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WO1996010636A1 - Nouveaux composes utilisables pour la preparation d'agents anti-infectieux - Google Patents

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Publication number
WO1996010636A1
WO1996010636A1 PCT/FR1995/001277 FR9501277W WO9610636A1 WO 1996010636 A1 WO1996010636 A1 WO 1996010636A1 FR 9501277 W FR9501277 W FR 9501277W WO 9610636 A1 WO9610636 A1 WO 9610636A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rnase
seq
sequence
polypeptides
rli
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/001277
Other languages
English (en)
Inventor
Tamim Salehzada
Catherine Bisbal
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm), Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Publication of WO1996010636A1 publication Critical patent/WO1996010636A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the invention is new compounds which can be used for the preparation of anti-infective agents.
  • IFN 2-5A-synthetases
  • 2-5A-synthetases 2-5A-synthetases
  • These enzymes activated by double-stranded RNA (cellular or viral), polymerize ATP into a series of 2'-5 'phosphodiester-linked oligoadenylates, hereinafter called "2-5A”.
  • the 2-5A / RNase L system could be involved in other situations such as cell growth and differentiation. This via the degradation of so-called unstable messengers carrying 3 'sequences AUUUA instabilizers potential RNase L targets (Shaw and Kamen, 1986, Cell, 46, 659-667).
  • the role of the 2-5A system is however limited during infection by certain viruses such as the encephalo-myocarditis virus (EMCV), vaccinia, Herpes or HIV, which reduces the anti- interferon virus.
  • viruses such as the encephalo-myocarditis virus (EMCV), vaccinia, Herpes or HIV, which reduces the anti- interferon virus.
  • the invention is based more particularly on the demonstration on the one hand, of a mechanism for regulating RNase L by this cellular protein and on the other hand for the induction of this cellular protein by viruses.
  • the invention thus offers a particularly effective and specific new approach for developing new antiviral strategies in pathological situations.
  • the object of the invention is therefore to provide, as new chemicals, DNA sequences capable of coding for polypeptides having inhibitory properties with respect to RNase L, as well as the corresponding antisense sequences , the corresponding RNA sequences and the cDNA sequences.
  • the invention aims to provide said polypeptides, as new chemicals, and a process for obtaining them according to the techniques of genetic engineering, so as to have these products in sufficient quantities for biological applications, and in purified form.
  • the invention relates to the application of these different products to develop compositions or products with anti-viral effect or making it possible to reinforce the effect of interferons.
  • the invention relates, as new products, to nucleotide sequences, isolated from their natural environment, capable of hybridizing with at least one fragment of the sequence SEQ ID N • 1 or SEQ ID NO:
  • Such sequences include those which are capable of hybridizing with at least one fragment of the sequence SEQ ID N • 1 or SEQ ID N • 2 which codes for a polypeptide capable of inhibiting RNase L.
  • This hybridization can be carried out under stringent conditions, but also under relaxed conditions.
  • the invention relates in particular to nucleotide sequences, isolated from their natural environment, corresponding to at least part of the sequence SEQ ID N • 1 or SEQ ID N • 2.
  • sequences include those corresponding to at least part of the sequence SEQ ID N • 1 or SEQ ID N • 2 capable of coding for an RNase L inhibitor.
  • sequences are further characterized in that they are capable of coding, implemented according to conventional recombinant DNA techniques, for polypeptides having an RNase L inhibitory activity, comprising at least one chain of amino acids.
  • SEQ ID N • 3 The invention relates to the nucleic acid sequences corresponding to the open reading frame going from position 118 to 1914 in SEQ ID N '1.
  • sequences are further characterized in that they comprise two motifs of the P loop type.
  • antisense sequences corresponding to the sequences defined above, the mRNA sequences and their antisense, and the corresponding cDNAs.
  • nucleotide sequences are further characterized in that they are free of mammalian DNA, infectious agents, prions and other materials from natural products.
  • the invention also relates, as new chemicals, to polypeptides having an inhibitory effect with respect to ribonuclease.
  • polypeptides according to the invention are characterized in that they have an RNase L inhibitory activity and consist of a chain of amino acids in the sequence coded by SEQ ID N • 1 OR SEQ ID N • 2.
  • polypeptides are further characterized by a chain of amino acids in SEQ ID N • 3 or in SEQ ID N • 4.
  • the invention relates in particular to polypeptides as defined above possessing, in their chain of amino acids, a sequence homologous with the motif CX 2 CX 2 CX 3 C: 4Fe4S - ferredoxin and / or a high number of thiol groups and / or a high number of leucine units.
  • the polypeptide corresponding to the open reading frame in the sequence SEQ ID N * 1 comprises 599 amino acids, has a molecular weight evaluated at 67.515 kDa and an isoelectric point estimated at 8.7.
  • polypeptides of the invention are further characterized in that they are as obtained by expression, in an appropriate host cell, according to recombinant DNA techniques, of an expression vector comprising a DNA sequence consisting of a sequence of nucleotides in the sequence SEQ ID N * 1 or SEQ ID N • 2, recovery of the expressed polypeptide and purification.
  • polypeptides within the meaning of the present invention are of several types.
  • fragments or derivatives obtained by genetic and / or chemical modification from the sequences SEQ ID N • 1 or SEQ ID N • 2, or sequences SEQ ID N • 3 or SEQ ID N • 4. Such fragments or derivatives at least partially retain the activity of inhibiting RNase L or of inhibiting the polypeptides corresponding to these sequences.
  • the nucleotide sequences thus modified on the one hand, and the polypeptide sequences thus modified on the other hand fall within the scope of the invention.
  • modification of a genetic and / or chemical nature is meant any mutation, deletion, substitution, addition and / or modification of one or more nucleotides or amino acids of the sequences defined above.
  • polypeptides defined above can be obtained in a form free of any contaminant and in a quantity sufficient for the biological applications described below.
  • the screening of a cDNA library is carried out using a 2-5A labeled, for example, with a radioactive element; the gene sought is isolated, then it is introduced into an expression vector and a host cell is transfected with this vector. After expression of the polypeptide with RNase L inhibitory activity sought, the latter is recovered after lysis of the cells, and it is subjected to at least one purification step.
  • prokaryotic systems such as bacteria, or eukaryotes, such as baculovirus, insect cells and yeasts, advantageously such as are commercially available.
  • the invention also relates to expression vectors containing at least one of the nucleotide sequences defined above subjected to the control of an appropriate promoter, in particular, the vectors corresponding to at least part of SEQ ID N • 1 or SEQ ID N • 2, or their antisense sequences.
  • Host cells transfected with these vectors and which include the expressed recombinant proteins are also part of the invention.
  • the cells used for the transfections advantageously correspond to those mentioned above, available commercially.
  • RNase L was first described as a molecular complex of about 200 kDa (Slattery et al, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4778-4782). However, its molecular weight varies with the analysis conditions used, such as the protein concentration (Floyd-Smith et al, J. Biol. Chem. 257, 8584-8587), and the origin of the cells (Bisbal et al, Eur. J. Biochem, 179, 595-602).
  • the inventors have characterized a protein, binding the RNA, associated with the protein of 80 KD binding 2-5A.
  • the inventors have therefore proposed a model where RNase L of high molecular weight is in fact a complex composed of at least two proteins: the protein binding 2-5A (2-5ABP) and the protein binding RNA (RNABP) ( Salehzada et al, 1993, J. Biol. Chem., 268, 7733-7740).
  • the polypeptides of the invention specifically associate with 2-5ABP and RNABP as shown by their co-immunoprecipitation with the monoclonal antibody MAb 3 (Example 5, FIG. 6).
  • the inhibition observed depends on the ratio between RNase L and the polypeptide and does not result from a degradation of 2-5A or a stable modification of RNase L.
  • polypeptides of the invention are advantageously used to stabilize the RNAs in cell extracts during molecular biology techniques (Example 8, Figure 9).
  • the invention relates to the use of the polypeptides defined above as target agents for detecting products capable of inhibiting their own inhibitory effect and thus making it possible to regulate the functioning of the 2-5A / RNase L system, and thereby to increase the action of interferons.
  • the invention therefore relates to a method of screening molecules or substances to detect in them an activity directed against the RNase L inhibitory activity of the polypeptides of the invention.
  • This process is characterized in that a polypeptide of the invention is brought into contact with a molecule or substance to be tested, and the reactivation of RNase L, again capable of binding 2-5A, or inhibition is detected. of its inhibitor.
  • Products capable of inhibiting the inhibitory activity against RNase L of the polypeptides of the invention consist of polyclonal and monoclonal antibodies.
  • These antibodies can also be used in diagnosis to follow the evolution of RLI during a viral infection.
  • the invention consists in the development of products capable of preventing the production of RNase L inhibitors by infectious agents or of neutralizing the inhibitors produced by these agents.
  • Viruses like EMCV induce inhibitors of RNase L, this induction can be inhibited by interferon when the action of the latter is capable of restoring activity to the 2-5A / RNase system. L. But when the 2-5A / RNase L system is unbalanced, interferon can no longer exert its anti-viral effect and the viral infection progresses.
  • the invention therefore provides means, with the polypeptides defined above, for searching for active products vis-à-vis virus-induced RNase L inhibitors.
  • the invention particularly relates to the use of antisense nucleotide sequences defined above for transfecting mammalian cells (see example 9, figure 10 and example 11 figures 12 A to F).
  • the anti-sense DNA may be contained in different vectors such as retroviruses or recombinant viruses modified to be usable in the mammal by operating according to conventional techniques of genetic engineering.
  • the first step is to obtain transgenic animals in which the RNase L inhibitor gene has been made inactive, or on the contrary will be overexpressed.
  • DNA can be microinjected directly into the pronucleus of fertilized eggs (see Constantitini and Lacy, 1981, Nature, 294, pages 92 to 94).
  • the mbryon can also be infected with a retroviral vector (Jaenisch, 1976, Proc. Nat. Se 1973, 1260-1264). This technique can also allow the gene to be inactivated (Jaenish et al, 1983, Cell, 32, 209-216).
  • Another technique for inactivating the gene could consist in the microinjection of a gene coding for an antisense RNA (Izant and Weintraub, 1985, Science, 229-345-352). These animals allow the study of their sensitivity to viruses inducing the RNase L inhibitor, such as EMCV, whether or not in conjunction with IFN treatment. By taking samples from animals, the level of virus produced is determined and, by comparison with control animals, the course of the infection is monitored.
  • RNase L inhibitor such as EMCV
  • the experiments are carried out on another animal model susceptible to an infection equivalent to the HIV system in humans in order to selectively express an antisense of the inhibitor in the cells infected with the virus.
  • the invention thus provides the means to study the evolution of an infection in these animal models.
  • compositions in association with an inert vehicle. These compositions are advantageously in the form of a sterile, isotonic solution or are stored in lyophilized form.
  • FIG. 1 represents the constructions of the cDNAs coding for the polypeptides according to the invention
  • FIG. 2 the nucleotide sequence of the cDNA of the RLI polypeptide and the corresponding amino acid sequence
  • FIGS. 3A and 3B analyzes by Northern transfer of mRNA of HeLa cells, treated or not with interferon, hybridized with different probes,
  • FIGS. 4A to 4C the autoradiographies after SDS-PAGE of translation products of the RLI cDNA and of the 2DR polypeptide in two different translation systems, and the results of the hybridization with a 2-5ApCp probe.
