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WO1996007735A1 - Nouvelle desoxyribonuclease - Google Patents

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Publication number
WO1996007735A1
WO1996007735A1 PCT/JP1995/001775 JP9501775W WO9607735A1 WO 1996007735 A1 WO1996007735 A1 WO 1996007735A1 JP 9501775 W JP9501775 W JP 9501775W WO 9607735 A1 WO9607735 A1 WO 9607735A1
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WO
WIPO (PCT)
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dna
dnase
amino acid
cells
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/001775
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Seiichi Tanuma
Original Assignee
Seiichi Tanuma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seiichi Tanuma filed Critical Seiichi Tanuma
Priority to EP95930710A priority Critical patent/EP0754751B1/en
Priority to DE69522799T priority patent/DE69522799T2/de
Priority to US08/640,765 priority patent/US5821103A/en
Publication of WO1996007735A1 publication Critical patent/WO1996007735A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to three novel desoxyribonucleases (hereinafter simply referred to as DNase).
  • DNase novel desoxyribonucleases
  • it relates to DNA fragmentation, a phenomenon characteristic of apoptosis, ie, a novel DNase that catalyzes the reaction of degrading chromatin DNA into mono- or oligonucleosome units.
  • the present invention provides a DNA encoding the amino acid sequence of-(the following DNase 7) of the above novel DNas, a vector containing the DNA, a host cell transformed with the vector,
  • the present invention relates to a method for producing the DNase by culturing the host cell, and an antibody having an affinity for the DNase or a precursor polypeptide thereof, or a fragment thereof.
  • apoptosis has been attracting attention due to the death of cell tissue.
  • This apoptosis unlike the necrosis (necrosis), which is a pathological cell death, is considered to be a death that is * originally integrated into the cell's own gene.
  • necrosis necrosis
  • necrosis necrosis
  • Apoptosis is involved in numerous life phenomena as shown in Table 1 above. That is, not only morphogenesis during development, but also the replacement of normal cells such as epidermal cells of the skin, epithelial cells of the small intestine and stomach in mature individuals (removal of old cells), and the thymus, a hormone-dependent group It has been suggested that apoptosis also causes atrophy of glucocorticoids, atrophy of the prostate by castration, elimination of immunocompetent cells that react to self components, and elimination of neurotrophic factors. Apoptosis occurs not only in such physiological cell death, but also in irradiated cells and virus-infected cells.
  • T cell depletion by AIDS virus is also caused by cell death by apoptosis.
  • Apoptosis also occurs due to chemical and physical stimuli such as administration of drugs and toxins and heat.
  • apoptosis also affects neuronal cell death in neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, spontaneous loss of tumor cells in cancer foci, and cell death caused by anticancer drugs.
  • the elucidation of the endonucleases involved in apoptosis chromatin DNA fragmentation and their regulatory mechanisms is important for understanding the entire molecular mechanism of apoptosis, as well as the mechanisms of cell survival and cell death. is there. Furthermore, it is useful in that it can be used as a means for diagnosing, preventing, or developing therapeutics for diseases such as cancer, autoimmune diseases, and AIDS involving apoptosis.
  • the present inventors While studying the endonuclease involved in apoptosis, the present inventors selectively cleaved the linker site of chromatin DNA into the nuclear fraction of rat thymocytes, resulting in DNA fragmentation characteristic of apoptosis. New types of endonucleases that cause phenomena. These three types of endonucleases were isolated and purified, and as a result of further research, it was confirmed that one of them was an endonuclease involved in the fragmentation of apoptotic chromatin DNA. The present invention was completed by successfully determining and obtaining the primary structure of the endonuclease and the nucleotide sequence of its gene.
  • DNaser A novel DNase (hereinafter, referred to as DNaser), which is an endonuclease capable of selectively cleaving a linker site of chromatin DNA and having the following properties.
  • DNase A novel DNase that can selectively cleave the linker position of chromatin DNA and has the following properties (hereinafter, DNase).
  • DNA having a nucleotide sequence encoding DNase according to any one of the above (1) or (4 :) to (6) Preferably, DNA having the base sequence (base numbers 87 to 941) described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, more preferably DNA having the base sequence (base numbers 1 to 941) described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing DNA fragmentation in apoptosis, and a photograph of an agarose gel electrophoresis image of fragmented DNA.
  • Figure 2 shows photographs (a, b) showing the results of autoradiography of a part of DNA extracted from apoptotic rat thymus analyzed by the end labeling method and subjected to 2% agarose gel electrophoresis.
  • a shows DNA extracted from irradiated apoptotic rat thymus
  • b shows DNA extracted from dexamethasone-treated apoptotic rat thymus.
  • Lane 1 alkaline phosphatase (APase) before labeling the 3 'end
  • Lane 2 DNA that had been incubated in the absence of Apase before labeling the 3 'end.
  • Lane 3 DNA incubated in the presence of APase before labeling the 5 'end.
  • Lane 4 DNA incubated in the absence of APase before labeling the 5 * terminus.
  • Figure 3 shows a HPLC profile of DNase active fraction obtained from S-S sepharose derived from normal rat thymus applied to a CM5 PW column, and a photograph showing an agarose gel electrophoresis image of each fraction. It is.
  • FIG. 4 shows the HPLC profile of the DNase active fraction obtained from S-S sepharose from apoptotic rat thymus applied to a CM5 PW column, and the agarose gel S-electrophoresis image of each fraction. It is a photograph.
  • FIG. 5 is a photograph showing a result of an active gel analysis of DNasea, / 8 and 7 (electrophoresis image).
  • Lane 1 DNA mass of DNase produced from cell nuclei of normal rat thymus
  • Lane 2 The results of analysis of DNase S molecule ⁇ purified from cell nuclei of normal rat thymus using an active gel system.
  • Lane 3 Results of analysis of the molecular weight of DNase 7 purified from apoptotic cells irradiated with 7 rays using an active gel system.
  • the protein molecular weight markers are phosphorylase b (97,400), cysteine albumin (66,200), ovalbumin (45,000), acetic acid dehydratase (31,500), and soybean tribusin inhibitor (21,400), respectively. 500) and lysozyme (14,400).
  • Figure 6 shows the profile of TSKG-2000 SW gel 3 ⁇ 43 ⁇ 4H PLC of DNa secr ( Figure a), DNa se / S ( Figure b) and DNa se r ( Figure c).
  • FIG. 7 is a photograph (agarose gel S electrophoresis image) showing the pH dependence of DNase ⁇ (FIG. A), ⁇ (FIG. B) and 7 (FIG. C). The activities of purified DNasea,; 5 and 7 were measured in acidic to basic (left to right in the photograph) buffers, respectively.
  • Figure 8 shows the effect of 2 ffi spacing on the activity of DNa sea, ⁇ and ".
  • A is the purified DNa sea (1 ⁇ 1), ⁇ (1 0 ⁇ ), r (- 1) shows the results obtained by measuring the activity of 1) in the presence of 3 mM Ca C 12 and increasing the degree of g of MgCl 2
  • b purified DNa sea (1 ⁇ 1), ⁇ (-Q—) and r shows the (one cloudy I) activity results measured with increasing concentrations of CaC 12 in the presence of 3 mM MgC 1 2 of.
  • c the concentration of Z nC 1 ⁇ in Itari ⁇ conditions for each DNa se Shows the results of measurement with the addition of.
  • FIG. 9 is a photograph showing the mode of DNA degradation by DNasea, S, and 7, respectively (obtained by autoradiography using 2% agarose gel electrophoresis).
  • Photo a shows the degradation of DNA extracted from the nuclei of HeLa S3 cells digested with DNase ⁇
  • Photo b shows the degradation of DNA extracted from the nuclei of HeLa S3 cells digested with DNase / S.
  • Photo c shows the degradation mode of DNA extracted from the HeLa S3 cell nucleus digested with DNase ⁇ .
  • Lane 1 pretreated with alkaline phosphatase (APase) and then labeled at the 3 'end.
  • APIase alkaline phosphatase
  • Lane 2 3'-end labeling without pretreatment with APase.
  • Lane 3 Pretreatment with APase and labeling at the 5 'end.
  • Lane 4 5'-end labeling without pretreatment with APase.
  • Figure 10 is a profile of SP5 PW HP LC. DNase activity of each fraction (Ichinichi), absorbance at 280 nm of each fraction (1), NaC 1 ⁇ gradient (11).
  • FIG. 11 Separation of the DNAse 7 fragment restricted by endopeptidase using reverse phase HPLC.
  • Lys fragment released by digestion with C-endodibutidase.
  • Chromatin DNA fragments generated in apoptotic cells increase in proportion to short DNA fragments such as nucleosome monomers and dimers in proportion to the progression of apoptosis, but progress to complete monomers It does not stop, but stops in some state. Therefore, when DNA was extracted from apoptotic cells and analyzed for DNA by agarose gel S-electrophoresis, the DNA electrophoresis image showed an integer of the DNA (about 180 base pairs) contained in the nucleosome monomer. It is observed as a ladder as a double-length fragment.
  • DNA fragmentation caused by apoptosis is dependent on Ca 2+ ZMg i + and is inhibited by Z. Furthermore, all of the DNA fragments produced are 3′-OH / 5′-P type double proteins having a phosphate group at the 5 ′ end.
  • the DNase of the present invention comprises a nucleus of an animal cell, preferably a cell nucleus derived from the thymus, spleen K or liver K of a mammal such as a rat or a calf, more preferably a nucleus of a calf thymus or a cell derived from a rat spleen K.
  • a mammal such as a rat or a calf
  • the DNase ⁇ y exists in both the nuclei of normal cells and the nuclei of apoptotic cells with the same activity regardless of whether apoptosis is induced or not.
  • DNase 7 is different from DNase ⁇ and DNase / S of the present invention, in which the activity is lost by inducing apoptosis.
  • the apoptosis referred to here is not particularly limited by the cause of the apoptosis, and includes not only spontaneous apoptosis but also apoptosis artificially caused by irradiation, glycocorticoid treatment or the like.
  • the DNase 7 of the present invention has a molecular weight of about 33,000 by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter, referred to as SDS-PAGE), and about 31,000 by gel chromatography. It is a monomer polypeptide having a molecular weight of 000.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the DNase 7 of the present invention selectively cleaves the linker site of chromatin DNA to produce a mono- or oligonucleolime having a phosphate group at the 5′-terminal side (5 ′-? / ⁇ ′ -OH formation).
  • Type) DNase The optimal pH conditions for the DNase activity are neutral pH, preferably about pH 6.8 to about 7.6, more preferably about pH 7.2 in MOPS-NaOH buffer or Tris salt.
  • activation of the DNase ⁇ requires the presence of both Ca 2+ and Mg + or at least one of Mn alone (in the present invention, the Ca 2V g i + , Mn-dependent Abbreviated).
  • the concentration of the Ca 2+ , Mg or Mn 2+ is respectively 1 to 3 mM, preferably 3 mM. More preferably, both a 3 mM concentration of Ca "and a 3 mM concentration of Mg are present.
  • DNase T activity is sensitive to micromolar concentrations of ⁇ 2, which are known to inhibit apoptosis, and ⁇ ⁇ concentrations as low as 40 / ⁇ .
  • the DNase 7 of the present invention can be produced by using a known method such as a method of extracting and producing from animal nuclei, a method of chemical synthesis, or a gene recombination technique using animal tissues or cells as raw materials. . Specifically, the following method is exemplified.
  • cells derived from thymus, spleen sensitivity or liver K of mammals such as rats and pups are used as raw materials to obtain non-ionic surfactants.
  • the cell nuclei are isolated by homogenization in the presence using a neutral region, preferably a pH 7.8 solution. Then, the obtained isolated nucleus is optionally used in the presence of ammonium sulfate (preferable 81-form includes use of ammonium sulfate having a degree of S of 0.4 to 0.5 M). It is solubilized by sonication, and the upper surface is obtained by centrifugation.
  • the obtained upper fraction was subjected to column chromatography using a separation ion exchanger, preferably a strongly acidic tetraion exchanger as a carrier, and developed by a linear gradient method according to the degree of salinity. get.
  • the active fraction is further subjected to high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC) using a column exchanger, preferably a weakly acidic ion-exchanger as a carrier, and similarly developed by a linear gradient method based on salt concentration. .
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • CM5 PW column (5 mm ID X 50 mm; manufactured by Tosoiso) was used as a column, and 20 mM Tris-HCl containing ImM2-mercaptoethanol, 0.1 lmM PMS F and 10% ethylene glycol as eluents.
  • KC1 is developed by the S gradient method using a buffer solution (pH 7.8)
  • DNase 7 of the present invention is eluted at a KC1 concentration of about 0.55M.
  • the elution active surface is subjected to a known purification chromatography such as HPLC using a heparin column, gel-based HPLC, or HPLC using an Oxion exchanger.
  • the DNase 7 * of the present invention is capable of matching the mode of cleavage of the DNA fragment by the enzyme with the mode of cleavage of the DNA fragment produced in rat thymus or splenic K cells that have undergone apoptosis, in an ion-dependent manner. Due to similarities and the presence of the enzyme in the nuclei of rat I »glands or splenic K cells that caused apoptosis, DN ⁇ fragmentation of apoptosis in B3 ⁇ 4 glands or spleen K, especially in rat thymus or spleen contact It is thought to be an enzyme involved in
  • the DNase “ ⁇ is used as a tool to elucidate the apoptosis that occurs in mammals including humans (eg, horses, horses, mice, rats, guinea pigs, and egrets) at the molecular level.
  • mammals including humans (eg, horses, horses, mice, rats, guinea pigs, and egrets) at the molecular level.
  • apoptosis-controlling drugs using a diagnostic agent or DNase ⁇ inhibitor and activator using DNA a method for evaluating apoptosis or apoptosis of pain or autoimmune disease using DNA kinase «Gene therapy Useful as a base S for establishing laws and regulations.
  • the DNaseot of the present invention is preferably a nucleus of an animal cell, preferably a cell nucleus derived from the thymus, spleen K or liver K of a mammal such as a rat or a calf. Endonuclease in the nucleus.
  • the DNase ⁇ is present in the nucleus of normal cells, and is hardly present in the nucleus of apoptotic cells.
  • the DNasea of the present invention is a monomeric polypeptide that exhibits a molecular i of about 32,000 by SDS-PAGE and a molecular weight of about 28,000 by gel chromatography.
  • the preferred embodiment of SDS-PAGE is described in detail in Reference Example 4 cited in Example 2 (1), and the preferred embodiment of gel chromatography is described in Example 2 (1).
  • the DNase ⁇ of the present invention selectively cleaves a linker site of chromatin DNA to generate an oligonucleosome having a phosphate group at the 3 ′ end (3′-P / 5 ′)
  • the optimal pH condition for the DNase activity is a weakly acidic pH, preferably a pH of about 5.4 to about 6.0 in a solution of drip acid-KOH buffer or MES-NaOH buffer solution. More preferably, the pH is about 5.6.
  • the activity of the DNa sea is not affected by the presence or absence of divalent gold ions such as Ca, Mg 2+ and Mn. Furthermore, it is insensitive to ⁇ ⁇ + and inhibits the activity by about 50%. Further, the activity is completely inhibited by 100 / M of porin tricarboxylic acid, an inhibitor of DNase and RNase. However, the activity of the present DNasea is not inhibited by G-actin.
  • the DNasea of the present invention can be produced by a known method such as a method of extracting and purifying animal tissues or cells as a raw material, a method of chemical synthesis, or a gene recombination technique. Specifically, the following method is exemplified.
  • cell nuclei are monatized by homogenizing a rat thymus-derived cell with a neutral region, preferably a pH 7.8 solution, in the presence of a nonionic surfactant. Then, in the presence of sulfuric acid ammonium (a preferred embodiment includes the use of 0.15 to 0.25 M ammonium sulfate), if necessary, solubilization by ultrasonic treatment, and centrifugation To obtain the above fraction.
  • a neutral region preferably a pH 7.8 solution
  • sulfuric acid ammonium a preferred embodiment includes the use of 0.15 to 0.25 M ammonium sulfate
  • the obtained upper surface fraction was subjected to column chromatography using a Zion exchanger, preferably a strongly acidic dion exchanger as a carrier, and developed by a linear gradient method based on salt concentration to obtain an eluted active surface component I do. Then, the active surface fraction is further subjected to HPLC using a K ion exchanger, preferably a weakly acidic IS ion exchanger as a carrier, and similarly developed by a linear gradient method based on salt concentration. At this time, a CM5PW column (5 mm ID x 5 Omm; manufactured by Tosoh Corporation) was used as a column, and lmM2-mercaptoethanol, 0. ImM PMSF and 10% ethylene glycol were used as eluents. When a gradient is applied to KC1 using OmM Tris-HCl buffer (pH 7.8), DNase ⁇ of the present invention is eluted at a KC1 concentration of about 0.25%.
  • the DNase of the present invention is used as a reagent for analyzing the DNA cleavage mode generated in mammals including humans (eg, horses, horses, mice, rats, guinea pigs, rabbits, etc.).
  • '-P / 5' is useful in that it can be used as a basis for developing antiviral agents because it cleaves into mono-OH-producing form.
  • the DNase / 8 of the present invention may be a nucleus of an animal cell, preferably a cell nucleus derived from the thymus, spleen K or liver K of a mammal such as a rat or a calf, and more preferably a cell derived from a calf thymus or a rat spleen K. It is an endonuclease that exists in the nucleus. Further, the DNase> S is present in the nucleus of normal cells, and is hardly present in the nucleus of apoptotic cells.
  • the DNaseS of the present invention has a molecular weight of about 32,000 according to SDS-PAGE and a molecular weight of about 30,000 according to gel permeation chromatography.
  • SDS-PAGE is described in detail in Reference Example 4 cited in Example 2 (1), and the preferred embodiment of gel chromatography is described in Example 2 (1).
  • the DNase 3 of the present invention selectively cleaves a linker site of chromatin DNA to produce an oligonucleotide (3′-P / 5 * -OH-producing type) having a phosphate group at the 3 ′ end.
  • the pH condition most suitable for the DNase activity is a weakly acidic pH, preferably a pH of about 5.2 to about 6. in a KOH buffer solution or MES-NaOH solution. 2. More preferably, the pH is about 5.6.
  • the DNase / S has activity independent of divalent metals such as Ca 2+ , Mg, and Mn, and is insensitive to ⁇ ⁇ + (50% activity inhibition Degree> about ImM). Further, the activity is completely inhibited by phosphine tricarboxylic acid 100 which is an inhibitor of DNase and RNase.
  • this DNa se is an inhibitor of DNase and RNase.
  • DNase; 5 of the present invention can be produced by appropriately using a known method such as a method of extracting and purifying animal tissues or cells as a raw material, a method of chemical synthesis, or a gene recombination technique. Specifically, the following method is exemplified.
  • cells derived from rat thymus, spleen or liver K are used as a raw material, and the cells are homogenized in the presence of a nonionic surfactant in a neutral region, preferably using a buffer solution having a pH of about 7.8. Isolate the cell nucleus. Then, in the presence of ammonium sulfate (preferably, 0.2 to 0.3 M ammonium sulfate is used), if necessary, solubilization by sonication, and centrifugation. To obtain the fraction.
  • a nonionic surfactant in a neutral region
  • ammonium sulfate preferably, 0.2 to 0.3 M ammonium sulfate is used
  • the obtained upper fraction was subjected to column chromatography using a cation exchanger, preferably a strongly acidic cation exchanger, and developed by a linear gradient method based on salt concentration, and the eluted active fraction was analyzed. get.
  • the active fraction is further subjected to HPLC using a carrier of a separate ion exchanger, preferably a weakly acidic ion exchanger, and similarly developed by a direct gradient method based on a salt concentration.
  • a CM5 PW column 5 mm 1.D.
  • the eluted active fraction is appropriately combined with known purification chromatography such as HPLC using a heparin column, gel chromatography, and HPLC using an ion exchanger to obtain a more highly purified DNase / S. You can get it.
  • the DNaseS thus obtained can be subjected to dialysis, centrifugation, lyophilization and the like.
  • the DNAse ⁇ of the present invention is used as a reagent for analyzing the mode of cleavage of DNA generated in mammals including humans (eg, horses, mice, rats, guinea pigs, and egrets).
  • Phosphorus is useful as a basis for developing antiviral agents because it cleaves viral DNA into 3'-PZ5'-OH-producing forms.
  • a preferred embodiment of the DNAse of the present invention is a DNAse having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 310 in the amino acid sequence substantially shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • Such an amino acid sequence is not particularly limited as long as the property of DNase ⁇ is not changed, and substitution, deletion, insertion or modification may occur in a part of the amino acid sequence.
  • DNase 7 having the amino acid sequence can be produced by appropriately using a known method such as a method of extracting W from the cell nucleus of an animal tissue or cell, a method of chemical synthesis, or a gene recombination technique.
  • a known method such as a method of extracting W from the cell nucleus of an animal tissue or cell, a method of chemical synthesis, or a gene recombination technique.
  • cells derived from the thymus, spleen K or liver K of lambs such as rats and pups, and more preferably cells derived from rat spleen K are used as a raw material and the method described in (a) above.
  • a method of extracting and purifying by the same process is exemplified.
  • the amino acid sequence of the DNase 7 can be directly identified by integrating the data obtained by the following 1 to ⁇ ,
  • the cDNA or the genomic DNA of the DNAse 7 is cloned and identified by an indirect method of determining the corresponding amino acid sequence from the base sequence of the coding region (ORF).
  • DNase 7 of the present invention is first synthesized in a cell as a precursor DNase 7 having a precursor peptide region on the N-terminal side thereof, and then the N-terminal precursor peptide region is cleaved by a peptide enzyme. It becomes mature DNase 7.
  • N-terminal precursor peptide region has substantially the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 25 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing.
  • amino acid sequence is not particularly limited as long as it does not change the properties of the DNase 7 and is normally processed. Substitution, deletion, insertion or modification with a part of the amino acid sequence May be happening.
  • the amino acid sequence of the N-terminal precursor peptide region was determined by cloning cDNA or genomic DNA, determining the nucleotide sequence thereof, and comparing the amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequence of 0RF contained in the nucleotide sequence with that of s mature DNase 7. It can be determined by comparing the amino acid sequence near the N-terminus.
  • the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it has a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of DNase 7 of the present invention, but is preferably amino acid 26 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • the DNA of the present invention also includes a DNA encoding a precursor polypeptide of the DNAse 7 of the present invention having an N-terminal precursor peptide region.
  • it is a DNA substantially encoding DNase 7 having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 25 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an N-terminal precursor peptide, and is preferably Is a DNA encoding an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 310 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, more preferably a nucleotide sequence represented by base numbers 12 to 941 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 Are exemplified.
