WO1996007433A1

WO1996007433A1 - Gene therapy drug for cancer, medicinal composition, and therapeutic method

Info

Publication number: WO1996007433A1
Application number: PCT/JP1995/001785
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Hamada; Haruo Sugano
Original assignee: Japanese Foundation For Cancer Research
Priority date: 1994-09-09
Filing date: 1995-09-08
Publication date: 1996-03-14
Also published as: JP3822261B2; JPH08127542A

Description

明細書

癌の遺伝子治療剤および医薬組成物、ならびに治療方法技術分野

本発明は、癌の遺伝子治療剤および医薬組成物、ならびに治療方法に関する。さらに詳細には、本発明は、サイト力イン遗伝子を導入したエフヱクタ一細胞とサイトカイン遺伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ワクチンを含む癌の遺伝子治療剤、該ェフユクタ一細胞を含有する製剤と該腫瘍ワクチンを含有する製剤を癌患者に投与することを特徴とする癌の遺伝子治療方法、ならびに該エフェクタ一細胞と該腫瘍ワクチンとの組み合わせを含む医薬組成物に関する。サイトカインは抗腫瘍効果を発揮するが、その作用機序により主に以下の 3つに大別される。すなわち、 ①腫瘍壊死因子（TNF)_a, β インターフェロン（IFN )-α, β, ァ、インターロイキン（ID- 1などのように、癌細胞に対して in vitro で直接的な増殖抑制ないし障害活性を示すもの、 ②インターロイキン（Iい- 2, 4, 6, 7, 8， 9, 10, 11, 12などのように生体の免疫エフヱクタ一機構を介して間接的に抗腫瘍効果を示すもの、 ③ IL- 3、 Iい 6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF：)、顆粒球コロニー刺激因子（G- CSF) 、幹細胞因子（SCF) などのように他の制癌療法に伴う生体の副作用の防止や治療に用いられているものである。さらに、近年サイトカイン遗伝子導入による癌治療も試みられている。これらの一つはサイトカイン遗伝子をリンパ球、例えばリンホカイン活性化キラー細胞

(LAK)、細胞障害性 T細胞（CTL)、腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) などに導入し、導入細胞から分泌されるサイトカインによりオートクラインあるいはパラクラインでリンパ球を活性化して受動免疫能を高めたり、 T1L に直接抗腫瘍性のある 1FN または TNF遺伝子を導入することにより腫瘍局所での抗腫瘍性を高めようという試みがなされている（Nishihara et al. , Cancer Res. , 48， 4730, 1988、 iyatake et al. , J. Natl. Cancer Inst., 82, 217, 1990、 Itoh et al., Jpn. J. Can cer Res., 82， 1203， 1991) 。 TIL へのサイトカイン遗伝子導入は、これまでレトロウィルスが利用されているが、導入効率が非常に悪く、当アブローチに対する障害となっている。

もう一つはレトロウィルスべクターなどにより腫瘍細胞にサイトカイン遗伝子を導入して腫瘍ワクチンとして用い、宿主の腫瘍特異的免疫細胞を誘導するものである。例えば、 Fearonらは 1 L-2遺伝子を導入したマウス大腸癌、悪性黒色腫を同系マウスに移植すると生着後自然退縮し、そのマウスは IL-2遗伝子非導入腫瘍細胞の再移植に対して抵抗性をもつ免疫能を獲得することを報告している（Fear on et aし， Ce l l, 60, 397， 1990) 。

し力、しな力くら、これらはいずれも抗腫瘍性に対して必ずしも満足のいく成績が得られるものではなかったり、また転移抑制効果という面からは検討がなされておらず、癌転移に対し有望と思われるものは現状では報告されていない。発明の開示

従って、本発明の目的は、上記のような問題を解決すべく、より高い抗腫瘍活性を発揮し得、かつ癌転移の抑制にも有効な癌の遗伝子治療剤を提供することにあ O ο

本発明者らは前記のような課題について鋭意研究を行った結果、サイトカイン遺伝子を導入したエフェクター細胞とサイトカイン遗伝子を腫瘍細胞に導人した腫瘍ワクチンを併用すれば、効率よく全身免疫が誘導されて抗腫瘍効果と転移抑制効果が増強されることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、サイトカイン遠伝子を導入したエフェクター細胞とサイト力ィン遗伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ヮクチンを含む癌の遺伝子治療剤を提供" 5る。

