WO1996006829A1

WO1996006829A1 - Derive de 1,4-dihydropyrydine

Info

Publication number: WO1996006829A1
Application number: PCT/JP1995/001606
Authority: WO
Inventors: Kunio Isshiki; Naoki Matsumoto; Takashi Nakashima; Kazuyuki Dobashi; Takurou Tsuruta; Takeo Yoshioka
Original assignee: Mercian Corporation
Priority date: 1994-08-29
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 1996-03-07
Also published as: JP3407888B2; ATE220395T1; CN1156450A; EP0779277A1; CN1089337C; EP0779277A4; DE69527359T2; EP0779277B1; DE69527359D1; US5760238A

Description

明細書

1 , 4 —ジヒドロピリジン誘導体技術分野

本発明は、虚血性心疾患や高血圧などの予防および治療薬として有用な光学活性 1， 4ージヒドロピリジン誘導体の製造中間体に関する。さらに詳しく言えば、微生物あるいは酵素を用いる生物化学反応により光学活性 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体を製造する際の有用な基質であり、またその基質の中間体である下記一般式（ I )

(式中の記号は後記と同じ意味を表わす。）

で示される新規な 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体およびその塩、および前記一般式（ I ) で示される基質から生物化学的反応によって得られる一般式（Π )

(式中の記号は後記と同じ意味を表わす。）

で示される新規な光学活性 1， 4ージヒドロピリジン誘導体およびその塩に関する。背景技術

1 , 4ージヒドロピリジン系化合物のジヒドロピリジン環の 3位と 5位に結合した 2つのカルボン酸エステルが互いに異なるものは、その 4位に不斉炭素を有しており、 2種の光学異性体が存在する。最近、これらの化合物の生物学的性質が検討された桔果、それぞれの光学活性体間に薬理活性、体内動態、安全性などに差があることが報告されてレる [K. Tamazawaer ai., J. Med. Chem., Vol. 29， 2504 (1986) ] 。このような不斉炭素を有する化合物を医薬品として使用する場合、生体に対して余計な負荷を与えないという意味から、医薬品として好ましい一方の異性体のみを与えるという考え方が一般的になりつつある。このような観点から光学活性 1 , 4 ージヒドロピリジン誘導体を製造するための方法が検討されている。

光学活性 1， 4ージヒドロピリジン誘導体を合成する一般的方法としては、（ 4 R ) — 1， 4 ージヒドロピリジンカルボン酸 · モノエステルを中間体とし、これに好ましいエステル残基を導入する方法が知られている [A. Ashimori et al., Chem. Pharm. Bull., Vol. 39, 108 (1991) ] 。

この光学活性中間体の（ 4 R) — 1， 4ージヒドロピリジン一 3 , 5 —ジカルボン酸 . モノエステルの製造方法としては、柴沼ら [Chem. Pharm. Bull., Vol. 28, 2809 (1980) ] の化学的方法、並びに阿知波ら [Te ahedron Letter, 32, 5805 ( 1991) ] およびシー (Charles J. Sih) ら [Tetrahedron Letter, ϋ， 3465 ( 1991) ] の酵素法が知られている。

これらの方法うち、酵素法はプロキラルな 1 , 4ージヒドロピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ジエステルを不斉加水分解するため、化学的方法のように必要としない一方の異性体を無駄にすることがなく製造方法として優れている。

しかし、酵素法では、その性格上、反応を水系媒体中で行なう必要があり、疎水性の高い 1， 4 ージヒドロピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 · ジエステルを基質とする従来の方法では助溶剤（アセトン、メ夕ノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等）を用いても基質濃度を高めることが出来ず反応効率が制限されていた。

そこで、より極性が高く、水に可溶性の基質を用いた効率の良い光学活性体、すなわち、（4 R ) — 1 , 4 ージヒドロピリジン一 3 , 5 ージカルボン酸 · モノエステルの製造法の開発が望まれている。発明の開示

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、微生物または酵素を用いて（ 4 R ) — 1 , 4ージヒドロピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ·モノエステル誘導体を製造する方法に適した水溶性の高い基質を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体を提供する。

1 ) 一般式（ I )

(式中、 Xおよび Yは各々独立して水素原子、ニトロ基、二トリル基またはハロゲン原子を表わし、

R ¹および R²は各々独立して水素原子、ホルミル基、フエニル基で置換されていてもよいアルキル部分の炭素原子数が 1〜 5のアルキル力ルポ二ル基、ハロゲン原子 1〜 3個で置換されたァセチル基、アルコキシ部分の炭素原子数が 1〜 4のアルコキシで置換されたァセチル基、炭素原子数が 1〜4のアルコキシを有するフヱニル基で置換されたァセチル基、クロトニル基、シンナモイル基、アルコキシ部分の炭素原子数が 1〜 6のアルコキシカルボニル基、ァリルォキシカルボニル基、ベンジルォキシカルボニル基、力ルボキシルベンゾィル基または R ¹ と R ²が一緒になってフタロイル基を表わし、 ηは 1〜3の整数を表わす。）

で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体またはその塩。

2) R ¹と R²が一緒になつてフタロイル基を表わす一般式（ l a)

(la)

(式中、 X、 Yおよび nは前記と同じ意味を表わす。）

で示される前記 1に記載の 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体。

3) R ¹が水素原子を表わし、 R ²が 2—カルボキシルベンゾィル基を表わす式 U b) (lb)

(式中、 X、 Yおよび nは前記と同じ意味を表わす。）

で示される前記 1に記載の 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体またはその塩。

4) R ¹および R²が同時に水素原子を表わす式（ I c)

(式中、 X、 Yおよび nは前記と同じ意味を表わす。）

5) R¹が水素原子を表わし、 R ²がアルコキシ部分の炭素原子数が 1〜 6のアルコキシカルボ二ル基を表わす前記 1に記載の 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体。

6) R²が t一ブトキシカルボ二ル基を表わす前記 5に記載の 1， 4 -ジヒドロピリジン誘導体。

7) 一般式（Π) R³R⁴N— (CH₂)_n— CT丫、0— H (Π)

H₃C,、、CH₃

(式中、 R³は水素原子を表わし、 R⁴は水素原子または 2—カルボキシルベンゾィル基を表わし、 X、 Yおよび nは前記と同じ意味を表わす。）

で示される光学活性 1， 4ージヒドロピリジン誘導体またはその塩。

8) 一般式（l b)

(式中、 X、 Yおよび nは前記と同じ意味を表わす。）で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体またはその塩、または一般式（I c)

(式中、 X、 Yおよび nは前記と同じ意味を表わす。）で示される 1, 4ージヒドロピリジン誘導体またはその塩を微生物または酵素を用いる不斉加水分解反応に付することを特徴とする一般式（Π)

(式中、 R³、 R⁴、 X、 Yおよび nは前記と同じ意味を表わす。）で示される光学活性 1， 4ージヒドロピリジン誘導体またはその塩の製造方法。

前記一般式（ I ) で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体の中で、

(i) R¹が水素原子を表わし、 R²が 2—カルボキシルベンゾィル基を表わす前記一般式（ I b ) で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体、および

(ii) R¹および R²が同時に水素原子を表わす前記一般式（I c) で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体、およびそれらの塩は水に対する溶解性が大きく微生物あるいは酵素を用いて生物化学反応により光学活性 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体を製造する際の有用な新規な基質である。

また、前記一般式（ I ) で示される 1， 4ージヒドロピリジン誘導体のうち、前記一般式（I b) および（ I c) 以外の化合物、特に、 R¹と R²が一緒になつてフタロイル基を表わす前記一般式（I a) で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体は、前記一般式（l b) および（ I c ) で示される化合物の原料として有用である。

前記一般式（Π) で示される光学活性 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体、およびその塩は、前記一般式（ I b ) および（ I c ) で示される化合物から生物化学反応により効率よく得られる新規な光学活性な 1， 4ージヒドロピリジン誘導体であり、虚血性心疾患や高血圧などの予防および治療薬として有用な化合物の製造中間体である。

前記一般式（ I ) において、 R ¹および R ²が表わすアルキル部分の炭素原子数が 1〜 5のアルキルカルボニル基の具体例としては、ァセチル、ブロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ノくレリル、イソノレリル基等が挙げられ、フエニル基で置換されたそのようなアルキル力ルボニル基の具体例としては、フエ二ルァセチル、フエ二ルブロピオニル基などが挙げられ、

1〜 3個のハロゲン原子で置換されたァセチル基の具体例としては、トリフロロァセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、ブロモアセチル、ジブ口モアセチル基などが挙げられ、アルコキシ部分の炭素原子数が 1〜 4のアルコキシ基で置換されたァセチル基の具体例としては、メトキシァセチル、エトキシァセチル、プロボキシァセチル基などが挙げられ、

炭素原子数が 1〜 4のアルコキシを有するフエニル基で置換されたァセチル基の具体例としては、メトキシフエニルァセチル基などが挙げられ、

アルコキシ部分の炭素原子数が 1一 6のアルコキシカルボニル基の具体例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、 t一ブトキシカルボニル基などが挙げられる。

一般式（ I ) あるいは一般式（Π ) の化合物において、ビリジン環

4位のフエニル基の置換基 Xおよび Y (すなわち、ニトロ基、二トリル基およびハロゲン原子）の位置は特に限定されず、 2位、 3位および 4位の何れでもよい。 Xおよび Yが表わすハロゲン原子としては、弗素、塩素、臭素およびヨウ素原子が挙げられ、塩素原子が好ましい。

一般式（I ) あるいは一般式（Π) の化合物において、 ηが表わす 1〜3の整数は、 2および 3が好ましく、特に 2が好ましい。

[塩]

一般式（I ) および一般式（Π) の化合物は常法により塩に誘導することができる。一般式（ I) の化合物のうち、一般式（l b) および（I c) で示される化合物は遊離体として、微生物または酵素を用いる生物化学反応の基質に用いられるが、それらの化合物のうち、 R ¹および R²の少なくとも一方が水素原子の化合物の場合にはその塩も基質として用いられる。

