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WO1996008571A1 - Identifizierung von dna-schädigenden substanzen durch poly(adp-ribose)-polymerase überexprimierende zellinien - Google Patents

Identifizierung von dna-schädigenden substanzen durch poly(adp-ribose)-polymerase überexprimierende zellinien Download PDF

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WO1996008571A1
WO1996008571A1 PCT/DE1995/001290 DE9501290W WO9608571A1 WO 1996008571 A1 WO1996008571 A1 WO 1996008571A1 DE 9501290 W DE9501290 W DE 9501290W WO 9608571 A1 WO9608571 A1 WO 9608571A1
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Alexander BÜRKLE
Léon VAN GOOL
Jan-Heiner KÜPPER
Harald Zur Hausen
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a DNA construct which contains a cDNA sequence for human poly (ADP-ribose) polymerase, cell lines which contain the DNA construct and a method for identifying DNA-damaging substances on the basis of these cell lines, overexpress the poly (ADP-ribose) polymerase.
  • DNA-damaging substances physical and chemical carcinogens
  • DNA strand breaks have been measured by measuring the strand breaks either in cell lysates by alkaline DNA denaturation methods (for example “alkali elution") or in situ using single cells ( The so-called “comet assay” was identified.
  • alkaline DNA denaturation methods for example "alkali elution”
  • in situ using single cells The so-called “comet assay” was identified.
  • the lysate tests had the disadvantage of being technically relatively complex and requiring a high level of manual skill on the part of the experimenter Effort required.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for the rapid, reliable identification of chemical carcinogens.
  • the principle of the present invention is based on the detection of cellular poly (ADP-Ribosel production as an indicator of DNA strand breaks occurring in living cells.
  • the poly (ADP-Ribose) is derived from the poly (ADP-Ribose) polymerase ( PARP) is synthesized in the presence of DNA strand breaks and with the consumption of NAD + . This occurs under the influence of carcinogenic substances in almost every nucleated cell.
  • manipulation ie by introducing a PARP-DNA sequence into a certain combination with a promoter, particularly a lot of poly (ADP-ribose), and can be formed by suitable measurement methods, for example immunofluorescence, be detected.
  • An example of a construct which contains the PARP-DNA sequence is the plasmid PPARP31 deposited with the DSM under the number DSM 9430 on September 13, 1994.
  • pPARP 31 can be obtained by the following steps: a) - Ligation of a cDNA which contains the complete open reading frame of the poly (ADP-ribose) polymerase from human embryonic fibroblasts (HEF cells), in pBluescript to obtain the plasmid pPARP 25 (Küpper, dissertation Heidelberg University, 1990). The complete open reading frame of one of the known PARP cDNAs is e.g. published in the GenBank / EMBL database, accession number J 03473 (Kurosaki). b) - Isolation of the Xho / Xba fragment from pPARP25 c) - Production of the eukaryotic expression vector pL15TK
  • the 650 bp Hincll / Avall fragment of the human cytomegalovirus promoter / enhancer (HCMV Prom), which has blunted ends, is ligated into the blunted EcoRI site of pUC19, whereby the "intermediate vector" is obtained pL15 becomes.
  • the 629 bp Smal / Hindlll fragment of the poly adenylation signal of the herpes simplex virus thymidine kinase gene (TK poly A) is then ligated into the smoothed Sphl site and into the Hind III site of pL15, as a result of which the vector pL15TK is obtained.
  • the vector pL15TK contains the resistance gene for ampicillin (Amp), a bacterial replication origin (ori), and parts of the lac operon (Z and i).
  • the polylinker cassette from pUC 19 is intact except for the EcoRI and Sphl interfaces.
  • the Xbal interfaces of the vector and the insert remain intact.
  • the embryonic hamster cell line CO60 (Lavi, PNAS 78, p. 6144 ff (1981)) is stably transfected with a plasmid which expresses a poly (ADP-ribose) polymerase, preferably pPARP 31.