本発明はまた、サイトカイン遗伝子を導入したエフュクター細胞を含有する製剤とサイトカイン遗伝子を腫瘻細胞に導入した腫瘍ワクチンを含有する製剤を同時にまたは逐次的に癌患者に投与することを特徵とする癌の遺伝子治療方法を提供する。

さらに本発明は、癌の遺伝子治療のために使用する医薬組成物であって、該組成物がサイトカイン遺伝子を導入したエフェクター細胞とサイトカイン遗伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ワクチンの組み合わせおよび薬学的に許容される担体からなる医薬組成物を提供する。

本発明にいう癌の遺伝子治療とは、サイトカイン遗伝子による抗腫瘍作用ならびに転移抑制作用の両面からの癌治療を企図するものである。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において使用されるサイトカイン遗伝子とは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM- CSF)、インターロイキン（1い- 2, IL-3, IL_4， IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15、インタ一ロイキン- la (IL- 1な）、インタ一ロイキンレセプター 1 アンタゴニス卜（1ぃ 1RA)、腫瘍壊死因子（TNF) —な、リンホトキシン（LT)一 5、顆粒球コロニー刺激因子（G- CSF) 、マクロファージコロニー刺激因子（M- CSF) 、インターフロン（IFN)— ァ、マクロファージ遊走阻止因子（ MIF)、白血病抑制因子（LIF)、 T細胞活性化共刺激因子 B7 (CD80) 並びに B7-2(C D86)、キット ' リガンド、オンコスタチン M等の各種サイトカインをコ一ドする遺伝子をいう。既に種々のサイトカイン c DNAがクローニングされている [ヒト GM- CSF cDNAについては Wong et al.， Science, 228， 810-815 (1985)、ヒト IL-2 cDNAについては Taniguchi et al., Nature, 302, 305-310 (1983)、ヒト IFN-r cDNA については Gray et al., Nature, 298， 859-863 (1982)]。本発明において使用されるサイトカイン遺伝子は、公知の技術を用いて細胞から単離して得られた c DNAであっても、また上記の文献等に開示される情報よりポリメレース連鎖反応（P CR) 等の方法に従って化学的に合成されたものであってもよいが、免疫的拒絶反応を最小に抑えるために、また、治療効果を上げるために、ヒト由来のものが望ましい。

本発明においてエフェクター細胞とは、癌細胞の破壊の最終段階を担当し、破壊に直接携わる細胞集団をいい、具体的には腫瘍浸潤リンパ球（TIL) 、リンホカイン活性化キラー細胞（LAK)、細胞障害性 T細胞（CTL)等をいう。

これらエフヱクタ一細胞へのサイトカイン遺伝子の導入は、アデノウイルスべクタ一を用いることにより非常に効率良く行うことができる。ここで使用されるアデノウイルスベクターとしては、サイトカイン遺伝子のための挿入部位を含み、導入されたエフヱクタ一細胞においてサイトカインを発現できるものであれば特に限定されないが、ヒト 5型アデノウイルス由来の Adexl [Sai to, 1. e t al. , J. Vi o l. , 54， 711-719 (1985)]が好適に使用される。

一方、本発明にいう腫瘍ワクチンとは、上記のサイトカイン遗伝子をレトロゥィルスべクタ一により単離（培養）腫瘍細胞に導入し、これに X線照射を行って、サイト力インの産生は阻害せずに増殖のみを停止させたものである。この腫瘍ヮクチンを宿主に投与することにより、宿主の腫瘍特異的免疫細胞を誘導することができる。

ここで使用されるレトロウイルスベクターは、サイトカイン遗伝子のための揷入部位を含み、導入された腫瘍細胞においてサイトカインを発現できるものであれば特に限定されないが、例えば、特表平 6-503968 号公報に開示される、 MFG 、 α -SCG, PLJ 、 pEm 等が挙げられる。サイト力イン遗伝了を挿入したレトロゥィルスべクタ一は、目的の遗伝子が導入されたことを選択するマーカーとしてネォマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドとミックスして、 Ψ2、 Ψ - Am、 CR IP 、 WCRE [Danos et al .， PNAS, 85, 6460-6464 (1988)]等のパッケージング細胞にカルシウム共沈殿法により導入する（コトランスフヱクシヨン）。さらにこれを薬剤 G 4 1 8の存在下で培養し、生存してコロニーを形成してくる細胞を採取することによって、目的とする遺伝子の導入されている細胞のみを採取することができる。次にこれらの細胞の培養上清を用いて N1H3T3マウス繊維芽細胞、 B16 マウスメラノーマ細胞など各種腫瘻細胞に感染させ、最終的には細胞の染色体に導入された安定な遺伝子導入細胞として、サザンハイブリダイゼーシヨンによつて確認することができる。また、感染細胞から分泌されるサイトカインの量は、 E L I S A等の免疫学的アツセィにより測定することができる。