一般式（I ) および一般式（Π) で示される化合物の塩としては、酢酸、酒石酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルォロ醉酸等の有機酸塩、塩酸、硫酸などの無機酸塩、モルホリン、トリェチルァミン、トリエチレンジアミンなどの有機塩基塩、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアル力リ金属塩などが挙げられる。

[化合物（I) の製造方法]

一般式（I ) で示される化合物はそれ自体公知の方法を組合わせることにより製造することができる。

一般式（I) で示される化合物のうち R¹および R²が同時に水素原子を表わさない化合物は、例えば下記反応工程式 1に従って製造することができる。反応工程式 1

HO— (CH2)_n—NR 1"1_DR21 (ΠΙ)

)

O― (CHaJn— NR¹¹R²¹ (V)

反応工程式中、 R ^{1 1}および R ^{2 1}は前記 R ¹および R ²と同じ意味を表わすが、同時に水素原子を表わさず、その他の記号は前記と同じ意味を表わす。

反応工程式を簡単に説明する。

まず、アミノ基を保護したエタノールァミン誘導体（ΙΠ ) にジケテン（IV ) を反応させてァセト齚酸エステル誘導体（V) を得る（工程 a ) 。次にァセト酢酸エステル誘導体（V) とアンモニア（VI ) とを反応させて /?ーァミノクロトン酸エステル誘導体（ΥΠ ) とする（工程 b ) 。また、ァセト齚酸エステル誘導体（V) とべンズアルデヒド誘導体（VIII) とを縮合して α ンジリデン一 /? ーケトエステル体

( K ) を製造する（工程 c ) 。次いで、ーアミノクロトン酸エステル誘導体（\¾ ) と α —べンジリデン一/?ーケトエステル体誘導体（Κ ) とを加熱縮合すること（工程 d ) により目的化合物を製造することができる。

工程 aは、エタノールァミン誘導体（ΙΠ ) を不活性溶媒（テトラヒドロフラン（T H F ) など）に溶かした溶液中、塩基（トリエチルァミンなど）存在下、ジケテン（IV ) を滴下し、 0 1 0 0でで 1 2 4時間撹拌加熱することにより行なうことができる。

工程 bは、取り扱いの容易なアンモニゥム塩（炭酸アンモニゥム等）を使用し、ァセト醉酸エステル誘導体（V) の不活性溶媒（ェタノ一ルなど）溶液に、前記アンモニゥム塩を添加し、 1 5 6 0でで 1 2 4時間撹拌することにより行なうことができる。

工程 cは、ァセト齚酸エステル誘導体（V) を不活性溶媒（ジォキサンなど）に溶かした溶液に、ベンズアルデヒド誘導体（H) を添加し、 8 0 1 1 0でで 2 2 4時間撹拌加熱することにより行なうことができる。工程 dは、 /3—アミノクロトン酸エステル（W) と _α—ベンジリデンーーケトエステル体（Κ) とを不活性溶媒（ジォキサンなどの）の存在下あるいは不存在下、 5 0〜 9 0でで 2〜 2 4時間加熱撹拌することにより行なうことができる。

また、上記の工程 b、工程 cおよび工程 dを一度に行なうこともできる。すなわち、ァセト酢酸エステル誘導体（V) 2当量とアンモニァ（VI) とべンズアルデヒド誘導体（堋）とを加熱縮合させることにより 1段階で製造することができる（反応工程式 2) 。反応工程式 2 へ

(V)

ン

また、ァセト酢酸エステル誘導体（V) と ^ーァミノクロトン酸ェステル誘導体（W) とべンズアルデヒド誘導体（VI) とを加熱縮合させる方法（反応工程式 3) 、あるいはァセト齚酸エステル誘導体（V) と _fl—ベンジリデンーーケトエステル体誘導体（DO とアンモニア (VI) とを加熱縮合させる方法（反応工程式 4) によっても製造することができる。工程式 _ o o 、

^义^^义O— (CH2)_n NR ¹R²¹ (V)

(VII)

Y

(VIU)

ノ

CHO

反応工程式 4_

一般式（I ) で示される化合物のうち、 R¹および R²が同時に水素原子を表わす化合物は、前記の方法で製造した化合物を酸またはアル力リ加水分解反応に付すことにより得ることができる。 ²¹ (I)

[化合物（Π) の製造方法]

一般式（Π ) で示される光学活性 1， 4ージヒドロピリジン化合物は、前記一般式（ I ) で示される化合物のうち、一般式（ l b) または（ I c ) で示される化合物を微生物または酵素を用いる不斉加水分解反応により製造することができる。

反応に用いられる微生物としては、ストレブトミセス属、パェシ口ミセス属、ボトリオディオプ口ディア属、アルテナリア属またはヘルミントスポリゥム属に属する不斉加水分解能を有する微生物が利用できる。このような微生物としては、例えば FI— 4株、 FI— 741株、 FI 一 1007株および A-914株が挙げられる。これらの菌の形態的特徴を以下に示す。

FI— 4株

ポテトデキストロース寒天培地上で、薄灰白色の綿状の菌糸層を形成し、培養が進むと基部は黒灰色となる。分生糸は分生糸柄の頂端の小孔から生じるポロ型分生糸で、隔壁により分断されレンガを積んだ形状を示す。分生糸の底部はまるく、頂部はとがつており色は褐色であ o。

FI - 741株

ポテトデキストロ一ス寒天培地上で、良く発達した白色綿状の菌糸層を形成し、培養が進むと基部は褐色となる。分生子は、頂端が開口した分生子殻と呼ばれる球形の器官内に形成される。分生子は、やや長く、平滑で粘性を示さない。成熟すると褐色となり、細胞壁が厚くなる。

FI— 1007株

ポテトデキストロ一ス寒天培地上で、灰白色の菌糸層を形成し、培養が進むと基部はややピンクかかった褐色となる。分生子は、分生子柄上の最先端部の枝（フィアライド）から出現するフィァ口型である。分生子柄はほとんど分枝しないがフィアライドは、よく分枝し、細長い構造を取る。

以上の形態的特徴をもとに The General of Fungi Sporulating in Pure Culture (J. A. vonARX著（1970 ) ) で検索した結果、 FI— 4は、ァルテナリアエスピー（ A ierjiaria s/). ) 、 FI— 741は、ボトリオディォプロディアエスピー（ βοίΓ odiop7ocfia .）、 FI— 1007は、ノ、'ェシロミセスエスピー ( Paecilomyces sp. ) と同定された。

A— 9 14株

IS P - 2寒天培地上で淡褐色の堅固なコロニーを形成する。培養が進むとコロニーの表面はやや灰色を带びた緑色となる。メラニン色素やその他の拡散性の色素を作らない。基中菌糸は、分断されないで良く発達し、気菌糸が存在する。気菌糸上にらせん状に連鎖した分生子を多量に着生する。分生子の表面は、平滑である。細胞壁成分に L ージァミノピメリン酸が含まれる。 Lーヒドロキシブロリンを利用できない。 1 0 0； g /mlのォレアンドマイシンに感受性である。以上の特徴 ¾Γ ¾とに Bergev' s Mannual of Systematic Bactcology Volume 4 で検索した結果、 A— 914は、ストレブトミセスピリドスポルス { Streptomvces viridosporus) と同定 eれこ。

FI— 4株は 1993年 3月 18日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され受託番号として FERM P— 13535が付与された。その後、 1993 年 6月 14日にブダぺスト条約に基づく寄託に移管され受託番号として FERM BP— 4335が付されている。

また、 FI— 741株、 FI— 1007株および A— 914株は、それぞれ 1992年 7月 29日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号として FERM P— 13097， FERM P— 13096、および FERM P— 13098 が付与された。その後、 1993年 6月 14日にそれぞれブダペスト条約に基づく寄託に移管され、受託番号としてそれぞれ FERM BP— 4333 , FERM BP— 4332 , FERM BP— 4334が付与されている。

さらに本発明に利用できる微生物として、ストレブトミセスエスピー ATCC 1 1862およびヘルミントスポリゥムゾナタム IF06678か * 挙げられる。これらの微生物は、それぞれアメリカンタイプカルチャーコレクションおよび（財）発酵研究所に保存されており、容易に入手できる。

上記微生物を培養する培地は、特に限定されず、通常の微生物の培養に用い得るものであればよい。

例えば、炭素源としては、上記微生物が利用可能なものであればいずれでも使用できる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類；グリセロール、ソルビトールなどの糖アルコール；フマル酸、クェン酸などの有機酸を使用できる。これらの炭素源の培地への添加量は、通常 0 . 1 乃至 1 0重量 9 程度とすることが好ましい。

窒素源としては、例えば、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、燐酸アンモニゥムなどの無機酸アンモニゥム塩；フマル酸アンモニゥム、クェン酸アンモニゥムなどの有機酸アンモニゥム塩；肉エキス、酵母エキス、コーンスティ一プリカ一、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源などを使用することができる。これらのうち有機窒素源は、多くの場合、炭素源としても兼用できる。窒素源の添加量は、通常、 0 . 1乃至 1 0重量が適当である。

無機塩類としては、例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどのリン酸アルカリ金属塩；塩化力リウム、塩化ナトリゥムなどの塩化アル力リ金厲塩；硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄などの硫酸金属塩等を使用できる。その使用量は、 0 . 0 0 1乃至 1重量％の範囲が適当である。

微生物の培養は、上記の培地で 2 0乃至 4 0 TC、好ましくは 2 8乃至 3 7 、 p Hは 5乃至 9、好ましくは、 6乃至 8で好気的条件で実施すればよい。

微生物を用いる反応は、微生物またはその処理物と一般式（ l b ) または（ I c ) で示される化合物とを反応させることによって行なわれる。微生物との反応は通常微生物の培養物に含まれる酵素との反応である。

微生物の培養物としては、培養された該微生物菌体、培養ろ液および培養液が用いられる。

微生物の処理物とは、培養された該微生物菌体の処理物、培養ろ液および培養液などの処理物をいい、そのような微生物茵体の処理物としては、乾燥菌体、例えば、凍桔乾燥菌体、噴霧乾燥菌体、または有機溶媒、例えばアセトン、トルエン、メタノール、ブタノ一ル等で処理した菌体、菌体抽出物、固定化処理物を挙げることができる。また、培養ろ液および培養液の処理物としては、培養液の澳縮物、乾燥粉末、噴霧乾燥粉末が挙げられる。