  • FIGS. 5A to 5C the effects of inhibition of RLI on RNase L in a rabbit reticulocyte system or the human Daudi or Hela cells
  • FIG. 6 the association by virtue of immunoprecipitation by a monoclonal antibody specific for RNase L, of RLI associated with 2DR or RNase L,
  • FIG. 8 the absence of degradation or of stable modification of RNase L by RLI
  • FIG. 9 the stabilization of the RNAs in a reticulocyte extract in the presence of RLI
  • FIGS. 10A and 10B the response to the interferon of the transfected cells by the sense construction of H2ABP inhibiting RNase L
  • FIG. 11 the induction of the RLI mRNA by EMCV, - Figures 12A to 12C, the activity of RNase
  • FIG. 13 the level of RLI mRNA after infection with HIV
  • Human Daudi cells are used as a source of mRNA given their high level of 2-5A binding activity. These cells are cultured in suspension and maintained in RPMI 1640 medium supplemented with 10% (v / v) fetal calf serum, 60 IU / ml of penicillin and 50 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • the HeLa cells are cultured in the same medium with 2 mM glutamine.
  • the cells are treated with human ⁇ / ⁇ interferon (IFN ⁇ / ⁇ Hu for short).
  • IFN ⁇ / ⁇ Hu for short.
  • Cell extracts are prepared as described by Salehzada et al in J. Biol. Chem., 1993, 268, pages 7733 - 7740. In short, the cells are resuspended in 2 volumes of hypotonic buffer, broken in a homogenizer and centrifuged at 10,000 g.
  • the radio-binding test and the covalent labeling process are carried out using, as sources of RNase L, SIO cell extracts, rabbit reticulocyte lysates or wheat germ extracts (with or without the various proteins translated cloned).
  • Total cellular RNA is prepared using the lithium chloride-guanidine thiocyanate method according to the method of Cathala et al in DNA, 1983, 4, 327-333.
  • Hybridizations by Northern transfer are carried out according to standard techniques as described by Sambrook et al in Molecular Cloning: a laboratory manual, 1982 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) .
  • the probes are synthesized by a multi-primer process (Ready-to-go kit, Pharmacia).
  • the mRNAs are quantified by image analysis using the Bioimage program on a Millipore image analysis station (Sun Station). Each track is standardized with the GAPDH probe
  • the filters are then rinsed with buffer A saturated with 5% (v / v) of skimmed milk and rinsed again with buffer A without milk.
  • An incubation is then carried out for approximately 14 hours at 4 ° C. in buffer A with 2-5A 4 -3 ′ - [ 32 P] pCp (5x10 5 dpm / filter).
  • the composition of buffer A is as follows:
  • FIG. 2 A positive clone containing an insertion of 2861 bp called H2ABP is thus isolated (FIG. 2).
  • This insertion includes an ATG initiator in position 125 (see Figure 2). It is translated as a 39 kDa protein in a rabbit reticulocyte lysate or an extract of wheat germ. It presents an open reading frame from the first nucleotide.
  • An internal primer determined from the H2APB sequence is used to isolate by anchored PCR a complete 3568 bp cDNA coding for the RLI (see FIG. 1).
  • dG nucleotides are added to one end of a polydT cDNA with a transferase terminal.
  • This cDNA (0.5 ⁇ g) is amplified by PCR (30 cycles) in a final volume of 50 ⁇ l using a 5 ′ polydC primer with Pstl and BamHI sites (5 ′ TTTCTGCAGGATCCCCCCCCCC) and an internal primer (5 ′ CACTTAGATCATGTTCCACCACAAT 3 ') as shown in Figure 1.
  • This 924 bp cDNA fragment designated by PCR in FIG. 1, which overlaps the H2ABP clone of 217 bp, is cloned in the BglII site.
  • the full RLI cDNA contains an additional 707 bp on the 5 'side of H2ABP.
  • H2ABP is sequenced in pSK (pBluescript II SK, Stratagene) according to the Sanger dideoxy nucleotide sequencing method (T7 sequencing kit, Pharmacia) after the 3 'progressive deletions.
  • deletions are generated by nuclease digestion with exonuclease III-S1, followed by filling with the Klenow polymerase DNA (Pharmacia).
  • the RLI cDNA has a 5 'non-coding region of 118 nucleotides, an open reading frame extending to nucleotide 1914 and a long 3' untranslated region of 1654 bp.
  • the open reading frame encodes a polypeptide of 599 amino acids, of molecular weight 67.515.
  • the ATG codon at the start of the open reading frame has the characteristics of a strong initiator codon, that is to say a purine in position -3 and a G in position +4.
  • the RLI cDNA contains two ATP / GTP repeat binding sites or P loop type motifs: one going from residues 110 to 117 and the other from residues 379 to 386 (see the empty rectangles in Figure 2).
  • the AATAAA polyadenylation signal sequences are underlined and the ATTTA sequences which may correspond to instability are underlined with two lines.
  • the shaded rectangles correspond to a potential PCK phosphorylation site.
  • RLI has a high number of thiol groups and is found to be very rich in leucine residues.
  • Example 2 Regulation of RLI mRNA expression by interferon (illustrated in FIG. 3)
  • RNAs (20 ⁇ g) are fractionated on a 1.2% (w / v) agarose gel, and hybridized with an RLI cDNA probe, with a human probe coding for a 15 kDa protein induced by IFN , or with a GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) human probe.
  • the filter is subjected to autoradiography for 5 h in the test with the GAPDH probe and for 12 h in the tests with the other probes.
  • the results obtained are given in FIG. 3A. Examination of this figure shows that the RLI cDNA hybridizes with two cellular mRNAs of 3.5 kb and 2.8 kb in HeLa cells. The same result is obtained in Daudi and CEM cells.
  • the human ⁇ / ⁇ interferon even at high concentrations, does not regulate the two mRNAs which hybridize with the RLI clones.
  • the duration of interferon therapy does not result in any quantitative variation in these mRNAs.
  • cells respond normally to interferon therapy. Indeed, by operating under the same conditions, a 15 kDa protein already described is induced as being induced by an interferon treatment (see Blomstrom et al, J. Biol. Chem., 1986, 261, 8811-8816) .
  • RNAs (20 ⁇ g) were fractionated on 1.2% (w / v) agarose gel and hybridized with two probes of RLI cDNA described in Figure 1, namely a 762 bp probe (A in Figure 3B), specific for the 5 'end of RLI, and a 764 bp probe (B in Figure 3B) representing its end 3 '.
  • probe A hybridizes with the two mRNAs while probe B hybridizes only with the longest mRNA. These two mRNAs therefore differ in their 3 'untranslated region. The similarity between the sizes of the two natural mRNAs and those of the cloned cDNAs is pure coincidence.
  • Example 3 In vitro synthesis of the mRNA coding for RLI and 2DR and of these polypeptides.
  • T3 polymerase Transcription is carried out with T3 polymerase in the presence of m 7 GtS ') ppp (5') G by operating according to the manufacturer's instructions (Promega).
  • RNA is analyzed and quantified by electrophoresis on 1.2% (w / v) agarose gels in TBE buffer (50 mM Tris pH 8; 50 mM boric acid, 1 mM EDTA).
  • RNA is extracted with phenol / dichloromethane (v / v) and precipitated with ethanol, 250 mM NaCl.
  • lane 1 corresponds to the extracts of rabbit reticulocyte without mRNA
  • lane 2 to these extracts after translation of 2DR and lane 3 after translation of RLI
  • lane 4 to wheat germ extracts without mRNA
  • lane 5 to extracts after translation of 2DR and lane 6 after translation of RLI.
  • RNABP 80 kDa polypeptide
  • the monoclonal antibody does not recognize any protein in the wheat germ extract where the 2-5A / RNase L system does not exist and consequently RNABP is absent.
  • the translation products of 2DR and RLI are deposited on nitrocellulose sheets.
  • the products are subjected to an incubation with the 2-5ApCp probe, according to the protocol used to screen the ⁇ ZAP library.
  • Autoradiography analyzes are then carried out.
  • the autoradiographs are given in FIG. 4C, where "O” corresponds to an experiment in wheat germ or in the rabbit reticulocyte without RNase L, 2DR or RLI; "RLI” experiments with 0.8 x 10- 15 moles of RLI in both the wheat germ extracts than in reticulocyte "2DR” experiments with 1.3 x 10 -15 moles of 2DR in wheat germ or reticulocyte extracts.
  • RLI and 2DR are present at the same time in the reticulocyte extract, there is an inhibition of the binding of 2-5A by endogenous 2DR (RNase L).
  • Translations are carried out in reticulocyte or wheat germ extracts of mRNA coding for luciferase, RLI or 2DR.
  • Different concentrations of the translation products are added to reticulocyte or wheat germ extracts, as well as to an extract in which the 2DR mRNA has already been expressed.
  • the curve corresponds to a reticulocyte + luciferase extract; (-4-) to a reticulocyte extract + RLI; a reticulocyte extract + 2DR + RLI; to a wheat germ + 2DR + RLI.
  • FIG. 5A No inhibition of endogenous RNase L is observed in the reticulocyte extract or that of expressed 2DR, after addition of a protein unrelated to the process studied such as luciferase (FIG. 5A; FIG. 5C tracks 3 and 4). which serves as a witness.
  • 2-5ApCp is not modified when the experiment is carried out with increasing concentrations of 2- 5ApCp as long as the ratio between 2DR and RLI is not modified.
  • the initial truncated clone H2ABP has the same properties as the complete clone. It inhibits the binding of endogenous RNase L, or 2DR expressed in vitro, to 2-5ApCp.
  • FIG. 5A illustrates that the activation of the complex depends on the stoechometry between RLI and RNase L, which is of interest for studying the involvement of RNase L in normal situations such as growth. or differentiation, but also in pathological cases such as viral infection or cancer.
  • Example 5 Study of the association of RLI with RNase L or 2 DR (illustration in FIG. 6).
  • an immunoprecipitation is carried out with the monoclonal antibody MAb3-
  • cellular extracts or the incubations of the translation products are incubated for 3 hours, at room temperature, with a dilution of 1/1000 of MAb3 or of a control antibody.
  • the RNase L-antibody complexes are incubated for approximately 14 hours at 4 ° C. with protein A-Sepharose (Pharmacia) and recovered by centrifugation.
  • the beads are washed several times with 10 mM Tris buffer (pH 7.4), 0.5% (v / v) of aprotinin, 1% (v / v) of NP40, 2 mM of EDTA, 150 mM NaCl, and resuspended in a volume of 300 mM Tris buffer (pH 8.9), 5% (w / v) SDS, 5% (v / v) ⁇ -mercaptoethanol, 20% v / v glycerol.
  • Protein A-Sepharose is heated for 5 min. at 95 ° C and the immunoprecipitated proteins are analyzed by SDS-PAGE 10% (w / v).
  • Example 6 Stability of 2-5 ApCp (illustrated in Figure 7)
  • Reticulocyte extracts may or may not be supplemented with RLI or 2DR mRNA and incubated for 1 hour at 30 ° C under translation conditions.
  • a buffer containing 50% (v / v) of formamide, 1% (v / v) of bromophenol blue and 1% (v / v) of xylene cyanol is added.
  • the samples are boiled for 3 min and centrifuged at 10,000 g.
  • the supernatants are loaded onto 20% (w / v) polyacrylamide gels containing 7 M urea.
  • the samples are analyzed by electrophoresis at 1100-1600 volts until a coloring of 15 cm is obtained from the bottom of the gel with blue bromophenol. Wet gel is exposed to Kodak film.
  • This example shows that the inhibition of 2-5A binding is not due to its degradation by RLI.
  • Example 7 Reactivation of RNase L after its separation from RLI (illustrated in FIG. 8)
  • the RLI mRNA is translated into a reticulocyte extract.
  • the example therefore shows that the RLI does not inhibit RNase L by degradation of the latter or irreversible modification.