次に、サイトカイン遗伝子が導入された腫瘍細胞を、通常】.0，000〜150，000 ra d の X線を照射後、これを腫瘍ワクチンとして用いる。

ここでいう腫瘍細胞は、メラノーマ細胞ないし腎癌細胞であるが、他の腫瘍細胞、例えば乳癌細胞、偏平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、肉腫、神経膠腫（グリオ —マ）等も用いることができる。

上記のようにしてそれぞれ調製したサイトカイン遺伝子導入エフクタ一細胞と腫瘍ワクチンはそのまま用いることができるが、医薬的に許容できる担体とともに医薬組成物として、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固形剤、または溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化して投与することもできる。

上記担体としては、使用形態に応じた製剤を調製するのに通常慣用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壌剤、表面活性剤等の賦形剤ないしは希釈剤等が挙げら本発明の遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内、皮下等の全身投与の他に、癌原病巣に対して、または癌種に対応した予想転移部位に対して、局所注射、経口投与等の局所投与を行うことができる。さらに、本発明の遗伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、または外科的手術等と組み合わせた投与形態をとることもできる。

また、投与方法としては、上記のようにしてそれぞれ調製したサイトカイン逡伝子導人エフクタ一細胞と腫瘍ヮクチンを同時に投与してもよく、ェフエクタ一細胞を先に投与してから腫瘍ワクチンを後に逐次的に投与してもよく、あるいは、腫瘍ワクチンを先に投与してからエフェクター細胞を後に逐次的に投与してもよい。

本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たりサイトカイン遗伝子の重量にして、約 0. 1〜100 mgの範囲が適当である。図面の簡単な説明

第 1図は、 Iい 2遺伝子導入に用いる発現用カセッ卜の構築を示す。

第 2図は、 IL- 2、または GM-CSF遗伝子導入に用いる組み換えレトロウイルスべクタ一の構築を示す。

第 3図は、サイトカイン遺伝子（Iい 2)を導入したマウスメラノーマ（B16F10)由来エフヱクタ一細胞（TI L) とサイトカイン遗伝子（Iい 2 + GM-CSF) を導入したマウスメラノ一マ（B16F10)ヮクチンによる癌転移抑制効果の結果を示す。

第 4図は、サイトカイン遗伝子（IFN-ァ）を導入したマウスメラノ一マ（B16F10 )由来エフクタ一細胞（TI L) とサイトカイン遺伝子（GM-CSF)を導入したマウスメラノ一マ（B16F10)ヮクチンによる癌転移抑制効果の結果を示す。第 5図は、サイト力イン遺伝子（Iい 2 または IFN-ァ）を導入したマウス大腸癌 (Colon26) 由来エフェクター細胞（TIL) とサイト力イン ¾伝子（Iい 2)を導入したマウス大腸癌（Col on26) ヮクチンによる癌転移抑制効果の結果を示す。発明を実施するための最良の方法

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。

〔参考例 1〕

マウス 1い 2、マウス GM-CSF、及びマウス IFN-ァの cDNAは、マウスの脾リンパ球の m R N Aを用いて RT - PCR (Reverse transcri pi ton-pol ymera.se chain react i o n)法により調製した。 PCR を行うに際し、マウス 1L- 2に対しては以下に示すブライマ一 #479, #480、マウス GM-CSFに対しては以下に示すプライマー #477, #478、マウス IFN-ァに対しては以下に示すプライマー #485, #486をそれぞれ使用した。プライマー（#479) ： CCGAATTCTAGACACC ATG TAC AGC ATG CAG CTC GCA TCC TG T G

