WO1996006181A1 - Procede de modification de proteine - Google Patents

Description

明 細 書 蛋 白 質 の 修 飾 方 法

(技術分野）

本発明 は、 生理活性蛋 白 質の N — 末端側 ま た は C 一 末端あ る い は ア ミ ノ 酸配列中 に ペ プチ ドが ア ミ ド桔合 し て な る 融合蛋 白 質のペ プチ ド部分の グ ル 夕 ミ ン （ G 1 n ) 残基の修飾方法、 よ り 詳 し く は、 生理活性蛋 白質中の G 1 n 残基を運択的に ポ リ ェ チ レ ン グ リ コ ー ル ま た は多糖、 ポ リ ア ミ ノ 酸 も し く は分枝型糖 誘導体で修飾す る 方法 に 関す る 。

(背景技術）

昨今、 多 く の生理活性蛋 白 質が医薬 と し て用 い ら れあ る い は 用 い ら れ よ う と し て い る 。 こ れ ら の生理活性蛋 白 は、 何れ も 人を含む動物体内 に投与 さ れた と き に体内で容易に 代謝、 分解 あ る い は排泄 さ れ、 そ の結果血中滞留時間が短 く 、 さ ら に標的 指向性が低い為、 患部 に必要な量かつ 必要な 時間蓄積 し な い と い う 問題があ る 。

こ の問題を解決す る た め に 、 今迄多 く の試み がな さ れて い る 例え ば、 K a e ら の報告 （ P r o c. N a t l . Ac a d. S c i . U SA,

84 ( 1987 ) , pp. 1487 - 1491) に記載 さ れて い る よ う に 、 生理活性 蛋 白 質を ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルで化学的 に修飾す る 方法があ る

し か し 、 こ れ ら の化学的修飾方法は、 何れ も 、 蛋 白質の特定 位置を修飾 し た り あ る い は修飾の程度を厳密に制御す る の は困 難であ っ た。 例え ば、 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルで修飾す る と き ポ リ エ チ レ ン グ ル コ ー ル は主 に 蛋 白質中の リ ジ ン残基の ε 位の ァ ミ ノ 基 に導入 さ れ る が、 リ ジ ン残基 は蛋 白質中複数個 あ る こ と が多 く 、 従 っ て複数の リ ジ ン残基 に ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル が導入 さ れ た り 導入 さ れな 力、 つ た り す る こ と があ る 。 こ の結果 あ る と き は蛋 白 質が持 っ て い た 生理活性を失い 、 あ る い は医薬 と し て の品質の コ ン ト ロ ー ルが困難で あ っ た。

従 っ て、 生理活性蛋 白質を ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 、 多糖等 の修飾剤で修飾す る に際 し 、 生理活性蛋 白 質の特定位置を修飾 し た り 或い は修飾の程度を 厳密 に制御で き る 方法の 開発が期待 さ れて い る。

(発明の開示）

本発明者は、 分子量 5 x l 0 ³ 〜 2 x l 0 ⁵ の範囲であ っ て 少な く と も 1 個の ト ラ ン ス グ ル 夕 ミ ナ 一 ゼの作用 を受 け る ダ ル 夕 ミ ン残基 を有す る 生理活性蛋白質 と ァ ミ ノ 供与体 と を 、 ト ラ ン ス ダル 夕 ミ ナ ー ゼの存在下に 反応せ し めて、 該 グル タ ミ ン 残 基の 7 — カ ル ボキ シ ァ ミ ド基 と 該ァ ミ ノ 基供与体の一級 ァ ミ ノ 基 と の 間の ア ミ ド桔合を形成せ し め る こ と に よ り 、 生理活性蛋 白質を ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル、 多糖、 ポ リ ア ミ ノ 酸 ま た は分 枝型糖誘導体で位置選択的 に修飾 し た り 或い は修飾量を厳密 に 制御で き る こ と を見出 し 、 こ の よ う な知見 に基 い て本発明を 完 成 し た

す な わ ち 、 本発明 は 、 分子量 5 x 0 2 X 1 0 ³ の範囲 で あ っ て少な く と も 1 個の グ ル タ ミ ン 残基を有す る 生理活性蛋 白質 と 下記一般式 （ I ) 〜 （ I V ) の いずれかに よ り 示 さ れ る ァ ミ ノ 基供与体 ま た は ア ルキ ル ア ミ ン を導入 し た 多糖 も し く は そ の修飾体 と を、 ト ラ ン ス ダル 夕 ミ ナ ー ゼの存在下に 反応せ し め て、 該 グル タ ミ ン 残基の y — 力 ノレ ボキ シ ア ミ ド基 と 該ァ ミ ノ 基 供与体の一級 ア ミ ノ 基 と の間の ア ミ ド結合を形成せ し め る こ を特徴 と す る 蛋 白 質の修飾方法 に 関す る NH₂ (CH₂ ) nT (CH₂ ) m (OCH₂ CH₂ ) pOR (I)

NH₂ (CH₂ ) nT (CH₂ ) m (OCH₂ CH₂ ) pT (CH₂ ) nNH_¾ (Π) た だ し 、 上記一般式 （ I ) お よ び （ I I ) 中、 n は 1 〜 8 の整 数であ り 、 m は 0 ~ 2 の整数で あ り 、 p は 1 〜 4 0 0 の整数で あ り 、 T は桔合 一 0 — 、 — C ( 0 ) 0 — 、 - 0 C ( 0 ) ―、 一

N H C 0 -、 一 0 C N H -、 一 N H C 0 N H -、 一 0 0 C N H 一ま た は一 H N C 0 0 — で あ り 、 そ し て R は水索原子、 炭紫原 子数 1 〜 5 の低极ア ルキ ル基 ま た は炭素原子数 2 〜 6 の低級ァ シ ル基であ る。

R (0CH₂ CH₂ ) _Q NHC0、

R (0CH₂ CH₂ ) _q NH

〉NHC0 (CH₂ ) nNH_¾

\

R (0CH₂ CH₂ ) _Q ΝΗ00^κ

た だ し 、 上記一般式 （ I I I ) 中、 n は 1 〜 8 の整数で あ り q は 2 〜 6 の整数で あ り 、 そ し て R は ガ ラ ク ト ー ス 、 グ ル コ 一 o 一 ス ま た は N — ァ セ チ ルガ ラ ク ト サ ミ ン で あ る

H, N- (CH_n ) _n -NH-CO-T' (IV) た だ し 、 上記一般式 （ IV) 中、 n は 1 〜 8 の整数であ り 、 そ し て T ' は ポ リ ア ミ ノ 酸の末端カ ル ボキ シ ル基を除 く 残基で あ る 。 こ こ で、 ポ リ ア ミ ノ 酸の構成ア ミ ノ 酸 と し て は いずれで も よ いが、 酸性 ま た は塩基性 ア ミ ノ 酸が溶解性の見地か ら 好 ま し い。 ま た、 ア ミ ノ 酸重合度 は 1 〜 4 0 0 が好 ま し い。

ア ルキ ル ア ミ ン を導入 し た多糖 ま た は そ の修飾体は、 多糖の ¾ 元末端 を 下記一般式 （ 1 ) で表 さ れ る 化合物 ま た は そ の 塩 (塩酸塩な ど） の存在下に通元ァ ミ ノ 化 し 、 次い で保護基 V を 脱離せ し め て得 ら れ る 化合物であ る 。

V-NH- (CH₂ ) _n -NH, (1) た だ し 、 上記一般式 （ 1 ) 中、 n は 1 〜 8 の 整数であ り 、 そ し て V は一般的に ア ミ ノ 基の保護 に 使わ れ る 保護基で、 例え ば F m o c ( 9 H — F 1 u o r e n — 9 — y I m e t h o x y c a r b o n y 1 ) を挙 げ る こ と がで き る 。

多糖 は、 例え ば、 プ ル ラ ン 、 デ キ ス ト ラ ン 、 デ キ ス ト ラ ン 硫 酸、 コ ン ド ロ イ チ ン硫酸等及 び こ れ ら を カ ルボキ シ メ チ ル化 し た も の であ っ て、 分子量 1 x 1 0 " か ら 1 X 1 0 ⁵ ダ ル ト ン の も の で あ る 。

ア ルキ ル ァ ミ ン を導入 し た多糖 ま た は そ の修飾体の製造方法 は、 例 えば、 多糖 ま た は カ ル ボキ シ メ チ ル化 し た 多糖を酢酸 — 水 - D M F の混合溶液 ま た は水の単独溶媒中 に溶解 さ せ、 多糖 に対 し 約 1 0 〜 ： L 0 0 0 倍 当量、 よ り 好 ま し く は約 1 0 0 倍当 量 の上記一般式 （ 1 ) に示す化合物 と 還元剤、 例 え ば水素化 シ ァ ノ ホ ウ 素ナ ト リ ウ ム を順次加え、 室温〜 8 0 て 、 よ り 好 ま し く は 5 0 〜 7 0 て で、 1 〜 3 日 間反応 さ せ た後 ァ ミ ノ 基 の保護 基を ァ ノレ カ リ 、 例え ば ジ ェ チ ル ァ ミ ン ま た は 0 . 1 N N a 0 H溶液で脱離す る こ と に よ り 得 ら れ る 。

さ ら に 、 前記生理活性蛋 白質 は 、 分子量 5 x 1 0 以 上 であ り 、 かつ該蛋 白 質 1 0 /z M と 該生理活性蛋 白 質 に対 し 1 0 0 倍 当重 の モ ノ ダ ン シ ル カ ダべ ル ン と を 1 O m M C a C 1 ₂ を 含 み かつ p H 7 . 5 の l O O m M ト リ ス ー 塩酸緩衝液中 で 前記 卜 ラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼの 存在下 に 3 7 °Cで 6 0 分間保持 し た と き に ダ ン シ ル カ ダ ベ リ ン が導入 さ れ る も の で あ る 。

以下、 本発明 を詳細 に説明す る 。

本発明の方法に よ り ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル、 多糖、 ポ リ ア ミ ノ 酸 ま た は分枝型糖誘導体 に よ っ て修飾すべ き 生理活性蛋 白 質 と し て は、 ア ル ブ ミ ン 、 ィ ム ノ グ ロ ブ リ ン 、 血液凝固因子 な どの ヒ 卜 血漿成分 ； ス ー パ 一 ォ キ サ イ ドデ イ ス ム 夕 一 ゼ、 ゥ ロ キ ナ ー ゼ な ど の酵素 ； 成長 ホ ル モ ン 、 ェ ル ス ロ ボ イ エ チ ン な ど の ホ ル モ ン ； 細胞增殖、 抑制 な ど の細胞増殖調節因子 ； 細胞分 化、 誘導、 刺激な どの免疫反応調節因子 ； モ ノ カ イ ン 、 サ イ ト カ イ ン 、 リ ン ホ カ イ ン な どの細胞産生生物学的活性蛋白 ； 等を 広 く 挙げ る こ と がで き る 。 こ れ ら の生理活性蛋 白質 は、 そ の 由 来 を問わず、 動物由 来の も の で あ っ て も 、 植物由来の も の で あ て も 、 微生物由 来の も の で あ っ て も よ い。 ま た 、 大腸菌、 酵 母、 ィ ニ ー ズハ ム ス タ ー 、 ォ バ リ ー 等 に こ れ ら 蛋 白 質の遗 伝子を組み込み発現 さ せ て生産 さ れた蛋 白質で あ っ て も よ い。

生理活性蛋 白 質 は、 分子量力《 5 X 1 0 ³ よ り 小 さ い場合に は リ ジ ン残基等が少な く 、 化学的 な 修飾方法で あ っ て も 修飾量、 修飾位置等が あ る 程度制御で き る 。 よ っ て 、 分子量 5 x 1 0 ³ 以上の生理活性蛋 白 質が本発明の方法の効果が よ り よ く 発揮で き る 。 ま た、 本発明の生理活性蛋白質は 、 分子中 に 少な く と も 1 個、 望ま し く は 1 〜 2 個の ト ラ ン ス ダル 夕 ミ ナ ー ゼの作用 を 受 け る グル 夕 ミ ン残基を有す る も ので あ る 。 分子中の グ ル 夕 ミ ン残基が ト ラ ン ス ダル 夕 ミ ナ ー ゼの作用 を受け る か ど う かは、 次の よ う に し て翻べ る 。 生理活性蛋 白 I 0 / M と 生理活性蛋 白質 に対 し 1 0 0 倍当量の モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン と を 1 O m M C a C l ₂ を含み かつ p H 7 . 5 の l O O m M ト リ ス — 塩 酸緩衝液中で ト ラ ン ス ダル 夕 ミ ナ ー ゼの存在下に 3 7 で 6 0 分間保持す る 。 ダ ン シ ル カ ダベ リ ン が導入 さ れた か否か は、 逆 相 H P L C に よ る 分析に よ り 蛋白 由来の ビ ー ク が蛍光吸収を も つ こ と に よ り 確認す る こ と がで き る 。

本発明の方法に お い て使用 さ れ る ト ラ ン ス グル タ ミ ナ ー ゼは そ の 由来を問わず、 動物の諸組織由来の も の、 血漿成分由来の も の 、 あ る い は微生物由来の も のであ っ て も よ い。

蛋 白質及 びペ プチ ド鎮中の グル タ ミ ン （ G l n ) 残基の 7 — カ ル ボキ シ ア ミ ド基 と リ ジ ン （ L y s ) 残基の ε — ア ミ ノ 基ぁ る い は各種 ア ルキ ルァ ミ ン 間の ァ シ ル転位反応を触媒す る 酵素 で あ る ト ラ ン ス ダル タ ミ ナ ー ゼ は、 動物の諸組繳、 血液細胞、 及 び血漿等に 広 く 分布 し 、 種 々 の分子形態を と つ て い る 。 本酵 素は生体内 に お い てペ プチ ド趙間 （内） の ε — （ 7 — ダル タ ミ ル） リ ジ ン 一 イ ソ ペ プチ ド結合 に よ る 架橋形成反応を触媒 し 、 血液凝固の最終 ス テ ッ プで あ る フ ィ プ リ ン 分子の架檷化を行 う 一方、 表皮細胞の 角 質化、 精液凝固及び創傷組機の治癒等への 関与が示 さ れて い る 。 こ の ト ラ ン ス グル タ ミ ナ ー ゼ は G 〗 η 残 基 に対す る 基質特異性が極め て高 い こ と か ら 、 蛋 白質中の特定 の G 1 η 残基の み を ア ルキ ル ア ミ ン に よ り 修飾で き る 可能性が あ っ た。 例え ば、 モ ルモ ッ ト 肝由来の ト ラ ン ス グル 夕 ミ ナ ー ゼ

( T G a s e ) を用 い、 糖類ュニ ッ ト を末端に有 し た ア ルキ ル ア ミ ン を ； S — カ ゼイ ン 中の特定の G 1 n 残基に導入 し た （ Yin,

S. C. B. e t i l. , ( 1984 ) B i o chem i s t r y, 23, 3759 - 3765 ) ₀ ま た、 血漿中 に存在す る ト ラ ン ス ダル タ ミ ナ ー ゼであ る 血液凝 固 X 因子 （ Fa c t o r XI I I) を用 い、 低分子の ス ペ ル ミ ン誘 導体 を ア ポ リ ポ プ ロ テ イ ン B 中 の G 1 n 残基 に 導入 し て い る ( Cocu zz i, E. e t a 1. , ( 1990 ) B i o c h e m. J. , 265, 707-713) こ の よ う に ト ラ ン ス グル タ ミ ナ ー ゼを用 い た応用 は、 基質 と な る G 1 n 残基を既に 有 し て い る 蛋 白質 に低分子の ア ルキ ル ア ミ ン 誘導体を導入す る の み で あ り 、 P E G 等の 台成高分子化合物 の導入 は行わ れて い な か っ た WO 96/06181 一 丄 ₀ 一 PCT/JP95/00298

蛋 白質が ト ラ ン ス グ ル 夕 ミ ナ ー ゼの作用 を受 け る ダ ル 夕 ミ ン 残基を有 し な い場合に は、 ト ラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼの作用 を受 け る グ ル 夕 ミ ン残基を 1 〜 2 個、 よ り 望 ま し く は 1 個有す る ぺ プチ ド と こ の蛋 白 質 と の融合蛋白質を得 る こ と に よ り 、 前記蛋 白 質 に グ ル タ ミ ン 残基 を 導入す る こ と が で き る 。 こ の 場合 、 ぺ プチ ド融合前の 蛋 白 質の分子量 は、 分子量 5 X 1 0 ³ 〜 2 1 0 ⁵ の範囲で あ る 。 ま た 、 生理活性を有す る も の で な け れば な ら な い。

な お 、 生理活性蛋 白質は、 副反応を最小限に抑え る た め に 、 よ り 精製す る の が望 ま し い。

上記べ プチ ド は、 a — L — ア ミ ノ 酸残基 3 〜 2 0 個 よ り な り Ν — 末端 よ り 2 番 目 以降かつ C 一 末端 よ り 2 番 目 以前 に グル 夕 ミ ン を有 し 、 かつ該ペ プチ ド 1 0 /ζ Μ と 該ペ プチ ド に対 し 1 0 0 倍 当 量 の モ ノ ダ ン シ ノレ 力 ダ べ ノレ ン と を 1 0 m M C a C 1 , を含みかつ p H 7 . 5 の l O O m M ト リ ス ー 塩酸緩衝液中で前 記 卜 ラ ン ス グル タ ミ ナ ー ゼの存在下に 3 7 で で 6 0 分間保持 し た と き に ダ ン シ ノレ 力 ダべ リ ン が導入 さ れ る も の で あ る 。

本発明者の知見に よ れば、 こ の よ う な 条件で ダ ン シ ル カ ダべ リ ン の導入 さ れ る ペ プ チ ド は 、 前記一般式 （ I ) 〜 （ ） の い ずれかに よ つ て表わ さ れ る ァ ミ ノ 基供与体 な ら び に ア ルキ ルァ ミ ン を導入 し た多糖お よ びそ の修飾体 と ト ラ ン ス ダ ル 夕 ミ ナ 一 ゼに よ っ て反応 し 、 ま た こ の よ う な 条件で ダ ン シ ル カ ダベ リ ン の導入 さ れな い ぺ プチ ド は 、 こ の よ う ァ ミ ノ 基供与体 と は 同 じ 酵素に よ っ て反応 し な い。

ぺ プチ ドの ァ ミ ノ 酸残基数 は 3 以上 は必要で あ る が、 あ ま り 多 い と 蛋 白質の性質に 影響を与え る こ と が あ り 、 ま た 合成が煩 雑で あ る 。

こ れ ら べ プチ ドの具体例 と し て は、 下記第 1 表 に 示す も のが あ げ ら れ る

d 0 O U ΙΛΙ a ti I 0 V D soi ooN Sd y

I^J Ί 0 J d O 0 d d y ΙΛΙ

Λ Ί d丄 O S CI S人 ΙΙζΙ ΘΕ)

