の種類、 細胞增殖継代時の培地、 細胞の 入手先については表 1 にま と めた。

細胞の培養は表 1 に示すよ う に各々の細胞に対応 した培地 で培養 し、 付着細胞の場合は米国のコーニング社製の T一 2 '2 5 フラスコにコ ンフルェン トになった時点で、 それぞれの 細胞株の培地を、 血清を含まない I MDM (米国、 G I B C Ο— B R L社製） 、 l O n g Zm l P MAを含む I MDM、 及び、 1 0 0 U/m l ヒ ト T N F を含む I MD Mの各培地に 交換し、 4 日 間培養 して培養上淸を回収 した。 浮遊細胞の場 合は細胞濃度 5 X 1 0⁵ c e 1 】 s Zm l となる よ う に上記 の条件で 4 日 間培養 し培養上淸を回収した。 回収した培養上 淸は米国のア ミ コ ン社製セン ト リ ブレップ 1 0で濃縮して、 溶液交換し、 最終的にス ウェーデン国、 フ ア ルマ シア社製 B I A c 0 r e用 H B Sバ ッ フ ァ ーに溶液交換澳縮倍率 4 0倍 から 2 0 0倍と してサンプルを得た。

実施例 2 バイオセンサ一 B I A c o r e を用いた細胞培養 上清のスク リ 一ニング

リ ガン ドを発現している細胞の同定を、 バイ オセンサ一 B I A c o r e (ス ウェーデン国、 フアルマシア社製） を用レ、 て、 添付の取扱い説明書に従って実施した。

参考例 9に記載の方法で作製、 精製された E X I g — P T N及び E X F L A G— P T Nを、 1 0 0 / g Zm l の濃度に なる よ う に l O mM酢酸ナ ト リ ウムバッ ファー （ p H 4 . 0 ) にて調製し、 活性化された B I A c o r eセンサーチップ C C e r t i f i e d (ス ウェーデン国、 フ ァ ノレマシア社 製） に、 添付の取扱い説明書の方法に従ってァ ミ ノ カ ツプリ ングにて結合させた。 イ ンジェ ク シ ョ ン量は 5 O β で 2回 行い、 結合後エタ ノ ールァ ミ ンでブロ ッ キ ング して、 ベース ライ ンが安定するまで、 H S Bバ ッ フ ァ 一で洗浄した。 流速 は以下のサンプルの測定を含め全て 5 μ β ノ m i nで行った。 セ ンサーチ ッ プと 、 E X I g — P T N及び E X F L A G— P T Nのそれぞれとの結合前と結合後の レス ポンス . ュニ ッ ト ( R U ) の差はおよそ 1 0 0 0 0 R U程度であった。

B I A c 0 r e のサンプル導入、 測定の条件は以下のよ う に行った。 上記のぺプチ ドが結合したセンサーチ ップに対し サンプル量 3 0 μ β ( 6分間） で流した。 代表的なプロ フ ァ ィルと して、 C一 1 細胞 （未刺激） 培養上清中に含まれる リ ガン ドの、 チロ シンキナ一ゼへの結合活性の測定結果を示す グラ フを図 1 に示す。 R U値は、 サンプルが導入される前の ベース ラ イ ンの部分、 サンプルが入る こ と に よ るマ ス ト ラ ン スポー ト （ベースライ ンの上が リ ） を起こ し リ ガン ドが リ "t: プターであるチロ シンキナーゼに結合する部分、 及び通常の H S Bノく ッフ ァーに置換される部分において変化 している。 図 1 に矢印で示した 2点の値、 つま リ初めのベー ス ライ ンの 値 （サンプル導入の 3 0秒前の値。 図 1 の矢印 Aで示す） と 最終的に H S Bバ ッ フ ァーに置き変わった直後の値 （つま リ サンプル導入後 6分 1 0秒後の値。 図 1 の矢印 Bで示す） の 2点の値の差を、 リ ガン ド結合活性と した。 1 回サンプルを 測定しおわった毎に 5 O mM酢酸ナ ト リ ゥムを含む 0 . 5 M N a C 1 ( p H 4 . 0 ) を 1 5 μ β 流してセンサ一チップを

¾t した。

測定結果を表 2に示す。

表 2から解るよ う に、 E X I g — P T N及び E X F L A G — P T Nの両方に対して高い リ ガン ド結合活性を示 した リ ガ ン ド発現細胞候補の代表的な細胞株と しては C— 1細胞、 リ ガン ドを発現していない細胞株と しては B T— 2 0細胞が明 らかになった。

実施例 3 リ セブタ一型チ口 シンキナーゼ細胞外蛋白を用い た リ ガン ド発現細胞の同定

実施例 2では各種細胞培養上淸を調べる こ と によ リ リ ガン ド発現細胞を同定したが、 も し、 リ ガン ドが細胞膜上にも存 在するならば、 細胞を参考例 9で作製した リ セブター型チロ シンキナーゼの細胞外部分を含むポ リ ぺプチ ドで リ ガン ド発 現細胞は染色されるはずである。 そこで、 参考例 9 に示した よ う に作製された配列表の配列番号 1 のア ミ ノ 酸配列を含有 するポ リ ペプチ ド E X I g — P T Nを用いて、 リ ガン ド発現 細胞の同定をフ ローサイ ト メ一ターにて行った。

実施例 2で リ ガン ド発現細胞候補と された、 C一 1 及び発 現されていないと考えられた B T— 2 0 について、 5 X

1 0⁶ 個の細胞を調製し、 まず初めに 2 % F C Sを含む P B S (一） （以下 P B S— F と示す） に懸渴して、 遠心分離 3 0 0 0 r p m、 1 分間の条件で遠心分離し、 洗浄した。 そ し て、 これらの細胞を正常マ ウス血清 （米国、 オルガノ ンテク 二力社製） を P B S— F にて 1 0 0倍希釈した溶液の 5 0 β に懸濁して、 氷中 1 時間放置した後、 上記の方法で 1 回洗 浄し、 次に参考例 9で作製された Ε Χ Ι §— ? 丁 1^を 5 0 0 n g / μ β の濃度で P B S — Fにて作製された溶液の 5 0 μ β も し く は P B S— Fの 5 0 μ β に懸濁 し氷中にて 3 0分間 放置した。 その後、 上記の方法で 2回洗浄した後、 F I T C 標識抗ヒ ト I g G l (英国、 B i n d i n g S i t e社製） を同様に反応させて、 2回洗浄した後、 最終的に 2 0 Ο μ β の P B S— Fに懸濁してフ ローサイ ト メ 一ターにて解析した。 フローサイ ト メ 一ターは米国のコールタ一社製 E P I C Sェ リ ー ト を使用 した。

その結果を図 2に示す。 なお、 図 2の縦軸は細胞数を示す。 横軸は相対蛍光強度を示し、 右に行く ほど強く なる。 この結 果から、 C— 1 については E X I g — P T Nを加えなかった コ ン ト ロールに比べ蛍光ピークのシフ 卜が見られ、 細胞表面 上にも リ ガン ドが存在する こ とが判った。 また、 B T— 2 0 については、 このよ う なピークのシフ ト は認められないこ と から細胞膜上に リ ガン ドが発現されていないこ とが判った。

以上の結果から、 少なく と も結腸癌由来細胞株 C一 1 はリ ガン ド候補分子を細胞表面にも発現している こ とが判明 した。 実施例 4 リ セプタ一型チロ シンキナーゼ遺伝子導入細胞を 用いた リ ン酸化アツセィ系によ る リ ガン ド発現細 胞の同定

実施例 2及び 3の結果、 リ ガン ドを発現している と考えら れる細胞株の 1 つである C— 1細胞が結合だけではな く 参考 例 8の工程 1 に記載の形質転換細胞 B a / F 3 Z F U L L F L A Gの細胞膜表面上に発現されている リ セプタ一型チロ シ ンキナーゼの リ ン酸化を引 き起こすかど う かについて調べる ため以下の実験を行った。

すなわち、 実施例 2 に記載した方法で作製された C— 1細 胞培養上清濃縮液、 C一 1 細胞それ自身、 参考例 1 0 に記載 のモノ ク ローナル抗体作製時の抗体価測定時に採取されたマ ウス抗血淸について、 リ セブター型チロ シンキナーゼが反応 して リ ン酸化され得るかど う か調べた。

リ ン酸化を行う前日 に新しい培地に交換し、 細胞数 5 X 1 0⁵ c e l l s /m l に した B a Z F S / F U L L F L A Gを実験当 日細胞数を 5 X 1 0⁶ 個取リ 出 して以下の 5種の 液 5 0 0 μ β に懸濁 して、 2 0分間、 3 7でにて。 0₂ イ ン キュベータ一中で反応させた。

反応液 1 : 培地 （ R P M I 1 6 4 0 、 1 0 % F C S、 1 0 0 / g Zm l マウス I L一 3 ) のみ ；

反応液 2 ： C一 1 細胞 5 X 1 0⁶ 個を反応液 1 の培地で懸 濁 した懸濁液 ；

反応液 3 ： 参考例 1 0に記載のマウス抗血淸を反応液 1 の 培地で 1 0 0倍希釈 した溶液 ；

反応液 4 ： 参考例 1 0に記載のマウス抗血清を反応液 1 の 培地で 5 0 0倍希釈 した溶液 ； 及び

反応液 5 ： 実施例 2に記載した方法で作製された C一 1細 胞の細胞培養上清をセン ト リ ブレ ップ 1 0 (米国、 ア ミ コ ン 社製） にて 5 0倍濃縮し、 反応液 1 の培地に溶液交換を行つ た溶液

反応後細胞をすぐさ ま氷中に置き 、 あらかじめ冷やしてお いた 2 mMバナジン酸ナ ト リ ウム （ N a ₃ V O„ ) を含む P B S (― ) を l m l 加え、 4 °Cにて 3 0 0 0 r p m、 1分間 遠心して細 '胞を沈降させ、 同様の作業を さ らにも う 1度行つ た後、 参考例 1 0記載の方法で細胞破砕溶液を得た。

こ の細胞破砕溶液に米国の K o d a k社製 A n t i 一 F L A G M 2 A f f i n i t y G e l を 3 0 μ β加えて、 沈澱を起こ さないよ う にゆつ く リ と回転させながら、 4 °Cに て反応させて、 ゲル上に F L A Gア ミ ノ 酸配列を有する配列 表の配列番号 2のァ ミ ノ酸配列を有するポ リ べプチ ドを吸着 させた。 反応後、 4 °C、 5 0 0 0 r p mの条件で 3分間遠心 を行いゲルを沈澱させて、 ゲルを吸わないよ う に上淸を除い た後、 参考例 1 0に記載のセルリ シスバッファーを 2 0 0 μ β加えて懸濁した。 更に同様に遠心操作、 懸濁操作を 3度行 い、 ゲルの沈澱物を得た。 以上と 同様な実験を B a Z F 3 / F U L L F L A Gだけではなく B a / F 3 / C O Nについて も行って同様のゲル沈澱物を得た。

このゲル沈澱物に参考例 8に記載の方法でウェスタ ンブロ ッ ト を行った。 ゲルの沈澱物 3 0 μ β の S D S — P A G Eサ ンプルバ ッ フ ァーを加えて、 2 — ME存在下で沸騰水浴 5分 行い、 1 5 μ β を 1 つの レーンに流して S D S — P A G Eを 行った。 同一サンブルが転写された P V D Fメ ンブラ ンを 2 組作リ 、 1組は目的の F L A G配列を有する配列表の配列番 号 2番のア ミ ノ酸配列を有するポ リ べプチ ドが回収されてい る こ と を確認し、 も う 一方ではチロ シン残基の リ ン酸化の有 無の判定に用いた。

このウェスタ ンブロ ッ 卜の写真を図 3 に示す。 A及び Bは 目的の配列表の配列番号 2のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べ プチ ド B a Z F 3 Z F U L L F L A Gの結果で、 C及び Dは それのコ ン ト ロールである B a / F 3 C O Nの結果である。 抗体の染色は A及び Cが抗 リ ン酸化チロ シン抗体 （米国、 U B I 社製） で、 B及び Dは A n t i — F L A G M 2 (米国、 K o d a k社製） によって行なった。 各 レー ンの番号は上記 の反応液の番号に対応する。 矢印は F L A G配列を有する配 列表の配列番号 2に記載のポリ ペプチ ドの位置を示す。

この結果から、 C— 1 細胞との共培養、 も し く はマ ウス抗 血清の刺激によって リ セプタ一型チ口 シンキナーゼのチ口 シ ンキナーゼ活性を活性化させ、 自 己のチロ シン残基の リ ン酸 ィヒを引き起こすこ とが判明 した。 しかしながら、 培地のみで はそのよ う なチロ シン残基の リ ン酸化は見られなかった。

さ らに、 マウス抗血清の濃度条件を変化させても、 C— 1 細胞と の共培養ほど強く リ ン酸化されていないこ とから、 ポ リ ク 口 一ナル抗体は本発明の リ ガン ドと 同等の作用を有する が、 明 らかに本発明の リ ガン ドの方がょ リ 強く リ セブター型 チロ シンキナーゼの酵素活性を上昇させ、 ょ リ 強く チロ シン 残基の リ ン酸化を引き起こ し、 リ セプター型チロ シンキナー ゼを通 した生理活性作用を細胞に及ぼすと考え られた。

一方、 実施例 2の B I A c 0 r e の結果では リ ガン ドが細 胞培養上清に存在する こ と が分かるが、 C 一 1 細胞の培養上 淸の 5 0倍濃縮液ではチロ シン残基の極めて弱い リ ン酸化し か引き起こ さなかった。 これは、 細胞培養上清中の リ ガン ド 量が極めて少なく 5 0倍濃縮程度の濃度では十分に リ セプタ 一型チロ シンキナーゼの細胞内部分のチロ シンキナーゼ活性 を上昇させないため力 も し く は リ ガン ドが細胞表面上の方 で部分的に高溏度にな リ 高い活性を有すためかは不明である が、 結果的に極めて弱い リ ン酸化しか引 き起こ さなかったと 推定された。

同様な実験を ヒ ト正常血清、 マウス正常血清、 F C S 、 細 胞株と しては B T— 2 0 について行ったがチロ シン残基の リ ン酸化は確認できなかったこ とから、 こ の反応は リ セプタ一 型チロ シンキナーゼに対する、 C一 1 細胞膜上にある特異的 な リ ガン ドによる作用によ る と考えられた。

以上の実施例 2 、 3及び 4 の結果から リ ガン ド発現細胞と してすく なく と も C— 1 細胞が挙げられ、 またその リ ガン ド はその細胞培養上淸、 及び細胞膜上に存在し、 これらから精 製でき る こ と が示された。

実施例 5 リ セプター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドのァフィ 二ティーカラムを用いた精製

実施例 4 までの結果から、 結腸癌由来細胞株 C一 1 が リ セ プター型チロ シンキナーゼの リ ガン ドを確実に発現している と考えられる こ とから、 その培養上清から p E X I g — P T Nを結合させたァフ ィ 二ティ ーゲルカラ ムを用いて精製する こ と を試みた。

C一 1 の上清は実施例 1 に記載の方法で作製されて最終的 に 5 4 O m l 分取し、 これを米国のア ミ コ ン社製セン ト リ ブ レップ 1 0で 4 5 m 1 に した濃縮液を用いた。 この濃縮液を 実施例 2に記載した方法にて測定 した B I A c 0 r e の値は 1 3 4 R Uであった。

ァフィ 二ティーカラムの作製はス ウェーデン国のフアルマ シァ社製 C N B r活性化 S e p h a r o s e 4 Bにて添付の 取扱い説明書に従い行った。 最終的に 4 . l m gの E X I g 一 P T Nが 3 . 5 m 1 のゲルに結合 したァフ ィ 二ティ 一ゲル が作製できた。 カ ップリ ング効率は 9 9 . 6 %であった。 こ のゲルの 2 m 1 を 2 c m² X 1 c mのサイ ズのカラムを作製 した。

このカラムに対し上記の細胞培養上清濃縮液を 2 0 m 1 / h r の速度で流し、 その後同一速度で P B S (—） を 1 5 m 1 流して洗浄し、 最終的に 0. 1 M酢酸ナ ト リ ウム、 0 . 5 M N a C 1 ( P H 4 . 0 ) にて溶出 した。 この溶離液を l m 1 づっ分取し、 各画分に l MT r i s — H C 1 ( p H 9 . 5 ) を 2 0 0 μ β づっ加えて、 中和 した。

このよ う にァフイ エティ 一カラムにて精製分画された溶液 を各画分を S D S— P A G Eにて中に含まれている タ ンパク 分子の分子量の確認を行った。 その際のサンプルバ ッフ ァ一 は 2 — M Eを含まないものを用い、 加熱しない非還元条件で 行い、 ゲルは 1 5〜 2 0 %のグラディエン トゲルを用いて行 つた。 分子量マーカーはス ゥ エーデン国のフ アルマ シア社製 L MW K i t Eを用いた。 電気泳動終了後、 日本国の和 光純薬社製ヮ コ一銀染キッ ト I I を用いて、 添付の染色方法 に従って銀染色を行った。 その結果を図 4 に示す。 溶出液に 入れ替わった直後から溶離されて く るバン ドが各種確認され たが、 この中のバン ドのどれが 目的の リ ガン ドに当たる力 ま この時点では不明であった。 そのため、 澳縮前、 カ ラム素通 リ 画分、 洗浄液、 及び分画した溶離液 （これについては 5分 の 1 希釈） の各画分を、 米国の ミ リ ポア社製ウル ト ラフ リ ー C 3 L G C ( 1 0 Kカ ッ ト） を用いて、 H B Sバッファ一に 溶液交換し、 再度 B I A c 0 r e で実施例 2 に記載の方法で 測定した。

その結果を表 3 に示す。

この結果から、 配列表の配列番号 1 に記載のア ミ ノ 酸配列 を有するポ リ べプチ ドを含むポ リ べプチ ドに結合する リ ガン ドと考えられる化合物が確かにフ ラ ク シ ョ ン番号 4の画分を ピーク と して濃縮、 精製されている こ と が確認できた。

実施例 6 リ セプター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドのゲル濾 過精製及び分子量の測定

次に、 実施例 5に示 したァ フ ィ 二ティ 一精製されたピーク のフ ラ ク シ ョ ン番号 4 の画分の 3 0 0 μ β を米国の ミ リ ポア 社製ゥノレ ト ラ フ リ ー C 3 L G C ( 1 0 Kカ ッ ト） を用いて、 0. 0 2 % T w e e n 2 0 を含む P B S (—） に溶液交換し、 同時に 6倍に濃縮し、 ゲル濾過を行った。