更に、該培養菌体および培養ろ液から分離、精製した酵素を、前記原料化合物の処理物と反応させることもできる。

本発明を実施するには、培地に微生物を接種した後、例えば、 2 0 乃至 4 0でで、 1 2乃至 1 2 0時間培養することにより、微生物を 1 ml中に 106乃至 1010個を含む菌株培養液を得る。その培養液に原料化合物である一般式（ I ) の化合物を、通常、最終濃度が 0 . 5 mgZml 乃至 5 mgZmlになるよう水に溶解して加え、通常 2 8でで 1 8時間乃至 7 2時間反応させる。次いで p Hを 5 に調整後、クロ口ホルム、酢酸ェチル、齚酸ブチル、ブタノール等の有機溶媒等で抽出し、結晶化するかまたは転溶、沈緞化等の手段により目的の光学活性体である一股式（Π ) の化合物を得ることができる。

また、酵素反応に用いられる酵素としてはプロテア一ゼ、例えばブ口テア一ゼ P— 6 (天野製薬社製）などが挙げられる。酵素を用いて、本発明を実施するには、 p H 5〜 1 0に調整した緩衝液に原料化合物である一般式（ I ) の化合物を、通常、最終濃度 1〜 1 0 O mgZmlになるよう溶解し、これに酵素を溶解し、 2 5〜4 0でで時間反応させる。次いで微生物菌体を用いて反応させたときと同様に有機溶媒で抽出し、結晶化するか、転溶、沈澱化等の手段を用いて目的の光学活性体である一般式（Π ) の化合物を得ることができる。

[好ましい化合物]

—般式（ I ) で示される化合物のうち、生物化学反応の基質として —般式（Π) の光学活性 1， 4—ジヒドロピリジン誘導体へ導かれる、好ましい一般式（ I b) および（ I c ) で示される化合物としては、

( 1 ) 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチル一 4一（3—二トロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（2 -アミノエチル）エステル、

(2) 1 , 4—ジヒドロー 2， 6—ジメチルー 4一（3—クロ口フエニル）ピリジン一 3， 5 -ジカルボン酸 ' ビス（ 2—アミノエチル）エステル、

(3 ) 1 , 4—ジヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（2—クロ口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（2—アミノエチル）エステル、

( 4 ) 1 , 4—ジヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（ 2 , 3—ジクロロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 - ビス（ 2—ァミノェチル）エステル、

(5) 1 , 4—ジヒドロー 2, 6—ジメチルー 4一（3—フルォロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—アミノエチル）エステル、

(6) 1 , 4—ジヒドロー 2， 6—ジメチル一 4一（2—フルォロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—アミノエチル）エステル、

(7) 1， 4ージヒドロー 2, 6—ジメチルー 4一（3—シァノフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（2—アミノエチル）エステル、

( 8 ) 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4— (2—二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—アミノエチル）エステル、 ( 9 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（3—二トロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス [ 2— ( 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル、

( 1 0 ) 1 , 4ージヒドロー 2， 6—ジメチルー 4 — (2 —クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 . ビス [ 2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル〗エステル、

( 1 1 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（3 —クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [ 2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル、

( 1 2 ) 1 , 4—ジヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 2 , 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [ 2— （ 2 一カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル、

( 1 3 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 2 —フルォ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルアミノエチル）エステル、

( 1 4 ) 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 2 —フルォ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 . ビス [2— （ 2—力ルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル、

( 1 5 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 3 —フルォ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [2— （2—力ルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル、

( 1 6 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 3 —シァノフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 - ビス [ 2— （ 2—カルボキシルペンゾィル）アミノエチル] エステル、

( 1 7 ) 1 , 4ージヒドロー 2， 6—ジメチルー 4 一（ 2 —二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [ 2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル、

( 1 8 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（3 —ニトロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [ 3— （2—カルボキシルベンゾィル）ァミノプロピルエステル、

( 1 9 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（3 —二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—カルボキシルベンゾィルアミノメチル）エステルおよびそれらの塩類が挙げられ一般式（ I ) で示される化合物のうち、前記一般式（ l b) および ( I c ) で示される化合物の製造中間体として有用な一般式（ I a ) で示される好ましい化合物としては、

(2 0 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（3—二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルァミノェチル）エステル、

(2 1 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（2—クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 - ビス（ 2—フタロイルァミノエチル）エステル、

(2 2 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（3—クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルァミノェチル）エステル、

(2 3 ) 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4— ( 2 , 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一3 , 5—ジカルボン酸 . ビス（2—フタロイルアミノエチル）エステル、

(2 4 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（3 —フルォ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（2—フタロイルァミノエチル）エステル、 (2 5 ) 1 , 4ージヒドロー 2， 6—ジメチルー 4 一（ 3 —シァノフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルァミノェチル）エステル、

(2 6 ) 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 2 —二トロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルァミノエチル）エステル、

(2 7 ) 1， 4—ジヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（3 —二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 3—フタロイルアミノブ口ピル）エステルなどが挙げられる。

また、一般式（Π) で示される好ましい光学活性 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体としては、

( 2 8 ) ( 4 R) — 1 , 4 ージヒドロー 2， 6 —ジメチルー 3 — (2—アミノエチル）ォキシカルボ二ルー 4一（3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸、

( 2 9 ) ( 4 R) 一 1， 4 ージヒドロー 2， 6—ジメチルー 3 —

[2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボ二ルー 4一（ 3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸、

( 3 0 ) ( 4 R) 一 1 , 4 ージヒドロー 2， 6 —ジメチル一 3 —

[2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル〗ォキシカルボ二ルー 4一（2， 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一 5—カルボン酸、

( 3 1 ) ( 4 R) - 1 , 4 ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 3 —

[2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボ二ルー 4一（ 3—クロ口フエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸、

( 3 2 ) ( 4 R) ー 1， 4 —ジヒドロー 2， 6 —ジメチル一 3 —

[2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボ二ルー 4一（ 3—シァノフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸、 (3 3 ) ( 4 R) — 1 , 4ージヒドロー 2， 6—ジメチルー 3—

[ 3— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノブ口ピル] ォキシカルボニルー 4一（ 3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸、

(3 4 ) ( 4 R) - 1 , 4ージヒドロ一 2 , 6—ジメチルー 3— [ ( 2—カルボキシルベンゾィル）アミノメチル] ォキシカルボニル一 4— ( 3—二トロフエニル）ピリジン一 5—カルボン酸などが挙げられる。

産業上の利用の可能性

一般式（ I ) で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体のうち、 (i) R ¹が水素原子を表わし、 R²が 2—カルボキシルペンゾィル基を表わす前記一般式（l b) で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体、および（ii) R¹および R²が同時に水素原子を表わす前記一般式（ I c ) で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体、およびそれらの塩は、後述の試験例に示されるように、従来不斉加水分解の基質として用いられているブロキラルな 1， 4ージヒドロピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 · ジエステルに比べて水に対する溶解性が数百倍から数万倍も高く、微生物あるいは酵素を用いる生物化学反応により光学活性 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体を製造する際の基質として極めて有用である。

また、一般式（I) で示される 1, 4ージヒドロピリジン誘導体のうち、前記一般式（l b) および（ I c ) 以外の化合物は、前記一般式（ I b) および（ I c ) の原料として有用である。

さらに、一般式（I b) および（I c ) の化合物を基質とする生物化学的反応によって効率よく得られる一般式（Π) で示される新規な光学活性 1, 4ージヒドロピリジン誘導体は虚血性疾患や高血圧などの予防および治療薬として有用な光学活性 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体の製造中間体として有用である。

すなわち、前記一般式（ I ) および一般式（Π) で示される新規な化合物は、例えば（4 R) — （2—ニコチノィルァミノ）ェチル（ 3 一二トロォキシ）ブロピル一 1 , 4ージヒドロー 2， 6 —ジメチル一 4一（ 3—二トロフエニル）ビリジン一 3 , 5—ジカルボキシレ一ト（日本薬学会第 112回年会，医薬品部会 30ZF 11— 2、講演要旨集 245頁、特開平 2-223580号公報）、（4 S ) — 2， 6 —ジメチル— ( 3—ニトロフエニル）一 1 , 4ージヒドロピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' （ 3 S ) — 3— （ 1一べンジルー 3—ピロリジル）エステル - メチルエステル [ J. Med. Chem.，， 2504 (1988) ] 、および (4 S) 一 2 , 6—ジメチルー（3—二トロフエニル）一 1 , 4ージヒドロビリジン一 3， 5—ジカルボン酸 · 3— I 2 - [ 4— ( 4一べンズヒドリル一 3—ピペラジニル）フエニル] ェチル t エステル · メチルエステル [Chem. Pharm. Bull., 39, 108，（1991) ] などの製造中間体として好ましく用いることができ、その利用価値は大きい。発明を実施するための最良の形態以下、本発明を参考例、実施例および試験例によって説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、特に記載のない限り下記の例中、％は重量％を表わす。また、 T L Cの吸着剤としてはシリカゲル（メルク社製 Art5715) を使用している。参考例 1 ： 1， 4ージヒドロー 2 , 6 -ジメチルー 4 — (3—ニトロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—ァセ夕ミドェチル) エステルの製造

N—ァセチルエタノールァミン 2 5 gのジォキサン 1 0 Oml溶液にトリエチルアミン 0.34 mlを加え、ジケテン 1 8.7 mlをゆつくり滴下した。発熱反応が終わった後、濃アンモニア水 8. 1 mlおよび m—二トロべンズアルデヒド 1 8.3gをカ卩ぇ 8 0 の油浴中で 1 7時間、加熱撹拌した。減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣を 7 00gのシリ力ゲルを充填したカラムに展開系としてトルエン一ァセトン混合溶媒 (混合比、 2 : 1 ) を用い精製し、目的化合物 2 4gを得た。