31 S V999上 S A 0 S I αΐ ΛΘ人 l

9人 SdOdVQS丄 O 上 AOOSS A人 E)

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DD3T H i dDOA O 03 dl 3nDV3

丄丄 d1 S3つ 30 D Λ丄 O丄 ョ

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0 100ΙΙΘ ΛΙΙΛΟ D H y d d Θ Λ I Sd

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N 1 Λ a D aj y sy v

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y i£>3 d9HWョ 人 o DTDdO^ J d i

丄" I dSOdOA I O D V 3

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ddd S0S3 SHM O E)丄 SS S A S S 3

丄 SSdfc! d SOdN 0 ΝΘ丄 SO丄 O S S

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Ί £)丄 30人 N l d b! O a gvvAO丄 Eiy

V 333 d 1 A d丄 O 3 dN0 iS0 D τ蚩

Z00/S6dT/lDd z 18190/96 OM な お、 第 1 表 に お け る 略号の意味 は、 下記第 2 表 に示す

第 2表

G グリシン

A ァラニン

V ノ リン

L ロイシン

I イソロイシン

S セリン

T トレオニン

C システィン

M メチォニン

D ァスパラギン酸

E グルタミン酸

N ァスパラギン

Q グルタミン

K リジン

H ヒスチジン

R アルギニン

F フエ二ルァラニン

Y チロシン

W トリブトファン

P プロリン

上記べ プチ ド中の N 末端側か ら 1 0 残基 目 に 示 し た グル タ ミ ン残基が ト ラ ン ス グル タ ミ ナ ー ゼに 対す る 基質 と な る も の であ WO 96/06181 ― 丄 ₄ 一 PCT/JP95/00298

る 。 上記べプチ ド 中 N — 末端 ま た は C 一 末端側 よ り ァ ミ ノ 酸残 基を除去 し た も の で も よ く 、 2 0 残基 に満 た な い も の につ い て は新た に ア ミ ノ 酸残基が付加 し た も の で も よ い 。 さ ら に 、 ト ラ ン ス ダ ル 夕 ミ ナ ー ゼ に対す る ダル 夕 ミ ン残基の基質 と し て の反 応性が大 き く 変わ ら な い埸合 に は、 上記べ プチ ド 中の ァ ミ ノ 酸 を他の ァ ミ ノ 酸 に 置換 し て も よ い。

前記蛋 白質 と 前記べ プ チ ド と か ら な る 融合蛋 白 質の調製方法 は、 同蛋 白質の N — 末端 も し く は C — 末端 ま た は 蛋 白質の ア ミ ノ 酸配列中 に 同ペ プチ ド を導入す る。 ペ プチ ド を蛋 白質に導入 す る 方法は、 対応す る D N A を調製 し て微生物ホ ス 卜 に 同 D N A を発現 さ せ る のが簡便で あ る 。

具体的 に は 、 以下の よ う に し て製造 さ れ る 融合蛋 白 があ げ ら れ る 。

N — 末端に導入す る 例 と し て は、 実施例 1 〜 6 に示 し た よ う に ヒ ト イ ン タ ー ロ イ キ ン 一 2 ( h I L - 2 ) の 発現用 プ ラ ス ミ ド p T 1 3 S N C o を用 い て （ N . T o n o u c h i e t a 1 . , J . B i o c h e m . , 1 0 4 , 3 0 〜 3 4 ( 1 9 8 8 ) ) 、 制限酵素 C 1 a I 、 N c o I で切断 し 、 第 1 表 に示 し た べ プチ ド 由来の 合成 D N A と を ラ イ ゲ 一 シ ョ ン さ せ る 。 得 ら O 96/06181 _Λ r-

― 1 5 ― れた プ ラ ス ミ ド を大腸菌株へ導入す る こ と に よ り N — 末端 に G 1 n 残基を 含むペ プチ ド を導入 し た融合蛋 白 質を生産 さ せ る 。

C 一 末端に導入す る 例 と し て は 、 井上 ら の ヒ ト ス ー パ ー ォ キ サ イ ド デ イ ス ム タ ー ゼ （ S O D ) に お け る 融 合蛋 白 質構築法 ( M. I n 0 u e e t a I . , F E B S LETTERS ( 1990 ) 269, 1, 89〜 92) に よ り 可能で あ る 。 即 ち 、 S O D 発現用 プ ラ ス ミ ド p B R S O D を制限酵素 B amH I 及び S a i l で切断 し 、 第 1 表 に 示 し たぺ プ チ ドの う ち 、 例え ば M e t - L y s — P r o - G 1 n - G 1 n - P h e - P h e - G 1 y — L e r 由来の合成 D N A と を ラ イ ゲ ー シ ヨ ン さ せ る 。 得 ら れた ブ ラ ス ミ ドを酵母株へ導入す る こ と に よ り S O D の C — 末端に G 1 n 残基 を含むペ プチ ド を導入 し た融合蛋 白 質を生産 さ せ る 。

ア ミ ノ 酸配列中 に導入す る 例 と し て は、 例え ば h I L — 2 の N — 末端 ア ミ ノ 酸 5 残基を A l a — P r o — T y r — S e r - S e r か ら L y s — P r o — G l n _ G l n — P h e と な る よ う に プ ラ ス ミ ド中の D N A シ ー ク ェ ン ス を 置 き 換え た 発現用 プ ラ ス ミ ド を構築す る 。 次 に 得 ら れた プ ラ ス ミ ド を大腸菌株へ導 入 す る こ と に よ り 、 h i L — 2 の N — 末端 ア ミ ノ 酸 5 残基 が G 1 n 残基を含むぺ プチ ド を ァ ミ ノ 酸配列中 に導入 し た 融合蛋 ― l b ― 白 質 を 生産 さ せ る 。

D N A の 導 入 に よ り 用 い ら れ る ベ ク タ ー は 、 特 に 制 限 が な く 今 ま で知 ら れ て い る 何 れ も 用 い る こ と が で き よ う 。 例 え ば 、 以 下 の も の が あ げ ら れ る 。 す な わ ち 、 ベ ク タ ー （ ス ト リ ン ゼ ン ト 型 ： p S C l O l , p R K 3 5 3 , p R K 6 4 6 , p R K 2 4 8 , p D F 4 1 な ど ） 、 お よ び E K タ イ プ プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー ( リ ラ ッ ク ス ド タ イ プ ： C o l E l , p V H 5 1 , p A C I O 5 , R S F 2 1 2 4 , p C R l , p M B 9 , p B R 3 1 3 , p B R 3 2 2 , p B R 3 2 4 , p B R 3 2 5 , p B R 3 2 7 , p B R 3 2 8 , p K Y 2 2 8 9 , p K Y 2 7 0 0 , p K N 8 0 , P K C 7 , p K B 1 5 8 , p K 2 0 0 4 , p A C Y C l , p A C Y C 1 8 4 , d u l な ど ） 、 タ イ プ フ ァ ー ジ ベ ク タ 一 （ ス g Λ c , λ g t . λ B , λ π, £ g . λ C , λ _{ν Γ} j . ス β ' λ _{Z J} V 1 Γ λ Β , ス

λ WE S - ^{Τ s} 622 ' λ _D a m な ど ） 等 が 含 ま れ る 。

こ れ ら ベ ク タ ー の ホ ス ト も 、 同 じ よ う に 制 限 が な く 、 細菌 、 酵 母 な ど が用 い ら れ る が、 取 り 分 け よ く 知 ら れ て い る よ う に 大 腸菌 が よ く 研究 さ れ、 使用 に 便利 で あ る 。

ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル誘導体 か ら な る ァ ミ ノ 基 供与体 は 、 WO 96/06181 一 マ _ PCT/JP95/00298

前記一般式 （ I ) ま た は （ 11) で示 さ れ る 化合物で あ る 。 こ れ ら ア ミ ノ 基供与体を得 る に は、 以下の よ う に特別 な方法を要 し な い o

ま ず、 一般式 （ I ) で表わ さ れ る 化合物の 合成 は、 例え ば、 次の よ う に し て行な う こ と がで き る 。

す な わ ち 、 結 合 τ が 酸 ア ミ ド 桔 合 で あ る 場 合 、 ア ミ ノ 基 ( T a ) を有す る ア ルキ ル ァ ミ ン と カ ル ボキ シ ル基 （ T b ) を 有す る メ ト キ シ ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル と を、 ま た は T a 及 び T b と の関係が逆で あ る 両化合物を、 脱水縮合条件下、 具体的 に は反応に 関与 し な い溶媒 （例え ば、 ァ セ ト ニ ト リ ル、 ジ メ チ ルホ ル ム ア ミ ド、 塩化 メ チ レ ン 、 塩化エ チ レ ン な ど） 中で、 適 当 な 触媒 （例え ば、 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド、 N , N ' ー ジ シ ク ロ へ キ シ ノレ カ ノレ ボ ジ イ ミ ド 、 1 ー ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ア ゾー ル な ど） の存在下、 0 で 〜室温の反応温度で 1 〜 2 4 時間反応 さ せ て得 る こ と がで き る 。

ま た、 結合 T がエ ス テ ル結合で あ る 場合、 水酸基 （ T a ) を 有す る ァ ノレキ ルァ ミ ン と カ ノレ ポキ シ ル基 （ T b ) を 有す る メ ト キ シ ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル と を 、 ま た は T a 及 び T b と の関 係が逆で あ る 両化合物を 、 脱水縮合条件下、 具体的 に は 反応に WO 96/06181 一 ₁ g _ PCT/JP95/00298

関与 し な い 溶媒 （例 え ば 、 ァ セ ト ニ ト リ ル 、 ジ メ チ ル ホ ル ム ァ ミ ド 、 塩 化 メ チ レ ン 、 塩化 エ チ レ ン な ど ） 中 で 適 当 な 触媒 （例 え ば、 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド 、 N , N ' — ジ シ ク ロ へ キ シ ノレ カ ル ボ ジ イ ミ ド 、 1 ー ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ア ゾ ー ル な ど） の 存在下 、 0 〜 室温 の 反 応温度 で 1 〜 2 4 時間反 応 さ せ て 得 る こ と が で き る 。

ま た 、 桔 合 T が エ ー テ ル で あ る 場 合 、 ハ ロ ゲ ン 原 子 ま た は o 一 ト シ ル基 （ T a ) を 有す る ア ル キ ル ァ ミ ン と 水酸基 （ T b ) を 有す る メ ト キ シ ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル を 水素化 ナ ト リ ゥ ム 水素化 カ リ ウ ム な ど の ヒ ド リ ド 試薬 で 処理 し た も の と を 、 ま た は T a 及 び T b と の 関係 が逆 で あ る 両 化 合物 を 、 反 応 に 関与 し な い 溶媒 （ 例 え ば 、 ジ メ チ ノレ ホ ル ム ア ミ ド 、 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン な ど ） 中 で 、 室温 〜 1 0 0 で の 反 応温度 で 1 〜 4 8 時 間反 応 さ せ て 得 る こ と がで き る 。

さ ら に ま た 、 結 合 T が ウ レ タ ン 結 合 で あ る 場 合 、 ア ミ ノ 基 ( T a ) を 有す る ア ル キ ル ァ ミ ン と 水酸基 （ T b ) を 有 す る メ ト キ シ ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ノレ を 常法 （ 例 え ば 、 1 , 1 一 カ ル ボ ニ ル ジ ィ ミ ダ ゾ ー ル で処理す る ） に 従 い イ ソ シ ア ナ 一 ト 化 し た も の と を 、 ま た は T a 及 び T b と の 関 係 が逆 で あ る 両 化 合物 „

を、 反応に関与 し な い溶媒 （例 え ば、 エ ー テ ル、 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン 、 4 一 ジ ォ キ サ ン な ど） の 中で、 適当 な触媒 （例え ば、 ト リ ェ チ ル ァ ミ ン 、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム な どの塩基） の存 在下、 〜室温の反応温度で 0 . 5 〜 2 4 時間反応 さ せ て得 る こ と がで き る 。

次に、 一般式 （ 11) で表 さ れ る 化合物の合成 は、 例え ば次の よ う に し て行な う こ と がで き る 。

す な わ ち 、 結 合 T が 酸 ア ミ ド 結 合 で あ る 埸 合 、 ア ミ ノ 基 ( T a ) を有す る ア ルキ ルァ ミ ン と カ ル ボキ シ ル基 （ T b ) を 有す る ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル と を、 ま た は T a 及び T b と の 関係が逆で あ る 両化合物を、 脱水縮合条件下、 具体的 に は反応 に 関与 し な い溶媒 （例え ば、 ァ セ ト ニ ト リ ル、 ジ メ チ ルホ ル ム ア ミ ド、 塩化 メ チ レ ン、 塩化エ チ レ ン な ど） 中で、 適当 な触媒 (例え ば、 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド、 N , N ' — ジ シ ク 口 へ キ シ ル カ ル ポ ジ イ ミ ド、 1 — ヒ ド ロ キ シベ ン ゾ ト リ ア ゾー ル な ど） の存在下、 0 て 〜室温の反応温度で 1 〜 2 4 時間反応 さ せ て得 る こ と がで き る 。

ま た、 桔合 T がエ ス テ ル結合で あ る 場合、 水酸基 （ T a ) を 有す る ア ルキ ル ァ ミ ン と カ ル ボキ シ ル基 （ T b ) を有す る ポ リ エ チ レ ン ダ リ コ ー ル と を 、 ま た は T a 及 び T b と の 関係 が逆 で あ る 両化合物 を 、 脱水縮 合条件下 、 具体 的 に は 反 応 に 関与 し な い 溶媒 （例 え ば、 ァ セ ト ニ ト リ ル 、 ジ メ チ ル ホ ノレ ム ア ミ ド 、 塩 化 メ チ レ ン 、 塩化 エ チ レ ン な ど ） 中 で適 当 な 触媒 （例 え ば 、 N ー ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド 、 N， N ' — ジ シ ク ロ へ キ シ ル カ ル ボ ジ イ ミ ド 、 1 ー ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ア ゾ ー ル な ど ） の 存 在下、 0 〜 室温 の 反 応温度 で 1 〜 2 4 時間 反 応 さ せ て 得 る こ と が で き る 。

ま た 、 結 合 T が エ ー テ ル 結 合 で あ る 場 合 、 ハ ロ ゲ ン 原 子 ま た は o — ト シ ル 基 （ T a ) を 有 す る ア ル キ ル ァ ミ ン と 水 酸 基

( T b ) を 有す る ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル を 水素化 ナ 卜 リ ゥ ム 水素化 カ リ ウ ム な ど の ヒ ド リ ド 試薬 で 処理 し た も の と を 、 ま た は T a 及 び T b と の 関係 が逆 で あ る 両 化 合物 を 、 反 応 に 関与 し な い 溶媒 （例 え ば、 ジ メ チ ノレ ホ ノレ ム ア ミ ド 、 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン な ど ） 中 で 、 室温 〜 1 0 0 の 反 応温度 で 1 〜 4 8 時 間 反 応 さ せ て 得 る こ と が で き る 。

さ ら に ま た 、 結 合 T が ウ レ タ ン 桔 台 で あ る 場 合 、 ア ミ ノ 基

( T a ) を 有す る ア ル キ ル ァ ミ ン と 水酸基 （ T b ) を 有す る ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ノレ を 常法 （例 え ば 、 1 ， 1 — カ ノレ ポ ニ ル ジ ク

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2

ィ ミ ダ ゾー ルで処理す る ） に 従い イ ソ シ ア ナ 一 ト 化 し た も の と を、 ま た は T a 及び T b と の関係が逆で あ る 両化合物を 、 反応 に 鬨与 し な い溶媒 （例え ば、 エ ー テ ル、 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン 、

1 , 4 — ジ ォ キ サ ン な ど）一 の 中で、 適当 な 触媒 （例え ば、 ト リ

ド

ェ チ ル ァ ミ ン 、 炭酸水素 ナ ト リ ウ ム な ど の 塩基） の 存在下、 0 〜室温の反応温度で 0 . 5 〜 2 4 時間反応 さ せ て得 る こ と がで き る 。 次 に、 一般式 （1 1 1 ) で表 さ れ る 化合物の 合成 は 、 例え ば次の よ う に し て行な う こ と 力 で き る 。 即 ち 、 特開平 5 — 2 0 2 0 8 5 に お け る 方法 に 従 っ て グ ル 夕 ミ ン酸を利用 し た分枝型骨格構造を構築 し 、 そ の カ ル ボキ シ ル 基 と 糖の水酸基を ァ セ チ ル基で保護 し た ト リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル ア ミ ン誘導体の ァ ミ ノ 基 と を、 脱水縮合条件下、 具体的 に は 反応に関与 し な い溶媒 （例 え ば、 ァ セ ト ニ ト リ ル、 ジ メ チ ルホ ル ム ア ミ ド、 塩化 メ チ レ ン 、 塩化エ チ レ ン 等） 中で、 適当 な 触 媒 （例え ば、 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン ィ N N 一 ジ シ ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ア ゾ ー ル等） の存在下、 o °c 〜室温の 反応温度 で 2 4時間反応 さ せ た後、 脱保護す る こ と に よ り 得 る こ と がで き る 。 次 に 、 一般式 （ I V) で 表 さ れ る 化 合物 の 合成 は 、 例 え ば次 の よ う に し て 行 な う こ と が で き る 。

即 ち 、 ホ モ ポ リ べ プ チ ド 重 合法 で あ る α — ァ ミ ノ 酸 ー Ν — 力 ル ボ ン 酸無水物 （以下 、 N C A と 略す ） 法 に よ り 、 ア ミ ノ 酸 Ν C A を 不活性溶媒 （ ジ ォ キ サ ン 、 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン 、 ベ ン ゼ ン 、 ニ ト ロ ベ ン ゼ ン 、 ジ ク ロ ロ ェ タ ン 、 ジ メ チ ノレ ホ ル ム ア ミ ド 等） 中 で 、 一方 の ア ミ ノ 基 を Ζ 基 で保護 し た ア ル キ ル ジ ァ ミ ン 化 合物 を 開始剤 と し て 反 応 を 行 わ せ る こ と に よ り 得 る こ と が で き る 。 開 始剤 の 濃度 を コ ン ト ロ ー ルす る こ と に よ り 平均鑌長 が 決 ま る 。

最後 に 、 ア ル キ ル ア ミ ン を 導 入 し た 多 糖 お よ び そ の 修飾体 の 合成 は 、 例 え ば 次 の よ う に し て 行 な う こ と が で き る 。

即 ち 、 M. Ya l pan i ら の デ キ ス ト ラ ン に お け る 還元末端 の 選択 的修飾方法 （ 】. Po l ym. S c i . P o I ym. Ch em. , 23, 1395 - 1405