  • Example 8 Stabilization of mRNAs in the Presence of RLI (Illustrated in FIG. 9)
  • the rabbit reticulocyte extracts are incubated for 1 h at 30 ° C. under translation conditions (1) without added mRNA (retic), (2) by adding the RLI mRNA (retic + RLI), (3) by adding the 2DR mRNA (retic + 2 DR), (4) by adding 2DR mRNA and RLI (retic + 2DR + RLI). Then 2-5A 4 is added at 100 nm (+) or not (-) and the extracts are again incubated for 30 min at 30oC.
  • the RNAs are isolated and analyzed on a 1.2% (w / v) agarose gel. The RNAs and their degradation products are quantified by image analysis.
  • Example 9 Activity of the RLI in the intact cells (illustrated by FIG. 10)
  • the human cDNA H2ABP which codes for a truncated active form of RLI, is directionally subcloned into pcDNAIneo (Invitrogen) by operating according to the standard methods described by Sambrook et al in the above reference.
  • each at a rate of 7 ⁇ g are transfected into HeLa cells by co-precipitation with calcium phosphate.
  • the stable transfectants are chosen by culturing the cells in the presence of 1 mg / ml of G418
  • PcDNAIneo or H2ABP / pcDNAIneo cells are seeded at the rate of 10 5 cells per well. These cells are treated 24 hours later with different dilutions of IFN ⁇ / ⁇ Hu for 20 hours.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • EMCV encephalo-myocarditis
  • the virus titers are determined 18 hours later as described by Milhaud et al. Ann. Virol, 1983, 134 E 405-416.
  • Example 10 Induction of the RLI mRNA by the EMCV (illustrated by FIG. 11)
  • HeLa cells are infected with an m.o.i. of 10 by EMCV or VSV, after or not treatment with IFN ⁇ / ⁇ Hu at 1000 U / ml.
  • RNAs are then extracted from these cells at different post-infection times, as described in Figure 11.
  • FIG. 11 shows that an induction of the RLI mRNA is observed by infecting with EMCV and not with VSV and that this induction is partly reversed by pre-treatment with interferon.
  • Example 11 Study of the inhibition of RNase L in sense or antisense RLI transfectants in human HeLa cells (illustrated by FIGS. 12A to F).
  • HeLa W4 Human HeLa cells were transfected with the pcDNAI neo expression vectors (HeLa W4),
  • H2ABP sense / pcDNAIneo HeLa 7.3
  • H2ABP antisense / pcDNAIneo HeLa 8.2
  • FIGS 12 D, E, F show the same transfectants infected with VSV, this virus does not induce the inhibitor (as illustrated by Figure 11 of the previous example), we do not observe any variation in the binding of 2-5A to RNase L during infection.
  • human HeLa cells, HeLa cells transfected with the empty pcDNAneoI vector (VV4) and HeLa cells transfected with the RLI antisense in pcDNAneoI (8.2) are seeded in 24-well dishes at the right rate. from:
  • the cells are counted, washed and infected with the EMCV and VSV virus at 10 m.o.i.
  • viruses produced in the different cell strains are then assayed by limiting dilution (Milhaud PG et al, (1983) Ann. Virol 134 E, 405-416).
  • Example 12 Determination of RLI mRNA during HIV infection and assay of viral reverse transcriptase (RT) in parallel indicating the development of HIV (FIG. 13)
  • Human H9 cells are infected with strain III B of HIV-1 by following these steps:
  • Two 30 ml bottles of H9 cells at 2 x 10 cells / ml are used.
  • the cells of each vial are infected with 3 ml of IIIB virus and incubated at 37oC for one week.
  • the two 30 ml flasks are collected in 50 ml flasks, centrifuged at 1200 rpm at 4oC for 5 min., And the virus is stored at -80oC.
  • the cells necessary for kinetics are placed at P3, then centrifuged and taken up in 40 ml of HIV virus strain IIIB (estimate at 10 m.o.i.). Incubate for 1 hour at 37oC.
  • RPMI / fetal calf serum is added to the infected cells and 30 ml are harvested for 1 hour and the remainder is distributed into boxes, ie 30 ml / box (one box / day).
  • the pellet is taken up in 300 ⁇ l of guanidium.
  • a conventional extraction of the RNAs is then carried out with LiCl and precipitation with ethanol, operating according to Cathala G. et al, 1983, DNA 4, 327-333.
  • the mRNAs are analyzed on agarose gel by transfer onto nitrocellulose, according to Sambrook et al above, an RLI probe being used for hybridization.
  • TNE buffer (lysis buffer): Tris p117.8 20 mM; 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.1% Triton X-100; qs H 2 O
  • the TB ⁇ buffer Tris 1M; MgCl 2 100 mM; 2M KCl; 0.2M DTT; EGTA 2mM; qs H 2 O
  • RLI as a function of the duration (in hours) of HIV infection.
  • the curve corresponds to the 3.5 kb mRNA of RLI and the curve 2.8 mb mRNA.
  • the human RLI gene was localized by fluorescence in an in situ hybridization on the human metaphase chromosomes, operating as described by Taviaux et al in Genomics, (1993) 15: 194-
  • the insert of the RLI cDNA probe (3588 bp) was labeled with biotinyl-16-dUTP. 37 metaphases were examined with a probe concentration of 4 ⁇ g / ml.
  • a main peak and two secondary peaks were observed, as shown in Figure 14.
  • the main peak is found on chromosome 4 at band q31. Specific labeling was observed on 4 chromatids (5 cells), 3 chromatids (16 cells), two chromatids (12 cells) and 1 chromatid (4 cells) of the homologs of chromosome 4.
  • the secondary peaks are on chromosomes lq31 and 7pl5-p21.
  • the RLI gene appears localized on chromosome 4q31 as indicated by the main fluorescence peak.
  • the other two peaks, of lower intensity, would indicate the presence of other genes, having a significant homology, of at least 80%, with the RLI gene.
  • the RNase L gene is located at lq25.
  • the gene located at 7p15-p21 is closely linked to the IFN ⁇ 2 gene (7p21).
  • the other components of the 2-5A system are located on different chromosomes: the small forms of synthetase 2-5A have been mapped to human chromosomes 11 and 12.
  • the 2-5A pathway enzyme genes do not cluster in the human genome.

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Abstract

L'invention vise des séquences de nucléotides capables de coder pour des polypeptides présentant une activité inhibitrice vis-à-vis de la RNase L. Ces séquences de nucléotides et ces inhibiteurs sont utiles pour le développement d'anti-viraux.

Description

TITRE : NOUVEAUX COMPOSES UTILISABLES
POUR LA PREPARATION D'AGENTS ANTI-INFECTIEUX.
L'invention a pour objet de nouveaux composés utilisables pour la préparation d'agents anti-infectieux.
On sait que la voie naturelle de défense de l'organisme vis-à-vis d'infections virales met en jeu les interférons, gui agissent au travers de différents médiateurs, dont le système 2-5A/RNase L.
Le traitement des cellules par les interférons
(désignés ci-après en abrégé par IFN) induit de nombreux gènes parmi lesquels ceux des 2-5A-synthétases. Ces enzymes, activées par de l'ARN double brin (cellulaire ou viral), polymérisent l'ATP en une série d'oligoadénylates à liaison phosphodiester 2'-5', appelés ci-après "2-5A". Ce 2-5A active, à des concentrations nanomolaires, une endoribonucléase latente la RNase L, qui possède notamment la propriété de cliver les ARNm au niveau des séquences UpNp (N=U ou A).
Lors d'une infection virale, l'activation du système 2-5A/RNase L conduit à la dégradation sélective des ARNm viraux, ce qui entraine une inhibition de la croissance virale.
Cette sélectivité d'une enzyme, la RNase L n'ayant que peu de spécificité de séquence serait due à une activation localisée du système, activation qui aurait lieu au niveau des structures double brin virales comme la séquence TAR de HIV.
Le système 2-5A/RNase L pourrait être impliqué dans d'autres situations comme la croissance et la différentiation cellulaire. Ceci via la dégradation de messagers dits instables et portant en 3' des séquences instabilisatrices AUUUA cibles potentielle de la RNase L (Shaw et Kamen, 1986, Cell, 46, 659-667).
Le rôle du système 2-5A se trouve toutefois limité lors de 1'infection par certains virus comme le virus de 1'encéphalo-myocardite (EMCV), la vaccine, l'Herpès ou le HIV, ce qui diminue l'effet anti-viral des interférons.
On conçoit donc 1' intérêt de disposer de moyens permettant de lutter avec efficacité contre une infection par de tels virus.
Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à mettre en évidence que la RNase L est inhibée par une protéine cellulaire.
L'invention repose plus particulièrement sur la mise en évidence d'une part, d'un mécanisme de régulation de la RNase L par cette protéine cellulaire et d'autre part de 1' induction de cette protéine cellulaire par des virus.
L'invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrement efficace et spécifique pour élaborer de nouvelles stratégies antivirales dans des situations pathologiques.
L'invention a donc pour but de fournir, en tant que nouveaux produits chimiques, des séquences d'ADN capables de coder pour des polypeptides ayant des propriétés inhibitrices vis-à-vis de la RNase L, ainsi que les séquences anti-sens correspondantes, les séquences d'ARN correspondantes et les séquences d'ADNc.
Elle vise également à fournir lesdits polypeptides, en tant que produits chimiques nouveaux, et un procédé pour les obtenir selon les techniques du génie génétique, de manière à disposer de ces produits en quantités suffisantes pour des applications biologiques, et sous forme purifiée. Selon encore un autre aspect, l'invention vise l'application de ces différents produits pour élaborer des compositions ou des produits à effet anti-viral ou permettant de renforcer 1' effet des interférons.
L'invention vise, en tant que nouveaux produits, les séquences de nucléotides, isolées de leur environnement naturel, capables de s'hybrider avec au moins un fragment de la séquence SEQ ID N• 1 ou SEQ ID
N• 2.
De telles séquences comprennent celles qui sont capables de s'hybrider avec au moins un fragment de la séquence SEQ ID N• 1 ou SEQ ID N• 2 qui code pour un polypeptide capable d'inhiber la RNase L.
La séquence SEQ ID N• 1 et suivantes sont données en fin de description dans le document appelé "Liste de séquences".
Cette hybridation peut être réalisée dans des conditions stringentes, mais également dans des conditions relaxes.
L'invention vise en particulier des séquences de nucléotides, isolées de leur environnement naturel, correspondant à au moins une partie de la séquence SEQ ID N• 1 ou SEQ ID N• 2. De telles séquences comprennent celles correspondant à au moins une partie de la séquence SEQ ID N• 1 ou SEQ ID N• 2 capable de coder pour un inhibiteur de RNase L.
De telles séquences sont encore caractérisées en ce qu'elles sont capables de coder, mises en oeuvre selon les techniques classiques de l'ADN recombinant, pour des polypeptides présentant une activité inhibitrice de la RNase L, comprenant au moins un enchaînement d'acides aminés dans la séquence SEQ ID N• 3. L ' invention vise les séquences d ' acides nucléiques correspondant au cadre ouvert de lecture allant de la position 118 à 1914 dans SEQ ID N' 1.
Ces séquences sont encore caractérisées en ce qu'elles comprennent deux motifs du type boucle P.
Entrent également dans le cadre de 1 ' invention les séquences anti-sens correspondant aux séquences définies ci-dessus, les séquences d'ARN-m et leurs antisens, et les ADNc correspondants.
Ces différentes séquences de nucléotides sont encore caractérisées en ce qu'elles sont dépourvues d'ADN de mammifères, d'agents infectieux, de prions et autres matériaux des produits naturels.
Elle vise plus particulièrement les séquences d'acides nucléiques ci-dessus, insérées dans un vecteur d'expression pour des polypeptides présentant une activité inhibitrice de la RNase L.
L'invention vise également, en tant que produits chimiques nouveaux, des polypeptides ayant un effet inhibiteur vis-à-vis de ribonucléase.