1 H-NMR (CDC13 ) ： S 8.23(lH,t, J=2Hz), 8.00(lH，td, J=lHz,2Hz, 8Hz)， 7.70(lH,td,J=lHz,2Hz,8Hz), 7.40(lH,t, J=8Hz), 6.85(2H,t, J=6Hz), 6.67(lH，s)， 5.11(lH，s)， 4.20(2H，m)， 3.95(2H,m), 3.60 (2H,m), 3.48(2H,m), 2.36(6H,s), 1.98(6H,s)

FAB-MS(m/z)： 489 (M+H) ⁺ 実施例 1 ： 1 , 4ージヒドロー 2, 6—ジメチルー 4一（3—二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 . ビス（ 2—アミノエチル）エステルの製造

参考例 1 で製造した 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一 ( 3 -ニトロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2 ーァセタミドエチル）エステル 1 0 0 mgをテトラヒドロフラン 1 mlおよび 1規定塩酸水 1 ml混合溶媒に懸濁させ 6 0での油浴中、 4時間、加熱撹拌した。反応混合物に水 2 Omlを加え減圧下でテトラヒドロフランを留去した後、齚酸ェチル 2 Omlを加え分液した。この水相に 1規定水酸化ナトリゥム水を加え、 p H 1 0とした後、酢酸ェチル 1 0 Omlで分液、抽出した。この有機相を水洗後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し減圧下で溶媒を留去して、標題の化合物 3 2mgを得た。 T L C ： R f 0.1 8 (ブタノール：酢酸：水 = 4 ： 1 ： 2 )

1H-NMR(D₂0-DC1 )： S 8.17(lH,s), 8.10(lH,d, J=8Hz), 7.80(lH，d， J=8Hz), 7.56(lH，t,J-8Hz)， 5.07(lH,s), 4.5-4.2(4H,m), 3.36(4H,br), 2.36(6H,s)

FAB-MS(m/z)： 405(M+H)⁺ グリセリンマトリックス実施例 2 : 1 , 4—ジヒドロ一 2, 6—ジメチルー 4 一（3—二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 . ビス（ 2— t一ブトキシカルボニルアミノエチル）エステルの製造

BuOCONH— (CH₂)₂ NHCOOBu¹

2— t一ブトキシカルボニルアミノエ夕ノール 1.8 7 5gのテトラヒドロフラン 8 ml溶液にトリェチルァミン 0.1 6 mlを加え、さらにジケテン 0.9 9 mlを滴下し室温で 3時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して得た粗ァセト酢酸 2— t一ブトキシカルボニルアミノェチルをエタノール 1 0 mlに溶解し、炭酸アンモニゥム 2 8 Omgを添加し 4 5 で 2時間撹拌した。反応混合物を再度、減圧下で濃縮して得たァセト醉酸エステル体と /?一アミノクロトン酸エステル体の混合物をジォキサン 1 0 mlに溶解し、 m—二トロべンズアルデヒド 8 7 9 mgを加え 80でで 1 8時間、加熱撹拌した。反応混合物を濃縮して得た残渣をシリカゲル 5 0 Omlを充填したカラムに展開溶媒としてトルェンーァセトン混合溶液（混合比、 2 0 : 1 ) を用い精製し、標題の化合物 2· 2 3g (収率 63 %) を得た。

T L C ： R f 0.2 1 ( トルエン：アセトン = 5 : 1 )

^-N R (CDC1₃)： δ 8.11(lH,s), 8.02(lH,d,J=8Hz), 7.67(lH,d, J=8Hz), 7.42(lH,t,J=8Hz), 5.96(lH，br)， 5.08(lH,s), 4.65(2H,br), 4.10(4H,m), 3.5-3.2(4H,m), 2.37(6H,s), 1.42(18H,s) 実施例 3 : 1 , 4—ジヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（3—ニトロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 - ビス（ 2—アミノエチル）エステル · 二塩酸塩の製造

実施例 2で製造した 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一 ( 3—ニトロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2 一 tーブトキシカルボ二ルアミノエチル）エステル 1.9 9 6 gをクロ口ホルム 1 0 mlに溶解し、塩酸一ジォキサン溶液（2規定） 1 3 mlを加え、 4 0でで 4時間、加熱撹拌した。生成した不溶物をろ取しへキサン 2 Omlで洗浄後、乾燥し標題の化合物の黄色粉末 1.4 9gを得た。

T L C ： R f 0.1 8 (ブタノール：醉酸：水 = 4 : 1 : 2)

¹ H-NMR(D₂0) ： δ 8.17(lH，s), 8.10(lH,d, J=8Hz), 7.80(lH,d,J=

8Hz), 7.56(lH，t,J=8Hz)， 5.07(lH,s), 4.5-4.2(4H,m), 3.36(4H,br),

2.36(6H,s)

FAB-MS(m/z)： 405(M+H)⁺ グリセリンマトリックス実施例 4 : 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（ 3—クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2— tーブトキシカルボニルアミノエチル）エステルの製造

実施例 2と同様にして得た、粗ァセト眸酸 2— t ^ブトキシカルボニルアミノエチル l . O Ogをエタノール 5 mlに溶解し、炭酸ァンモニゥム 1 3 7mgを加え 5 0"Cで 2.5時間撹拌した後、 3—クロ口ベンズアルデヒド 0.2 5 4 mlを加え 3時間加熱還流した。減圧下に溶媒を留去して得られた残渣を 1 0 Ogのシリカゲルを充填したカラムにチャージし、トルエン一アセトン混合溶媒（混合比、 6 : 1 ) で展開することにより精製し、標題の化合物 1.0 Og (収率 83 %) を得た。 T L C ： R f 0.3 5 (トルエン：アセトン = 4 : 1 )

1 H-NMR (CDC13 ) ： δ 7.3-7. l(4H,m), 5.79(lH,s), 4.93(lH，bs), 4.58(2H,bs), 4.2-4.0(4H，m)， 3.5-3.3(4H,m)， 2.35(6H，s)， 1.43(18H， s)

FAB-MS (m/z)： 594( +H)⁺ m—二ト口べンジルアルコールマトリックス

IR(KBr)： 3339, 2978, 1692， 1493， 1273, 1213, 1171, 1117cm¹ 実施例 5 : 1 , 4—ジヒドロー 2， 6—ジメチルー 4 一（3—クロ口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—アミノエチル）エステル · 二塩酸塩の製造

実施例 4で製造した 1 , 4 ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一 ( 3—クロ口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2 一 t一ブトキシカルボニルアミノエチル）エステル 4 9

を丁11 F 4 mlに溶解し、濃塩酸 l mlを加え、 5 0でで 2. 5時間撹拌した。減圧下に溶媒を留去して得られた残渣にエタノール 2 mlを加え、 0でで 1 0分間撹拌し、ろ過、冷エタノールで洗浄した後、乾燥し、標題の化合物 1 3 9mg (収率 3 6 %) を得た。

T L C ： R f 0.4 7 (ブタノ一ル：酢酸：水 = 4 ： 1 ： 1 )

： 3 7.39(lH,s), 7.35-7.25(3H,m), 4.92(lH,s), 4.42- 4.27(4H,m), 3.35-3.25(4H,m), 2.33(6H,s)

FAB -MS (m/z)： 394(M+H)⁺ グリセリンマトリックス IR( Br)： 3246, 2975, 1688, 1483， 1273, 1213, 1115, 1100cm"¹ 実施例 6 : 1， 4ージヒドロー 2， 6—ジメチル一 4一（2—クロ口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2— tーブトキシカルボニルアミノエチル）エステルの製造

Bu'OCONH— NHCOOBu¹

2—クロ口べンズアルデヒド 0. 2 5 3 mlを用い実施例 4 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 965mg (収率 80%) を得た。 T L C ： R f 0.3 7 (トルエン：アセトン = 4 : 1 )

^-NMR (CDC1₃) ： S 7.43-7.39(lH,m), 7.31-7.23(lH，m)， 7.21- 7.16(lH,m), 7.11-7.06(lH,m), 5.81(lH，bs)， 5.34(lH，s)， 4.64(2H， bs), 4.15-4.03(4H,m), 3.4-3.2(4H,m), 2.32(6H,s), 1.44(18H,s) FAB-MS(m/z)： 594(M+H)+ m—二トロべンジルアルコールマトリックス

IR(KBr)： 3347, 2978, 1696, 1497, 1273, 1209， 1171, 1115cm"¹ 実施例 7 : 1 , 4—ジヒドロー 2, 6—ジメチルー 4一（2—クロ口フエニル）ピリジン一 3, 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—アミノエチル）エステル . 二塩酸塩の製造

実施例 6で製造した 1， 4ージヒドロー 2， 6—ジメチルー 4— (2—クロ口フエニル）ピリジン一 3， 5 -ジカルボン酸 ' ビス（ 2 — t一ブトキシカルボニルァミノェチル）エステル 6 73 mgを用い、実施例 5と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 4 2 6 mg (収率 8 1 %) を得た。

T L C： R f 0.4 5 (ブタノ一ル：酢酸：水 = 4 ： 1 ： 1 )

1 H-NMR(D₂0)： δ 7.59-7.56(lH,m), 7.43-7.39(lH,m), 7.35-7.30 (lH，m)， 7.26-7.20(lH,m)， 5.34(lH,s), 4.4-4.2(4H,m), 3.40-3.25 (4H，m)， 2.32(6H,s)

FAB-MS (m/z)： 394( +H)⁺ グリセリンマトリックス

IR(KBr)： 3434, 2978, 1698, 1493, 1273, 1209, 1113cm"' 実施例 8 : 1 , 4—ジヒドロー 2， 6—ジメチルー 4 - ( 2， 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2 — t 一ブトキシカルボニルアミノエチル）エステルの製造

Bu'OCON Η— (CH₂)₂ NHCOOBu'

2， 3—ジクロ口べンズアルデヒド 3 92 mgを用い実施例 4と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 9 64 mg (収率 7596) を得た。 T L C ： R f 0.43 (トルエン：アセトン = 3 : 1 )

1 H-NMR (CDC1₃ )： δ 7.35-7.25(2H,m), 7.15-7.09(lH,m), 5.83 (lH,bs), 5.42(lH,s), 4.66(2H,bs), 4.15-4.05(4H,m), 3.45-3.25 (4H,m), 2.32(6H,s), 1.43(18H,s)