  • the DNA of the present invention may be obtained by any method.
  • complementary DNA cDNA
  • mRNA complementary DNA
  • cDNA complementary DNA
  • genomic DNA DNA obtained by chemical synthesis
  • RNA RNA
  • DNA obtained by spreading DNA by PCR using type I as DNA and Use these methods appropriately
  • mRNA polynucleotide (A) RNA
  • A polynucleotide
  • mRNA is prepared from cells such as rat gland or spleen K that express and produce DNase7.
  • the mRNA may be prepared by known methods such as the guanidine thionate method CChirgwin, JM et al. Biochem. 18.5294 (1979)], the thermal phenol method or the acid guanidine-phenol-chloroform (AGPC) method.
  • the total RNA prepared by the method can be subjected to affinity chromatography using oligo (dT) cellulose, Boli U-Sepharose, or the like. Then, the obtained mRNA is used as a spire type, and known methods such as, for example, using reverse transcriptase COkayama. H. et al. Uol. Cell. Biol .. 2, 161 (1982) and 3, 280 (1983) ), Gubler. H. and Hoffman. BJ. Gene. 25. 263 (1983) etc.), nicks were introduced into type I RNA with RNase H, and double-stranded cDNA with DNA bolimerase I. Is prepared.
  • the cDNA is incorporated into a plasmid vector or a phage vector, and transformed into a large K bacterium or subjected to in vitro packaging to prepare a cDNA library.
  • the plasmid vector used here is not particularly limited as long as it can be replicated and maintained in the host, and any phage vector that can be propagated in the host may be used.
  • Examples of a commonly used cloning vector include pUC119, ⁇ gt10, 11 and the like.
  • a vector having a promoter capable of expressing a DNAse gene in a host is preferred.
  • Methods for incorporating cDNA into plasmid include, for example, Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition; Cold Spring Harbor Laboratory. 1.53 (1989) And the method described in 4.
  • the phage vector contains cDNA.
  • a method for introducing brasside into a host is described in Molecular Cloning. A Laboratory Manual, second edition of Maniatis. T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory. 1.74 (1989). And the calcium chloride method, the calcium chloride Z rubidium chloride method, the electroporation method and the like.
  • Examples of a method for introducing a phage vector into a host include a method in which phage DNA is packaged in vitro, and then introduced into a grown host. In vitro packaging can be easily carried out by using a commercially available in vitro packaging kit (for example, manufactured by Stratagene, Amersham, etc.).
  • the method for isolating the cDNA encoding the DNAse 7 of the present invention from the cDNA library prepared by the above method can be carried out by combining a general cDNA screening method.
  • the nucleotide sequence of the DNA thus obtained was determined by the Maxam-Gilbert method (Maxain, A.
  • DNase7 cDNA can be obtained by cutting out all or a part of the clone obtained as described above using a restriction enzyme or the like.
  • the following method is exemplified as a method for isolating a DNA encoding DNase ⁇ of the present invention from one genomic DNA library.
  • genomic DNA is prepared from cells such as rat thymus or spleen K using a known method such as the SDS-phenol method and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method.
  • CTCAB cetyltrimethylammonium bromide
  • RNA is degraded and removed by ribonuclease.
  • the resulting DNA is partially digested with a suitable IS enzyme, and the obtained DNA fragment is amplified with a suitable phage or cosmid to prepare a library.
  • a clone having the desired sequence is detected by, for example, a method using a DNA probe which has been subjected to radioactivity, and all or a part of the DNAse ⁇ r3 ⁇ 4 gene is cut out from the clone with a restriction enzyme or the like and obtained. .
  • the production of the DNA of the present invention by chemical synthesis involves synthesizing all or a part of the base sequence represented by base numbers 12 to 941 in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. Can be performed.
  • the present invention further relates to a recombinant vector containing the DNA encoding the above-mentioned DNAse7.
  • the recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it can maintain or replicate in various prokaryotic and Z or eukaryotic host cells, and includes a brassmid vector and a phage vector.
  • the recombinant vector is a vector for recombination conveniently available in the art.
  • Bosmid DNA and pacteriophage DNA can be prepared by ligating the DNA encoding the DNaser of the present invention by a conventional method.
  • Specific examples of the integration vector used include Escherichia coli-derived plasmids such as PBR322 and pBR325.pUC12.pUC13, and yeast-derived plasmids such as pSHI9 and pSH15. pTP5. pC19 and the like.
  • the phage include bacterium phage such as ⁇ phage, and animal and insect viruses [pVL1393 (manufactured by Invitrogen)] such as retrovirus, puccinia virus, and nucleopolyhedrovirus.
  • An expression vector is useful for expressing and producing DNase7.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing the DNase7 gene in various host cells of prokaryotic cells and / or eukaryotic cells and producing the enzyme.
  • an expression vector When a bacterium, particularly Escherichia coli, is used as a host cell, an expression vector generally comprises at least a promoter-operator region, an initiation codon, DNA encoding the DNAse of the present invention, a stop codon, a terminator region, and a replicable unit.
  • the expression vector preferably contains at least a promoter, an initiation codon, a DNA encoding the DNase ⁇ r of the present invention, and a stop codon.
  • One region of the promoter-operator for expressing the DNase 7 of the present invention in bacteria is a region containing a promoter, an operator and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (for example, AAGG).
  • SD Shine-Dalgarno
  • the host is Escherichia coli, preferably a Trp promoter, a lac promoter, a recA promoter, a ⁇
  • 2 1g replacement paper examples include those containing a PL promoter, an lpp promoter, a tac promoter, and the like.
  • examples include the SL01 promoter, the SP02 mouth motor, and the penP promoter.
  • examples of a promoter for expressing the DNase 7 of the present invention in eukaryotic yeast include a PH05 open motor, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, and a host such as a mammalian cell.
  • promoters derived from SV40, retrovirus promoters, heat shock promoters, and the like can be mentioned.
  • it is SV-40, a small virus.
  • the use of enhansa is also an effective method for expression.
  • Suitable initiation codons include methionine codon (ATG).
  • Examples of the stop codon include common stop codons (eg, TAG, TGA, TAA, etc.).
  • As the terminator region a commonly used natural or synthetic terminator can be used.
  • a replicable unit is DNA that has the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell. It can be a natural or artificially modified plasmid (prepared from natural plasmid). DNA fragments) and synthetic plasmids. Examples of suitable plasmids include plasmid pBR322 or an artificially modified product thereof (a DNA fragment obtained by treating PBR322 with an S enzyme) in E. coli, and yeast 2 ⁇ plasmid in yeast.
  • yeast chromosome DNA and in mammalian cells, plasmid pRSVneo ATCC 37198.Brasmid pSV2 dhfr ATCC 37145, brassmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224, brassmid pSV2neo ATCC
  • polyadenylation site and slicing junction site those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, for example, can be used.
  • the selection marker s of those commonly used can be routinely used
  • antibiotic resistance genes such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin.
  • the expression vector of the present invention is obtained by linking at least the above-mentioned promoter, initiation codon, DNA encoding DNase ⁇ of the present invention, termination codon and terminator region to an appropriate replicable unit in a continuous and circular manner. Can be prepared. At this time, if desired, an appropriate DNA fragment (for example, linker, other restriction site, etc.) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase.
  • the transformed cell of the present invention can be produced by introducing the above-described expression vector into a host cell.
  • the host cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is compatible with the above-mentioned expression vector and can be transformed.Natural cells or artificially established cells usually used in the technical field of the present invention are used. Various types of cells such as the obtained recombinant cells [eg, bacteria (Escherichia bacteria, Bacillus bacteria), yeasts (Saccharomyces medica, genus Bichia, etc.), animal cells or insect cells, etc.] are exemplified.
  • Escherichia coli or animal cells specifically Escherichia coli (DH5, HB101, etc.), mouse-derived cells (COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3 T3, etc.) , Rat-derived cells, hamster-derived cells ( ⁇ and C ⁇ , etc.), monkey-derived cells (COS1, COS3, COS7, CV1 and Velo, etc.) and human-derived cells (Hela, diploid diploid buds) Cells derived from cells, myeloma cells, Namalwa, etc.).
  • Escherichia coli DH5, HB101, etc.
  • mouse-derived cells COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3 T3, etc.
  • Rat-derived cells hamster-derived cells ( ⁇ and C ⁇ , etc.)
  • monkey-derived cells COS1, COS3, COS7, CV1 and Velo, etc.
  • human-derived cells Hela, diploid diploid buds
  • Transduction (transformation or transfection) of an expression vector into a host cell can be performed by a conventionally known method.
  • bacteria E. coli, Bacillus subtilis, etc.
  • Cohen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA .. 69. 2110 (1972)
  • Saccharomyces cerevisiae for example, the method of Hinnen et al. CProc. Natl. Acad. Scad. USA. . 75. 1927
  • the DNase "of the present invention is produced by culturing a transformed cell containing the so-called expression vector (hereinafter referred to as including a transfectant) in a nutrient medium. can do.
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (form K transformant).
  • carbon sources include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose.
  • inorganic or organic nitrogen sources include ammonium clays, nitrates, amino acids, corn chip liquor, peptone, casein, and meat extract. , Soybean meal, potato extract, etc. are exemplified.
  • other nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (eg, tetracycline, neomycin, ambicilin, kanamycin, etc.), etc.) are included. May be.
  • the culturing is performed by a method known in the art. Culture conditions, for example, temperature, pH of the medium, and culture time are appropriately selected so that DNase 7 is produced in large quantities.
  • a liquid medium containing the above-mentioned nutrients is suitable.
  • the medium has a pH of 5 to 8.
  • preferred mediums include LB medium, M9 medium CMiller. J., Exp. Mol. Genet, p.431. Cold Spring Harbor Laboratory. New York (1972)].
  • the cultivation can be carried out for about 3 to 24 hours, usually 14 to 43 times, with aeration and agitation as necessary.
  • the host is yeast
  • Burkholder minimal medium CBostian.K.shi et al, Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 77.4505 (1980)] is used, and the pH is 5 to 5. It is desirable to be 8.
  • the cultivation is usually carried out at about 20 to 35 for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration and / or agitation can be carried out.
  • a MEM medium containing, for example, about 5 to 20% fetal bovine serum [Science. 122. 501 (1952, DMEM medium Virology. 8.396 (1959)]), PI 16 199, 519 (1967)], 199 medium Cproc. Soc. Exp. Biol. Med.. 73.1 (1950)] and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 for about 15 to 72 hours, and aeration and / or agitation can be carried out if necessary.
  • the host is an insect cell, for example, Grace's medium containing fetal calf blood serum, CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985)], etc., and its pH is about 5 to 8 Is preferred.
  • the cultivation is usually carried out at about 20 to 40 to 15 to 100 hours, and if necessary, aeration and stirring can be carried out.
  • the DNase 7 of the present invention can be obtained from the culture obtained by the above culture ft as follows.
  • the DNase ⁇ r of the present invention when the DNase ⁇ r of the present invention is present in the culture solution of the culture, the obtained culture is subjected to a method such as ⁇ * or centrifugation to obtain a culture solution (supernatant).
  • the DNase 7 is saccharide-produced and isolated according to a commonly used method for purifying and isolating a natural or synthetic protein from a culture broth.
  • Isolation and purification methods include, for example, methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel elimination, sodium dodecyl sodium urea-polyacrylamide gel S-electrophoresis, and the like. Methods that utilize differences, methods that use load ⁇ , such as ion-exchange chromatography, and liquid chromatography, and methods that use specific affinity, such as affinity chromatography, and methods that use reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • the culture is subjected to a conventional method such as centrifugation or centrifugation to separate the cells or cells.
  • the cells are collected, suspended in an appropriate Sui street solution, and the cell wall and / or cell abdomen such as cells are destroyed by, for example, ultrasonication, lysozyme, and freeze-thawing, and then the DNAse is centrifuged or filtered. A fine fraction containing 7 is obtained.
  • a surfactant such as Triton-X100 to obtain a crude solution.
  • the crude solution can be isolated and purified by using a conventional method as exemplified above.
  • the DNase 7 is present in the nucleus of the cultured transformed cells, the cell wall and cell ⁇ ⁇ are destroyed by a conventional method to isolate the nucleus, and then the nucleus is destroyed by ultrasonic treatment or the like. Then, centrifugation is performed to obtain the supernatant, which can be purified into a single bran by using a conventional method as exemplified above.
  • the present invention also relates to an antibody having an affinity for the above-mentioned DNAse or a precursor polypeptide thereof or a peptide having a part of the amino acid sequence thereof.
  • the antibodies of the present invention include both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies having the above properties.
  • the monoclonal antibody includes a monoclonal antibody belonging to any of the immunoglobulin classes of IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE. Or a 1 g M immunoglobulin class monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention can be obtained according to a conventional method (Tokyo Biochemical Experiment Course 5, Immunology and Biochemistry Research Method, edited by The Biochemical Society of Japan, published by Tokyo Kagaku Dojin, etc.).
  • the polyclonal antibody of the present invention can be prepared by the following method.
  • the monoclonal antibody against DNase "T of the present invention can be produced from a hybridoma (fused cell) produced by so-called cell I fusion. That is, the antibody can be produced from an antibody-producing cell and a bone ftoma cell line. A hybrid dome is formed, the hybrid dome is cloned, and a (b) peptide having a part or all of the amino acid sequence of the DNase ⁇ or its precursor of the present invention is used as an antigen, and the specific affinity for the peptide is determined. It is produced by selecting a clone that produces the antibody shown in Table 1. The procedure is as follows except that a (poly) peptide having a part or all of the amino acid sequence of the DNase « ⁇ or its precursor of the present invention is used as the immunizing antigen. Can use a conventionally known means.
  • the immunizing antigen is produced, for example, by mixing a (poly) peptide having part or all of the amino acid sequence of DNAse 7 or its precursor with complete or incomplete Freund's adjuvant.
  • a (poly) peptide having part or all of the amino acid sequence of DNAse 7 or its precursor with complete or incomplete Freund's adjuvant.
  • the animal used as the target for immunization include mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, and egrets, preferably mice or rats, and more preferably mice. Immunization is carried out by subcutaneous, intramuscular, intravenous, Hoodpat II or intraperitoneal injection of these mammals one to several times.
  • a booster immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 4 times after the initial immunization, and a final immunization is performed about 1 to 4 days later, and an immune immunity is obtained about 3 to 10 days after the final immunization.
  • the antibody-producing cells are collected from the produced animal.
  • the preparation of a hybridoma that secretes a monoclonal antibody can be carried out according to the method of Koehler and Milstein et al. (Nature, Vol. 256, pp. 495-497. 1975) and a modification method analogous thereto. That is, the monoclonal antibody of the present invention is preferably of the same species as the antibody-producing cells contained in spleen ⁇ , lymph node, bone or prosthesis, preferably spleen K, obtained from the animal immunized as described above. mouse of,
  • a fusion cell (hypridoma) obtained by fusion with a mammal such as rat, guinea pig, hamster, rabbit, human or the like, and more preferably mouse, rat or human bone tt tumor cell line (myeloma).
  • the culture can be performed in vitro or in vivo in a mammal such as a mouse, rat, guinea pig, hamster, or a heron, preferably in a mouse or rat, more preferably in a mouse ascites, and the like. Alternatively, it can be obtained from ascites of a mammal.
  • Bone tumor cells used for cell fusion include, for example, mouse myeloma P3
  • Screening of fused cell clones producing the monoclonal antibody of the present invention can be performed by, for example, culturing the combined cells in, for example, a microtiter plate, and determining the reactivity of the cultured gel with the antigen on the culture.
  • the measurement can be performed by an enzyme antibody method such as RI RI or ELISA.
  • Purification and isolation of the monoclonal antibody can be performed using a blood, ascites or ion-exchange chromatography (such as DEAE or DE52), an anti-immunoglobulin column or the like containing the monoclonal antibody of the present invention obtained by the method described above. It can be performed by subjecting to affinity column chromatography such as a brotin A column.
  • the “monoclonal antibody” of the present invention is not limited to the production method described above, and may be obtained by any method.
  • the monoclonal antibody J has a sugar chain having a different structure depending on the type of mammal to be immunized, but the “monoclonal antibody” in the present invention is limited by the structural difference of the sugar chain. But also encompasses monoclonal antibodies from any mammal. Furthermore, for example, by incorporating a human immunoglobulin gene,
  • the suspension was suspended with a Krebs-Ringer phosphate solution containing 1 OmM glucose. After processing by ⁇ or irradiated with r ray, or 1 0 ⁇ 7 Micromax Dexa methasone of the thymus gland 1 0 Gy location of * Co, Ri by to 4 hours fin-incubated over Chillon at 37 'C, apoptosis was induced. These treated apoptotic thymus were used for morphological examination by microscopic microscopy and analysis of DNA fragments by 2% agarose gel electrophoresis.
  • the thymus of the rats treated with 7 rays was observed with a radioscopic microscope. Compared to normal thymus, morphological changes such as chromatin clots in the nucleus specific to apodosis and the loss of hypertrophoblasts on the cell surface were evident. Similar morphological changes were also observed in the W glands of rats treated with dexamethasone.
  • Dissolve cells that have undergone apoptosis by irradiation in a buffer solution for dissolution [5 OmM Tris-HCl (pH 7.8), 1 OmM EDTA, 0.5% w / w N-lauronil sarcosylate Na] did.
  • the obtained DNA was sufficiently treated with 0.5 mgZml RNaseA for 20 minutes and with 0.5 mg / ml proteinase K for 30 minutes, and then subjected to 2% agarose gel electrophoresis. And the mouth
  • DNA was starved from the apoptotic rat thymus obtained in Reference Example 1 by phenol-chloroform extraction.
  • Labeling of the 3 'end of the obtained DNA was carried out in the presence of 25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1 OmM DTT and ImM CaC 1, in the presence of a DNA fragment by T dT (5U: Takara Shuzo). and [alpha - Si P] dCTP (0. 83 m C i / m 1; DuPont) was carried out by incubating out with.
  • labeling of the 5 'end is performed in the presence of 10 OmM Tris-HCl (pH 7.6), 2 OmM MgC 1 j. 1 OmM DTT and 0.2 mM spermidine.
  • the cells were treated with ammonium acid / isobrobanol and the labeled DNA was recovered by precipitation from nucleotides not used for labeling.
  • the labeled DNA was recovered by precipitation from nucleotides not used for labeling.
  • the DNA in the gel was transferred to a membrane, and the membrane was subjected to autoradiography.
  • the obtained autoradiogram is shown in FIG. 2 (a: DNA from irradiated apopto ⁇ -cis induced thymus, b: DNA from dexamethasone-treated apoptosis-induced thymus).
  • Endonuclease activity is based on the nucleus of HeLa S3 cells (human uterine epithelial cells) that do not contain any endogenous endonuclease, and the degradation of chromosome DNA in the nucleus is determined by 2% agarose gel. (See Biochem. Biophys. Res. Commun. 194, (1993), pp. 30-31).
  • HeLa S3 cells (1. 67 x 1 0 7 / m 1) and at 37 in the reaction mixture (30 1) among containing DN ase surface fraction, after 60 minutes ⁇ process, cooling on ice To stop the reaction. Next, the reaction mixture after the reaction was
  • the activity of the endonuclease is measured by observing the degradation of the chromosomal DNA of the brassmid by 0.8% agarose gel-g electrophoresis using supercoiled pBSIISK (-) brasmid as a substrate. be able to. Specifically, the reaction was performed at 37 ° C. for 10 minutes in a reaction mixture (301) containing supercoiled pBS IIS K (-) plasmid (6.6 Tmg / m 1) and the DNase area. Thereafter, the reaction is stopped by cooling on ice.
  • the reaction mixture after the reaction is treated with phenol-cloth form to extract plasmid DNA, and the aqueous ⁇ is subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. Observe the DNA fragment pattern stained with ethidium ⁇ -mid using a photograph taken under UV irradiation.
  • the fragmentation ratio (percent fragmentation) is determined by the density of DNA fragments having a molecular weight of less than 5 kb.
  • Example 1 various DNases purified and obtained in Example 1 were separated by electrophoresis in a Laemm1iSDS-PAGE gel containing 200 tgZm1 of natural thyme DNA.
  • the calibration curve of the molecular weight on the SDS gel measured with the standard protein was not affected by the presence of 200 g / l double-stranded DNA in the SDS gel.
  • the gel was washed with 1 OmM Tris-HCl (pH 7.8) and 5 mM 2-mercaptoethanol at 50 for 1 hour to remove SDS, and then at 4 with 1 OmM Tris-HCl ( The DNase was refolded at pH 7.8). Then the gel 1 Omm Tris-HCl (pH7. 8), and appropriate time ⁇ fin-incubated over Chillon at 37 with a solution containing 3 mM CaC l 2 and 3mM Mg C 1 2.
  • Distinct nuclease activity was detected as dark areas on a fluorescent background after staining the gel with ethidium bromide and irradiating with UV.
  • rat thymus was buffered with 0.1% Neudet -40 (NP-40) in buffer A [1 OmM Tris-HCl (pH 7.8), 2m2-mercaptoethanol, 0.3m PMSF. 1 s ].
  • the homogenate was centrifuged at 600 xg for 10 minutes. Collect the nuclear fraction (containing mitochondria) collected by ft and centrifuge the upper fraction for 1 hour at 150,00 O xg for 1 hour. The above fraction was called the cytosol surface fraction.
  • the endonuclease activity present in each of the obtained surface segments was determined by the method described in Reference Example 3.
  • the obtained supernatant (nuclear extract) was flattened with buffer solution N [2 OmM Tris-HCl (pH 7.8), 1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 ImM PMSF, 10% ethylene glycol]. It was applied to an S-Sepharose column (1 cm ID XI, 3 cm; manufactured by Pharmacia). After washing the column with buffer N, the column was developed by linearly increasing the salt S degree (KC 1) in buffer N from 0 M to 1 M (300 min) (flow rate 0.15 m 1 Zm). in). As a result of the measurement by the method of Reference Example 1 in Reference Example 3, the active substance of DNase was recovered as a single beak eluted with 0.6 M KC1.
  • the surface of the active substance was subjected to HP LC using a CM 5 PW force ram (5 mm ID x 50 mm; manufactured by Tosoh I) that had been equilibrated with buffer N to obtain a 0 to 1 M KC 1 straight line of buffer N. Elution was performed with a gradient (35 min ⁇ ) (flow rate: 0.3 m 1 / min).
  • each active surface (DNase, DNaseS and DNaser) was purified by a series of HPLC using heparin 5 PW. G2000 SW and CM5 PW columns.
  • each DNase fraction was applied to a heparin 5 PW column (5 mm ID x 50 mm: manufactured by Tosoh I) that had been equilibrated with buffer N, and the protein was 0 to 1 M in buffer N.