ゲル濾過のカラムはス ウェーデン国のフアルマシア社製 S u p e r d e x 7 5 H R 1 0 Z 3 0 を使用 し、 分離バッファ —は 0 . 0 2 % T w e e n 2 0を含む P B S (― ) を使用 し た。 流速は 4 0 μ β Ζπι ί ηの条件で行なった。 サンプルの 分離前にス ウェーデン国のフアルマシア社製分子量マーカ測 定キッ ト L MW用にて溶離位置の分子量の測定を行なったの ち、 上記のサンプルのゲル濾過を行い、 1面分 2 0 ^ β に分 画した。

このよ う に分子量分画されたサンプルを H B Sバッ ファー にて 1 0培希釈し、 B I A c 0 r e の測定を行った。

ゲル濂過フラ ク シ ョ ンの 2 1 4 n mの吸光度の値変化を図 5に示 し、 各フ ラ ク シ ョ ンの B I A c o r e の測定結果を図 6 に示す。 この結果からフ ラ ク シ ョ ン番号 1 3及び 1 4 にピ ーク を持つ配列表の配列番号 2のァ ミ ノ酸配列を有すポ リ べ プチ ドに結合する リ ガン ドのピーク が検出された。 さ らに、 フ ラ ク シ ョ ン番号 2 1及び 2 2 にも小さなピーク が同様に認 められた。 前もって行った分子量マ一カーの結果から、 フラ ク シヨ ン番号 1 1 と 1 2 の間が 6 3 0 0 0 ダル ト ン、 1 3 と 1 4の間力 ί 5 4 0 0 0 ダノレ ト ン、 1 5 と 1 6 の間力 S 4 3 0 0 0 ダル ト ンで有る こ と力ゝら、 フラ ク シ ョ ン番号 1 3及び 1 4 をピーク とする本発明の リ セプタ一型チロ シンキナーゼ リ ガ ン ドの分子量はゲル濾過の結果から 5 4 0 0 0 土 9 0 0 0 ダ ル ト ンと推定された。

さ らに、 同一分画サンプルを画分毎に実施例 5 に記載の方 法で同様に S D S — P A G Eにて中に含まれる化合物の解析 を行った。 その結果を図 7 に示す。

この結果から、 こ の活性面分 （フ ラ ク シ ョ ン番号 1 1 から 1 6 ) に含まれているバン ドは 3種確認された。 B I A c o r e の測定結果と の相関から本発明の リ ガン ドはおよそ 4 2 Kダル ト ンにあるスメ ァなバン ド （図 7 の右矢印で示す。 ） である と判断された。 従って、 本発明の リ セプタ一型チロ シ ンキナーゼリ ガン ドの分子量は 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ン と推定された。

ゲル濾過の結果と S D S — P A G Eの分子量の値は一致し ないがゲル濾過はゲルとの相互作用などによ り その推定分子 量が実際の物質と異なる こ とがあるため、 S D S — P A G E の値である 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ンが本発明の リ セブ ター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドの分子量である こ と が推察 された。

実施例丄 リ セプタ一型チロ シンキナーゼ リ ガン ドのァフィ 二ティ一カラムを用いた精製

さ らに、 上記のゲル濾過の活性画分 （フラ ク シ ョ ン番号 1 2 から 1 5 ) を回収 して、 再度実施例 5 に記載の方法で配列 表の配列番号 2に記載のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドを用いたァフィ 二ティーカ ラムにて精製 した。

カ ラ ムは小スケールのべ ッ ト ボ リ ューム 1 5 0 μ β の もの を用いて、 自然落下にて溶出 した。 上記の活性画分フラ ク シ ヨ ン番号 1 2から 1 5 を集め、 上記の小スケールカラムに流 した。 その後、 1 5 0 £ の 0. 0 2 % T w e e n 2 0 を含 む P B S (― ) を 8回流して洗浄した後、 1 5 0 £ の 0 . 1 M酢酸ナ ト リ ウム、 0 . 5 MN a C l ( P H 4 . 0 ) を 4 回流して各画分に分画して溶出 した。 溶出液には l MT r i s — H C 1 ( p H 9 . 5 ) を 3 0 μ βづっ加えて中和 した。 このよ う に して最終精製された リ ガン ドをその純度を確か めるために、 各画分を米国のミ リ ポア社製ウル ト ラ フ リ ー C 3 L G C ( 1 0 Kカ ッ ト） を用いて Ι Ο μ β に濃縮後、 各画 分ごと に S D S— P A G Eにて中に含まれている物質の確認 を行った。 その際のサンプルバッ フ ァ一は 2 — M Eを含まな い ものを用い、 加熱 しない非還元条件で行い、 ゲルは 1 5〜 2 0 %のグラディエン トゲルを用いて行った。 分子量マーカ —はス ウェーデン国のフアルマシア社製 L MW K i t E を用いた。 電気泳動終了後、 日本国の和光純薬社製ヮ コ一銀 染キッ ト I I を用いて、 添付の染色方法に従って銀染色を行 つた。

結果を図 8 に示す。 図 7では 3種の混合物の 1 つであった 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダノレ ト ンのバン ド力；フ ラ ク シ ョ ン番号 1 及び 2 に単一物と して精製されている こ とが確認された。 以上の結果から、 これらの方法で本発明の リ セプター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドが精製でき る こ とが示され、 純品を得 るこ と が出来た。

実施例 8 リ セプター型チロ シンキナーゼ リ ガン ドの呈色反 応

実施例 7 に記載の方法で精製された リ ガン ドの純品を、 実 施例 5 に記載の方法で同様に S D S— P A G E を行なった。

このよ う に して新規な リ ガン ドが泳動されたポ リ アク リ ル ア ミ ドゲルを、 タンパク質の特異的な染色法である クマシ一 プリ リ ア ン トブルー染色用 日本国の和光純薬社製クイ ック C B Bキ ッ ト を用いて、 添付の実験方法に従って染色を行った と こ ろ、 本発明の リ ガン ドであるおよそ 4 2 0 0 0 ダル ト ン のバン ドが染色され、 本発明の リ ガン ドにはタ ンパク質が含 まれている こ とが判明 した。

更に、 同様に作製されたポリ アク リ ルア ミ ドゲルを糖鎖の 特異的な染色法である P A S染色にて検出 した。 すなわち、 新規 リ セプタ一型チロ シンキナーゼ リ ガン ドが泳動されたポ リ アク リ ノレア ミ ドゲルを 1 2 . 5 %の ト リ ク ロ ロ酢酸溶液に 3 0分間振と う しなが ら浸し、 次に蒸留水にて同様に 3 0秒 間振と う しながら浸 し、 ついで 1 %過ヨ ウ素酸を含む 3 %酢 酸溶液にて 5 0分間振と う しながら浸した。 その後、 蒸留水 にてよ く 振と う して洗浄を行なった。 洗浄は 1 回 1 0分間で 8回行った。 洗浄後、 暗所にてフ ク シン液 （ 1 gの塩基性フ ク シン （日本国、 和光純薬社製） を 6 0 °Cに加熱 した 2 0 0 m l の蒸留水に溶かし、 これに対して l gの亜硫酸水素ナ ト リ ウム、 2 0 m l の 1 N H C 1 を加えて作製した。 ) に 1 時 間程度浸して染色した。 最後に 0 . 5 %亜硫酸ナ ト リ ウム溶 液にて 1 0分間振と う して洗浄し、 更にこれを 2回繰 リ返し 最終的に蒸留水中に置きバン ドの観察を行っ た と こ ろ、 P A S染色されている赤色バン ドが分子量およそ 4 2 0 0 0 ダル ト ンに確認できた。 こ の結果から本発明の リ ガン ドは糖を含 むこ と が判明 した。

以上の 2つの呈色反応の結果から、 本発明の リ ガン ドは糖 タンパク質を含む化合物である こ とが判明 した。

実施例 9 新規リ セプタ一型チロ シンキナーゼ リ ガン ドの N 末端からのア ミ ノ酸配列の決定

実施例 7に記載した方法によ リ 精製した リ ガン ドを含む溶 液を、 プロ ス ピン （米国、 アプライ ドバイオシステム社製） にのせ、 遠心後、 専用のポンチでプロ ス ピン中の P V D Fフ イ ノレタ一を取 リ 出 した。 フ イ ノレターは、 5 0 %メ タ ノ ール水 溶液、 及び精製水でよ く 洗浄後、 ペプチ ドシーク ェ ンサ一解 析機にて N末端の配列を決定した。 ぺプチ ドシ一クェンサ一 は、 米国のアブライ ドバイ オシステム社のプロテイ ン ' シー タエンサー m o d e 1 4 9 2 を使用 し、 附属の取扱い説明書 に従って解析を行った。 N末端からの解析の結果、 配列表の配列番号 1 9 に記載し たア ミ ノ酸配列、 すなわち N末端から Lys- Se r- Π e- Va卜 Leu- Glu-Pro-l l e-Tyr-Trp-Asn-Ser-Ser-Asn-Se r-Lys-Phe-Leu-Pr o-Gi y-Gln-Gl y-Leu-Va l-Leu-Tyr-Pro-Gln-l l e-Gl -Asp-Lys- Le u-As p-I 1 e-1 I e-XXX-P r o -L y s -V a 1 -A s p -XXX-L y s -Th r -V a 1 - G 1 y - XXX- Tyrの配列を有している こ とが示された。 ただし、 こ のア ミ ノ酸配列にはア ミ ノ酸残基が決定できなかった残基が 3 つぁ リ 、 これらの残基については各々 XXX と示した。 この 結果から、 本発明の リ ガン ドは配列表の配列番号 1 のア ミ ノ 酸配列を有すポリ ペプチ ドを含む化合物である こ とが示され た。

ア ミ ノ酸残基が不明である部分に関して、 配列表の配列番 号 1 9 のア ミ ノ酸配列の 3 7番のア ミ ノ 酸残基前後のァ ミ ノ 酸配列が明瞭に判断できている こ とから、 ジスルフ ィ ド結合 したシスティ ン残基、 も し く は糖鎖などで修飾されたア ミ ノ 酸残基など、 ア ミ ノ 酸が何らかの修飾を受けた結果ア ミ ノ酸 配列が決定できなかったと考えられる。

実施例 1 0 P C R法によ る リ ガン ドの c D N Aプローブの 作成

実施例 9 で行った N末端からのア ミ ノ 酸配列よ リ 、 オ リ ゴ ヌ ク レオチ ド混合プライマ一を用いた P C R法にて c D N A プローブの作成を行った。 すなわち、 実施例 1 に記載の P M Aを含む条件で培養された該 C一 1 細胞の m R N Aよ リ c D N Aを作成し、 実施例 9 の結果判明 したア ミ ノ 酸配列よ リセ ンス及びアンチセンスの 2 O m e r の混合プライマーを合成 し、 R T— P C Rを行レヽ、 p B 1 u e s c r i p t にサブク ローニングして、 遺伝子配列を決定し、 その遺伝子がコー ド しているア ミ ノ酸配列と実施例 9 で決定されたア ミ ノ酸配列 を比較して、 確かに リ ガン ドのア ミ ノ 酸配列の一部をコ一 ド している c D N Aプローブである こ と を確認した。

C— 1細胞からの m R N A、 すなわち P o 1 y (A) ⁺ R N Aの分離、 精製は次のよ う に行った。 実施例 1 の条件で培 養した C一 1 細胞をセルス ク レイ パ一 （米国、 コ 一ニング社 製） で剥し、 P B S (—） で 2回遠心分離洗浄を行った。 こ の細胞沈澱物の細胞数 3 X 1 0⁸ 個を 4 Mグァニジン · ィォ シァネー ト、 2 0 mM酢酸ナ ト リ ウム （ p H 5 . 2 ) 、 0 . 1 M D T T , 0. 5 % N— ラ ウ リ ルサルコ シルカ ら構成さ れる全 R N A抽出溶液 2 0 m l に懸濁させ、 日本国のテルモ 社製の 2 0 Gの針を通すこ と によ り 完全に溶解、 分散させた, その後、 5 0 0 0 gで遠心分離を 2 0分間行い、 上清を回収 した。 次に、 上記の全 R N A抽出溶液で全量を 2 5 m l と し た後、 5 . 7 M塩化セシウム、 0 . 1 M E D T A ( p H 8 0 ) 溶液の 1 2 m l を前もって入れておいた遠心分離チュ一 ブに重層 し、 1 8 °Cにて 2 5 0 0 0回転でー晚遠心分離した 遠心分離の結果、 全 R N Aを含む沈澱物を回収 し、 それに T E S溶液 （ l O m M T r i s ( p H 7 . 4 ) 、 5 m M E D T A、 1 % S D S ) の 7 2 0 μ β を力 Dえて室温に 1 0 分間放置して溶解し、 こ の溶液を 1 . 5 m l のエ ツペン ドル フチューブに移し、 溶液に対して同体積のク ロ ロ フ オルム/ ^ 1 ーブタ ノ ール （ 4 ： 1 ) を加えて良く 撹拌し、 1 5 0 0 0 回転、 5分間遠心分離し、 上層を回収し同様の操作を更にも う 1 度繰り 返し、 上層を回収 した。

次に回収した溶液を 2本のエツペン ドル フチューブに等量 ずつ分注し、 各々 に 3 M酢酸ナ ト リ ウム溶液 （ p H 5 . 2 ) を 3 0 μ β 、 エタ ノ ーノレを 8 5 0 χ βカ卩えて、 一 8 0 °Cに 3 0分間放置後、 4 °Cにて 1 5 0 0 0 回転で遠心分離を 1 5 分 間行い、 全 R N Aを沈澱させた。 更に同様に、 全 R N Aを含 む沈澱物を各々 3 6 0 μ Ά の滅菌蒸留水に溶かして、 3 M g 酸ナ ト リ ウム溶液 （ P H 5 . 2 ) を 3 6 μ β 、 エ タ ノールを 1 m 1 加え、 — 8 0 °Cに 3 0分間放置後、 4 °Cにて 1 5 0 U 0 回転で遠心分離を 1 5分間行い、 再度全 R N Aを沈澱させ て精製 した。

このよ う に して得られた全 R N Aを 7 0 %エタ ノールで洗 浄し、 風乾した後、 各々 1 0 Ο μ β の滅菌蒸留水に溶解し、 2 6 0 ：1 111の吸光度にて 1^ 1^八量を定量した。 この結果、 2 4 m g の全 R N Aが回収されているこ と が確認された。

次に、 上記の方法で得られた C — 1 細胞の全 R N Aから m R N A , すなわち P o 1 y ( A ) ⁺ R N Aの分離を行った。 分離はス ウェーデン国のフ ァ ノレマシア社製の m R N A p u r i f i c a t i o n K i t を用い、 添付の説明書に従つ て、 オリ ゴ d Tカラムによ る精製を行った。 この結果、 6 0 Ο g の全 R N Aょ リ 1 5 /i g の P o l y ( A ) ⁺ R N Aが 回収された。

このよ う に して、 精製された P o 1 y ( A ) ⁺ R N Aを米 国のライ フサイエンス社製 F i r s t — s t r a n d c D N A S y n t h e s i s K i t (日本国、 宝酒造株式会 社よ リ購入） を用いて、 添付の取扱い説明書に従って、 c D N Aの合成を行った。 すなわち、 上記の P o 1 y ( A ) * R N Aの 2 μ g を最終的に体穢が 1 6 μ β になる よ う に希釈し、 これに対して本キッ トに添付のオ リ ゴ d T ( 1 2 - 1 8 ) 溶 液 （ 0 . 5 y g / fi ) も しく はラ ンダムへキサマー （ 1 0 0 n g / μ Ά ) を Ι μ β力 Dえ、 7 0 °Cに 1 0分間放置 し、 次 いで氷中に 1 0分間放置した。

次に、 キ ッ トに添付の 5 X緩衝液を 5 £ 、 R N a s e ィ ン ヒ ビタ一である R N a s i n溶液を 1 μ β 、 0 . 2 5 Μ D T Tを 1 β 、 ア ビア ン ミ エ ロ ブラ ス ト シス ウイノレス逆転 酵素 ( a v i a n m y e l o b l a s t o s i s v i r u s r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e : 2 5 / μ β ) 溶液を 1 μ β を各々加え、 4 1 °Cで 6 0分間放 置して c D N Aを合成した、 その後 7 2 °Cに 1 0分間放置し て酵素を失活させ、 これを次の P C Rに用いた。 リ ガン ドのア ミ ノ酸配列の 1 部をコ一 ドする c D N Aプロ —ブの作製の為の P C Rは次のよ う に行った。 すなわち、 配 列表の配列番号 1 9 に記載の リ ガン ドの N末端からァ ミ ノ酸 配列の 5番目 のロイ シンから 1 1 番目 のァスパラギンまでの ア ミ ノ酸配列、 すなわち Leu- Gl U- Pro-11 e- Ty r- Trp- Asn の ア ミ ノ酸配列をコ一 ドする c D N A配列のあらゆる可能性に 対応した 2 0 m e r のオリ ゴヌ ク レオチ ド混合セ ンスプライ マ一、 すなわち配列表の配列番号 2 0 に記載の配列 （5'-(TC) T(ACGT)GA(AG)CC(ACGT)AT(TCA)TA(TC)TGGAA-3'，ブライマ一 9 ) を有す合成 D N A、 更にこのア ミ ノ 酸配列の C末端方向 のア ミ ノ酸配列、 すなわち配列表の配列番号 1 9 に記載のァ ミ ノ酸配列の 3 4番目 のァ スパラ ギン酸から 4 1 番目 のバ リ ンまでのア ミ ノ酸配列、 すなわち Asp- I 1 e- 1 I e- XXX-Pro- Lys -Va 1 のア ミ ノ酸配列に関して、 ア ミ ノ酸配列が不明である X XX 部分については、 実施例 9 に示したよ う に リ ガン ドが内 部でジスルフ ィ ド結合しているシスティ ン残基でぁ リ 、 ぺブ チ ドシークェンサ一で解析不能であつたと予想されたため、

As p-11 e-1 I e-Cy s-Pro-Lys-Va I のァ ミ ノ酸配列をコー ドする c D N A配列のあらゆる可能性に対応した 2 0 m e r のオ リ ゴヌ ク レオチ ド混合ア ンチセ ンスプラ イ マー、 すなわち配列 表の配列番号 2 1 に記載の配列 （5' - AC (TC)TT(ACGT)GG(AG) C A(AGT)AT(AGT) AT(AG)TC-3'、 プライマ一 1 0 ) を有す合成 D N Aの以上 2種を参考例 2 に記載 した方法に従って作製した。 P C Rによ るプローブ作製は以下のよ う に行った。 上記の 方法で作製された C一 1 の c D N A溶液を 2種混合 し、 この 混合液の Ι Ο μ β を使用 し、 1 0倍濃度緩衝液 （ 5 0 0 mM