FAB-MS(m/z)： 628(M+H)⁺ m—ニトロべンジルアルコールマトリツクス

IR(KBr)： 3349, 2978， 1696， 1497， 1275, 1211， 1171， 1115cm'¹ 実施例 9 : 1， 4ージヒドロ一 2， 6—ジメチル一 4一（ 2 , 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—アミノエチル）エステル . 二塩酸塩の製造

実施例 8で製造した 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一 ( 2， 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2— t—ブトキシカルボニルアミノエチル）エステル 4 5 5mgを用い、実施例 5 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 2 2 3 mg (収率 6 1 %) を得た。

T L C ： R f 0.4 5 (ブタノ一ル：酢酸：水 = 4 : 1 : 1 )

1 H-NMR(D 20) ： δ 7.54-7.48(lH,m), 7.46-7.41(lH,m), 7.29- 7.24(lH,m), 5.42(lH,s), 4.41-4.22(4H,m), 3.38-3.24(4H,m), 2.31(6H,s)

FAB-MS (m/z)： 428(M+H)⁺ グリセリンマトリックス

IR(KBr)： 3432, 2975, 1690， 1489， 1277, 1211, 1113cm'¹ 実施例 1 0 : 1 , 4—ジヒドロー 2 , 6 —ジメチル一 4一（ 3 -シァノフエ二ル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2— t一ブトキシカルボニルアミノエチル）エステルの製 ¾

Bu'OCONH—

3一シァノベンズアルデヒド 3 0 Omgを用い実施例 4 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 9 0 Omg (収率 7 6 %) を得た。

T L C ： R f 0.3 6 ( トルエン：アセトン = 4 : 1 )

^-NMR (CDC1₃)： 8 7.60-7.55(2H,m), 7.45(lH,d, J=7.7Hz), 7.35 (lH,t,J=7.7Hz), 5.91(lH，bs)， 5.00(lH，s)， 4.62(2H,bs), 4.15-4.05 (4H，m), 3.43-3.25(4H,m), 2.36(6H,s), 1.44(18H,s)

FAB -MS (m/z)： 585(M+H)⁺ m—二トロべンジルアルコールマトリツクス

IR( Br)： 3368, 2978， 2230, 1692, 1491, 1213, 1171, 1119cm"¹ 実施例 1 1 : 1， 4—ジヒドロ一 2 , 6—ジメチルー 4一（ 3—シァノフエ二ル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 - ビス（2—アミノエチル）エステル · 二塩酸塩の製造

実施例 1 0で製造した 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 3—シァノフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス (2— t—ブトキシカルボニルアミノエチル）エステル 4 2 2 mgを用い、実施例 5と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 2 0 1 mg (収率 6 1 ·%) を得た。

T L C ： R f 0.43 (ブタノール：酢酸：水 = 4 ： 1 ： 1 )

1H-NMR(D₂0)： δ 7.74-7.68(2H,m), 7.61(lH,d, J=7.7Hz), 7.49(1H, t,J=7.7Hz), 4.99(lH，s), 4.44-4.28(4H,m), 3.36-3.30(4H,m), 2.35 (6H,s)

FAB-MS (m/z)： 385(M+H)⁺ グリセリンマトリックス

IR(KBr) ： 3434, 3013, 2228, 1711, 1495, 1273, 1209, 1113，

1092cm"¹ 実施例 1 2 : 1 , 4—ジヒドロー 2， 6—ジメチルー 4一（2—二ト口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 - ビス（2— t—ブトキシカルボニルアミノエチル）エステルの製造

NHCOOBu¹

2—二ト口べンズアルデヒド 339 mgを用い実施例 4と同様に反応, 処理、精製し標題の化合物 779mg (収率 63 %) を得た。 T L C ： R f 0.2 6 (トルエン：アセトン = 4 ： 1 )

1 H-NMR (CDC1₃) ： δ 7.71(lH,d,J=7.7Hz), 7,53-7.46(2H,m), 7.31- 7.26(lH,m), 5.94(lH，bs)， 5.81(lH，s)， 4.83(2H,bs), 4.23-3.96 (4H，m)， 3.35-3.25(4H,m), 2.34(6H,s), 1.43(18H,s)

FAB-MS (m/z)： 605(M+H)⁺ m—二トロべンジルアルコールマトリックス

IR(KBr)： 3391, 2978, 1698, 1532, 1497, 1213, 1171, 1115cm-' 実施例 1 3 : 1 , 4—ジヒドロ一 2， 6—ジメチルー 4一（2—二ト口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（2—アミノエチル）エステル · 二塩酸塩の製造

実施例 1 2で製造した 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 - ( 2—ニトロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス (2— t一ブトキシカルボニルアミノエチル）エステル 4 1 8mgを用い、実施例 5と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 2 7 l mg (収率 8 2%) を得た。

シリカゲル TL C : R f 0.4 0 (ブタノ一ル：醉酸：水 = 4 : 1 ： 1 )

¹ H-NMR(D₂0)： δ 7.83-7, 80(lH，m)， 7.70-7.62(2H,m), 7.46-7.40 (lH,m)， 5.65(lH，s)， 4.43-4.16(4H,m), 3.32-3.27(4H,m), 2.32 (6H,s)

FAB-MS (m/z)： 405(M+H)⁺ グリセリンマトリックス

IR(KBr)： 3432, 1696, 1524, 1489， 1209, 1111cm"¹ 実施例 1 4 : 1 , 4ージヒドロー 2, 6—ジメチルー 4 - (3—二ト口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 - ビス（2—フタロイルアミノエチル）エステルの製造

2—フタロイルァミノエタノール l. Ogのテトラヒドロフラン 2 ml 溶液にトリェチルアミン 0.03 6 mlを加え、さらにジケテン 0.4 5 mlのテトラヒドロフラン 0.5 ml溶液を滴下し 5 5 で 1時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して得た粗ァセト酢酸エステル体を 9 5 %エタノール水 2 mlに溶解し、炭酸アンモニゥム 2 0 Omgを添力 H し 4 0でで 2時間撹拌した。この反応混合物にさらに m—二トロベンズアルデヒド 4 80mg、クェン酸 8 Omgおよび水 1 mlを加え 9 0での油浴中で 4時間、加熱還流した。反応混合物を濃縮して得た残渣を酢酸ェチル 5 0 mlに溶解し水洗後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。この有機相を減圧下で濃縮して得た残渣をシリカゲル 5 0 ml を充填したカラムに展開溶媒としてトルェン一酢酸ェチル混合溶液

(混合比、 5 : 1 ) を用い精製し、標題の化合物 1.02gを得た。

T L C ： R f 0.2 5 (トルエン：酢酸ェチル = 2 : 1 ) ¹ H-NMR (CDC1 a ) ： δ 8.04(lH，s)， 7.80(4H,m), 7.8-7.7(5H,m), 7.55(lH，d，J=7.7Hz)， 7.08(lH,t,J=7.7Hz), 5.89(lH，br)， 4.96(lH,s)， 4.33-4.22(4H,m), 4.06-3.99(2H,m), 3. 0-3.84(2H,m), 2.31(6H,s) FAB-MS(m/z)： 665(M+H)⁺ m—二トロべンジルアルコールマトリツクス、

融点： 233〜236で実施例 1 5 : 1， 4ージヒドロ一 2, 6—ジメチルー 4一（3—二ト口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [2— （ 2—力ルボキシルベンゾィル）アミノエチル 1 エステルの製造

1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（3—二トロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルアミノエチル）エステル 1.0 gをアセトン 2 0 mlに溶解し 2 0 %炭酸ナトリウム水溶液 2 0 mlを加え、 5 0〜6 0でで 3時間、加熱撹拌した。反応混合物に水 2 0 mlを加え減圧下でァセトンを留去した後、酢酸ェチル 2 0mlを加え分液した。水相に 1規定塩酸水 5 0mlを加え、 p H 2 とした後、酢酸ェチル 1 0 0mlで分液、抽出した。有機相を水洗後、無水硫酸ナトリゥムで乾燥し減圧下で溶媒を留去して、標題の化合物 9 8 Omgを得た。

¹ H-NMR (CD₃OD) ： δ 8.13(lH,t,J=2.2Hz), 7.92(2H,d, J=7.7Hz), 7.87(lH，d,J-7.7Hz), 7.71(lH,d， J=7.7Hz)， 7.57-7.48(4H,m), 7.33 (2H，d，J=7.7Hz)， 7.28(lH,t,J=8.1Hz), 5.15(lH,s), 4.25-4.19(2H,m), 4.16-4.1 l(2H,m), 3.64-3.57(2H，m)， 3.50-3.43(2H,m), 2.34(6H,s) FAB-MS (m/z)： 699(M-H) " m—二トロべンジルアルコールマトリックス

融点： 136〜139で実施例 1 6 : 1， 4ージヒドロ一 2， 6—ジメチルー 4一（ 2—クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルアミノエチル）エステルの製造

2—クロ口べンズアルデヒド 6 0 8 mgを用い実施例 1 4と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 1.6 2gを得た。

T L C ： R f 0.2 1 (トルエン：酢酸ェチル = 2 ： 1 )

1 H-NMR (CDC13 ) ： $ 7.81(4H，dd,J=5.5Hz，3.3Hz), 7.71(4H,dd, J=5.5Hz,3.3Hz), 7.30(lH,d,J=7.7Hz), 6.99-6.95(lH，m)， 6.72-6.69 (2H,m), 5.61(lH，s)， 5.11(lH，s)， 4.27-4.21 (2H,m), 4.18-4.12 (2H,m), 3.96-3.86(2H,m), 3.84-3.77(2H,m), 2.28(6H,s)

FAB-MS (m/z) ： 654(M+H)⁺ m—二トロべンジルアルコールマトリツクス実施例 1 7 : 1， 4ージヒドロー 2 , 6 —ジメチルー 4— (2—クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [2— （ 2—力ルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステルの製造

実施例 1 6で製造した 1， 4ージヒドロー 2 , 6 —ジメチルー 4 一（ 2—クロ口フエニル）ピリジン一 3， 5 —ジカルボン酸 ' ビス ( 2—フタロイルアミノエチル）エステル 5 0 Omgを用いて実施例 1 5 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 3 3 8mgを得た。