  • a heparin 5 PW column (5 mm ID x 50 mm: manufactured by Tosoh I) that had been equilibrated with buffer N, and the protein was 0 to 1 M in buffer N.
  • KC 1 linear gradient ⁇ :
  • the resulting DNase fraction was dialyzed against buffer S and stored at 0-4.
  • the DNase activity in each fraction obtained by HPLC was measured using the method described in Reference Example 3 (1).
  • Fig. 4 shows the profile of CM5PW HPLC obtained by purifying cell nuclei derived from apoptotic thymus similarly irradiated. From this, it was found that when apoptosis is induced by irradiation, DNase is reduced, whereas DNase activity is not affected at all. Similar results were seen with dexamethasone-treated apoptotic thymus.
  • the molecular weights of DNase and ⁇ purified according to Example 1 were determined by the SDS-PAGE regeneration method (active gel system) described in Reference Example 4. This active gel system is regenerated after removal of SDS and is based on the ability of DNase to degrade DNA during incubation.
  • DNase ⁇ ,; 8 and y were subjected to gel chromatography using a G2000 SW column (8 mm ID x 30 cm; manufactured by Tosoh Ichisha) (flow rate: 0.5 m
  • the optimal pH for DNase and ⁇ ⁇ activities was determined by performing HeLa S3 nuclear assembly (Reference Example 3, Atsey 1) in various buffer solutions from acidic to basic, and the rate of DNA fragmentation. Asked from.
  • Fig. 07 shows the pH dependence of DNasea (Fig. A), ⁇ (Fig. B) and 7 (Fig. C) in the CHe La S3 nuclear Atsushi system.
  • the Suifen solution used for the measurement was ft acid-KOHS city solution (pH 4.0, pH 4.4, pH 4.8, pH 5.2 and pH 5.6), MES-N a OH buffer (pH 5.6 and pH 6.2), MOPS-NaOH buffer (pH 6.8, pH 7.2 and pH 7.6), Tris-HC buffer (pH 7.4, pH 7.8, pH
  • the effect of the dual ions on the activities of DNase 8, DNase 8 and DNase 7 was examined. Specifically, the effect of Mg is, was 3 ⁇ 4 base by purified DNa s ea. 5 and MgC 1 activity ⁇ in the presence of 3 mM CaC 1 2, the concentration is ⁇ the measured. The effect of Ca was examined by measuring the activities of ⁇ and ⁇ , which were similarly purified, by increasing the concentration of CaCl 2 in the presence of 3 mM MgC 12.
  • ⁇ ⁇ + is that for DNase and S, 5 OmM MES-NaOH (pH 5.6) containing 3 mM MgC 12.1 mM 2-mercaptoethanol and 0.1 lm M PMSF It examined by UzutakaKa the concentration of ZnC 1 2 in a liquid, DNa se 3 mM for ⁇ C a C 1 ,, 3m MgC 12> 1 mM 2- Mel helmet ethanol and 5 Omm OPS containing 0. 1 mM PMSF The concentration of ZnC12 was investigated by depositing it in -NaOH (pH 7.2) buffer solution. Fig. 8 shows the results.
  • DNase 7 required both Ca i + and Mg 2+ for full activity, and the sensitivities of both were 1 to 3 mM (FIG. 8, a, b).
  • DNase 7 was sensitive to Zn, and its activity was inhibited by 50% by Zn at a low concentration of 40 (Fig. 8c).
  • the activity of DNasea and DNase; 3 was not affected by Mg, Ca ", etc., and was not affected by the presence of Zn ⁇ up to ImM. However, the concentration was as high as 10-3 OmM.
  • the presence of the gold ion inhibited the activity of DNase and DNase in the same manner as DNase7.
  • DNasea and / 5 are HeLa S3 cell nuclear chromatin as a substrate.
  • OES-tfeQH OIES-KaOH
  • MQPS-1 ⁇ 2GH Mg 92 94 16 1 Ca, * 1 1-2 to mercaptoethanol 115 119 96
  • DNase 7 may be an endonuclease involved in DNA fragmentation of apoptosis. Therefore, whether or not the DNA treated with DNase 7 produces a fragment having a 3'-OH / 5 'single P-terminal was determined according to the end labeling method described in Reference Example 2 (2) (ii). »I ’m sorry. Fig. 9 shows the results. As can be seen, when purified DNA from HeLa S3 cell nuclei digested with DNa ser (c in the figure) was end-labeled, it was observed in Reference Example 2- ( Figure 2, a, b). The same label pattern was seen. In terms of end labeling, the 5 'end of the DNA fragment was not labeled without pre-treatment with alkaline phosphatase (Fig. 9, lane 4). It was found to produce one P-terminus.
  • DNA fragments generated by DNasea (a in the figure) and ⁇ (b in the figure) are labeled at the 3 'end under Td only after pretreatment with lipase and before lipase. All of the 5 'termites reacted without treatment, indicating that they had 3' — P / 5 '— OH powder.
  • DNases are present in the cell nucleus in a monomeric fashion and cleave the linker region of chromatin DNA to produce nucleosome oligomers.
  • DNase ⁇ and 5 were both obtained by easily solubilizing from the nucleus, they are considered to be endonucleases present in the nucleoplasm.
  • DNase 7 could not be solubilized without sonication at a high clay concentration, so it was considered that it was strongly bound to a certain nuclear structure.
  • the DNase ⁇ of the present invention is an endonuclease endogenous in the cell nucleus that requires both C ai + and Mg 2+ for its activity.
  • the end of the DNA fragment cleaved by DNase 7 is the end of the DNA fragment produced in the apoptotic rat thymus.
  • DNase ⁇ and DNase 8 of the present invention are different from the above-mentioned DNa ser in physical and enzymatic properties, and the difference is due to the cleavage mode of chromosome DNA and divalent gold ion.
  • the request was for ⁇ .
  • DNase ⁇ and DNase ⁇ are present in the nucleus of the same type as DNase ⁇ and 8 in the nucleus of the thymus and the spleen of the rat and the liver of the rat, DN ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ metabolism and It is thought to play an important role in the degradation of virus DN ⁇ .
  • DNase7 was purified from splenic K cells having high DNase7 activity.
  • the homogenate was centrifuged at 60 Oxg for 10 minutes.
  • the precipitated nuclear fraction was collected, and the DNase activity in the nuclear surface was dissolved by sonication in buffer A containing 0.3 M ammonium sulfate.
  • the cells were removed by centrifugation at 00 Oxg for 1 hour.
  • the salt (KC 1) in the buffer N was developed by linearly depositing the salt (KC 1) from 0 M to 1 M (50 minutes) (flow rate 2.0 ml). / min).
  • the active substance of DNase was recovered as a single peak eluted with 0.6 M KC1.
  • the surface of the active substance was subjected to HPLC using a CM5 PW column (5 mm ID x 50 mm; manufactured by Sohzo Co., Ltd.) equilibrated with buffer N to give a linear graph of 0 to 1 M KC1 of buffer N.
  • the mixture was eluted with Zinto (30 min.) (Flow rate 0.3 ml Zn).
  • the DNase 7 active fraction eluted with 0.5M KC1 was purified by a series of HPLC using heparin 5PW, TSKG2000 SW and SP5PW columns.
  • each DNase surface was applied to a heparin 5 PW column (5 mm ID x 50 mm; manufactured by Tosoh I) that had been equilibrated with buffer N, and the protein was allowed to reach 0 to 1 in buffer N. It was developed and eluted with a linear gradient of MKC1 (30 minutes) (flow rate: 0. SmlZmin). The elution activity was further increased with a buffer M containing 0.3 M NaCl (2 Om ES-NaOH (pH 5.6), 1 mM 2-mercaptoethanol, 0. ImM PMSF, 2.5 ethylene glycol).
  • the gel was purified by gel permeation HPLC (flow rate 0.5 ml / min) using an equilibrated T SKG 2000 SW column (8 mm ID ⁇ 30 cm; manufactured by Tosoh Corporation).
  • the 7 fractions were finally subjected to HPLC using a SP5 PW column (5 mm ID x 50 mm; manufactured by Toso Ichisha) equilibrated with buffer M to obtain a buffer S of 0.3 to 0.7 M NaC.
  • the profile of SP5 PW HP LC is shown in Figure 10.
  • DNa eluted with 0.58 M NaC1 The se 7 activity fraction was collected and subjected to SDS-PAGE, and the DNase activity was measured using the method of (1) of Reference Example 3 (in FIG. 10).
  • each fraction of the fragment detected as a beak is dried in a centrifugal evaporator overnight, dissolved in an SDS solution, and subjected to amino acid analysis using a gas-phase protein sequencer (Shimadzu Corporation, PSQ-1).
  • the partial amino acid sequence of each peptide fragment was determined [Table 3, (K) shows lysine residues cleaved by enzymatic digestion].
  • the peptide still bound on the membrane is treated with Asp-N-endopeptidase (an enzyme that specifically cleaves the peptide bond on the amino side of the aspartic acid residue of the peptide) according to the method described above. After treatment, the resulting peptide fragments were separated and recovered by reverse-phase HPLC in the same manner (Fig. 1 lb), and the amino acid sequence was determined (Table 3).
  • Asp-N-endopeptidase an enzyme that specifically cleaves the peptide bond on the amino side of the aspartic acid residue of the peptide
  • Rat spleen KcDNA library As the rat spleen KcDNA library, a commercially available Rat spleen 5'-STRETCH cDNA Library (Clontech) was used. This library contains cDNA (average size: 1.8 kb) cDNA prepared using oligo (dT) random primers from mRNA extracted and purified from whole spleen K of adult rat (Sprague-Dawley. Os). (2 X 10 »independent clone) was inserted into the EcoRI site of the Sgt11 vector via an adapter.
  • cDNA average size: 1.8 kb
  • cDNA prepared using oligo (dT) random primers from mRNA extracted and purified from whole spleen K of adult rat (Sprague-Dawley. Os). (2 X 10 »independent clone) was inserted into the EcoRI site of the Sgt11 vector via an adapter.
  • an oligo DNA probe was synthesized based on the nucleotide sequence deduced from the underlined sequence.
  • Table 4 shows the nucleotide sequence of the oligo DNA probe (codons corresponding to the last amino acid are narrowed to one.
  • R A or G
  • Y T or N: A, G, T or C.
  • H T, C or A
  • the mixture of bacteria and phage was spread on a 53 ⁇ 4LB agar medium containing 1 OmM MgSO, and then 60-65 LB totubagarose (6 ml) was spread and mixed well. When the toppagarose was hardened, it was incubated at 37 days. After incubation, allowed to stand for 1 hour the Bureto in 4'C, was then performed fi-out transfer to nylon filters (balls, Inc.) on the Totsubuagarosu t
  • nylon filter was subjected to a ra treatment in a denaturing solution for 20 seconds and then in a neutralizing solution for 20 seconds.
  • the filter was dried on paper and further fixed by UV irradiation.
  • Oligo DNA Burobu prepared in the above (4) using [7- 32 P] ATP and T4 kinase, a 5 'end and Si P ⁇ .
  • a reaction solution having the following composition was incubated at 37 for 30 minutes.
  • a blur hybridization solution was prepared as follows.
  • the filter was prepared in the above (1).
  • the filter was placed in the dihedralization solution, and left at 37 overnight. Subsequently, the labeled probe prepared in the above (1) was mixed with an appropriate amount of a hybridization solution, and a hybridization solution, and hybridized at 37'C for 18 hours using 5 u1 of a probe solution per filter.
  • the recovered phage DNA was treated with BswiI to excise the cDNA insert, a part of the phage DNA was subjected to agarose gel S electrophoresis, and the insert length was confirmed by ethidium-muff staining. After S-electrophoresis, the DNA was transferred to Nylon II (Biodyne, manufactured by Ball Inc.) according to the method of Southern et al. [J. Mol. Biol. 98, p503 (1975)], and hybridized as in the screening. Go to the localization
  • Insert DNA was recovered using 11 Kit. After blunting the ends with the K1enow enzyme, the insert DNA was integrated into the SmaI site of pBS IKS (+) which had been BAP-treated with T4 ligase. Using this ligage solution, the competent Escherichia coli DH5 cr was transformed. That is, 0.3 ml of the competent bacterial strain was added to a ligation solution of a total volume of 7 ⁇ 1, left on ice for several hours,
  • the primary translation product of the DNase ⁇ ⁇ gene was found to have 25 amino acid residues (amino acid numbers 1 to 25 of SEQ ID NO: 1) on the ⁇ -terminal side. It was found to have a precursor peptide region consisting of Therefore, the mature DNase7 protein is composed of 285 amino acid residues (amino acid numbers 26 to 310 of SEQ ID NO: 1), and the molecular weight of the protein deduced from the amino acid sequence is 33.027. This value was in good agreement with the molecular weight of the protein by SDS-PAGE.
  • KLH Keyhole Limpets Hemocyanin
  • FCA complete Freund's adjuvant
  • the present invention provides novel DNAs, / S and 7, which catalyze a reaction that selectively cleaves a linker site of chromatin DNA.
  • the present invention also provides a novel DNase 7 that contributes to apoptosis.