  • a poly (ADP-ribose) polymerase preferably pPARP 31.
  • the cell clones obtained in the process (in the case of using pPARP31, these cell clones were called COCF1, -2, -4) overexpress the human PARP.
  • COCF1, -2, -4 With the same genotoxic treatment (eg.
  • the hamster cell clones COCF1, COCF2 and C0CF4 and the control cell line COC-FN1 were deposited with the DSM under the numbers ACC2186, ACC2187, ACC2188 and ACC2189 on September 6, 1994.
  • the sensitivity of a detection method for carcinogens that produce DNA strand breaks is significantly increased.
  • the cellular synthesis of poly results in a signal amplification, as it were, since a single DNA strand break leads to the synthesis of several or even many polymer molecules which, with up to 200 monomeric building blocks, achieve considerable complexity.
  • the polymer synthesis is further increased by transfection of the expression construct containing the PARP sequence, preferably pPARP31.
  • the sensitivity of the detection method can be further increased by subjecting the cells to a defined heat shock, for example 30 minutes at 45 ° C., shortly before the action of the test substance, as a result of which the degradation of the poly (ADP-ribose) associated with the Synthesis can compete, is inhibited.
  • Evidence of cellular poly (ADP- Ribose) is preferably immunological. This has the advantage that the steps can be carried out easily and the method can be carried out quickly with a time expenditure of a few hours.
  • the test is preferably carried out by means of fluorescence microscopy or on microtiter plates, where the specific antibody binding can be evaluated in the sense of an ELISA by automated measurement.
  • the cells are lysed after treatment with the DNA-damaging test substance, the lysates are applied to a support, for example a filter membrane, and the poly (ADP-ribose) formed is detected with a poly (ADP-ribose) -specific antibody , which can be enzyme-labeled.
  • a poly (ADP-ribose) -specific antibody which can be enzyme-labeled.
  • the above antibody may be unlabeled.
  • the detection is then carried out by a second antibody directed against the above antibody, which is labeled, for example enzyme-labeled.
  • the detection of poly (ADP-ribose) by immunofluorescence is described as an example.
  • the cells containing the PARP-DNA construct are left on e.g. Cover glasses or microtiter plates to a normal cell density.
  • the cells are treated with a DNA-damaging test substance.
  • the treatment time is different for individual test substances. It can easily be determined by a specialist. The treatment time is often 1-15 minutes.
  • the cells are then fixed to the support (e.g. cover glass or microtiter plate). After washing the carrier, briefly drying and rehydrating the cells in buffer, incubation is carried out with a first antibody against poly (ADP-Ribose). After washing several times with buffer, the incubation is carried out with a labeled second antibody directed against the first antibody. After repeated washing, the fluorescence microscopic evaluation or detection is carried out in an ELISA reader.
  • Suitable DNA-damaging test substances are, for example, radiation, drugs such as cytostatics, UV light, food additives or chemicals such as dyes, solvents or cleaning agents.
  • the principle of PARP overexpression described can easily be extended to primary cells from experimental animals by transiently or stably introducing the expression cassette for human PARP into such primary cell cultures with the aid of a viral vector. As a result, cells with the full, tissue-specific foreign substance metabolizing capacity are available. On the one hand, this allows the detection of agents that only damage the DNA after metabolization, on the other hand, an organ-specific damage potential can be estimated with such cells.
  • 1 shows the eukaryotic expression vector pL15TK
  • FIG. 2 shows the cloning scheme for pPARP 31
  • FIG. 3 shows the gene map of the plasmid pPARP31.
  • HCMV Prom Human cytomegaly promoter / enhancer
  • TK Herpes Simplex Virus polyadenylation signal
  • Thymidine kinase gene ori bacterial origin of replication
  • C0CF1 cells were grown on coverslips overnight.
  • the cells were treated with 2.8-20 Gray Gamma radiation.