'H-NMR (CD₃OD) ： 8 7.93(2H，d，J=7.7Hz)， 7.60-7,50(4H，m)， 7.40 (lH，d,J=8.1Hz)， 7.36(2H,d,J=7.7Hz), 7.06(2H,t, J=8.1Hz), 6.92 (lH,t，J=8.1Hz)， 5.41(lH，s)， 4.23-4.18(2H,m), 4.15-4.10(2H，m)， 3.62-3.56(2H,m), 3.53-3.47(2H,m), 2.28(6H,s)

FAB-MS (m/z)： 688(M-H)^_ m-二トロべンジルアルコールマトリツクス実施例 1 8 : 1 , 4—ジヒドロー 2 , 6 —ジメチルー 4— (3—クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルアミノエチル）エステルの製造

3一クロ口べンズアルデヒド 6 08mgを用い実施例 1 4と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 1.8 5gを得た。

T L C ： R f 0.2 1 (トルエン：酢酸ェチル = 2 : 1 )

1 H-NMR (CDC13 ) ： δ 7.83(4H,dd,J=5.5Hz,3.3Hz), 7.71(4H,dd, J=5.5Hz,3.3Hz), 7.12(lH,s), 7.06-7.03(lH,m), 6.82-6.81(2H,m), 5.63(lH,s), 4.84(lH，s)， 4.35-4.30(2H,m), 4.26-4.20(2H,m), 4.05- 3.98(2H,m), 3.92-3.86(2H,m), 2.29(6H,s)

FAB-MS(m/z)： 654(M+H)⁺ m—二トロべンジルアルコールマトリツクス実施例 1 9 : 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（ 3—クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 - ビス [ 2— （ 2—力ルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステルの製造

実施例 1 8で製造した 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチル一 4 一（ 3—クロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス (2—フタロイルアミノエチル）エステル 5 0 Omgを用いて実施例 1 5と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 3 9 9mgを得た。

1 H-NMR (CD₃OD) ： δ 7.94-7.91(2H,m), 7.58-7.49(4H,m), 7.35- 7.33(2H,m), 7.23-7.19(2H,m), 7.03-6.95(2H,m), 5.02(lH,s), 4.25- 4.14(4H，m)， 3.63-3.58(2H,m)， 3.52-3.47(2H,m), 2.29(6H,s)

FAB-MS (m/z)： 688(M-H)" m—二トロべンジルアルコールマトリックス実施例 2 0 : 1 , 4 —ジヒドロー 2, 6—ジメチルー 4一（2 , 3 ージクロ口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 - ビス（ 2 一フタロイルアミノエチル）エステルの製造

2 , 3ージクロロべンズアルデヒド 763 mgを用い実施例 1 4と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 1.04gを得た。

T L C ： R f 0.2 1 (トルエン：醉酸ェチル = 2 : 1 )

1 H-NMR (CDC13 ) ： δ 7.80(4H,dd,J=5.5Hz,3.3Hz), 7.71(4H,dd, J=5.5Hz,3.3Hz), 7.26-7.25(lH,m), 7.23(lH,d, J=2.2Hz), 6.89(lH，t， J=7.7Hz), 6.83(lH,d,J=7.7Hz), 5.61(lH，s)， 5.17(lH,s), 4.11-4.26 (4H，m)， 3.98-3.91(2H,m), 3.83-3.77(2H,m), 2.28(6H，s)

FAB-MS(m/z)： 688(M+H)⁺ m—二トロべンジルアルコールマトリックス実施例 2 1 : 1， 4 ージヒドロー 2 , 6 —ジメチル一 4 一（ 2 , 3 —ジクロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5 —ジカルボン酸 ' ビス [ 2 一（ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステルの製造

C 0 Ν Η— (CH2)₂ ~ ^{N H C} COOH

COO、H

実施例 2 0で製造した 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 2， 3—クロ口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2—フタロイルアミノエチル）エステル 5 0 Omgを用いて実施例 1 5 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 3 0 2mgを得た。

1 H-NMR (CD₃OD) ： 8 7.93(2H，dd， J=7.7Hz， 1.5Hz)， 7.57(2H,td, J=7.7Hz,1.5Hz), 7.51(2H,td,J=7.7Hz,1.5Hz), 7.38(3H,m), 7.18(1H, dd,J=8.1Hz,1.8Hz), 7.06(lH,t, J=8.1Hz), 5.49(lH,s), 4.26-4.20 (2H,m), 4.13-4.08(2H,m), 3.64-3.57(2H,m), 3.52-3.46(2H,m), 2.28 (6H，s)

FAB-MS (m/z)： 722(M-H)⁺ m—二トロペンジルアルコールマトリックス

実施例 2 2 : 1， 4 -ジヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（ 3—シァノフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（2—フタロイルアミノエチル）エステルの製造

3—シァノフエ二ルペンズアルデヒド 5 7 2 mgを用い実施例 1 4 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 2.0 Ogを得た。

^-NMR (CDC13 ) ： S 7.84(4H，dd，J=5.5Hz，3.3Hz), 7.73(4H,dd, J=5.5Hz,3.3Hz), 7.47-7.44(2H，m)， 7.15(lH，d， J=7.7Hz)， 7.00(lH,t, J=7.7Hz), 5.70(lH，s)， 4.87(lH,s), 4.34-4.21(4H,m), 4.03-3.97 (2H,m), 3.91-3.85(2H,m), 2.30(6H,s)

FAB-MS(m/z)： 645(M+H)⁺ m—二トロペンジルアルコールマトリックス実施例 2 3 : 1 , 4—ジヒドロ一 2 , 6 —ジメチルー 4一（ 3—シァノフエ二ル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [2— （ 2—力ルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステルの製造

実施例 2 2で製造した 1， 4ージヒドロー 2， 6 —ジメチルー 4 一（ 3—シァノフエニル）ピリジン一 3 , 5 —ジカルボン酸 ' ビス (2—フタロイルアミノエチル）エステル 5 0 Omgを用いて実施例 1 5 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 4 2 9mgを得た。

1 H-NMR (CD₃OD) ： δ 7.93(2H,d,J=7.7Hz), 7.61(lH,t, J=8.0Hz), 7.57-7.49(5H，m), 7.37-7.33(3H,m), 7.23(lH,t, J=7.7Hz), 5.07(1H, s)， 4.26-4.20(2H,m), 4.16-4.09(2H,m), 3.63-3.56(2H,m), 3.50- 3.44(2H,m), 2.33(6H,s)

FAB-MS(m/z)： 679(M-H)— m—二トロべンジルアルコールマトリックス実施例 2 4 : 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（ 2—二ト口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（2—フタロイルアミノエチル）エステルの製造

2—二トロべンズアルデヒド 6 6 Omgを用い実施例 1 4と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 9 5 8mgを得た。

1 H-NMR (CDC1₃ ) ： S 7.78(4H,dd,J=5.5Hz,3.3Hz), 7.70(4H,dd， J=5.5Hz,3.3Hz), 7.44(lH,d, J=8.1Hz), 7.33(lH,t,J=7.7Hz), 7.16 (lH,d,J=8.1Hz), 6.92(lH,t,J=7.7Hz), 5.71(lH,s), 5.43(lH，s)， 4.24 - 4.10(4H,m), 3.90-3.74(4H,m), 2.30(6H,s)

FAB-MS (m/z)： 665(M+H)⁺ m—二トロべンジルアルコールマトリックス実施例 2 5 : 1 , 4—ジヒドロ一 2， 6 —ジメチル一 4— (2—二ト口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [ 2— （ 2—力ルボキシルベンゾィル）アミノエチル Ί エステルの製造

実施例 2 4で製造した 1 , 4ージヒドロー 2 , 6 —ジメチルー 4 一（ 2—二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5 —ジカルボン酸 ' ビス (2—フタロイルアミノエチル）エステル 5 0 Omgを用い実施例 1 5 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 2 3 9m_gを得た。

^-NMR (CD₃OD) ： S 7.92(2H,d,J=7.3Hz), 7.59-7.44(7H,m), 7.38 (2H,d,J=7.3Hz), 7.19(lH,t,J=7.3Hz), 5.75(lH,s)， 4.30-4.24(2H,m), 4.08-4.02(2H,m), 3.54-3.51(4H,m), 2.30(6H,s)

FAB-MS(m/z)： 699(M-H)― m—二トロべンジルアルコールマトリックス

実施例 2 6 : 1 , 4—ジヒドロー 2 , 6 —ジメチル一 4— (3—二ト口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス（3—フタロイルァミノブ口ピル）エステルの製造

3—フタロイルァミノブロパノール 3.0 gのテトラヒドロフラン 6 ml溶液にトリェチルァミン 0.1 mlを加え、さらにジケテン 1.5 mlのテトラヒドロフラン 2 ml溶液を滴下し 5 5でで 1時間攩拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して得た粗ァセト齚酸エステル体を 9 0%エタノール水 6 mlに溶解し、炭酸アンモニゥム

を添カ0し 4 0でで 2時間撹拌した。この反応混合物にさらに m—ニトロべンズアルデヒド 1.3 3g、クェン酸 23 0 mgおよび水 1.5 mlを力！]え 9 0での油浴中で 4時間、加熱還流した。反応混合物を濃縮して得た残渣を酢酸ェチル 2 0 Omlに溶解し水洗後、有機相を無水硫酸ナトリゥムで乾燥した。この有機相を減圧下で濃縮して得た残渣をシリ力ゲル 2 0 Omlを充填したカラムに展開溶媒としてトルエンー齚酸ェチル混合溶液（混合比、 5 : 1 ) を用い精製し、標題の化合物 2.5 lgを得た。

T L C ： R f 0.24 (トルエン：舴酸ェチル- 2 : 1 )

1 H-NMR (CDC1 a ) ： δ 8.18(lH,t， J=l.8Hz)， 7.99(lH,d, J=7.7Hz)， 7.83(lH，d，J=7.7Hz)， 7.78(4H，dd,J=5.5Hz，3.3Hz), 7.67(4H,dd, J=5.5Hz,3.3Hz), 7.43(lH,t, J=7.7Hz), 6.09(lH，s)， 5.17(lH，s)， 4.15-4.08(4H,m), 3.77-3.74(4H,m), 2.39(6H,s), 2.08-2.01(4H,m) FAB-MS (m/z)： 693(M+H)⁺ m—二トロべンジルアルコールマトリックス実施例 2 7 : 1， 4ージヒドロー 2, 6—ジメチル一 4一（3—二ト口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス [ 3— （ 2—力ルボキシルベンゾィル）アミノブ口ピル] エステルの製造