( 1985 ) ) を 参考 に 平均分子 KD a か ら l O OKDaの デ キ ス ト ラ ン プ ル ラ ン 、 デ キ ス ト ラ ン 硫酸、 コ ン ド ロ イ チ ン 硫酸等 の 多 糖、 あ る い は 一部の 水酸基 の 水素原 子 が 力 ノレ ボ キ シ C ₁ 〜 c ₄ ア ル キ ル基 で 置換 さ れ た 修 飾 体 を 適 当 な 溶媒 （ Q . 1 %酢酸溶液 、 あ る い は ジ メ チ ル ホ ノレ ム ア ミ ド と の 混合溶媒 等） 中 で 、 一方 の ァ ミ ノ 基を F iii o e基で保護 し た ア ルキ ル ジ ァ ミ ン 化合物 と 水素化 シ ァ ノ ホ ウ 素ナ ト リ ウ ム と を多糖 に対 し 過剰量加え、 室温か ら 80 での反応温度で多糖の通元末端を通元 ァ ミ ノ 化 さ せ た後、 脱保 護す る こ と に よ り 得 る こ と がで き る 。

こ れ ら の、 生理活性蛋白 質 と ア ミ ノ 基供与体 と を ト ラ ン ス グ ル 夕 ミ ナ ー ゼの存在下に 反応せ し め る 方法 は、 要す る に 、 ト ラ ン ス ダル 夕 ミ ナ ー ゼの作用条件下で行な う と い う こ と に な り 、 例え ば、 水性溶媒中で p H 6 . 0 〜 8 . 0 の範囲で、 よ り 好 ま し く は p H 7 . 5 前後で、 温度 2 5 〜 4 0 で の範囲で、 よ り 好 ま し く は 3 7 で前後で、 3 0 分〜 2 時間、 生理活性蛋 白質、 ァ ミ ノ 基供与体及び ト ラ ン ス グル タ ミ ナ ー ゼを保持す る こ と であ る 。 こ の反応に お い て、 生理活性蛋 白 の 濃度 は 1 〜 3 0 Mの 範囲が望 ま し く 、 ア ミ ノ 基供与体の濃度 は 1 0 0 u M〜 3 0 m Mの範囲が望 ま し い。 生理活性蛋 白質 と ァ.ミ ノ 基供与体 と の澳 度比は 1 ： 1 0 0 〜 1 ： 5 0 0 0 の範囲、 よ り 好 ま し く は 1 ： 5 0 0 〜 1 ： 1 0 0 0 の範囲力くよ い。 ま た、 ト ラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼの使用量 は 、 蛋 白質 l m m o 1 当 り 0 . 1 〜 1 0 ュ ニ ッ ト で あ る 。

か く し て得 ら れ た ア ミ ノ 基供与体で修飾 さ れた生理活性蛋 白 質を水性溶媒 よ り 単離、 精製す る に は、 当業界 に 周知の透析、 ゲ ル濂過、 イ オ ン交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 等の方法を適宜組み 合わせて行え ばよ い。

さ ら に、 蛋白 質の修飾位置を 同定す る 方法 と し て は 、 例え ば 凍結乾燥 し た ァ ミ ノ 基供与体修飾蛋 白質を変性剤存在下、 C y s 残基を モ ノ ョ ー ド酢酸で カ ルボキ シ メ チ ル化 し た後、 ト リ ブ シ ン な どの酵素に よ り 加水分解 し 、 分解 し た ぺ プチ ド を逆相 H P L C 、 あ る い は キ ヤ ビ ラ リ ー電気泳動に よ り べ プチ ド マ ッ プ を作製す る 。 未修飾蛋白質に つ い て も 同条件でペ プチ ド マ ッ プ を作製 し 、 各べ プチ ド ピ ー ク を比絞す る こ と に よ り 修飾 さ れた ペ プチ ド繽及び G 1 n 残基を決定す る こ と がで き る 。

(図面の簡単な 説明）

図 1 は、 融合蛋 白質 r S P — I L 一 2 発現 プ ラ ス ミ ド p T S P — I L 一 2 の構築を示す （実施例 1 ) 。

図 2 A は、 実施例 7 に 含 ま れ る 反応を示す。

図 2 B は、 実施例 7 に含 ま れ る 反応を示す。

図 2 C は、 実施例 7 に 含 ま れ る 反応を示す。

図 2 D は、 実施例 7 に 含 ま れ る 反応を示す。

図 2 E は、 実施例 7 に 含 ま れ る 反応を示す 図 3 A は、 実施例 1 9 に お け る 結果を示す。

図 3 B は、 実施例 1 9 に お け る 結果を示す。

図 4 は、 r S P - I L — 2 誘導体の体内動態を示す （実施例

2 1 )

(発明 を実施す る た めの最良の形態）

以下、 実施例 に よ り 本発明 を更 に説明す る

実施例 1 ( 融 合 蛋 白 質 r S P - I L 一 2 直接発現 プ ラ ス ド'

p T S P I L 一 2 の構築及 びそ の生産）

ト リ プ ト フ ァ ン プ ロ モ ー タ ー P P Z O を配铕 し た発現 ベ ク タ ー に h I L - 2 c D N A を組み込ん だ発現 プラ ス ミ ド p T 1 3 S N c 0 ( E. c 0 I i FERM P- 10757 ) を制限酵素 C l a l 及び N co l で切断 し 、 大 き い ほ う の フ ラ グ メ ン ト と 生理活性べ プチ ドであ る サ ブ ス タ ン ス 一 P ( S P ) を基 に し た ア ミ ノ 酸 K 列 （ M e A r g - P r o - L y s - P r o - G l n - G n - P h e - P h e - G l y - L e u ) 由来の塩基配列 を有す る 合成 D N A ( ⁵ C G T T A A A T G C G T C C A A A A C C G C A G C A G T T C T T C G G T C T と ⁵ C A T G A G A C C G A A G A A C T G C T G C G G T T T T G G A C G C A

T T T A A ³' ) と を T 4 D N A リ ガ 一 ゼ を 使 っ て 結 合 さ せ た WO 96/06181 一 ₂ g 一 PCT/JP95/00298

(図 1 参照） 。 該プ ラ ス ミ ド溶液 1 5 m L を 氷冷 し た大腸菌 H B 1 0 1 ( A T C C 3 3 6 9 4 ) 株の コ ン ビ テ ン ト 細胞懸 ¾ 液 l O O u L と 緩やかに混合 し 、 氷浴中 に て 3 分間静置 し た後 4 2 の温浴中で 9 0 秒間熱処理を行な っ た。 そ の後、 再び氷 浴中で 2 分間静置 し た後、 そ の懸濁液を 3 m L の 2 X T Y 培地

( 1 . 6 % ト リ プ ト ン 、 1 %酵母エ キ ス 、 0 . 5 % N a C l ) の 中へ加え、 3 0 で 6 0 分間静置培養 し た。

こ の培養菌体液 1 0 0 L を ア ン ピ シ リ ン （ l O O /u g Z m L ) を含む L B 寒天培地 （ 1 % ト リ プ ト ン 、 0 . 5 %酵母ェキ ス 、 0 . 5 % N a C l ) プ レ ー ト に散布 し 、 3 0 °Cで 一晚培養 し た後、 出現す る ア ン ピ シ リ ン耐性 コ ロ ニ ー を拾 い 、 再度ア ン ピ シ リ ン を含む同寒天 プ レ ー 卜 に散布 し 、 r S P — I L — 2 生 産菌 （ E . c o l i H B l O l Z p T S P I L — 2 で あ っ て 工業技術院生命工学工業技術研究所へ受託番号 F E R M P - 1 4 3 6 9 を以 つ て平成 6 年 6 月 1 4 曰 に 寄託 し 、 そ の後平成 7 年 2 月 2 3 日 付を以て ブ タ ぺ ス ト 条約 に よ る 国際寄託に転換

(受託番号 F E R M B P — 5 0 1 3 ) 済） を得 た。 な お、 取 得 し た菌体か ら プ ラ ス ミ ド D N A を単離精製 し 、 制限酵素マ ツ ビ ン グ及 び D A N 塩基配列検定に よ り 目 的の p T S P I L - 2 - i で あ る こ と を確認 し た。

r S P — I L — 2 (す な わ ち 、 I L 一 2 の N末端 に サ ブ ス タ ン ス P ( S P ) の ア ミ ノ 酸配列 を 有す る 融合蛋 白 質） の生産 は 以下の よ う に し て行 な っ た。

す な わ ち 、 r S P — I L 一 2 生産菌 （ E . c o l i H B I O I Z P T S P I L — 2 、 す な わ ち 、 E . c o l i F E R M B P — 5 0 1 3 ) を 2 x T Y培地で 2 8 で一晩培養 し た 後、 こ の培養液 1 0 m L を ア ン ピ シ リ ン （ 1 0 0 ii/ g / m L ) L 一 口 イ シ ン （ 2 0 0 / g Z m L ：) 、 L 一 プ ロ リ ン （ 2 0 0 g / m L ) 及 び チ ア ミ ン 塩酸塩 （ 2 . 0 ^ g / m L ) を 含 む M 9 カ ザ ミ ノ 酸混合培地 （ N a n H P O 0 . 6 % . K H ₂ P 0 ₄ 0 . 3 % 、 N a C 1 0 . 0 5 % ^ N H ^ C 1 0 . 1 % . M g S 0 ₄ 2 m M 、 グ ル コ ー ス 0 . 2 % 、 C a C 1 ₂ 0 . l m M及 び カ ザ ミ ノ 酸 0 . 2 % ) 1 0 0 m L に接 種 し 、 2 8 °Cで振通培養 を行な っ た。 フ ラ ス コ 培養の 開始 9 時 間後、 イ ン ド ー ル ア ク リ ル酸 （ I A A ) を終濃度 2 5 ;i/ g Z m L に な る よ う に 添加 し 、 さ ら に 3 1 . 5 °Cで 1 4 時間培養を続 け た。

培 養 液 の 一 部 を 取 り 、 位 相 差 顕 微 鏡 （ 倍 率 1 0 0 0 〜 WO 96/06181 一 _{2 g} ― PCT/JP95/00298

1 5 0 0 ) で菌体の様子を観察 し 、 細長 く 伸長 し た形態の大腸 菌体内 に顆粒状の封入体を確認 し た。 そ の後、 培養液を遠心分 離 （ 8 0 0 0 r p m、 5 分間） に付 し 、 菌体を集め て凍結 し た 集菌 し た菌体を 3 0 m M N a C l を含む 2 0 m M ト リ ス ー 塩酸緩衝液 （ P H 8 . 0 ) に 懸 ¾ し 、 卵 白 リ ゾチ ー ム を終澳度 0 . 2 m g Z m L に な る よ う に添加 し た。 氷中 1 時間放置 し 、 菌体を ス フ エ ロ プ ラ ス ト 化 し た。 次に 、 超音波破砕処理を施 し 菌体か ら 封入体を取 り 出 し た。 続い て遠心分離 （ 6 0 0 0 r p m、 1 5 分 間 ） に よ り 不溶性画 分 を 得 た 。 そ の 不溶性画分 に 1 0 m M E D T A ( p H 6 . 0 ) を加え て沈濺を懸濁 し 、 リ コ ン ビ ナ ン ト S P — I L — 2 ( r S P — I L — 2 ) の封入体懸 濁液 と し た。 該懸濁液 に 8 M塩酸 グァ ニ ジ ン を含む 2 O m M ト リ ス 一 塩酸緩衝液 （ p H 8 . 0 ) を添加 し 、 溶液中の塩酸 グ ァ 二 ジ ン 濃度を 6 Mに調整 し 、 室温に て 3 0 分間放置 し て r S P 一 I L — 2 を可溶化 し た。

可溶化 し た r S P — I L 一 2 溶液を 1 O m M還元型 グ ル 夕 チ オ ン及び I m M酸化型 ダ ル 夕 チ オ ン を含む 2 O m M ト リ ス 一 塩 酸緩衝液 （ P H 8 . 0 ) に 、 蛋 白 質濃度が 5 0 〜 ； L O O g Z m L と な る よ う に調製 し た。 室温下、 一晩放置す る こ と に よ り WO 96/06181 _ 2 g _ PCT/JP95/00298

r S P — I L — 2 の立体構造を再生 さ せ た。 な お、 変性蛋 白質 か ら の分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合形成 は、 逆相 H P L C を用 い た 蛋 白質の溶出位置の移動確認 に よ り 行 つ た。

該 r S P - I L 一 2 の可溶化溶液を 5 O m M酢酸緩衝液 （ p H 6 . 0 ) で あ ら か じ め平衡化 し た 「 S e p h a d e x G - 2 5 」 カ ラ ム に ア プ ラ イ し 、 同緩衝液 に て溶出 し た。 溶出液を 2 8 0 n m の吸光度でモ ニ タ ー し な が ら 変性剤が除去 さ れた 融 合蛋 白 質の溶出画分を得 た。 該溶出画分を 「 C M — S e p h a r o s e 」 カ ラ ム を用 い、 5 0 m M舴酸緩衝液 （ p H 6 . 0 ) に て r S P — I L — 2 を吸着 さ せ、 カ ラ ム 洗浄の後、 同 じ p H に て塩 «度を 5 0 O m M に上昇 さ せ る こ と に よ り グ ラ ジ ェ ン ト 溶出 し た。 上記 2 8 0 n m に て吸収を示す溶出画分を 「 Y M C - C ₈ A P 」 カ ラ ム （ 3 0 0 x 1 O m m 、 山村化学社製） を用 い た精製を行 っ た後、 再び 「 S e p h a d e x G — 2 5 」 力 ラ ム に よ り 保存用 緩 衝液 で あ る 0 . 2 5 M の N a C 1 を 含 む 5 O m M酢酸緩衝液 （ p H 5 . 0 ) 〖こ 置換 し た。

精製物の純度 に つ い て は 「 P h a s S y s t e m 」 （ P h a r m a c i a 社） に よ る S D S — P A G E ( 「 H o m o g e n i o u s 2 0 」 ゲル使用） に よ り 分析 し た結果、 精製物 は不溶性顆粒中の蛋 白 質の う ち の主生成物由来のバ ン ド の みで あ り 、 r h I L — 2 (すな わ ち 、 リ コ ン ビ ナ ン ト ヒ ト I L — 2 ) に対 し約 l K D a 程度分子量が増大 し て い た。 さ ら に 、 精 製物 の N — 末端 ァ ミ ノ 酸配列 を ェ ド マ ン 分解 に よ り 分析 し た 結果 、 h I L 一 2 の N - 末端側 に 目 的 の ア ミ ノ 酸配列 が付加 し た構造で あ る こ と を確認 し た。 ま た、 蛋白質濃度 につ い て は

S P - I L 一 2 の 2 8 0 n m に お け る モ ル吸光係数を 2

X 1 0 M— ' c m — ¹と し て換算 し た （蛋 白質収率約 2 0 % ) 。 実施例 2 (融合 蛋 白 質 r X l — I L 一 2 直接発現 プ ラ ス ミ ド

p T X l I L — 2 の構築及 びそ の生産） ： 実施例 1 の 方法 に 従 っ て 、 ト リ ブ ト フ ァ ン プ ロ モ ー タ ー t r p P Z O を配備 し た発現ベ ク タ ー に h i L — 2 c D N A を 組み込ん だ発現プラ ス ミ ド p T l 3 S N coを制限酵素 C l a l 及 び N co l で切断 し 、 大 き い ほ う の グ メ ン ト M e t A g - P r o - L y s - P r o - G l n - G 1 n - P h e - M e t 由来の塩基配列 を 有す る 合成 D N A ( ⁵ C G T T A A A T G C G T C C A A A A C C T C A G C A G T T ³ と C A T G A A C T G C T G A G G T T T T G G A C G C A T T T A A ³ ) を T 4 D N A リ ガ ー ゼを使 っ て結合 さ せ た。 得 ら れた プ ラ ス ミ ド p T X l I L — 2 を大腸菌 H B 1 0 1 ( A T C C 3 3 6 9 4 ) 株へ導入 し 、 ア ン ピ シ リ ン抵抗性を有す る コ ロ ニ ー を選 択 し た。 選択 し た コ ロ ニ ー を制限酵素に よ る 切断試験及 び結合 部位付近の塩基配列の決定を行な う こ と に よ り 、 p T X l I L 一 2 を保持す る 菌を選定 し た （ E . c o 1 i H B l O l / p T X 1 I L 一 2 で あ っ て 、 工業技術院生命工学工業技術研究所 へ受託 番号 F E R M P - 1 4 3 6 8 を 以 つ て平成 6 年 6 月 1 4 曰 に寄託 し 、 そ の後平成 7 年 2 月 2 3 日 付を以て ブ 夕 ぺ ス ト 条約 に よ る 国際寄託に転換 （受託番号 F E R M B P - 5 0 1 2 ) 済） 。

リ コ ン ビ ナ ン ト X 1 L - 2 ( r X 1 - I L - 2 (す な わ ち 、 I L 一 2 の N末端に M e t — A r g — P r o — L y s — P r o — G 1 n — G 1 n - P h e - M e t の ア ミ ノ 酸配列 を有す る 融合蛋 白質） ） の生産 も 、 実施例 1 の方法に従 っ て行な っ た 精製物の純度を 「 P h a s S y s t e m」 ( P h a r m a c i a 社） に よ る S D S — P A G E ( 「 Homogen i oiis 2 0 」 ゲ ル使用） に よ り 分析 し た結果、 精製物は r h I L — 2 に対 し 約 0 . 5 K D a 程度分子量が增大 し た位置 に の み蛋 白質.由来のバ ン ドが確認 さ れた。 さ ら に 、 精製物の N — 末端 ァ ミ ノ 酸配列を エ ドマ ン分解 に よ り 分析 し た結果、 h I L — 2 の N — 末端側 に 目 的の ァ ミ ノ 酸配列が付加 し た構造で あ る こ と を確認 し た。 ま た、 蛋 白質濃度 に つ い て は r X l — I L 一 2 の 2 8 O n m に於 け る モ ル吸光係数を 1 . 2 X 1 0 ⁴ M — i c m — ¹と し て換算 し た (蛋白質収率約 2 0 % ) 。

実施例 3 (融 合 蛋 白 K r X 2 - I L 一 2 直接発現 プ ラ ス ミ ド

P T X 2 I L 一 2 の構築及びそ の生産）

実施例 1 の方法 に従 っ て、 ト リ ブ ト フ ァ ン プ ロ モ ー タ ー t r p P Z O を配備 し た発現ベ ク タ ー に h i L — 2 c D N A を 組み込ん だ発現 プラ ス ミ ド p T l 3 S N を制限酵素 C l a l 及 び N co l で切断 し 、 大 き い ほ う の フ ラ グ メ ン ト と M e t — P r o - L y s - P r o - G l n - G 1 n - P h e - M e t 由来の 塩基配列を有す る 合成 D N A ( ⁵ C G T T A A A T G C C A A