プライマ—（#480) ： C TGT CAA AGC ATC ATC TCA ACA AGC CCT CAA TAA GGATC C CC

プライマー（#477) ： CCGAATTCTAGACACC ATG TGG CTG CAG AAT TTA CTT TTC CT G GGC

プライマー（#478) ： C CCC TTT GAA TGC AAA AAA CCA AGC CAA AAA TGA GGATC C GG

プライマ一（#485) ： CC GAA TTC TAGA CACC ATG AAC GCT ACA CAC TGC ATC TT G GC

プライマー（#486) ： C AGG AAG CGG AAA AGG AGT CGC TGC TGA GGATCCGG

〔実施例 1〕サイト力イン遺伝子導入エフェクター細胞（TI L/Iい 2) の調製 (1) マウスメラノ一マ B16F10由来 T1L の調製

T1L の調製は、 Alexander, R. B. et al.， J. Immunol. , 145, 1615-1620 (199 0)、 Mat is, L. A. et al. , Methods Enzymol. , 150， 342-351 (1987) 、 Livingst one, A. et al. , Methods Enzymol. , 150, 325-333 (1987)記載の方法に改良を加えて以下のようにして行った。 6 〜10週令の雌性 C57BL/6 マウス（Charles Riv er Japanより購入）に移植したマウスメラノ一マ B16(ATCC CRL6322) の高転移株である B16F10 (Whitehead Institute Dr. Glenn Dranoffより入手）の新鮮な腫瘍塊を完全培養培地（CM) 中に 4 °Cで 5 X 10⁷cells/ml 懸濁した。 CMは、熱不活化した 10¾ ゥシ胎児血清、 2mM L-グルタミン、 5 X 10"⁵M 2- メルカプトエタノール、 100U/ml ペニシリン、 100 g/mlストレプトマイシン、 0.5 ^g/ml 了ンホテリシン B、 lOmM 3- (N-モルホリノ）プロパンスルホン酸、及び 70U/ml組み換えヒ卜 IL- 2 (塩野義製薬（株）より入手）を添加した RPMI 1640 である。 TIL を等量の抗 CD-8- 結合免疫吸着ビーズと 1 X 10⁸/mlで混合し、 4 °Cで 2 時間インキュベ一卜した。 T1L が付着したビーズはペレツトイヒし、冷 CMで 3 回洗浄し、 CM中に 1 xi0⁷beads/ml 懸濁し、 24ゥヱルの組織培養プレー卜に播き、 37°C、 5¾C0₂ 下でィンキュベートした。培養 1 日後、 TIL から分離したビーズをペレツト化し、除去した。分離した TIL にゥヱル当たり 2 X 10⁵ 個の照射（10，000rad) 腫瘍細胞、ならびに 1 X 10⁶ 個の照射（3，000rad)正常脾細胞を用いて刺激した。 in vitro刺激を 7 曰から 14日毎に繰り返した。コンフルェントになったときに TI L を分取し、新たな CM中に 2 X l0⁵cell/ml再懸濁した。

(2) アデノウイルスによるマウス IL- 2遠伝子の TIL への導入

組み換えアデノウイルスを調製する方法は、 Saito. I. et al., J. Viol., 54, 711-719 (1985) の変法により行った。すなわち、サイトメガロウィルスェンハンサ一、チキン/ S—ァクチンプロモーター、参考例 1で調製したマウス 1L- 2の cD NA配列、ラビット一 yS—グロビンポリ（A) シグナル配列からなる発現ユニット [Niwa, H. et al., J. Gene 108， 193-200 (1991)]を、 E1A， E1B, および E3遗伝子を欠く 31kbのアデノウイルスタイプ 5 を含む 42kbコスミドである pAdexlvv (鐘ケ江裕美、原田志津子、斉藤泉、実験医学バイオマニュアル 4、 189-204 、 1994 、羊土社）の Swal制限酵素部位に挿入することによって発現用コスミドカセットを構築した（第 1図）。この発現用コスミドカセッ卜とアデノウイルス DNA— ターミナル蛋白複合体（DNA- TPC)を 293 細胞（ATCC CRL1573)にカルシウム共沈法によりコトランスフヱク卜した。発現カセッ卜の入った組み換えウィルスは適当な制限酵素による消化によって確認した。組み換えウィルスは続いて 293 細胞で增殖させ、ウィルス溶液を- 80 °Cで咛蔵した。ウィルスストックのタイターは 29 3 細胞上でのプラークアツセィによって決定した。（1) で調製した TIL へのアデノウィルスの in vitro感染のために、培養液を 12—ゥヱル培養プレートに播いた TIL 細胞から除き、各ゥヱルにウィルスストック 150 ΐ を加えた。 37°Cで 1 時間インキュベーション後、増殖用培地を添加し、 TIL 細胞を 2 〜3 日培養し、マウス 1レ 2遺伝子導入 T1L 細胞（TIL/ -2) を得た。

〔実施例 2] 腫瘍ワクチン（B16F10/IL- 2 +GM- CSFワクチン）の調製

(1) マウス lL-2、マウス GM-CSF高タイ夕一組み換えレトロウイルス産生クローンの調製

レトロウイルスベクター MF G (Dranoff, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 90, 3539-3543, 1993)の 2 つの LTR (Long Terminal Repeat)含む Eagl/B amHIフラグメント（5200bp：)、 Eagl/Xbal フラグメント（lOOObp：)、ならびに参考例