  • Five minutes after the start of radiation the cells were fixed in 10% trichloroacetic acid (10 minutes on ice).
  • the coverslips were washed in 70%, 90% and absolute ethanol for 3 minutes each.
  • After air drying for 1 minute the cells were rehydrated in PBS buffer (phosphate buffered saline) for 1 minute.
  • the first antibody was added (cell culture supernatant of the hybridoma 10H [described by Kawamitsu et al., Biochemistry 23, 3771 ff., 1984], which secretes a monoclonal, highly specific antibody against poly (ADP-ribose)) .
  • the coverslips were then washed three times for 5 minutes in PBS buffer and the second antibody (FITC-coupled goat anti-mouse immunoglobulins; from Renner, Dannstadt) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Then it was washed again three times for 5 minutes with PBS buffer and the cover slips were embedded in polyvinyl alcohol on slides. The fluorescence microscopic evaluation was carried out.
  • the second antibody FITC-coupled goat anti-mouse immunoglobulins

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Konstrukt, das eine cDNA-Sequenz für menschliche Poly(ADP-Ribose)-Polymerase enthält, Zellinien, die das DNA-Konstrukt enthalten und ein Verfahren zur Identifizierung von DNA-schädigenden Substanzen anhand dieser Zellinien, die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase überexprimieren.

Description

Identifizierung von DNA-schädigenden Substanzen durch Poly(ADP-Ribose)- Polymerase überexpri.mierende Zellinien
Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Konstrukt, das eine cDNA-Sequenz für menschliche Poly(ADP-Ribose)-Polymerase enthält, Zellinien, die das DNA-Kon¬ strukt enthalten und ein Verfahren zur Identifizierung von DNA-schädigenden Substanzen anhand dieser Zellinien, die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase überexpri- mieren.
Bisher wurden DNA-schädigende Substanzen (physikalische und chemische Kanze¬ rogene), die DNA-Strangbrüche herbeiführen, durch die Messung der Strangbrüche entweder in Zellysaten durch alkalische DNA-Denaturierungsverfahren (z.B. "Alkali¬ sche Elution") oder in situ anhand von Einzelzellen (sog. "Kometenassay) identifi¬ ziert. Die Lysat-Tests hatten aber den Nachteil, technisch relativ aufwendig zu sein und eine hohe manuelle Geschicklichkeit des Experimentators zu erfordern. Bei "Kometenassays" kommt hinzu, daß die Ablesung mikroskopisch erfolgt, was einen hohen apparativen Aufwand bedingt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren zur schnellen, zuverlässigen Identifizierung von chemischen Kanzerogenen bereitzustel¬ len.
Das Prinzip der vorliegenden Erfindung beruht darauf, die zelluläre Poly(ADP- Ribosel-Produktion als Indikator für in lebenden Zellen auftretende DNA-Strang¬ brüche nachzuweisen. Die Poly(ADP-Ribose) wird von der Poly(ADP-Ribose)- Polymerase (PARP) in Anwesenheit von DNA-Strangbrüchen und unter Verbrauch von NAD+ synthetisiert. Dies geschieht unter Einfluß von kanzerogenen Sub¬ stanzen fast in jeder kernhaltigen Zelle. Jedoch wird in einer solchen Zelle durch Manipulation, d.h. durch Einbringung einer PARP-DNA-Sequenz in einer bestimm¬ ten Kombination mit einem Promotor, besonders viel Poly(ADP-Ribose) gebildet und kann durch geeignete Meßmethoden, beispielsweise Immunfluoreszenz, nachgewiesen werden.