K C 1 、 1 0 0 m M T r i s — H C l ( p H 8 . 3 ) 、 1 5 mM M g C 1 2 、 0 . 0 1 %ゼラチン） 1 0 μ β 、 d N T P M i x t u r e ( 日本国、 宝酒造社製） 8 /ζ β 、 及 び T a q D N Aポリ メ ラーゼ （A m p l i T a q : 米国、 P e r k i n — E l m e r社製、 5 υ/ μ β ) 0 . 5 μ β を加 え、 上記のプライマー 9及び 1 0が最終濃度で 1 0 にな るよ う に加え、 最後に脱イオン水を加えて全量を 1 0 0 μ β と して、 9 5 °Cで 0 . 5分間、 4 2 °Cで 0. 5分間、 7 2 °C を 1 分間からなる行程を 1 サイ クルと して、 この行程を 5サ イ クノレ行い、 続いて、 9 5 °Cで 0. 5分間、 4 8 °Cで 0 . 5 分間、 7 2 °Cを 1分間からなる行程を 1 サイ ク ルと して、 こ の行程を 3 5サイ ク ル行い、 最後に 7 2 °Cにて 7分間放置し て P C Rを行った。 こ の P C R産物の一部を 3 %ァガロース ゲル電気泳動を行い、 ェチジュ ゥムブ口マイ ド （ 日本国、 日 本ジーン社製） にて染色後、 紫外線下で観察し、 約 1 1 0 b Pの D N Aが増幅されている こ と を確認した。

次にこの P C R産物の全量を低融点ァガロ ース にて作成 し た 3 %ァガロ ースゲルにて電気泳動し、 ェチジュ ゥムブロマ ィ ドにて染色後、 紫外線照射下にて約 1 1 O b p のバン ドを 切 リ 出 し、 ゲルの 3倍量の T E溶液を加え， 6 5 °Cにて 1 0 分間加熱し、 ゲルを完全に溶かしたの ち 、 等量の T E飽和フ エノ一ノレ （ 日本国、 日本ジーン社製） を加えて、 1 5 0 0 0 r p m 5分間遠心分離後上淸を分離し、 さ らに同様な分離作 業を T E飽和フ エ ノ ール ： ク ロ ロ フ オノレム （ 1 ： 1 ) 溶液、 さ らにク 口 ロ フオルムにて行った。 最終的に得られた溶液か ら D N Aをエタ ノール沈澱して回収 した。 回収 した D N Aを 日本国の宝酒造社製の D N A B 1 u n t i n g K i t を用 いて、 添付の取扱い説明書に従い、 末端の平滑化を行い、 次 いで 日本国の宝酒造社製 T 4 P 0 1 y n u c 1 e o t i d e K i n a s e を用いて、 同社発行の遺伝子工学製品ガイ ド （ 1 9 9 4一 1 9 9 5年版） に記載の方法に従って、 末端 の リ ン酸化を行った。

このよ う に末端が平滑化、 リ ン酸化された P C R産物を、 前もって制限酵素 E c o R V (日本国、 宝酒造社製） で消化 し、 末端を 日本国の宝酒造社製 A l k a 1 i n e P h o s p h a t a s e ( C I A P ) にて、 同社発行の遺伝子工学製 品ガイ ド （ 1 9 9 4— 1 9 9 5年版） に記載の方法に従って 末端の脱 リ ン酸化した P B 1 u e s c r i p t に 日本国の 宝酒造社製 D N A L i g a t i o n K i t V e r 2 を用 いて、 添付の取扱い説明書に従ってライ ゲ一シ ョ ンを行った。

このライ ゲ一シヨ ン液の 2 /i β を大腸菌 J M 1 0 9 (日本 国、 東洋紡社製） に遺伝子導入し、 ア ン ピシ リ ンを 5 0 /i g Zm l 含む L一 B r o t h ( 日本国、 宝酒造社製） 半固型培 地のプレー ト に蒔き 、 1 2 時間程度 3 7 °Cに放置し、 現れて きたコ ロ ニーをラ ンダムに選択し、 c D N Aが組み込まれて いる こ と を M l 3ユニバーサルプライマー、 リ バースブライ マー （これらのプライマーの配列などに付いては米国のス ト ラ タ ジーン社の p B 1 e u s c r i p t の取扱い説明書を 参考に して参考例 2 に記載した方法で作製した。 ） を用いた P C R法にて、 イ ンサー ト を含まなレヽ p B 1 u e s c r i p t ょ リ 1 1 O b p 大きなバン ドが確認されるク ローンを 選択 した。 確認されたク ローンについて、 組み込まれている c D N Aの塩基配列を米国のアプライ ドバイオシステム社の 螢光 D N Aシークェンサ一にて決定した。

その結果、 配列表の配列番号 7 に記載の D N A配列の 1 3 8番から 2 0 4番の配列を有す遺伝子断片を有している P C R産物がク ローニングされている こ とが確認され、 リ ガン ド のア ミ ノ酸配列の一部のア ミ ノ酸配列をコ一 ド している c D N A断片のプローブが作製された。 その D N Aプローブの遺 伝子配列を配列表の配列番号 2 2 にそれがコ一 ドするア ミ ノ 酸配列と共に示す。 本 D N A配列と配列表の配列番号 7 に記 載の D N A配列の 1 1 8番から 2 2 4番の配列とは 5 カ所異 なっているが、 これらは P C Rブライマー由来の D N A配列 部分にあた リ 、 P C Rによ リ人工的に作製されたものに由来 する と考えられる。

実施例 1 1 C 一 1 細胞 c D N Aライブラ リ ーの作成及び リ ガン ドの全長 c D N Aク ローニング並びにその 解析

実施例 1 0 で作製した c D N Aプローブを用いて、 リ ガン ドのァ ミ ノ酸配列の全長をコー ドする c D N Aのク ロ ーニン グを行った。

まず初めに、 実施例 1 0 で精製された P o 1 y A ⁺ R N A を用いて、 C一 1 細胞の c D N Aライブラ リ 一を作製した。 c D N Aの作製は米国の G I B C O — B R L社の S u p e r

S c r i t I I R N a s e H— を使用 した。 実施例 1 0で精製された P o 1 y A ⁺ R N Aの 2 μ g を最終的な体積 力； 6 μ β となるよ う に 5 m M T r i s ( p H 7 . 5 ) で希 釈し、 6 5 °Cで 5分間放置し、 次いで氷上に 5 分間放置後、 次の溶液を加えた。 すなわち、 上記の米国の G I B C O - B R L社の S u p e r S c r i p t I I R N a s e H - に 添付の 5 X R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e ノく ッ ファ一 （ 0 . 2 5 M T r i s — H C 1 ( p H 8 . 3 ) 、 0 . 3 7 5 M塩化カ リ ウム、 1 5 m M塩化マグネシウム） を 5 μ H 、 0 . 1 M D T Tを 2 . 5 μ β 、 1 O m M d N T P 溶液 （独国のベ一 リ ンガーマンハイ ム社製の 1 0 O m Mの d A T P , d C T P 、 d G T P 、 d T T P溶液を等量混ぜ合わ せて作製し、 各々の最終濃度が 1 0 m Mと なるよ う に蒸留水 で希釈 して作製 した溶液） を 1 . 5 μ β 、 米国のプロ メ ガ社 製の R N a s e イ ン ヒ ビタ一溶液を 1 μ β 、 米国の G I B C O — B R L社製の 5 0 0 gノ m l オリ ゴ d T ( 1 2 — 1 8 ) 溶液を 2 . 5 μ β 、 滅菌蒸留水を 1 0 . 5 μ β を加えた。 そ の後、 1 0分間室温で放置し、 次に米国の G I B C O — B R L社の S u p e r S c r i p t I I R N a s e H— 酵素 溶液を 1 β 加え、 3 7 °Cで 1 時間放置 した。 そ して、 更に 同酵素溶液を 1 μ β加え、 4 5 °Cで 3 0分間放置し、 次に氷 中で 2 0分間放置した。 以上の過程によ リ 一本鎖 c D N Aが 作製された。

そ して次に、 この溶液に 1 O x S e c 0 n d - S t r a n d反応用バッファー （ 1 8 0 mM T r i s — H C 1 ( p H 8 . 3 ) 、 9 0 6 mM塩化カ リ ウム、 4 6 mM塩化マグネシ ゥム） を 2 0 μ β 、 0 . 1 M D T Tを 7 . 5 / β 、 上記の l O mM d N T P溶液を 3 μ β 、 滅菌蒸留水を 1 3 4 . 4 μ β を各々加え、 氷中に 5分間放置後、 ス ウ ェーデン国のフ ァ ノレマシア社製 R N a s e H ( 2 u n i t / μ 0, ) を 2 μ β 、 ス ウェーデン国のフアルマシア社製 D N Aポ リ メ ラーゼ （ 5 O u n i t / μ β ) を 8 . Ι μ β を加え、 1 6 °Cに 2 時間半 放置した。 その後、 フエ ノ ール ク ロ ロ フ オノレム （ 1 ： 1 ) 溶液を 2 0 0 μ β加え、 良く 混ぜ合わせた後、 1 5 0 0 0 回 転で 5分間遠心分離した後、 上層を回収 し、 さ らにク ロ ロ フ オルムを 2 0 0 /i β 加え、 同様に遠心分離し上層を回収した。 次に、 3 Μ酢酸ナ ト リ ウム溶液 （ Ρ Η 5 . 2 ) を 1 6 . 7 μ β 、 エタ ノールを 4 3 4 /χ β加え、 — 8 0 °Cに 3 0分間放置 した後、 4 °C、 1 5 0 0 0回転で 1 5分間遠心分離し、 2本 鎖になった C一 1 の c D N Aを沈澱させた。 そ ' 、 7 0 % エタ ノ ールで洗浄した後、 風乾し、 滅菌蒸留水で 1 Z 1 0に 希釈 した T Eバ ッ フ ァ 一 （ 日本国、 日本ジーン社製） の 3 0 μ & に溶解した。

次に、 この c D N Aを 日本国の宝酒造社製の D N A B 1 u n t i n g K i t を用いて、 添付の取扱い説明書に従い， 末端の平滑化を行い、 最終的に 2 0 μ β の T Eバ ッ フ ァーに 溶解した。 こ の c D N Aを用いて、 英国のアマ シャ ム社製 c D N Aク ローニングシステム ； I g t 1 0 にて、 添付の実験方 法に従って、 C一 1 細胞の ； L g t l O c D N Aライ ブラ リ 一 を作製した。 最終的に作製された c D N Aのタイ タ一はホス ト と して NM 5 1 4 (上記キッ ト に添付されている） 使用 し て測定したと ころ、 およそ 1 X 1 0⁸ p f u / μ g p o l y A ⁺ R N Aであった。

以上の方法で作製された c D N Aライ ブラ リ 一を参考例 6 に記載した方法と同様の方法でブラ一クハイブ リ ダィゼーシ ョ ン法にてスク リ ーエングした。 検索したライ ブラ リ ーのプ ラーク数は 4 X 1 0⁵ 個で、 スク リ ーニングに用いたプロ一 ブは配列表の配列番号 2 2 に記載の D N A配列を有する D N Aを P C R法にて作製し、 そのラベ リ ング方法は同様に参考 例 6 に記載したラベ リ ング方法で ³² Pラベルした。

ス ク リ ーユ ングの結果、 最終的に 4 ク ロ ー ン分離された。 ク ローン名は T 2 、 T 3 、 T 5 、 Τ 6 と命名 した。 各々 ク ロ —ンのファ一ジ D N Aを M a n i a t i s らの編集した前述 の成書の方法に従い、 精製した。 これらの 4種の D N Aを制 限酵素 E c 0 R I にて消化 してァガロールゲル電気泳動にて、 λ g t 1 0から リ ガン ドの c D N Aのイ ンサー ト部分を切 リ 出 し、 ァガロールゲル電気泳動にてそのサイ ズを調べたと こ ろ、 全てのク ローンと も 3つのバン ドが確認された。 それら ののおおおおよよそそのの DD NN AAののササイイ ズズはは各各々々 TT 22が力； 33 00 00 bb pp 、、 5 0 O b p 、 1 8 0 0 b p で、 T 3力； 3 0 0 b p 、 8 0 0 b P 、

4 0 0 0 b pで、 丁 5力 3 0 0 b p 、 8 0 0 b p 、 1 5 0 0 b pで、 丁 6力 3 0 0 b p 、 8 0 0 b p 、 2 0 0 0 b pであ つた。 そこでこれらの 1 2種のバン ドをァガロースゲルから 切 り 出 して、 前述の方法で精製し、 前もって制限酵素 E c o R I にて消化し、 末端の脱 リ ン酸化を行った p B 1 u e s c r i p t に前述の方法でライ ゲ一シ ヨ ン し、 大腸菌 J M 1 0 9 に遺伝子導入した。 これらのク ローンに各々 の遣伝子断片 がサブク ロ一ニングされている こ と を確認後、 ブラス ミ ド D N Aを精製して、 米国のアプライ ドバイ オシステム社製 D N Aシークェンサ一と 同社の蛍光ラベ リ ングキ ッ ト を使用 して 遺伝子配列を決定した。 また、 上記の 3 0 0 b p以上のサイ ズの D N Aについては各々制限酵素サイ 卜のマ ッ ビングを行 い、 その結果生 じた遺伝子断片を上記の方法でサブク 口 一二 ングを行う こ と及び日本国の宝酒造社製のキロ シ一キエ ンス 用デ リ ュ一シ ヨ ン ミ ュータ ン ト ' キ ッ ト を用い、 添付の取极 い説明書に従ってデリ ュ一シ ョ ン ミ ユータ ン ト作製する こ と を組み合わせて両方向からの遣伝子配列を決定した。

その結果、 明 らかになった遺伝子配列から、 上記の T 2 、 T 3 、 Τ 5 、 Τ 6の 4 ク ローンと も共通であった約 3 0 0 b P の遣伝子断片は配列表の配列番号 7の D N A配列の 1 3 5 番から 3 8 1番の部分にあたる 2 4 6 b P遺伝子配列を有す る遺伝子断片である こ とが明らかと なった。 従って、 ち ょ う どこれらの遺伝子断片は配列表の配列番号 7の D N A配列の 1 3 5番から 1 4 0番及び 3 7 6番から 3 8 1 番にある制限 酵素 E c 0 R I のサイ 卜で切 り 出されたものである こ とが明 らカ こなった。 次に、 T 2の 5 0 0 b p 、 T 3の 8 0 0 b p 、 T 5の 8 0 0 b p 、 丁 6の 5 0 0 b pの 1 方向において遺伝 子配列に一致部分が見いだされ、 さ らにその一致しなかった 方向に関 しては、 ライ ブラ リ 一作製に使用 した英国のアマシ ャ ム社製 c D N Aク ローニ ングシステム え g t 1 0のァダプ ターの配列が見いだされた。 また、 T 2の 1 8 0 0 b p 、 T 3の 4 0 0 0 b p 、 T 5の 1 5 0 0 b p 、 T 6 の 2 0 0 0 b Pにおいても同様に 1 方向において遺伝子配列に一致部分が 見いだされ、 さ らにその一致しなかった方向に関 しては、 ラ ィ ブラ リ ー作製に使用 した英国のアマ シャ ム社製 c D N Aク ローニングシステム え g t 1 0のアダプタ一の配列が見いだ された。 また、 最も大きな遺伝子断片 T 3の約 4 0 0 0 b p の遺伝子断片については、 そのアダプター配列に続き P o 1 y Aの配列が見いだされた。

これらの遺伝子配列から、 各々 ク ローンの各々の遺伝子断 片方向とつなが リ方を P C R法を用いた方法及び上記のファ —ジ D N Aの制限酵素サイ 卜のマ ッ ピング、 さ らにそれらの 遺伝子配列を決定し、 これらを対比 した結果、 リ ガン ドをコ — ド してレヽる c D N Aは、 その 5 ' 方向には各々 のク ロー ン の約 5 0 0〜 8 0 0 b p の遺伝子断片が位置し、 ついで約 3 0 0 b p の遺伝子断片が、 そ して 3 ' 方向には残 り の約 1 5 0 0〜 4 0 0 0 b p の遺伝子断片が位置 している こ と が明 ら かになった。

上記のよ う に並べた c D N A遺伝子配列をそれがコ 一 ド し ているア ミ ノ酸配列を配列表の配列番号 1 9に記載した リ ガ ン ドの N末端ア ミ ノ 酸配列を対比 した結果、 該 リ ガ ン ドが 々 ンパク質と して翻訳された際のア ミ ノ 酸配列は配列表の配 W 番号 7 に記載したア ミ ノ酸配列である こ と が明 らかと なった _c また、 上記のク ローン T 3 由来のア ミ ノ 酸配列をコー ド して いる c D N Aの遺伝子配列をその遺伝子配列がア ミ ノ酸をコ — ド している部分及びその前後の遺伝子配列を同様に配列表 の配列番号 7 に記載した。

本遺伝子配列の全長を有する c D N Aは上記のク ローン T 3であるため、 各々 の制限酵素 E c 0 R I サイ ト において c D N Aの方向が合う形でつないで （およそ 5 0 0 0 b P ) 、 p B 1 u e s c r i p t のマルチク ローニングサイ ト上につ ないで作製したプラス ミ ドを P B S— L I G— F U L L と し、 さ らに別のベク タ一である P U C 1 8 (ス ウェーデン国、 フ アルマシア社製） に同様にサブク ローニングして作成 したプ ラ ス ミ ドを P U C M E K L と した。 また、 配列表の配列番号 7に記載の D N A配列を有する遺伝子断片 （およそ 1 0 0 0 b p ) のみを同様に p B 1 u e s c r i p t のマノレチク ロ一 ニングサイ ト上につないで作製したプラ ス ミ ドを p B S— L I G— C O D E と した。

実施例 1 2 ノーザンブロ ッティ ングによ る リ ガン ドの m R

N A発現の解析

本発明の リ ガン ドをコ一 ド している m R N Aの発現を調べ るため、 あらかじめ m R N Aが転写されている フ イ ノレターで ある米国のし 1 0 n t e c h社 Human Mult iple Tissue No r thern Blot , Human Mult iple Tissue Northern Blot I I、 H u man Fetal Mult iple Tissue Northern Blot を用い、 実施例 1 1 で分離された配列表の配列番号 7の D N A配列の 1 3 8 番から 3 8 1番の 2 4 6 b P の遺伝子断片、 すなわち リ ガン ドのア ミ ノ酸配列をコー ド している部分の制限酵素 E c o R I で切 リ 出されるおよそ 3 0 0 b Pの遺伝子断片を用いて、 前述の方法にて ³² P標識してその m R N Aのサイ ズ、 発現臓 器を調べた。