Les polypeptides selon l' invention sont caractérisés en ce qu'ils possèdent une activité inhibitrice de la RNase L et sont constitués par un enchaînement d'acides aminés dans la séquence codée par SEQ ID N• 1 OU SEQ ID N• 2.
Ces polypeptides sont encore caractérisés par un enchaînement d'acides aminés dans SEQ ID N• 3 ou dans SEQ ID N• 4.
L' invention vise en particulier des polypeptides tels que définis ci-dessus possédant, dans leur enchaînement d'acides aminés une séquence homologue avec le motif CX2CX2CX3C:4Fe4S - ferredoxine et/ou un nombre élevé de groupes thiol et/ou un nombre élevé de motifs leucine. Le polypeptide correspondant au cadre ouvert de lecture dans la séquence SEQ ID N* 1 comprend 599 acides aminés, possède un poids moléculaire évalué à 67,515 kDa et un point isoélectrique estimé à 8,7.
Les polypeptides de l' invention sont encore caractérisés en ce qu'ils sont tels qu'obtenus par expression, dans une cellule hôte appropriée, selon les techniques de l'ADN recombinant, d'un vecteur d'expression comportant une séquence d'ADN constituée par un enchaînement de nucléotides dans la séquence SEQ ID N* 1 ou SEQ ID N• 2, récupération du polypeptide exprimé et purification.
Les polypeptides au sens de la présente invention sont de plusieurs types.
Il peut s'agir de fragments ou dérivés obtenus par modification génétique et/ou chimique à partir des séquences SEQ ID N• 1 ou SEQ ID N• 2, ou des séquences SEQ ID N• 3 ou SEQ ID N• 4. De tels fragments ou dérivés conservent au moins en partie l' activité d' inhiber la RNase L ou d' inhiber les polypeptides correspondant à ces séquences. Les séquences de nucléotides ainsi modifiées d'une part, et les séquences de polypeptides ainsi modifiées d'autre part entrent dans le champ de l'invention.
Par modification de nature génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, délétion, substitution, addition et/ou modification d'un ou plusieurs nucléotides ou acides aminés des séquences définies plus haut.
Ces modifications permettent, si on le souhaite, d'adapter, notamment, les séquences des nucléotides définies ci-dessus à l'expression dans un type de vecteur ou d'hôte, de faciliter leur pénétration cellulaire ou d'augmenter l' activité d'inhibition. L'activité d'inhibition des polypeptides peut être mise en évidence selon différents protocoles décrits dans les exemples.
D'une manière avantageuse, les polypeptides définis ci-dessus peuvent être obtenus sous une forme débarassée de tout contaminant et en quantité suffisante pour les applications biologiques décrites ci-après.
Pour obtenir les polypeptides de l'invention, comme illustré par les exemples, on procède au criblage d'une banque d'ADNc à l'aide d'un 2-5A marqué, par exemple, par un élément radioactif ; on isole le gène recherché, puis on l'introduit dans un vecteur d'expression et on transfecte une cellule hôte avec ce vecteur. Après expression du polypeptide à activité inhibitrice de la RNase L recherché, on récupère ce dernier après lyse des cellules, et on le soumet à au moins une étape de purification.
Pour la production du polypeptide, on utilisera des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme baculovirus, les cellules d'insectes et les levures, avantageusement tels que disponibles dans le commerce.
Pour l'étape de purification, on peut utiliser des techniques de biochimie classique, par exemple l' isoélectrofocalisation et/ou on utilise des vecteurs également disponibles dans le commerce comportant des séquences permettant des purifications par affinité, anticorps ou nickel par exemple.
L'invention vise également les vecteurs d' expression contenant au moins 1 ' une des séquences de nucléotides définies ci-dessus soumises au contrôle d'un promoteur approprié, en particulier, les vecteurs correspondant à une partie au moins de SEQ ID N• 1 ou SEQ ID N• 2, ou leurs séquences anti-sens. Les cellules hôtes transfectées par ces vecteurs et qui comprennent les protéines recombinantes exprimées font également partie de l'invention. Les cellules utilisées pour les transfections correspondent avantageusement à celles mentionnées ci-dessus, disponibles dans le commerce.
L'étude des propriétés des polypeptides définis ci-dessus a permis de mettre en évidence, comme déjà souligné, un effet inhibiteur de RNase L et, par voie de conséquence, de son activation dépendante de 2-5 A. Ces polypeptides se lient à la RNAse L et inhibent son activité enzymatique (voir exemple 4, figure 5 et exemple 5, figure 6).
On rappelle que la RNase L a tout d'abord été décrite comme un complexe moléculaire d'environ 200 kDa (Slattery et al, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4778-4782). Mais son poids moléculaire varie avec les conditions d' analyse utilisées comme la concentration en protéines (Floyd-Smith et al, J. Biol. Chem. 257, 8584- 8587), et l'origine des cellules (Bisbal et al, Eur. J. Biochem. 179, 595-602).
Zhou et al (1993, Cell, 72, 753-765) ont publié le clonage d'une protéine de 80 KD appelée 2DR, qui lie le 2-5A et clive le poly(U) après traduction in vitro dans le lysat de réticulocyte de lapin, mais pas dans le lysat de germe de blé.
Récemment, grâce à un anticorps monoclonal spécifique, les inventeurs ont caractérisé une protéine, liant le RNA, associée à la protéine de 80 KD liant le 2- 5A. Les inventeurs ont donc proposé un modèle où la RNase L de haut poids moléculaire est en fait un complexe composé d'au moins deux protéines : la protéine liant le 2-5A (2-5ABP) et la protéine liant le RNA (RNABP) (Salehzada et al, 1993, J. Biol. Chem., 268, 7733-7740). Les polypeptides de l' invention s' associent spécifiquement à 2-5ABP et RNABP comme le montre leur co- immunoprécipitation avec l' anticorps monoclonal MAb3 (exemple 5, figure 6).
Les essais effectués avec les polypeptides de l' invention, dont des exemples illustratifs sont donnés ci-après, ont montré qu'ils sont capables d'inhiber l' activité RNase L, aussi bien dans des extraits cellulaires (exemple 4, figure 5) que dans des cellules intactes (exemple 9, figure 10), ainsi que l'activité de liaison au 2-5A de la protéine 2DR exprimée dans un système acellulaire (exemple 4, figure 5).
L'inhibition observée dépend du rapport entre la RNase L et le polypeptide et ne résulte pas d'une dégradation du 2-5A ou d'une modification stable de la RNase L.
Ils ne sont pas régulés par les interférons mais sont associés à la RNase L et co-précipitent avec le complexe RNase L lorsqu'on les met en contact avec un anticorps monoclonal spécifique de la RNase L.
Ils constituent donc des régulateurs du système
2-5A/RNase L, qui correspond à l'une des voies d'action des interférons dans les cellules de mammifères.
Les polypeptides de l'invention sont avantageusement utilisés pour stabiliser les ARN dans des extraits cellulaires lors des techniques de biologie moléculaire (exemple 8 figure 9).
Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation des polypeptides définis ci-dessus comme agents cibles pour détecter des produits capables d'inhiber leur propre effet inhibiteur et permettant ainsi de réguler le fonctionnement du système 2-5A/RNase L, et par là d'augmenter l'action des interférons. L' invention vise donc un procédé de criblage de molécules ou substances pour détecter chez ces dernières une activité dirigée contre l' activité inhibitrice de la RNase L des polypeptides de l'invention.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'on met en contact un polypeptide de l' invention avec une molécule ou substance à tester, et on détecte la réactivation de la RNase L, à nouveau capable de lier le 2-5A, ou l'inhibition de son inhibiteur.
Pour mettre en évidence l' activité de la RNase L, on procédera avantageusement comme décrit dans 1'exemple 4.
Des produits capables d' inhiber l' activité inhibitrice vis-à-vis de la RNase L des polypeptides de 1' invention sont constitués par des anticorps polyclonaux et monoclonaux.
Ces anticorps sont également utilisables en diagnostic pour suivre l 'évolution de RLI durant une infection virale.
Ces anticorps polyclonaux et monoclonaux sont des produits nouveaux et, en tant que tels, entrent également dans le champ de l' invention.
Ces anticorps dirigés contre les polypeptides de l' invention sont préparés avantageusement selon les techniques classiques.
Une autre application des polypeptides de
1' invention consiste dans le développement de produits capables d'empêcher la production d'inhibiteurs de RNase L par des agents infectieux ou de neutraliser les inhibiteurs produits par ces agents.
Des virus, comme EMCV, induisent en effet des inhibiteurs de RNase L, cette induction pouvant être inhibée par l' interféron lorsque l' action de ce dernier est capable de rétablir l'activité au système 2-5A/RNase L. Mais lorsque le système 2-5A/RNase L se trouve déséquilibré, l'interféron ne peut plus exercer son effet anti-viral et l'infection virale progresse.
L'invention fournit donc des moyens, avec les polypeptides définis ci-dessus, pour rechercher des produits actifs vis-à-vis des inhibiteurs de RNase L induits par les virus.
L'invention vise particulièrement l'utilisation de séquences de nucléotides anti-sens définies plus haut pour transfecter des cellules de mammifères (voir exemple 9, figure 10 et exemple 11 figures 12 A à F).
L'ADN anti-sens pourra être contenu dans différents vecteurs tels que des rétrovirus ou des virus recombinants modifiés pour être utilisables chez le mammifère en opérant selon les techniques classiques du génie génétique.
La première étape consiste à obtenir des animaux transgéniques dans lesquels le gène de l'inhibiteur de la RNase L aura été rendu inactif, ou au contraire sera surexprimé.
On opère, selon les techniques décrites dans
"Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual", Hogan B et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, Ed. Cold Spring Harbor. Par exemple l'ADN pourra être microinjecté directement dans le pronucleus des oeufs fertilisés (voir Constantitini et Lacy, 1981, Nature, 294, pages 92 à 94). On pourra aussi infecter l' mbryon avec un vecteur rétroviral (Jaenisch, 1976, Proc. Nat. Se 1973, 1260-1264). Cette technique peut aussi permettre l'inactivation du gène (Jaenish et al, 1983, Cell, 32, 209-216). Une autre technique pour inactiver le gène pourra consister dans la microinjection d'un gène codant pour un ARN anti-sens (Izant et Weintraub, 1985, Science, 229-345-352). Ces animaux permettent l'étude de leur sensibilité à des virus induisant l' inhibiteur de la RNase L, comme l' EMCV, en liaison ou non avec un traitement à l'IFN. En effectuant des prélèvements chez l'animal, on détermine le taux de virus produit et, en comparant à des animaux témoins, on suit l'évolution de l'infection.
Dans une autre étape, on réalise les expériences sur un autre modèle animal sensible à une infection équivalente au système HIV chez l'homme pour exprimer sélectivement un anti-sens de l'inhibiteur dans les cellules infectées par le virus.
On procède soit par pilotage des virus ou rétrovirus en prenant pour cible le CD4, ou en obtenant une expression sélective de l' anti-sens dans les cellules infectées seulement, celui-ci étant sous le contrôle du promoteur naturel du gène de l' inhibiteur de la RNase L qui est induit par le virus lui-même.
L'invention fournit ainsi les moyens d'étudier l'évolution d'une infection chez ces modèles animaux.
Les vecteurs utilisés dans le modèle ci-dessus sont contenus dans des compositions pharmaceutiques en association avec un véhicule inerte. Ces compositions se présentent avantageusement sous forme de solution stérile, isotonique ou sont conservées sous forme lyophilisée.
Ces solutions sont administrées sous forme de sprays par voie intra-nasale, ou par voie orale, intraveineuse ou intramusculaire.