Ein Beispiel für ein Konstrukt, das die PARP-DNA-Sequenz enthält, ist das bei der DSM unter der Nummer DSM 9430 am 13. September 1994 hinterlegte Plasmid PPARP31.
pPARP 31 kann durch folgende Schritte erhalten werden: a) - Ligierung einer cDNA, die den vollständigen offenen Leserahmen der Po- ly(ADP-Ribose)-Polymerase aus menschlichen embryonalen Fibroblasten (HEF-Zellen) enthält, in pBluescript unter Erhalt des Plasmids pPARP 25 (Küpper, Dissertation Universität Heidelberg, 1990). Der vollständige offene Leserahmen einer der bekannten PARP-cDNAs ist z.B. in der GenBank/- EMBL-Datenbank, Zugangsnummer J 03473 (Kurosaki) veröffentlicht. b) - Isolierung des Xho/Xba-Fragments aus pPARP25 c) - Herstellung des eukaryotischen Expressionsvektors pL15TK
Zuerst wird das 650 bp Hincll/Avall-Fragment des Humanen-Cytomegalie- Virus-Promotor/Enhancer (HCMV Prom), das über geglättete Enden verfügt, in die geglättete EcoRI-Schnittstelle von pUC19 ligiert, wodurch der "Zwi- schenvektor" pL15 erhalten wird. In die geglättete Sphl-Schnittstelle und in die Hindlll-Schnittstelle von pL15 wird dann das 629 bp Smal/Hindlll-Frag- ment des Poly-Adenylierungssignals des Herpes-Simplex-Virus-Thymidinki- nase-Gens (TK poly A) ligiert, wodurch der Vektor pL15TK erhalten wird. Der Vektor pL15TK enthält das Resistenzgen für Ampicillin (Amp), einen bakteriellen Replikationsorigin (ori), sowie Teile des Lac-Operons (Z und i). Die Polylinker-Kassette von pUC 19 ist bis auf die EcoRI- und Sphl-Schnitt- stellen intakt. d) - Ligierung des Xho/Xba-Fragments aus pPARP25 in den Vektor pL15TK (wie in Fig. 2 gezeigt) unter Erhalt des Plasmids pPARP31 (s. Fig. 3), wobei die Xhol-Schnittstelle des Inserts und die BamHI-Schnittstelle des Vektors zer¬ stört werden. Die Xbal-Schnittstellen des Vektors und des Inserts bleiben intakt.
Zur Erzeugung von Zellinien wird die embryonale Hamsterzellinie CO60 (Lavi, PNAS 78, S. 6144 ff (1981 )) mit einem Plasmid, das eine Poly(ADP-Ribose)- Polymerase exprimiert, vorzugsweise pPARP 31 , stabil transfiziert. Die dabei erhaltenen Zeilklone (im Falle der Verwendung von pPARP31 wurden diese Zell- klone COCF1 , -2, -4 genannt) überexprimieren die menschliche PARP. Diese Klone produzieren bei gleicher gentoxischer Behandlung (z.B. »/-Strahlung oder Einwir¬ kung von kanzerogenen Chemikalien) deutlich mehr Poly(ADP-Ribose) als parallel isolierte Kontrollklone (COCFN1 , -2, -4), die keine Explosion der menschlichen PARP aufweisen. Ähnliche PARP-überexprimierende Zellinien können natürlich auch aus anderen bekannten Basis-Zellinien außer der verwendeten Hamsterzellinie erzeugt werden. Desweiteren können PARP-überexprimierende Zellinien auch nach transienter Transfektion mit einem PARP-exprimierenden Plasmid erhalten werden.
Die Hamsterzellklone COCF1 , COCF2 und C0CF4 sowie die Kontrollzellinie COC- FN1 wurden bei der DSM unter den Nummern ACC2186, ACC2187, ACC2188 bzw. ACC2189 am 6. Sept. 1994 hinterlegt.