その結果、 m R N Aのサイ ズはおよそ 5 2 0 0 b であ り 、 バン ドは 1 種類しか確認されなかった。 また、 発現臓器に関 しては、 ヒ ト成人組織の う ち心臓、 脳、 胎盤、 肺、 骨格筋、 胬臓、 脾臓、 前立腺、 精巣、 卵巣、 小腸で発現が認められ、 特に胎盤、 肺、 ^臓において若干は強く 発現が認められた。 しかしながら、 肝臓、 すい臓、 胸腺、 大腸、 末梢血 リ ンパ球 においては発現が極めて弱いカ も しく は発現が認め られな かった。 また、 ヒ ト胎児組織では心臓、 脳、 肺、 腎臓におい て発現が認められたが、 肝臓においては発現が認められなか つた。

また、 同様のプローブを用いて、 同様の方法でラ ッ トの臓 器における発現を米国の C 1 o n t e c h社 Rat Mult iple Tissue Northern Blot を用いて調べたと ころ、 m R N Aの サイ ズはおよそ 5 0 0 0 b であ り 、 心臓、 脳、 脾臓、 肺、 骨 格筋、 精巣に発現が認められ、 特に肺において強い発現が認 められた。 しかしながら、 肝臓、 腎臓においては発現が認め られなカゝつた。

これらの結果から、 実施例 1 1 でク ローニングされた c D N Aのク ローン T 3 はほぼ全 m R N Aの遺伝子配列を含んで いる と予想される。

実施例 1 3 遺伝子導入による リ ガン ド発現細胞の作成

上記の配列表の配列番号 7記載の遺伝子を用いて、 リ ガン ドの発現べク タ—並びに リ ガン ドとのキメ ラ タ ンパク の発現 べク タ一を作製し、 リ ガン ドの遺伝子を発現させた。 発現させた形態及び方法を 1 ) 〜 5 ) に上げた。 すなわち、 1 ) 配列表の配列番号 7 に記載した D N A配列、 すなわち 全長の c D N Aを、 発現ベク ターを用いて、 動物細胞に遺伝 子導入してシグナルべプチ ドを含む膜結合型と して発現させ、 最終的にシグナルぺプチ ドを含まない形態、 すなわち配列表 の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有する形態の リ ガン ドと し て細胞表面上に発現させ、 最終的に培養上清中に発現させる 方法。

2 ) 発現された該 リ ガン ドの検出を容易にするため、 配列 表の配列番号 7に記載の D N A配列の終止コ ドンの前、 すな わち配列表の配列番号 7の D N A配列の 1 0 2 9番の C と 1 0 3 0番の Tの間に、 配列表の配列番号 1 3の D N A配列を 有する D N Aが挿入された遺伝子配列を有する D N Aを、 発 現ベク ターを用いて、 1 ) と同様に発現させ、 細胞内部分の C末端に配列表の配列番号 1 3 に記載のア ミ ノ 酸配列、 すな わち F L A G配列を有する形態を取る よ う に発現させる方法。

3 ) 配列表の配列番号 7 に記載の D N A配列の 3 1番から 6 9 0番の D N A配列の 3 ' 末端に停止コ ドンが挿入された 遺伝子配列を有する D N A、 すなわち配列表の配列番号 7に 記載のア ミ ノ酸配列の— 2 5番から 1 9 5番のア ミ ノ酸配列 のみをコー ドする c D N Aを、 発現べク タ一を用いて、 動物 細胞に遺伝子導入して、 シグナルペプチ ドを含む分泌型と し て発現させ、 最終的にシグナルペプチ ドを含まない形態、 す なわち配列表の配列番号 5 に記載のア ミ ノ酸配列を含有する 形態の リ ガン ドと して、 培養上清中に発現させる方法。

4 ) 配列表の配列番号 7 に記載の D N A配列の 3 1番から 6 9 0番の D N A配列の 3 ' 末端に配列表の配列番号 1 3の D N A配列を有する D N A、 次いで停止コ ドンが挿入された 遺伝子配列を有する D N A、 すなわち配列表の配列番号 7に 記載のア ミ ノ酸配列の一 2 5番から 1 9 5番のア ミ ノ 酸配列 の C末端に配列表の配列番号 1 3 のア ミ ノ 酸配列が結合した ア ミ ノ酸配列をコ一 ドする D N Aを、 発現べク タ一を用いて、 3 ) と 同様に発現させ、 最終的にシグナルペプチ ドを含まな い形態、 すなわち配列表の配列番号 5に記載のア ミ ノ酸配列 の C末端に配列表の配列番号 1 3 のア ミ ノ酸配列、 すなわち F L A G配列を有する形態を取る リ ガン ドと して、 培養上清 中に発現させる方法。

5 ) 配列表の配列番号 7 に記載の D N A配列の 3 1 番から 6 9 0番の D N A配列の 3 ' 末端に、 参考例 8 に示 した方法 で作製された ヒ ト I g G F c部分をコー ドするゲノ ム遺伝子 配列を有する D N Aがつながった配列を有する D N A、 すな わち配列表の配列番号 7 に記載のァ ミ ノ 酸配列の— 2 5番か ら 1 9 5番のア ミ ノ酸配列コ ー ドする D N Aとその C末端に ヒ ト I g G l の F c 部分のア ミ ノ 酸配列をイ ン ト ロ ンを含む 形態でコー ドする D N Aを、 発現ベク ターを用いて、 3 ) と 同様に発現させ、 最終的にシグナルべプチ ドを含まない形態、 すなわち配列表の配列番号 5に記載のア ミ ノ酸配列の C末端 に ヒ ト I g G l の F c部分のア ミ ノ酸配列を有する形態で発 現され、 最終的にその I g G F c部分のヒ ンジ領域のシステ イ ン残基がおこすジスルフ ィ ド結合にょ リ 、 2量体を形成し た形態を有する リ ガン ドと して、 培養上清中に発現させる方 法。

これらの 1 ) から 5 ) の形態を取 り得る発現べク タ一を、 参考例 8に示 した発現ベク ター p MK I T n e o を用いて作 製した。 作製の詳細は参考例 8 に示した方法と 同様の方法に 従い、 P C R法等を用いて作製した。

作製された 1 ) カゝら 5 ) の発現べク タ一を各々 、 1 ) 〖ま p MK L i g F U L L、 2 ) は p MK L i g F U L L F L A G、 3 ) は p MK L i g E X、 4 ) は p MK L i g E X F L A G、 5 ) は p MK L i g E X I g とする。

遺伝子導入は p MK L i g F U L Lに関 しては該 C O S — 7細胞及び該 C— 1 細胞に行い、 残り のは該 C O S — 7細胞 のみで行い、 その遺伝子導入法は参考例 8 に示 したエ レク ト ロボレ一ショ ン法で行い、 その他の培養条件等については参 考例 8 に記載した C O S — 7細胞の条件で行った。

1 ) に示した方法で作製された C一 1 細胞を、 遺伝子導入 後、 1 日間 1 0 % F C S入 り の条件で培養 し、 その後無血清 培地に置き換え、 培養上淸を 4 日 間おき に 3回を分取した。 同様操作を、 リ ガン ド遺伝子を含まない発現べク タ一を用い て、 遺伝子導入を行い、 コ ン ト ロールと した。 この様に して 作製された培養上淸 2種を、 実施例 1 に記載の方法で 1 0倍 に濃縮し、 実施例 2 に記載した方法に従い、 B I A c o r e を用いて、 それらの B i n d i n g A c t i v i t yを E X l g — P T Nの結合したチップで測定した。 その結果、 コ ン ト ロ 一ノレでは B i n d i n g A c t i v i t y力；結合活 性が 9 8 R Uであったが、 リ ガン ド遺伝子導入サンプルでは 3 1 0 R Uであった。

さ らに、 この 2種の培養上清を実施例 5から 7に記載の方 法と 同様の方法で リ ガン ドの精製を行ったと こ ろ、 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ンの リ ガン ドが精製された。 精製された リ ガン ドの精製量は、 ポ リ アク リ ルア ミ ド電気泳動ゲルの銀 染色の結果から、 視覚的に確認したと こ ろ 、 リ ガン ド遺伝子 導入サンプルはコ ン ト ロ ールに比べておよそ 3倍程度であつ た。 また、 こ の様に精製された リ ガン ドを、 再度同様に B I A c o r e にて B i n d i n g A c t i v i t y を測定し たと こ ろ、 コ ン ト ロールに比べておよそ 3倍の B i n d i n g A c t i v i t y を有している こ とが明 ら力 こなった。 この結果から、 配列表の配列番号 7の遺伝子導入細胞株は リ ガン ドをよ リ 効率的に産生する こ とが出来る こ とが明 ら力 こ なった。

同様な実験、 すなわち上記の遗伝子導入、 培養上淸分取、 培養上清からの リ ガン ドの精製を C O S - 7細胞にて行い、 参考例 8に記載した方法に従い、 非還元条件下でサンプルを 調製し、 S D S— P A G Eを行い、 銀染色を行ってバン ドの 確認を行ったと こ ろ、 コ ン ト ロールでは 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0ダル ト ンのバン ドは確認されなかったが、 遺伝子導入細胞 上淸中には 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダノレ ト ンのバン ドが同俵に 確認された。 この精製された リ ガン ドを実施例 9 に記載の方 法で N末端のア ミ ノ酸配列を決定したと こ ろ、 配列表の配列 番号 4 に記載したア ミ ノ酸配列を有していた。 これらの結果 から、 リ ガン ドを発現していない、 も し く は発現の弱い細胞 株に配列表の配列番号 7の遺伝子導入を行う こ と によ リ 、 リ ガン ドを産生させる こ とが出来る こ とが明 ら力 こなった。 次に、 2 ) に示 した発現べク タ一で遗伝子導入を行った C O S— 7細胞を、 F C S入リ培地で 4 日 間培養後、 参考例 9 に記載した方法で細胞の破砕物を得て、 参考例 8 に記載した 方法に従い、 還元条件下でサンプルを調製 し、 S D S — P A G E及び抗 F L A G抗体を用いた抗体染色法にてウェスタン プロ ッ トを行い、 上記の 2 ) に示 した C末端に F L A G配列 を有する配列表の配列番号 6 のァ ミ ノ 酸配列を含有する リ ガ ン ドが細胞上に発現されているかを調べた。 その結果、 分子 量が 3 0 0 0 0カゝら 6 0 0 0 0 ダル ト ン程度の極めて幅広い 部分が染色された。 し力 しながら、 コ ン ト ロ ールの C O S — 7細胞はそのよ う なバン ドは認められなかったこ とから、 本 リ ガン ドが細胞上で発現された場合、 極めて幅広い分子量を 有してなる物質と して発現される こ とが明 らかになった。

次に、 3 ) に示した方法で作製された C — 1 細胞を、 遺伝 子導入後、 1 日 間 1 0 % F C S入 リ の条件で培養後、 無血清 培地に置き換え、 培養上淸を 4 日 間おきに 3 回を分取 した。 こ の様に して作製された培養上清を、 実施例 1 に記載の方法 で 1 0倍に濃縮し、 実施例 5 から 7 に記載の方法と 同様の方 法で リ ガン ドの精製を行ったと こ ろ、 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ンの リ ガン ドが精製された。 こ の精製された リ ガン ド を実施例 9 に記載の方法で N末端のァ ミ ノ酸配列を決定した と こ ろ、 配列表の配列番号 4 に記載 したァ ミ ノ 酸配列を有 し ていた。 これらの結果から、 リ ガン ドを発現していない、 も し く は発現の弱い細胞株に、 少な く と も 3 ) で示 した遺伝子 を遺伝子導入を行う こ と によ リ 、 リ ガン ドを産生させる こ と が出来る こ とが明ら力 こなった。 次に、 4 ) に示した方法で作製された C _ 1 細胞を、 遺伝 子導入後、 1 日間 1 0 % F C S入 り の条件で培養後、 無血清 培地に置き換え、 培養上清を 4 日 間おきに 3回を分取した。 この様に して作製された培養上清を、 実施例 1 に記載の方法 で 1 0倍に濃縮した。 こ の濃縮液を参考例 8 に記載した方法 に従い、 非還元条件下でサンプルを調製 し、 S D S — P A G E及び抗 F L A G抗体を用いた抗体染色法にて ウェス タ ンブ ロ ッ ト を行なった。 このよ う に して、 上記の 4 ) に示した C 末端に F L A G配列を有する配列表の配列番号 5 のア ミ ノ酸 配列を含有するポリ ぺブチ ドを含むリ ガン ドが培養上清中に 発現されているかを調べた。 その結果、 分子量がおよそ 2 0 0 0 0から 5 0 0 0 0 ダル ト ン程度の極めて幅広い部分が染 色され、 特に強く 染まった部分は、 4 2 0 0 0 ダル ト ンを中 心と した部分と 、 2 4 0 0 0ダル ト ンを中心と した部分であ つた。 し力 >しながら、 コ ン ト ロールの C O S — 7細胞の培養 上淸では、 そのよ う なバン ドは認められなかったこ と から、 上記の 4 ) に示した C末端に F L A G配列を有する配列表の 配列番号 5のア ミ ノ 酸配列をコー ドする D N Aを動物細胞に 遗伝子導入する と 、 およそ 2 0 0 0 0力 ら 5 0 0 0 0 ダル ト ンの リ ガン ド、 またこれらには少なく と も分子量が 4 2 0 0 0ダル ト ン付近、 2 4 0 0 0 ダル ト ン付近である リ ガン ドが 含まれている こ とが明 らかになった。

次に、 5 ) に示した方法で作製された C— 1 細胞を、 遺伝 子導入後、 1 日 間 1 0 % F C S入 リ の条件で培養後、 無血清 培地に置き換え、 培養上淸を 4 日 間おき に 3回を分取 した。 こ の様に して作製された培養上清を、 実施例 1 に記載の方法 で 1 0倍に濃縮した。 この濃縮液を参考例 8 に記載した S D S— P A G E及びペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト I g羊抗体を 用いた抗体染色法にてウェス タ ンブロ ッ ト を行なった。 但し、 S D S — P A G Eの際のサンプル調製の条件と して、 還元条 件下のサンブルと非還元条件下のサンプルの 2つで行った。 このよ う に して、 上記の 5 ) に示した C末端にヒ ト I g Gの F c部分のァ ミ ノ酸配列を有する配列表の配列番号 5 のァ ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドを含む リ ガン ドが培養上清 中に発現されているかを調べた。 その結果、 還元条件下では、 分子量の中心がおよそ 8 0 0 0 0 ダル ト ン程度の極めて幅広 い部分のバン ドが染色され、 非還元条件では 2 0 0 0 0 0 ダ ノレ ト ン程度の極めて幅広いの部分のバン ドが染色された。 し 力 しなが ら、 コ ン ト ロールの C O S— 7細胞の培養上清では、 そのよ う なバン ドは認められなかったこ とから、 上記の 5 ) に示 した C末端にヒ ト I g Gの F c部分のア ミ ノ酸配列を有 する配列表の配列番号 5のア ミ ノ酸配列をコー ドする D N A を動物細胞に遺伝子導入する と 、 還元条件下では、 分子量の 中心がおよそ 8 0 0 0 0 ダル ト ン程度、 非還元条件では 2 0 0 0 0 0 ダル ト ン程度をの ヒ ト I g Gの F c部分と リ ガン ド と融合物が培養上清中に産生 し、 また分子量の大き さ と ヒ ト I g Gの F c 部分のア ミ ノ 酸配列の構造から、 こ の融合物は 2量体も しぐはそれ以上の多量体構造を有している こ とが明 らかになった。

以上に示した結果から、 上記 1 ) 〜 5 ) の方法を用いれば, 該リ ガン ドの生産効率の向上、 並びに該 リ ガン ド未産生細胞 に該 リ ガン ドを産生させる こ とが出来、 さ らに配列表の配列 番号 5及び 6 のア ミ ノ 酸配列を有するポ リ べプチ ドの 1部も しく は全部を含有してなる化合物が作製でき 、 また、 それら の 2量体も し く はそれ以上の多量体構造を有する複合体が作 製でき るこ とが示された。

実施例 1 4 遺伝子導入細胞によ リ 生産された リ ガン ド細胞 外部分の精製

実施例 1 3記載の 4 ) 及び 5 ) の方法で作製された C O S 一 7の培養上淸を用いて、 参考例 9に記載した方法にて各々 の細胞培養上淸中からァフ イ エティ—カ ラ ムにて リ ガン ドと の融合蛋白を精製した。

4 ) の培養上淸に関 しては、 培養上清の 5 1 を米国のコダ ッ ク社製 A n t i — F L A G M 2 A f f i n i t y G e l カ ラムに通して、 リ ガン ドを C末端部分の F L A G配列 を有する部分でカ ラ ムに吸着させた。 カ ラ ムのサイ ズは共に 1 c m X 3 c mで容稍はおよそ 2 m 1 であ リ 、 流速は全て 1 m l /m i n . で行った。 吸着後、 カ ラ ムを P B S (―) 2 O m l で洗浄し、 その後、 0. 5 M T r i s—グ リ シン （ p H 3 . 0 ) で溶出 した。 溶出画分を 2 m l ずつ分取し、 0 . 5 M T r i s - H C 1 ( p H 9 . 5 ) 2 0 0 /i fi ずつ加えて， 各々 の画分を中和した。 また、 5 ) の培養上清に関 しては、 培養上清の 5 1 をス ウェーデン国のフアルマシア社製 P r o t e i n A セフ ァ ロ一スカ ラムに通 して、 上記と 同 じ力 ラ ムのサイ ズ、 流速で行った。 また、 洗浄、 溶離に関 しても 同様に行った。

さ らに、 上記の方法で精製された C末端に F L A G配列を 有する配列表の配列番号 5のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べ プチ ドを含む リ ガン ド、 及び C末端に ヒ ト I g Gの F c部分 のア ミ ノ酸配列を有する配列表の配列番号 5のァ ミ ノ 酸配列 を含有するポリべプチ ドを含む リ ガン ドを各々 のゲル濾過に て精製を行った。 ァフィ 二ティーカラムからの溶離液を米国 のア ミ コ ン社製セン ト リ コ ン 3 0 にて濃縮及び P B S (―) へのバッファー交換を行い、 ゲル濾過はス ゥエーデン国のフ アルマ シア社製 F P L Cシステムを用い、 同社の S u p e r o s e 1 2 カ ラムにて行った。 その溶離画分を各々実施例 2 に記載 した B I A c o r e を用いて、 それらの B i n d i n g A c t i v i t y を E X I g — P T Nの結合したチップ で測定した。 次に、 B i n d i n g A c t i v i t yの高 い画分を 4 ) の培養上清由来、 5 ) の培養上淸由来各々別々 にま と め、 さ らに、 上記の方法で濃縮し、 それらを実施例 1 4 に記載した方法で S D S — P A G Eを行い、 さ らに銀染色 を行った。 その結果、 実施例 1 4 で得られたウェス タ ンプ ロ ッ 卜の結果染色された部分に対応する部分が銀染色された。 従って、 C末端に F L A G配列を有する配列表の配列番号 5 のア ミ ノ酸配列を含有するポリ ペプチ ドを含む リ ガン ド （以 降こ の物質を L i g F L A G— P T Nとする） 及び、 C末端 にヒ ト I g Gの F c 部分のア ミ ノ酸配列を有する配列表の配 列番号 5のァ ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドを含むリ ガ ン ド （以降こ の物質を L i g I g — P T N) の精製物を得た。