実施例 2 6で製造した 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一（ 3—二トロフエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 ' ビス ( 3—フタロイルァミノブ口ピル）エステル 1 gを用いて実施例 1 5 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 5 04m_gを得た。

1 H-NMR (CD₃0D) ： δ 8.13(lH，t，J-1.8Hz)， 8.00(lH,d, J=8.1Hz), 7.92(2H,dd,J=7.3Hz,1.5Hz), 7.74(lH，d， J=7.7Hz)， 7.57-7.46(5H,m), 7.38(2H,dd,J=7.3Hz,1.5Hz), 5.12(lH,s)， 4.15(4H，t，J=6.2Hz), 3.36 (4H,t,J=6.6Hz), 2.35(6H,s), 1.99-1.89(4H,m)

FAB-MS(m/z)： 727(M-H)" m—二トロべンジルアルコールマトリックス実施例 2 8 : ( 4 R ) 一 1 , 4ージヒドロー 2， 6—ジメチルー 3 - (2—アミノエチル）ォキシ力ルポ二ルー 4一（3—二トロフエ二ル）ピリジン一 5—力ルボン酸の製造（微生物法）

実施例 3で製造した 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 一 ( 3—二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（ 2 一アミノエチル）エステル . 二塩酸塩 3 Omgを 0.5Mリン酸塩緩衝液（p H 8.0 ) 0.5 mlに溶解した。この溶液に下記の方法により調製したストレブトミセスピリドスポルス A— 914株培養液遠心分離上清 0.5 mlを加えて 4 0での振盪機上で 4 8時間反応を行なった。 R応混合物をダイヤイオン HP— 20 (Ξ菱化成工業） 5 mlを充填したカラムに通して吸着させた。カラムを 1 Omlの蒸留水および 2 0%メタノール水 1 Omlで洗浄した後、 40 %メタノ一ル水 2 Omlで溶出し、 T L C (n—ブタノール：酢酸：水 = 4 ： 1 ： 1 ) で R f 値 0.6 1にニンヒドリンで発色する目的物を含む画分を集め、濃縮乾固し、標題の化合物 1 2.4mgを得た。

¹ H-NMR (CD₃OD) ： δ 8.12(lH,t, J=2.0Hz), 7.97(lH,dd,J=8.0Hz, 2.4Hz),7.67(lH,d,J=8.0Hz), 7.43(lH,t, J=8.0Hz), 5.26(lH,s), 4.26 (lH，m), 3.97(lH,m), 3.06(2H，t， J=5.4Hz), 2.36(3H,s), 2.23(3H,s) FAB-MS(m/z)： 362(M+H)⁺ m—二ト口べンジルアルコールマトリックス

[ストレブトミセスピリドスポルス A— 914株の培養] ストレブトミセスピリドスボルス A— 914株を 3 Omlの C培地 (ポテトスターチ 2 %、エスサンミート 2%、酵母エキス 0.5 %、食塩 0.2 596、炭酸カルシウム 0.3296、硫酸第一鉄 7水和物 0.00 05 %、硫酸マンガン 4水和物 0.0005 %、硫酸亜鉛 7水和物 0.0005 %、 p H 7.4 ) を含む 2 5 Omlフラスコに植菌し、 2 8でで 3日間培養し、 5 00 Orpmで 1 0分間遠心分離して調製した。参考例 2 ： ( 4 R) ー 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 3— (2—アミノエチル）ォキシカルボニル一 4一（3—二トロフエニル）ピリジン一 5—カルボン酸の光学純度の測定

HgCCONH— (CH₂)₂

以下の方法により、既知物質である（ 4 R) — 3— （2—ァセタミドエチル）ォキシカルボ二ルー 1， 4ージヒドロー 2， 6—ジメチル一 4一（ 3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸（ W094Z 05637) に誘導して実施例 28の化合物の光学純度を測定した。

実施例 2 8で得た（ 4 R ) — 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチル - 3 - (2—アミノエチル）ォキシカルボ二ルー 4一（3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルポン酸 1 Omgをィォン交換水 2 mlに溶解し、室温で撹拌しながら無水酔酸 0.2 mlを加えた。 3 0分間撹拌を続けた後、反応混合物を酢酸ェチル 5mlで 3回抽出し、飽和食塩水 1 0ml で洗浄した。酢酸ェチル層を分取用 T L Cブレートに吸着させ、クロ口ホルム一メタノール（7 : 1 ) にて展開し、 R f 値 0.2 2に11¥吸収を示す区分を溶出し、減圧乾固して（ 4 R) — 3— （2—ァセタミドエチル）ォキシカルボ二ルー 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチル一 4— ( 3—ニトロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸 3.7 mgを得た。この物質の光学純度は、ダイセル工業社製光学分割用カラム：キラル AGP ( 4 mmX 1 00 mm) を用いた HPLC (移動相： 0.3 5 % イソブロパノール一 0.1 Mリン酸緩衝液（ p H 4.4 ) , 流速 0.8 ml 分）により分析した。その結果、 4 R体の光学純度は 1 00%であり、保持時間は 1 4.3分を示した。

¹ H-NMR (CDC1₃) ： 8 8.11(lH,t,J=2.0Hz), 7.99(lH,dd,J=8.0Hz, 2.4Hz),7.66(lH,d,J=8.0Hz), 7.44(lH,t_t J=8.0Hz), 5.10(lH，s)， 4.2- 4.0(2H,m), 3.40(2H,t,J=5.5Hz), 2.34(6H,s), 1.91(3H,s) 実施例 2 9 ： ( 4 R ) 一 1， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 3 一 [2 - (2 -カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボニルー 4— ( 3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸の製造（酵素法）

1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4— (3—二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [2— （2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル 5 Omgを pH 9の水溶液に溶解し、プロテアーゼ P— 6 (天野製薬社製）を 5 Omg加え、 2 8でで2 3時間撹拌した。反応液を 1 N塩酸水で酸性にしたのち、酢酸ェチル 2 0 mlを加えた。酢酸ェチル層を水洗、芒硝にて脱水乾燥後、減圧下に濃縮した。残留物を分取 T LCに供し、標題の化合物を 1 7. lmg得た。 ¹ H-NMR (CD₃OD) ： δ 8.14(lH,t,J=2.2Hz), 7.92(lH,d, J = 8.1Hz), 7.69-7.66(2H,m), 7.44-7.33(4H,m), 5.13(lH,s), 4.23-4.16(2H,m), 3.58-3.50(2H，m)， 2.35(3H，s)， 2.31(3H,s)

FAB-MS(m/z)： 508(M-H)一実施例 3 0 ： ( 4 R ) — 1 ， 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 3 一 [ 2— （ 2 —カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボニルー 4一（3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸の製造（微生物法）

FERMP— 13098 (A— 914株）のスラント培養物の一白金耳量をとり、種母培地（ポテトスターチ 2 %、グルコース 2 %、エスサンミ一ト 2 %、酵母ェキス 0.596、食塩 0.2 5 %、炭酸力ルシゥム 0.3 2 %、硫酸第一鉄 7水和物 0.0 0 0 596、硫酸マンガン 4水和物 0. 0 0 0 5 %、硫酸亜鉛 7水和物 0.0 0 0 5 %) 3 0 mlを入れた 2 5 0 ml三角フラスコに植菌し、 2 8でで 2 日間ロータリ一シェーカー上で培養し種母とした。

このようにして培養した種母 1 mlを種母培地と同じ組成の生産培地 1 0 0mlを入れた 5 0 0ml三角フラスコに添加して培養温度 2 8でで 5日間培養した。得られた培養液をろ過し、ろ液 8 0 mlを得た。

得られた培養ろ液 5 0 mlに 1 ， 4—ジヒドロー 2， 6—ジメチル一 4一（ 3—二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス [2— ( 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル 1. O gを溶解し、 p Hスタツト装置を備えた反応容器で 1 N水酸化ナトリゥム水溶液を用いて p 118.5〜 8.6に調整しながら 4 0でで7 2 時間攩拌を行なった。反応混合物を 1 N塩酸で p H 3.0に調整し、酢酸ェチル 1 0 Omlで 2回抽出した。酢酸ェチル層を飽和食塩水 5 0 ml で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤をろ過した後、濃縮乾固して黄色固体を得た。この混合物を分取用 T LCブレートに吸着させ、酢酸ェチルーメタノール一酢酸（ 1 0 ： 2 ： 0.1 ) にて展開し、 R f 値 0.3 6に U V吸収を示す区分を溶出し、減圧乾固して (4 R) 一 1， 4—ジヒドロー 2 , 6—ジメチル一 3— [ 2— （ 2 一カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボ二ルー 4 一（3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸を 35 Omg得た。

NMRスぺクトルは実施例 2 9で得た化合物と同一であった。参考例 3 ： (4 R) - 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチル一 3—

[2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボ二ルー 4— ( 3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸の光学純度の測定

シス

実施例 2 9で得た（ 4 R ) — 1， 4—ジヒドロー 2 , 6—ジメチル一 3— [2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボ二ルー 4一（ 3—二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸 5 Omgにナトリウムメトキシド（28%メタノ一ル溶液） 5 mlを加え、 50でで 2時間撹拌した。反応液を水 1 0mlで希釈した後、酢酸ェチル 5mlで洗浄し、水層を p H 3に合わせてから酢酸ェチル 1 0ml で 3回抽出した。酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリゥムで乾燥してから乾固し、得られた黄色物質を Sephadex LH— 20の 1 2 0 mlの力ラム (溶媒：メタノール）によつて精製し、（4 R) — 1 , 4ージヒドロ一 2， 6—ジメチルー 3—メチルォキシカルボ二ルー 4一（ 3—ニトロフヱニル）ピリジン一 5—力ルボン酸を 2 2mg得た。この物質の光学純度は、ダイセル工業社製光学分割用カラム CHIRALPAK AS ( 4. 6 mm 2 5 0 mm) を用いた HPLC (移動相：へキサン：エタノール：齚酸 = 90 ： 1 0 ： 0. 1 , 流速 1. OmlZ分、検出 U V 2 5 4 nm) により分析した。その結果、光学純度は 1 00%であり、保持時間は 1 2. 5分を示した。