Durch die Verwendung der COCF-Klone bzw. dazu gleichartiger Klone aus anderen Zellinien als Indikatorzellen wird die Empfindlichkeit eines Nachweisverfahrens für Kanzerogene, die DNA-Strangbrüche erzeugen, deutlich gesteigert. Durch die zelluläre Sythese von Poly(ADP-Ribose) kommt es gleichsam zu einer Signalver¬ stärkung, da ein einzelner DNA-Strangbruch zur Synthese von mehreren oder gar vielen Polymermolekülen führt, die mit bis zu 200 monomeren Bausteinen eine beträchtliche Komplexität erreichen. Durch Transfektion des die PARP-Sequenz enthaltenden Expressionskonstrukts, vorzugsweise pPARP31 , wird die Polymersy- these weiter gesteigert. Darüberhinaus kann die Empfindlichkeit des Nachweisver¬ fahrens dadurch weiter erhöht werden, daß die Zellen kurz vor der Einwirkung der Testsubstanz einem definierten Hitzeschock, z.B. 30 Minuten 45 °C, unterworfen werden, wodurch der Abbau der Poly(ADP-Ribose), der mit der Synthese kon¬ kurrieren kann, gehemmt wird. Der Nachweis der zellulär gebildeten Poly (ADP- Ribose) erfolgt vorzugsweise immunologisch. Dies hat den Vorteil, daß die Schritte leicht ausführbar sind und die Methode mit einem Zeitaufwand von wenigen Stunden schnell durchführbar ist. Vorzugsweise erfolgt der Test mittels Fluo¬ reszenzmikroskopie oder auf Mikrotiterplatten, wo sich die spezifische Antikörper¬ bindung im Sinne eines ELISAs durch automatisierte Vermessung auswerten läßt. Jedoch eignen sich auch alle anderen gängigen immunologischen Detektionsver- fahren, wie z.B. Immunozytochemie oder Immunodotblot. Bei letzterem Verfahren werden die Zellen nach Behandlung mit der DNA-schädigenden Testsubstanz lysiert, die Lysate werden auf einen Träger, z.B. eine Filtermembran, aufgebracht und die gebildete Poly(ADP-Ribose) wird mit einem Poly(ADP-Ribose)-spezifischen Antikörper nachgewiesen, der Enzym-markiert sein kann. Andererseits kann vorstehender Antikörper unmarkiert sein. Der Nachweis erfolgt dann durch einen zweiten, gegen vorstehenden Antikörper gerichteten Antikörper, der markiert ist, z.B. Enzym-markiert.
Beispielhaft sei der Nachweis von Poly(ADP-Ribose) durch Immunfluoreszenz beschrieben. Zuerst läßt man die das PARP-DNA-Konstrukt enthaltenden Zellen auf z.B. Deckgläschen oder Mikrotiterplatten auf eine übliche Zelldichte anwach¬ sen. Dann erfolgt die Behandlung der Zellen mit einer DNA-schädigenden Testsub¬ stanz. Die Behandlungszeit ist für einzelne Testsubstanzen unterschiedlich. Sie kann vom Fachmann leicht bestimmt werden. Vielfach ist die Behandlungszeit 1 - 15 Minuten. Danach werden die Zellen an den Träger (z.B. Deckgläschen oder Mikrotiterplatte) fixiert. Nach Waschen des Trägers, kurzem Trocknen und Rehy- drieren der Zellen in Puffer erfolgt die Inkubation mit einem Erst-Antikörper gegen Poly(ADP-Ribose). Nach mehrmaligem Waschen mit Puffer erfolgt die Inkubation mit einem markierten, gegen den Erst-Antikörper gerichteten Zweit-Antikörper. Nach wiederholtem Waschen erfolgt die fluoreszenzmikroskopische Auswertung oder die Detektion in einem ELISA-Lesegerät.