これら精製産物を実施例 9 に記載の方法で N末端のァ ミ ノ 酸配列を決定したと こ ろ、 配列表の配列番号 4 に記載したァ ミ ノ酸配列を共に有していた。 この様に して、 L i g F L A G— P T N及び L i g I g — P T Nを精製でき る こ とが示さ れた。

実施例 1 5 リ ガン ドを認識する抗体作成、 タ ンパク発現の 確認

配列表の配列番号 7 に記載のア ミ ノ酸配列の 1 1番から 3 7番のア ミ ノ酸配列から構成されるオリ ゴペプチ ドを常法に 従い、 米国のアプライ ドバイオシステム社製ペプチ ド合成機 によ り 作製し、 カブ トガニ由来へモシァニン （ K L H) (米 国、 シグマ社製） と末端のシスティ ン残基で結合させて、 こ れを免疫原と してゥサギに免疫 して、 抗体価の測定後、 全血 の採血を行い、 血淸を採取 して、 米国の B i o R a d社製の ェコ ノ パッ ク血清 I g G精製キ ッ ト を用いて、 添付の取扱い 説明書に従って、 抗リ ガン ドウサギポ リ ク ロ一ナル抗体を精 製して作製した。

さ らに、 実施例 1 4 に記載の方法で精製された L i g F L A G— P T Nを免疫原と して、 上記の方法と 同様に、 ゥサギ に免疫 して抗 リ ガン ドウサギポリ ク 口 一ナル抗体を作製した。

また、 実施例 1 4 に記載した方法で精製された L i g F L A G— P T Nを免疫原と して、 成書の方法に従いマ ウ スモ ノ ク ロ一ナル抗体を作成した。 すなわち、 上記のよ う に精製さ れた L i g F L A G— P T Nを B a 1 b / cマ ウス （ 日本国、 ョ本エスエルシー社製） に 1 匹あた り 1 g を皮下 · 皮内 に免疫 した。 2回の免疫後、 眼底採血を行い血清中の抗体価 の上昇を認めた後、 3回目の免疫を行ってからマウスの脾臓 細胞を取 リ 出 し、 マ ウ ス ミ エローマ細胞株 P 3 X 6 3 A g 8 ( A T C C T I B 9 ) とポ リ エチ レングリ コール法にて細 胞融合を行った。 H A T培地 （ 日本国、 日本免疫生物研究所 製） にてハイ プリ ドーマを選択し、 酵素抗体法にて リ ガン ド の細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブ リ ドーマ株を株を分離し、 リ ガン ドを特異的に認識するマ ウ スモノ ク ローナル抗体を産生するハイプ リ ドーマ産生株が榭 立された。

このよ う に して樹立されたハイ プ リ ドーマの培養上淸をス ゥエーデン国のフ アルマ シア社製 M a b T r a p G I I を用いて、 添付の取扱い説明書に従って、 抗 リ ガン ドモノ ク 口 一ナル抗体を精製 し作製した。

これらの抗体を用いて、 実施例 7で精製された リ ガン ド、 及び実施例 1 3の 1 ) 、 2 ) 及び 3 ) の方法で作製 した遺伝 子導入された C O S — 7細胞の細胞培養から、 実施例 5から 7に記載の方法で精製された各々 の リ ガン ドの濃縮液を、 参 考例 8 に記載の条件でウェスタ ンブロ ッ ト を行った。 ただし、 ゥサギで作製したポ リ ク ローナル抗体に関 しては、 2次抗体 と して英国のアマシャ ム社製抗ゥサギ I g羊抗体を使用 した。 その結果、 すべて 4 2 0 0 0 ダル ト ン付近のブロー ドな部分 のバン ドを染色でき 、 これらの抗体は何れも リ ガン ドを特異 的に識別でき るこ とが明 らかになった。 同様に、 実施例 1 3 の 4 ) 及び 5 ) に記載の方法で作製し、 実施例 1 4に記載の 方法で作製した L i g F L A G— P T N及び L i g I g — P T Nについては、 米国の B i o R a d社製の P V D F メ ンブ ラ ンを用い、 添付の取扱い説明書に従って、 ド ッ ト ブ ロ ッ ト を行なった。 すなわち、 L i g F L A G— P T N及び L i g I g — P T Nの溶液の 5 /x β を米国の B i o R a d社製 P V D F上に落と し、 風乾後、 実施例 8に記載したウェス タ ンブ ロ ッ トの条件と同様の方法で抗体染色 した。 その結果、 共に コ ン ト ロール抗体では染色されなかったが上記の精製抗体全 てによ リ染色される こ とが明 ら力 こなった。

さ らに、 特に上記モ ノ ク ローナル抗体に関 して、 C— 1 細 胞及び実施例 1 3の 1 ) の方法で遺伝子導入され、 4 日後の C O S — 7細胞について、 参考例 1 0に記載 した方法で米国 のコールター社製フ ロ ーサイ ト メ ーター E P I C Sエ リ ー ト にて細胞表面の リ ガン ドの発現の解析を行った。 抗体によ る 染色は成書の方法に従って行った。 1 次抗体と して上記の精 製されたモノ ク ローナル抗体を用い、 2次抗体と して米国の べク ト ンデッキン ソ ン社製ャギ抗マ ウス I g F I T C標識で 行った。 その結果、 C一 1 細胞の全て、 並びに遺伝子導入 C O S— 7細胞およそ 2 0 %が上記のモノ ク ロ ーナル抗体によ リ染色される こ とが確認された。

以上の結果から、 本実施例に示された抗体は実施例 7で精 製された リ ガン ド、 C— 1 細胞上に存在する リ ガン ド、 並び に実施例 1 3 の各々 の条件で発現が確認された リ ガン ドを特 異的に認識するこ と が確認された。

実施例 1 6 リ ガン ドによ るチロ シン残基 リ ン酸化反応

実施例 7で精製された リ ガン ド、 及び実施例 1 4で得られ た L i g F L A G— P T N及び L i g I g — P T Nが参考例

8 に記載の形質転換細胞 B a / F 3 / F U L L F L A Gの細 胞膜表面上に発現されている リ セブタ一型チロ シンキナーゼ の自 己 リ ン酸化を引き起こすかど う かについて調べるため以 下の実験を行った。

リ ン酸化を行う前日 に新しい培地に交換 し、 細胞数 5 X

1 0⁵ c e 1 1 s Zm l に した B a Z F 3 F U L L F L A Gを実験当 日細胞数を 5 X 1 0⁶ 個取リ 出 して以下の 8種の 液 5 0 0 /χ β に懸濁 して、 2 0分間、 3 7 °〇にて〇 0₂ イ ン キュベータ一中で反応させた。 反応液 1 : 培地 （ R P M I 1 6 4 0、 1 0 % F C S , 1 0 0 /i g /m l マウス I L一 3 ) のみ ；

反応液 2 ： C— 1 細胞 5 X 1 0⁶ 個を反応液 1 の培地で懸 濁した懸濁液 ； 及び

反応液 3 ： 実施例 7で精製された リ ガン ドを 5 0 0 μ g / m 1 の濃度で含む反応液 1 の培地 ；

反応液 4 ： 実施例 7で精製された リ ガン ドを 1 0 0 g / m 1 の濃度で含む反応液 1 の培地 ；

反応液 5 ： L i g F L A G— P T Nを g Zm l の 濃度で含む反応液 1 の培地 ；

反応液 6 ： L i g F L A G— Ρ Τ Νを 1 0 0 g /m l の 濃度で含む反応液 1 の培地 ；

反応液 7 ： L i g I g — P T Nを 5 0 0 g /m 】 の濃度 で含む反応液 1 の培地 ；

反応液 8 ： L i g l g — P T Nを l O O g /m l の濃度 で含む反応液 1 の培地

反応後細胞をすぐに氷中に置き、 あらかじめ冷やしておい た 2 mM N a ₃ V O , を含む P B S (― ) を l m l 加え、 4 °〇にて 3 0 0 0 111、 1分間遠心して細胞を落と し、 同 様の作業をさ らにも う 1度行った後、 参考例 1 0記載の方法 で細胞破砕溶液を得た。 この細胞破砕溶液に米国の K o d a k社製 A n t i 一 F L A G M 2 A f f i n i t y G e l を 3 0 β加えて、 沈緞を起こ さないよ う にゆつ く リ と回転させながら、 4 °Cに て反応させて、 ゲル上に F L A Gア ミ ノ 酸配列を有する配列 表の配列番号 3のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドを吸 着させた。 反応後、 4 °C、 5 0 0 0 r p mの条件で 3分間遠 心を行いゲルを沈澱させて、 ゲルを吸わないよ う に上清を除 いた後、 参考例 1 0に記載のセル リ シスバ ッ フ ァ ーを 2 0 0 μ β加えて懸濁した。 更に同様に遠心操作、 懸'渴操作を 3度 行い、 ゲルの沈澱物を得た。 同様の方法によ り コ ン ト ロール 実験実験を B a / F 3 / F U L L F L A Gだけではな く B a Z F 3 Z C O Nについても行って同様のゲル沈澱物を得た。

こ のゲル沈澱物に参考例 8 に記載の方法でウ ェ ス タ ンブ c ッ ト を行った。 ゲルの沈澱物 3 0 β の S D S — P A G Eサ ンプルバッファーを加えて、 2 — M E存在下で沸騰水浴を 5 分行レヽ、 1 5 μ β を 1 つの レーンに流 して S D S — P A G E を行った。 同一サンプルが転写された P V D F メ ンブラ ンを 2組作り 、 1 組は目的の F L A G配列を有する配列表の配列 番号 3番のァ ミ ノ酸配列を有するポ リ ぺブチ ドが回収されて いる こ と を確認し、 も う 一方ではそれのチロ シン残基が リ ン 酸化されているかの判定に用いた。

この結果、 リ ン酸化が確認されたのは反応液 2 、 3 、 5 、 7及び 8であ リ 、 その リ ン酸化の程度は反応液 2 、 7 、 及び 8が強く 、 反応液 3 、 5 はそれよ り も弱く 、 視覚的にみたと こ ろ半分以下程度であった。 従って、 C— 1 細胞との共培養 と同様実施例 8で精製された リ ガン ド、 実施例 1 4 で得られ たし i g F L A G— P T N及び L i g I g — P T Nは リ セプ タ一型チロ シンキナーゼのチ口 シンキナーゼ活性を活性化さ せ、 自 己のチロ シン残基の リ ン酸化を引き起こすこ とが判明 した。 しかしながら、 培地のみではそのよ う なチロ シン残基 の リ ン酸化は見られなかった。 しかしながら、 実施例 8で精 製された リ ガン ド、 実施例 1 4で得られた L i g F L A G— P T Nは希釈された条件、 すなわち反応液 4 、 6 の条件では リ ン酸化を惹起しなかった。 一方、 L i g I g — P T Nは同 様な濃度に希釈した条件下でも十分な リ ン酸化活性を有し、 前の 2者よ り もずつ と強い活性を有していた。

さ らに、 この点に付いて詳細に解析するため、 実施例 1 4 で得られた L i g F L A G— P T Nについて、 反応液 9 (反 応液 5 に対して、 米国のコダック社製モ ノ ク ロ ーナル抗体 A n t i - F L A G M 2 を l O O g Zm l と なる よ う に添 加した反応液） 、 反応液 1 0 (反応液 6 に対して、 米国のコ ダッ ク社製モ ノ ク ロ ーナル抗体 A n t i - F L A G M 2 を I 0 0 g /m l と なるよ う に添加 した反応液） 、 そ してコ ン ト ロールと して、 反応液 1 1 (反応液 1 に対して、 米国の コ ダ ッ ク社製モ ノ ク ロ ーナル抗体 A n t i - F L A G M 2 を l O O g Zm l と なる よ う に添加 した反応液） 、 で同様 な実験を行った。

その結果、 反応液 9及び 1 0では十分に リ ン酸化がされて ぉ リ 、 反応液 2 、 7 、 及び 8 と 同等な程度の リ ン酸化活性を 有 していた。 また、 コ ン ト ロールの反応液 1 1 では リ ン酸化 は見られなかった。

従って、 実施例 8 の方法で精製された リ ガン ドは配列表の 配列番号 3 に記載のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ べプチ ドを リ ン酸化する活性を有する こ と が明 らカ こなった。 また、 実 施例 1 4で得られた L i g F L A G— P T N及び L i g I g 一 P T Nに付いても同様であった。 また、 こ の中で最も高い 活性を有している形態は L i g I g — P T Nの形態でぁ リ 、 さ らに L i g F L A G— P T Nも C末端部分を認識する抗 F L A G抗体を投与する こ と によ リ 、 同様の強い活性を示すこ とから、 2量体も しく はそれ以上の多量体構造を有してなる 形態の方が、 よ リ強い活性を有する リ ガン ドの形態と して望 ま しいこ とが明ら力 こなった。

よって、 これらの化合物は本 リ ガン ドは リ セブタ一型チロ シンキナーゼを発現している細胞に作用 して、 チロ シン残基 の リ ン酸化を促して増殖のシグナルを伝え得る化合物である こ とが示された。

実施例 1 7 リ ガン ドの生理活性

実施例 7で精製された リ ガン ド、 及び実施例 1 4で得られ た L i g F L A G— P T N及び L i g I g — P T Nを用いて その生理活性の確認を行った。

へパ リ ンを加えたさい帯血に P B S ( ― ) を等量加え、 フ イ コーノレノ ッ ク （ス ウェーデン国、 フ ァ ノレマ シ ア社製） にて さい帯血中の単核細胞を遠心分離によ リ 分離した。

こ の よ う に して分離された細胞を更に 2回 P B S (—） に て遠心分離で洗浄し最終的に細胞澳度が 5 X 1 0⁶ c e 1 1 s / m 1 に I MDM培地にて懸濁 してさい帯血単核球懸濁液 を調製した。

コ 口 ニーア ッセィ に必要な試薬は前もつて以下のよ う に調 製した。 3 %メ チルセルロ ース溶液はメ チルセルロ ース （ 日 本国、 和光純薬社製） を沸騰水にて撹拌しなが ら溶かし、 体 温程度まで冷えた後に、 前もって作製した 2倍濃度の I MD M培地を等量加え、 4 °Cにて 5 日 間程度放置して作製した。 1 0 % B S A溶液は米国の S i g m a社製 B S Aを蒸留水に 加えて、 ゆつ く リ と撹拌しながら 4 °Cにて 2 日 間放置して、 完全に溶けたら、 0 . 2 2 μ πιのメ ンブラ ンフ イ ノレター （米 国、 ミ リ ポア社製） にて濂過 して作製した。 こ の溶液につい ては使用直前に 7. 5 %重炭酸ナ ト リ ウム溶液 （米国、 G I B C O— B R L社製） を 1 0 % B S A溶液 5 m l あた リ 2 0 Ο μ β加えた。 5 6 3 7 コ ンディ シ ョ ンメ ディ ウム （ 5 6 3 7 C Μ) は ヒ ト細胞株 5 6 3 7 を米国のコ一ニング社製 Τ— 2 2 5 フラ スコを用レヽて 1 0 % ? 。 5を含む 1 ? ^1 1 1 6 4 0培地 5 0 m 1 にて、 およそ 5 日 間培養 した培養上清を 0. 2 2 μ πιのメ ンブラ ンフ イ ノレター （米国、 ミ リ ポア社製） に て濾過 し作製した。

上記のよ う にコ ロニーア ツセィ用に調製したさい帯血単核 球細胞懸濁液を 3 0 μ β 、 1 0 % B S A溶液を 3 0 0 μ β 、 1 0 mM 2—メノレカプ トエタ ノール溶液を 1 5 β 、 4 0 0 U/m l の ヒ トエ リ ス ロ ポエチン （日本国、 中外製薬社製） 溶液を 1 5 // β , これらを混ぜ合わした溶液に対して、 反応 液 1 ( I MD M培地のみ） 、 反応液 2 ( 5 6 3 7 C Mを 3 0 0 μ H ) 、 反応液 3 (実施例 7 で精製された リ ガン ドを 9 0 0 μ g ) 、 反応液 4 (実施例 1 4 で得られた L i g F L A G 一 P T Nを 9 0 0 /i g ) 、 反応液 5 (実施例 1 4 で得られた L i g l g — P T Nを 3 0 0 /i g ) 、 の各々 を加え、 最終的 な体積が 1 . 8 m 1 になる よ う に I M D M培地を加えた。

この 3者に対して上記のよ う に作製された 3 %メ チルセル ロース溶液を 1 . 2 m l 加えて、 良く 撹拌して均一に し静置 して、 気泡が抜けた後、 シ リ ンジを用いて l m l を米国のフ アルコ ン社製 3 5 m inディ ッ シュに均一になる よ う にまき、

3 7 °Cの C 0₂ イ ンキュベー タ一にて 2週間培養 した。

2週間の培養後、 1 つのディ ッ シュあた リ のコ ロ ニ一数を 倒立顕微鏡 （ 日本国、 ォリ ンパス社製） にて計測 した。 その 結果、 反応液 1 の I M DMのみではコ ロニ一形成が極めて少 なく （ 1 個及び 0個） 、 反応液 2 の 5 6 3 7 C Mではコ ロニ —の形成が多く みられ （ 5 6個及び 4 8個） 、 反応液 3 の リ ガン ドを含むディ ッ シュはその中間的な値 （ 2 8個及び 3 1 個） の数のコ ロニー形成が観察できた。

また、 別のさい帯血のサンプルを用いた実験から、 反応液 1 の I M D Mのみではコ ロ ニー形成が極め少な く （ 1 個及び 0個） 、 反応液 2の 5 6 3 7 C Mではコ ロ ニーの形成が多く みられ （ 3 5個及び 2 8個） 、 反応液 3 の リ ガン ドを含むデ イ ツシュはその中間的な値 （ 1 0個及び 1 5個） 、 反応液 4 のし i g F L A G— P T Nを含むデイ シュでは 3 と ほぼ同 じ ( 1 2個と 1 4個） 、 反応液 5の L i g I g— P T Nを含む デイ シュではそれらよ り も若干多く （ 2 0個と 2 2個） の数 のコ ロ ニー形成が観察できた。