A A C C T C A G C A G T T 3' , 5

C A T G A A C T G C T G

A G G T T T T G G C A T T T A A ³ ) と を T 4 D N A リ ガ一 ゼを使 っ て結合 さ せ た。 得 ら れた プ ラ ス ミ ド p T X 2 I L - 2 を大腸菌 H B 1 0 1 株 （ A T C C 3 3 6 9 4 ) へ導入 し 、 ァ ン ピ シ リ ン抵抗性を有す る コ ロ ニ ー を遍択 し た。 選択 し た コ ロ ニ ー を制限酵素に よ る 切断試験及び結合部位付近の塩基配列の 決定を行な う こ と に よ り 、 P T X 2 I L — 2 を保持す る 菌を遷 定 し た （ E c o l i H B 1 0 1 Z p T X 2 I L — 2 であ て、 工業技術院生命工学工業技術研究所へ受託番号 F E R M P — 1 4 3 7 0 を以 つ て平成 6 年 6 月 1 4 日 に 寄託 し 、 そ の後 平成 7 年 2 月 2 3 日 付を以て ブ タ ぺ ス ト 条約に よ る 国際寄託に 転換 （受託番号 F E R M B P — 5 0 1 4 ) 済） 。

リ コ ン ビ ナ ン ト X 2 — I L — 2 ( r X 2 - I L - 2 ) (す な わ ち 、 I L 一 2 の N 末端 に M e t — P r o — L y s — P r o — G 1 n - G 1 n - P h e — M e t の ア ミ ノ 酸 E列 を有す る » ^ 蛋白質） の生産 も 、 実施例 1 の方法に従 っ て行な っ た。 精製物 の純度を 「 P h a s S y s t e m」 P h a r m a c i a 社） に よ る S D S — P A G E ( 「 Honioge n i oii s 2 0 J ゲル使用） に よ り 分析 し た結果、 精製物 は r h I L — 2 に対 し約 0 . 5 K D a 程度分子量が增大 し た位置 に の み蛋 白質由来の バ ン ドが確 認 さ れた。 さ ら に 、 精製物の N — 末端 ア ミ ノ 酸配列 を エ ドマ ン 分解に よ り 分析 し た結果、 11 1 1^ ー 2 の ？^ ー 末端側 に 目 的の ァ ミ ノ 酸配列が付加 し た構造であ る こ と を確認 し た。 ま た、 蛋白 質濃度 に つ い て は r X 2 — I L 一 2 の 2 8 0 n m に 於 け る モ ル 吸光係数を 1 . S x l O ^ M —i c m —¹と し て換算 し た （蛋 白質 収率約 2 0 % ) 。

実施例 4 ( 融 合 蛋 白 質 r X 3 - I L 一 2 直接発現 プ ラ ス ミ ド

P T X 3 1 L - 2 の構築及びそ の生産） ：

実施例 1 の 方 法 に 従 っ て 、 ト リ ブ ト フ ァ ン プ ロ モ ー タ ー t r p P / O を配備 し た発現ベ ク タ ー に h i L — 2 c D N A を 組み込んだ発現 プ ラ ス ミ ド p T l 3 S N C Qを制限酵素 C l i l 及 び N c o l で切断 し 、 大 き い ほ う の フ ラ グ メ ン ト と M e t - L y s — P r o — G l n - G 1 n - P h e - M e t 由来の塩基配列 を有す る 合成 D N A ( ^J C G T T A A A T G A A A C C T C A

G C A G T T 3' , 5' C A T G A A C T G C T G A G G T T T C

A T T T A A ³ ) と を T 4 D N A リ ガ ー ゼを使 っ て結合 さ せ た 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド p T X 3 I L — 2 を 大腸菌 H B 1 0 1 株 ( A T C C 3 3 6 9 4 ) へ導入 し 、 ア ン ピ シ リ ン抵抗性を有 す る コ ロ ニ ー を運択 し た。 邁択 し た コ ロ ニ ー を制限酵素に よ る 切断試験及び桔合部位付近の塩基配列の決定を行な う に よ り 、 p T X 3 I L — 2 を保持す る 菌を選定 し た （ E . c o l i H B 1 0 1 / p T X 3 I L — 2 で あ っ て、 工業技術院生命ェ 学工業技術研究所へ受託番号 F E R M P - 1 3 7 3 を以 っ て平成 6 年 6 月 1 4 日 に 寄託 し 、 そ の 後平成 7 年 2 月 2 3 日 付 を以て ブ タ ペ ス ト 条約に よ る 国際寄託に転換 （受託番号 F E R

M B P — 5 0 1 7 ) 済）

リ コ ン ビ ナ ン ト X 3 — I L — 2 ( r X 3 - I L - 2 ) (す な わ ち、 I L — 2 の N末端 に M e t — L y s — P r o — G i n — G 1 n - P h e - M e t の ア ミ ノ 酸配列を有す る 融合蛋白 質） の生産 も 、 実施例 1 の方法 に従 っ て行な っ た。 精製物の純度を

Γ P h a s S y s e m ( P h a r m a c i a 社） に よ る S D S — P A G E ( 「 H o m o g e n i M S 2 0 」 ゲル使用） に よ り 分析 し た結果、 精製物 は r h I L — 2 に対 し約 0 . 5 K D a 程 度分子量が增大 し た位置 に の み蛋白質由来のパ ン ドが確認 さ れ た。 さ ら に、 精製物の N — 末端ア ミ ノ 酸配列 を エ ド マ ン分解 に よ り 分析 し た結果、 h I L — 2 の N — 末端側 に 目 的の ア ミ ノ 酸 配列が付加 し た構造であ る こ と を確認 し た。 ま た、 蛋白 質濃度 に つ い て は r X 3 — I L — 2 の 2 8 0 n m に於 け る モ ル吸光係 数を 1 . 2 x l 0 ⁴ M— i c m — ¹と し て換算 し た （蛋 白質収率約 2 0 % ) 。

実施例 5 ( 融 合 蛋 白 質 r X 4 — I L — 2 直接発現 プ ラ ス ミ ド

P T X 4 I L — 2 の構築及びそ の生産） ： 実施例 1 の方法に 従 っ て、 ト リ ブ ト フ ァ ン プ ロ モ ー タ ー t r p P Z O を配備 し た発現ベ ク タ ー に h i L — 2 c D N A を 組み込んだ発現プ ラ ス ミ ド p T l 3 S N coを制限酵素 C l i l 及 び N co l で切断 し 、 大 き い ほ う の フ ラ グ メ ン ト と M e A 1 a — L e u — T r p — G 1 n - P h e - A r g - M e t 由来の 壇基配列を有す る 合成 D N A ( 5' C G T T A A A T G G C T C T G T G T G G C A G T T T C G " と ⁵ C A T G C G A A A C T G C C A C A G A G C C A T T T A A ³ ) と を T 4 D N A リ ガ ー ゼを使 っ て結合 さ せ た。 得 ら れた ブ ラ ス ミ ド p T X 4 I L 一 2 を大腸菌 H B 1 0 1 株 （ A T C C 3 3 6 9 4 ) へ導入 し ア ン ピ シ リ ン 抵抗性を有す る コ ロ ニ ー を選択 し た。 選択 し た コ ロ ニ ー を制限酵素に よ る 切断試験及 び結合部位付近の塩基配列 の決定を行な う こ と に よ り 、 p T X 4 I L — 2 を保持す る 菌を 邁定 し た （ E . c 0 1 i H B 1 0 1 Z p T X 4 I L — 2 であ つ て 、 工業技術院生命工学工業技術研究所へ受託番号 F E R M

P — 1 4 3 7 1 を以 つ て平成 6 年 6 月 1 4 日 に 寄託 し 、 そ の 後平成 7 年 2 月 2 3 日 付を以て ブ タ ぺ ス ト 条約 に よ る 国際寄託 に 転換 （受託番号 F E R M B P — 5 0 1 5 ) 済） 。

リ コ ン ビ ナ ン ト X 4 — I L — 2 ( r X 4 - I L - 2 ) (す な わ ち 、 I L — 2 の N 末端 に M e t - A 1 a — L e u — T r D _ G 1 n - P h e — A r g - M e t の ア ミ ノ 酸配列を有す る 融合 蛋白 K) の生産 も 、 実施例 1 の方法に従 っ て行な っ た。 精製物 の純度を 「 P h a s S y s t e m」 ( P h a r m a c i a 社） に よ る S D S — P A G E ( r Homogeni ou s 2 0 J ゲル使用） に よ り 分析 し た桔果、 精製物 は r h I L — 2 に対 し 約 0 . 5 K D a 程度分子量が増大 し た位置 に の み蛋 白質由来のバ ン ドが確 認 さ れた。 さ ら に、 精製物の N — 末端ア ミ ノ 酸配列 をエ ド マ ン 分解 に よ り 分析 し た結果、 h 〖 L 一 2 の N — 末端側 に 目 的の ァ ミ ノ 酸配列が付加 し た構造で あ る こ と を確認 し た。 ま た、 蛋白 質濃度に つ い て は r X 4 — I L 一 2 の 2 8 0 n m に於け る モ ル 吸光係数を 1 . 7 5 x l 0 ⁴ M— i c m —¹と し て換算 し た （蛋 白 質収率約 2 0 % ) 。

実施例 6 ( 融合 蛋 白 質 r X 5 — I L 一 2 直接発現 プ ラ ス ミ ド p T X 5 I L 一 2 の構築及びそ の生産）

実施例 1 の方法に従 っ て、 ト リ ブ ト ン プ ロ モ ー タ ー p P Z O を配備 し た発現ベ ク タ ー に h i L — 2 c D N A を 組み込ん だ発現 プ ラ ス ミ ド p T 1 3 S N coを制限酵素 C l a l 及 び N co l で切断 し 、 大 き い ほ う の フ ラ グ メ ン ト と M e t - A 1 a - G 1 n - G 1 n — I I e - V a 1 — M e t 由来の塩基配列 を有す る 合成 D N A ( ⁵ C G T T A A A T G G C T C A G C A G A T C G T ^u と ⁵ C A T G A C G A T C T G C T G A G C C A T T T A A ³' ) と を T 4 D N A リ ガ ー ゼを使 っ て結合 さ せ た 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド p T X 5 I L 一 2 を大腸菌 H B 1 0 1 株

( A T C C 3 3 6 9 4 ) へ導入 し 、 ア ン ピ シ リ ン抵抗性を有 す る コ ロ ニ ー を選択 し た。 選択 し た コ ロ ニ ー を制限酵素に よ る 切断試験及び桔合部位付近の塩基配列の決定を行な う こ と に よ り 、 p T X 5 I L — 2 を保持す る 菌を選定 し た （ E . c o l i H B 1 0 1 / p T X 5 I L — 2 であ っ て、 工業技術院生命ェ 学工業技術研究所へ受託番号 F E R M P - 1 4 3 7 2 を以 っ て平成 6 年 6 月 1 4 曰 に寄託 し 、 そ の後平成 7 年 2 月 2 3 日 付 を以て ブ タ ペ ス ト 条約に よ る 国際寄託に転換 （受託番号 F E R M B P — 5 0 1 6 ) 済） 。

リ コ ン ビ ナ ン ト X 5 — I L 一 2 ( r X 5 - I L - 2 ) (すな わ ち 、 1 1^ ー 2 の 11 末端に ^1 6 t - A 1 a - G 1 n - G 1 n -

I 1 e - V a 1 - M e t の ア ミ ノ 酸配列 を有す る 融合蛋 白質） の生産 も 、 実施例 1 の方法 に従 っ て行な っ た。 精製物の純度を r P h a s t S y s t e m 」 ( P h a r m a c i a 社 j よ る S D S — P A G E ( 「 Homoge n i (tu s 2 0 」 ゲ ル使用） に よ り 分析 し た 結果、 精製物 は r h I L — 2 に 対 し 約 0 . 5 K D a 程度分子量が増大 し た位置 に のみ蛋白 質由来のバ ン ドが確認 さ れた。 さ ら に 、 精製物の N — 末端ア ミ ノ 酸配列を エ ド マ ン 分解 に よ り 分析 し た結果、 h 1 L 一 2 の N — 末端側 に 目 的の ア ミ ノ 酸配列が付加 し た構造で あ る こ と を確認 し た。 ま た、 蛋 白質濃 度 につ い て は r X 5 - I L 一 2 の 2 8 0 n m に於 け る モ ル吸光 係数を 1 . 2 x l 0 ⁴ M— i c m — ¹と し て換算 し た （蛋白 質収率 約 2 0 % ) 。

実施例 7 (合成例） ：

本実施例 に含 ま れ る 反応を 図 2 A 〜図 2 E に示す。

( a ) 化合物 の 合成

5 — ァ ミ ノ 一 ペ ン 夕 ノ ー ル （ 1 0 g ) を ジ ク ロ ロ メ タ ン

( 6 0 m l に溶解 し 、 N — メ チ ル モ ル ホ リ ン を 当量 （ 9 . 0

3 m l ) 加え て氷浴中で冷却 し た後、 反応液に ジ ブ チ ル カ ル ボネ ー ト （ 2 5 . 4 g ) を加え 、 室温で 2 4 時間撹拌 し た 反応液を ジ ク ロ ロ メ タ ン で希釈 し 、 水洗 し 、 乾燥後溶媒を滅圧 下留去 し た。 残渣を シ リ カ ゲル （ 1 5 0 g ) を用 い る カ ラ ム ク 口 マ ト グ ラ フ ィ ー （へ キ サ ン — 酢酸ェ チ ル 3 ： 2 ) で精製 し 、 化合物 ( 9 . 0 g ) を無色油状物 と し て得 た I R ( C H C 1 ₃ ) : 3 4 5 6 , 0 8 c m - 1

¹ H - N M R ( C D C 1 , ) δ ： 3. 65 (2H, t, 】 = 6. 5H z 3. 16

- 3. 08 (2H, n: 64 - 1. 56 ( 2 H, ra) , 1. 54 - 1. 46 ( 2 H , n) ,

1. 4 (9H, s) , 1. 3 - 1. 35 ( 2 H, m)

( b ) 化合物 1 一 2 の 合成

化合物 ( 5 . 0 g ) を ア ル ゴ ン ガ ス 雰囲気下で乾燥 卜 ラ ヒ ド ロ ン （ 1 0 0 m l ) に 溶解 し 、 フ タ ル イ ミ ド

( 3 . 8 g ) を加え て水浴で冷却 し た。 反応液 に ト リ フ ヱ ニ ル フ ォ ス フ ィ ン （ 7 . 7 g ) と ジ イ ソ プ ロ ピ ル ァ ゾ ジ カ ル ボ キ シ レ ー 卜 （ 5 . 8 m l ) を加え、 室温で 1 2 時間攬拌 し た。 反応 液 を ク ロ 口 ホ ル ム で希釈 し 、 溶媒 を 滅圧下留去 し た 。 残渣 を シ リ カ ゲ ル （ 4 5 0 g ) を 用 い る カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

( 卜 ノレ ェ ン 一 酢酸ェ チ ル 1 0 ) で精製 し 、 化合物 1 一 2

( 8 . 4 g ) を 白色粉末 と し て得た

I R ( K B r ) ： 3 3 5 4 . 7 6 , 1 7 2 2 . 1 6 7 4 7 2 3 c m " ¹.

1 H - N M R ( C D C 1 J ) δ ： 7. 85 - 7. 83 ( 2 Η , m) , 1. 11

7. 70 (2H, π) , 3. 69 (2Η, t, J = 7. 2H z) , 3. 14 - 3. 06 ( 2 H , m 1. - 1. 66 (2H, in) , 1. 57 - 1. 49 (2H, ro) 。 ( c ) 化合物 3 の 合成 化 合 物 2 ( 4 . O g ) を 乾燥 エ タ ノ ー ル （ 3 2 m l ) に 溶解 し た 後 、 冷却下還流 し た 。 反 応液 に ヒ ド ラ ジ ン 水化物 ( 0 . 8 3 m l ) を添加 し 、 6 時間通流を続け た。 冷却後沈澱 を «過 し 、 滅液を減圧下濃縮 し た。 残渣に ク ロ 口 ホ ル ム 及 び 1 N 水酸化ナ ト リ ウ ム を加え 、 水洗 し 、 乾燥後、 溶媒 を減圧下留 去 し 、 化合物 1 一 3 ( 2 . 4 5 g ) を薄黄 色 の油状物 と し て得 た

I R ( C H C 1 ₃ ) ： 3 4 5 6 , 1 7 0 8 c m "¹.