Als DNA-schädigende Testsubstanz eignen sich z.B. »/-Strahlung, Medikamente, wie Zytostatika, UV-Licht, Nahrungsmittelzusatzstoffe oder Chemikalien wie Farb¬ stoffe, Lösungsmittel oder Reinigungsmittel. Das beschriebene Prinzip der PARP-Überexpression läßt sich ohne weiteres auch auf primäre Zellen aus Versuchstieren ausweiten, indem die Expressionskassette für menschliche PARP mit Hilfe eines viralen Vektors transient oder stabil in solche Primärzellkulturen eingeschleust wird. Dadurch stehen Zellen mit der vollen, gewe¬ bespezifischen Fremdstoff-Metabolisierungskapazität zur Verfügung. Einerseits erlaubt dies die Detektion von Agentien, die erst nach der Metabolisierung die DNA schädigen, andereseits läßt sich mit solchen Zellen ein organspezifisches Schädi¬ gungspotential abschätzen.
Die Erfindung wird anhand der Figuren weiter beschrieben, von denen
Fig.1 den eukaryotischen Expressionsvektor pL15TK zeigt,
Fig.2 das Klonierungsschema für pPARP 31 zeigt und
Fig.3 die Genkarte des Plasmids pPARP31 zeigt.
Die Abkürzungen in den Figuren bedeuten:
HCMV Prom: Humaner Cytomegalie-Promotor/Enhancer
AMP: Ampicillin-Resistenzgen
Z: Teil des Lac-Operons
I: Teil des Lac-Operons
(TK) Poly A: Polyadenylierungssignal des Herpes-Simplex-Virus-
Thymidinkinase-Gens ori: bakterieller Replikationsursprung
D: DNA-Bindungsdomäne
A: Automodifikationsdomäne
N: NAD-Bindungsdomäne
ATG: Initiationskodon
Stop: Stopkodon
Für die Restriktionsschnittstellen wurden die üblichen Abkürzungen verwendet.
Beispielhaft sei auf das nachfolgende Beispiel verwiesen, das die Erfindung weiter erläutert.
BEISPIEL:
C0CF1 -Zellen wurden über Nacht auf Deckgläschen angezüchtet. Die Zellen wurden mit 2,8-20 Gray Gamma-Strahlung behandelt. Fünf Minuten nach Bestrah¬ lungsbeginn erfolgte die Fixierung der Zellen in 10% Trichloressigsäure (10 Min. auf Eis). Die Deckgläschen wurden für jeweils 3 Minuten in 70%, 90% und absolutem Ethanol gewaschen. Nach Lufttrocknen für 1 Minute wurden die Zellen in PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung) für 1 Minute rehydriert. Es erfolgte die Zugabe des Erst-Antikörpers (Zellkulturüberstand des Hybridoms 10H [beschrie¬ ben von Kawamitsu et al., Biochemistry 23, 3771 ff., 1984], das einen monoklo- nalen, hochspezifischen Antikörper gegen Poly(ADP-Ribose) sezerniert). Danach wurden die Deckgläschen dreimal 5 Minuten in PBS-Puffer gewaschen und der Zweit-Antikörper (FITC-gekoppelte Ziegen-anti-Maus-lmmunglobuline; Fa. Renner, Dannstadt) wurde zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurde wieder dreimal 5 Minuten mit PBS-Puffer gewaschen und die Deckgläschen wur¬ den in Polyvinylalkohol auf Objektträger eingebettet. Es erfolgte die fluoreszenzmi¬ kroskopische Auswertung.

Claims

Patentansprüche
1 ) Plasmid pPARP 31 (DSM 9430, hinterlegt am 13. Sept. 1994)
2) Poly (ADP-Ribose)-Polymerase überexprimierende Zellinie, umfassend ein DNA-Konstrukt mit einer Nukleinsäuresequenz für menschliche PARP.
3) Zellinie nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäurese¬ quenz eine cDNA-Sequenz ist.
4) Zellinie nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA- Konstrukt pPARP31 ist.
5) Zellinie nach einem der Ansprüche 2 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Hamster-Zellinie, insbesondere C060 ist.