D'autres caractéristiques et avantages de l' invention sont donnés dans les exemples qui suivent qui se rapportent aux polypeptides inhibiteurs de séquence SEQ ID N• 3 ou SEQ ID N• 4, appelés respectivement RLI et H2ABP. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 12, où
- la figure 1 représente les constructions des ADNc codant pour les polypeptides selon l'invention,
- la figure 2, la séquence de nuclétotides de l'ADNc du polypeptide RLI et la séquence d' acides aminés correspondante,
- les figures 3A et 3B, les analyses par transfert Northern d'ARNm de cellules HeLa, traitées ou non par de l'interféron, hybridées avec différentes sondes,
- les figures 4A à 4C, les autoradiographies après SDS-PAGE de produits de traduction de l'ADNc de RLI et du polypeptide 2DR dans deux systèmes de traduction différents, et les résultats de l'hybridation avec une sonde 2-5ApCp.
- les figures 5A à 5C, les effets d'inhibition du RLI sur la RNase L dans un système de réticulocyte de lapin ou les cellules humaines Daudi ou Hela,
- la figure 6, l'association grâce à 1' immunoprécipitation par un anticorps monoclonal spécifique de la RNase L, de RLI associé à la 2DR ou la RNase L,
- la figure 7, la stabilité du 2-5A en présence de RLI,
- la figure 8, l'absence de dégradation ou de modification stable de la RNase L par RLI,
- la figure 9, la stabilisation des ARN dans un extrait de réticulocyte en présence de RLI,
- les figures 10A et 10B, la réponse à 1 ' interféron des cellules transfectées par la construction sens de H2ABP inhibant la RNase L,
- la figure 11, l'induction de l'ARNm de RLI par EMCV, - les figures 12A à 12C, l'activité de la RNase
L lors de l'infection par EMCV de cellules HeLa transfectees par un vecteur vide, la construction sens H2ABP inhibant la RNase L ou la construction anti-sens de H2ABP inhibant RLI, en présence ou non d' interféron,
- les figures 12 D,E,F, les mêmes cellules mais après infection par VSV,
- la figure 13, le taux d'ARNm de RLI après infection par HIV, et
- la figure 14, la localisation de RLI sur les chromosomes.
On indique tout d'abord ci-après les produits et méthodes utilisées dans les exemples donnés pour illustrer l' invention.
I - Produits et méthodes
Cellules et extraits cellulaires
On utilise des cellules Daudi humaines comme source d'ARNm compte tenu de leur niveau élevé en activité liant 2-5A. Ces cellules sont cultivées en suspension et maintenues dans un milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 % (v/v) de sérum de veau foetal, 60 Ul/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine.
Les cellules HeLa sont mises en culture dans le même milieu avec de la glutamine 2 mM.
Les cellules sont traitées avec de l' interféron α/β humain (IFN α/β Hu en abrégé).
Les extraits cellulaires sont préparés comme décrit par Salehzada et al dans J. Biol. Chem., 1993, 268, pages 7733 - 7740. En bref, les cellules sont remises en suspension dans 2 volumes de tampon hypotoniques, brisées dans un homogénéiseur et centrifugées à 10000 g.
Isolement des clones d'ADNc La technique utilisée pour isoler les clones d'ADNc de RLI est donnée dans 1 'exemple 1.
Pour l'ADNc de 2DR, on opère par PCR avec des amorces déterminées à partir de la séquence publiée par Zhou et al dans Cell, 1993, 72, 753-765.
Radio-liaison de la RNase L et marquage radio- covalent sur affinité de la RNase L.
On réalise l'essai de radio-liaison et le procédé de marquage covalent en utilisant, comme sources de RNase L, des extraits cellulaires SIO, des lysats de réticulocyte de lapin ou des extraits de germes de blé (avec ou sans les différentes protéines traduites clonées).
On utilise comme sonde de la 2-5A4-3'-[32p]pCp (3000 Ci/mmole) (voir Bayard et al, Biochemistry, 1986, 25, 3730-3736).
Analyse de l'ARN
L'ARN cellulaire total est préparé en utilisant le procédé au chlorure de lithium - thiocyanate de guanidine selon la méthode de Cathala et al dans DNA, 1983, 4, 327-333.
Les hybridations par transfert Northern ( transfert passif d' acides nucléiques sur membranes) sont effectuées selon les techniques standards comme décrit par Sambrook et al dans Molecular Cloning : a laboratory manual, 1982 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New-York).
Les sondes sont synthétisées par procédé multi- amorce (kit Ready-to-go, Pharmacia).
Après auto-radiographie, les ARNm sont quantifiés par analyse d'image à l'aide du programme Bioimage sur une station d'analyse d'images Millipore (Sun Station). Chaque piste est normalisée avec la sonde GAPDH
(glycéraldehyde-3-phosphate déhydrogénase).
II Exemples :
Exemple I: ADNC de RLI
(illustré par la figure 1)
. Isolement des clones d'ADNc
On établit une banque d'ADNc de cellules Daudi λ ZAP. On effectue un criblage avec 2-5A4-3'-[32P]pCp
(3000 Ci/mmole), comme sonde radio-marquée, en utilisant la technique développée pour la renaturation de l'activité RNase L sur filtre. On imprègne des filtres de nitrocellulose de IPTG 10 mM, on les sèche et on les applique sur des plaques de phage pendant 3 heures à
37'C. Les filtres sont alors rincés avec un tampon A saturé avec 5 % (v/v) de lait écrémé et soumis à nouveau à un rinçage avec le tampon A sans lait. On effectue ensuite une incubation durant environ 14 heures à 4ºC dans le tampon A avec du 2-5A4-3'-[32P]pCp ( 5x105 dpm/filtre). La composition du tampon A est la suivante :
10 mM Hepes, pH 7,5, 80 mM de KCl, 5 mM de Mg(OAc)2, 1 mM de EDTA, 5 % (v/v) de glycérol, 20 mM de ß- mercaptoéthanol.
Après lavage dans le tampon A, les filtres sont auto-radiographiés sur films.
On isole ainsi un clone positif contenant une insertion de 2861 pb appelé H2ABP (figure 2). Cette insertion comporte un initiateur ATG en position 125 (voir figure 2). Il est traduit sous forme d'une protéine de 39 kDa dans un lysat de réticulocyte de lapin ou un extrait de germe de blé. Il présente un cadre ouvert de lecture à partir du premier nucleotide.
On utilise une amorce interne déterminée à partir de la séquence de H2APB pour isoler par PCR ancrée un ADNc complet de 3568 pb codant pour la RLI (voir figure 1).
En bref, on ajoute à une extrémité d'un ADNc de polydT des nucléotides dG avec une terminal transférase.
Cet ADNc (0,5 μg) est amplifié par PCR (30 cycles) dans un volume final de 50 μl en utilisant une amorce 5' polydC avec des sites Pstl et BamHl (5' TTTCTGCAGGATCCCCCCCCCCCC) et une amorce interne (5' CACTTAGATCATGTTCCACCACAAT 3') comme illustré sur la figure 1.
Ce fragment d'ADNc de 924 pb, désigné par PCR sur la figure 1, qui chevauche le clone H2ABP de 217 pb, est clone dans le site BglII. L'ADNc complet de RLI contient 707 pb additionnelles du côté 5' de H2ABP.
. Analyse de la séquence de nucléotides (illustrée par la figure 2)
On effectue un séquençage de H2ABP dans pSK (pBluescript II SK, Stratagène) selon la méthode de séquençage au didéoxy nucleotide de Sanger (kit de séquençage T7, Pharmacia) après les délétions progressives 3'.
Ces délétions sont engendrées par digestion de nucléase avec l'exonucléase III-S1, suivie d'un remplissage avec l'ΑDN de polymérase Klenow (Pharmacia).
La séquence entière d'ADNc est séquencée selon la méthode Sanger et des amorces internes. Cette séquence avec celle correspondante en acides aminés est représentée sur la figure 2.
L'ADNc de RLI présente une région non codante 5' de 118 nucléotides, un cadre ouvert de lecture s 'étendant jusqu'au nucleotide 1914 et une longue région 3' non traduite de 1654 pb. Le cadre ouvert de lecture code pour un polypeptide de 599 acides aminés, de poids moléculaire 67,515.
Le codon ATG au début du cadre ouvert de lecture présente les caractéristiques d'un codon initiateur fort, c'est-à-dire une purine en position -3 et un G en position +4.
L'ADNc de RLI contient deux sites de liaison répétés ATP/GTP ou motifs du type boucle P : l'un allant des résidus 110 à 117 et l'autre des résidus 379 à 386 (voir les rectangles vides dans la figure 2).
Dans la région non codante 3', les séquences de signal de polyadénylation AATAAA sont soulignés et les séquences ATTTA pouvant correspondre à une instabilité sont soulignées de deux traits.
Dans la séquence d'acides aminés, entre les acides aminés 55 et 66, on constate une homologie complète de RLI avec le motif CX2CX2CX3C: 4Fe4S - Ferredoxine (voir rectangle avec carrés noirs sur la figure 2).
On note également une répétition interne de 128 acides aminés avec une homologie de 53 % démarrant aux acides aminés 200 et 440. (ces parties sont soulignées en gras dans la figure 2).
Les rectangles grisés correspondent à un site de phosphorylation potentiel PCK.
RLI présente un nombre élevé de groupes thiol et se révèle très riche en résidus leucine.
Son point isoélectrique estimé est de 8,7.
Exemple 2 : Régulation de l'expression de l'ARNm de RLI par l' interféron (illustrée sur la figure 3)
Dans une première série d'expériences, on traite des cellules HeLa avec 103 U/ml de IFN α/β Hu pendant 2, 4, 6, 8, 10, 18 et 24 heures. L'ARN cytoplasmique total est extrait des cellules et analysé par transfert Northern. Les mêmes expériences sont réalisées sur des cellules HeLa non traitées. Les ARN (20 μg) sont fractionnés sur un gel d ' agarose à 1,2% (p/v), et hybrides avec une sonde d 'ADNc de RLI, avec une sonde humaine codant pour une protéine de 15 kDa induite par IFN, ou avec une sonde humaine GAPDH (glycéraldéhyde- 3-phosphate déhydrogénase). Le filtre est soumis à une autoradiographie pendant 5 h dans l' essai avec la sonde GAPDH et pendant 12 h dans les essais avec les autres sondes. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 3A. L'examen de cette figure montre que l'ADNc de RLI s 'hybride avec deux ARNm cellulaires de 3,5 kb et de 2,8 kb dans les cellules HeLa. Le même résultat est obtenu dans des cellules Daudi et CEM.
On constate qu'un traitement avec de
1' interféron humain α/β, même à des concentrations élevées, ne régule pas les deux ARNm qui s 'hybrident avec les clones de RLI.
La durée du traitement à l'interféron n'entraîne pas de variation quantitative de ces ARNm.
Les cellules répondent cependant normalement au traitement à l' interféron. En effet, en opérant selon les mêmes conditions, on induit une protéine de 15 kDa déjà décrite comme étant induite par un traitement à l'interféron (voir Blomstrom et al, J. Biol. Chem., 1986, 261, 8811-8816).
Pour étudier les différences entre les ARNm de 2,8 et 3,5 pb, on a effectué une autre série d'expériences consistant en une analyse par transfert Northern de l'ARN cytoplasmique total extrait des cellules HeLa. Les ARN (20 μg) ont été fractionnés sur gel d' agarose à 1,2 % (p/v) et hybrides avec deux sondes d'ADNc de RLI décrites dans la figure 1, à savoir une sonde de 762 pb (A dans figure 3B), spécifique de l'extrémité 5' de RLI, et une sonde de 764pb (B dans la figure 3B) représentant son extrémité 3'.