  • the present invention provides an amino acid sequence of rat DNase 7, a DNA encoding the amino acid sequence, a base sequence of the DNA, a recombinant vector having the DNA, and a host ilffl cell transformed with the recombinant vector.
  • a method for producing ⁇ DNase ⁇ by culturing the host cell; and an antibody against the DNase ⁇ or its precursor, or a fragment thereof.
  • the DNase ⁇ of the present invention it is possible to elucidate, at a molecular level, a mechanism for controlling carcinogenesis in vivo by apoptosis, a mechanism for controlling autoimmunity, the onset of AIDS, and the like. It is useful in that it contributes to the prevention, treatment, and development of diagnostics for cancer, autoimmune diseases, and viral infections.
  • the antibody prepared based on the DNase of the present invention is capable of determining the malignancy of pain.
  • inhibitors and activators that are specifically searched for DNaser activity can be novel “apoptosis-controlling drugs”, and DNase7 gene is a cancer-causing agent.
  • DNase7 gene is a cancer-causing agent.
  • DNase ⁇ and / 5 of the present invention are useful for the development of therapeutic agents for viral infection, because they increase during viral infection and cleave virus D D.
  • antibodies prepared based on the DNAse ⁇ or / S of the present invention are considered to be useful as reagents for diagnosing virus infection and the like.
  • Sequence type nucleic acid
  • TTTCTTAAAG TCGTCCCTTG CTTCCAGATA AAATGGCCTC GTGGGTCTCA GCTCTCTGCA 1024 CACTCAGGAA TTAAGACTGG CTAAGCTGTT TTCACTGTCC ACTCTGGTTA ATTTTCCCTG 1084 GAGCCAAGTT GGGAGGACAG CCTTCTGTTA CATCACCCTG ACCACGGGAT CC CCTCGATCAGATCC CCCTCCGAGATCCATCCATCAGATCC 1
  • Lys Asp Phe Val lie Val Pro Leu His Thr Thr Pro Glu
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA

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Description

明 細 害
新規デォキシリボヌクレアーゼ
技術分野
本発明は、 3種類の新規なデォキシリボヌクレアーゼ （以下、 単に DNa s e という） に関する。 詳細には、 アポトーシスに特徴的な現象である DNAの断片 化、 すなわちクロマチン DNAをモノまたはォリゴヌクレオソーム単位に分解す る反応を触媒する新規 DN a s eに関する。
また本発明は、 上記の新規 DN a s «の内の - (後述の DNa s e 7) のァ ミノ酸配列をコードする DNA、 該 DNAを含有するベクター、 該ベクターで形 質転換された宿主細胞、 該宿主細胞を培養することによる該 DNa s eの製造方 法、 及び該 DNa s eもしくはその前駆体ボリペプチド、 又はそれらの断片に対 して親和性を有する抗体に関する。
背景技 fer
近年、 細胞組織の死に して、 アポトーシス （apoptosis)が注目されている。 このアポトーシスは、 病理的細胞死である壞死 （ネクローシス） とは異なり、 細 胞自身の遺伝子に *初から組み込まれている死であると考えられている。 すなわ ち、 何らかの外部的または内部的要因が引き金となって、 アポトーシスをブログ ラムする遣伝子が活性化され、 当該自壊プログラムが発動することによって起こ る能動的な钿胞死であると考えられている。
差替 え 用紙 （規則 26) 表 1
アポトーシス
発 生 過 程
ΰ^ϋ^ ^SM^, , Ι^Ιの ±B3Bfi≥ 神 経 系 よ。 ¾®tefiS5E 内 分 泌 系 グル: an コィドによる »em^E アンドロゲン^ ¾こよる lifflKW!^E 免 疫 系
Figure imgf000004_0001
ウィル^ A I
Figure imgf000004_0002
{ΦΚΰΗ3!^^:よる
熱
差替 え 用紙 （規則 26) アポトーシスは、 上記表 1に示すように非常に多くの生命現象に κわっている。 すなわち、 発生過程での形態形成のみならず、 成熟した個体における皮膚の表皮 細胞， 小腸や胃の上皮細胞といった正常細胞の交代 （古くなつた細胞の除去） 、 ホルモン依存性の組繳である胸腺のグルココルチコィドによる萎縮、 去勢による 前立腺の萎縮、 さらに自己成分に反応してしまう免疫担当細胞の排除や、 神経栄 養因子の除去による神経細胞死もアポトーシスによることが示唆されている。 また、 アポトーシスは、 このような生理的な細胞死だけでなく、 放射線照射を 受けた細胞や、 ウィルス感染した細胞の細胞死にも見られる。 さらに A I D Sゥ ィルスによる T細胞の滅少もアポトーシスによる細胞死が原因であることが報告 され、 注目を集めている。 この他に、 薬物や毒物の投与、 熱といった化学的およ び物理的刺激によってもアポトーシスが起こる。 さらにアルツハイマー病等の神 経変性疾患における神経細胞死、 癌病巣內での腫瘸細胞の自然消失や制癌剤によ る細胞死にもアポトーシスが閟与していることが明らかになつている。
したがって、 アポトーシスの分子機構を解明することは、 個体発生及び発癌の 制御 （調整） における細胞死の生化学的意義、 役割を理解する上に重要である。 アポトーシスに共通する特徴的な現象は、 細胞膜の変化 （微絨毛の消失） を伴 う舳胞の縮小、 クロマチンの凝縮等といつた形態上の変化およびクロマチン D N Aの断片化である (Br. J Cancer 26. 239-257 (1972) 、 Nature 284, 555-556 (1980)〕 。 中でもクロマチン D N Aのヌクレオソー厶単位での断片化 （図 1 ) は、 アポトーシスの発生要因等の多様性にかかわらず、 いずれのアポトーシス細 胞にも共通して見られる最も顕著な現象であり、 このことからアポトーシスの力 スケードはクロマチン D N Aの断片化というプロセスに収束することが示唆され ている。
従来から、 当該アポトーシスで生じるクロマチン D N Aの切断が、 Ζ η ί +感受 性の、 内在性 C a ί +依存性ェンドヌクレアーゼによって触媒されることが示唆さ れている CJ. Imnunol. 132, 38-42 (1984) 、 J. Biol. Chem. 266. 18580-1858 5 (1991)、 EMBO J. 12, 371-377 (1993) 、 Biochemistry 32, 9129-9136 (199
差替 え 用紙 （規則 26) 3) 等〕 。
かかる示唆のもと、 最近、 W腺や培養钿胞から、 アポトーシスに閟わる醉素の 候補として考えられる数種のエンドヌクレアーゼ （N u c 1 8、 D N a s e I、 D N a s e l l) が精製されている [Biochem. Biophys. Res. Comnun. 39, 254-2 59 (1970)、 J. Biol. Chem. 266. 18580-18585 (1991)、 EUBO J. 12. 371-377 (1993)、 Arch. Biochem. Biophys. 300. 440-450 (1993) 等〕 。
しかしながら、 かかる酵素は正常な状 ISの細胞から精製されたものであり、 骸 酵素が実際にアポトーシスに関与しているか否かについての確かな証拠はまだ得 られていない。
従って、 アポトーシスのクロマチン D N Aの断片化に関与するェンドヌクレ ァーゼおよびその制御機構の解明は、 アポトーシスの分子機構の全容、 さらには 細胞生存および細胞死のメ力二ズムを理解するうえで めて重要である。 さらに は、 アポトーシスが関与する癌、 自己免疫疾患、 A I D S等の疾患の診断、 予防 もしくは治療薬を開発する手立てとなる点で有用である。
発明の開示
本発明者らは、 アポトーシスに関与するェンドヌクレアーゼを研究していたと ころ、 ラット胸腺細胞の核画分に、 クロマチン DNAのリンカ一部位を選択的に 切断し、 アポトーシスに特徴的な D N A断片化を起こす新規なエンドヌクレア一 ゼを 3種類見出した。 そして、 これら 3種のエンドヌクレア一ゼを単離精製し、 さらなる研究遂行の結果、 そのうちの一^つが、 アポトーシスのクロマチン D NA の断片化に関与するェンドヌクレアーゼであることを確 Sし、 さらに該ェンドヌ クレアーゼの一次構造及びその遺伝子の塩基配列を決定、 取得することに成功し て本発明を完成した。
すなわち本発明は次に述べるものである。
( 1 ) クロマチン DNAのリンカー部位を選択的に切断し得るェンドヌクレアー ゼであって、 かつ下記性伏を有することを特徵とする新規 DN a s e (以下、 D N a s e rという) 。
差替 え 用紙 （規則 26) ①局在性 ： 細胞核
②分子置 ： （i) 3 3, 0 0 0 (SD S - PAGE)
(ii) 3 1 , 0 0 0 (ゲル «過法）
③至適 pH： 7. 2
④ 2価隔イオン要求性 Ca*V g2+, Μηί+依存性
⑤ Zni+による阻害 I C.o= A 0 Μ
⑥ DNA切断様式 3' -OH, 5' 一 Ρ末饞生成型
(2) クロマチン DNAのリンカ一郎位を選択的に切断し得るェンドヌクレアー ゼであって、 かつ下記性状を有することを特徴とする新規 DNa s e (以下、 D Na s e aといつ) 。
①局在性 ： 細胞核
②分子 i ： (i) 32, 000 (SDS - PAGE)
(ii) 28, 000 (ゲル «¾法）
③至適 pH： 5. 6
④ 2優 »イオン要求性 非依存性
⑤ Ζη による阻害 I Ceo> 1 mM
⑥ DN Α切断様式 3' - P, 5' — OH末端生成型
(3) クロマチン DNAのリンカー部位を選択的に切断し得るエンドヌクレア一 ゼであって、 かつ下記性状を有することを特徵とする新規 DNa s e (以下、 D Na s e y8という） 0
①局在性 ： 細胞核
②分子量 ： (i) 32， 000 (SDS - PAGE)
(ii) 30, 000 (ゲル »通法）
③至適 pH： 5. 6
④ 2価隔イオン要求性 非依存性
⑤ Zn1+による阻害 I C«o> 1 mM
⑥ DN A切断様式 3' - P, 5' 一 OH末端生成型
差替え用紙 （規則 26) (4)実質的に、 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列 （アミノ酸番号 26 〜31 0) を有する上記 （ 1 )記載の新規 DN a s e。
(5)前駆体ボリペプチドが、 N末端プリカーサ一ペプチド領域を有する上記 (1)記載の新規 DN a s e。
(6) N末端プリカーサ一ペプチド領域として、 実 的に配列表配列番号 1に示 されるアミノ酸配列 （アミノ酸番号 1〜25) を有する上記 （4)記載の新規 D N a s e
(7)上記 （1) 又は （4：) 〜 （6) のいずれかに記載の DN a s eをコードす る塩基配列を有する DNA。 好ましくは、 配列表配列番号 2記載の塩基配列 （塩 基番号 87〜94 1) を有する DNA、 より好ましくは、 配列表配列番号 2記載 の塩基配列 （塩基番号 1〜94 1) を有する DNA。
(8)上記 （7) の DNAを含有する組換えベクター。
(9)上記 （8) の組換えべクタ一で形質転換された宿主钿胞。
(1 0)上記 （9) の宿主細胞を培養し、 得られる培養物から採取されることを 特徴とする上記 （1) 又は （4)〜（6) のいずれかに記載の DN a s eの製造 方法。
(1 1)実質的に配列表配列番号 1記載のァミノ酸配列 （ァミノ酸番号 1〜31 0) の全部又は一部を有するペプチドに親和性を示す抗体。
図面の簡単な説明
図 1は、 アポトーシスにおける DNAの断片化を模式的に示した図、 および断 片化された DN Aのァガロースゲル ¾気泳動像の写真である。
図 2は、 アポトーシスラット胸腺から抽出した DNAをェンドラベリング法に よって分析した DNAの一部を 2%ァガロースゲル鼋気泳動にかけ、 オートラジ ォグラフィ一した結果を示す写真 （a, b) である。 aは、 放射線照射したアポ トーシスラット胸腺から抽出した DNA、 bは、 デキサメタゾン処理したアポ トーシスラット胸腺から抽出した DNAを示す。
レーン 1 ： 3' 末端をラベルする前にアルカリホスファターゼ （APa s e) と
6 差替 え 用紙 （規則 26) 共にィンキュベーシヨンした DNAを示す。
レーン 2 ： 3' 末端をラベルする前に APa s e非存在下でインキュベーション した DNAを示す。
レーン 3 ： 5' 末端をラベルする前に A P a s e存在下でインキュベーションし た DNAを示す。
レーン 4 ： 5* 末端をラベルする前に AP a s e非存在下でインキュベーション した DN Aを示す。
図 3は、 正常のラット胸腺由来の、 S— Sセファロースにより得られた DNa s eの活性画分を CM5 PWカラムに付した HPLCのプロファイルを示す図、 および各フラクションのァガロースゲル電気泳動像を示す写真である。
図 4は、 アポトーシスラット胸腺由来の、 S— Sセファロースにより得られた DNa s eの活性画分を CM5 PWカラムに付した HPLCのプロファイルを示 す図、 および各フラクションのァガロースゲル S気泳動像を示す写真である。 図 5は、 DNa s ea, /8および 7の活性ゲル分析の結果 気泳動像） を示 す写真である。
レーン 1 ：正常ラッ ト胸腺の細胞核から铕製した DNa s eaの分子量を活性ゲ
ルシステムで分析した結果である。
レーン 2 ：正常ラット胸腺の細胞核から精製した DNa s e Sの分子鼉を活性ゲ ルシステムで分析した結果である。
レーン 3 ： 7線照射したアポトーシス細胞から精製した DNa s e 7の分子量を 活性ゲルシステムで分析した結果である。
タンパクの分子量マーカーは、 それぞれホスフオリラーゼ b ( 97, 400) 、 ゥシ血淸アルブミン （66, 200)、 オボアルブミン （45, 000 ) 、 崁酸 デヒドラターゼ （ 31, 500)、 大豆トリブシンインヒビター （21， 50 0) およびリゾチーム （ 1 4, 400) を示す。
図 6は、 DNa s ecr (図 a)、 DNa s e/S (図 b) および DNa s e r (図 c) の TSKG— 2000 S Wゲル ¾¾H PLCのプロファイルを示す図で
差替 え用紙 （規則 26) ある。 溶出は流速 0. 5m l /m i nで行った。 なお、 図 a中の挿入図は、 分子 量標準品 〔 I gG ( 1 58, 0 00) 、 オボアルブミン （ 44, 000 ) 、 ミオ グロビン （ 1 7, 000) 〕 による検量線を示す。
図 7は、 DNa s e α (図 a) , β (図 b) および 7 (図 c) の pH依存性を 示す写真 （ァガロースゲル S気泳動像） である。 精製した DNa s e a, ;5およ び 7の活性を酸性〜塩基性 （写真中、 向かって左から右） の緩衝液中でそれぞれ 測定した。 写真中の左端レーンから、 酔酸一 KOH緵衡液 （ρΗ4· 0、 ρΗ4. 4、 ρΗ4. 8、 ρΗ5. 2および ρΗ5. 6)、 MES— NaOH緩衝液 （p H5. 6および pH6. 2)、 MOPS— NaOH緩衝液 （pH 6. 8、 pH7. 2および pH7. 6)、 Tr i s— HC 1緩衝液 （pH7. 4、 pH7. 8、 p H 8. 2および pH9. 0) および CHES-NaOH緩衝液 （pH8. 6、 p H 9. 4および pH l O. 4) 中での結果を示す。
図 8は、 DNa s e a, δおよび" の活性に対する 2 ffi隔ィオンの影響を示し た図である。 aは、 精製した DNa s e a (一△一） 、 β (一 0~)、 r (― · 一） の活性を 3mM Ca C 12 の存在下で MgC l 2 の g度を增加させて測定 した結果を示す。 bは、 精製した DNa s e a (一△一） ， β (-Q— ) および r (一曇一） の活性を 3mM MgC 12 の存在下で CaC 12 の濃度を増加さ せて測定した結果を示す。 cは、 それぞれの DNa s eに対する至邃条件下で Z nC 1 ί の濃度を增加させて測定した結果を示す。
図 9は、 DNa s e a, Sおよび 7それぞれによる DNAの分解様式を示す写 真 （2%ァガロースゲル ¾気泳動したものをオートラジオグラフィ一で見たも の） である。 写真 aは、 DNa s e αで消化した He La S 3細胞核から抽出 した DNAの分解様式を、 写真 bは DNa s e /Sで消化した He L a S 3钿胞 核から抽出した DNAの分解様式を、 そして写真 cは DNa s e τで消化した H e La S 3細胞核から抽出した DNAの分解様式を示す。
レーン 1 ：アルカリホスファターゼ （AP a s e) で前処理した後、 3' 末端ラ ベリングしたもの。
差替 え用紙（規則 26) レーン 2 : AP a s eで前処理しないで、 3' 末端ラベリングしたもの。
レーン 3 ： AP a s eで前処理した後、 5' 末端ラベリングしたもの。
レーン 4 ： AP a s eで前処理しないで、 5' 末端ラベリングしたもの。
図 1 0は、 SP 5 PW HP LCのブロファイル。 各フラクションの DNa s e活性 （一拿一）、 各フラクションの 280 nmの吸光度（一） 、 N a C 1饞度 勾配（一一） 。
図 1 1は、 逆相 HPLCを用いたエンドべプチダーゼにより限定分解された D Na s e 7フラグメントの分離。
a ： Lys— Cエンドぺブチダーゼで消化されて遊離したフラグメント。
b ： Ly s— Cエンドべプチダーゼ処理で PVDF膜上に残ったぺブチドをさら に As p— Nェンドぺプチダーゼで消化したときに遊離するフラグメント。
発明の詳細な説明
アポトーシスに閟与するェンドヌクレアーゼを同定するためのアブローチは、 アポトーシス細胞で見られ クロマチン DN Aの各断片の性質とアポトーシス钿 胞の核から精製したェンドヌクレアーゼによって断片化された DNAの断片の性 Kとを比較することである。
アポトーシス細胞で生じるクロマチン DNAの断片は、 アポトーシスの進行時 間に比例してヌクレオソーム単量体， 二量体といった短い D N A断片の比率が增 加していくが、 完全に単量体に至るまで進行するわけではなく、 ある程度の状態 で停止する。 従って、 アポトーシスをおこした細胞から DNAを抽出してァガ ロースゲル S気泳動法により DN Aを解析すると、 その DNA泳動像はヌクレオ ソーム単量体に含まれる DNA (約 1 80塩基対） の整数倍の長さの断片として はしご状に観察される。
また、 アポトーシスで生じる DNAの断片化は、 Ca2+ZMgi+依存性で、 Z により阻害される。 さらに、 産生される DNA断片は、 いずれも 5' 末端側 にリン酸基を有する 3' -OH/5' 一 P型 2本鎮である。
(a)本発明 DNa s e rについて
差替 え 用紙 （規則 26) 本発明の DNa s e は、 動物細胞の核、 好ましくはラット， 子ゥシ等哺乳類 の胸腺、 脾 Kまたは肝 Kに由来する細胞核、 より好ましくは子ゥシ胸腺または ラット脾 K由来の細胞の核に存在するェンドヌクレアーゼである。 また当該 DN a s e <yは、 アポトーシスの誘導の有無にかかわらず、 正常細胞の核にもアポ トーシス細胞の核にも共に同程度の活性をもって存在する。 この点、 該 DNa s e 7は、 アポトーシス誘導によって活性が消失する本発明 DNa s e αおよび D Na s e/Sと相違する。 なお、 ここでいうアポトーシスは、 その発生要因により 特に限定されることなく、 自然発生的アポトーシスのみならず、 放射線照射ゃグ ルココルチコィド処理等により人為的に生じるアポトーシスも広く包含される。 また、 本発明の DNa s e 7は、 ドデシル硫酸ナトリウム一ボリアクリルアミ ドゲル ¾気泳動法 （以下、 SDS— PAGEという） により約 33, 000の分 子量を示し、 ゲル ¾¾クロマトグラフィーにより約 31, 000の分子量を示す 単量体ボリペプチドである。 なお、 SDS— PAGEの好ましい想様は後の実施 例 2 (1) において引用する参考例 4に、 およびゲル ¾¾クロマトグラフィーの 好ましい憨様は後の実施例 2 (1) に詳述する。
本発明の DNa s e 7は、 クロマチン DNAのリンカー部位を選択的に切断し て、 5' 末端側にリン酸基をもつモノまたはオリゴヌクレオリームを生成する (5' -？/Ζ' 一 OH生成型） DNa s eである。 当該 DNa s e活性に最適 な pH条件は、 中性 pH、 好ましくは MOPS— NaOH緩衝液またはトリス塩 ¾中で pH約 6. 8〜約 7. 6、 より好ましくは pH約 7. 2である。
また、 当該 DNa s e γの活性化には、 C a 2+及び Mg +の両者、 または Mn 単独の少なくともいずれかの存在を必要とする （なお、 本発明において、 Ca 2V gi+, Mn 依存性と略す）。 当該 Ca2+、 Mg または Mn 2+の «度は、 それぞれ l〜3mM、 好ましくはそれぞれ 3mMである。 より好ましくは、 3m M濃度の C a "及び 3 mM濃度の M g の両者が存在することである。
さらに、 DNa s e Tの活性は、 アポトーシスを阻害することが知られている マイクロモル濃度の Ζη2Ίこ対して感受性を示し、 40 /ζΜという低濃度の Ζη
1 0 差替 え用紙 （規則 26) により活性の 50 が阻害される （ I Cso= 40〃M) 。 また、 DNa s eお よび RNa s eの阻害剤であるォゥリントリカルボン酸 1 00 Mで完全に活性 が阻害される。 しかしながら、 当該 DNa s e < の活性は、 DNa s e lを阻害 することが知られている G—ァクチンによっては阻害されない。
本発明の DNa s e 7は、 動物組維または細胞を原料として、 その細胞核から 抽出锖製する方法、 化学的合成による方法または遺伝子組換え技術等の公知手法 を適宜用いることによって製造することができる。 具体的には、 下記の方法が例 示される。
ラット、 子ゥシ等哺乳類の胸腺、 脾敏または肝 K由来の細胞、 好ましくはラッ トまたは子ゥシの胸腺又は脾 K由来の钿胞を原料として、 その細胞から非ィォン 性界面活性剤の存在下で中性領域、 好ましくは pH約 7. 8の锾衢液を用いてホ モジネートすることにより細胞核を単雔する。 ついで得られた単離核を硫酸アン モニゥ厶の存在下 （好適な 81様としては、 0. 4〜0. 5Mの S度の硫酸アンモ 二ゥムの使用が挙げられる。 ） で、 必要により超音波処理することにより可溶化 して、 遠心処理により上淸面分を得る。
得られた上淸画分を隔ィォン交換体、 好ましくは強酸性瞎ィォン交換体を担体 とするカラムクロマトグラフィーにかけ、 塩 «度による直線グラジヱント法によ り展開させて、 溶出した活性画分を取得する。 ついで該活性画分をさらに場ィォ ン交换体、 好ましくは弱酸性隔イオン交換体を担体とする高速液体クロマトグラ フィー （以下、 HPLCという） にかけ、 同様に塩濃度による直線グラジュント 法により展開させる。 この際、 カラムとして CM5 PWカラム （5mm I. D. X 50mm；柬ソ一社製） を、 また溶離液として ImM 2—メルカブトエタ ノール、 0. lmM PMS Fおよび 1 0 %エチレングリコールを含有する 20 mM トリス塩酸緩衢液 （pH7. 8) を用いて KC 1の S度勾配法で展開した 場合、 本発明の DNa s e 7は KC 1濃度約 0. 55Mの位置に溶出される。 ついで、 該溶出活性面分をへパリンカラムによる HPLC、 ゲル據過 HPLC または暘ィォン交换体による H P L Cなどの公知精製クロマトグラフィーを適宜
1 1 差替 え用紙 （規則 26) 組み合わせることにより、 より一層高度に精製された単量体の DN a s e 7を取 得することができる。 かくして得られた DNa s e 7は、 さらに透析、 遠心分離、 凍結乾燥等を施すことができる。
本発明の DNa s e 7*は、 当該酵素による DN A断片の切断様式とアポトーシ スを起こしたラット胸腺又は脾 K細胞で産生される DNA断片の切断様式とがー 致すること、 イオン依存性において類似すること、 および当該酵素がアポトーシ スを起こしたラット I»腺又は脾 K細胞核に存在していること等から、 B¾腺又は脾 K、 特にラット胸腺又は脾接でのアポトーシスの DN Α断片化に関与する酵素で あると考えられる。
当該 DNa s e "τは、 ヒトを含む哺乳動物 （ゥシ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 モ ルモット、 ゥサギ等） で生じるアポトーシスを分子レベルで解明するツールの一 つとして、 また DNa s e γの抗体を用いた診断薬または DNa s e τの阻害剤 および活性化剤によるアポトーシス制御性医薬品の開発、 アポトーシスの評価法 または DNa s eァの遗伝子を用いた痛や自己免疫疾患のアポトーシス «伝子療 法等を確立するための基 Sとして有用である。
(b)本発明 DNa s e αについて
本発明の DNa s eotは、 動物細胞の核、 好ましくはラット， 子ゥシ等哺乳類 の胸腺、 脾 Kまたは肝 Kに由来する細胞核、 より好ましくは子ゥシ胸腺または ラット牌 Κ由来の細胞の核に存在するェンドヌクレアーゼである。 また当該 DN a s e α;は、 正常細胞の核に存在し、 アポトーシス細胞の核には殆ど存在しない。 また、 本発明の DNa s eaは、 SDS-PAGEにより約 32, 000の分子 iを示し、 ゲル Λ¾クロマトグラフィーにより約 28, 000の分子量を示す単 量体ボリペプチドである。 なお、 SDS— PAGEの好ましい憨様は実施例 2 (1) において引用する参考例 4に、 およびゲル «¾クロマトグラフィーの好ま しい想様は実施例 2 (1) に詳述する。