1で調製したマウス Iい 2、マウス GM- CSFの各 cDNAの Xbal/BamHIフラグメントの 3 つを T 4 DNAライゲ一スでつないでプラスミドに組み込んだ（第 2図）。得られたプラスミドと pPGKneo [H. Takeshima et al. , Nature, 369, 556-559 (1994 ；)]をカルシウム共沈殿法により WCRIPCDanos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85， 6460 (1988)] に導入し、これを G- 418(GIBC0, lmg/ml)を含む培地にて

1週間培養し、コロニーを形成してくる細胞を採取した。次にこれらの細胞の培養上清を polybrene(Sigma, 8 g/ml) 存在下、 NIH3T3マウス繊維芽細胞 (ATCC C RL 1658)に感染させた。感染細胞のゲノム DNAを単離し、ウィルスのタイターをサザンブロット法で測定し、組み込まれたプロウィルスのコピー数として評価した。 N1H3T3への導入効率は通常、 1 細胞につきプロウィルスの組み込みで 1 〜 3 コピー数であった。また、感染細胞より分泌されるサイトカインは、培地 10ml を含む 10- cm ディッシュに 1 X10⁶ 細胞を播いた 48時間後に、 ELISA (Endogen) によりアツセィした（第 1表）。第 1表 cDNA タイター（コピー数）発現量マウス IL- 2 2.0 6350 IU/ml

マウス GM- CSF 2.0 13.5 ng/ml

(2) 腫瘍ワクチン（B16F10/IL-2 + GM-SCFワクチン）の調製

(1) で選択したマウス 1レ2、マウス GM-CSFそれぞれの高タイター組み換えレトロウィルス産生クローンをマウスメラノ一マ B16(ATCC CRL 6322)の高転移株である B16F10 (Whitehead Institute Dr. Glenn Dranof fより入手）に導入した。該遗伝子導入細胞は、 10 ゥシ胎児血清および 2mM グルタミンを添加したダルベッコのイーグル培地で維持し、トリプシン/ EDTA で処理し、 HITACHI MBR-1505R X-ra y generator を用い、 10，000rad の X線を照射した。照射細胞は HBSS(Hank' s Ba lanced Salt Solution) で 2 回洗浄し、 5 xiO⁶ cell/ml の濃度で HBSSに再懸濁し、腫瘍ワクチン（B16F10/IL-2 +GM-CSFワクチン）を得た。

〔実施例 3〕サイトカイン遗伝子導入エフェクター細胞（TIL/IFN-ァ）の調製

(1) マウスメラノーマ B16F10由来 TIL の調製

実施例 1 (1)と同様の方法により調製した。

(2) アデノウイルスによるマウス IFN-7遺伝子の T1L への導入

組み換えアデノウイルスを調製する方法は、 Saito. I. et al.， J. Viol., 54， 711-719 (1985) の変法により行った。すなわち、サイトメガロウィルスェンハンサ一、チキン yS—ァクチンプロモータ一、参考例 1で調製したマウス IFN-ァの cDNA配列、ラビット— β—グロビンポリ（ A ) シグナル配列からなる発現ュニッ h [Niwa, H. et a , J. Gene 108， 193-200 (1991)]を、 E1A, BIB, および E3遗伝子を欠く 31kbのアデノウイルスタイプ 5 を含む 42kbコスミドである pAdexlcw ( 鐘ケ江裕美、原田志津子、斉藤泉、実験医学バイオマニュアル 4、 189-204、 19 94、羊土社）の Clal制限酵素部位に挿入することによって発現用コスミドカセットを構築した（第 1図）。この発現用コスミドカセッ卜とアデノウイルス DNA 一ターミナル蛋白複合体（DNA- TPC)を 293 細胞（ATCC CRL1573)にカルシウム共沈法によりコトランスフヱク卜した。発現カセッ卜の入った組み換えウィルスは適当な制限酵素による消化によって確認した。組み換えウィルスは続いて 293 細胞で増殖させ、ウィルス溶液を- 80 °Cで貯蔵した。ウィルスストックのタイタ一は 293 細胞上でのプラークアツセィによって決定した。（1) で調製した TIL へのァデノウィルスの in vitro感染のために、培養液を 12—ゥヱル培養プレートに播ぃた T1L 細胞から除き、各ゥヱルにウィルスストック 150 \ を加えた。 37°Cで 1 時間ィンキュベーション後、増殖用培地を添加し、 TIL 細胞を 2〜3 日培養し、マウス 1FN- 7遺伝子導入 T1L 細胞（T1し/ IFN-7) を得た。