¹ H-NMR (CD₃OD) ： δ 8.09(lH,s), 7.99(lH,d, J=9.5Hz), 7.65(1H, d,J=7.7Hz), 7.44(lH,t,J=8.1Hz)， 5.09(lH,s), 3.62(3H,s), 2.34 (3H,s), 2.33(3H,s) 実施例 3 1 : ( 4 R ) — 1， 4 —ジヒドロー 2 , 6 —ジメチルー 3 一 [ 2 — （ 2 —カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボニルー 4 一（ 3 —ニトロフエニル）ピリジン一 5 —カルボン酸の製造（微生物法）

ボトリオディオプ口ディアエスピー FI— 741を 3 0 mlの FI培地 (ポテトスターチ 2 %、エスサンミート 2 %、 H₂P0₄ 0. 1 %、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 0 5 %、グルコース 1 %、アデ力ノール LG109 0.0 5 %) を含む 2 5 0 mlの三角フラスコに植菌し、 2 8 1Cで 3 日間培養した。

得られた培養液に 1 , 4 ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4 — ( 3 一二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5 —ジカルボン酸 ' ビス [ 2 — ( 2 —カルボキシルベンゾィル）ァミノエチル] エステル 1 00mgを蒸留水 0. 7 5 mlに溶解して加え、さらに 2 日間 2 8でで振盪を続けた。以下、実施例 3 0と同様に操作をして（4 R) — 1 , 4 一ジヒドロー 2 , 6—ジメチルー 3 — [2— （ 2 —カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボ二ルー 4一（ 3 —二トロフエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸を 3 0 mg得た。実施例 3 2 ： ( 4 R ) — 1 , 4ージヒドロー 2 , 6 —ジメチル一 3 一 [2— （ 2 —カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボニルー 4一（ 2， 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸の製造

1， 4ージヒドロー 2， 6—ジメチルー 4一（2， 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一 3， 5—ジカルボン酸 . ビス [ 2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル 5 Omgを用いて実施例 2 9 と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 3.4 mgを得た。

1 H-NMR (CDC13 ) ： S 7.74-7.71(lH,m)， 7.44-7.43(3H,m), 7.35 (lH,dd,J=8.1Hz,1.5Hz), 7.22(lH,dd, J=7.7Hz, 1.5Hz), 7.08(lH,t, J=7.7Hz), 5.48(lH,s), 4.26-4.20(lH,m), 4.13-4.07(lH,m), 3.61- 3.52(2H,m), 2.28(3H,s), 2.24(3H,s)

FAB-MS(m/z)： 531(Μ-Η)' 実施例 3 3 ： ( 4 R ) 一 1 , 4—ジヒドロー 2， 6 —ジメチルー 3 - [ 2— （ 2 —カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] ォキシカルボニルー 4一（3—クロ口フエニル）ピリジン一 5—力ルボン酸の製 CONH— (CH2)₂ -O

COOH ^h3し

実施例 1 9で製造した 1， 4—ジヒドロー 2 , 6 —ジメチルー 4 一（ 3—ジクロ口フエニル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス

[2— （2—力ルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル 5 0 mgを用いて実施例 2 9と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 4. 0 mgを得た。

¹ H-NMR (CDjOD) ： δ 7.68-7.66(lH,m)， 7.43-7.37(3H,m), 7.21- 7.17(2H,m), 7.09-7.01(2H,m), 5.02(lH,s), 4.26-4.16(2H,m), 3.59- 3.57(2H，m)， 2.33(3H,s), 2.28(3H，s)

FAB-MS(m/z)： 497(M-H)" 実施例 3 4 : ( 4 R) — 1， 4ージヒドロー 2 , 6 —ジメチルー 3 一 [ 2— （ 2 —カルボキシルベンゾィル）アミノエチル】ォキシカルボニルー 4一（ 3—シァノフエニル）ピリジン一 5 力ルボン酸の製

実施例 2 3で製造した 1 , 4—ジヒドロ一 2 , 6 —ジメチルー 4 ( 3—シァノフエニル）ピリジン一 3， 5 —ジカルボン酸 ' ビス [2— （ 2—カルボキシルベンゾィル）アミノエチル] エステル 5 0 mgを用いて実施例 2 9と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 8. 2mgを得た。

¹ H-NMR (CD₃OD) ： δ 7.73-7.71(lH,m), 7.59-7.55(2H,m), 7.47- 7.39(4H,m), 7.30(lH,t, J=7.7Hz), 5.05(lH，s), 4.28-4.22(lH,m), 4.20-4.15(lH,m), 3.59-3.57(2H,m), 2.34(3H,s), 2.30(3H,s)

FAB-MS(m/z)： 488( -H)"

実施例 3 5 ： ( 4 R ) — 1 , 4ージヒドロ一 2， 6 —ジメチルー 3 一 [3— （ 2 —カルボキシルベンゾィル）アミノブ口ピル] ォキシ力ルボニルー 4 一（3—二トロフエニル）ピリジン一 5 —力ルボン酸の製造

実施例 2 7で製造した 1 , 4ージヒドロー 2 , 6 —ジメチル一 4 一（ 3—ニトロフエニル）ピリジン一 3 , 5 —ジカルボン酸 ' ビス [ 3— （ 2—カルボキシルべンゾィル）アミノブ口ピルエステル 5 0 mgを用いて実施例 2 9と同様に反応、処理、精製し標題の化合物 2. 8mgを得た。

^-NMR (CD,OD) ： δ 8.11(lH,t,J=1.8Hz), 8.00-7.97(lH,m), 7.79- 7.77(lH，m)， 7.69(lH,d, J=7.7Hz), 7.48-7.43(4H,m), 5.11(lH，s)， 4.15(2H,t,J=6.2Hz), 3.35(2H，t,J=6.6Hz)， 2.36(3H,s), 2.33(3H,s), 1.95-1.90(2H,m)

FAB-MS(m/z)： 522( -H)" 試験例 1 ：水に対する溶解性試験

実施例 3、 1 5および 2 7で得た化合物の 0.0 5Mリン酸緩衝液 (PB) (p H 8) および 0.0 1 Mリン酸緩衝液（PB) ( p H 9) に対する溶解度を測定した。測定はリン酸緩衝液 1〜 1 0mlと基質 1〜 5 Omgを混合した後、電磁振動撹拌機で 1分間撹拌し不溶物の有無により臨界値（溶解度）を求めた。

また、対照化合物として

A： 1 , 4ージヒドロー 2, 6—ジメチルー 4一（3—二トロフエ二ル）ピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ' ビス（2—シァノエチル）ェステル、

B： 1， 4ージヒドロ 2 , 6—ジメチルー 4一（3—二トロフエ二ル）ピリジン一 3 , 5 ジカルボン酸 . ビス（2—メチルスルホニルェチル）エステル

および

C： 1 , 4ージヒドロー 2 , 6—ジメチルー 4一（3 —二トロフエ二ル）ピリジン一 3, 5—ジカルボン酸 ' ビス（力ルバモイルメチル）エステル

についても同様にして溶解度を測定した。結果を表 1に示す,

表 1 ジヒドロピリジン誘導体の溶解度（mgZml)

表 1から、本発明化合物は生物化学反応の媒体となるリン酸緩衝液での溶解度が従来の対照化合物（A , B, C) に比べて極めて高く、効率良く反応が行なえることが分かる。試験例 2 ：酵素反応の転換率

実施例 3、 1 5の化合物および上記試験例 1 に記載した化合物 A (対照化合物）を用い、 A— 914株粗精製酵素による不斉加水分解反応の反応転換率を調べた。

反応は基質濃度 1 O mg/mlの 0 . 2 5 Mリン酸緩衝液（p H 9 . 0 ) 中 4 O t の振盪機上で 4 8時間反応を行なった。反応混合物を HPLC により分析した。 HPLCの分析条件を以下に示す。

HPLC条件

[実施例 3の化合物および対照化合物 A]

カラム： YMCA-302 (4.6ID X 150mm )

移動相： 0.02M KH₂P0₄—リン酸（pH3.0 ) ：メタノール =60： 40,

0.5mlZ分

検出： UV350nm

標準的溶出時間；実施例 3の化合物： 4.3分，生成物： 7.2分

対照化合物 A ： 10.9分，生成物： 12.3分

[実施例 1 5の化合物]

カラム： Kaseisorb LC ODS SUPER (4.6ID X 150mm)

移動相： 60%メタノール：酢酸 = 1000： 1 , 0.8 ml/分

検出： UV254nm

標準的溶出時間： 7.9分，生成物： 5.3分

結果を表 2に示す。

表 2

表 2から、本発明化合物は酵素を用いる不斉加水分解反応において従来の対照化合物（A) に比べて格段に高い変換効率を有していると力 ^わ力、る。

Claims

請求の範囲

) 一般式（ I )

R ¹および R ²は各々独立して水素原子、ホルミル基、フエニル基で置換されていてもよいアルキル部分の炭素原子数が 1 〜 5のアルキル力ルボニル基、ハロゲン原子 1 〜 3個で置換されたァセチル基、アルコキシ部分の炭素原子数が 1〜 4のアルコキシで置換されたァセチル基、炭素原子数が 1 〜 4のアルコキシを有するフエニル基で置換されたァセチル基、クロトニル基、シンナモイル基、アルコキシ部分の炭素原子数が 1〜 6のアルコキシカルボニル基、ァリルォキシカルボニル基、ベンジルォキシカルボニル基、力ルボキシルベンゾィル基または R ¹ と R ²がー緒になってフタロイル基を表わし、 ηは 1 〜 3の整数を表わす。）

で示される 1 , 4ージヒドロピリジン誘導体またはその塩。

2 ) R ¹と R ²が一緒になってフタロイル基を表わす一般式（ I a )