本発明 DNa s e αは、 クロマチン DNAのリンカー部位を選択的に切断して、 3' 末端側にリン酸基をもつオリゴヌクレオソームを生成する （3' -P/5'
1 2 差替 え用紙 （規則 26) 一 OH生成型） DNa s eである。 当該 DNa s e活性に最適な p H条件は、 弱 酸性 p H、 好ましくは醉酸ー K OH緩衢液または ME S— N a OH緩街液中で p H約 5. 4〜約 6. 0、 より好ましくは pH約 5. 6である。
また、 当該 DNa s e aの活性は、 Ca 、 Mg 2+及び Mn などの二価の金 厲イオンの存在の有無に影響されない。 さらに Ζηϊ+にも非感受性であり活性を 約 50%阻害する濃度は ImM以上である。 また、 DNa s eおよび RNa s e の阻害剤であるォゥリントリカルボン酸 1 00 / Mで完全に活性が阻害される。 しかしながら、 本 DNa s eaの活性は、 G—ァクチンによっては阻害されない。 本発明の DNa s eaは、 動物組繳または細胞を原料として抽出精製する方法、 化学的合成による方法または遗伝子組換え技術等公知手法を速宜用いることに よって製造することができる。 具体的には、 下記の方法が例示される。
まず、 ラット胸腺由来の細胞から非イオン性界面活性剤の存在下で中性領域、 好ましくは pH約 7. 8の缓衢液を用いてホモジネートすることにより細胞核を 単雄する。 ついで、 硫酸了ンモニゥムの存在下 （好適な態様としては、 0, 15 〜0. 25 Mの硫酸アンモニゥムの使用が挙げられる） で、 必要により超音波処 理することにより可溶化して、 遠心処理により上淸画分を得る。
得られた上淸面分を |¾ィォン交換体、 好ましくは強酸性 ィォン交换体を担体 とするカラムクロマトグラフィーにかけ、 塩濃度による直線グラジヱント法によ り展開させて、 溶出した活性面分を取得する。 ついで該活性面分をさらに Kィォ ン交换体、 好ましくは弱酸性 ISイオン交換体を担体とする HPLCにかけ、 同様 に塩濃度による直線グラジェント法により展開させる。 この際、 カラムとして C M5PWカラム （5mm I. D. x5 Omm；東ソ一社製） を、 また溶離液と して lmM 2—メルカブトエタノール、 0. ImM PMSFおよび 1 0%ェ チレングリコールを含有する 2 OmM トリス塩酸緩衝液 （pH7. 8) を用い て KC 1でグラジェントをかけた場合、 本発明の DNa s e αは KC 1濃度約 0. 25 Μ付近の位 に溶出される。
ついで、 該溶出活性面分をへパリンカラムによる HPLC、 ゲル «¾HPLC
1 3 差替 え用紙 （規則 26) および隔ィォン交换 H P L Cなど公知精製クロマトグラフィーを適宜組み合わせ ることにより、 より一B高度に精製された単量体の DN a s e αを取得すること ができる。 かくして得られた DNa s e aは、 さらに透析、 遠心分離、 凍結乾燥 等を施すことができる。
本発明の DNa s eなは、 ヒトを含む哺乳動物 （ゥシ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 モルモッ ト、 ゥサギ等） で生じる DN A切断様式の解析試薬として、 また当該酵 素はウィルス DNAを 3' -P/5' 一 OH生成型に切断することから抗ウィル ス剤を開発するための基 となる点で有用である。
(c)本発明 DNa s e )8について
本発明の DNa s e/8は、 動物細胞の核、 好ましくはラット， 子ゥシ等哺乳類 の胸腺、 脾 Kまたは肝 Kに由来する細胞核、 より好ましくは子ゥシ胸腺または ラット脾 K由来の細胞の核に存在するェンドヌクレアーゼである。 また当該 DN a s e>Sは、 正常钿胞の核に存在し、 アポトーシス細胞の核には殆ど存在しない。 また、 本発明の DNa s e Sは、 SDS— PAGEによると約 32, 000の分 子量を示し、 ゲル ¾過クロマトグラフィーによると約 30, 000の分子量を示 す。 なお、 SDS— PAGEの好ましい態様は実施例 2 (1) において引用する 参考例 4に、 およびゲル «¾クロマトグラフィーの好ましい態様は実施例 2 ( 1 ) に詳述する。
本発明 DNa s e 3は、 クロマチン DNAのリンカー部位を選択的に切断して、 3' 末端側にリン酸基をもつオリゴヌクレオリーム （3' -P/5* 一 OH生成 型） を生成する DNa s eである。 当該 DNa s e活性に最邃な p H条件は、 弱 酸性 p H、 好ましくは ft酸一 K 0 H緩衝液または M E S— N a 0 H縵街液中で p H約 5. 2〜約 6. 2、 より好ましくは pH約 5. 6である。
また、 当該 DNa s e/Sは、 Ca2+、 Mg 及び Mn などの二価金属暘ィォ ン非依存的に活性を有し、 また Ζηί+にも非感受性である （50%活性阻害膿度 >約 ImM)。 また、 DNa s eおよび RNa s eの阻害剤であるォゥリントリ カルボン酸 100 で完全に活性が阻害される。 しかしながら、 本 DNa s e
差替 え用紙 （規則 26) ;6の活性は、 G—ァクチンによっては阻害されない。
本発明の DNa s e；5は、 動物組織または細胞を原料として抽出精製する方法、 化学的合成による方法または遗伝子組換え技術等公知手法を邃宜用いることに よって製造することができる。 具体的には、 下記の方法が例示される。
まず、 ラット胸腺、 脾臓または肝 K由来の細胞を原料として、 その細胞から非 イオン性界面活性剤の存在下で中性領域、 好ましくは pH約 7. 8の锾衝液を用 いてホモジネートすることにより钿胞核を単離する。 次いで ¾酸アンモニゥムの 存在下 （好適な態様としては、 0. 2〜0. 3Mの硫酸アンモニゥムの使用が举 げられる） で、 必要により超音波処理することにより可溶化して、 遠心処理によ り上淸画分を得る。
得られた上淸画分を暘イオン交換体、 好ましくは強酸性陽イオン交換体を担体 とするカラムクロマトグラフィーにかけ、 塩濃度による直線グラジ ント法によ り展開させて、 溶出した活性画分を取得する。 ついで該活性画分をさらに隔ィォ ン交换体、 好ましくは弱酸性 »イオン交換体を担体とする HPLCにかけ、 同様 に塩濃度による直棣グラジェント法により展開させる。 この際、 カラムとして C M5 PWカラム （5mm 1. D. x 5 Omm：東ソ一社製） を、 また溶離液と して lmM 2—メルカブトエタノール、 0. lmM PMSFおよび 1 0¾ェ チレングリコールを含有する 2 OmM トリス塩酸緩衝液 （pH7. 8) を用い て KC 1でグラジェントをかけた場合、 本発明の DNa s e;Sは KC 1濃度約 0. 35 M付近の位置に溶出される。
ついで、 該溶出活性画分をへパリンカラムによる HPLC、 ゲル ¾«HPLC および碭イオン交換体による H P L C等の公知精製クロマトグラフィーを適宜組 み合わせることにより、 より一層高度に精製された DNa s e/Sを取得すること ができる。 かくして得られた DNa s e Sは、 透析、 遠心分離、 凍結乾燥等を施 すことができる。
本発明の DNa s e ^は、 ヒトを含む哺乳動物 （ゥシ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 モルモッ ト、 ゥサギ等） で生じる DN A切断様式の解析試薬として、 また当該酵
1 5 差替 え 用紙 （規則 26) 素はウィルス DNAを 3 ' — PZ 5 ' — OH生成型に切断することから抗ウィル ス剤を開発するための基整として有用である。
( d ) 本発明 DN a s e 7の一次構造 （アミノ酸配列）
本発明 DN a s e rの好ましい »様は、 実質的に配列表配列番号 1に示される アミノ酸配列中、 アミノ酸番号 2 6〜3 1 0で示されるアミノ酸配列を有する D N a s eである。 かかるァミノ酸配列は、 当賅 DN a s e «τの性状を変化させな い限り特に限定されず、 アミノ酸配列の一部で置換、 欠失、 挿入又は修飾が起 こっていてもよい。
該アミノ酸配列を有する DN a s e 7は、 動物組織又は細胞の、 細胞核から抽 出 W製する方法、 化学合成による方法又は遺伝子組換え技術等の公知手法を適宜 用いることにより製造できる。 好適には、 ラット、 仔ゥシ等の喃乳類の胸腺、 脾 K又は肝 K由来の細胞、 より好ましくは、 ラットの脾 K由来の細胞を原料として、 上記 （a ) に記載の方法と同様の工程により抽出精製する方法が例示される。 ま た当該 DN a s e 7のァミノ酸配列は、 以下の①〜④によって得られたデータを 総合して同定する直接的方法、
①該酵素を完全加水分解しァミノ鐘組成を決定する
②エドマン法等により N末 Sを、 加ヒドラジン分解等により C末端を决定する
③ブロテアーゼ又は化学物質を用いて限定分解後、 アミノ酸配列分析装 で各断 片のアミノ酸配列を決定する
④別のプロテアーゼ又は化学物 を用いて③と同様の処理を行う
又は当該 DN a s e 7の c DNAもしくはゲノミック DN Aをクローニングし、 そのコード領域 (O R F ) の塩基配列より対応するアミノ酸配列を決定する間接 的方法により同定される。
( e ) 本発明 DN a s e 7の N末端プリカーサ一ペプチド領域
また、 本発明 DN a s e 7は細胞中で、 まずその N末端側にプリカーサーぺブ チド領域を有する前駆体 DN a s e 7として合成され、 次いでぺブチダーゼに よって該 N末プリカーサ一べプチド領域が切断され、 成熟 DN a s e 7となる。
1 6 差替 え用紙 （規則 26) 該 N末プリカーサ一ペプチド領域は、 実質的に、 配列表配列番号 1に示される アミノ酸配列中、 アミノ酸番号 1〜25で示されるアミノ酸配列を有する。 かか るアミノ酸配列は、 当該 DNa s e 7の性状を変化させることなく、 且つ正常に プロセッシングされるものであれば特に限定されず、 ァミノ酸配列の一部で置換、 欠失、 揷入又は修飾が起こっていてもよい。
該 N末プリカーサ一ペプチド領域のアミノ酸配列は、 cDNA又はゲノミック DNAをクローニングしてその塩基配列を决定し、 該塩基配列に含まれる 0 R F の塩基配列に対応するアミノ酸配列と s 成熟 DN a s e 7の N末端付近のァミノ 酸配列とを比較することにより決定することができる。
(f )本発明 DNa s e <rをコードする DNA
本発明の DNAは、 本発明 DNa s e 7のァミノ酸配列をコードする塩基配列 を有する DN Aであれば特に限定されないが、 好ましくは配列表配列番号 1に示 されるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 26〜31 0で示されるアミノ酸配列を コードする DNA、 より好ましくは配列表配列番号 2に示される塩基配列中、 塩 基番号 87〜941で示される塩基配列を有する DNAである。
また、 本発明の DNAは、 N末プリカーサ一ペプチド領域を有する本発明 DN a s e 7の前駆体ボリぺブチドをコ一ドする DNAをも包含する。 具体的には、 実質的に、 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜25で 示されるアミノ酸配列を N末プリカーサ一ペプチドとして有する DNa s e 7を コードする DN Aであり、 好ましくは配列番号 1記載のァミノ酸配列中ァミノ酸 番号 1〜31 0で示されるアミノ酸 列をコードする DNA、 より好ましくは配 列番号 2記載の塩基配列中塩基番号 12〜94 1で示される塩基配列を有する D NAが例示される。
また、 本発明の DNAはいかなる方法で得られるものであってもよい。 例えば mRNAから ¾製される相補 DNA (cDNA) 、 ゲノミック DNAから翻製さ れる DNA、 化学合成によって得られる DNA、 RNA (cDNA)又は DNA を铸型として PCR法で堆幅させて得られる DNAおよびこれらの方法を適当に
1 7
差替え用紙 （規則 26) 組み合わせて構築される DNAをも全て包含するものである。
例えば、 DNa s e 7を産生する紬胞由来の c DNAライブラリーから DN a s e 7の c DNAをクローン化する方法としては、 以下の方法が例示される。 まず、 DNa s e 7を発現 ·産生するラット 腺又は脾 K等の細胞から mRN A Cpoly (A) RNA) を調製する。 mRNAの調製は、 例えばグァニジンチォシァ ネート法 CChirgwin, J. M. et al.. Biochem.. 18. 5294 (1979) 〕 、 熱フエ ノール法もしくは酸グァニジン一フエノールークロロホルム （AGPC)法等の 公知の方法を用いて調製した全 RNAをオリゴ （dT) セルロースやボリ U-セ ファロース等によるァフィ二ティクロマトグラフィ一にかけることによって行う ことができる。 次いで得られた mRNAを瞎型として、 例えば逆転写酵素を用い る等の公知の方法 COkayama. H. et al.. Uol. Cell. Biol.. 2, 161 (1982) 及び 同誌 3, 280 (1983)、 Gubler. H. and Hoffman. B.J.. Gene. 25. 263(1983) 等〕 で cDNAfiを合成し、 RNa s e Hで铸型 RNAにニックを導入した後 D NAボリメラーゼ Iで二本鎖 c DNAを作製する。 さらに末端平滑化、 リンカ一 結合後、 該 cDNAをブラスミ ドベクターもしくはファージベクターに組み込み、 大 K菌を形質転換して、 あるいはインビトロパッケージングを行い c DNAライ ブラリーを作製する。
ここで用いられるブラスミ ドベクターとしては、 宿主内で複製保持されるもの であれば特に制限されず、 また用いられるファージベクターとしても宿主内で堆 殖できるものであれば良い。 常法的に用いられるクローニング用ベクタ一として pUC 1 1 9, λ g t 1 0, 1 1等が例示される。 ただし、 後述の抗体ス クリーニングに供する場合は、 宿主内で DNa s eァ¾伝子を発現させ得るプロ モーターを有したベクターであることが好ましい。
プラスミ ドに cDNAを組み込む方法としては、 例えば Maniatis, T. ら， モ レキユラ一クローニング， ァ ·ラボラトリー ·マニュアル （Molecular Cloning. A Laboratory Manual, second edition;. Cold Spring Harbor Laboratory. 1. 53 (1989) に記載の方法などが挙げられる。 また、 ファージベクターに cDNA
1 8 差替 え 用紙 （規則 26) を組み込む方法としては、 Hyunh.T. V. らの方法 （Hyunh.T.V.. DNA Cloning, a practical approach.1.49(1985)) などが举げられる。 簡便には、 市販のライ ゲーシヨンキット （例えば、 宝酒造製等） を用いることもできる。 このようにし て得られる組換えブラスミ ドゃファージベクターは、 原核钿胞 （例えば、 E. c 01 i HB 1 0 1, DH5または MC 1061 /P 3等） 等の適当な宿主に導入 する。
ブラスミ ドを宿主に導入する方法としては、 Maniatis. T.らのモレキュラーク ローニング， ァ ·ラボラトリー 'マニュアル（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, second edition). Cold Spring Harbor Laboratory. 1.74 (1989)に記 載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム Z塩化ルビジウム法、 エレクトロボ レーシヨン法等が挙げられる。 また、 ファージベクターを宿主に導入する方法と してはファージ DNAをインビトロパッケージングした後、 増殖させた宿主に導 入する方法等が例示される。 インビトロパッケージングは、 市販のインビトロ パッケージングキット （例えば、 ストラタジーン社製， アマシャム社製等） を用 いることによって簡便に行うことができる。
上記の方法によって作製された cDNAライプラリーから、 本発明 DNa s e 7をコードする c DN Aを単糠する方法は、 一般的な c DNAスクリ一二ング法 を組み合わせることによって行うことができる。
例えば、 別個に DNa s e 7の部分アミノ酸配列に対応すると考えられるオリ ゴヌクレオチドを化学合成したのち、 これを3 SPでラベルしてプローブとなし、 公知のコロニーハイプリダイゼーシヨン法 〔Crunstein, U. and Hogness, D.S.:
Proc. Natl. Acid. Sci. USA 72. 3961 (1975) 〕 またはプラークハイブリダィ ゼーシ 3ン法 （Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition . C old Spring Harbor Laboratory. 2.108 (1989)〕 により、 目的の c DNAを含有 するクローンをスクリーニングする方法、 PCRブライマーを作製し DNa s e rの特定領域を P C R法により增幅し、 該領域をコードする D N A断片を有する クローンを選択する方法等が挙げられる。 また、 cDNAを発現しうるベクター
1 9 差转 え 用紙 （規則 26) (例えば、 ig t 1 1ファージベクター） を用いて作製した cDNAライブラ リーを用いる場合には、 DNa s e >rに対する抗体を用いるィムノスクリーニン グにより、 目的のクローンを選択することができる。 大量にクローンを処理する 場合には、 PCR法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
この様にして得られた DNAの塩基配列はマキサム ·ギルバート法 〔Maxain, A.
M. and Gilbert. W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74. 560 (1977)〕 あるい はファージ Ml 3を用いたジデォキシターミネーシヨン法 〔Sanger.f.ら、 Proc.
Natl. Acad. Sci. USA.. 74. 5463-5467 (1977) 〕 によって決定することがで きる。 DNa s e 7 cDNAは、 その全部または一部を上記のようにして得られ るクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
また、 ゲノミック DN Aライブラリ一から本発明 DNa s e < をコードする D N Aを単離する方法としては以下の方法が例示される。
まず、 ラット胸腺又は脾 K等の細胞から SDS—フエノール法、 セチルトリメ チルアンモニゥムブロマイド （CTAB)法等の公知の方法を用いてゲノミック DNAを調製する。 好ましくはリボヌクレアーゼにより RNAを分解除去する。 得られる DN Aを適当な制 IS酵素により部分消化し、 得られる DN A断片を速当 なファージまたはコスミ ドで增幅しライブラリーを作製する。 そして目的の配列 を有するクローンを、 例えば放射性樣識された DNAプローブを用 、る方法等に より検出し、 該クローンから DNa s e <r¾伝子の全部または一部を制限酵素等 により切り出し取得する。
また、 化学的合成による本発明の DNAの製造は、 配列表配列番号 2記載の塩 基配列中、 塩基番号 12〜941で示される塩基配列を基にして、 その全部又は 一部を合成することにより行うことができる。
(g) さらに本発明は、 上述の DNa s e 7をコードする DNAを含有する組換 えベクターに関する。 本発明の組換えベクターとしては、 原核細胞及び Zまたは 真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己增¾できるものであれば特に制限 されず、 ブラスミ ドベクターおよびファージベクターが包含される。
2 0 差替 え 用紙 （規則 26) 当該組換えベクターは、 簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター
(ブラスミ ド DNAおよびパクテリオファージ DNA) に本発明の DN a s e r をコードする DNAを常法により連結することによって調製することができる。 用いられる組换ぇ用ベクターとして具体的には、 大腸菌由来のブラスミ ドとして 例えば PBR322, pBR325. pUC12. pUC13など、 酵母由来ブラスミ ドとして例えば pS HI 9. pSH15など、 枯草菌由来ブラスミ ドとして例えば pUBllO. pTP5. pC19 など が例示される。 また、 ファージとしては、 λファージなどのパクテリオファージ が、 さらにレトロウイルス、 ヮクシニヤウィルス、 核多角体ウィルスなどの動物 や昆虫のウィルス 〔pVL1393 (インビトロゲン社製） 〕 が例示される。
DNa s e 7を発現 ·生産させる目的においては、 発現ベクターが有用である。 発現べクタ一としては、 原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主钿胞中で DNa s e 7遺伝子を発現し、 該酵素を生産する機能を有するものであれば特に 制さされない。
宿主細胞として細菌、 特に大腸菌を用いる場合、 一般に発現ベクターは少なく ともプロモーター一オペレーター領域， 開始コドン， 本発明 DNa s eァをコ一 ドする DNA, 終止コドン， ターミネータ一領域および複製可能単位から構成さ れる 0
宿主として酵母， 動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、 発現ベクターは少な くともプロモーター， 開始コドン， 本発明 DNa s e <rをコードする DNA, 終 止コドンを含んでいることが好ましい。 またシグナルぺブチドをコ一ドする DN A, ェンハンサー配列， 本発明 DNa s e 7遺伝子の 5' 側および 3' 側の非翮 訳領域， スブライシング接合部， ポリアデニレーシヨン部位， 還択マーカー領域 または複製可能単位などを含んでいてもよい。
細菌中で本発明の DNa s e 7を発現させるためのプロモーター-オペレータ 一領域は、 プロモーター、 オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列 （例え ば、 AAGGなど） を含むものである。 例えば宿主がエシ リキア厲菌の場合、 好適には T r pプロモーター， l a cブロモーター， r e cAブロモーター， λ
2 1 g替 え 用紙 （規則? 6) PLプロモーター， l ppプロモーター， t a cブロモーターなどを含むものが 例示される。 宿主がバチルス属菌の場合は、 SL01プロモーター， SP02ブ 口モーター， p e nPプロモーターなどが挙げられる。 また、 真核細胞の酵母中 で本発明の DN a s e 7を発現させるためのプロモーターとしては、 PH05ブ 口モーター， PGKプロモーター， GAPプロモーター， ADHプロモーターが 挙げられ、 さらに宿主が哺乳動物細胞等である場合、 SV4 0由来のプロモー ター， レトロウイルスのブロモーター， ヒートショックプロモーターなどが挙げ られる。 好ましくは、 SV— 40, レ小ロウィルスである。 しかし、 特にこれら に限定されるものではない。 また、 発現にはェンハンサ一の利用も効果的な方法 である。
好適な開始コドンとしては、 メチォニンコドン （ATG) が例示される。 終 止コドンとしては、 常用の終止コドン （例えば、 TAG, TGA, TAAなど） が例示される。 ターミネータ一領域としては、 通常用いられる天然または合成の ターミネータ一を用いることができる。
複製可能単位とは、 宿主細胞中でその全 D N A配列を複製することができる能 力をもつ DNAをいい、 天然のブラスミ ド， 人工的に修飾されたブラスミ ド （天 然のブラスミ ドから調製された DNAフラグメント） および合成ブラスミ ド等が 含まれる。 好適なブラスミ ドとしては、 E. coli ではブラスミ ド pBR 322、 もしくはその人工的修飾物 （PBR 322を適当な制 [S酵素で処理して得られる DN Aフラグメント） が、 酵母では酵母 2 ^ブラスミ ド、 もしくは酵母染色体 D NAが、 また哺乳動物細胞ではブラスミ ド pRSVneo ATCC 37198. ブラスミ ド pSV2 dhfr ATCC 37145,ブラスミ ド pdBPV-MMTneo ATCC 37224,ブラスミ ド pSV2neo ATCC
37149等があげられる。
ェンハンサー配列、 ポリアデニレーシヨン部位およびスブライシング接合部位 については、 例えばそれぞれ S V 40に由来するもの等、 当業者において通常使 用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、 通常使用されるものを常法により用いることができる s
2 2 差替 え 用紙 （規則 26) 例えばテトラサイクリン， アンピシリン， またはカナマイシン等の抗生物質耐性 遺伝子等が例示される。
本発明の発現ベクターは、 少なくとも、 上述のプロモータ一， 開始コドン， 本 発明の DNa s e < をコードする DNA, 終止コドンおよびターミネーター領域 を連統的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することが できる。 またこの際、 所望により制限酵素での消化や T 4 DN Aリガーゼを用い るライゲーシヨン等の常法により適当な DNAフラグメント （例えば、 リンカ一、 他の制限部位など） を用いることができる。
(h) 本発明の形質転換細胞は、 上述の発現ベクターを宿主細胞に導入すること により »製することができる。
本発明で用いられる宿主钿胞としては、 前記の発現ベクターに適合し、 形質転 换されうるものであれば特に限定されず、 本発明の技術分野において通常使用さ れる天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞 〔例えば、 細菌 （エシュリキア厲菌、 バチルス厲菌）， 酵母 （サッカロマイセス瞑、 ビキア 属など） , 動物細胞または昆虫細胞など〕 が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、 具体的には大腸菌 （DH5, HB 1 0 1等） 、 マウス由来細胞 （COP、 L、 C 127、 Sp 2/0, NS— 1ま たは NIH3 T3等） 、 ラット由来細胞、 ハムスター由来細胞 （ΒΗΚおよび C ΗΟ等）、 サル由来細胞 （COS l、 COS 3, COS 7, CV 1および Ve l o等） およびヒト由来細胞 （He l a、 2倍体棣維芽細胞に由来する細胞、 ミエ ローマ钿胞および Nama lwa等） などが例示される。