〔実施例 4] 腫瘍ワクチン（B16F10/GM- CSF ワクチン）の調製

(1)マウス GM- CSF高タイター組み換えレトロウィルス産生クローンの調製実施例 2 (1) と同様の方法により調製した。

(2) 腫瘍ワクチン（B16F10/GM-SCFワクチン）の調製

(1) で選択したマウス GM-CSFの高タイター組み換えレトロウィルス産生クローンをマウスメラノーマ B16(ATCC CRL 6322)の高転移株である B16F10 (Whitehead Institute Dr. Glenn Dranoffより入手）に導入した。該遗伝子導入細胞は、 10X ゥシ胎児血清および 2mM グルタミンを添加したダルベッコのイーグル培地で維持し、トリブシン/ EDTA で処理し、 HITACHI MBR-1505R X-ray generator を用い、 10, OOOrad の X線を照射した。照射細胞は HBSSで 2 回洗浄し、 5 xiO⁶ cell/ml の濃度で HBSSに再懸濁し、腫瘍ワクチン（B16F10/GM-CSF ワクチン）を得た。

〔実施例 5〕サイトカイン遗伝子導入エフヱクタ一細胞（TIL/Iい 2, TIL/IFN- 7) の調製

(1) マウス大腸癌 Colon 26由来 TIL の調製

TIL の調製は、 Alexander, R. B. et al.， J. Immunol., 145, 1615-1620 (199 0)、 Matis, し A. et al., Methods Bnzymol. , 150, 342-351 (1987) 、 Livingst l o one, A. et al. , Methods Enzymol. , 150, 325-333 (1987)記載の方法に改良を加えて以下のようにして行った。 6 〜10週令の雌性 BALB/Cマウス（Charles River Japanより購入）に移植したマウス大腸癌 Colon 26の新鮮な腫瘍塊を完全培養培地（CM) 中に 4 °Cで 5 X10⁷cells/ml 懸濁した。 CMは熱不活化した 10¾ ゥシ胎児血清、 2mM いグルタミン、 5 X10— ⁵M 2- メルカプトエタノール、 lOOU/ml ぺニシリン、 100 g/mlストレブトマイシン、 0.5 g/ml アンホテリシン B 、 10mM 3- (N-モルホリノ）プロパンスルホン酸、及び 70U/ml組み換えヒト Iい 2 (塩野義製薬（株）より入手）を添加した RPMI 1640 である。 TIL を等量の抗 CD-8 - 結合免疫吸着ビーズと 1 Xl0⁸/mlで混合し、 4 °Cで 2 時間インキュベートした。

TIL が付着したビーズはペレツトイ匕し、冷 CMで 3 回洗浄し、 CM中に 1 xl0⁷b eads/ml 懸濁し、 24ゥヱルの組織培養プレートに播き、 37°C、 5¾C0₂ 下でインキュベートした。培養 1 日後： TIL から分離したビーズをペレツトイヒし、除去した。分離した TIL にゥヱル当たり 2 X10⁵ 個の照射（10,000rad) 腫瘍細胞、ならびに 1 X10⁶ 個の照射（3， OOOrad)正常脾細胞を用いて刺激した。 in vitro刺激を 7 日から 14日毎に繰り返した。コンフルェントになったときに TIL を分取し、新たな CM中に 2 xi0⁵cell/ml再懸濁した。

(2) アデノウイルスによるマウス Iい 2遺伝子の TIL への導入

実施例 1 (2) と同様の方法により上記（1) で調製した TIL へ参考例 1で調製したマウス Iい 2cDNAを導入し、マウス IL- 2遺伝子導入 TIL 細胞（TIL/Iい 2)を得た。

(3) アデノウイルスによるマウス IFN-ァ遗伝子の TIL への導入

実施例 3 (2) と同様の方法により上記（1) で調製した T1L へ参考例 1で調製したマウス IFN- 7 CDNAを導入し、マウス IFN- 7遺伝子導入 TIL 細胞（TIL/1FN-ァ）を得た。