On constate que la sonde A s' hybride avec les deux ARNm tandis que la sonde B s 'hybride uniquement avec l'ARNm le plus long. Ces deux ARNm diffèrent donc dans leur région 3' non traduites. La similarité entre les tailles des deux ARNm naturels et celles des ADNc clones correspond à une pure coïncidence.
Exemple 3 : Synthèse in vitro de l'ARNm codant pour RLI et 2DR et de ces polypeptides.
(illustrée par le figure 4)
. Transcription des ADNc
On effectue la transcription avec de la T3 polymérase en présence de m7GtS')ppp(5')G en opérant selon les prescriptions du fabricant (Promega).
L'ARN est analysé et quantifié par électrophorèse sur des gels d' agarose 1,2 % (p/v) dans un tampon TBE (50 mM Tris pH 8; 50 mM d'acide borique, 1 mM d'EDTA).
L'ARN est extrait avec du phénol/ dichlorométhane (v/v) et précipité avec de l'éthanol, NaCl 250 mM.
. Traduction des ARNm
On effectue la traduction in vitro en présence de méthionine 35S dans deux systèmes de traduction acellulaires, à savoir dans les lysats de réticulocyte de lapin (pistes 1 et 2 de la figure 4A) (avec ou sans microsomes pancréatiques de chien), où le système 2-5/RNase L est présent, ou dans des extraits de germe de blé (pistes 3 et 4), qui ne comporte pas ce système. On procède selon les prescriptions du fabricant (Promega). Les produits sont analysés par SDS-PAGE et autoradiographiés. Sur la figure 4A, on rapporte les résultats obtenus après traduction d'ADNc de RLI (pistes 2 et 4) et de 2DR (pistes 1 et 3).
L'expression de l'ADNc complet de RLI dans des extraits de germe de blé ou de réticulocytes de lapin, conduit à un seul polypeptide de 68 kDa comme prévu (fig 4, pistes 2 et 4).
La traduction de l'ADNc de 2DR donne un seul polypeptide de 80 kDa (figure 4A, pistes 1 et 3). Le niveau d'expression est légèrement plus faible dans
1 ' extrait de germe de blé par rapport au lysat de réticulocytes pour les deux clones.
On n'observe pas de modification post- traductionnelle de ces polypeptides lorsqu'ils sont traduits en présence de membranes de microsomes pancréatiques de chien).
Dans une autre série d'expériences, on a analysé divers extraits par SDS-PAGE, transfert Western et hybridation avec l'anticorps MAb3, spécifique du complexe RNase L. Les autoradiographies obtenues sont données sur la figure 4B, la piste 1 correspond aux extraits de réticulocyte de lapin sans ARNm, la piste 2 à ces extraits après traduction de 2DR et la piste 3 après traduction de RLI, la piste 4 aux extraits de germe de blé sans ARNm, la piste 5 aux extraits après traduction de 2DR et la piste 6 après traduction de RLI.
En comparant les pistes 1 d'une part et 2 et 3 d'autre part, on s'aperçoit que seul le polypeptide de 80 kDa ( RNABP) est révélé dans l'extrait de réticulocyte soit avant soit après traduction (comparer la piste 1 aux pistes 2 et 3).
De même l'anticorps monoclonal ne reconnaît aucune protéine dans l'extrait de germe de blé où le système 2-5A/RNase L n'existe pas et en conséquence RNABP est absente.
Dans une troisième série d'essais, on dépose les produits de traduction de 2DR et de RLI sur des feuilles de nitrocellulose. On soumet les produits à une incubation avec la sonde 2-5ApCp, selon le protocole utilisé pour cribler la banque λZAP. On procède ensuite à des analyses par autoradiographie. Les autoradiographes sont donnés sur la figure 4C, où "O" correspond à une expérience dans le germe de blé ou dans le réticulocyte de lapin sans RNase L, 2DR ou RLI; "RLI" à des expériences avec 0,8 x 10-15 moles de RLI aussi bien dans les extraits de germe de blé que dans ceux de réticulocytes "2DR" à des expériences avec 1,3 x 10-15 moles de 2DR dans des extraits de germe de blé ou de réticulocyte.
On constate une légère liaison de RLI à 2-5ApCp dans l'extrait de germe de blé.
De manière surprenante on observe une diminution de la liaison de 2-5ApCp par la RNase L endogène lorsque RLI est exprimé dans un lysat de réticulocyte de lapin.
Une augmentation de la liaison de 2-5ApCp est en revanche clairement observée lorsque 2DR est exprimé dans les extraits de germe de blé ou ceux de réticulocytes de lapin (fig 4c).
Cet exemple montre que RLI ne lie que faiblement le 2-5A, comparé à la 2DR. De plus, lorsque
RLI et 2DR sont présents en même temps dans l'extrait de réticulocyte, on a une inhibition de la fixation du 2-5A par la 2DR (RNase L) endogène.
Exemple 4 : Mise en évidence de l'effet inhibiteur de RLI sur la RNase L selon la dose,
(illustrée par la figure 5) . inhibition de la liaison de la RNase L au 2-5
A.L
On rapporte ci-après trois séries d'expériences effectuées dans le cadre de cette étude.
a) On réalise des traductions dans des extraits de réticulocytes ou de germe de blé d'ARNm codant pour la luciférase, RLI ou 2DR.
Différentes concentrations des produits de traduction sont ajoutées aux extraits de réticulocytes ou de germe de blé, ainsi qu'à un extrait dans lequel l'ARNm de 2DR a déjà été exprimé.
On établit donc différents rapports entre RLI (ou la luciférase), la RNase L endogène et 2DR exprimé in vitro.
On étudie la liaison du 2-5 A à la RNase L de ces extraits dans des essais de radio-liaison ou de procédé de marquage covalent.
Les résultats sont donnés sur la figure 5A exprimés en % de 2-5 ApCp lié (100 % correspondant à la liaison obtenue lorsque 2DR seule est exprimée).
Sur cette figure, la courbe
Figure imgf000024_0001
correspond à un extrait réticulocyte + luciférase ;
Figure imgf000024_0002
(-4-) à un extrait réticulocyte + RLI ;
Figure imgf000024_0004
à un extrait réticulocyte + 2DR + RLI ; à un germe de blé + 2DR + RLI.
Figure imgf000024_0003
L'expression de RLI dans les extraits de réticulocytes conduit à une diminution importante, dépendante de la dose, dans la radio-liaison et la liaison radio-covalente de la RNase L endogène à 2-5ApCp dans le lysat de réticulocyte (figure 5A; figure 5C, pistes 1 et 2).
Comme on s'y attendait, l'expression de 2DR seul, dans les extraits de germe de blé ou de réticulocytes, augmente la liaison à 2-5ApCp dans les deux essais (figure 5A; figure 5C piste 3). La co-expression de RLI conduit à une inhibition de la liaison à 2-5ApCp par 2DR que l'on procède selon l'essai de radio-liaison ou l'esssai radio- covalent (figure 5A; figure 5C pistes 3 et 5).
On n'observe aucune inhibition de la RNase L endogène dans 1 'extrait de réticulocytes ou celui de 2DR exprimé, après addition d'une protéine sans rapport avec le processus étudié telle que la luciférase (figure 5A; figure 5C pistes 3 et 4) ce qui sert de témoin.
Le même phénomène est observé avec d'autres extraits cellulaires.
A titre d'exemple, l'addition de RLI à des extraits de cellules Daudi ou de cellules HeLa inhibe la liaison de la RNase L au 2-5ApCp (fig 5B).
Il est intéressant de noter que la traduction de RLI dans des extraits de germe de blé n'inhibe pas la liaison de 2DR au 2-5ApCp (fig 5A).
Cette différence entre les deux systèmes de traduction pourrait refléter des différences dans les modifications post-traductionnelles de la protéine.
L'inhibition de l'activité de 2DR sous l'effet de RLI ne résulte pas d'une compétition pour le 2-5A.
En effet, l'inhibition de la liaison de 2DR au
2-5ApCp n'est pas modifiée lorsqu'on effectue l'expérience avec des concentrations croissantes de 2- 5ApCp dès lors que le rapport entre 2DR et RLI n'est pas modifié.
On notera avec intérêt que le clone initial tronqué H2ABP présente les mêmes propriétés que le clone complet. Il inhibe la liaison de la RNase L endogène, ou de la 2DR exprimée in vitro, au 2-5ApCp.
Cet exemple montre clairement que RLI inhibe la liaison de la RNase L au 2-5 A, et ce dans différents systèmes cellulaires. De plus, il apparaît que cette inhibition n' est pas due à une inhibition entre les deux protéines pour la fixation au 2-5A.
On remarquera en outre que la figure 5A illustre que l' activation du complexe dépend de la stoechométrie entre RLI et la RNase L, ce qui présente un intérêt pour l'étude de l'implication de la RNase L dans les situations normales comme la croissance ou la différenciation, mais aussi dans des cas pathologiques tels que l'infection virale ou des cancers.
Exemple 5 : Etude de l'association de RLI avec la RNase L ou 2 DR (illustration par la figure 6).
Après traduction, en présence de méthionine 35s, des ARNm RLI et 2 DR dans des lysats de germe de blé ou de réticulocyte de lapin, on réalise une immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal MAb3- Pour l'immuno-précipitation, les extraits cellulaires ou les incubations des produits de traduction sont soumis à incubation durant 3 heures, à température ambiante, avec une dilution de 1/1000 de MAb3 ou d'un anticorps témoin.
Les complexes RNase L-anticorps sont soumis à incubation durant environ 14 heures à 4*C avec de la protéine A-Sépharose (Pharmacia) et récupérés par centrifugation. Les billes sont lavées plusieurs fois avec un tampon Tris 10 mM (pH 7,4), 0,5 % (v/v) d'aprotinine, 1 % (v/v) de NP40, 2 mM d'EDTA, 150 mM de NaCl, et remises en suspension dans un volume de tampon Tris 300 mM (pH 8,9), 5 % (p/v) de SDS, 5 % (v/v) de β- mercaptoéthanol, 20 % v/v de glycérol.
La protéine A-Sépharose est chauffée 5 min. à 95*C et les protéines immuno-précipitées sont analysées par SDS-PAGE 10 % (p/v).
Le gel est séché et soumis à une autoradiographie. Les résultats sont donnés sur la figure 6. On constate que, pistes 2, 4 et 5, après traduction dans le réticulocyte, on a une immunoprécipitation des protéines, RLI piste 2, 2DR piste 4, ou co-immunoprécipitation des deux, piste 5. Cette immunoprécipitation se fait via l'association à la RNABP, protéine reconnue par 1' anticorps et présente dans le lysat de réticulocyte.
En revanche lorsque ces protéines sont traduites dans le germe de blé (pistes 1 et 3) d 'où la RNABP est absente, on n'observe aucune immunopré- cipitation.
Grâce à l'utilisation d'un anticorps spécifique, on a bien démontré dans cet exemple que la protéine RLI s'associe bien à la protéine qu'il inhibe, la 2DR ou RNase L.
Exemple 6 : Stabilité du 2-5 ApCp (illustrée par la figure 7)
Les extraits de réticulocyte sont complémentés ou non avec de l'ARNm de RLI ou de 2DR et soumis à incubation 1 heure à 30ºC dans des conditions de traduction.
On ajoute le 2-5 ApCp à ces extraits, puis on soumet l'ensemble à incubation à 4*C pendant 15 min. (comme pour la radio-liaison) ou à 37ºC à différentes périodes de temps comme indiqué dans la figure 7.
On ajoute un tampon contenant 50 % (v/v) de formamide, 1 % (v/v) de bleu de bromophénol et 1 % (v/v) de xylène cyanol.