発現ベクターの宿主細胞への尋入 （形質転換又は形質移入） は従来公知の方法 を用いて行うことができる。 例えば、 細菌 （E.coli, Bacillus subtilis等） の場合は、 例えば Cohen らの方法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.. 69. 2110 (1 972)〕 、 プロトプラスト法 Olol. Gen. Genet.. 168. Ill (1979) 〕 やコンビテ ント法 CJ. Mol. Biol., 56, 209 (1971) 〕 によって、 Saccharomyces cerevisi aeの場合は、 例えば Hinnenらの方法 CProc. Natl. Acad. Sci. USA.. 75. 1927
2 3 差 え 用 紙 （規則 26) (1978)〕 やリチウム法 〔J. Bacteriol. . 153. 163 (1983)〕 によって、 動物钿胞 の場合は、 例えば Grahamの方法 〔Virology, 52, 456 (1973)〕 、 昆虫細胞の場合 は、 例えば Summers らの方法 鼠 Cell. Biol. 3. 2156-2165 (1983) 〕 によつ てそれぞれ形質転換することができる。
( i ) 本発明の D N a s e "は、 上記の如く謂製される発現ベクターを含む形質 転換細胞 （以下、 形質移入体を包含する意味で使用する。 ） を栄養培地で培養す ることによって製造することができる。
栄養培地は、 宿主細胞 （形 K転換体） の生育に必要な炭素源， 無機窒素源もし くは有機窒素源を含でいることが好ましい。 炭素源としては、 例えばグルコース， デキストラン. 可溶性デンプン， ショ糖などが、 無機窒素源もしくは有機窒素源 としては、 例えばアンモニゥム埴類， 硝酸塩類， アミノ酸， コーンスチープ' リ カー， ペプトン， カゼイン， 肉エキス， 大豆粕， バレイショ抽出液などが例示さ れる。 また所望により他の栄養素 〔例えば、 無機塩 （例えば塩化カルシウム， リ ン酸ニ水素ナトリウム， 塩化マグネシウム） ， ビタミン類， 抗生物質 （例えばテ トラサイクリン， ネオマイシン， アンビシリン， カナマイシン等） など〕 を含ん でいてもよい。
培養は当分野において知られている方法により行われる。 培養条件、 例えば温 度， 培地の p Hおよび培養時閟は、 D N a s e 7が大量に生産されるように適宜 選択される。
なお、 下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示 するが、 何らこれらに限定されるものではない。
宿主が細菌， 放線菌， 酵母， 糸状菌である場合、 例えば上記栄養源を含有する 液体培地が適当である。 好ましくは、 p Hが 5〜 8である培地である。
宿主が E. coli の場合、 好ましい培地として L B培地， M 9培地 CMi ller. J. , Exp. Mol. Genet, p.431. Cold Spring Harbor Laboratory. New York (1972)〕 等が例示される。 かかる場合、 培養は、 必要により通気， *拌をしながら、 通常 1 4〜4 3て、 約3〜2 4時間行うことができる。
2 4 差替 え用紙 （規則 26： 宿主が Baci l lus属菌の場合、 必要により通気， 撹拌をしながら、 通常 3 0〜4 0て、 約 1 6〜9 6時間行うことができる。
宿主が酵母である場合、 培地として、 例えば Burkholder最小培地 CBost ian. K. し et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77. 4505 (1980) 〕 が举げられ、 p H は 5〜8であることが望ましい。 培養は通常約 2 0〜3 5でで約1 4〜1 4 4時 間行なわれ、 必要により通気や橋拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、 培地として例えば約 5〜2 0 %の胎児牛血淸を含む M E M培地 [Science. 122. 501 (1952 ， D M E M培地 Virology. 8. 396 (19 59) 〕、 P I 1 6 4 0培地 U. Am. Med. Assoc. . 199, 519 (1967) 〕 , 1 9 9培地 Cproc. Soc. Exp. Biol. Med. . 73. 1 (1950)〕 等を用いることができ る。 培地の p Hは約 6〜 8であるのが好ましく、 培養は通常約 3 0〜4 0でで約 1 5〜7 2時間行なわれ、 必要により通気や擾徉を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、 例えば胎児牛血淸を含む Grace' s培地 CProc. Natl. A cad. Sci. USA, 82, 8404 (1985)〕 等が挙げられ、 その p Hは約 5〜 8であるの が好ましい。 培養は通常約 2 0〜4 0でで 1 5〜1 0 0時圊行なわれ、 必要によ り通気や擾拌を行うこともできる。
本発明の DN a s e 7は、 上記培 ftにより得られる培養物より以下のようにし て取得できる。
すなわち、 本発明の DN a s e <rが、 培養物のうち培養液中に存在する場合は、 得られた培養物を Λ*または遠心分離等の方法で培養 ¾液 （上清） を得、 該培養 ¾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常 法に従って該 DN a s e 7を糖製、 単離する。
単離， 精製方法としては、 例えば塩析， 溶媒沈》法等の溶解度を利用する方法、 透析， 限外 Λ過， ゲル «過， ドデシル琉酸ナトリウム一ボリアクリルアミ ドゲル S気泳動など分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーゃヒド 口キシルアバタイトク口マトグラフィーなどの荷 δを利用する方法、 ァフィ二 ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク
2 5 差替
用紙 （規則 26) 口マトグラフィ一などの疎水性の差を利用する方法、 等 S点《気泳動などの等髦 点の差を利用する方法などが举げられる。
一方、 本発明 D N a s e <rが培養された形質転換体のペリブラズムまたは钿跑 質内に存在する場合は、 培養物を »通または遠心分離などの常法に付して菌体ぁ るいは钿胞を集め、 適当な綏街液に懸 し、 例えば超音波、 リゾチーム及び凍結 融解などの方法で細胞等の細胞壁および/または細胞腹を破壊した後、 遠心分離 や «過などの方法で DN a s e 7を含有する蹊画分を得る。 胲瞜面分をトライト ンー X 1 0 0等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。 そして、 当該粗 溶液を先に例示したような常法を用いることにより、 単離， 精製することができ る。 また、 当該 DN a s e 7が培養された形質転換細胞の核内に存在する場合は、 常法により細胞壁及び細胞糗を破壊して核を単 «した後、 超音波処理等により核 腹を破 *し、 遠心処理して上淸を得、 該上淸を先に例示したような常法を用いる ことにより、 単糠 ·精製することができる
( j ) また、 本発明は、 上述の DN a s e « もしくはその前駆体ボリペプチド又 はそれらのァミノ酸配列の一部を有するぺブチドに親和性を有する抗体に関する。 本発明の抗体は、 上記性質を有するボリクローナル抗体およびモノクローナル抗 体を共に包含する。 また、 当該モノクローナル抗体には、 I g G, I gM, I g A, I g Dおよび I g Eなるいずれのィムノグロブリンクラスに属するモノク ローナル抗体をも包含し、 好適には、 I g Gまたは 1 g Mィムノグロプリンクラ スモノクローナル抗体が挙げられる。
本発明の抗体は常法に従って取得することができる （統生化学実験講座 5、 免 疫生化学研究法、 日本生化学会編：東京化学同人発行、 等） 。 例えば、 本発明 のボリクローナル抗体は、 以下の方法により作製することができる。 本発明 DN a s e 7のアミノ酸配列の一部又は全部を有する （ボリ） ペプチドをゥシ血淸ァ ルブミン、 Keyhole Limpets Hemocyanin (K L H) 等のキヤリアタンパク質に架 橋した複合体と、 完全 （不完全） フロイントアジュバント 〔F C A ( F I A) 〕 との混和物を抗原として、 ゥサギ、 マウス、 ラット、 モルモット又はハムスター
2 6 差替 え 用紙 （規則 26) 等の晡乳動物に免疫 （初回免疫から約 1〜4通間毎に 1〜数回追加免役し、 各追 加免疫の約 3〜1 0日後に部分採血した血清の抗体価を従来公知の抗原抗体反応 を利用して測定、 その上昇を確認しておく。 さらに最終免疫から約 3〜1 0日後 全血を採取して抗血淸を精製する。
また、 本発明の D N a s e "Tに対するモノクローナル抗体は、 いわゆる細胞 I» 合によって製造されるハイプリ ドーマ （融合細胞） から製造することができる。 すなわち、 抗体産生細胞と骨 ft腫系細胞から ¾合ハイプリ ドーマを形成し、 当該 ハイプリ ドーマをクローン化し、 本発明の D N a s e < 又はその前駆体のアミノ 錶配列の一部または全部を有する （ボリ） ペプチドを抗原として、 それに対して 特異的親和性を示す抗体を生産するクローンを選択することによって製造される。 その操作は免疫抗原として本発明の D N a s e «τ又はその前駆体のアミノ酸配列 の一部または全部を有する （ボリ） ペプチドを使用する以外は、 従来既知の手段 を用いることができる。
免疫抗原は、 例えば D N a s e 7又はその前駆体のアミノ酸配列の一部または 全部を有する （ボリ） ペプチドを完全又は不完全フロインドアジュバントとを混 和して 製される。 免疫化の対象として用いられる動物としては、 マウス、 ラヅ ト、 モルモット、 ハムスター又はゥサギ等の哺乳動物、 好ましくはマウス又は ラット、 より好ましくはマウスが例示される。 免疫は、 これらの哺乳動物の皮下 内、 筋肉内、 静脈内、 フッドパット內あるいは腹腔内に 1〜数回注射することに より行われる。 通常、 初回免疫から約 1〜4通面毎に 1〜4度追加免疫を行い、 さらに約 1〜4 ¾間後に最終免疫を行って、 該最終免疫より約 3〜1 0日後に免 疫感作された動物から抗体産生細胞が採取される。
モノクローナル抗体を分泌するハイプリ ドーマの調製は、 ケーラー及びミル シュタインらの方法 （Nature, Vol.256, pp. 495-497. 1975)及びそれに準じる修 飾方法に従って行うことができる。 すなわち、 本発明のモノクローナル抗体は、 前述の如く免疫感作された動物から取得される脾 Κ、 リンパ節、 骨 «あるいは扁 挑等、 好ましくは脾 Kに含まれる抗体産生細胞と、 好ましくは同種のマウス、
2 7
差替え用紙 （規則 26) ラット、 モルモット、 ハムスター、 ゥサギまたはヒト等の哺乳動物、 より好まし くはマウス、 ラットまたはヒトの骨 tt腫系細胞 （ミエローマ） との融合により得 られる融合細胞 （ハイプリ ドーマ） を培養することにより》製される。 培養は、 インビトロ、 またはマウス、 ラット、 モルモット、 ハムスターもしくはゥサギ等 の哺乳動物、 好ましくはマウスまたはラット、 より好ましくはマウスの腹水中等 でのインビボで行うことができ、 抗体はそれぞれ該培養上淸、 または哺乳動物の 腹水から取得することができる。
細胞融合に用いられる骨 «腫系細胞としては、 例えばマウス由来ミエローマ P3
/X63-AG8、 P3/NSI/l-Ag4-K P3/X63-Ag8. Ul 、 SP2/0_Agl4、 FOあるいは BW5147、 ラット由来ミエローマ 210RCY3-Agl. 2. 3.、 ヒト由来ミエローマ U_266AR1、 GM1500 -6TG-A1-2、 UC729-6、 CEM-AGR、 D1R11 あるいは CEM-T15 を挙げることができ る β
本発明のモノクローナル抗体を産生する融合钿胞クローンのスクリーニングは、 »合細胞を、 例えばマイクロタイタープレート中で培養し、 増殖の見られたゥェ ルの培養上澝の抗原に対する反応性を、 例えば R I Αや E L I S A等の酵素抗体 法によって測定することにより行うことができる。
モノクローナル抗体の精製、 単離は、 上述のような方法によって取得される本 発明のモノクローナル抗体を含有する血淸、 腹水あるいはイオン交換クロマトグ ラフィー （D E A Eまたは D E 5 2など） 、 抗ィムノグロブリンカラムあるいは ブロティン Aカラム等のァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーに付すること により行うことができる。
本発明の 「モノクローナル抗体」 は、 上述の製造方法に限定されることなく、 いかなる方法で得られたものであってもよい。 また、 通常 Γモノクローナル抗 体 J は、 免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる構造の糖鎖を有す るが、 本発明における 「モノクローナル抗体」 は該糖鎖の構造差異により限定さ れるものではなく、 あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル抗体をも包含するも のである。 さらに、 例えばヒトイムノグロブリン遗伝子を組み込むことにより、
2 8 差替 え用紙 （規則 26) ヒト型抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたトランスジュニックマウ スを用いて得られるヒト型モノクローナル抗体、 あるいは、 *伝子組換え技術に より、 ある哺乳動物由来のモノクローナル抗体の定常領域 （F c領域） をヒトモ ノクローナル抗体の F c領域と組み換えたキメラモノクローナル抗体、 さらには 抗原と相補的に直接結合し得る相補性決定部位 （C D R： complementarity dete rmining region) 以外、 全領域をヒトモノクローナル抗体抗体の対応領域と組換 えたキメラモノクローナル抗体も本発明の 「モノクローナル抗体 j に包含される。
2 9 差 え 用紙 （規則 2fi) 実施例
以下、 実施例及び参考例を挙げて本発明をより明確に説明するが、 本発明はこ れらの実施例によって何ら限定されるものではない。
参考例 1 アポトーシスの誘導
まず、 10週齡の雄ラット （アルビノウィスター種） から、 胸腺を取り出して
1 OmMグルコースの入った K r eb s -R i nge rホスフエ一ト溶液で懸 S した。 該胸腺を 1 0 Gy置の * Coの <r線で照射するか、 または 1 0·7Μデキサ メタゾンによって処理した後、 37 'Cで 4時間ィンキュベーシヨンすることによ り、 アポトーシスを誘導した。 これら処理したアポトーシス胸腺を、 ¾子 ¾微鏡 による形態上の截察、 および 2%ァガロースゲル電気泳動による DNAフラグメ ントの分析に用いた。
参考例 2 ラッ ト胸腺中でのアポトーシスの特徴
参考例 1に従って、 7線照射またはデキサメタゾン処理によって誘導された ラット胸腺細胞のアポトーシスを特 ¾づけるために、 アポトーシス細胞の形 上 の変化および D N A断片の性質を翻べた。
( 1 ) アポトーシス細胞の形態上の変化
7線照射処理したラット胸腺を、 透 ¾性 子顕微镜で観察した。 正常な胸腺と 比較すると、 アポドーシスに特 ¾的な核内でのクロマチンの凝箱、 および細胞表 面の激絨毛の消失といった形態上の変化が明らかに認められた。 また、 デキサメ タゾンで処理したラットの W腺においても同様な形態上の変化が認められた。
(2)アポトーシス細胞で産生される DN A断片の性状
(i)DN A断片のァガロースゲル ¾気泳動上の挙動
7照射によりアポトーシスを起こした紬胞を、 まず溶解用緩衡液 〔5 OmMト リス塩酸 （pH7. 8) 、 1 OmM EDTA、 0. 5 %w/w N—ラウロニ ル サルコシレート Na〕 中で溶解した。 得られた DNAを 0. 5mgZml RNa s eAで 20分面、 および 0. 5 m g/m 1プロティナーゼ Kで 30分間， 充分処理した後、 2%ァガロースゲル ¾気泳動に付した。 そしてェチジゥムブ口
3 0 差替 え用紙 （規則 26) ミ ドで染色した DNA断片のパターンを UV照射下で行ったフォトグラフで観察 した (Biochem. Biophys. Res. Commun. 194,(1993)、 第 30〜3 1頁参照〕 。 その結果、 放射線照射胸腺由来の細胞の核 DNA画分の 296ァガロースゲル 気泳動は、 クロマチン DN Aのヌクレオリーム簡が切断されていることを示すァ ボトーシスの特徴であるはしご状パターンを示した。 また、 デキサメタゾン処理 胸腺由来の細胞 DN Aのァガロースゲル «気泳動も同様の挙動を示した。
(ii) DNA切断様式
放射線照射またはデキサメタゾン処理によって誘導ざれたアポトーシス胸腺細 胞内での DNA切断様式を、 後述するエンドラベリング法により脚べた。 もし、 産生される.ヌクレオソーム DNA断片が、 その 5' 末端にリン酸基を有し 3' 末 端はフリーであるタイプであるなら （5' -P/Z' 一 0H生成型） 、 該 DNA は、 アルカリホスファタ一ゼで前処理することなく、 ターミナルデォキシヌクレ ォチジルトランスフェラーゼ （以下、 TdTという） およびな一 "P—デォキシ シチジントリホスフ —ト 〔以下、 （α— " P) dCTPという〕 で処理するこ とにより、 その 3' 末端をラベルすることができ、 そして、 アルカリホスファ ターゼで前処理した場合に Rり、 ボリヌクレオチドキナーゼおよび 7—31 P—ァ デノシントリホスフヱート 〔以下、 （7— S2P) ATPという〕 による処理に よって 5' 末端をラベルすることができる。
ェンドラべリング法
まず、 参考例 1で得られたアポトーシスラット胸腺から、 DNAをフヱノール クロロホルム抽出法により単饑した。
得られた DNAの 3' 末端側のラベリングは、 25mMトリス塩酸 （pH7. 6) 、 1 OmM DTTおよび ImM C a C 1 , の存在下で、 DN A断片を T dT (5U：宝酒造社製） および 〔α - SiP〕 dCTP (0. 83 m C i /m 1 ；デュポン社製） とでインキュベーションすることによって行った。
—方、 5' 末端侧のラベリングは、 1 0 OmMトリス塩酸 (pH7. 6) 、 2 OmM MgC 1 j . 1 OmM DTTおよび 0. 2 mMスペルミジンの存在下
3 1 差替 え用紙 （規則 26) で、 DNA断片を T 4ボリヌクレオチドキナーゼ （5U；宝酒造社 S) および (r-ilP) ATP (0. 83mC i/ml ；ジュボン社製） とでインキュベー シヨンすることにより行った。
DN A鎖の末端にリン酸基がある場合には、 36 mMトリス塩酸 （pH8. 0)及び ImM MgC 12 の存在下で子ゥシ小腸アルカリホスファターゼ （2 0U ;宝酒造社製） で前処理することにより除去される。
ラベリング処理後、 ^酸アンモニゥム/イソブロバノールで処理して、 ラベル 化 DNAをラベルに用いられなかったヌクレオチドから沈 Sさせることにより回 収した。 ラベル化 DNAを 2%ァガロースゲル電気泳動にかけた後、 ゲル中の D NAをナイ口ン膜に転写し、 そのナイ口ン膜をォートラジオグラフィ一にかけた。 得られたオートラジオグラムを図 2に示す （aは、 放射線照射アポト^-シス誘 導胸腺由来の DNA、 bは、 デキサメタゾン処理アポトーシス誘導胸腺由来の D NA)。 これから明らかなように、 放射線照射およびデキサメタゾン処理それぞ れによって誘導された両者のアポトーシス胸腺において、 3' — OHと 5' — P 末端を有する DNA断片が産生されていることが判明した。 これらの結果から、 アポトーシスは、 DNA缜の 3' — OH/5' — P切断末端を生じるエンドヌク レアーゼによって触媒されるものと考えられた。
参考例 3 エンドヌクレアーゼ （DNa s e)活性の測定
( 1 ) アツセィ 1
ェンドヌクレアーゼ （DNa s e)の活性は、 内在性のェンドヌクレアーゼを 全く含有しない HeLa S3細胞 （ヒト子宮頓«上皮細胞） の核を基 Kとして 該核のクロモソーム DN Aの分解を 2%ァガロースゲル ¾気泳動で見ることによ り測定することができる Biochem. Biophys. Res. Commun. 194, (1993)、 第 3 0〜 31頁参照〕 。
詳細には、 HeLa S3細胞 （1. 67 x 1 07 /m 1 ) および DN a s e 面分を含有する反応混液 （30 1 ) 中で 37で、 60分闥処理した後、 氷上で 冷却することにより反応を停止する。 次いで、 反応を終えた反応混液を 20, 0
3 2
^替 え 用紙 （規則 26) 00 xgで 20秒面速心し、 沈 ¾した核を溶解用緩衝液 〔5 OmMトリス塩酸 (pH 7. 8) 、 1 OmM EDTA、 0. 59d /v N—ラウロニル サル コシレート Na〕 中で溶解する。 得られた DNAを 0. 5mg/m l RNa s e Aで 20分間、 および 0. SmgZm 1ブロティナーゼ Kで 30分間、 充分処 理した後、 2 ¾ァガロースゲル ¾気泳動に付す。 ェチジゥムブロミ ドで染色した DNA断片のパターンを UV照射下で行ったフォトグラフで観察する。 断片化し た割合は （パーセント フラグメンテーション） を、 分子量 5 kb未満の DNA 断片の密度によって求める。
(2) アツセィ 2
また、 ェンドヌクレアーゼ （DNa s e) の活性は、 スーパーコイルド p BS IISK(-) ブラスミ ドを基質として該ブラスミ ドのクロモソーム DNAの分解を 0. 8%ァガロースゲル g気泳動で見ることにより測定することができる。 詳綑には、 スーパーコイルド pBS IIS K (-) プラスミ ド （6. 6 Tmg/m 1 ) および DNa s e面分を含有する反応混液 （ 30 1 ) 中で 37で、 1 0分 閎処理した後、 氷上で冷却することにより反応を停止する。 次いで、 反応を終え た反応混液をフエノール クロ口ホルム処理することにより、 プラスミ ド DNA を抽出し、 その水 βを 0. 8%ァガロースゲル 気泳動に付す。 ェチジゥムブ π ミ ドで染色した DNA断片のパターンを UV照射下で行ったフォトグラフで観察 する。 断片化した割合は （パーセント フラグメンテーション） を、 分子量 5 k b未満の DNA断片の密度によって求める。
なお、 DNa s eなと 5の活性を測定するための好 な反応液として、 3mM
MgC l , 、 1 m 2—メルカブトエタノール及び 0. 1 mM PMSFを 含有する 5 OmM MES-NaOH (pH5. 6 ) 緩衝液を用いる。 また、 D Na s e 7の活性を測定するための好適な反応液として、 3mM C aC l , 、 3mM MgC l i 、 1 mM .2—メルカブトエタノール及び 0. 1 mM PM SFを含有する 5 OmM MOPS-NaOH (PH7. 2) 緩 *液を用いる。
3 3 差替 え 用紙 （規則 26) 参考例 4 DNa s e—活性ゲルシステム
DNa s eの活性物を同定し、 またそれらの分子量を決定するために、 Rosent hal らによる DNa s e—活性ゲルシステム CAnal. Biochem. 80. 76-90. (197 7) 参照〕 を少々変えて用いた。
すなわち、 まず実施例 1で精製、 取得した各種 DNa s eを天然の子ゥシ胸腺 DNAを 200 t gZm 1含む L a emm 1 i S D S - P A G Eゲル中で ¾気 泳動することにより分鐘した。 なお、 標準タンパクで測定した SDSゲル上での 分子量の検量線は、 SDSゲル中の 2 ΰ 0 g/ 1の 2重鏆 DNAの存在に よっては影響されなかった。
電気泳動後、 そのゲルを 1 OmMトリス塩酸 （pH7. 8) および 5mM 2 一メルカブトエタノールを用いて 50でで 1時間洗浄して SDSを除去し、 それ から 4でで 1 OmMトリス塩黢 (pH7. 8) でー晚おいて、 該 DNa s eをリ フォールディングさせた。 次いで該ゲルを 1 OmMトリス塩酸 （pH7. 8)、 3mM CaC l 2 および 3mM Mg C 12 を含有する溶液を用いて 37でで 適当時閟ィンキュベーシヨンした。
明確なヌクレアーゼ活性は、 ゲルをェチジゥムブロミ ドで染色して、 UVでト ランス照射した後、 蛍光バックグランド上で暗領域として検出された。
実施例 1 DNa s e a, および 7の精製
特に示さない限り、 以下の処理はすべて 0〜 4でで行つた。
まず、 ラット胸腺を 0. 1 %ノイデット Ρ— 40(NP— 40)を含有する緩衝液 A 〔1 OmMトリス塩酸 （pH7. 8) 、 2m 2—メルカブトエタノール、 0. 3m PMSF. 3mM Mg C 1 s 〕 中でホモジネートした。 該ホモジネー トを 600 xgで 1 0分簡、 遠心分離にかけた。 ft殿した核面分 （ミ トコンドリ ァを含有する） を集め、 上淸画分をさらに 1 50, 00 O xgで 1時間遠心した c その沈殴面分を獏面分 （ミクロソームを含有する） と称し、 上淸画分をサイトゾ ル面分と称した。
得られた各面分中に存するェンドヌクレアーゼ活性を参考例 3に記載の方法に
差替え用紙 （規則 26) 準じて測定したところ、 核 （ミ トコンドリア含有） 画分、 腠 （ミクロソーム含 有） 面分およびサイトゾル面分にそれぞれ約 65%、 25 ¾および 10 %の活性 が局在していた。 そこで、 核画分を原料としてエンドヌクレアーゼの精製を行つ まず、 核画分中の DN a s e活性物を 0. 5 M硫安を含有する緩衝液 A中で超 音波処理することにより溶解し、 核の残賅物は 1 50, 00 O xgで 1時閭遠心 することにより除去した。
得られた上淸 （核抽出物） を緩街液 N 〔2 OmMトリス塩酸 (pH7. 8)、 1 mM 2—メルカブトエタノール、 0. ImM PMSF、 1 0%エチレング リコール〕 で平銜化した S—セファロースカラム （ 1 cm I. D. X I 3 c m； フアルマシア社製） に付した。 そのカラムを緩衝液 Nで洗浄した後、 緩衝液 N中の塩 S度 （KC 1 ) を 0M〜1M ( 300分間） まで直線的に増加させるこ とにより展開させた （流速 0. 15m 1 Zm i n)。 参考例 3の了ッセィ 1の方 法で測定した結果、 DNa s eの活性物は 0. 6M KC 1で溶出したシングル ビークとして回収された。 この活性物面分を緩衝液 Nで平衡化した CM 5 PW力 ラム （5mm I. D. x 50 mm；東ソ一社製） による HP L Cに供して、 緩 衢液 Nの 0〜1M KC 1の直線グラジェント （35分闞） で溶出させた （流速 0. 3m 1 /m i n)。
その結果、 エンドヌクレアーゼの活性が約 0. 24M、 0. 34Mおよび 0. 55M KC 1讒度によって溶出される 3つの面分にそれぞれ認められ、 溶出顺 に DNa s e . および γと名付けられた （図 3)。
さらに、 それぞれの活性面分 （DNa s eひ、 DNa s e Sおよび DNa s e r) について、 へパリン 5 PW. G 2000 SWおよび CM5 PWカラムを用い た連铰した H P L Cにより精製を行った。
詳細には、 まず各 DNa s e画分を緩衝液 Nで平衡化したへパリン 5 PWカラ ム （5mm I. D. x 50 mm：東ソ一社製） に付し、 蛋白質を緩衝液 Nの 0 〜1M KC 1の直線グラジ：《：ント （35分間） で展開、 溶出させた （流速 0.