〔実施例 6] 腫瘍ワクチン（Colon26/IL-2ワクチン）の調製

(1)マウス IL- 2高タイター組み換えレトロウィルス産生クローンの調製

実施例 2 (1) と同様の方法により調製した。

(2) 腫瘍ワクチン（Colon26/IL-2ワクチン）の調製

(1) で選択した IL-2高タイター組み換えレトロウィルス産生クローンをマウス大腸癌 Colon26 に導入した。該遗伝子導入細胞は、 10¾ ゥシ胎児血清および 2mM グルタミンを添加した RPMI1640培地で維持し、 HITACHI MBR-1505R X-ray genera tor を用い、 10,000rad の X線を照射した。照射細胞は HBSSで 2 回洗浄し、 5 x 10⁶ cell/ml の濃度で HBSSに再懸濁し、腫瘍ワクチン（Colon26/IL-2ワクチン）を得た。

〔試験例 1〕肺転移系における効果試験（ 1 )

6〜10週令の雌性 C57BL/6 マウス（Charles River Japanより購入）に 4 X10⁵ 個のマウスメラノーマ B16F10細胞を尾静脈に接種し、肺転移を誘発させた。 2日後に TIL 単独、あるいは実施例 1にて調製した TIL/IL- 2を 4 xlO⁶ 個静脈より投与した [E/T ratio-10:E/T はェフユクタ一細胞（TIL/Iい 2)数/腫瘍細胞（B16F10) 数を表す] 。同時に実施例 2にて調製した B16F10/IL-2 +GM-CSFワクチンを 5 x 10⁵ 個皮下投与した。肺転移誘発より 1 6曰後に解剖して肺に生じた転移結節数を数えた。比較として TIL 単独、あるいは TIL/IL-2投与のみでワクチン投与を行わないものについても試験した。結果を第 2表ならびに第 3図に示す。

第 2表

TIL/IL- 2と B16F10/Iい 2 +GM-CSFヮクチンを併用して投与した群では特に顕著な転移結節数の減少が認められ、肺への癌転移抑制効果が最大となることが確認できた。

〔試験例 2〕肺転移系における効果試験（2)

6 〜10週令の雌性 C57BL/6 マウス（Charles River Japanより購入）に 3 xiO⁵ 個のマウスメラノーマ B16F10細胞を尾静脈に接種し、肺転移を誘発させた。 2日後に TIL 単独、あるいは実施例 3にて調製した TIL/IFN- 7を 4.5 X10⁶ 個静脈より投与した（E/T ratio=15)₀ 同時に実施例 4にて調製した B16F10/GM-CSF ヮクチンを 5 X10⁵ 個皮下投与した。肺転移誘発より 1 6日後に解剖して肺に生じた転移結節数を数えた。比較として TIL 単独、 TIL/IFN-ァ投与のみでワクチン投与を行わないもの、あるいは B16F10/GM-CSF ワクチン投与のみについても試験した。結果を第 3表ならびに第 4図に示す。

第 3表

T1L/IFN- rと B16F10/GM- CSF ヮクチンを併用して投与した群では特に顕著な転移結節数の減少が認められ、肺への癌転移抑制効果が最大となることが確認できた。

〔試験例 3〕肺転移系における効果試験（3)

6 〜10週令の雌性 BALB/Cマウス（Charles River Japanより購入）に 2 x 10⁴ 個のマウスメラノーマ大腸癌 Colon 26細胞を尾静脈に接種し、肺転移を誘発させた。 2曰後に TIL 単独、あるいは実施例 5にて調製した TIL/1L- 2または TML/IFN-ァを 1 X 10⁶ 個静脈より投与した（E/T ratio=50)。同時に実施例 6にて調製した Co lon26/IL-2ワクチンを 5 X10⁵ 個皮下投与した。肺転移誘発より 1 8日後に解剖して肺に生じた転移結節数を数えた。比較として T1L 単独、 TIL/IFN-ァ投与のみでワクチン投与を行わないもの、あるいは Colon26/Iい 2ワクチン投与のみについても試験した。結果を第 4表ならびに第 5図に示す。第 4表

TI L/IFN-ァと Col on26/IL- 2ワクチン、あるいは TlL/ -2と Col on26/IL-2 ワクチンを併用して投与した群では特に顕著な転移結節数の減少が認められ、肺への癌転移抑制効果が最大となることが確認できた。産業上の利用可能性

本発明によれば、ヒト、またはマウス、サル、ィヌ、ネコ、ゥマ、ブタ等の動物に高い抗腫瘍性を発揮し得、かつ癌転移抑制効果がある微小転移の癌治療に有用な癌の遺伝子治療剤および医薬組成物、ならびに治療方法が提供される。

Claims

請求の範囲

1 . サイトカイン遺伝子を導入したエフヱクタ一細胞とサイトカイン遗伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ヮクチンを含む癌の遺伝子治療剤。