1

H - N M R ( C D C 1 ₃ ) δ 3. 35 - 3. 05 ( 2 Η , Β) , 2. 69 (2

H, t, J = 7. OH z) , 1. 55 - 1. 30 ( 6 H, m) , 1. 44 (9H, s) 。 ( d ) 化合物 1 — 4 及 び 1 — 5 の 合成 メ ト キ シ ポ リ オ キ シ エ チ レ ン グ リ コ 一 ノレ酸 （ 5 g 、 平均分子 量 5 0 0 0 、 日 本油脂 （株） 製） を乾燥 ジ ク ロ ロ メ タ ン （ 2 5 m 1 ) に溶解 し 、 1 ー ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ア ゾ 一 ル （ 0 . 1 7 5 g ) 及 び ジ シ ク ロ へ キ シ ル カ ル ポ ジ イ ミ ド （ 0 . 2 8 9 g ) を順次加え 、 ア ル ゴ ン ガ ス雰囲気下、 室温で 1 2 時間撹拌 し て 化合物 4 を生成 さ せ た。 こ の化合物 1 一 4 は単離せず、 そ の反応液に 化合物 3 ( 0 . 5 g ) を加え 、 ア クレ ゴ ン ガ ス棼 囲気下、 室温で 1 2 時間撹拌 し た。 溶媒を減圧下留去 し 、 残渣 を シ リ カ ゲ ル （ 4 5 0 g ) を用 い る カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

( ジ ク ロ ロ メ 夕 ン ー メ 夕 ノ ー ル 一 水 0 ： 3 ： 1 ) で精製 し 化合物 1 — 5 ( 1 . 9 4 g ) を 白色粉末 と し て得 た

I R ( K B r ) ： 3 5 2 7 . 2 8 8 3 , 1 4 c m

¹ H - N M R ( C D C 1 ₃ ) δ ： 3. 98 (2 Η, s ) , 3. 72— 3. 59 (559 Η, m) . 3. 38 (3H, s) , 3. 31 - 3. 26 (2H, in ) , 3. 1 - 3. 07

(2H， m) , 1. 56 - 1. 30 ( 6 H, m 1. 44 (9H, s

( e ) 化合物 6 の 合成

化合物 1 一 5 ( 7 2 g ) を ト リ フ ル ォ ロ 酢酸 （ 7 m l ) に溶解 し 、 室温で 1 2 時間撹拌 し た。 反応液を減圧下留去 し た 後、 残渣に メ タ ノ ー ルを加え、 ナ ト リ ウ ム メ ト キ サ イ ド で中和 し た。 再度反応液を滅圧下濃縮 し 、 残渣を シ リ カ ゲ ル （ 4 5 0 g ) を 用 い る カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ ジ ク ロ ロ メ タ ン 一 メ タ ノ ー ル 一 水 0 ： 3 ) で 精 製 し 、 化 合 物 6

( 3 g ) を 白色粉末 と し て得 た

I R ( C H C 】 ₃ ) ： 2 8 8 0 , 1 6 8 1 , 4 0 ， 0 9

9 c m

1

H - N M R ( C D C 1 , ) δ ： U 8 (2 H, s ) ， 3. U - 3. 59 (545 H, m) , 3. 39 (3H, s) , 3. 34 - 3. 28 ( 2 H, m) , 3. 02— 2. 94

(2H, m) , 1. 62 - 1. 55 ( 2 H, m) , 1. 29— 1. 22 ( 2 H, m:

( f ) 化 合物 2 及 び 2 — 2 の 合成

メ ト キ シ ポ リ オ キ シ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 酸 （ 5 g 、 平 均 分 子 量 1 0 0 0 0 、 日 本油脂 （株） 製 ） を 乾燥 ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド （ 8 m l ) に 溶 解 し 、 N — ヒ ド ロ キ シ コ ハ ク 酸 イ ミ ド （ 0 . 0 7 5 g ) 及 び ジ ク ロ ロ へ キ シ ノレ 力 ノレ ポ ジ イ ミ ド ( 0 . 1 3 g ) を 順 次 加 え 、 ア ル ゴ ン ガ ス 雰 囲 気 下 、 室 温 で

2 時 間撹拌 し て'化 合物 2 - 1 を 生成 さ せ た の 化 合物 2 — は 単離せ ず、 の 反 応液 に 化 合物 3 ( 0 . 2 2 g ) を 加 え 、 ア ル ゴ ン ガ ス 棼 囲 気下、 室温で 1 2 時間 撹拌 し た 。 溶媒 を 減圧 下留 去 し 、 残渣 を シ リ カ ゲ ル （ 4 5 0 g ) を 用 い る 力 ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ ジ ク ロ ロ メ タ ン 一 メ タ ノ ー ル 一 水 0

3 ) で精製 し 、 化 合物 2 — 2 ( 3 . 7 g ) を 白 色粉 末 と し て 得 た

I R C C H C 1 3 4 4 0 , 2 8 9 5 0 9 c m

¹ H - N M R ( C D C 1 J ) δ ： 3. 98 (2 Η, s ) , 3. 74 - 3. 58 (1036 Η, m) , 3. 38 (3H, s) , 3. 32 - 3. 2 M2H, m) , 3. 16 - 3. 06

(2 H, m 1. 56 - 1. 26 ( 6 H, m 1. 4 (9H, s ( g ) 化 合物 2 - 3 の 合成

化 合物 2 — 2 ( 0 . 6 9 g ) を ト リ フ ル ォ ロ 酢酸 （ 6 m l ) に 溶解 し 、 室温 で 1 2 時間撹拌 し た 。 反 応液 を 減圧 下 濃縮 し た 後 、 残澶 に メ タ ノ ー ル を 加 え 、 ナ ト リ ウ ム メ ト キ サ イ ド で 中和 し た 。 再度 反 応液 を 減圧 下濃縮 し 、 残渣 を シ リ カ ゲ ル （ 1 2 0 g ) を 用 い る カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ ジ ク ロ ロ メ タ ン 一 メ タ ノ ー ル 一 水 0 ： 3 ) で 精 製 し 、 化 合 物 2 — 3

( 0 . 5 6 g ) を 白 色粉 末 と し て 得 た

I R ( C H C 1 J ) 2 8 8 0 , 1 6 7 9 , 3 8 ， 0 9

7 c m

1 H - N M R ( C D C 1 ₃ ) δ ： 4. 03 ( 2 Η, s ) , 3. 76 3. 52

(100 OH. n) , 3. 38 (3Η, s) ， 3. 33 - 3. 27 ( 2 H, m) , 3. 01 - 2. 95

(2Η, m) , 1. 56 - 1. 30 ( 6 Η, m:

h ) 化 合物 3 — 3 の 合 成

Bo c-G I B-OB I I (化 合物 3 - 1 , 4. 98 g ) と N - メ チ ル モ ノレ ホ リ ン （1 . 62mL)を テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン UOOmL) に 溶 か し 、 メ タ ノ ー ル . ド ラ イ ア イ ス で 冷 却 し 、 ク ロ 口 炭 酸 ェ チ ノレ （1. 4raL) を 加 え 、 - 30で で 5 分 間擅拌 し 、 液温 を 再度 -40で 以 下 と し 、 H-Gl ii (0B I 1 ) -0B z I - T 0 s 0H (化 合 物 3 - 2 , 7. 38 g ) と N — メ チ ル モ ル ホ リ ン ( 1. 62 m L )を含む ジ メ チ ルホ ル ム ア ミ ド （ 50 m L )溶液 を加え た。 冷 媒を外 し 、 食塩 と 氷で冷却 し て 1 晚擾拌 し た。 反応液を セ ラ イ ト を通 し て滅過 し 、 滅液を 濃縮 し 、 残渣を酢酸ェ チ ル に溶か し 10 % ク ェ ン酸水溶液、 飽和食塩水、 10 %炭酸水素ナ ト リ ゥ ム 水 溶液で洗い、 有機雇 を硫酸マ グ ネ シ ウ ム で乾燥 し た。 溶液を滅 過 し 、 溶媒を 溜去 し 、 9 g の固体を得た。 こ れを酢酸ェ チ ル Z メ タ ノ ー ルか ら 再結晶 し 、 8. (85 % ) を 得 た。

[ a ] _D = + 16. ド （ c - 0. 93, ク ロ 口 ホ ル ム ） .

I R (ク ロ ロ ホ ノレ ム ） c m— ¹ ： 1738 , 1500 , 1166.

1 H - N M R ( C D C 1 ₃ ) ： δ 7. 2 - 7. 3 ( 15 H, m) , 6. 41 (1 H, d, J = 7. OH i ) , 5. 25 (1 H, d, 】 = 7. 0H z) , 5. 0 - 5. 2 ( 6 H , m ) , 4. 62 - 4. 64 ( 1

H. m) , 4. 30 - 4. 35 ( 1 H, ni) , 2. 3 - 2. 5 ( 2 H , m ) , 2. 1 - 2. 25 ( H , ni ) ,

I. 98 - 2. 06 ( 1 H, Hi) , 1. 86 - 1. 94 ( 1 H, in) , 1. 4 (9 H, s ) 。

( i ) 化合物 3 - 5 の 合成

6 — ァ ミ ノ へ キ サ ン酸 （化合物 3 - 4, 10 g) を ジ ォ キ サ ン 一 水 ( 2 : 1 ) ( 2 {H m L) に 溶 か し 、 氷冷 し 、 1 N 水酸化 ナ ト リ ゥ ム 溶液 (70m L) と d i - t - プチ ル ジ カ ル ボ ネ ー ト （18. 3 g) を加え 、 室温で 1 晩攪拌 し た。 溶媒を溜去 し ， 1 N 塩酸で p H を 2 と し 、 ジ ク 口 ロ メ タ ン で抽 出 し た。 有機層 を 硫酸マ グ ネ シ ウ ム で乾燥 し 、 滅過 し 、 溶媒 を 溜 去 し て 、 化合物 （ 3- 5, 16. 5g)を 白 色固体 と し て 得 た

I R (ク ロ 口 ホ ル ム ） cm mO, 1510, 1166

¹ H - N M R ( C D C 1 ₃ ) ： δ 3. 15-3. 05 (2H, b r) , 2. 36 (2H, I, ] = 7. 5Hz) , 1. 66 (2fi, d t , I = 15H7, 1 = 1. 5Hz) , 1. 50 (2H, d t , J = 15H i, J = 7. 5Hz) , 1. 44 (9H, s) , 1. 42 - 1. 34 ( 2 H, m ) 。

( j ) 化 合物 3 - 6 の 合成

化 合物 3 — 3 (2. 0g)を ト リ フ ル ォ ロ 酢酸 （ 5mL) に 溶 か し 、 3 時間放 置 し た 。 溶媒 を 溜去 し 、 さ ら に エ タ ノ ー ル と 2 回 共沸 さ せ た 。 得 ら れ た 残渣 を メ タ ノ ー ル 5 m L に 溶 か し 、 N — メ チ ル モ ル ホ リ ン （330 Uで 中 和 し た 。 溶媒 を 溜去 し 、 ジ ク ロ ロ メ タ ン （50mL)に 溶 か し た 。 こ れ を A 液 と す る 。 化 合物 3 — 5 (700mi! ) と ジ ン ク ロ へ キ シ ル カ ノレ ボ ジ イ ミ ド （ 680 m g ) 、 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン ィ ミ ド （380mg) を 氷 冷下 で ジ ク 口 ロ メ 夕 ン （50mL) に 溶 か し 、 こ こ に A 液 を 加 え 、 5 で で 1 晚擅拌 し た 。 ジ ク ロ ロ メ タ ン （l OOmL) で希釈 し 、 10% ク ェ ン 酸 水 溶 液 と 飽和 食塩 水 と 10 % 炭酸 ナ ト リ ゥ ム 水溶 液 で 洗 い 、 硫酸 マ グ ネ シ ウ ム で 乾燥 し 、 慮過 し 、 溶媒 を 溜去 し た 。 得 ら れ た 残渣 を シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク 口 マ ト グ ラ フ ィ ー （ へ キ サ ン ： 酢酸 ェ チ ル = 1 : 1 2 ) で精製 し 、 化合物 3 — 6 mg) を 白色固体 と し て得た

[ a ] _D = - 3. 32' (c = l. 08 , ク ロ 口 ホ ル ム

I R (ク ロ 口 ホ ル ム ） cm 1738, 1682. 1645, 1537, 1169

¹ Η - N M R (C D C 1 ₃ ) ： (5 7. 3-7. HI 5Η, m) , 6. 5-6. 6 (2H b r) , 5. 06 - 5. 20 ( 6 H, m) , 4. 55-4. 65 (3H, 3. 06-3. 10 (2H, m) ,

2. 34 - 2. 48 ( 2 H, m) , 2. i 3 - 2. 26 ( 6 H , m ) , 1. 93 - 2. 06 ( 2 H, 1. 60

1. 64 (2H, π) , 1. 39 - 1. 8 (11H, m) , 1. 30 - 1. 34 ( 2 H, m)

( k ) 化合物 3 の 合成

化合物 3 — 6 (5 ΟΟιηκ) を テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン （20mL) と 詐酸ェ チ ル （20mL) に溶か し 、 10%パ ラ ジ ウ ム 一 炭素 （l OOmg) を加え、 水素 1 気圧下 1 晩擾拌 し た。 滅過 し 、 溶媒を溜去 し 、 （UOmg) の固体を得た。

¹ H - N M R (C D ₃ 0 D ) ： δ 44 ( lH. dd, 5. 0Hz, 9. 0 Hi) , 4. 39 (1Η, dd, J = 5. OHi, J = 9. OHi) , 3. 03 (2H, t, J = 7. 0Hz) ,

2. 35 - 2. 43 ( 4 H, n) , 2. 26 ( 2H, t, J =7. 5Hi) 2. 15 - 2. 24 ( 2 H , m： 1. 91 -2. 0 (2H, m) , 1. 61 - 1. 67 ( 2 H , m ) , 1. 34 - 1. 52 ( 13 H , m ) 。

( I ) 化合物 3 — 9 の 合成

[ 2 - (2 - ク ロ ロ ー エ ト キ ン ） エ ト キ シ ] エ タ ノ ー ル . 9g) ア ジ 化 ナ ト リ ゥ ム （ 3. ) に ジ メ チ ル ホ ル ム ァ ミ ド （ 50 mい を 加 え 80て で 1 晩 a拌 し た 。 溶媒 を 溜去 し 、 残渣 を シ リ カ ゲ ル の カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ ジ ク ロ ロ メ タ ン ） で精製 し 、 油状物 （3

9) を 2. 5 g得 た

H - N M R ( C D C 1 ₃ ) δ 3. 73 - 3. 76 ( 2 Η, n) , 3. 67-3. 71

(6Η, σ) , 3. 61 -3. 63 (2Η, m) , 3. 40 (2Η, t, J = 5. ΟΗζ) , 2. 33 ( 1 Η, s

( m ) 化 合物 3 - の 合成

ー D — ガ ラ ク ト ピ ラ ノ ー ス ペ ン タ ァ セ テ ー 卜 （3- 10) (10g) と 化合物 3 - 9 (9. 0 g) を ジ ク 口 ロ メ タ ン U O O B L) に 溶か し 、 三 フ ッ 化 ホ ウ 素エ ー テ ル錯体塩 （6. 3ID L) を 加 え 、 1 晚擾拌 し た 。 ジ ク 口 ロ メ 夕 ン （500mL) で薄 め 、 飽和 炭酸水素 ナ ト リ ゥ ム 水溶 液 で 洗 い 、 有機雇 を 硫酸 マ グ ネ シ ウ ム で乾燥 し た 。 滅過 し 、 溶 媒 を 溜去 し 、 残渣 を シ リ カ ゲ ル の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に の せ 、 へ キ サ ン ： ^酸 ェ チ ル = 3 : 1 か ら 1 : 1 で溶 出 し 、 生成物 と ア ル コ ー ル 体 の 混 合 物 を え た 。 こ れ に 無 水 酢 酸 （2mL) と ピ リ ジ ン (20niL) を 加 え 、 1 晚擅拌 し た 。 溶媒 を 溜去 し 、 残渣 を 酢酸 ェ チ ル に 溶 か し 、 0. 5N塩酸 と 飽和食塩水 と 飽和 炭酸水素 ナ ト リ ゥ ム 水溶液 で 洗 い 、 有機層 を 硫酸 マ グ ネ シ ウ ム で乾燥 し た 。 濂過 し 溶媒 を 溜去 し 、 残渣 を シ リ カ ゲ ル の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に の せ へ キ サ ン ： 酢酸 ェ チ ル = 3 : 1 か ら 1 : 1 で溶 出 し 、 7. 4 g (55X) の 油伏物を得た

[ a ] _D = — 6, 2 Γ ( c = 1. 05, ク ロ ロ ホ ノレ ム ）

I R (ク ロ ロ ホ ノレ ム ） cm 2110, 1749, 1369.

1

H - N M R ( C D C 1 ： δ 5. 39 (1 H, d, 】 = 3· 5H z) , 5. 21 (1

H, d d, J = 8. OH z, J = 10. 5 H i ) , 5. 02 ( 1 H, d d, J = 3. 5H z, J = 10. 5H z) , 4. 58 (1 H, d, J = 8. OH z) , 4. 10-4. 20 (2H, m) , 3. 89 - 3. 99 ( 2 H, m) , 3. 74 - 3. 7 M1H, m) , 3. 64 - 3. 69 ( 8 H, m) , 3. 40 (2H, t, J = 5. OH i) , 2. 15 (3H , s) . 2. 06 (3H, s) , 2. 05 (3H, s) , 1. 99 (3H, s) 。

( n ) 化合物 3 — 1 3 の 合成

化合物 3 - (2. 3 g) と p — ト ル エ ン ス ル ホ ン酸 （850ng) を エ タ ノ ー ル （50niL) に溶か し 、 リ ン ド ラ ー溶媒を U. O g)加え、 水 素加圧下 （50p s i ) 1 時間振 と う し た。 そ の後 さ ら に リ ン ド ラ ー 触媒 U. O g)を加え、 水素加圧下 （50p s i ) 1 時間振 と う し た。 触 媒を滅過 し 、 溶媒を溜去 し た。 残渣を ァ セ ト ニ ト リ ル U GmL)に 溶か し 、 N — メ チ ルモ ノレ ホ リ ン （500 / L)で中和 し た。 こ れを A 液 と す る

化合物 3 — 7 ( 700 Hi g ) を ジ メ チ ル ホ ノレ ム ア ミ ド （ 10 m L ) に 溶 か し 、 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド （ 510 m g ジ シ ク ロ へ キ シ ル カ ル ポ ジ イ ミ ド （920i ) と を 氷冷下加え 、 4 で 1 晚擾拌 し た。 反応液を濃縮 し 、 残渣 を酢酸ェ チ ル に溶か し 、 10% ク ェ ン 酸水溶液、 飽和食塩水、 10%炭酸水素ナ ト リ ウ ム水溶液で洗い 有機層 を硫酸マ グ ネ シ ウ ム で乾燥 し た。 濃過 し 、 溶媒を 溜去 し た 。 残渣を シ リ カ ゲ ル の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に の せ 、 ジ ク ロ ロ メ タ ン か ら ジ ク ロ ロ メ タ ン ： メ タ ノ ー ル = 30 : 1、 そ し て 25 : 1に 変え て、 溶出 し 、 1. 8ifの粉体を え た。

[ a ] D = — 11. 2' ( c = l. 00, ク ロ ロ ホ ノレ ム ） -

I R (K B r ) era - 1 1753, 16339, 1371, 1226.