3 5 差替え 用！ ¾ (規則 26) 3m 1 Zm i n)。 溶出活性画分をさらに 0. 3M NaC lを含有する緩衢液 S C2 Om MOPS-NaOH (pH7. 0) 、 1 m 2—メルカブトェ タノール、 0. ImM PMSF、 5 %エチレングリコール〕 で平衡化した G 2 000 SWカラム （8 mm I. D. x 30 c m：東ソ一社製） を用いたゲル慮 «HPLC (流速 0. 5 m 1 /m i n ) で精製した。 得られた DNa s e面分を 最終的に、 0. 3M Na C 1を含有する絚衡液 Sで平衡化した CM5 PWカラ ム （5mm I. D. x 50 mm；東ソ一社製） による H P L Cに付して、 目的 DNa s eを緩衡液 Sの 0. 3〜1. 5M N a C 1の直線グラジヱント （ 35 分簡） で展開、 溶出させた （流速 0. 3ml/m i n) 。
得られた DNa s e面分を緩衝液 Sに対して透析して 0〜4でで保存した。 なお、 HPLCで得られる各フラクション中の DNa s e活性は、 参考例 3 (1) に記載の方法を用いて測定した。
これらのクロマトグラフィーの結果、 どのクロマトグラフィーにおいても、 そ れぞれの DNa s eについて、 複合体および様々な形 »の相互変換は見られな かった。 すなわち、 DNa s ea, および τはそれぞれ単量体で存在している と考えられた。
また、 同様に放射線照射処理したアポトーシス胸腺由来の細胞核について精製 を行った CM5PW HPLCのプロファイルを図 4に示す。 これから、 放射線 照射によりアポトーシスを誘導させると DNa s eなと； δの活性が減少するのに 対して、 DNa s e 活性は全く影響されないことが分かった。 同様な結果がデ キサメタゾン処理によるアポトーシス胸腺でも見られた。
実旄例 2 DNa s eの性質
( 1 ) 分子量
実施例 1に従って精製した DNa s ea、 および τそれぞれの分子量を参考 例 4に記載の SDS— PAGE再生法 （活性ゲルシステム） によって求めた。 こ の活性ゲルシステムは、 SDSを除去した後に再生され、 インキュベーション中 に DNAを分解する DNa s eの能力に基づくものである。
3 6 差 え用紙 （規則 26) ゲル中の DNa s eの局在は、 ェチジゥ厶ブロミ ドー蛍光バックグラウンド上 の喑バンドとして、 DN A蛍光の消失により検出することができる。 結果を図 5 に示す。 DNa s e 7とのインキュベーション用溶媒に C a /Mg を添加す ると、 33 kDaタンパクに相当する部分に非蛍光性のバンドが見られた （レー ン 3) 。 一方、 DNa s e a (レーン 1 ) および DNa s e S (レーン 2) は、 共に 32 kD aのタンパクに相当する部分に非蛍光性のバンドを示した。
また、 DNa s e α、 ；8および yをそれぞれ G 2000 SWカラム （8mm I . D. x 30 cm；東ソ一社製） を用いたゲル濂 ¾HPLC (流速： 0. 5m
、 溶離液： 0. 3M N a C 1含有緩衝液 S 〔 20 mM MOPS - NaOH (pH7. 0) 、 1 mM 2—メルカブトエタノール、 0. 1 mM P MSF、 5 %エチレングリコール〕 ） にかけたところ、 それぞれ 28 kDa (図 6中、 a) 、 30 kDa (図 6中、 b) および 3 1 kDa (図 6中、 c) のシン グルピークとして検出された （図 6)。
(2) DNa s eの至適 pH
DNa s eな、 および《τの活性の至適 P Hは、 酸性から塩基性までの様々な 緩衡液中で HeLa S 3核アツセィ （参考例 3、 アツセィ 1 ) を行い、 その D N A断片化の割合から求めた。
07に、 その結果 CHe La S 3核アツセィシステムでの DN a s e a (図 a)、 β (図 b) および 7 (図 c) の pH依存性〕 を示す。 なお、 測定に用いた 綏衡液は、 図 7の左端レーンから、 ft酸一 KOHS街液 （pH4. 0、 pH4. 4、 pH4. 8、 pH5. 2および pH5. 6 )、 ME S -N a OH緩衝液 （p H5. 6および pH6. 2)、 MOPS-NaOH緩衝液 （pH6. 8、 pH7. 2および pH7. 6)、 Tr i s -HC緵衡液 （pH7. 4、 pH7. 8、 pH
8. 2および pH9. 0) および CHES— NaOH緩衝液 （pH8. 6、 pH
9. 4および pH 1 0. 4) である。 これからわかるように、 DNa s eなの活 性は、 醉酸- KOH緩衝液 (pH5. 6)〜MES-NaOH緩衝液 （pH5. 6) で見られ、 また DNa s e ;8の活性は i酸一 K OH緩衡液 （pH5. 6)〜
3 7 差替 え 用紙 （規則 26) MES— NaOH緵衡液 （pH5. 6、 6. 2 ) で見られ、 至適 p Hは共に約 5. 6であると判断された。 一方、 DNa s e 7の活性は、 MOPS— NaOH緩衝 液 （pH7. 2) 付近で最大であり、 至適 PHは約 7. 2であると判断された。
(3)二価陽イオンの影響
DNa s eな、 DNa s e 8および DNa s e 7の活性に対する二 «暘イオン の影響を調べた。 具体的には、 Mg の影響は、 精製した DNa s ea. 5およ び γの活性を 3mM CaC 12 の存在下で MgC 1 , の濃度を增加させて測定 することにより ¾ベた。 また Ca の影響は、 同様に精製した DNa s eな、 β および < の活性を 3mM MgC 12 の存在下で C a C 12 の濃度を增加させて 測定することにより調べた。 さらに Ζηί+の影響は、 DNa s eなおよびSにつ いては、 3mM MgC 12. 1 mM 2—メルカブトエタノール及び 0. lm M PMSFを含有する 5 OmM MES-NaOH (pH5. 6 ) 緩衡液中で ZnC 12 の濃度を堆加させて調べ、 DNa s e τについては 3mM C a C 1 ,、 3m MgC 12 > 1 mM 2—メルカブトエタノール及び 0. 1 mM PMSFを含有する 5 OmM OPS-NaOH (pH7. 2)緵衡液中で Z nC 12 の濃度を堆加させて調べた。 結果を図 8に示す。 この結果、 DNa s e 7は、 フル活性のために Cai+と Mg2+の両者を必要とし、 その両者の至 ¾»度 はともに 1〜3mMであった （図 8、 a, b ) 。 また、 DN a s e 7は、 Zn に感受性があり、 40 という低濃度の Zn によって活性が 50%阻害され た （図 8 c )。
一方、 DNa s ea及び DNa s e ;3の活性は、 Mg や C a "等によって影 響されず、 また ImMまでは Zn^の存在によっても影響されなかった。 しかし、 10〜3 OmMという高濃度の金孱イオンの存在により、 DNa s e 7と同様に DNa s eaおよび の DNa s e活性も阻害された。
また、 表 2に示す条件下での各 DNa s eのェンドヌクレアーゼ活性を測定し た結果を示す 〔参考例 2 (1) アツセィ 1使用〕 。
なお、 DNa s eaおよび /5は、 基質として HeLa S 3钿胞核クロマチン
3 8 差替 え 用紙 （規則 26) DNA、 反応液として 3mM MgC l 2 、 1 mM 2—メルカブトエタノール 及び 0. lmM PMS Fを含有する 5 OmM MES-NaOH (pH5. 6)锾衡液を用いて測定したエンドヌクレアーゼ活性を 1 00%とし、 また DN a s e "Tは、 基質として HeLa S 3細胞核クロマチン DN A、 反応液として 3m C a C 12 > 3mM g C 12. 1 mM 2—メルカブトエタノール 及び 0. ImM PMSFを含有する 5 OmM OPS-NaOH (pH7. 2)緩衡液を用いて測定したエンドヌクレアーゼ活性を 1 00 <？として活性を换 算した。 なお、 表中、 一は上記 *適反応液から該成分を削除したことを、 +は上 記最適反応液に該成分を添加したことを意味する。
3 9 差替 え 用紙 （規則 26) 表 2
DNase 活 性（9ί α β r
100 100 100
Figure imgf000042_0001
OES-tfeQH) OIES-KaOH) (MQPS-½GH) 一 Mg 92 94 16 一 Ca，* 1 一 2~メルカブトエタノール 115 119 96
-PMSF 81 102 94
+Mg,+ (3mM 104 102
+Ca，+ (3mM) 101 104
+Mn (3m ) (Hfe'VCa1つ 104 103 45
+Zn,+ (dlmM) 90 93 21
+Gァクチン（100 ug/m\) 99 97 98
+ォゥリントリカルボン
Figure imgf000042_0002
差替 え 甩紙 （規則 26) (4) DNa s e τの加水分解の様式
上記 （ 1)〜（3) で示された DNa s e 7の特 »は、 DNa s e 7がアポ トーシスの DNA断片化に関与するェンドヌクレアーゼである可能性を示唆する ものであった。 そこで、 DNa s e 7によって処理 DNAが、 3' -OH/5' 一 P末端をもつフラグメントを産生するか否かを、 参考例 2 (2) (ii)に記載し たエンドラベリング法に準じて »ベた。 結果を図 9に示す。 これからわかるよう に、 DNa s e r (図中 c ) で消化した H e L a S 3細胞核由来の精製 DNA がエンドラベルされた時に、 参考例 2-(図 2、 a, b)で見られたのと同じラベ ルパターンが見られた。 エンドラベリングの面、 DNA断片の 5' 末端はアル力 リホスファターゼ前処理しなければ、 ラベルされなかった （図 9、 レーン 4〉 。 これから、 DNa s e は、 DNA鎮の 3' -OH/5' 一 P末端を生じること が判明した。
一方、 DNa s ea (図中 a) と β (図中 b) によって生じた DNA断片は、 アル力リホスフ" Γターゼ前処理後にのみ Td下により 3' 末端がラベル化され、 またアル力リホスファァーゼ前処理しなくても 5' 末蟻が全て反応することから、 3' — P/5' — OH末 «を有していることが判明した。
以上の実験結果から、 DNa s ea, 8および 7の性状および生理学的意義に ついて次のことがいえる。
これら 3種の DNa s eは、 細胞核の中に単量体の形想で存在しており、 クロ マチン DN Aのリンカー領域を切断し、 ヌクレオソームオリゴマーを産生する。
DNa s e αおよび5は、 ともに核から容易に可溶化して得られたことから、 核 質内に存在するェンドヌクレアーゼであると考えられる。 一方、 DNa s e 7は、 高埴濃度下で超音波処理しないと可溶化できないことから、 ある核構造物と強く 結合して存在していると考えられた。
本発明の DNa s e τは、 その活性に C a i+および Mg2+の両方を必要とする 細胞核に内在するエンドヌクレアーゼである。 当該 DNa s e 7によって切断さ れる DNA断片の末 ¾は、 アポトーシスラット胸腺で産生される DNA断片の末
差 ¾ え 用紙 （規則 26) 端と同じ 5' -P/3' 一 OH生成型であり、 またアポトーシスを抑制すること が知られる// Mオーダーの Ζηί+で、 DNa s e 7の活性も抑制される。 これら のことから、 DNa s e 7は胸腺のアポトーシスの DN A断片化に関与するェン ドヌクレアーゼであると考えられる。
一方、 本発明の DNa s e αおよび DNa s e )8は、 物理的および酵素上の性 質において上記 DNa s e rと相違しており、 その相違はクロモソーム DN Aの 切断様式および二価の金厲 »ィォンの要求性において β著であつた。
DNa s e αおよび は、 DNa s ατおよび; 8と同種の形 «の酵素が子ゥシ 胸腺の細胞核およびラット脾 Κ, 肝 Κの細胞核に存在していることから、 核機能 における D.N Α代謝やウィルス DN Αの分解に重要な働きを担っていると考えら れる。
実施例 3 DNa s e <rの c DNAクローニング
( 1 ) DNa s e 7の大量精製
ラット胸腺細胞では、 DNa s e 7の活性 （タンパク量） が低く、 部分アミノ 酸配列を決定するために必要な十分 1：の賅タンパクが得られなかった。 そこで D Na s e 7活性の高い脾 K細胞より DNa s e 7の精製を行った。
特に示さない限り、 以下の処理は 4 'Cで行った。
ラット脾 K細胞 1 0 Ogを 0. 3%ノイデット P— 40(NP— 40)を含有する縵 衡液 A 〔1 OmMトリス塩酸 （pH7. 8) 、 2mM 2—メルカブトエタノー ル、 0. 3mM PMSF、 3mM Mg C 12 〕 中でホモジネートした。 該ホ モジネートを 60 Oxgで 1 0分簡、 遠心分離にかけた。 沈 »した核画分を集め、 核面分中の DNa s e活性物を 0. 3 M硫安を含有する緩衝液 A中で超音波処理 することにより溶解し、 核の残舷物は 1 50, 00 Oxgで 1時圚遠心すること により除去した。
得られた上淸 （核抽出物） を緵衝液 N C2 OmMトリス塩酸 (pH7. 8)、 ImM 2—メルカブトエタノール、 0. ImM PMSF、 2. 5%エチレン グリコール〕 で平衡化した S—力一トリッジ （バイオラッド社製） に付した。 そ
差替 え用紙 （規則 26) のカラムを緩衢液 Nで洗浄した後、 锾衢液 N中の塩 »度 （KC 1 ) を 0M〜1M (50分間） まで直線的に堆加させることにより展開させた （流速 2. 0ml / m i n)。 参考例 3のアツセィ 1の方法で測定した結果、 DNa s eの活性物は 0. 6M KC 1で溶出したシングルピークとして回収された。 この活性物面分 を緩«液 Nで平衡化した CM 5 PWカラム （5 mm I. D. x 50mm ;柬 ソ一社製） による HPLCに供して、 緩衝液 Nの 0〜1 M KC 1の直線グラ ジ Xント （30分閼） で溶出させた （流速 0. 3mlZmi n) 。
0. 55M KC 1で溶出した DNa s e 7活性画分を、 挠いてへパリン 5 P W、 TSKG 2000 SWおよび SP 5 P Wカラムを用いた連統した H P L Cに より精製を行った。
詳細には、 まず各 DNa s e面分を緩衝液 Nで平衡化したへパリン 5 PWカラ ム （5mm I. D. x 50 mm；東ソ一社製） に付し、 蛋白質を緩衝液 Nの 0 〜1 M KC 1の直線グラジェント （30分間） で展開、 溶出させた （流速 0. SmlZmi n)。 溶出活性面分をさらに 0. 3M NaC lを含有する緩«液 M (2 Om ES-NaOH (pH5. 6) 、 1 mM 2—メルカブトエタ ノール、 0. ImM PMSF、 2. 5 ¾エチレングリコール〕 で平衡化した T SKG 2000 SWカラム （8mm I . D. x 30 cm；東ソ一社製） を用い たゲル Λ過 HPLC (流速 0. 5ml/mi n)で枏製した。 得られた DNa s e 7画分を最終的に緩衝液 Mで平衡化した SP 5 PWカラム （5mm I. D. x 50mm；東ソ一社製） による HPLCに付して、 緩衝液 Sの 0. 3〜0. 7 M NaC 1の直線グラジェント （35分間） で展開、 溶出させた （流速 0. 3 m 1 /m i n) o SP 5 PW HP L Cのプロファイルを図 1 0に示す。 0. 5 8M NaC 1で溶出した DNa s e 7活性画分を回収し、 SDS— PAGEに 付した。 尚、 DNa s e活性は参考例 3の （1) の方法を用いて測定した （図 1 0中） 。
(2) DNa s e 7の部分ァミノ酸配列の決定
SP5PW HPLCによる DNa s e «τ精製画分をトリクロロ醉酸で沈殿処
4 3 差替 え 用紙 （規則 26) 理し、 常法に従って CLaenunli. U., K.， Nature. 227: 680-685 (1970)等〕 、 1 0 %アタリルァミ ドによる SDS-PAGEにかけ、 銀染色により 33 kD aの バンドを検出した （図 1 0中） 。 次いで、 DNa s e γタンパクのバンドをミニ トランスプロッ トセル （バイオラッ ド社製） を用いてエレク トロプロッティング により PVDF膜 （ミ リボア社製） にトランスファーし、 その一部を用いて気相 プロテインークェンサー （PSQ— 1、 島津製作所製） により Ν末端アミノ酸配 列を決定した （表 3)。
また、 残りについては、 まず ¾剰の-メルカブトエタノールを加えてタンパク質 内のジスルフィ ド結合をスルフヒドリル基に還元後、 ョード醉酸を用いて該スル フヒドリル基をアルキル化し、 S—カルボキシメチル誘導体とした。 次いで、 L y s— Cェンドぺプチダーゼ （ぺプチドのリジン残基のカルボキシル基側のぺブ チド結合を特異的に切断する酵素） を含む緩衝液中に DNa s e «τタンパクを結 合した PVDF腹を加え、 37'Cで反応させた。 酵素消化後、 逆相 HPLCによ り輳より遊離する各ぺブチドフラグメントを分離回収した。 ぺブチドを含むフラ クシヨンを波長 2 1 4 nmでモニターした （図 1 1 a)。
ビークとして検出されるフラグメントの各フラクションは、 遠心エバボレ一 夕一にて乾燥後、 SDS溶液に溶解し、 気相プロテインシークェンサ一 （島津製 作所、 PSQ- 1 ) にかけて、 アミノ酸分析を行い、 各ペプチド断片の部分アミ ノ酸配列を決定した 〔表 3、 （K) は酵素消化により切断されたリジン残基を示 す〕 。
さらに、 まだ膜上に結合しているぺブチドを As p— Nェンドぺプチダーゼ (ぺプチドのァスパラギン酸残基のァミノ基側のぺプチド結合を特異的に切断す る酵素） で上述の方法により処理し、 得られるペプチドフラグメントを同様に逆 相 HPLCで分離回収し （図 1 l b) 、 アミノ酸配列を決定した （表 3)。
差替 え 用紙 （規則 26) 表 3 ット DNa s e τ消化断片のアミノ酸配列 処理 アミノ酸配列
Ν -末端 LRLTSFNXR
Ly s - Cエンド (K) ENHNA D I I V ぺブチダーゼ分解 (K) EQYAFLYK
(K) DFV I VPLHTTPE (K) AENF I FMG
A s p— Nェン ド DVFS
ぺプチダーゼ分解
X：未同定ァミノ酸
(3) cDNAライブラリー
ラット脾 KcDN Aライブラリ一は、 市販の Rat spleen 5' -STRETCH cDNA Lib rary (クロンテック社製） を用いた。 このライブラリ一は、 成体ラット （Spragu e-Dawley. ォス） の全脾 Kより抽出 ·精製した mRNAから、 オリゴ （dT) ラ ンダムブライマーを用いて調製した cDNA (平均サイズ： 1. 8kb) クロー ン （2 X 1 0 » インディペンデントクローン） をアダプターを介してス g t 1 1 ベクターの E c oR I部位に挿入したものである。
(4) DNAプローブの作製
表 3に示される DNa s e 7の部分アミノ酸配列中、 下線で示した配列から推 定される塩基配列に基づき、 オリゴ DN Aブローブを合成した。 表 4に該オリゴ DNAプローブの塩基配列を示す （最後のアミノ酸に対応するコドンが 1つに絞
4 5 差替 え 用紙 （規則 26) れない場合は合成しなかった）
表 4 オリゴ DNAプローブの塩基配列 アミノ酸配列 塩基配列 塩基数
KE HNA 5' -AARGA AAYCAYAAYGC-3' 17mer
KEQYAFL 5' -AA蘭 CARTAYGCNTTYYT-3' 20mer
DFVIV 5' -AARGAYTTYGTNATHGT-3' 17mer DVFS 5' -GARGTNTTYTC-3* llmer
R: A又は G, Y: T 又は N: A, G, T又は C. H: T, C 又は A
(5) スクリーニング
①スクリーニング用フィルターの作製
大碟菌 Y 1 090 "を 0. 2 %マルト一スと 1 OmM MgSO«を含む 40 m lの LB培地で一晚埯養後、 菌体を遠心して回収し、 該菌体を 30〜4 Om l の 1 OmM Mg SO こ懸濁した。 液 200 Iと上記 （3) のラッ ト c
DNAを有する t 1 1ファージ液とを混合し、 SM1 0緩衝液 UOm Tris-
HCl(ph7.6). 10mM UgC , 68mM NaCl.0, lmg/mlゼラチン〕 を加えて全量を 4 00 1として 37でで 20〜30分閟ィンキュベーシヨンした。
大 »菌 ·ファージ混合液を 1 OmM MgSO を含む 5¾LB寒天培地 上にまき、 次いで 60〜65ての LBトツブァガロース 6m 1をまいてよく混合 した。 トツプァガロースが固まったら 37てでー晚インキュベーションした。 インキュベーション後、 該ブレートを 4'Cで 1時間静置し、 次いでナイロン フィルター （ボール社製） をトツブァガロース上に fiきトランスファーを行った t
差替 え 用紙 （規則 26) 該ナイロンフィルターを変性液中で 20秒間、 次いで中和液中で 20秒 ra処理し、 該フィルターを ¾紙上で乾燥させた後さらに UV照射により固定した。
②ブローブの標識
上記 （4) で作製したオリゴ DNAブローブを 〔7—32 P〕 ATPと T4キ ナーゼを用いて、 5' 末端を SiP棵畿した。 以下の組成の反応液を 37でで 30 分閟ィンキュベーションした。
1 O ng/ 1 オリゴ DNA 1 u 1
1 0 x キナーゼバッファー 4 1
〔T一32 P〕 ATP 1 0 /i 1
UP 23 1
T 4キナーゼ 2 1
③プラークハイブリダィゼーシヨン
以下のように、 ブレハイブリダィゼーシヨン液を調製した。
5 X De nh a r d t溶液
6 SSPE溶液
0. 25 ¾ SDS
40 g/m 1 熱変性サケ精子 DNA
上記①で作製した.フィルターを該ブレハイブ、)ダイゼーション液中に入れ、 3 7でで一晩放置した。 次いで、 上記②で調製した標識化プローブを適量のブレハ イブ、)ダイゼーシヨン液と混合し、 フィルター 1枚あたり 5 u 1のプローブ溶液 を用いて 37'C、 1 8時間ハイブリダィズさせた。
ハイブリダィゼーシヨン終了後、 該フィルターを 0. 1 % SDSを含む 2 X SSCで洗い、 さらに 0. 1 % SDSを含む 2 XSSC中に該フィルターを入 れ、 42でで1〜1. 5時藺浸とうさせながら洗浄した。 該操作を 3回繰り返し た後 «紙上でフィルターを乾燥させ、 オートラジオグラフィーを行った （3日 面） 。
オートラジオグラフィ一の結果、 ポジティブクローンを示すシグナルの位置に
差替 え H (規則 26) 対応するトッブァガロースを取り出し、 500 1の 1 X λノくッファー中に入れ、 室温で 30〜60分囿放置した後、 その 1 0 s倍希釈液 1〜1 0 1を大 K菌 Y
1 090 '-懸菊液 200 / 1と混合した。 該混合液を用いて上記①〜③の操作を 繰り返して二次スクリーニングを行い、 単一プラークを分離した。 その結果、 1 6儷のポジティブクローンが得られた。 該ポジティブクローンを再び大腸菌 Y 1 090 f-に感染させ、 LB寒天培地プレート 1 «に一面にプラークができるよう にまき、 そのス g t 1 1ファージ DNAを回収した。 ファージ DN Aの回収法の 詳細については、 Maniatisらの方法 [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, second edition 2.64 (1989)〕 を参照した。
(6)サザン法による c DNAインサートの確認
回収したファージ DNAを B s i w I処理して c DNAィンサートを切り出し た後、 一部についてァガロースゲル S気泳動を行いェチジゥムブ口ミ ド染色によ りインサートの長さを確認した。 S気泳動後、 サザンらの方法 〔J.Mol.Biol.. 9 8, p503 (1975)〕 に従って DNAをナイロン腠 〔バイオダイン、 ボール社製〕 に トランスファーし、 スクリーニングの時と同様にハイブリダィゼーションを行つ
(7) ポジティブクローンのサブクローニング
B s i w I処理したファージ DNAをァガロースゲル 気泳動し、 GENECLEAN
11 Kitを用いてィンサート DNAを回収した。 そして、 K 1 e n ow酵素で末端 平滑化した後、 T4リガーゼによってインサート DNAを BAP処理した pBS IKS ( + ) の Sma Iサイトに組み込んだ。 そのライゲージヨン溶液を用いて コンビテント大碟菌 DH5 crを形 転換した。 すなわち、 全量 7〃 1のライゲー シヨン溶液にコンビテント大騰菌 0. 3m 1を加えて氷上で数時面放置後、 4