2 . エフクタ一細胞が癌細胞の破壊に関与するリンパ球である請求の範囲第 1 項記載の遺伝子治療剤。

3 . リンパ球が腫瘍浸潤リンパ球（TI L) 、リンホカイン活性化キラ一細胞（LAK) 、または細胞障害性 T細胞（CTL)である、請求の範囲第 2項記載の遺伝子治療剤

4 . 腫瘍細胞がメラノーマ細胞、肾癌細胞、乳癌細胞、偏平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、肉腫、または神経膠腫（ダルコ一マ）である、請求の範囲第 1項に記載の遗伝子療剤。

5 . エフヱクタ一細胞に導入するサイトカイン遗伝子が、インターロイキン（1 L ) - 2遗伝子である請求の範囲第 1項に記載の遺伝子治療剤。

6 . 腫瘍細胞に導入するサイトカイン遗伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)遺伝子、インタ一ロイキン（1 L) 一 2遺伝子の少なくとも一つである請求の範囲第 1項に記載の遺伝子治療剤。

7 . サイトカイン遺伝子がアデノウイルスベクターによりエフェクター細胞に導入された請求の範囲第 1項記載の遺伝子治療剤。

8 . サイトカイン遗伝子がレトロウィルスベクターにより腫瘍細胞に導入された請求の範囲第 1項記載の遗伝子治療剤。

9 . サイトカイン遗伝子を導入したエフヱクタ一細胞を含有する製剤とサイトカィン遗伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ワクチンを含有する製剤を同時にまたは逐次的に癌患者に投与することを特徴とする癌の遺伝子治療方法。

10. ェフクタ一細胞が癌細胞の破壊に関与するリンパ球である請求の範囲第 9 項記載の遺伝子治療方法。

11. リンパ球が腫瘍浸潤リンパ球（TIし）、リンホカイン活性化キラー細胞（LAK) 、または細胞障害性 T細胞（CTいである、請求の範囲第 10項記載の遗伝子治療方法。

12. 腫瘍細胞がメラノ一マ細胞、肾癌細胞、乳癌細胞、偏平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、肉腫、または神経膠腫（ダルコ一マ）である、請求の範囲第 9項に記載の遺伝子治療方法。

13. エフヱクタ一細胞に導入するサイト力イン遺伝子が、インターロイキン（I L ) - 2遺伝子である請求の範囲第 9項に記載の遺伝子治療方法。

14. 腫瘍細胞に導入するサイト力イン遺伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)遺伝子、インタ一ロイキン（ ) — 2遗伝子の少なくとも一つである請求の範囲第 9項に記載の遺伝子治療方法。

15. サイトカイン遺伝子がアデノウイルスベクターによりエフェクター細胞に導入された請求の範囲第 9項記載の遺伝子治療方法。

16. サイトカイン遺伝子がレトロウィルスベクタ一により腫瘍細胞に導入された請求の範囲第 9項記載の遗伝子治療方法。

17. 癌の遺伝子治療のために使用する医薬組成物であって、該組成物がサイトカィン遺伝子を導入したエフェクタ一細胞とサイト力ィン遗伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ワクチンの組み合わせおよび薬学的に許容される担体からなる医薬組成物。

18. エフェクター細胞が癌細胞の破壊に関与するリンパ球である請求の範囲第 17 項記載の医薬組成物。

19. リンパ球が腫瘍浸潤リンパ球（TI L) 、リンホカイン活性化キラー細胞（LAK) 、または細胞障害性 T細胞（CTL)である、請求の範囲第 18項記載の医薬組成物。

20. 腫瘍細胞がメラノーマ細胞、腎癌細胞、乳癌細胞、偏平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、肉腫、または神経膠腫（ダルコ一マ）である、請求の範囲第 Π項に記載の医薬組成物。

21. エフヱクタ一細胞に導入するサイトカイン遗伝子が、インターロイキン（I L ) 一 2遺伝子である請求の範囲第 17項に記載の医薬組成物。

22. 腫瘍細胞に導入するサイトカイン遗伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)遺伝子、インターロイキン（）一 2遺伝子の少なくとも一つである請求の範囲第 Π項に記載の医薬組成物。

23. サイトカイン遗伝子がアデノウイルスベクターによりエフヱクタ一細胞に導入された請求の範囲第 17項記載の医薬組成物。

24. サイトカイン遺伝子がレトロウィルスベクターにより腫瘍細胞に導入された請求の範囲第 17項記載の医薬組成物。