1 H - N M R (C D C 1 ： 5 7. 80-7. 85 (1H, m) , 7. 24-7. 26

(1H, n) , 7. 12-7. 18 (1Η, m) , 7. 04 -？ . 08 ( 1 H, m) , 6. 58 - 6. 62 ( 1 H, m ) , 5. 39 (3H, d, J =3. 5Hz) , 5. 11-5. 22 (3H, m) , 5. 02 - 5. 06 ( 3 H , in , H - 2) . 4. 72-4. 76 (1H, m) , 4. 55-4. 57 (3H, m) , 4. 38-4. U (2H, m) , 4. 10-4. 20 (6H, π) , 3. 93 - 3. 98 ( 6 H, m) , 3. 70 - 3. 75 ( 6 H, m) , 3. 5 - 3. 6 (3 , m) , 3. 8- 3. 12 (2H, m) , 2. 2-2. 4 (2H, m) , 2. 09 (9H, s) , 2. 04 (9H, s) , 2. 02 (9H, s) , 2. 01 (9H, s) , 1. 60 - 1. 66 ( 2 H, m) , 1. 46-1. 52 (2H, m) , 1. 42 (9H, s) , 1. 30 - 1. 36 ( 2 H, ra)。

( o ) 化合物 3 — 1 4 の 合成

化合物 3 — 1 3 (2. 4g)を 50% ト リ フ ルォ ロ 舴酸 一 ジ ク ロ ロ メ タ ン溶液に溶か し 、 1 時間擾拌 し 、 溶媒を溜去 し 、 エ タ ノ ー ル WO 96/06181 -. _Λ PCT/JP95/00298

一 5 1 ― と 2 回 共沸 さ せ た 。 メ タ ノ ー ノレ （30mL)に 溶 か し 、 28% ソ ジ ゥ ム メ ト キ サ イ ド ー メ タ ノ ー ル溶液 で 中 和 し 、 シ リ カ ゲ ル ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 （ ジ ク ロ ロ メ タ ン ： メ タ ノ ー ル = 30 : 1→ 5 : 1)で 精製 し た 。 得 ら れ た 粉体 を メ タ ノ ー ル （20mL)に 溶 か し 、 28% ソ ジ ゥ ム メ ト キ サ イ ド ー メ タ ノ ー ル溶液 （200 // L)を 氷冷下 で加 え 、 加 え 終 わ っ た ら 、 室温 に 戻 し て 、 1 時 間擾拌 し た 。 陰 イ オ ン 交換 槲 flg D 0 w " 50W ( H で 中和 し 、 樹脂 を 除 去 し 、 溶媒 を 溜去 し て 、 500ug の 粉体 を 得 た

[ a ] 5. 7Γ ( c = 0. 63, メ タ ノ ー ノレ ）

D

¹ H - N M R (C D ₃ 0 D ) ： δ . 8 - . 9 ( 11 H, m) , 4. 34 - 4. 36 (ΙΗ, ιπ) , 4. 29-4. 31 (1H, m) , 4. 26 - . 29 ( 3 H , m) , . 08 - . 05 ( 3 H , n) , 3. 83 - 3. 85 ( 2 H, m) , 3. 72 - 3. 79 ( 6 H, m) , 3. 68 - 3. 72 ( 5 H, m) , 3. 65 - 3. 68 ( 5 H, B) , 3. 61 - 3. 64 (5 H, m) , 3. U-3. 59 (5H, m) , 3. 36-

3. 40 (1 H, 3. 26 - 3. 32 ( 36 H, m) , 2. 9-3. 0 (2H, m) , 2. 25-2. 40 (6

H. Di) , 2. 03-2. 10 (1H, m) , 1. 86 - 1. 98 ( 1 H, m) , 1. 60 - 1. 70 ( 1 H , m

( P ) 化合物 4 一 2 の 合成

ー D — ダ ル コ ビ ラ ノ ー ス ペ ン 夕 ァ セ テ一 ト （10g) と 2- [2- ( ア ジ ド ー エ ト キ シ ） エ ト キ シ ] エ タ ノ ー ル （ 3 - 9 ) ( 9 g ) を ジ ク ロ ロ メ タ ン （l OQniL) に 溶 か し 、 三 フ ッ 化 ホ ウ 酸 エ ー テ ル 錯 体 塩 (6. 3mL) を加え、 1 晚損拌 し た。 ジ ク ロ ロ メ タ ン （500inL) で薄 め、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウ ム 水溶液で洗い、 有機雇 を硫酸マ グ ネ シ ゥ ム で乾燥 し た。 滅過 し 、 溶媒を溜去 し 、 残渣を ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に の せ 、 へ キ サ ン ： 酢酸ェ チ ル = 3 : 1 か ら 1 : 1 で溶 出 し 、 生成物 と ア ル コ ー ル体の混合物を え た。 こ れに無水酢酸 (2nL) と ピ リ ジ ン （20raL)を加え 、 1 晚擾拌 し た。 溶媒を 溜去 し 残渣を酢酸ェ チ ルに溶か し 、 0. 5 N塩酸 と 飽和食塩水 と 飽和炭酸 水素ナ ト リ ゥ ム 水溶液で洗い、 有機騸 を硫酸マ グ ネ シ ウ ム で乾 燥 し た。 據過 し 、 溶媒を 溜去 し 、 残渣を シ リ カ ゲ ル ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に の せ 、 へ キ サ ン ： 醉酸ェ チ ル = 3 : 1 か ら 1 : 1 で溶出 し 、 化合物 4 — 2 (5. 9 g, 44 X)の油伏物を得た。

[ a ] _D = — 15. 2' ( c = 0. 97, ク ロ 口 ホ ル ム ）

I R (" ク ロ 口 ホ ル ム ） c m - 1

2110. 1755. 1367

¹ H - N M R ( C D C 1 ₃ ) ： <5 5. 21 (l H, t, 】 = 9. 5H z)， 5. 09 (1 H, t. J = 9. 5 Η ι ) . 5. 00 (1 H. d d, 】 = 8. G H z, J = 9. 5H ! ) , 4. 61 ( 1 H, d, J = 8. OH i) , 4. 26 (1 H, d d, J = 4. 5 H z , 12. 0H z ) , 4. H - ( 1 H, d d, i = 2. 5 H z, J = 12 H i ) , 3. 93 - 3. 9 Π 1 Η, m) , 3. 73 - 3. 78 ( 1 H, m ) , 3. 64 - 3. 73 ( 9 H , m) , 3. 40 (2 H, t , J = 5. 0H z) , 2. 09 (3 H, s) , 2. 05 (3 H, s) , 2. 03 (3 H, s) , 2. 01 (3 H, s ( q ) 化合物 4 一 4 の 合成

化合物 4 一 2 (2. 3g) と ρ — ト ル エ ン ス ル ホ ン 酸 （85Qing) を ェ タ ノ ー ル （5dmL) に 溶 か し 、 リ ン ド ラ ー 触媒 を l. Og加 え 、 水素加 圧下 （50ps i) 1 時間振 と う し た 。 そ の 後 さ ら に リ ン ド 触媒 を （l. Qg)を 加 え 、 水素加圧下 （50ps i) 1 時 間振 と う し た 。 触媒 を «過 し 、 溶媒 を 溜去 し た 。 残渣 を ァ セ ト ニ ト リ ル （lOmL)に 溶 か し 、 N— メ チ ノレ モ ル ホ リ ン （500 L)で 中和 し た 。 こ れ を A 液 す る

化合物 3 ( 700 m ί ) を ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド （ 10 mい に 溶 か し 、 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド （ 510 n g ) と ジ シ ク ロ へ キ シ ル カ ル ポ ジ イ ミ ド （920mg) を 氷冷下加 え 、 4 で で ー晚 »拌 し た こ の 混 合溶液 に A 液 を 氷 冷下加 え 、 4 で一晚擾拌 し た 。 反 応 液 を 濃縮 し 、 残渣 を 舴酸 ェ チ ル に 溶 か し 、 10% ク ェ ン 酸水溶 液 飽和食塩水、 10%炭酸 ナ ト リ ウ ム 水溶液で 洗 い 、 有機層 を 硫酸 マ グ ネ シ ウ ム で乾燥 し た 。 濂過 し 、 溶媒 を 溜去 し た 。 残渣 を シ リ カ ゲ ノレ の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に の せ 、 ジ ク ロ ロ メ タ ン か ら ジ ク ロ ロ メ タ ン ： メ タ ノ ー ル = 30 : 1そ し て 25 : 1に 変 え て 溶 出 し 、 1. 6gの 粉体 を え た 。

H - N M R ( C D C 1 ₃ ) ： 5 7. 75 - 7. 80 ( 1 H , m ) , 7. 37-7. 4 (1H, m) , 7. 18 (1H, d, 】 =7, 5H z) , 7. 0 - 7. 04 ( 1 H, m) , 5. H-5. 49 (1H , d, J = 8Hz) , 5. 19-5. 24 (3H, m) , 5. 06-5. 12 (3H, n) , 4. 96 - 5. 02 (3

H, ra) , 4. 59 -4. 61 (3H, πι) , 4. 38 - . U ( 2 H, i) , 4. 10 - 4. 20 ( 6 H, ra) , 3. 93 - 3. 98 ( 6 H, B) , 3. 70 - 3. 75 ( 6 H, m) , 3. 5 - 3. 6 ( 34 H , m ) , 3. 8 -

3. 12 (2H, B) , 2. 2-2. 4 (2H, B) , 2. 09 (9H, $) , 2. 04 (9H, s) , 2. 02 (9H， s) , 2. 01 (9H, s) , 1. 60 - 1. 66 ( 2 H, m) , 1. 46- 1. 52 (2H, m) ,

I. 42 (9H, s) , 1. 30 - 1. 36 ( 2 H, m) 。

( r ) 化合物 4 一 5 の 合成

化合物 4 — 4 ( 5. 4 g) を 50% ト リ フ ル ォ ロ 酢酸 ー ジ ク ロ ロ メ タ ン 溶液 に 溶 か し 、 1 時 間 «拌 し 、 溶媒 を 溜去 し 、 エ タ ノ ー ル と 2 回 供沸 さ せ た 。 メ タ ノ ー ノレ （30nL) に 溶 か し 、 28% ソ ジ ゥ ム メ ト キ サ イ ド 一 メ タ ノ ー ル溶液 で 中和 し 、 シ リ カ ゲ ル ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 （ ジ ク ロ ロ メ タ ン ： メ 夕 ノ ー ル = 30 : 1→ 5 : 1) で 精製 し た 。 得 ら れ た 粉体 を メ タ ノ ー ノレ （20mL) に 溶 か し 、 28% ソ ジ ゥ ム メ ト キ サ イ ド ー メ タ ノ ー ル溶液 （200 ) [/ い を 氷冷下 で 加 え 、 加 え 終 わ っ た ら 、 室 温 に 戻 し て 、 1 時 間 «拌 し た 。 陰 イ オ ン 交 換 樹脂 Doire i 50W ( H ^τ ) で 中 和 し 、 樹脂 を 除去 し 、 溶媒 を 溜去 し て 、 500mg の 粉 体 を 得 た 。

[ a ] _D = ー 13. 7° ( c = 0. 19, メ タ ノ ー ル） . ¹ Η - Ν Μ R (C D ₃ O D ) ： <5 4. 8 - 4. 9 ( 11 Η, m) , 4. 34 - 4. 36 (1H, m) , 4. 26 - 4. 40 ( 3 Η, Β) , 4. 01 - 4. 05 (2 Η, υ) , 3. 83 - 3 · 85 ( 2 Η . ΒΙ) , 3. 72 - 3. 79 ( 7 Η, m) , 3. 68 - 3. 72 ( 5 Η, m) , 3. 65 - 3. 68 ( 5 Η , m ) , 3. 61 -3. 64 (5Η, Β) , 3. 48 - 3. 59 ( 5 Η, Β) , 3. 36-3. 40 (1Η, m) , 3. 26- 3. 32 ( 37 Η, m) , 2. 9-3. 0 (1H, m) , 2. 25-2. 40 (5Η, m) , 2. 03-2. 10 (1 Η, η) , 1. 86 - 1. 98 ( 1 H, m) , 1. 60 - 1. 70 ( 2 Η, m) ₀

( s ) 化合物 5 の 合成

Ν - Boc-1, 5 -ジ ァ ミ ノ ペ ン 夕 ン 3 g を 57mLの ジ ク 口 ロ メ 夕 ン に 氷浴中で溶解 さ せ、 5. 49g の Fmoc- OSuを加え室温で 2 時間 »拌 し た。 溶媒を溜去 し た後、 シ リ カ ゲル ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ ジ ク ロ ロ メ タ ン ： メ タ ノ ー ル = 50 : 1) で精製 し 4. 5gの 白色粉体を 得た

1 H - N M R ( C D C 1 δ 7. 77 - 7. 76 ( 2 Η, d) , 7. 60-7. 59

(2H. d) , 7. 42-7. 39 (2Η. t) , 7. 33 - 7. 30 ( 2 Η, t) , 4. 23-4. 20 (2Η, m) , 3. 21 -3. Π (2Η, m) , 3. 13 - 3. 09 (2 Η, m) , 1. 56 - 1. 30 ( 6 Η, m) ,

1. Η9Η,

( t ) 化合物 5 - 2 の 合成

化合物 5 — 1 (4. 5g)を乾燥 ジ ク ロ ロ メ 夕 ン （50mL) と ト リ フ ル ォ ロ 醉酸 （5QniL)の混合溶液に 氷浴中で溶解 さ せ、 4 で 1 時間 擾拌 し た。 溶媒を溜去 し 、 50niLの 12%塩酸を含む酔酸ェ チ ルを 加え再び溶媒を 溜去 し た後、 エ タ ノ ー ル中で再結晶す る こ と に よ り 2. 6gの 白色結晶を得 た。

H - N M R (C D C 1 δ 7. 80 - 7. 79 ( 2 Η, d) , 7. 64-7. 63

(2Η, d) , 7. 40 - 7. 38 ( 2 H, t) , 7. 32 - 7. 29 ( 2 H, t ) , . 38 - 4. 36 ( 2 H, d) , 3. 13-3. 10 (2H, 2. 91-2. 88 (2H. t) , 1. 67 - 1. 64 ( 2 H,

1. 55 - 1. 52 ( 2 H, t)， 1. 40 - 1. 37 ( 2 H, t

( u ) 化合物 5 — 3 の合成

平均分子量 40001) の ス 卜 ラ ン （ Dex t ran T 40, Pha rm c i a 社製） を ジ メ チ ルホ ル ム ア ミ ド （ 5 " ) と 0. 01 %酢酸溶液 （ 2. 5 mL) の混合溶液中で溶解 さ せ、 化合物 5 — 2 (U9mg) と 水素化 シ ァ ノ ホ ウ 素ナ ト リ ウ ム を加え、 で 3 日 間授拌 し た 反応液を 75nLの 99% エ タ ノ ー ル中 に添加 し nOOrpm で 10分間遠 心 し 、 白色の沈殿物を 得 た。 さ ら に 95%エ タ ノ ー ル、 ア セ ト ン ェ チ ルエ ー テ ルで順次洗浄後、 減圧下乾燥 さ せ 48g の化合物 5 — 3 を得た。 本反応が進行 し て い る こ と は、 生成物を 「 TSK ge l G400 OPWXL 」 カ ラ ム （東 ソ 一 社製） で分析 し 、 屈折率 （R 1) で検出 さ れ た デキ ス ト ラ ン の ピ ー ク に Fmoc基由 来の 265nm の U

V 吸収があ る こ と よ り 確認 し た 一 O I ―

( v ) 化合物 5 - 4 の合成

化合物 5 — 3 (370m g) を 19 m Lの水に溶解 さ せ た後、 0. 95mLの ジ ェ チ ルア ミ ン を加え一晚擾拌 し た。 反応液を 50mLの 99 % エ タ ノ ー ル中に添加 し 350 () τ ρ πι で 10分間遠心 し 、 白色の沈殿物を得 た 。 さ ら に 95 % エ タ ノ ー ル 、 ア セ ト ン 、 ェ チ ル ェ ル で順次 洗浄後、 減圧下乾燥 さ せ 300m g の化合物 5 - 4 を得 た。 本反応 が進行 し て い る こ と は、 生成物を 「 T S K g e l G 4000 PWX L 」 カ ラ ム （東 ソ 一 社製） で分析 し 、 屈折率 （R I )で検出 さ れた デキ ス ト ラ ン の ピ ー ク に F m Q C基由来の 265 nm の U V 吸収が消失 し た こ と よ り 確認 し た

( w ) 化合物 6 の 合成

平均分子量 5000の プ ル ラ ン （P - 5, S hwd e x社製） 0. 5 gを D M F (2 mL) と 0. 01 %舴酸溶液 （5mL) の混合溶液中で溶解 さ せ、 化合 物 5 — 2 (660IM) と 水素化 シ ァ ノ ホ ウ 素ナ ト リ ウ ム 217ra g を加 え、 50でで 3 日 間攪拌 し た。 反応液を 35mLの 99 % エ タ ノ ー ル中 に添加 し 35 Q ϋ r p m で 1 D分間遠心 し 、 白 色の沈殿物を得た。 さ ら に 95 % エ タ ノ ー ル 、 ア セ ト ン 、 ェ チ ル エ ー テ ル で順次洗浄後、 減圧下乾燥 さ せ 0. 45 g の化合物 6 — 1 を得た。 本反応が進行 し て い る こ と は、 生成物を 「 T S K I e I G 400 O PWX L 」 カ ラ ム （東 ソ 一社製） で分析 し 、 屈折率 （R 1) で検出 さ れた デキ ス ト ラ ン の ピ ー ク に Fmo c基由来の 265nm の U V 吸収があ る こ と よ り 確認 し た ( X ) 化合物 6 - 2 の合成

化合物 6 (50mg) を 4 nLの 0. 1N NaOH に溶解 さ せ一晩携拌 し た。 反応液を 35mLの 99%エ タ ノ ー ル中 に添加 し 3500 r pra で 10 分間遠心 し 、 白色の沈殿物を得た。 さ ら に 95% エ タ ノ ー ル、 ァ セ ト ン 、 ェ チ ル エ ー テ ル で順次洗浄後、 滅圧下乾燥 さ せ 36ruの 化合物 6 — 2 を得た。 本反応が進行 し て い る こ と は、 生成物を

Γ TSR g e l G 4000 」 カ ラ ム （東 ソ 一社製） で分析 し 、 屈折 率 （R I )で検出 さ れた デキ ス ト ラ ン の ピ ー ク に Fmo c基由来の 265 ηπの U V 吸収が消失 し た こ と よ り 確認 し た。

実施例 8 ( P E G 5 - r S P — I L — 2 の調製） ：

0 . 2 5 M の N a C 1 を 含 む 5 0 m M 酢 酸 緩 衝 液 （ p H 5 . 0 ) に 溶解 し た r S P — I L — 2 溶液 （ 1 0 m l ) を 、 1 O m M の塩化カ ル シ ウ ム を含む 1 0 O m M ト リ ス — 塩酸緩衝 液 （ p H 7 . 7 ) であ ら か じ め平衡化 し た 「 S e p h a d e x

G — 2 5 」 カ ラ ム に ア プ ラ イ し 、 同緩衝液で溶出 し た。 溶出 液を 2 8 0 n m の吸光度でモ ニ タ ー し 、 融合蛋 白質の溶出画分 を得た （ 1 2 m l ) 。 こ の溶 出画分 （ m l ) に 化合物 6 ( 4 1 3 m g ) を該緩衝液 （ 2 . 2 m l ) に溶解 さ せて添加 し 、 3 7 でで プ レ イ ン キ ュ ペ ー ト し た。 該反応液に モ ルモ ヅ ト 肝由来 ト ラ ン ス ダル タ ミ ナ ー ゼ （ S i g m a 社、 6 u n i t ) を該鑀衢液に溶解 さ せて 2 回 に わ た っ て添加 し 、 3 7 でで 2 時 間ィ ン キ ュ ベ 一 ト し た。