2でで 40秒閟熱刺瀲を加え氷上に戻し、 200 1の LB培地を加え、 37て で 30分間インキュベーションした後、 アンピシリン含有 LB寒天培地プレート に注ぎ 37でで一晚インキュベーションした。 シングルコロニーを採取し、 1. 5ml LB培地に入れ、 5時間振 ¾培養した。 遠心した沈殿からアルカリ法
4 8 差替 え 用紙 （規則 2G) (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition 1.25 (1989)〕 に よって pBSIKS ( + ) DNAを回収した。
(8)塩基配列の決定
(7) で得られた pBSEKS ( + ) DNAから TaKaRa Taq サイクルシーケ ンスキット（SIMAZU用、 宝酒造社製） を用いて、 DNAシークェンサ一 （DSQ - 1 000、 島津製作所製） で DNa s e r c DNAィンサートの塩基配列を 決定した。 その結果、 1 6働のポジティブクローン全てが DNa s eァの全長を コードしていた （配列表配列番号 2)。 該 c DNAクローンの全長は 1 208 b pであり、 その内部に 933 bpから成るオープンリーディングフレーム （配列 番号 2の塩基番号 12〜944 ) が存在し、 31 0アミノ酸残基 （配列表配列番 号 1) をコードしていた。 精製した DNa s e 7タンパク N末端のアミノ酸配列 解析結果と比較したところ、 該 DNa s e τ遗伝子一次翻訳産物は、 Ν末端側に 25アミノ酸残基 （配列番号 1のアミノ酸番号 1〜25)から成るプリカーサ一 ペプチド領域を有することが判明した。 したがって、 成熟 DNa s e 7タンパク は 285アミノ酸残基 （配列番号 1のアミノ酸番号 26〜 31 0) より成り、 か かるァミノ酸配列から推定される該タンパク質の分子量は 33. 027である。 この値は、 該タンパク質の SDS— PAGEによる分子量とよく一致した。
実施例 4 DNa s e 7抗体の作製
実施例 3の （2)で決定された本発明 DNa s eァの部分アミノ酸配列を基に、 合成した 2種のぺブチド （表 5) を使用抗原として DNa s e < に対するポリク ローナル抗体を作製した。
差替 え 用紙 （規則 26) 表 5
抗原として用いたペプチド
KENHNAMD I
KEQYAFLYK
上記 2種の合成ペプチドを、 それぞれマレイミ ド法によりキヤリアタンパクで ある Keyhole Limpets Hemocyanin (KLH) に架接した複合体と、 完全フロイン トアジュバント （FCA) との混和物を抗原として、 ゥサギ 〔Kb l ： JW、 1 5齡、 ォス、 体重 3〜3. 5kg (初回免疫時）、 各抗原に対して 2羽使用〕 に 背部皮下注射により 0. 5m g免疫した。 初回免疫から 3週簡毎に計 3回 0. 5 mgずつ追加免疫し、 各追加免疫の 1 0日後に部分採血し、 抗体価を測定しらに 最終免疫 （3回目の追加免疫） から 1 0日後に全血を採取して抗血淸を得た。 抗体価の測定は以下の方法で行った。
抗原を 1 0 jt g/mlの濃度でマイクロタイタープレートに固相化し、 ブロッ キング後、 感作ゥサギの部分血 （初回感作後 0, 3し 52日） を10'〜1 0' まで希釈して抗原と反応させた。 洗浄後、 抗ゥサギ I gG—ペルォキシダーゼ搮 班二次抗体を反応させ、 洗浄後、 基質液 ABTSの発色により抗体価を測定した c その結果、 いずれの場合も経時的に抗体価の上昇が確認された （表 6)。
5 0 差替 え 用紙 （規則 26) 表 6
抗 DNa s e 7血瀋の抗体雀
使用抗原： KENHNAMD I
^コーティング ブランク 倍数 初回 ίϋ$からの日数
0 31 52 0 31 52
101 0.186 2.182 2.630 0.097 1.071 1.095 10* 0.095 0.807 1.461 0.081 0.182 0.118 10* 0.079 0.154 0.358 0.079 0.085 0.082 10* 0.078 0.097 0.151 0.075 0.077 0.080 10» 0.079 0.083 0.092 0.076 0.076 0.081 10· 0.078 0.082 0.084 0.077 0.078 0.078 107 ο.οπ 0.079 0.082 0.078 0.074 0.079 10· 0.076 0.076 0.081 ο.ο 0.077 0.077 使用 SUE: KEQYAFLYK fit®コーティング ブランク 希釈倍数 初回免疫からの日数
0 31 52 0 31 52
101 0.175 2.445 2.537 0.112 0.116 0.121
10» 0.093 1.728 2.351 0.080 0.080 0.080
10， 0.092 0.663 0.928 0.078 0.076 0.074
10* 0.105 0.338 0.277 0.092 0.078 0.076
10' 0.105 0.241 0.165 0.081 0.079 0.079
10· 0.098 0.162 0.134 0.091 0.082 0.080
10τ 0.114 0.131 0.126 0.103 0.086 0.080
10» 0.105 0.123 0.129 0.151 0.105 0.089
5 1 差替 え 用紙 (規則 26) 産業上の利用可能性
本発明は、 クロマチン DNAのリンカー部位を選択的に切断する反応を触媒す る新規 DNa s ea, /Sおよび 7を提供するものである。 また、 本発明はアポ トーシスに閟与する新規な DNa s e 7を提供する。 さらに本発明はラットの D Na s e 7のアミノ酸配列、 該ァミノ酸配列をコードする DNA、 該 DNAの塩 基配列、 該 DNAを有する組換えベクター、 該組換えベクターで形質転換させた 宿主 ilffl胞、 該宿主細胞を培養することによる賅 DNa s e τの製造方法、 及び該 DNa s e γもしくはその前駆体、 又はそれらの断片に対する抗体を提供する。 本発明 DNa s e τによれば、 、 アポトーシスによる生体内での発癌の制御機 構、 自己免疫の制御機構、 A I DSの発症等を分子レベルで解明することが可能 であり、 また、 本酵素は癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症等の予防、 治療およ び診断薬の開発に貢献する点で有用である。 また、 癌の悪性度が増すほど、 その 癌細胞中の DNa s e 7の活性が低下すること等から、 本発明 DNa s e "をも とにして作成される抗体は、 痛の悪性度を轸断する試薬として有用であると考え られる。 さらに、 DNa s e r活性を指樣に探索される阻害剤及び活性化剤は、 新規な "アポトーシス制御性医薬品" となり得ることや、 DNa s e 7の遺伝子 は癌 （センス DNAの S化によるアポトーシスの促進） 、 自己免疫疾患 （アンチ センス DNAによるアポトーシス抑制） のアポトーシス ¾伝子療法を確立するた めの情報および試料として有用であると考えられる。
一方、 本発明の DNa s e αおよび /5は、 ウィルス感染時に增加しウィルス D Ν Αを切断することから、 ウィルス感染の治療薬の開発に有用である。 また、 本 発明 DNa s e αまたは /Sをもとにして作成される抗体は、 ウィルス感染等を診 断する試薬として有用であると考えられる。
5 2 差替 え 用紙 （規則 26)' 配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 310
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列：
Met Ser Leu Tyr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Ser Leu Leu Leu Phe
5 10 15 l ie Leu Ala Leu His Gly Ala Leu Ser Leu Arg Leu Cys Ser Phe Asn
20 25 30
Val Arg Ser Phe Gly Glu Ser Lys Lys Glu Asn His Asn Ala Met Asp
35 40 45
l ie l ie Val Lys l ie He Lys Arg Cys Asp Leu He Leu Leu Met Glu
50 55 60
l ie Lys Asp Ser Asn Asn Asn l ie Cys Pro Met Leu Met Glu Lys Leu 65 70 75 80
Asn Gly Asn Ser Arg Arg Ser Thr Thr Tyr Asn Tyr Val l ie Ser Ser
85 90 95
Arg Leu Gly Arg Asn Thr Tyr lys Glu Gin Tyr Ala Phe Leu Tyr Lys
100 105 110
Glu Lys Leu Val Ser Val Lys Ala lys Tyr Leu Tyr His Asp Tyr Gin
115 120 125
Asp Gly Asp Thr Asp Val Phe Ser Arg Glu Pro Phe Val Val Trp Phe
130 135 140
Gin Ala Pro Phe Thr Ala Ala Lys Asp Phe Val He Val Pro Leu His 145 150 155 160
Thr Thr Pro Glu Thr Ser Val Lys Glu l ie Asp Glu Leu Ala Asp Val
5 3 差替 え用紙 （規則 26) 165 170 175
Tyr Thr Asp Val Arg Arg Arg Trp Lys Ala Glu He Phe l ie Phe Met
180 185 190
Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Pro Lys Lys Ala Trp Lys
195 200 205
Asn 〖le Arg Leu Arg Thr Asp Pro Asn Phe Val Trp Leu l ie Gly Asp
210 215 220
Gin Glu Asp Thr Thr Val Lys Lys Ser Thr Ser Cys Ala Tyr Asp Arg 225 230 235 240 l ie Val Val Arg Gly Gin Glu l ie Val Asn Ser Val Val Pro Arg Ser
245 250 255
Ser Gly Val Phe Asp Phe Gin Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Glu Glu Glu
260 265 270
Ala Leu Asp Val Ser Asp His Phe Pro Val Glu Phe Lys Leu Gin Ser
275 280 285
Ser Arg Ala Phe Thr Asn Ser Arg Lys Ser Val Ser Leu Lys Lys Lys
290 295 300
Lys Lys Gly Ser Arg Ser
305 310 配列番号： 2
配列の長さ： 1208
配列の型：核酸
鎖の数：ニ本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類： cDNA
配列の特微
差替 え 用紙 （規則 26) 特徴を表す記号： CDS
存在位置： 12. . 941
特 ¾を決定した方法： E
配列：
CGAGTGCAAA G ATG TCC CTT TAC CCA CCT TCC CCA TAC CTG CCC TCC CTC 50
Met Ser Leu Tyr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Ser leu
5 10
CTA CTC TTC ATC CTT GCC CTT CAT GGT GCC CTG TCC CTG AGG CTC TGC 98 Leu Leu Phe l ie Leu Ala Leu His Gly Ala Leu Ser Leu Arg Leu Cys
15 20 25
TCC TTC AAT CTG ACG TCC TTT GGA GAG AGC AAG AAG GAA AAC CAC AAT 146 Ser Phe Asn Val Arg Ser Phe Gly Glu Ser Lys Lys Glu Asn His Asn 30 35 40 45
GCC ATG GAT ATC ATT CTG AAG ATC ATC AAA CGC TCC GAC CTC ATA CTG 194 Ala Met Asp He lie Val Lys He l ie Lys Arg Cys Asp Leu lie Leu
50 55 60
CTG ATG GAA ATC AAG GAC AGC AAC AAC AAC ATC TGT CCC ATG CTG ATG 242 Leu Met Glu lie Lys Asp Ser Asn Asn Asn He Cys Pro Met Leu Met
65 70 75
GAG AAG CTG AAT GGA AAC TCA CGA AGA AGC ACG ACA TAC AAC TAC GTG 290 Glu Lys Leu Asn Gly Asn Ser Arg Arg Ser Thr Thr Tyr Asn Tyr Val
80 85 90
ATT AGC TCT CGG ΖΊΊ GGA AGA AAC ACA TAT AAA GAA CAG TAT GCC TTC 338 He Ser Ser Arg Leu Gly Arg Asn Thr Tyr Lys Glu Gin Tyr Ala Phe
95 100 105
CTC TAC AAG GAG AAG CTC GTG TCT GTG AAG GCA AAA TAC CTC TAC CAT 386 Leu Tyr Lys Glu Lys Leu Val Ser Val Lys Ala Lys Tyr Leu Tyr His
5 5 差替 え甩紙 （規則 26) 110 115 120 125
GAC TAT CAG GAT GGA GAC ACA GAC GTG TTT TCC AGG GAG CCC TTT GTG 434
Asp Tyr Gin Asp Gly Asp Thr Asp Val Phe Ser Arg Glu Pro Phe Val
130 135 140
CTT TGG TTC CAG GCG CCC TTC ACT CCT GCC AAG CAC TTC GTG ATT GTC 482 Val Trp Phe Gin Ala Pro Phe Thr Ala Ala Lys Asp Phe Val He Val
145 150 155
CCC TTG CAC ACA ACT CCT GAA ACC TCC GTT AAA GAG ATA GAT GAG CTG 530 Pro Leu His Thr Thr Pro Glu Thr Ser Val lys Glu He Asp Glu Leu
160 165 170
GCT GAC GTC TAC ACG GAT GTT AGA AGA CGA TGG AAG GCA GAG ATT TTC 578 Ala Asp Val Tyr Thr Asp Val Arg Arg Arg Trp Lys Ala Glu He Phe
175 180 185
ATC TTC ATG GGT GAT TTC AAT GCT GGC TGC AGC TAC GTC CCC AAG AAG 626 He Phe Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Pro Lys Lys 190 195 200 205
GCC TGG AAG AAC ATC CGT TTG AGG ACA GAC CCC AAC TTT GTT TGG CTG 674 Ala Trp lys Asn lie Arg Leu Arg Thr Asp Pro Asn Phe Val Trp Leu
210 215 220
ΑΠ GGG GAC CAA GAG GAC ACC ACG GTC AAG AAG AGC ACC AGC TGT GCC 722 l ie Gly Asp Gin Glu Asp Thr Thr Val Lys Lys Ser Thr Ser Cys Ala
225 230 235
TAT GAC AGG ATT GTC GTT CGC GGA CAA GAG ATA GTC AAC TCT GTG GTT 770 Tyr Asp Arg l ie Val Val Arg Gly Gin Glu l ie Val Asn Ser Val Val
240 245 250
CCC CGC TCC ACT GGC GTC TTT GAC TTT CAG AAA GCT TAT GAG HG TCT 818 Pro Arg Ser Ser Gly Val Phe Asp Phe Gin lys Ala Tyr Glu Leu Ser
5 6
差替 え 用 紙 （規則? 6) 255 260 265
GAA GAG GAG GCC CTG GAT GAT GTC AGT GAC CAC TTT CCA GTT GAG TTT 866 Glu Glu Glu Ala Leu Asp Val Ser Asp His Phe Pro Val Glu Phe Lys
270 275 280 285
AAG CTA AGT TCA AGA GCC TTC ACC AAC AGC CGG AAA TCT GH TCT CTA 914 Leu Gin Ser Ser Arg Ala Phe Thr Asn Ser Arg Lys Ser Val Ser Leu
290 295 300
AAG AAA AAG AAA AAA GGC AGT CGC TCG TAG GTCTCATGTT GCCATTTTCT 964 Lys Lys Lys Lys Lys Gly Ser Arg Ser
305 310
TTTCTTAAAG TCGTCCCTTG CTTCCAGATA AAATGGCCTC GTGGGTCTCA GCTCTCTGCA 1024 CACTCAGGAA TTAAGACTGG CTAAGCTGTT TTCACTGTCC ACTCTGGTTA ATTTTCCCTG 1084 GAGCCAAGTT GGGAGGACAG CCTTCTGTTA CATCACCCTG ACCACGGGCA CCCTCCGAAC 1144 CACCATGGGT AACCTGAAGA GACACAAAGT CTATTCCATA ATAAATGCGT GTATTTATTA 1204 CCCG 1208 配列番号： 3
配列の長さ ： 9
配列の型：アミノ酸
K列の種類：タンパク質
配列：
Leu Arg Leu Thr Ser Phe Asn Xaa Arg
5 9 配列番号： 4
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
差替 え 用紙 （規則 26) 配列の種類：タンパク質
配列：
Lys Glu Asn His Asn Ala Met Asp He lie Val
5 10 11
配列番号： 5
配列の長さ ： 9
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列：
Lys Glu Gin Tyr Ala Phe Leu Tyr Lys
5 9
E列番号： 6
配列の長さ ： 13
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列：
Lys Asp Phe Val lie Val Pro Leu His Thr Thr Pro Glu
5 10 13
配列番号： 7
配列の長さ： 9
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
5 8 差替 え 用紙 （規則 26) 配列：
Lys Ala Glu Asn Phe l ie Phe Met Gly
5 9 配列番号： 8
配列の長さ ： 4
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列：
Asp Val Phe Ser
4 配列番号： 9
配列の長さ ： 17
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
£列：
AA GARAAYC AYAAYGC 17 配列番号： 10
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎮
トポロジー：直鑌状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
5 9
差替 え 用紙 （規則 26) 配列：
AARGARCART AYGCNTTYH 20
E列番号： 11
配列の長さ ： 17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直敏状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列：
AARGAYTTYG TNATHG 17 配列番号： 12
配列の長さ： 11
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直镇状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列：
GAYCTNTTTT C 11
6 0 差替 え 用紙 （規則 26)

Claims

請求の範囲
1. クロマチン DNAのリンカー部位を選択的に切断し得るェンドヌクレアー ゼであって、 かつ下記性状を有することを特徵とするデォキシリボヌクレアーゼ。
①局在性 ： 钿胞核
②分子量 ： （i) 33, 000 (SDS-PAGE)
(ii) 31, 000 (ゲル據通法）
®至適 pH： 7. 2
④ 2価隔イオン要求性 Ca2VM¾2+, Mn 依存性
⑤ Zn による阻害 I Cso= 40
⑥ DNA切断様式 3' - OH, 5' 一 P末端生成型
2. クロマチン DNAのリンカー部位を選択的に切断し得るェンドヌクレアー ゼであって、 かつ下記性状を有することを特徴とするデォキシリボヌクレアーゼ,
①局在性 ： 細胞核
②分子量 ： （0 32， 000 (SDS-PAGE)
(ii) 28, 000 (ゲル激 ¾法）
③至適 pH： 5. 6
④ 2価 Kイオン要求性 非依存性
⑤ Zni+による阻害 I C,0> 1 mM
⑥ DN A切断様式 3' 一 P, 5' 一 OH末端生成型
3. クロマチン DN Aのリンカー部位を選択的に切断し得るェンドヌクレア一 ゼであって、 かつ下記性状を有することを特徴とするデォキシリボヌクレアーゼ,
①局在性 ： 細胞核
②分子量 ： （i) 32, 000 (SDS-PAGE)
(ii) 30, 000 (ゲル »過法）
③至適 pH : 5. 6
④ 2価暘ィォン要求性： 非依存性
⑤ Zn，+による阻害 ： I C80> 1 mM
6 1 差替 え 用紙 （規則 26) ⑥ DN A切断様式 3' — P, 5' - OH末端生成型
4. 実質的に、 列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 2 6乃至 3 1 0で示されるァミノ藪配列を有する講求項 1記載のデォキシリボヌク レアーゼ。
5. 細胞中でプロテアーゼによってプロセッシングされる前の前駆体が N末端 プリカーサ一ぺブチド領域を有する請求項 1記載のデォキシリボヌクレアーゼ。
6. N末端プリカーサ一ぺブチド領域が、 実質的に配列表配列番号 1に示され るアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 1乃至 25で示されるアミノ酸配列を有する購 求項 4記載のデォキシリボヌクレアーゼ。
7. 請求項 1又は 4〜 6のいずれかに記載のデォキシリボヌクレアーゼをコ一 ドする塩基配列を含む DNA。
8. 配列表配列番号 2に示される塩基配列中、 塩基番号 87乃至 94 1で示さ れる埴基配列を有する讅求項 7記載の DNA。
9. 配列表配列番号 2に示される塩基配列中、 塩基番号 1 2乃至 94 1で示さ れる ¾基配列を有する請求項 6に記載の DN A。
1 0. 請求項？〜 9のいずれかに記載の DNAを含有する組換えベクター。
1 1. 請求項 1 0記載の組換えべクタ一で形質転換された宿主細胞。
1 2. 請求項 1 1記載の宿主細胞を培養し、 得られる培養物から請求項 1又は 4〜 6のいずれかに記載のデォキシリボヌクレア一ゼを採取することを特徵とす る請求項 1又は 4〜6のいずれかに記載のデォキシリボヌクレアーゼの製造法。
1 3. 実質的に、 配列表 se列番号 1に示されるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号
1乃至 3 1 0で示されるアミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチドに親和性 を示す抗体。
6 2
辇替 え用紙 （規則 26)
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