さ らに別の実験と して別のさい帯血のサンプルにおいて、 コ ロニー形成を促すこ とが知られている ヒ トイ ンターロイ キ ン 3 ( I L— 3 ) (米国、 イ ンタージヱ ン社製） 、 ヒ ト GM 一 C S F (米国、 イ ンタ一ジェ ン社製） 、 ヒ ト S C F (米国、 イ ンタ一ジェン社製） を加えた条件に对し、 さ らにコ ロニー の形成を促すかについて調べた。 すなわち、 上記の反応液 1 、 反応液 3 、 反応液 4 に加えて、 反応液 5 (最終濃度が I L一 3力； I 0 n g 、 GM— C S F力 2 0 n g 、 S C F力 2 0 0 η g ) 、 反応液 6 (反応液 5の条件に実施例 7で精製された リ ガン ドを 5 0 0 g ) 、 反応液 7 (反応液 5の条件に実施例 1 4で得られた L i g I g — P T Nを 1 0 0 μ g ) 、 と した 各々の反応液において同様のコ 口ニーア ッセィ を行った。 その結果、 反応液 1 は 0個及び 0個、 反応液 3 は 7個及び 1 0個、 反応液 4 は 1 5個及び 1 2個、 反応液 5 は 5 5個と 6 8個、 反応液 6 は 6 3個と 7 5個、 反応液 7 は 8 0個と 8 9個であった。 また、 顕微鏡下で観察した結果、 反応液 7 の コ ロニーは他の反応液に比べて視覚的に判断したと こ ろ、 2 割から 5割程度大きかった。

これらの結果から リ ガン ドは血液未分化細胞の増殖を促し、 コ ロニー形成作用を有し、 2 量体も し く はそれ以上の多量体 を有する構造に方がよ り その活性が高いこ と が判明 した。

実施例 1 8 液体培養によ る細胞増殖作用

液体培地における血液細胞の増殖に与える該 リ ガン ドの効 果を調べるため以下の実験を行った。

増殖のァ ッセィに用いた細胞は本願で使用 した リ セプタ一 型チロ シンキナーゼを発現している臍帯血単核細胞を用いた。 該チロ シンキナーゼ発現細胞の検出及び分離は参考例 1 0に 記載した 3 8抗体にて染色 し、 米国のべク ト ンデ ッ キン ソ ン 社製フ 口一サイ ト メ 一ター F A C S V a n t a g e を用い、 添付の取扱い説明書の方法にて細胞の解析、 分離を行った。 この結果、 リ セプタ一型チロ シンキナ一ゼは骨髄単核細胞中 の約数パ一セン 卜 に発現されてお り 、 ま た この細胞は造血幹 細胞のマ一カーである C D 3 4弱陽性、 c — k i t 陽性の細 胞である。 同様に臍帯血単核細胞においてもおよそ 0 . 0 5 %程度の細胞に発現されている こ とが明 らカ こなった。 また、 骨髄並びに臍帯血単核細胞を 1 0 0 n g /m 1 ステムセルフ ア ク ター （米国、 イ ンタ一ジェン社） の存在化で 1 0 %牛胎 児血清 （日本国、 I C Nジャパン社） を含むイ ス コ フ改変ダ ルべ ッ コ培地 （米国、 G I B C O— B R L社） にて 1 X 1 0 ⁷ c e 1 1 s / 1 5 m l で培養を行う と リ セプタ一型チロ シ ンキナーゼ発現細胞が増加 し、 1 週間程度の培養で培養前に 比べて 1 0倍程度以上の該チロ シ ンキナーゼ発現細胞の割合 が高ま る。 上記の条件で 1 週間の培養後、 F A C S V a n t a e _e にて該チロ シンキナーゼを発現 している細胞を分離し た。 また、 同様に培養前の該チロ シンキナーゼ発現細胞も同 様に分離した。

このよ う に分離された細胞を詳 し く 調べるために、 サイ ト ス ピン 3 (英国、 シャ ン ドン社） にて標本を作成し、 メ イ グ リ ュ ワル ト一ギムザ染色し、 顕微鏡下で細胞を調べた。 該チ 口 シンキナーゼ発現細胞は血液細胞ア ト ラ ス （ 日本国、 文光 堂） を参考に細胞を同定したと こ ろ、 血液未分化細胞である こ とが明らかになった。

このよ う に して、 分離された細胞を該 リ ガン ド存在下、 非 存在下の条件で培養して、 細胞数の増加を調べた。 培養の条 件は上記の培地に 1 O n g / m 1 のイ ンタ一ロ イ キン 3 (米 国、 イ ンタ一ジェ ン社） 、 2 U n i t /m l のエ リ ス ロ ポェ チン （日本国、 中外製薬） を加え、 該 リ ガン ド存在区には上 記の方法で作成された L i g I g — P T Nを 5 0 0 n g /m 1 、 抗ヒ ト I g G F c ャギ抗体を 5 μ g / m 1 (米国、 オル ガノ ンテク二力社） を加え、 比較区には該 リ ガン ドの替わ リ にヒ ト血淸由来 I g G (米国、 オルガノ ンテク 二力社） を同 量加えた。 この条件で 5 日 間の培養 した。 細胞数は 2 . 4 X 1 0 ^A c e 1 1 s / 6 m 1 の条件で行った。

この結果、 該リ ガン ド存在区では細胞は 1 . 7 6 X 1 0⁵ c e 1 1 s / 6 m 1 におよそ 5倍に増加 し、 比較区では 7 .

X 1 0 ' e e l 1 s Z 6 m l で該 リ ガン ド存在区の半分に と どまった。 また、 細胞を詳 しく 調べるため、 上記同様に細 胞の標本染色を行ったと こ ろ、 前の形質を保持 していた。 こ の結果から、 本願の リ ガン ドは血液未分化細胞を増殖させる 作用を有する こ とが判明 した。

実施例 1 9 L E R K— 2 との比較

本新規リ セブタ一型チロ シンキナーゼ リ ガン ドは既知分子 である L E R K— 2 と 5 4 %のホモロ ジ一が有 り 、 該 リ ガン ドと 同様な作用を有する こ とが想像されるため、 リ セプタ一 に対する作用についての比較を行った。

L E R K— 2遺伝子の入手は以下のよ う に行った。 すなわ ち、 Beckmannらの論文 （ EMBO J , 13 , 3757-3762 , 1994 ) も しく は W0 9 4 Z 1 1 3 8 4 の明細書に記載されている遺伝子配 列を基に配列表の配列番号 2 3 ( L E R K— 2 のア ミ ノ酸を コー ドする初めのメ チォニンから 2 9ベース上流の遺伝子配 列から 2 0ベースのセ ンス鎖の配列に相当する） 及び配列番 号 2 4 ( L E R K— 2 のア ミ ノ酸配列をコー ドする部分の終 止コ ドンから上流の 2 3ベース上流の遺伝子配列から終止コ ドンま での 2 3ベースのア ンチセ ンス鎖の配列に相当する） の遺伝子配列を有するオ リ ゴヌク レオチ ドをブライマ一と し て、 ヒ ト胎盤 c D N A (米国、 C I o n t e c h社） をテ ン プレー ト と して用いて、 上記に示 した P C R法にて遺伝子ク ロ ーニ ンク を行った。

このよ う に して分離された L E R K— 2遺伝子を実施例 1 3及び参考例 8 に記載した方法と全く 同様な手法を用いて、 該 リ ガン ドと 同様に L E R K— 2 リ コ ンビナン ト タ ンパク発 現べク タ一を構築し、 遺伝子導入にょ リ 生産し、 'さ らに細胞 培養上清から参考例 9 に記載の方法にて精製した。 これらの 発現ベク ターは L E R K— 2の細胞外部分、 すなわちに上記 の Bee kmannらの論文に記載されている L E R K - 2のァ ミ ノ 酸配列の 2 3 7番目 のア ミ ノ酸までの部分のア ミ ノ 酸配列に ヒ ト I g Gの F c部分のア ミ ノ酸配列がつながった分子また は F L A G配列がつながった分子を発現させるべク ターの 2 種でぁ リ 、 この各々 の分子を L E R K— 2 I g — P T N、 及 び L E R K— 2 F L A G— P T Nとする。

まず初めに リ セプタ一型チロ シンキナーゼに対する該 リ ガ ン ドと L E R K— 2 の結合能力に関 して B I A c o r e にて 調べた。 実施例 2に記載した方法で E X I g を結合させた ンサーチップに対し、 該リ ガン ドの細胞外部分タ ンパクすな わち L i g I g — P T N及び L i g F L A G— P T N も し 、： は L E R K— 2の細胞外部分タ ンパクすなわち L E R K— 2 I g — P T N及び L E R K— 2 F L A G— P T Nを 1 から 1 O O i g /m l の澳度段階で流し、 測定 した。 また、 コ ン ト ロールと して牛血淸アルブミ ン （ B S A ) (米国、 シグマ社） を用いた。

この結果を図 9に示す。 この結果は L i g F L A G - P T N力 5 μ g / m 1 、 L E R K— 2 F L A G— P T N力 5 0 μ g /m l 、 また B S Aが 1 0 0 μ g Zm l の濃度で測定した 結果である。 こ のグラフカゝら明らかなよ う に、 L E R K— 2 は該リ セプター型チロ シンキナーゼに対し、 かな リ の高濃度 でも弱い結合を示すにと どま リ 、 それに比べ該 リ ガン ドは極 めて強く 結合する こ とが明 らかになった。 またさ らに、 異な つた濃度及び I g Gキメ ラタ ンパク を用いて測定を行い、 こ のデータを基に各々 の結合定数を求めた。 計算方法に関 して は B I A c 0 r e に附属のコ ンピュータ一ソフ ト ウエア B I A e v a 1 u a t i o n 2 . 1 及びその取扱い説明害に した がって計算 した。 その結果、 該リ ガン ドの K d値は 1 . 2 3 X 1 0—⁹Mで L E R K— 2 は 1 . 3 5 X 1 0— ⁷Mであ リ 、 該 リ ガン ドは L E R K— 2 に対しおよそ 1 0 0倍の結合能を有 する こ とが明 ら力 こなった。

次に、 該チロ シンキナーゼの リ ン酸化活性について実施例 1 6及び参考例 8 の方法を用いて調べた。 その結果を図 1 0 に示す。 各レーンのサンプルは 1 がコ ン ト ロール、 2 カ L i g I g — P T N、 1 0 0 n g / m 1 に対し米国のオルガノ ン テク二力社製抗ヒ ト I g G F c ャギ抗体を 1 μ g Zm l 、 3 力 i g I g _ P T N、 1 μ g / m 1 に対し米国のオルガノ ンテク ニ力社製抗ヒ ト I g G F c ャギ抗体を 1 O ju g /m 1 , 4 力； L E R K — 2 I g — P T N 、 1 O O n g / m l に対し米 国のオルガノ ンテク 二力社製抗ヒ ト I g G F c ャギ抗体を 1 μ g / m 1 , 5 が L E R K - 2 I g — P T N、 1 μ g / m \ に対し米国のオルガノ ンテク二力社製抗ヒ ト I g G F c ャギ 1 4 1

抗体を I 0 ju g /m l 、 各々加えて、 実施例 1 6 に示 した反 応液で反応させて行ったものである。 図 1 0の Aは抗 リ ン酸 化チロ シンモ ノ ク ロ ーナル抗体 （米国、 U B I 社） で、 Bは 抗 F L A GM 2モ ノ ク ローナル抗体 （米国、 K o d a k社） で各々染色し、 参考例 8の条件で X線フ ィ ルムに焼き付けた。 また、 分子量からブロ ッ ト されている該チロ シ ンキナーゼを 矢印で示した。

この結果から明 らかなよ う に レー ン 4及び 5 の L E R K— 2は極めて弱いなが ら該チ口 シンキナーゼの リ ン酸化を引き 起こすが、 それはレーン 2及び 3の該リ ガン ドょ リ もはる力 に弱く また高澳度の条件下、 すなわち レーン 5の 1 μ g /m 1 においてもその作用が高ま らないこ と から量の問題ではな く その作用自身が極めて弱いこ と は明 らかである。

従って、 以上の結果から L E R K— 2 は本願の リ セブタ— 型チロ シンキナーゼ リ ガン ドが有する物理化学的性質を持た ないこ とから、 本願に示すよ う な生理作用はないと結論づけ られた。

表

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1 o I1RC-5 k TP ¾f ftfc UFU+10%FCS ATCC (CCl 171)

Λ A Raj i ヒ 卜 ノ ーキッ 卜 リ ンノ flS RPUI +10 FCS ATCC (CCL86)

1 x U937 ヒ 卜骨 fl£性白血病 RPU1+10%FCS ATCC(、CRL1593)

X u MKN-74 ヒ ト II疮（赛分ィヒ沏 状〉 RPUI + 10XFCS 免疫生物研究所

1 1 KN-28 ト胃癌（高分化型管状） RPU1+10%FCS 免疫生物研究所

R o UKN-1 ヒ ト宵^ (僞平上皮痛） Rpui - o%FCS 岩并ィヒ学

Ί Q A431 ヒ ト想表皮膽 Rpui + i

ΑΤΓΓ iCRI 1555)

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2 2 HeLa-OHIO ヒ ト十 gffi部 ft KrM 1 + 1U ト tS 大 H不 ΪΪ楽

2 3 COLO - 205 ヒ ト大腸癌（アデ ルシ/-マ） RPMI+10 FCS ATCC(CCL222)

2 4 H - 1 ヒ ト胆管 « RPyi+10%FCS 免疫生物研究所

2 5 BT-20 ヒ ト乳 ft Pyi+10%FCS ATCC(HTB19)

2 6 PC-14 ヒ ト肺癌 RPIII + 10XFCS 理化学研究所（RCB0446)

2 7 PC- 9 ヒ 卜肺癌（分化型腺癌） RPMI+10%FCS 免疫生物研究所

2 8 KB ヒ ト鼻咽頭癌 RPU1+10%FCS ATCC(CCLH)

2 9 T-24 ヒ ト膀胱癌 RPMI+10 FCS ATCC(HTB4)

表 2

リガンド結合活性（RU

細胞名 刺敏 Exlg-PTN EXFLAG-PTN _浚縮倍率

5637 96 45 57

PMA 117 x43 SEKI 196 112 xll8

PMA 153 xl28 UT-7 67 xl33

PMA 67 xl30 567 97 xl38

PMA 161 100 xl38 THP-1 143 132 x63

PMA 142 x65 Daudi 64 x65

PMA 110 x56 Jurkat 108 xll3

PMA 93 xl88 CCRF-CEM 151 86 xlll

PMA 107 xlll KG-la 90 xll3

PMA 83 33 x94 HL-60 25 x89

PMA 32 x80 Hep3B 63 x59

PMA 48 x48 KATOm 158 116 x52

PMA 167 x55 MRC-5 26 x77

PMA 45 x59 TNF 62 x49 aji 32 x67

PMA 20 x94 U937 124 73 xl36

PMA 135 xl68 MKN-74 12 xl02

PMA 37 x83 TNF 90 x97

MKN-28 36 x64

PMA 80 x69 TNF 83 x73

(統く） 表 2 (統き）

リガンド結合活性（RU)

No. 細胞名 刺散 Exlg-PTN EXFLAG-PT 箱倍率

18 M -1 ' 61 x9l

PMA 80 xlOO TNF 63 xl03

19 A431 44 x50

PMA 74 x54 TNF 139 86 x65

20 C-1 160 60 x65

PMA 385 154 x89 TNF 227 87 x78

21 Hcla 94 x83

PMA 77 x81 TNF 117 x81

22 Hela-OHIO 81 xl24

PMA 100 xl43 23 COLO-205 180 75 x58

PMA 160 92 x60 TNF 192 x81

24 H-l 163 77 x92

PMA 194 111 x94 TNF 146 77 ス 100

25 BT-20 x78

PMA 15 x91 TNF 13 x83

26 PC- 14 86 x79

PMA 72 x70 TNF 89 x72

27 PC-9 35 x83

PMA 41 xlOO TNF 61 x91

28 KB 94 x73

PMA 225 328 x84

29 T24 76 x75

PMA 33 x89 TNF 88 x61 4 5

表 3

サンブル リガンド桔合活性 （RU) 精製前画分 134 カラム素通り画分 30

洗诤画分 4 溶出面分 (5分の 1希釈）

fraction No.

1 -8

2 -8

3 25

4 258

5 230

6 42

7 9

8 2

産業上の利用可能性

血液未分化細胞の分化及び増殖に関与する特定の リ セプタ 一型チロ シンキナーゼの細胞外部分に結合して、 その細胞内 部分のチロ シンキナーゼ酵素活性を賦活化し、 該チロ シンキ ナーゼの リ ン酸化を引き起こす本発明の リ ガン ド及び該 リ ガ ン ドを含む複合体は血液未分化細胞の分化及び増殖を促進す る作用を有する こ とから、 白血病や骨髄移植など、 増血幹細 胞を含む血液未分化細胞に関連する問題の研究や治療に有用 に用いる こ とができ る。

配列表

配列番号 1

配列の長さ ： 5 2 2

配列の型 ： アミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： タンパク質

起源

生物名 ： ヒ ト

配列

Leu Gl u Glu Th【 Leu Leu Asn Th r Lys Leu Glu Thr Ala As p Leu Lys

1 5 10 15

Trp Ya 1 Thi Phe Pro Gin Va 1 Asp Gly GID Tip Glu Glu Leu Ser G

20 25 30

Leu Asp Glu Glu Gin His Ser Va 1 Arg Thr Tyr Glu Va 1 Cys Asp Va 1

35 40 45

Gin Arg Ala Pro Gly Gin Ala His Trp Leu Arg Thr Gly Ttp Val Pro

50 55 60

Arg Arg Gけ Ala Val His Val Tyr Ala Thr Leu Arg Phe Thr Met Leu 65 70 75 80

Glu Cys Leu Ser Leu Pro Arg Ala Gl Arg Sei Cys Lys Glu Thr Phe

85 90 95

Th r Val Pbe Tyr Tyr Glu Ser Asp Ala Asp Thr Ala Thr Ala Leu Thr

100 105 110

Pro Ala Trp Met Glu Asn Pro Tyr l ie Lys Val Asp Thr Val Ala Ala

115 120 125

Glu His Leu Tht Arg Lys Arg Pro Gly Ala Glu Ala Thr Gly Lys Va 1

130 135 NO

Asn Va I Lys Thr Leu Arg Leu CI y Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Ty r 145 150 155 160 Leu Ala Phe Gin Asp Gin Gl y Ala Cys Met Ala Leu Leu Se r Leu His

165 170 175

Leu Phe T" Lys Lys Cys Ala Glo Leu Thr Va 1 Asn Leu Thr Arg Phe

180 185 190

Pro Glu Thr Va 1 Pro Aig Glu Leu Va 1 Va 1 Pro Va 1 Ala Gけ Ser Cys

195 200 205

Va 1 Va I Asp Ala Va 1 Pro Ala Pro Gly P【o Ser Pro Ser Leu Ty【 Cys

210 215 220

Arg Glu Asp Gly Gin Trp Ala Glu Gin Pro Va 1 Thr Gly Cys Ser Cys 225 230 235 240

Ala Pro Gly Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys

245 250 255

Ala Glo Gly Thr Phe Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys Gin Pro