反応液を 「 Y M C — C ₈ A P 」 カ ラ ム （ 6 . 0 3 0 0 m m 山村化学社製） を用 い た逆相 H P L C に よ り 数回 に わ た っ て精 製 し 、 未反応の r S P — I L 一 2 画分を除去 し た。 精製物の盹 度を 「 P h a s S y s t e m J P h a r m a c i a 社 ) を用 い た S D S — P A G E (す な わ ち 、 平均分 5 , 0 0 0 の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル ア ルキ ル ァ ミ ン） に よ る （ Γ Ηουιθϊβ n i ou s 2 0 」 ゲル使用） に よ り 分析 し た結果、 P E G 5 (す な わ ち 、 平均分子量 5 ， 0 0 0 の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルア ルキ ル ァ ミ ン ） に よ る 修飾体 （ P E G 5 — r S P — I L — 2 ) は 未修飾体 に 対 し P E G 5 が 1 分子結合 し た と 予想 さ れ る 約 8

K D a 程度分子量が上昇 し た位置 に の み蛋白質由来の バ ン ドを 確認 し た。 収率約 1 6 %

実施例 9 ( P E G 1 0 — r S P — I L - 2 の調製）

0 2 5 M の N a C 1 を 含 む 5 O m M 酢 酸 緩 衝 液 （ p H 5 . 0 ) に溶解 し た r S P — I L — 2 溶液 （ 5 m l ) を、 1 0 m M の 塩化 カ ル シ ウ ム を 含む 1 0 O m M ト リ ス — 塩酸緩衝液 ( p H 7 . 7 ) であ ら か じ め平衡化 し た 「 S e p h a d e x G — 2 5 」 カ ラ ム に ア プ ラ イ し 、 同鑀銜液で溶出 し た。 溶出液 を 2 8 0 n m の 吸光度 で モ ニ タ ー し 、 »合蛋 白 質の 溶 出画分 を 得 た （ 6 m l ) 。 こ の 溶 出画分 （ 6 m l ) に 化合物 2 — 3

( 5 5 0 m g ) を該緩衝液 （ 2 m l ) に溶解 さ せ て添加 し

3 7 でで プ レ イ ン キ ュ ペ ー ト し た。 該反応液に モ ルモ ッ ト 肝由 来 ト ラ ン ス ダ ル タ ミ ナ ー ゼ （ S i g m a 社、 4 u n i t ) を該 綏衝液に溶解 さ せて 2 回 に わ た っ て添加 し、 3 7 でで 2 時間 ィ ン キ ュ ベ 一 卜 し た

反応液を 「 Y M C — C ₈ A P 」 カ ラ ム （ 6 . 0 X 3 0 0 m m 山村化学社製） を用 い た逆相 H P L C に よ り 数回 に わた っ て精 製 し 、 未反応の r S P - I L 一 2 画分を除去 し た。 精製物の純 度を 「 P h a s S y s t e m」 P h a r m a c i a 社 ) を用 い た S D S — P A G E ( 「 Homogen i ous 2 0 」 ゲル使用） に よ り 分 析 し た 結果 、 P E G 1 0 ( す な わ ち 、 平均 分 子 量 1 0 , 0 0 0 の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル ア ル キ ル ミ ア ン ） に よ る 修飾体 （ P E G 1 0 — r S P — I L — 2 ) は未修飾体に対 し P E G 1 0 が 1 分子桔合 し た と 予想 さ れ る 約 1 6 K D a 程度分 子量が上昇 し た位置 に のみ蛋白質由来のバ ン ドを確 ¾ し た。 収 率約 3 1 %。

実施例 1 0 ( P E G 5 - r X l — I L — 2 の調製） ：

P E G 5 — r X 1 - I L — 2 の調製 は、 実施例 8 の方法に従 つ て行な っ た。 精製物の純度を 「 P h a s t S y s t e m」 ( P h a r m a c i a 社） を用 い た S D S — P A G E ( 「 Hono geni oos 2 0 」 ゲル使用） に よ り 分析 し た結果、 P E G 5 修飾 体 （ P E G 5 — r X l — I L — 2 ) は未修飾体に対 し P E G 5 が 1 分子結合 し た と 予想 さ れ る約 8 K D a 程度分子量が上昇 し た位置にの み蛋白質由来のバ ン ド を確認 し た。 収率約 1 5 % 実施例 ( P E G 5 X 2 - I L 一 2 の調製）

P E G 5 - r X 2 I L 一 2 の翻製 は 、 実施例 8 の方法に 従 つ て 行 な っ た 。 精製物の 純度 を 「 P h a s S y s t e m J

( P h a r m a c i a 社） を用 い た S D S — P A G E C Ho Bl 0 gen i ous 2 0 」 ゲル使用） に よ り 分析 し た桔果、 P E G 5 修飾 体 （ P E G 5 — r X 2 — I L — 2 ) は未修飾体 に対 し P E G 5 が 1 分子結合 し た と 予想 さ れ る 約 8 K D a 程度分子量が上昇 し た位置 に のみ蛋白質由来のバ ン ド を確認 し た 実施例 1 2 ( P E G 5 - r X 3 - I L 一 2 の調製）

P E G 5 - r X 3 - I L 一 2 の網製は、 実施例 8 の方法に従 て行な っ た。 精製物の純度を 「 P h a s S y s t e m I

( P h a r m a c i a 社） を用 い た S D S — P A G E ( 「 Hono gen i oos 2 0 J ゲル使用） に よ り 分析 し た結果、 P E G 5 修飾 体 （ P E G 5 — r X 3 — I L — 2 ) は未修飾体に対 し P E G 5 が 1 分子結合 し た と 予想 さ れ る 約 8 K D a 程度分子量が上昇 し た位置 に の み蛋白 H由来のバ ン ド を確認 し た。 収率約 1 5 %。 実施例 1 3 ( P E G 5 - r X 4 - I L — 2 の調製） ：

P E G 5 — r X 4 - I L 一 2 の調製は、 実施例 8 の方法に従 て行な っ た。 精製物の純度を 「 P h a s S y s e m」

( P h a r m a c i a 社） を用 い た S D S — P A G E ( Γ Ηοπο Ke n i oo s 2 0 」 ゲル使用） に よ り 分析 し た結果、 P E G 5 修飾 体 （ P E G 5 — r X 4 — I L 一 2 ) は未修飾体 に対 し P E G 5 が 1 分子結合 し た と 予想 さ れ る 約 8 K D a 程度分子量が上昇 し た位置 に の み蛋 白質由来のバ ン ド を確認 し た。 収率約 1 5 % 実施例 1 4 ( P E G 5 X 5 - I L 一 2 の調製）

P E G 5 - r X 5 - I L 一 2 の調製 は、 実施例 8 の方法に従 つ て行な っ た。 精製物の純度を 「 P h a s t S y s t e m」 ( P h a r m a c i a 社） を用 い た S D S — P A G E ( 「 Homo ge n i on s 2 0 」 ゲル使用） に よ り 分析 し た結果、 P E G修飾体

( P E G 5 — r X 5 - I L - 2 ) は未修飾体 に対 し P E G 5 が 2 分子結合 し た と 予想 さ れ る 約 1 6 K D a 程度分子量が上昇 し た位置 に の み蛋 白 K由来のバ ン ドを確認 し た。 収率約 1 0 %。 実施例 1 5 ( ( G a l ) 3 一 r S P - I L — 2 の調製） ：

0 . 2 5 M の N a C 1 を 含 む 5 0 m M 酢 酸 緩 衝 液 （ p H

5 0 ) に溶解 し た r S P — I L — 2 溶液 （ 4 m l ) を、 0 m M の 塩 化 カ ル シ ウ ム を 含 む 1 0 O m M ト リ ス — 塩酸緩衝液

( P H 7 . 7 ) であ ら か じ め平衡化 し た 「 S e p h a d e x —

G — 2 5 」 ラ ム に ア ブ ラ イ し 、 上記 ト リ ス緩衝液で溶出 し た。 溶出液を 2 8 0 n mの吸光度でモ ニ タ 一 し 、 融合蛋 白質の溶出 画分を得た （ 4 . 8 m l ) 。 こ の溶出画分 （ 4 m l ) に 化合物

3 - 1 4 ( 2 0 m g ) を添加 し、 3 7 で プ レ イ ン ペ ー ト し た。 こ の反応液に モ ル モ ッ ト 肝 由来 ト ラ ン ス グル 夕 ミ ナ ーゼ ( S i g m a . 2 u n i t ) を ト リ ス緩衝液に溶解 さ せ て 2 回 に わ た つ て添加 し 、 3 7 で 2 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。

反応液を 「 Y M C — C _n A P 」 カ ラ ム （ 6 . 0 x 3 0 0 m m 山村化学社製） を用 い た逆相 H P L C に よ り 数回 に わ た っ て精 製 し 、 未反応の r S P - I L 一 2 画分を除去 し た。 精製物の純 度は P h a s t S y s t e m ( P h a r m a c i a ) を用 い た S D S — P A G E ( H o m o g e n i o u s 2 0 ゲル使用） に よ り 分析 し た の結果、 （ G a l ) (すな わ ち、 3 分枝 型ガ ラ ク ト ー ス ア ル キ ル ァ ミ ン ） に よ る 修飾体 （ （ G a 1 ) J 一 r S P — I L — 2 ) は未修飾体に対 し て （ G a 1 ) ₃ が 1 分 子桔合 し た と 予想さ れ る 約 2 K D a 程度分子量が上昇 し た位 B に の み蛋 白質由来の バ ン ド を確認 し た。 収率約 %

実施例 6 ( ( G 1 c ) r S P - I L 一 2 の調製）

0 . 2 5 Mの N a C 1 を 含 む 5 O m M酢酸緩衝液 ( H 5 . 0 ) に溶解 し た r S P — I L — 2 溶液 （ 5 m l ) を、 1 0 m M の塩化カ ル シ ウ ム を含む 1 0 O m M ト リ ス — 塩酸綬銜液 ( H 7 . 7 ) で あ ら か じ め 平衡化 し た 「 S e p h a d e x G — 2 5 」 カ ラ ム に ア プ ラ イ し 、 上記 ト リ ス緩衝液で溶出 し た。 溶 出液を 2 8 0 n mの吸光度でモ ニ タ ー し 、 融合蛋白質の溶出画 分を得 た （ 6 m l ) 。 こ の溶出画分 （ 4 m l ) に化合物 4 一 5 ( 9 0 m g ) を 添加 し 、 3 7 て で プ レ イ ン キ ュ べ 一 卜 し た 。 こ の反応液 に モ ル モ ッ ト 肝由来 ト ラ ン ス グ ル タ ミ ナ 一 ゼ （ S i g a m a , 2 u n i t ) を ト リ ス 緩衝液に溶解 さ せ て 2 回 に わ た つ て添加 し 、 3 7 で で 2 時間イ ン キ ュ ベ ー ト し た。

反応液を 「 Y M C — C ₈ A P 」 カ ラ ム （ 6 . 0 3 0 0 m m 山村化学社製） を用 い た逆相 H P L C に よ り 数回 に わ た っ て精 製 し 、 未反応の r S P — I L 一 2 画分を除去 し た。 精製物の tt 度 は P h a s t S y s t e m ( P h a r m a c i a ) を用 い た S D S — P A G E ( H o m o g e n i o u s 2 0 ゲル使用） に よ り 分析 し た の結果 ( G 1 c ) (す な わ ち 、 3 分枝 型 グ ル コ ー ス ア ルキ ル ァ ミ ン） に よ る 修飾体 （ （ G l c ) ₃ 一 r S P — I L — 2 ) は未修飾体 に対 し て （ G l c ) _g が 1 分子 結合 し た と 予想 さ れ る 約 2 K D a 程度分子量が上昇 し た位置に のみ蛋白質由来のバ ン ド を確認 し た。 収率約 %

実施例 1 7 ( D e x 4 0 - r X 3 - I L 一 2 の翻製）

O O m M ト リ ス ー 塩酸緩衝液 （ 1 0 m M C a C 1 ₂ 含有

P H 7 ) に溶解 し た r X 3 — I L — 2 溶液 （ 0 . 5 m l ) に化合物 5 — 4 ( 1 2 0 m g ) を添加 し 、 3 7 でで プ レ イ ン キ ュ ペ ー ト し た。 こ の反応液に モ ルモ ッ ト 肝由来 ト ラ ン ス グ ル 夕 ミ ナ 一 ゼ （ S i g m a , 0 . 3 u n i t ) を ト リ ス緩銜液に溶 解 さ せ て添加 し 、 3 7 で 1 時間イ ン キ ュ ベ ー ト し た。

反応液を 「 Y M C C 8 A P 」 カ ラ ム （山村化学社製） を用 い た 逆相 H P L C に よ り 精製 し 、 未反応の r X 3 — I L 一 2 画 分 を 除 去 し た 。 精製物の純度 は P h a s t S y s t e m

( P h a r m a c i a ) を用 い た S D S — P A G E ( H o m o g e n l o u s 2 0 ゲル使用） に よ り 分析 し た の結果

D e X 4 0 (す な わ ち 、 平均分子量 4 0 , 0 0 0 の デキ ス ト ラ ン ア ル キ ル ア ミ ン ） に よ る 修飾体 （ D e x 4 0 — r X 3 — I L 一 2 ) は未修飾体 に対 し D e X 4 0 が 1 分子結合 し た と 予想 さ れ る 約 1 0 0 K D a 程度分子量が上昇 し た位置 に の み蛋白質由 来のバ ン ド を確認 し た。 収率約 1 0 %

実施例 1 8 ( P u 1 5 - r X 3 - I L 一 2 の調製）

O O m M ト リ ス ー 塩酸緩衝液 （ 1 0 m M C a C l ₂ 含有

P H 7 . 7 ) に溶解 し た r X 3 — I L — 2 溶液 （ 0 . 5 m l ) に化合物 6 — 2 ( 6 0 m g ) を添加 し 、 3 7 で プ レ イ ン キ ュ ペ ー ト し た。 こ の反応液に モ ルモ ッ ト 肝由来 ト ラ ン ス グル タ ミ ナ ー ゼ （ S i g m a , 0 . 3 u n i t ) を ト リ ス緩衝液に 溶解 さ せ て添加 し 、 3 7 でで 1 時間イ ン キ ュ ベ ー ト し た。

反応液を 「 Y M C C 8 A P 」 カ ラ ム （山村化学社製） を用 い た 逆相 H P L C に よ り 精製 し 、 未反応の r X 3 — I L - 2 画 分 を 除 去 し た 。 精製物の 純度 は P h a s t S y s t e m ( P h a r m a c i a ) を用 い た S D S — P A G E ( H o m o g e n i o u s 2 0 ゲル使用） に よ り 分析 し た。 そ の結果、 P u 1 5 (す な わ ち 、 平均分子量 5 , 0 0 0 の プ ル ラ ン ア ル キ ル ァ ミ ン ） に よ る 修飾体 （ P u l 5 — r X 3 — I L — 2 ) は未 修飾体に対 し P u 1 5 が 1 分子結合 し た と 予想 さ れ る 約 1 5 K

D a 程度分子量が上昇 し た位置 に の み蛋白質由来のバ ン ドを確 認 し た。 収率約 1 0 %

実施例 1 9 (修飾位置の確認） ：

実施例 8 に お い て調製 し 、 凍結乾燥 し た P E G 5 — r S P — I L - 2 ( 2 0 0 / g ) 及び r S P — I L — 2 ( 2 0 0 g ) を 6 M塩酸 グ ァ ニ ジ ン 及 び 3 5 m M E D T A を含む 0 . 3 5

M ト リ ス ー 塩酸緩衝液 （ p H 8 . 5 、 0 0 1 ) に溶解 し 、

D T T溶液 （ 2 1 5 m g Z m l 、 同緩衝液に溶解 し た も の） を加え て、 3 7 で 1 時間イ ン キ ュ ベ ー ト し た の 後、 ョ ー ド酢酸溶液 （ 1 2 jw l 、 1 8 . 6 m g Z m l 、 同緩衝 液 に溶解 し た も の） を加え、 遮光下、 室温で 1 時間放置 し た。

2 — メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル （ 4 1 ) を加え反応を停止 さ せ た 後、 2 . 5 %酢酸で あ ら か じ め平衡化 し た 「 S e p h a d e x

G — 2 5 J カ ラ ム に ア プ ラ イ し て試薬を除去 し た後、 蛋 白質 通分を凍結乾燥 し て通元ア ルキ ル化 P E G 5 — r S P — I L - 2 及び r S P — I L 一 2 を得た。

該通元ア ルキ ル化 P E G 5 S P - I L — 2 及び r S P -

I L 一 2 の凍結乾燥粉末 （ l O O jw g ) を 0 M炭酸水素 ン モ ニ ゥ ム緩衝液 （ p H 7 . 9 ) に懸濁 し 、 「 T P C K — ト リ ブ シ ン 」 （ S i g m a 社） 溶液 ( 2 1 、 l m _g / m l 、 同緵 衢液に溶解 し た も の） を加え、 2 5 で 4 時間酵索分解 し た。

反 応 液 は そ の ま ま 「 x B o n d a p a k C J カ ラ ム ( 3 . 9 X 3 0 0 m m . W a t e r s 社製） に よ る 逆相 H P L

C 分析を行な っ た の結果を図 3 A お よ び図 3 B に示す。 図

3 B の r S P — I L 一 2 の ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ 中 、 T S — P と 付 し た S P 由来の ア ミ ノ 酸配列 を含ん だ ア ミ ノ 酸配列 （ M e t 一 A r g — P r o — L y s — P r o — G l n — G l n — P h e

- P h e - G 1 y - L e u - M e t - A 1 a — P r o — T y r

- S e r - S e S e T y r — L y s ) 由来の ピ ー ク の み が図 3 A の P E G 5 — r S P — I L 一 2 の ペ プ チ ド マ ツ ピ ン グ に お い て消失 し 、 * 印 を付 し た新 た に異な っ た リ テ ン ョ ン タ ィ ム の位置 に ピ ー ク が検 出 さ れた。 こ の結果、 h I L — 2 の N 一 末端 側 に 新 た に 付加 し た S P を元 に し た ァ ミ ノ 酸配列 中 の G 1 n 残基が選択的 に P E G修飾 さ れて い る と 判断 し た。

実施例 2 0 (修飾体の I L 一 2 活性） ：

A T C C よ り 入手 し た I L 一 2 依存性マ ウ ス細胞 「 C T L L

- 2 J ( A T C C T I B 2 1 4 ) を 、 a I L - 2

( C o 1 1 a b o r a t i v e 社製） 約 5 0 uni mlを含む

0 % F C S ( ゥ シ胎児血清） 含有 R P M I 6 4 0 培地で 培養 し た。 本細胞を 2 % F C S 含有 R P M I 6 4 0 培地で