6) Zellinie nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Zellklone COCF1 (DSM ACC2186, hinterlegt am 6. Sept. 1994), COCF2 (DSM ACC21 87, hinterlegt am 6. Sept. 1 994) und C0CF4 (DSM ACC2188, hinterlegt am 6. Sept. 1994) handelt.
7) Verfahren zur Identifizierung von DNA-schädigenden Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen, die Poly(ADP-Ribose) überexprimieren, entwe¬ der (a) auf einem Träger wachsen gelassen werden, einer DNA-schädigen¬ den Testsubstanz ausgesetzt werden und die gebildete Poly(ADP-Ribose) immunologisch nachgewiesen wird, oder (b) einer DNA-schädigenden Testsubstanz ausgesetzt werden, lysiert werden und die Lysate auf einen Träger aufgebracht werden sowie die gebildete Poly(ADP-Ribose) immunolo¬ gisch nachgewiesen wird.
8) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zellen der Zellklone COCF-1 (DSM ACC2186), COCF-2 (DSM ACC2187) oder COCF-4 (DSM ACC2188) handelt.
9) Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in (a) ein Deckgläschen oder eine Mikrotiterplatte ist und in (b) eine Filter¬ membran ist.
10) Verfahren nach einem der Ansprüche 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologische Nachweis in (a) über Fluoreszenzmikroskopie geschieht.
PCT/DE1995/001290 1994-09-16 1995-09-15 Identifizierung von dna-schädigenden substanzen durch poly(adp-ribose)-polymerase überexprimierende zellinien WO1996008571A1 (de)

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DE (1) DE4433130C2 (de)
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999044943A3 (de) * 1998-03-03 1999-12-09 Deutsches Krebsforsch Vektoren und viren zur gentherapie

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19726824C1 (de) * 1997-06-24 1999-03-04 Deutsches Krebsforsch Verfahren zur Identifizierung kanzerogener Agenzien
AU762770B2 (en) 1998-12-01 2003-07-03 University Of Kentucky Research Foundation, The A method for enhancing protective cellular responses to genotoxic stress in skin
US7072771B2 (en) * 2001-06-07 2006-07-04 University Of Kentucky Research Foundation Selective PARP-1 targeting for designing chemo/radio sensitizing agents

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. BÜRKLE ET AL.: "Poly(ADP-ribosyl)atiobn: its role in inducible DNA amplification, and its correlation with the longevity of mammalian species", EXP. CLIN. IMMUNOGENET., vol. 9, pages 230 - 240 *
B.W. CHERNEY ET AL.: "cDNA sequence, protein structure and chromosomal location of the human gene for poly(ADP-ribose) polymerase", PROCEEDINGS OF NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES USA, vol. 84, pages 8370 - 8374 *
G. FRITZ ET AL.: "Effects of transfection of human poly(ADP-ribose) polymerase in Chinses Hamster cells on mutagen resistance", MUTATION RESEARCH, vol. 308, pages 127 - 133 *
H. SUZUKI ET AL.: "Molecular cloning of cDNA for human poly(ADP-ribose) polymerase and expression of its gene during HL-60 cell differentiation", BIOCHEMICAL BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 146, no. 2, pages 403 - 409 *
H.M. ALKHATIB ET AL.: "Cloning and expression of cDNA for human poly(ADP-ribose) polymerase", PROCEEDINGS OF NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES USA, vol. 84, pages 1224 - 1228 *
K. BHATIA ET AL.: "Expression of the poly(ADP-ribose) polymerase gene following natural and induced DNA strand breakage and effect of hyperexprssion on DNA repair", CARCINOGENESIS, vol. 1, no. 1, pages 123 - 128 *
K. UCHIDA ET AL.: "Nucleotide sequence of a full-length cDNA for human fibroblast poly(ADP-ribose) polymerase", BIOCHEMICAL BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 148, no. 2, pages 617 - 622 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999044943A3 (de) * 1998-03-03 1999-12-09 Deutsches Krebsforsch Vektoren und viren zur gentherapie

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