260 265 270

Cys Pro Ala Aso Ser His Ser Asn Thr l ie Gl Ser Ala Va 1 Cys Gin

275 280 285

Cys Arg Va 1 Gl Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg Gl Ala Pro

290 295 300

Cys Tb【 Th【 Pro Pro Ser Ala Pro Arg Sei Va 1 Va 1 Ser Arg Leu Asn 305 310 315 320

Gl y Ser Ser Leu His Leu Glu Tip Ser Ala Pro Leu Glu Ser Gly Gly

325 330 335

Arg Glu Asp Leu Th r Tyr Ala Leu Arg Cys Ar Glu Cys Ar Pro Gly

340 345 350

Gl Ser Cys Ala Pro Cys Gly Gl Asp Leu Th r Phe Asp Pro Gly Pro

355 360 365

Ai g Asp Leu Va 1 Glu Pro Trp Va 1 Va 1 Va I Arg Gly Leu Arg Pro Asp

370 375 380

Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Va 1 Thr Ala Leu Asn Gl Va I Ser Ser Leu 385 390 395 400

Ala Thr Gly Pro Va I Pro Phe Gl u Pro Va 1 Asn Va 1 Th r Tbr Asp Ar g

405 410 415

Gl u Va 1 Pro Pro Ala Va I Se r Asp I 1 e Arg Va 1 Tbr Ar g Se r Ser Pro

420 425 430

Ser S e r Leu Ser u Ala T r p Ala Va 1 Pro Arg A I a Pro Ser Gly Ala

435 440 445

Va 1 Leu Asp Tyr Gl u Va 1 Lys Tyr His Gl u Lys Gly Ala Gl u Gl Pro

450 455 460

Ser Ser Va 1 Arg Phe Leu Lys Thr Ser Glu Asn Arg Ala Glu Leu Arg 465 470 475 480

Gl Leu Lys Arg Gly Ala Ser Tyr Leu Va 1 Gin Va 1 Arg Ala Arg Ser

485 490 495

Glu Ala Gly Tyr Gl Pro Phe Gly Gin Glu His His Ser Gin Thi Gin

500 505 510

Leu Asp Glu Ser Glu Gly Tr p Arg Glu Gin

515 520 配列番号 2

配列の長さ ： 9 7 2

配列の型 ： アミ ノ酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： ア ミ ノ酸

起源

生物名 ： ヒ ト

配列

Leu Glu Glu Thr Leu Leu Asn Tb i Lys Leu Glu Th r A 1 a As p Leu Lys Tr p Va 1 Thr Phe Pro Gin Va 1 Asp Gl y Gin Trp Glu Glu Leu Ser Gl y

20 25 30

Leu Asp Glu Glu Gin His Ser Va 1 Arg Thr Tyr Glu Va 1 Cys Asp Va I

35 40 45

Gin Arg Ala Pro Gけ Gin Ala His Trp Leu Arg Thr Gl Trp Va 1 Pro

50 55 60

Arg Arg Gly Ala Va 1 His Ya 1 T t Ala Thr Leu Arg Phe Thr Met Leu 65 70 75 80

Glu Cys Leu Ser Leu Pro Arg Ala Gly Arg Ser Cys Lys Glu Thr Phe

85 90 95

Thr Va I Phe Tyr Tyr Glu Ser Asp Ala Asp Thr Ala Thr Ala Leu Thr

100 105 110

Pro Ala Trp Met Glu Asn Pro Tyr lie Lys Va 1 Asp Thr Va 1 Ala Ala

115 120 125

Glu His Leu Th【 A【g Lys Arg Pro Gl Ala Glu Ala Thr G Lys Va 1

130 135 140

Asn Va 1 Lys Th r Leu Arg Leu Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr 145 150 155 160

Leu Ala Phe Gin Asp Gin Gly Ala Cys Met Ala Leu Leu Ser Leu His

165 170 175

Leu Phe Tyr L Lys Cys Ala Gin Leu Thr Va 1 Asn Leu Thr Arg Pbe

180 185 190

Pro Glu Thr Va 1 Pro Arg Glu Leu Va I Va 1 Pro Va 1 Ala Gly Ser Cys

195 200 205

Va I Va 1 Asp Ala Va 1 Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser Leu Tyr Cys

210 215 220

Arg Glu Asp Gl Gin Trp Ala Glu Gin Pro Va 1 Thr Gly Cys Ser Cys 225 230 235 240

Ala Pro C I y Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys 08C S 0 S9^

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725 730 735

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740 745 750

Asn Ser Ser As p Pro Thr Tyr Th r Ser Ser Leu Gl Gけ Lys l ie Pro

755 760 765

l i e Arg Trp Th r Ala Pro Glu Ala l ie Al a Phe Arg Lys Phe Thr Ser

770 775 780

Ala Ser Asp Ala Trp Ser T" G l ie Va 1 Met Trp Glu Va 1 Met Ser 785 790 795 800

Pbe Gl Glu Arg Pro Tyi Trp Asp Met Ser Asn Gin Asp Va I l ie Asn

805 810 815

Ala I 1 « Glu Gin Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Pro Asp Cys Pro Thr

820 825 830

Se I Leu His Gin Leu Met Leu Asp Cys Trp Gin Lys Asp Arg Asn Ala

835 840 845

Arg Pro Arg Phe Pro Gin Va 1 Va 1 Ser Ala Leu Asp Lys Met l ie Arg

850 855 860

Asn Pro Ala Ser Leu Lys l ie Va 1 Ala Arg Glu Asn Gl Gl y Ala Ser 865 870 875 880

Hi s Pro Leu Leu As Gin Arg Gin Pro Hi s T r Ser Ala Phe Gl y Ser

885 890 895

Va 1 CI y Glu Trp Leu Arg Ala I 1 e Lys Met Gl Arg Tyr Glu Glu Ser

900 905 910

Phe Al a Ala Ala Gけ Phe Gl Ser Phe Glu Leu Va 1 Ser Gin l ie Ser

915 920 925

Ala Glu Asp Leu Leu Arg l ie G 1 Va 1 Thr Leu Ala Gl y His Gin Lys 930 935 940 54

Lys l ie Leu Ala Se r Va 1 Gin His Met Lys Se r Gin Ala Lys Pi Gly

945 950 955 960

Thr Pro Gly G Thr Gけ G Pro Ala Pro Gin Tyr

965 970 配列番号 3

配列の長さ ： 4 2 9 0及び 9 8 7

配列の型 ： 核酸及びァ ミ ノ酸

鎖の数 ： 二本鎖及び一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： c D NA to m R N A、 及びアミ ノ酸

起源

生物名 ： ヒ 卜

ただし遗伝子配列の Xは遣伝子配列が未決定。

配列

GCGCTGGCG GGGAGGGAAC ACAGGTCAGT GTGGCGACAG GGGTCACGGT 49 GGACACGGGG GTGGGCTGTC TCAGGGGGGG ACACCGCGAG CGGCCGGCTC ACCCCCCGCC 109 ACCCGGGGCG GGACCCCGAG GCCCCGGAGG GACCCCAACT CCACCCACGT CTTGCTGCGC 169 GCCCGCCCGG CGCGGCCACT GCCAGCACGC TCCGGGCCCG CCGCCCGCGC GCGCGCACAG 229 ACGCGGGGCC ACACTTGGCG CCGCCGCCCG GTGCCCCGCA CGCTCGCATC GGCCCGCGCT 289 GAGCGCCCGA CGAGGAGTCC CGCGCGGAGT ATCGGCGTCC ACCCGCCCAG GGAGAGTCAG 349 ACCTXXXXXG GCGAGGCCCC CCCAAACTCA GTTCGGATCC TACCCGAGTG AGGCGGCGCC 409 ATG GAG CTC CGG GTG CTG CTC TGC TGG GCT TCG TTG GCC GCA GCT TTC 457 Met Gl u Leu Arg Va 1 Leu Leu Cys Trp Ala Ser Leu Ala Ala Ala Leu -15 -10 -5 -1 1

GAA GAG ACC CTG CTG AAC ACA AAA TTG GAA ACT GCT GAT CTG AAG TGC 505 Glu G I u Thr Leu Leu Asn Th r Lys Leu Glu Thr Ala Asp Leu Lys Tr

5 10 15

GTG ACA TTC CCT CAG GTG GAC GGG CAG TGG GAG GAA CTC AGC GGC CTG 553 . 56

TTC TAC AAA AAG TGC GCC CAG CTG ACT CTG AAC CTG ACT CGA TTC CCG 1033 Phe Tyr L ys Lys Cys Ala Gin Leu Tin Va 1 Asn Leu Thr Arg Phe Pro

180 185 190

GAG ACT GTG CCT CGG GAG CTG GTT GTG CCC CTG GCC CGT AGC TGC GTG 1081

Glu Thr Va 1 Pro Arg Glu Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys Val

195 200 205

GTG GAT GCC GTC CCC GCC CCT GGC CCC AGC CCC AGC CTC TAC TGC CGT 1129 Va 1 Asp Ala Va 1 Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pio Ser Leu Tyr Cys Arg 210 215 220 225

GAG GAT GGC CAG TGC GCC GAA CAG CCG GTC ACG GGC TGC ACC TGT GCT 1177

Glu Asp Gけ Gin Trp Ala Glu Gin Pio Val Th【 G Cys Ser Cys Ala

230 235 240

CCG GGG TTC GAG GCA CCT GAG GGG AAC ACC AAG TGC CGA GCC TGT GCC 1225 Pro Gl Phe Glu Ala Ala Glu C 1 Asn Thr Lys Cys Arg Ala Crs Ala

245 250 255

CAG GGC ACC TTC AAG CCC CTG TCA GGA GAA GGG TCC TGC CAG CCA TGC 1273 Gin Gly Thr Phe Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys Gin Pro Cys

260 265 270

CCA CCC AAT AGC CAC TCT AAC ACC ATT GGA TCA GCC GTC TGC CAC TCC 1321 Pro Ala Aso Ser His Ser As Q Thr l ie Gly Ser Ala Val Cys C i D Cys

275 280 285

CGC GTC GGG TAC TTC CGG GCA CGC ACA GAC CCC CGG GGT CCA CCC TGC 1369 A【 g Va 1 Gly Tyr Phe Arg A 1 a Ac g Thr Asp Pro Ai g Gl Ma Pro Cys 290 295 300 305

ACA ACC CCT CCT TCG GCT CCG CGG AGC GTG GTT TCG CGC CTG AAC GGC

Thr Thr Pro Pro Se I Ala Pro Arg Ser Val Val Ser Arg Leu Aso Gly

310 315 320

TCC TCC CTC CAC CTC GAA TGG ACT GCC CCC CTG GAG TCT GCT GGC CGA 1465

Se r Se【 Leu H i s Leu Glu Trp Ser Ala Pro Leu Glu Ser Gly Gly Arg SKI OVO 丄:)丄 33；) 030 003 V10 9V3 010 91D ：) VI 33V DDO VOO OOD OVV 013 o S 0

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GCC CGC TAC GGG CCC TTC GGC CAG GAA CAT CAC AGC CAG ACC CAA CTG 1993

Ala Gl Tyr Gly Pro Phe Gly Gin Glu His His Ser Gin Thr Gin Leu

500 505 510

GAT GAG AGC GAG GCC TGG CGG GAG CAC CTG GCC CTG ATT GCG GGC ACG 2041

As p G 1 u S e r Glu Gl Trp Arg Glu Gin Leu A 1 a Leu l ie Ala Gl Thr

515 520 525

GCA GTC GTG CGT GTG GTC CTG GTC CTG GTG GTC ATT GTG GTC GCA GTT 2089 Ala Va 1 Va 1 Gly Va 1 Val Leu Val Leu Val Va 1 l ie Val Val Ala Va 1 530 535 540 545

CTC TGC CTC AGG AAG CAG AGC AAT GGG AGA GAA GCA GAA TAT TCG GAC 2137

Leu C y s Leu Ar Lys Gin Ser As n Gly Arg Glu Ala Glu Tyr Ser Asp

550 555 560

AAA CAC GGA CAG TAT CTC ATC GGA CAT GGT ACT AAG GTC TAC ATC GAC 2185 Lys His Gl Gin T t Leu lie Gly His Gl Thi Lys Val Tyr l ie Asp

565 570 575

CCC TTC ACT TAT GAA GAC CCT AAT GAG GCT GTG AGG GAA TTT GCA AAA 2233 Pro Phe Thr T" Glu A p Pro A a Glu Ala Val Arg Glu Phe Ala Lys

580 585 590

GAG ATC GAT GTC TCC TAC GTC AAG ATT GAA GAG GTG ATT GGT GCA GCT 2281 Gl u l ie Asp Va 1 Ser Tyr Val Lys l ie Glu Glu Val l ie Gl Ala Gl

595 600 605

GAG TTT GGC GAG GTC TGT CGG GGG CGG CTC AAG GCC CCA GGG AAG AAG 2329 Gl u Phe Gly Glu Val Cys Arg Gly Arg Leu Lys A I a Pro Gly Lys Lys 610 615 620 625

GAG AGC TGT GTG GCA ATC AAG ACC CTG AAG GCT GGC TAC ACG GAG CGC 2377 Gl u Se r Cys Va 1 Ala l ie Lys Thr Leu Lys Gl Gl Tyr Thr Glu Arg

630 635 640 】3S 1Ή iio i i »n \n ³i ] ^10 ^JU ¹⁹S d】丄 eiv dsy 135

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6 9 1

Z0/S6df/XDiI ζτειτ/96θΛλ 790 795 800

GGG GAG AGG CCG TAC TGG GAC ATG AGC AAT CAC GAC GTG ATC AAT CCC 2905 GI Glu Aig Pro Tyi Trp Asp Met Se r ASD Gin Asp Va 1 lie Asn Ala

805 810 815

ATT GAA CAG GAC TAC CGG CTG CCC CCG CCC CCA GAC TGT CCC ACC TCC 2953 I 1 e Glu Gin Asp Tyi K:g Leu Pro P o Pro Pro Asp Cys P [ o Tbi Set

820 825 830

CTC CAC CAG CTC ATG CTG GAC TGT TGG CAG AAA GAC CGG AAT GCC CGG 3001 Leu His Gin Leu Met Leu Asp Cys Trp Gin Lys Asp Arg Asn Ala Arg

835 840 845

CCC CCC TTC CCC CAG GTG GTC AGC GCC CTG GAC AAG ATG ATC CGG AAC 3049 Pro Arg Phe Pro Gin Val Va 1 Ser Ala Leu Asp Lys Met l ie Arg Asn 850 855 860 865

CCC GCC AGC CTC AAA ATC GTG GCC CGG GAG AAT GCC GGG GCC TCA CAC 3097 Pro Ala S e i Leu Lys l ie Val Ala Arg Glu Asn Gly Gl y Ala Ser His

870 875 880

CCT CTC CTG GAC CAG CGG CAG CCT CAC TAC TCA CCT TTT GGC TCT GTG 3145 Pro Leu Leu Asp Gin Arg Gin Pro His Tyr Ser Ala Phe G I y Ser Val

885 890 895

GGC CAC TGG CTT CGG GCC ATC AAA ATC GGA AGA TAC GAA GAA ACT TTC 3193 Gl Glu Trp Leu Arg Ala l ie Lys Me t Gly Arg Tyr Glu Glu Se Phe

900 905 910

GCA GCC GCT GGC TTT GGC TCC TTC GAG CTG GTC AGC CAG ATC TCT GCT 3241 A 1 a Ala Ala Gly Phe Gly Ser Phe Glu Leu Va 1 Ser Gin l ie Ser Ala

915 920 925

GAG GAC CTG CTC CGA ATC GGA GTC ACT CTG GCG GGA CAC CAG AAG AAA 3289 Glu Asp Leu Leu Arg l ie Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gin Lys Lys 930 935 940 945

ATC TTG GCC ACT GTC CAG CAC ATG AAC TCC CAG GCC AAC CCG GGA ACC 3337 1 6 1

I 1 e Leu Ala Se r Va 1 Gin His Met Lys Se r Gin Ala Lys Pro Gly Th r

950 955 960

CCG GGT GGG ACA GGA GGA CCC CCC CCG CAG TAC 3370 Pro Gly G 1 y Th r Gly Gly Pro Ala Pro Gin Ty r

965 970

TGACCTGCAG CAACTCCCCA CCCCAGCCAC ACCGCCTCCC CATTTTCCGG GGCAGAGTGG 3430

GGACTCACAG AGGCCCCCAG CCCTGTGCCC CGCTGCATTG CACTTTGAGC CCGTGGGGTG 3490

AGGAGTTGGC AATTTGGAGA GACAGGATTT GGGGGGTTCT CCCATAATAG GAGGGGAAAA 3550

TCACCCCCCC AGCCACCTCG GGGAACTCCA GACCAAGGCT GAGGGCGCCT TTCCCTCAGG 3610

ACTGGGTGTG ACCAGAGGAA AAGGAAGTGC CCAACATCTC CCAGCCTCCC CCAGGTGCCC 3670

CCCCTCACCT TGATGCGTGC GTTCCCGCAG ACCAAAGAGA CTGTGACTCC CTTGCCAGCT 3730

CCAGAGTGGG GGGGCTGTCC CAGGGCGCAA GAAGGGGTGT CAGGGCCCAG TGACAAAATC 3790

ATTGGGGTTT GTAGTCCCAA CTTGCTGCTG TCACCACCAA ACTCAATCAT TTTTTTCCCT 3850

TGTAAATCCC CCTCCCCCAG CTCCTGCCTT CATATTGAAG GTTTTTGAGT TTTGTTTTTG 3910

GTCTTAATTT TTCTCCCCGT TCCCTTTTTG TTTCTTCGTT TTGTTTTTCT ACCGTCCTTG 3970

TCATAACTTT GTCTTGGAGG GAACCTGTTT CACTATGGCC TCCTTTGCCC AAGTTGAAAC 4030

AGGGGCCCAT CATCATGTCT GTTTCCAGAA CAGTGCCTTG GTCATCCCAC ATCCCCGGAC 4090

CCCGCCTGGG ACCCCCAAGC TGTGTCCTAT GAAGGGGTGT GGGGTGAGGT AGTGAAAAGG 4150

GCGGTAGTTG GTGGTGGAAC CCAGAAACGG ACCCCGGTGC TTGGAGGGGT TCTTAAATTA 4210

TATTTAAAAA AGTAACTTTT TGTATAAATA AAAGAAAATG GGACGTGTCC CAGCTCCAGG 4270

GGTGAAAAAA AAAAAAAAAA 4290 配列番号 4

配列の長さ ： 8

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： タンパク質

起源

生物名 ： ヒ 卜 配列 ： Lys Ser l ie Va 1 Leu Glu Pro l ie

配列番号 5

配列の長さ ： 1 9 5

配列の型 ： アミ ノ酸

鎖の数 ： 一本鑛

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： ア ミ ノ酸

起源

生物名 ： ヒ ト

配列

Lys Ser l ie Va 1 Leu Glu Pro l ie Tyt Trp Asn Ser Ser Asn Ser Lys

1 5 10 15

Pbe Leu Pro Gl Gin Gly Leu Va 1 Leu Tyr Pro Gin l ie CI y Asp Lys

20 25 30

Lea Asp l ie l ie Cys Pro Lys Va 1 Asp Ser l y % Thr Va 1 Gly Gin Tyr

35 40 45

Glu Tyr Tyr Lys Va I Tyr Met Va 1 Asp Lys Asp Gin Ala Asp Arg Cys

50 55 60

Thr l ie Lys Lys Glu Asn Th t Pro Leu Leu Asn Cys Ala Lys Pro As 65 70 75 80

Gin Asp l ie Lys Pbe Thr I 1 e Lys Phe Gin Glu Phe Ser Pro Asn Leu

85 90 95

Trp Gly Leu Glu Pbe Gin Lys Asn Lys Asp T" Tyr l ie l ie Ser Thr

100 105 110

Ser Asn Gly Ser Leu Glu Gly Leu Asp Asn Gin Glu Gly Gl y Va 1 Cys

115 120 125

Gin Thr ^ ^ l Ala Met Lys l ie Leu Met Lys Va 1 Gly Gin Asp Ala Ser 130 135 140 1