Les échantillons sont soumis à ébullition 3 min et centrifugés à 10000 g. Les surnageants sont chargés sur des gels de polyacrylamide à 20 % (p/v) contenant de l'urée 7 M. Les échantillons sont analysés par électrophorèse à 1100-1600 volts jusqu'à obtention d'une coloration de 15 cm à partir du bas du gel avec le bleu de bromophénol. Le gel humide est exposé à une pellicule Kodak.
On n'observe aucune dégradation significative dans les extraits de réticulocyte + RLI, que ce soit à +4ºC (comparer pistes 1 et 2) ou à 37ºC (comparer pistes 4 à 9).
Cet exemple montre que l' inhibition de la fixation du 2-5A n'est pas due à sa dégradation par RLI.
Exemple 7 : Réactivation de la RNase L après sa séparation de RLI (illustré par la figure 8)
On traduit l'ARNm de RLI dans un extrait de réticulocyte.
On opère dans les mêmes conditions que celles illustrées par l'exemple 4 et la figure 5A ou C, mais la fixation de 2-5 ApCp sur la RNase L est réalisée après que la RNase L ait été séparée de RLI par fractionnement en gel PAGE-SDS.
En comparant les pistes 1 et 2, on constate que la quantité de RNase L est la même pour la piste 1 (réticulocyte seul) ou la piste 2 (réticulocyte + RLI).
L'exemple montre donc que le RLI n'inhibe pas la RNase L par dégradation de cette dernière ou modification irréversible.
Exemple 8 : Stabilisation des ARNm en présence de RLI (illustré par la figure 9)
Les extraits de réticulocytes de lapin sont incubés 1 h à 30ºC dans les conditions de traduction (1) sans ARNm ajoutés (retic), (2) en ajoutant l'ARNm de RLI (retic + RLI), (3) en ajoutant l'ARNm de 2DR (retic + 2 DR), (4) en ajoutant l'ARNm de 2DR et RLI (retic + 2DR + RLI). Puis du 2-5A4 est ajouté à 100 nm (+) ou non (-) et les extraits sont à nouveau incubés pour 30 min à 30ºC. Les ARN sont isolés et analysés sur un gel d' agarose 1,2 % (p/v). Les ARN et leurs produits de dégradation sont quantifiés par analyse d'image.
Cet exemple montre que, dans un extrait de réticulocyte, les ARN sont stabilisés en présence de RLI et ceci même en surexprimant la 2DR.
Exemple 9 : Activité du RLI dans les cellules intactes (illustré par la figure 10)
Vecteurs d'expression et transfections
L'ADNc humain H2ABP, qui code pour une forme active tronquée de RLI, est sous-cloné directionnellement dans pcDNAIneo ( Invitrogen) en opérant selon les méthodes standard décrites par Sambrook et al dans la référence ci-dessus. H2ABP/pcDNAIneo ou le plasmide pcDNAneoI
(chacun à raison de 7 μg) sont transfectés dans des cellules HeLa par co-précipitation avec du phosphate de calcium. Les transfectants stables sont choisis en cultivant les cellules en présence de 1 mg/ml de G418
(Gibco/BRL).
On isole des clones individuels pour l' analyse de l'expression de l'ADNc transfecté. Le clone exprimant les plus hauts niveaux d'ADNc est choisi pour poursuivre les études .
Activité anti-virale des interférons.
Les cellules pcDNAIneo ou H2ABP/pcDNAIneo sont ensemencées à raison de 105 cellules par puits. Ces cellules sont traitées 24 heures plus tard avec différentes dilutions d'IFN α/β Hu pendant 20 heures.
Les cellules sont alors infectées avec le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) ou celui de l'encéphalo-myocardite (EMCV) à une multiplicité d'infections (m.o.i.) de 1,0, pendant 1 heure à 37ºC dans un milieu RPMI supplémenté avec du sérum de veau foetal à 5 % (v/v). On élimine les virus non adsorbés par 3 lavages avec du RPMI contenant 10 % de sérum de veau foetal (v/v).
Les titres en virus sont déterminés 18 heures après comme décrit par Milhaud et al. Ann. Virol, 1983, 134 E 405-416.
Cet exemple montre que la surexpression de RLI dans les cellules humaines HeLa inhibe une partie de l'effet anti-viral de l' interféron pour le virus EMCV et non de VSV (comparer figures 10A à 10B).
Exemple 10 : Induction de 1 'ARNm de RLI par l'EMCV (illustré par la figure 11)
Les cellules HeLa sont infectées à une m.o.i. de 10 par EMCV ou VSV, après ou non traitement par IFN α/β Hu à 1000 U/ml.
Les ARN sont ensuite extraits de ces cellules à différents temps de post-infection, comme décrit dans la figure 11.
Après analyse par Northern Blot de ces messagers en opérant comme indiqué ci-dessus et quantification, la figure 11 montre qu'on observe une induction de l'ARNm de RLI en infectant par EMCV et non par VSV et que cette induction est en partie reversée par un pré-traitement à l'interféron.
Exemple 11 : Etude de l' inhibition de la RNase L dans des transfectants sens ou anti-sens de RLI dans des cellules humaines HeLa (illustrée par les figures 12A à F).
Les cellules HeLa humaines ont été transfectees par les vecteurs d'expression pcDNAI neo (HeLa W4),
H2ABP sens/pcDNAIneo (HeLa 7.3) et H2ABP anti- sens/pcDNAIneo (HeLa 8.2) selon la technique décrite dans l' exemple précédent. Chaque clone a été ensuite infecté par l'EMCV ou le VSV à une m.o.i. de 1 après ou non avoir été traité par IFN α/β Hu à 1000 U/ml.
En ce qui concerne l'infection par l'EMCV (figure 12A), on voit une inhibition de la liaison du 2- 5A à la RNase L augmentant au cours de l'infection, reversée par l' interféron.
Pour les cellules HeLa 7.3, exprimant plus de RLI, l' inhibition de la liaison du 2-5A est plus précoce et plus forte (figure 12B).
Pour les cellules HeLa 8.2 exprimant l'anti- sens RLI, donc moins de RLI, on n'observe pas au cours de l'infection d'inhibition de la liaison du 2-5A à la RNase L.
Les figures 12 D, E, F, montrent les mêmes transfectants infectés par la VSV, ce virus n'induisant pas l'inhibiteur (comme illustré par la figure 11 de l'exemple précédent), on n'observe pas de variation de la liaison de 2-5A à la RNase L au cours de l' infection.
Dans une autre série d'expériences, les cellules humaines HeLa, des cellules HeLa transfectees par le vecteur pcDNAneoI vide (VV4) et des cellules HeLa transfectees avec l'antisens de RLI dans pcDNAneoI (8.2) sont ensemencées dans des boîtes 24 puits à raison de :
- HeLa : 1,74 x 105 cellules/ml
- 8.2 : 1,19 x 105 cellules/ml
- W4 : 1,47 x 105 cellules/ml.
Le lendemain, on recompte les cellules, on les lave et on infecte par le virus EMCV et VSV à 10 m.o.i.
(multiplicity of infection) dans 1 milieu sans sérum. Une heure après, les cellules sont lavées et laissées pendant
8 h pour l'EMCV, et 15 h pour le VSV. Les virus produits dans les différentes souches de cellules sont alors dosés par dilution limite (Milhaud P.G. et al, (1983) Ann. Virol 134 E, 405-416).
(Pour chaque point, 3 puits ont été utilisés) VSV 10 m.o.i.
HeLa W4 8.2
0,7 x 104 0,2 x 104 104
pfu/10 cellules pfu/10 cellules
EMCV 10 m.o.i.
HeLa W4 8.2
4,3 x 106 2,3 x 106 5 x 105 On constate que les cellules 8.2 qui comportent moins de RLI, et donc en théorie plus d'activité RNase L, produisent moins de virus EMCV contre lequel le système 2-5A est actif, alors que pour le VSV, on n'observe pas de différence entre les différentes cellules.
Exemple 12 : Dosage de l'ARNm de RLI au cours de l' infection par HIV et dosage de la reverse- transcriptase (RT) virale en parallèle indiquant le développement de HIV (figure 13)
. dosage de l'ARNm de RLI.
Des cellules H9 humaines sont infectées par la souche III B de HIV-1 en procédant comme suit :
- amplification du virus III B :
On utilise 2 flacons de 30 ml de cellules H9 à 2 x 10 cellules/ml. Les cellules de chaque flacon sont infectées par 3 ml de virus IIIB et mises à incuber à 37ºC pendant une semaine. On récolte les 2 flacons de 30 ml dans des flacons de 50 ml, on centrifuge à 1200 trs/min à 4ºC pendant 5 min., et on stocke le virus à -80ºC.
- préparation des cellules H9 : On utilise les conditions suivantes (cinétique sur 15 jours environ ; utilisation de 2 x 10
cellules/ml, soit 6 x 106 cellules/point).
Les cellules nécessaires à la cinétique sont placées au P3, puis centrifugées et reprises dans 40 ml de virus HIV souche IIIB (estimation à 10 m.o.i.). On laisse incuber 1 heure à 37ºC.
On ajoute du RPMI/sérum de veau foetal aux cellules infectées et on récolte 30 ml pour le temps 1 heure et on répartit le reste dans des boîtes, soit 30 ml/boite (une boite/jour).
Pour chaque temps de cinétique :
- on compte les cellules,
- on centrifuge les 30 ml dans un flacon de 50 ml, 3 min à 1200 trs/min à 4ºC,
- on récolte 300 μl pour le test RT (à -80'C),
- on enlève le surnageant, puis on rince avec 1 ml de PBS dans un épendorf,
- on centrifuge 3 min. à 1200 trs/min à 4ºC,
- on reprend le culot dans 300 μl de guanidium. On procède ensuite à une extraction classique des ARNs avec LiCl et précipitation par de l'éthanol en opérant selon Cathala G. et al, 1983, DNA 4, 327-333.
Les ARNm sont analysés sur gel d'agarose par transfert sur nitrocellulose, selon Sambrook et al cidessus, une sonde RLI étant utilisée pour l'hybridation.
. dosage de la RT
On utilise :
- le tampon TNE (tampon de lyse) : Tris p117,8 20 mM ; EDTA 1 mM ; NaCl 100 mM ; Triton X-100 0,1 % ; qsp H2O
- le tampon TBβ : Tris 1M ; MgCl2 lOOmM ; KCl 2M ; DTT 0,2M ; EGTA 2mM ; qsp H2O
- du poly rAdT 2DO/ml ; dTTP* 1mCi/ml ; TCA 10 % 12 mM pyrophosphate ; TCA 5 % 12 mM pyrophosphate.
Dans les puits de microplaques à 96 puits, on dépose 50 μl de surnageant et 10 μl de TNE, et on laisse
10 min à 4ºC. On ajoute, par puits, 5 μ de 1 TBβ, 12,5 μ de rA2dT, 2,5 μl de dTTP* ; on laisse incuber 2 h à 37*C et on dépose 50 μl sur papier Watman.
On laisse 5 min dans TCA 10 %, 12 mM pyrophosphate, on soumet à agitation à 4ºC, on rince 3 fois 5 min dans TCA 5 % 12 mM pyrophosphate, puis 2 min dans EtOH 100 %. On sèche alors 15 min aux IR et on procède à un comptage avec scintillant.
Les résulats obtenus sont représentés sur la figure 13 sur laquelle sont indiqués le taux d'ARNm de
RLI en fonction de la durée (en heures) de l'infection par HIV. La courbe correspond à l'ARNm de 3,5 kb de RLI et la courbe
Figure imgf000034_0001
à l'ARNm de 2,8 kb.
L'examen de cette figure montre que la teneur en ARNm décroit tout d'abord lors de la période d'augmentation de l'activité 2-5A, puis augmente juste après le pic de RT. Le virus HIV apparaît donc induire RLI.