2 回洗浄 し た後、 5 % F C S を含む R P M I 1 6 4 0 培地に

2 1 0 ⁵ ce l l s mlと な る よ う に浮遊 さ せ た。 こ の 5 0 1 ( 1 0 " 4 ce l l sを含む） を組繳培養用 9 6 穴 プ レ ー ト の各穴に 分注 し 、 さ ら に 5 % F C S 含有 R P M I 6 4 0 で希釈 し た 検体 液 を 各穴 5 0 β 1 加 え て培養 し た。 培養開始 4 4 時間後 に A m e r s h a m社製 [ me thy l - ³ H ] T h y m i d i n e

( 2 . 9 6 T B g / mmo 1 ) を 5 % F C S 含有 R P M I 6 4

0 で希釈 し 、 3 7 k B q ノ を各穴に加え、 さ ら に 4 時 間培養 し た。 培養後、 細胞を C a m b r i d g e T e c h n o 1 o g y , I n c 製 「 P H D ノヽ 一 べ ス タ ー （ m o d e 1 2 0 0 0 ) 」 を 用 い て グ ラ ス フ ィ ル タ ー 上に捕集 し 、 シ ン チ レ 一 夕 一 （ N E N社製 「 A q u a s o I I L J ) を加え た後、 P a c k a r d 社製液体 シ ン チ レ ー シ ヨ ン カ ウ ン タ ー （ 「 T R

1 一 C A R B ( m o d e 1 2 5 0 0 T R ) 」 ） で取 り 込 ま れ た放射活性を測定 し た。 な お、 検体の評価に お い て は、 檩準品 と し て精製 r h i L — 2 を用 い た。

そ の結果、 r h I L — 2 に対す る 比活性は、 r S P — I L —

2 ( 5 9 % ) 、 r X 1 - I L - 2 ( 9 3 % ) 、 r X 2 - I L - 2 ( 1 2 4 % ) 、 r X 3 - I L - 2 ( 9 4 % ) 、 r X 4 - I L 一 2 ( 9 3 % ) 、 r X 5 - I L - 2 ( 3 0 % ) 、 P E G 5 - r S P - I L - 2 ( 9 5 % ) 、 及び P E G 1 0 — r S P — I L - 2 ( 8 5 % ) 、 P E G 5 - r X l - I L 一 2 ( 1 3 5 % ) , P E G 5 - r X 2 - I L - 2 ( 1 3 5 % ) 、 P E G 5 — r X 3 —

I L 一 2 ( 1 3 2 % ) 、 P E G 5 - r X 4 - I L - 2 ( 3

% ) P E G 5 — r X 5 — I L _ 2 ( 1 9 8 % ) お よ び P u

5 X 3 - I L - 2 ( 5 . 4 % ) と な り 、 融合蛋 白質 及び そ の修飾体は r h I L 一 2 の I L 一 2 活性を保持 し て い る が示 さ れた

実施例 2 1 ( P E G 修飾体の体内動態）

W i s t a r 系雄性 ラ ッ ト （ 1 8 0 〜 2 0 0 g ) に未修飾の

S P — I L 一 2 な ら び に P E G 5 — r S P — I L 一 2 お よ び - 7

P E G 0 S P - I L — 2 の 3 種の各検体を r h 1 L - 2 換算 で 1 0 / g Z k _g で静脈内 投与 （ n = 3 ) し 、 柽時的 に 採 血 し て 血 漿 を 採取 し た 。 各 血 漿 サ ン プ ル 中 濃 度 を E I A E n z y m e I m m u n o A s s a y 「 I L 一 2 — E I

A 'ソ 卜 ( C A Y M A N社製） を使用） に よ り 測定 し た

そ の結果、 図 4 に示す よ う に、 r S P — I L 一 2 は投与後す みや かに血策中 よ り 消失 し た。 P E G 5 0 0 0 で修飾 し た P E G 5 — r S P — I L — 2 は r S P - I L — 2 よ り わずかに高 い 血中滞留性を示 し た。 こ れに対 し 、 P E G 1 0 0 0 0 で修飾 し た P E G 1 0 — r S P — I L 一 2 は顕著 に高 い血中滞留性を示 し た

実施例 2 2 (組織集積性） ：

W i s t a r 系雄性 ラ 'ソ ト （ 7 遇令） に S P I し 一 2

( G a l ) S P — I L 一 2 お よ び （ v G l c ) S P 一 I L — 2 を l O ^ g Z k g ( r h i 1 — 2 換算） で静脈内投 与 し た。 投与後 5 分後 に主要組繳を採取 し た。 組繳に P B S を 9 倍量添加 し ホ モ ジ ナ イ ズ し 、 3 0 0 0 r p mで 5 分間遠心分 離 し た後、 上淸を P B S で希釈 し E L I S A で組織中濃度を測 定 し た の桔果、 （ G a 1 ) , - r S P - I L 一 2 が高い 肝 膽集積性を示 し た。

(産業上 の利用可能性）

本発明 に よ り 、 生理活性蛋白質は、 そ の N —末端 ま た は C 一 末咪あ る い は ア ミ ノ 酸配列中 にペ プチ ドがア ミ ド桔合 し て な る 融合蛋白質の ぺ プチ ド部分 に選択的 に ボ リ エ チ レ ン ダ リ コ ー ル 多糖、 ポ リ ア ミ ノ 酸、 ま た は分枝型糖誘導体を有す る ア ミ ノ 基 供与体を導入す る こ と が容易に行な い得 る と こ ろ と な り 、 延ぃ て は該生理活性蛋白 の医薬への利用 を促進す る と こ ろ と な つ た

Claims

請 求 の 範 囲 分子量が 5 0 3 〜 2 X 1 0 3 の範囲であ っ て、 少 く と も 1 個の グル タ ミ ン残基を有す る 生理活性蛋 白 質 と 下記一般 式 （ I ) 〜 （ IV) の いずれかに よ り 示 さ れ る ア ミ ノ 基供与体 ま た は ア ルキ ルア ミ ン を導入 し た多糖 も し く は そ の修飾体 と を、 ト ラ ン ス グル タ ミ ナ 一 ゼの存在下 に反応せ し め て、 該 グル タ ミ ン残基の 7 — カ ル ボキ シ ア ミ ド基 と 該ァ ミ ノ 基供与体の第一級 ァ ミ ノ 基 と の間の ア ミ ド結合を形成せ し め る こ と を特微 と す る 蛋 白質の修飾方法 NH2 (CH, ) nT (CH2 ) m (OCH2 CH2 ) pOR (I) H2 (CH2 ) nT (CH2 ) m (OCH2 CH2 ) pT (CH2 ) nNH2 (Π) た だ し 、 上記一般式 （ I ) お よ び （ I I) 中、 n は 1 〜 8 の整 数で あ り 、 m は 0 〜 2 の整数で あ り 、 P は 1 〜 4 0 0 の整数で あ り 、 T は結合 一 0 — 、 — C ( 0 ) 0 - 、 - 0 C ( 0 ) - 、 一 N H C 0 — 、 一 O C N H — 、 一 N H C 0 N H — 、 一 O O C N H 一 ま た は 一 H N C O O — で あ り 、 そ し て R は水素原子、 炭素原 子数 1 〜 5 の低极ア ルキ ル基 ま た は炭素原子数 2 〜 6 の低极 ァ シ ル基で あ る 。 た だ し 、 上記一般式 （ H I ) 中、 n は 1〜 8 の整数で あ り 、 q は 2 〜 6 の整数であ り 、 そ し て R は ガ ラ ク ト ー ス、 グ ル コ一 ス ま た は N — ァ セ チ ル ガラ ク ト サ ミ ン であ る 。 H2 N - (CH2 ) -NH-CO-T' (IV) た だ し 、 上記一般式 （ IV) 中、 n は 1 〜 8 の整数であ り 、 そ し て T ' は ポ リ ア ミ ノ 酸の末端カ ルボキ シ ル基を除 く 残基であ る 0 さ ら に、 前記生理活性蛋 白質は、 該生理活性蛋 白 質 1 0 M と 該生理活性蛋白 質に対 し 1 0 0 倍当量の モ ノ ダ ン シ ル カ ダべ リ ン と を 1 0 m M C a C l q を含み かつ p H 7 . 5 の 1 0 0 m M ト リ ス ー 塩酸緩衝液中で前記 ト ラ ン ス グル タ ミ ナ一ゼの存 在下に 3 7 で 6 0 分間保持 し た と き に モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン が導入 さ れ る も の で あ る 2 該生理活性蛋白質が、 蛋 白質の N - 末端 も し く は C 一末 端ま た は ァ ミ ノ 酸配列中 に ぺ ブチ ドが挿入 さ れて な る »合蛋白 であ り 、 該生理活性蛋 白質 は分子量が 5 X 1 0 3 ~ 2 1 0 5 の範囲であ り 、 該生理活性蛋 白質 1 0 // M と 該ぺ プチ ド に対 し 1 0 0 倍当量の モ ノ ダ ン シ ノレ 力 ダベ リ ン と を 1 0 m M C a C 1 2 を含みかつ p H 7 . 5 の l O O m M ト リ ス ー 塩酸緩衝液中 で前記 ト ラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼの存在下に 3 7 で で 6 0 分間保 持 し た と き に は ダ ン シ ル カ ダベ リ ン が導入 さ れな い も の で あ り かつ、 該ペ プチ ド は α — L 一 ア ミ ノ 酸残基 3〜 2 0 個 よ り な り 少な く と も 1 個の ダル 夕 ミ ン残基を有 し かつ該ぺ プチ ド 1 0Μ と 該ぺ プチ ド に対 し 1 0 0 倍当量の モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン と を 1 0 m M C a C l 2 を含み かつ p H 7 . 5 の l O O m M ト リ ス ー 塩酸緩衝液中で前記 ト ラ ン ス ダル 夕 ミ ナ 一 ゼの存在下 に 3 7 で で 6 0 分間保持 し た と き に モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン が 導入 さ れ る も の であ る こ と を特徽 と す る 請求項 1 記載の蛋白質 の修飾方法。 3 該融合蛋 白質が、 該生理活性蛋 白質の N - 末端に該ぺ プ ドが導入 さ れた も の で あ る こ と を特徴 と す る 猜求項 2 記載の 修飾方法 4 該生理活性蛋白質が、 該生理活性蛋白質 1 0 / M と 該生 理活性べ プチ ド に対 し 1 0 0 倍当量の モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン と を 1 0 m M C a C l 2 を含み かつ ρ Η 7 . 5 の l O O m M ト リ ス 一 塩酸緩衝液中で前記 ト ラ ン ス グル タ ミ ナ ー ゼ の存在下 に 3 7 でで 6 0 分間保持 し た と き に生理活性蛋白質 1 分子につ き ダ ン シ ルカ ダベ リ ン が 1 〜 2 分子導入 さ れ る も の で あ る こ と を特徵 と す る 請求項 1 記載の 蛋白 質の修飾方法。 5 該一般式 （ I ) ま た は （ 11) に お け る p が、 1 0 0 〜3 0 0 で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の 蛋白 質の修飾方 法 6 該一般式 （ 111 ) に お け る q が 2 〜 4 で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の 蛋 白 質の修飾方法。 7 . 該一般式 （ I V) に お け る ポ リ ア ミ ノ 酸の 重合度が 1 〜4 0 0 で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の蛋 白質の修飾方 法 8 . ア ルキ ル ア ミ ン を導入 し た多糖 ま た そ の修飾体の平均分 子量が l K D a か ら 1 0 O K D a で あ る を特微 と す る 請求 項 1 記載の 蛋 白 質の修飾方法 9 請求項 8 の いずれかに記載の修飾方法に よ り 製造 さ れた こ と を特微 る 被修飾蛋 白 質 補正書の請求の範囲 [1 995年 7月 1 7日 （1 7. 07. 95 ) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲 2及び 4は補 正された；他の請求の範囲は変更なし。 （5頁） ]

1 . 分子量が 5 x l 0 ³ 〜 2 x l 0 ⁵ の範囲で あ っ て、 少 く と も 1 個の グル タ ミ ン残基 を 有す る 生理活性蛋白 質 と 下記一般 式 （ I ) 〜 （ IV) の いずれか に よ り 示 さ れ る ア ミ ノ 基供与体 ま た は ア ルキ ル ア ミ ン を導入 し た多糖 も し く は そ の 修飾体 と を 、 ト ラ ン ス ダ ル タ ミ ナ ー ゼの存在下 に反応せ し め て、 該 グ ル 夕 ミ ン 残基の 7 — カ ル ボキ シ ァ ミ ド基 と 該ァ ミ ノ 基供与体の第一級 ァ ミ ノ 基 と の間の ァ ミ ド桔合を形成せ し め る こ と を特微 と す る 蛋 白質の修飾方法。 Hj (CHj ) nT (CHj ) m (OCHj CH, ) pOR (I) NHj (CH. ) nT (CH_∑ ) m (0CH_∑ CHj ) pT (CH^ ) n Hj (Π)

た だ し 、 上記一般式 （ I ) お よ び （ 11 ) 中、 n は 1 〜 8 の整 数で あ り 、 m は 0 〜 2 の 整数で あ り 、 p は 1 〜 4 0 0 の整数で あ り 、 T は結合 — 0 — 、 一 C ( 0 ) 0 — 、 - 0 C ( 0 ) ― 、 ― N H C 0 — 、 一 0 C N H — 、 一 N H C 0 N H — 、 一 0 0 C N H

^正された用 ¾ (条約 19条） 一 ま た は 一 H N C O O — であ り 、 そ し て R は水素原子、 炭素原 子数 1 〜 5 の低級 ア ルキ ル基 ま た は炭素原子数 2 〜 6 の低級ァ シ ル基で あ る 。

た だ し 、 上記一般式 （ ) 中、 n は 1 〜 8 の整数で あ り q は 2 〜 6 の整数で あ り 、 そ し て R は ガ ラ ク ト ー ス、 ダル コ一 ス ま た は N — ァ セ チ ル ガ ラ ク ト サ ミ ン で あ る

Hj N— (CHj ) -NH-CO-T' (IV)

た だ し 、 上記一般式 （ IV) 中、 n は 1 〜 8 の整数で あ り 、 そ し て T ' は ポ リ ア ミ ノ 酸の末端 カ ル ボキ シ ル基 を 除 く 残基で あ る o

さ ら に 、 前記生理活性蛋 白質は 、 該生理活性蛋 白質 1 0 M

補正された ¾紙 (条約第 19条） と 該生理活性蛋白 質 に対 し 1 0 0 倍当量の モ ノ ダ ン シ ル カ ダべ リ ン と を 1 0 m M C a C l ₂ を含みかつ p H 7 . 5 の 1 0 0 m M ト リ ス — 塩酸緩衝液中で前記 ト ラ ン ス グル タ ミ ナ一ゼの存 在下 に 3 7 で 6 0 分間保持 し た と き に モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン が導入 さ れ る も の で あ る 。

2 . (補正後） 該生理活性蛋 白質が、 蛋 白質の N - 末端 も し く は C 一 末端 ま た は ァ ミ ノ 酸配列中 にぺ ブチ ドが挿入 さ れて な る 融合蛋 白 で あ り 、 該生理活性蛋 白質 は分子量が 5 x 1 0 ³ 〜 2 1 0 ⁵ の範囲で あ り 、 該生理活性蛋 白質 1 0 M と 該ぺ ブ チ ド に対 し 1 0 0 倍当重の モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン と を 1 O m M C a C l ₂ を含み かつ p H 7 . 5 の l O O m M ト リ ス — 塩 酸緩衝液中で前記 ト ラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼの存在下に 3 7 ^ で 6 0 分間保持 し た と き に は モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン が導入 さ れ な い も の であ り 、 かつ 、 該ペ プチ ド は α - L — ア ミ ノ 酸残基 3 〜 2 0 個 よ り な り 少な く と も 1 個の グル タ ミ ン残基を有 し かつ 該ぺ プ チ ド 1 0 M と 該ぺ プ チ ド に 対 し 1 0 0 倍 当 量の モ ノ ダ ン シ ルカ ダベ リ ン と を 1 0 m M C a C I ₉ を含みかつ p H 7 . 5 の 1 0 O m M 卜 リ ス 一 塩酸緩衝液中で前記 ト ラ ン ス ダル 夕 ミ ナ ー ゼの存在下 に 3 7 て で 6 0 分間保持 し た と き に モ ノ ダ

補正された 紙 (条約第 19条） ン シ ル カ ダべ リ ン が導入 さ れ る も の で あ る こ と を特微 と す る 請 求項 1 記載の蛋 白質の修飾方法。

3 . 該融合蛋 白質が、 該生理活性蛋 白 質の N — 末端 に該ぺプ チ ドが導入 さ れた も の で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 2 記載の 修飾方法。

4 . (補正後） 該生理活性蛋白質が、 該生理活性蛋 白質 1 0 ί Μ と 該生理活性べ プチ ド に対 し 1 0 0 倍当量の モ ノ ダ ン シ ル カ ダベ リ ン と を l O m M C a C l q を含み かつ p H 7 . 5 の 1 0 0 m M ト リ ス — 塩酸緩衝液中で前記 ト ラ ン ス グル 夕 ミ ナ一 ゼの存在下 に 3 7 で 6 0 分間保持 し た と き に生理活性蛋 白質 1 分子 につ き モ ノ ダ ン シ ル カ ダべ リ ン カ《 1 〜 2 分子導入 さ れ る も の で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の 蛋白 質の修飾方法

5 . 該一般 式 （ I ) ま た は （ 11) に お け る p が、 1 0 0 〜

3 0 0 であ る こ と を特黴 と す る 諝求項 1 記載の蛋 白質の修飾方 法。

6 . 該一般式 （ 111 ) に お け る q が 2 〜 4 で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の蛋 白 質の修飾方法。

7 . 該 一般式 （ IV) に お け る ポ リ ア ミ ノ 酸 の 重合度 が 1 〜

4 0 0 であ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の 蛋 白 質の修飾方

補正された! (条約第 1条) 法

8 . ア ル キ ルア ミ ン を導入 し た多糖 ま た そ の修飾体の平均分 子量が l K D a か ら 1 0 O K D a で あ る こ と を特徵 と す る 請求 項 1 記載の蛋白質の修飾方法。

9 . 請求項 1 〜 8 の いずれか に記載の修飾方法 に よ り 製造 さ れた こ と を特微 と す る 被修飾蛋白質。

補正された (条 第 19条） 条約 1 9条に基づく説明;

請求の範囲第 2項及び第 4項は、 そこに記載の 「ダンシルカダベリ ン」

(第 2項第 8行及び第 4項第 6行） が 「モノ ダンシルカダベリ ン」 を意味 することは文脈上明白であるが、 今般の補正書により、 その旨を形式的に もより-一層明確にした。