Ser Ala Gly Sei Th r Arg Asn Lys Asp Pro Thi Ai g Ar g Pro G I u Leu 145 150 155 160

Gl u Ala Gly Thr Asn Gly Arg Ser Ser Thr Thr Ser Pro Phe Val Lys

165 170 175

Pro Asn Pro Gly Ser Ser Tbr Asp G 1 Asn Ser Ala Gl His Ser Gly

180 185 190

Asn Asn I 1 e

195 配列番号 6

配列の長さ ： 3 0 8

配列の型 ： アミ ノ酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： アミ ノ酸

起源

生物名 ： ヒ ト

配列

Lys Ser lie Val Leu C 1 u Pro lie Ty r Tr p Asn Ser Ser Asn Ser Lys

1 5 10 15

Phe Leu Pro G Gin Gl Leu Val Leu Tyr Pro Gin lie CI Asp Lys

20 25 30

Leu Asp l ie i 1 e Cys Pro Lys Val Asp Ser Lys Thr Val Gly Gin Tyr

35 40 45

Gl u Tyr Tyr Lys Val Tyr Met Val Asp Lys Asp Gin Ala Asp Arg Cys

50 55 60

Th r l ie Lys Lys G I u Asn Th r Pro Leu Leu Asn Cys A I a Lys Pro Asp 65 70 75 80

Gin Asp l ie Lys Phe Thr lie Lys Phe Gin Glu Phe Ser Pro Asn Leu soc

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S6 06 98

69020/S6dT/X3d ΓΙΙΪΙ/96 ΟΛΑ 1 6 5 配列番号 7

配列の長さ ： 1 0 5 1及び 3 3 3

配列の型 ： 核酸及びァミ ノ酸

鎖の数 ： 二本鎖及び一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： c D NA to m R NA、 及びアミ ノ酸

起源

生物名 ： ヒ 卜

配列

GGAGTGCGCG GAGCTGGGAG TGGCTTCGCC 30

ATG GCT GTG AGA AGG GAC TCC GTG TGG AAG TAC TGC TGG GGT GTT TTG 78

Met Ala Va 1 Arg Arg Asp Set Val Trp Lys Ty【 C" Trp G Va 1 Leu

-25 -20 -15 -10

ATG GTT TTA TGC AGA ACT GCG ATT TCC AAA TCG ATA GTT TTA GAG CCT 126

Met Val Leu Cys Arg Thr Ala l ie Se r Lys Ser l ie Val Leu Glu Pro

- 5 -1 1 5

ATC TAT TGG AAT TCC TCG AAC TCC AAA TTT CTA CCT GGA CAA GGA CTG 174 lie T" Trp Asn Ser Ser Asn Se【 L" Phe Leu Pro Gl Gin G 1 y Leu

10 15 20

GTA CTA TAC CCA CAG ATA GGA GAC AAA TTG GAT ATT ATT TGC CCC AAA 222

Val Leu Tyr Pro Gin l ie Gl y Asp Lys Leu Asp l ie l ie Cys Pro Lys

25 30 35

GTG GAC TCT AAA ACT GTT GGC CAG TAT GAA TAT TAT AAA GTT TAT ATC 270

Va 1 Asp Ser Lys Thr Val Gl y Gin Tyr Glu Tyr Tyr Lys Val Tyr Met

40 45 50 55

GTT GAT AAA GAC CAA GCA GAC AGA TGC ACT ATT AAG AAC CAA AAT ACC 318

Val Asp Lys As Gin A 1 a Asp Arg Cys Thr l ie Lys Lys Glu Asn Thr 1 6 6

60 65 70

CCT CTC CTC AAC TCT GCC AAA CCA GAC CAA GAT ATC AAA TTC ACC ATC 366 Pro Leu Leu Asn Cys Ala Lys Pro Asp Gin Asp l ie Lys Phe Thr l ie

75 80 85

AAG TTT CAA GAA TTC AGC CCT AAC CTC TGG GGT CTA GAA TTT CAG AAG 414 Lys Phe Gin Gl u Phe Ser Pro As。 Leu Tip G Leu Gl u Phe Gin Lys

90 95 100

AAC AAA GAT TAT TAC ATT ATA TCT ACA TCA AAT GGG TCT TTG GAG GGC 462 Asn Lys Asp Tyr Tyr l ie l ie Ser Tbr Set Asn Gly Ser Leu Glu Gl

105 110 115

CTG GAT AAC CAG GAG GCA GGG CTG TGC CAG ACA AGA GCC ATG AAG ATC 510 Leu As p Asn Gin Glu Gl Gけ Va 1 Cys Gin Tin Arg Ala Met Lys l ie 120 125 130 135

CTC ATG AAA GTT GGA CAA GAT GCA ACT TCT GCT GGA TCA ACC AGG AAT 558 Leu Met Lys Va 1 Gl GID Asp Ala Ser Se【 Ala G I Ser Tin Arg ASD

140 145 150

AAA GAT CCA ACA AGA CGT CCA GAA CTA GAA GCT GGT ACA AAT GGA AGA 606 Lys Asp Pro Thr Arg A Pro Glu Leu Glu Ala Gly Tbr Asn Gl Arg

155 160 165

ACT TCG ACA ACA ACT CCC TTT GTA AAA CCA AAT CCA GGT TCT AGC ACA 654 Ser Ser Thr Thr Ser Pro Phe Va 1 Lys Pro Asn Pro Gl y Ser Ser Thr

170 175 180

GAC GGC AAC ACC GCC GGA CAT TCG GGG AAC AAC ATC CTC GGT TCC GAA 702 Asp Gly Asn Ser Ala Gly His Ser G I y Asn Asn l ie Leu Gl Ser Glu

185 190 195

GTG GCC TTA TTT GCA GGG ATT GCT TCA GGA TGC ATC ATC TTC ATC GTC 750 Va 1 Ala Leu Phe Ala Gly l ie Ala Ser Gly Cys l ie l ie Phe l ie Va 1 200 205 210 215

ATC ATC ATC ACG CTG GTG GTC CTC TTG CTG AAG TAC CGG AGC AGA CAC 798 1 6 7

lie l ie l ie Th r Leu Va 1 Va 1 Leu Leu Leu Lys Ty r Ar g Ar g A【g His

220 225 230

AGG AAG CAC TCG CCG CAG CAC ACG ACC ACG CTG TCC CTC AGC ACA CTG 846 Ar g Lys His Ser Pro Gin His Th【 Tin Th r Leu Se r Leu Se r Thr Leu

235 240 245

GCC ACA CCC AAG CGC AGC GGC AAC AAC AAC GGC TCA GAG CCC ACT GAC 894 Ala Thr Pro Lys Arg Ser Gl y Asn Aso Asn G I y Ser Glu Pro Ser As p

250 255 260

ATT ATC ATC CCC CTA AGG ACT GCG GAC AGC GTC TTC TGC CCT CAC TAC 942 lie l ie lie Pro Leu Arg Thi Ala Asp Ser Va I Phe Cys Pro His T"

265 270 275

GAG AAG GTC AGC GGG GAC TAC GGG CAC CCG GTG TAC ATC GTC CAG GAG 990 Glu Lys Val Set Gl y Asp Tyi Gl His Pro Va 1 Tyr l ie Va I C I D Glu 280 285 290 295

ATG CCC CCG CAG AGC CCG GCG AAC ATT TAC TAC AAC CTC 1029 Met Pro Pro Gin Ser Pro Ala Asn l ie Ty r Tyr Lys Val

300 305

TGAGAGGGAC CCTCGTGGTA CC 1051 配列番号 8

配列の長さ ： 2 7

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

卜ポロジ一 ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5' -TTGTCGACAC (AC) G (AG) GA (CT) (CT) T (CC) GC (ACGT) GC (ACGT) (AC)G - 3' 配列番号 9 6 8

配列の長さ ： 2 4

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鑛

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5'- TGGAATTCCA(AT) A(AG) (CG) (AT) CCA (CG) AC (AG) TC-3 ' 配列番号 1 0

配列の長さ ： 2 6

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直缀状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配歹 IJ ： 5'-AACTCGAGATCTCTGCTGAGGACCTG-3' 配列番号 1 1

配列の長さ ： 2 8

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎮

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配歹 IJ ： 5' -AAGAATTCTCAGTACTCCCGGGCCCGTC-3' 配列番号 1 2

SS列の長さ ： 5

配列の型 ： 核酸 1 6 9

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配歹 IJ ： 5' -GGGAATTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCGTACTGCGGGGCCGGTCCTCCTGT-3'

配列番号 1 3

配列の長さ ： 2 7及び 8

配列の型 ： 核酸及びァ ミ ノ酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A及びァミ ノ酸

起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5' -GAT TAT AAA GAT GAT GAT GAT AAA TGA-3'

Asp Ty r Lys Asp Asp Asp Asp Lys 配列番号 1 4

配列の長さ ： 3 0

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配歹リ ： 5' -CGGAATTCGTGCGCTTCCTGAAGACGTCAG-3' 配列番号 1 5

配列の長さ ： 5 8

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖 トポロジー 直鎮状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配歹 IJ ： 5'-GCGAATTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCA-3' 配列番号 1 6

配列の長さ ： 3 2

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

BH列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5'-AAGGATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCA-3' 配列番号 1 7

配列の長さ ： 3 7

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配歹リ ： 5' -AACCATCCCCGAGGGTCTCTGCTGGAAGCCAGGCTCA-3' 配列番号 1 8

配列の長さ ： 3 3

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A 起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5'-CCTCTAGAGTCCCGGCCGTCGCACTCATTTACC-3' 配列番号 1 9

配列の長さ ：

配列の型 ： アミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： タンパク質

起源

生物名 ： ヒ ト

ただし XXXは配列が決定できなかった残基を示す。

配列

Lys Se r l ie Va I Leu Glu Pro l ie Tyr Trp Asn Ser Ser ASD Set Lys

1 5 10 15

Phe Leu Pro CI Gin Gl Leu Va 1 Leu Tyr Pro Gin l ie CI Asp Lys

20 25 30

Leu Asp l ie l ie XXX Pro Lys Va 1 Asp XXX Lys Thi Va 1 Gl y XXX Tyr

35 40 45 配列番号 2 0

配列の長さ ： 2 0

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎮状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5' -(TOT(ACGT)GA(AG) CC (ACGT) AT (TCA) TA (TO TGGAA-3 ' 配列番号 2 1 72

配列の長さ ： 2 0

配列の型 ： 核酸

鑛の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5'-AC(TC)TT(ACCT)GG(AG)CA(ACT)AT(AGT)AT(AG)TC-3' 配列番号 2 2

配列の長さ ： 1 0 7及び 3 5

配列の型 ： 核酸及びァ ミ ノ酸

銕の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D NA及びアミ ノ酸

起源 ： 化学合成法及びヒ ト

配列

CTT GAG CCG ATC TAT TGG AAT TCC TCG AAC TCC AAA TTT CTA CCT GGA 48 Leu Gl u Pro lie Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Ser Lys Pbe Leu Pro Gl y

1 5 10 15

CAA GGA CTG GTA CTA TAC CCA CAG ATA GGA GAC AAA TTG GAT ATA ATT 96 Gin G 1 Leu Vat Leu Tyr Pro Gin lie Gl Asp Lys Leu Asp 1 le I 1 e

20 25 30

TGC CCG AAA GT 107 Cys Pro Lys

35 配列番号 2 3

配列の長さ ： 2 0

配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5'- ATCCCGAAGTGCAGTCTGCC-3' 配列番号 2 4

配列の長さ ： 2 3

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： D N A

起源 ： 化学合成法による

配列 ： 5'- TCAGACCTTGTAGTAGATGTTCG - 3'

Claims

請求の範囲

1 . リ セプタ一型チロ シ ンキナーゼ活性を有し、 且つ、 配列 表の配列番号 1 及び 2 からなる群よ リ選ばれるア ミ ノ 酸配列 を含有する単離されたポ リ ペプチ ドと、 該ポ リ ペプチ ドの、 リ セプタ一型チロ シ ンキナーゼ活性を有する相同変異体とへ の結合能を有し、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動で測定し た分子量が少な く と も 4 1 5 0 0 ± 7 5 0 0 ダル ト ンであ り クマシ一プリ リ アン トブルー染色反応を受け得る こ と を特徴 とする単離された化合物。

2 . リ セプタ一型チロ シ ンキナーゼ活性を有 し、 且つ、 配列 表の配列番号 2 のァ ミ ノ酸配列を含有する単離されたポ リ べ プチ ド、 又は該ポ リ ペプチ ドの、 リ セプター型チロ シ ンキ十 —ゼ活性を有する相同変異体を発現した細胞に反応させる と 該ポリ べプチ ドの少な く と も 1 個のチロ シ ン残基を リ ン酸化 させる特性を有する請求項 1 に記載の化合物。

3 . 配列表の配列番号 4 に記載のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ ぺプチ ドを包含する請求項 1 に記載の化合物。

4 . 配列表の配列番号 4 に記載のァ ミ ノ 酸配列が該ポ リ ぺブ チ ドのア ミ ノ末端に位置する請求項 3 に記載の化合物。

5 . ク マ シ一プ リ リ アン ト ブル一染色反応と P A S染色反応 の両方を受け得る請求項 1 に記載の化合物。

6 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ ぺプ チ ドの少なく と も一部を含有してなる請求項 1 に記載の化合 物

7 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少なく と も一部が、 配列表の配列番号 5 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少な く と も一部である請 求項 6 に記載の化合物。

8 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ぺプ チ ドの少なく と も一部を含有してなる単離された化合物。

9 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少なく と も一部が、 配列表の配列番号 5 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少な く と も一部である請 求項 8 に記載の化合物。

1 0 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ 酸配列を含有するポ リ べ プチ ドの少な く と も一部を含有する化合物と 、

配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少なく と も一部を含有する化合物の少なく と も 1 種と 、 上記の配列表の配列番号 6 のァ ミ ノ 酸配列を含有するポ リ べ プチ ドの少な く と も一部を含有する化合物以外の化合物から なる群から選ばれる少な く と も 1 種、 とからなる複合体。

1 1 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ 酸配列を含有する ポリ ペプチ ドの少な く と も一部が、 配列表の配列番号 5 のァ ミ ノ酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少な く と も一部である 請求項 1 0 に記載の複合体。

1 2 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べ プチ ドの少なく と も一部をコー ドする単離された D N A。

1 3 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有する ポリ ペプチ ドの少なく と も一部が、 配列表の配列番号 5 のァ ミ ノ 酸配列を含有するポ リ べプチ ドの少なく と も一部である 請求項 1 2 に記載の化合物 D N A。

1 4 . 配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有するポ リ べ プチ ドの少なく と も一部を含有してなる単離された化合物の 製造方法に して ：

( a ) 該ポリ ペプチ ドの少な く と も一部をコー ドする D N Aを複製可能な発現べク タ一に連結して、 該 D N Aが、 該 複製可能な発現ベク ターに発現可能に組み入れられてなる複 製可能な組換え D N Aを得て、

( b ) 真核細胞又は原核細胞を該複製可能な組換え D N Aで形質転換して、 形質転換体を形成 し、

( c ) 該形質転換体を親細胞と しての該真核細胞又は原 核細胞から選別 し、

( d ) 該形質転換体をイ ンキュベー トする こ と に よ リ 、 形質転換体に該 D N Aを発現させて、 該ポ リ ペプチ ドの少な く と も一部を含有してなる化合物を生産させ、 そ して

( e ) イ ンキュベー ト された形質転換体から該化合物を 単離する、

こ と を特徴とする方法。

1 5 . 上記の配列表の配列番号 6 のア ミ ノ酸配列を含有する ポリ ペプチ ドの少なく と も一部が、 配列表の配列番号 5のァ ミ ノ酸配列を含有するポリ べプチ ドの少なく と も一部である 請求項 1 4 に記載の方法。

1 6 . 請求項 1 に記載の化合物、 又は配列表の配列番号 5の ア ミ ノ酸配列を含有するポ リ ペプチ ドの少なく と も一部を含 有する化合物を特異的に認識する抗体。

1 7 . 配列表の配列番号 7の塩基配列の少なく と も 1 2個の 連続した塩基配列を含有するセ ンス D N A、 該セ ンス D N A に相補的なア ンチセ ンス D N Aからなる群よ リ 選ばれる単離 された D N A断片、 及び該センス D N A及び該アンチセ ンス D N Aを、 それぞれ、 メ チル化、 メ チルフ ォ スフェー ト化、 チォフ ォ スフュー ト化又は脱ア ミ ノ化する こ と によ リ 得られ る . 該セ ンス D N A及び該ア ンチセンス D N Aの誘導体から なる群よ リ選ばれる単離された D N A断片。

1 8 . 配列表の配列番号 7の塩基配列に相補的な少な く と も 1 2個の連続 した塩基配列を含有するアンチセンス R N A、 該ア ンチセ ンス R N Aに相補的なセンス R N Aからなる群よ リ選ばれる単離された R N A断片、 及び該ア ンチセ ンス R N A及び該センス R N Aを、 それぞれ、 メ チル化、 メ チルフォ ス フ ェー ト化、 チォフォ ス フ ェー ト化又は脱ァ ミ ノ化する こ と にょ リ得られる、 該ア ンチセンス R N A及び該セ ンス R N Aの誘導体からなる群よ リ選ばれる単離された R N A断片。