Exemple 13 : Localisation de RLI sur les chromosomes
Le gène humain de RLI a été localisé par fluorescence dans une hybridation in situ sur les chromosomes humains de la métaphase, en opérant comme décrit par Taviaux et al dans Genomics, (1993) 15:194-
196.
L'insert de la sonde d'ADNc de RLI (3588 bp) a été marqué avec du biotinyl-16-dUTP. 37 métaphases ont été examinées avec une concentration en sonde de 4 μg/ml.
Un pic principal et deux pics secondaires ont été observés, comme représenté sur la figure 14. Le pic principal se trouve sur le chromosome 4 à la bande q31. Un marquage spécifique a été observé sur 4 chromatides (5 cellules), 3 chromatides (16 cellules), deux chromatides (12 cellules) et 1 chromatide (4 cellules) des homologues du chromosome 4.
Les pics secondaires sont sur les chromosomes lq31 et 7pl5-p21.
77 métaphases ont été étudiées pour déterminer le rapport d'hybridation entre les différents pics pour la sonde RLI.
191 tâches fluorescentes sur 370 (51,5 %) ont été localisées à 4q31, 94 (25,5 %) à 7pl5-p21 et 85 (23%) à lq31).
Pour déterminer si ces trois pics correspondent à des gènes différents de RLI donnant les deux transcripts de 3,5 et 2,8 kb, deux sondes ont été hybridées, 3' RLI (correspondant à 1377 bp dans la région 3' non codante de l'ARNm de RLI) qui est spécifique pour l'ARNm de 3,5 kb de RLI et RLIcod (correspondant aux 1797 bp codantes de l'ARNm de RLI).
Avec 3'RLI, on observe, pour 57 métaphases, 166 taches fluorescentes, 84 (51 %) sont localisées à 4 q31, 42 (25 %) à 7pl5-p21 et 40 (24 %) à lq31.
Avec RLIcod, on observe, pour 50 métaphases, 199 taches fluorescentes, 99 (50 %) étant localisées à 4q31, 43 (22 %) à 7pl5-p21 et 57(28 %) à lq31.
Ces deux sondes donnent les mêmes résultats que l'ADNc total de RLI.
Il s'ensuit que les deux ARNm de 3,5 et 2,8 kb n'apparaissent pas être associés à des gènes différents, étant donné que toutes les sondes s'hybrident avec la même bande et dans la même proportion.
Le gène RLI apparaît localisé sur le chromosome 4q31 comme indiqué par le pic de fluorescence principal. Les deux autres pics, de plus faible intensité, indiqueraient la présence d'autres gènes, présentant une homologie importante, d'au moins 80 %, avec le gène RLI.
Selon toute vraissemblance, les deux gènes à lq25 et 7p15-21 sont des pseudo-gènes.
Le gène de la RNase L est localisé à lq25. Le gène localisé à 7p15-p21 est étroitement lié au gène de l' IFN β2 (7p21).
Les autres composants du système 2-5A sont localisés sur des chromosomes différents : les petites formes de synthétase 2-5A ont été cartographiées aux chromosomes humains 11 et 12.
Les gènes des enzymes de la voie 2-5A ne forment pas de cluster dans le génome humain.
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Séquences de nucléotides, isolées de leur environnement naturel, caractérisées en ce qu'elles sont capables de s'hybrider avec au moins un fragment de la séquence SEQ ID N• 1 ou SEQ ID N• 2 capable d'inhiber la RNase L.
2/ Séquences de nucléotides selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont capables de s'hybrider avec au moins un fragment de la séquence SEQ ID N• 1 ou SEQ ID N• 2 qui code pour un polypeptide.
3/ Séquences de nucléotides, isolées de leur environnement naturel, caractérisées en ce qu'elles correspondent à au moins une partie des séquences SEQ ID N• 1 et SEQ ID N• 2.
4/ Séquences de nucléotides selon la revendication 3, caractérisées en ce qu'elles correspondent à au moins une partie des séquences SEQ ID N• 1 et SEQ ID N• 2, capables de coder pour un polypeptide inhibiteur de la RNase L.
5/ Séquences de nucléotides, isolées de leur environnement naturel, caractérisées en ce qu'elles sont capables de coder, mises en oeuvre selon les techniques classiques de l'ADN recombinant, pour des polypeptides présentant une activité inhibitrice de la RNase L, et comprenant au moins une partie de l' enchaînement d' acides aminés de la séquence SEQ ID N* 3 ou SEQ ID N•4.
6/ Séquence de nucléotides selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu'elle correspond au cadre ouvert de lecture allant de la position 118 à 1914 dans SEQ ID N• 1.
7/ Séquence selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend deux motifs du type boucle P. 8/ Les séquences d' ARN-m correspondant aux séquences selon l'une des revendications 1 à 7.
9/ Les séquences anti-sens correspondant aux séquences selon l' une des revendications précédentes.
10/ Les ADNc correspondent aux séquences selon l'une des revendications 1 à 9.
11/ Séquences d'acides nucléiques selon l'une des revendications précédentes insérées dans un vecteur d'expression pour des polypeptides présentant une activité inhibitrice de la RNase L.
12/ Polypeptides, caractérisés en ce qu'ils possèdent une activité inhibitrice de la RNase L et comprennent au moins une partie de l'enchaînement d'acides aminés de la séquence codée par SEQ ID N• 1 ou par SEQ N• 2.
13/ Polypeptides selon la revendication 12, caractérisés en ce qu' ils comprennent au moins une partie de l'enchaînement d'acides aminés de SEQ ID N* 3 ou dans SEQ ID N• 4.
14/ Polypeptides selon la revendication 12 ou 13, caractérisés en ce qu'ils possèdent dans leur enchaînement d'acides aminés une séquence homologue avec le motif CX2CX2CX3C:4Fe4S - ferredoxine et/ou un nombre élevé de groupes thiol et/ou un nombre élevé de motifs leucine.
15/ Polypeptide selon la revendication 12, caractérisé en ce qu' il correspond à la séquence d'acides aminés codée par le cadre ouvert de lecture dans la séquence SEQ ID N• 1, qu'il comprend 599 acides aminés, et qu'il possède un poids moléculaire évalué à 67,515 kDa et un point isoélectrique estimé à 8,7.
16/ Polypeptides selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisés en ce qu'ils sont tels qu'obtenus par expression, dans une cellule hôte appropriée, selon les techniques de l'ADN recombinant, d' un vecteur d'expression comportant une séquence d'ADN constituée par un enchaînement de nucléotides dans la séquence SEQ ID N• 1 ou SEQ ID N• 2, récupération du polypeptide exprimé et purification.
17/ Procédé d'obtention des polypeptides selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend le criblage d'une banque d'ADNc à l'aide d'un 2- 5A marqué par exemple par un élément radioactif, l'isolement de la séquence nucléique recherchée, son introduction dans un vecteur d'expression, la transfection d'une cellule hôte avec ce vecteur, puis après expression du polypeptide à activité inhibitrice de la RNase codé par ladite séquence nucléique, la récupération de ce dernier, après lyse des cellules, et sa purification.
18/ Vecteurs d'expression contenant au moins l'une des séquences de nucléotides selon l'une des revendications 1 à 10, soumises au contrôle d'un promoteur approprié.
19/ Cellules hôtes transfectees par les vecteurs selon la revendication 18 et qui comprennent les protéines recombinantes exprimées.
20/ Les anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre les polypeptides selon l'une des revendications 12 à 16.
21/ Utilisation des polypeptides selon l'une des revendications 12 à 16 comme agents régulateurs du système 2-5A/RNase L.
22/ Utilisation des polypeptides selon l'une des revendications 12 à 16 comme agents cibles pour détecter des produits capables d'inhiber leur propre effet inhibiteur et permettant ainsi de réguler le fonctionnement du système 2-5A/RNase L, et par là d' augmenter l'action des interférons.
23/ Produits capables d'inhiber l'effet inhibiteur de RNase L des polypeptides selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisés en ce qu'il s'agit des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre ces polypeptides.
24/ Utilisation des anticorps selon la revendication 20 en diagnostic, pour le suivi de RLI durant une infection virale.
25/ Procédé de criblage de molécules ou substances pour détecter chez ces dernières une activité dirigée contre l'activité inhibitrice de la RNase L des polypeptides selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'on met en contact le polypeptide avec une molécule ou substance à tester, et qu'on détecte la réactivation de la RNase L, à nouveau capable de lier le 2-5A, ou l'inhibition de son inhibiteur.
26/ Utilisation des polypeptides selon l'une des revendications 12 à 16, pour rechercher des produits actifs vis-à-vis des inhibiteurs de RNase L induits par les virus, capables de les neutraliser.
27/ Utilisation des séquences de nucléotides anti-sens selon la revendication 9 pour transfecter des cellules de mammifères afin d'empêcher la production d'inhibiteurs de RNase L par des agents infectieux.
28/ Composition pharmaceutique contenant des vecteurs tels que rétrovirus ou virus recombinants modifiés pour être utilisables chez le mammifère, contenant une séquence de nucléotides anti-sens selon la revendication 9.
29/ Composition pharmaceutique contenant des vecteurs tels que rétrovirus ou virus recombinants, modifiés pour être utilisables chez le mammifère, contenant une séquence de nucléotides selon l'une des revendications 1 à 7, ces vecteurs étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
30/ Composition pharmaceutique contenant des vecteurs tels que rétrovirus ou virus recombinants, modifiés pour être utilisable chez le mammifère, contenant une séquence de nucléotides selon la revendication 8, ces vecteurs étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
31/ Composition pharmaceutique contenant des vecteurs tels que rétrovirus ou virus recombinants, modifiés pour être utilisable chez le mammifère, contenant une séquence de nucléotides selon la revendication 10, ces vecteurs étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
32/ Composition pharmaceutique contenant des vecteurs tels que rétrovirus ou virus recombinants, modifiés pour être utilisable chez le mammifère, contenant une séquence de nucléotides selon la revendication 11, ces vecteurs étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
33/ Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 28 à 32, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'une solution stérile, isotonique ou qu'elle est conservée sous forme lyophilisée.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766859A (en) * 1996-10-07 1998-06-16 Immunosciences Lab, Inc. Ribonuclease L inhibitor as an indicator of chronic fatigue syndrome

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0325018A2 (fr) * 1987-12-23 1989-07-26 Hem Pharmaceuticals Corp. RNase L inhibiteur comme marqueur pour des infections virales

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0325018A2 (fr) * 1987-12-23 1989-07-26 Hem Pharmaceuticals Corp. RNase L inhibiteur comme marqueur pour des infections virales

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Base de données EMBL fiche HSB87C022, numéro d'accès Z25045; 30 juillet 1993 *
BISBAL, C. ET AL.: "Cloning and characterization of a RNase L inhibitor", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 22, 2 June 1995 (1995-06-02), MD US, pages 13308 - 13317 *
SALEHZADA, T. ET AL.: "2',5'-OLIGOADENYLATE-DEPENDENT RNASE L IS A DIMER OF REGULATORY AND CATALYTIC SUBUNITS.", J BIOL CHEM 268 (11). 1993. 7733-7740 *
ZHOU, A. ET AL.: "Expression cloning of 2-5A-dependent RNAase: a uniquely regulated mediator of interferon action", CELL, vol. 72, no. 5, 12 March 1993 (1993-03-12), NA US, pages 753 - 765 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766859A (en) * 1996-10-07 1998-06-16 Immunosciences Lab, Inc. Ribonuclease L inhibitor as an indicator of chronic fatigue syndrome
US5776690A (en) * 1996-10-07 1998-07-07 Vojdani; Aristo Detection of chronic fatigue syndrome by decreased levels of RNase L inhibitor mRNA

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