WO1996006176A1 - Hsv1-tk modifiee fonctionnelle - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an improvement made to drugs used in gene therapy by suicide gene, and in particular to all drugs using the expression system of a thymidine kinase gene in cells infected with a virus or in cells cancer, making said cells specifically sensitive to nucleoside analogs (AN), especially ganciclovir (GCV) or aciclovir (ACV).
- AN nucleoside analogs
- GCV ganciclovir
- ACCV aciclovir
- the herpes simplex virus type I thymidine kinase gene The herpes simplex virus type I thymidine kinase gene
- HSV1-TK has acquired considerable importance in the development of antiviral or anticancer therapy using conditional toxicity and I ⁇ SV1-TK is the enzyme which has been the subject of the greatest number of investigations relating to genes suicides.
- This enzyme non-toxic to eukaryotic cells, has the characteristic of being able to transform certain nucleoside analogues such as ACV OR GCV into monophosphated molecules, which cellular kinases are normally incapable of (1,2). These monophosphated nucleosides are then converted by cellular enzymes into nucleoside triphosphates which are used during the synthesis of DNA and block the elongation process, thus causing cell death.
- viral thymidine kinases having the same properties can also be used, in particular that of the Varicella zoster virus (VZV) as described in patent application EP 415 731.
- VZV Varicella zoster virus
- HSV1-TK This conditional toxicity of HSV1-TK was first demonstrated in vitro and is now used in vivo for several purposes including:
- retroviruses appear to be the vectors of choice.
- an essential prerequisite for their use for therapeutic purposes is to ensure the safety of their use: the present invention offers a means of increasing the safety of the system without reducing the therapeutic index of treatment with an AN by administration.
- retrovirus recombinants containing a gene coding for thymidine kinase, said gene being modified by deletion or mutation in its 5 ′ part so that the gene expresses non-toxic kinase activity in the presence of GCV if it is expressed weakly and toxic if it is expressed strongly.
- the therapeutic index is defined as the ratio of the lethal doses 50% (LD50) of the treatment with A.N. of cells containing the suicide gene of those which do not contain it; in some cases, the therapeutic index may be increased if cells expressing the low-level suicide gene remain insensitive to the toxic effect of A.N.
- the security of the system is brought about by the use of packaging cells which produce only defective retroviruses thus avoiding the dissemination of a reconstituted wild virus in the cell population or the treated tissue; the development of such packaging cell lines has dramatically increased the use of retroviruses in gene therapy; in this case, the viral vector proper retains the essential sequences: the LTRs for the control of reverse transcription and integration, the ⁇ sequence necessary for packaging, the TB sequence necessary for viral replication; the viral genes (gag, pol, env) are deleted and replaced by the thymidine kinase gene placed under the dependence of its own promoter or a promoter deemed more powerful, specific or regulable.
- the viral genes gag, pol, env are often integrated into another vector, sometimes called a helper and defective in the LTR and ⁇ sequences. Their expression allows the packaging of the transgene to the exclusion of the genes necessary for the multiplication of the viral genome and for the formation of complete viral particles.
- the proviral form of the Helper is generally integrated into the genome of a murine cell line (for example the fibroblastic line NIH / 3T3) which plays both the role of host for the vector and of Helper for the functions which make it default.
- a murine cell line for example the fibroblastic line NIH / 3T3
- the cell strain becomes capable of producing detectable infectious viral particles.
- these particles contain only the transgene (HSV1-TK) but do not contain the information necessary for the reconstitution of complete viral particles in the target cells.
- This system is therefore designed to normally prevent any further spread of virus after the first infection, i.e. 4 say if the virus carrying the transgene enters a cell lacking information of the Helper type (gag, pol, env), its production is stopped.
- Helper type gag, pol, env
- a nucleic acid sequence including a sequence coding for an envelope or membrane protein, which sequence is under the dependence of a promoter and is associated if appropriate with said transgene and flanked at its 3 * end by a polyadenylation site, the recombinant viral genome and the nucleic acid sequence including the sequence for the env protein being capable of complementing in trans and allowing the host cell to produce defective infectious viruses provided with the envelope protein but lacking the corresponding gene.
- transgene to be expressed is a suicide gene of the HSV1-TK type.
- This system allows the production in the first stage of infectious viral particles carrying in particular the HSV1-TK gene but themselves lacking the envelope gene, this leading to an abortive infectious cycle from the second infection.
- a therapeutic target of the HSV1-TK / AN system consists of cells infected or infectable by a virus, in particular the HIV retrovirus.
- these cells are, unlike cancer cells, cells which divide little and therefore unlikely to be infected directly and with good efficacy by a retroviral vector; the cells concerned are then infected by a construct comprising the thymidine kinase gene under the control of the HIV LTR, this construct itself being included in a recombinant retrovirus which ensures its transduction with the required efficiency.
- the cells after infection with a retrovirus such as HIV produce the transactivating signals of the LTR, causing the expression of the thymidine kinase gene and making the cells sensitive to the ANs then administered as drugs (5).
- it is the infection itself by the virus that will trigger the expression of the killer gene and give the cell a particular sensitivity to ganciclovir or aciclovir.
- the suicide genes under the control of a specific promoter, be regulated in such a way that all of the treatment associating the transfection of the cells with the vector carrying the thymidine kinase gene and the administration of drugs of the aciclovir or ganciclovir type will in no way affect healthy cells, and it is the aim of the present invention to add an additional safety element.
- the transgene In the case, for example, of the treatment of HIV infection, the transgene must be introduced into the hematopoietic stem cells and expressed, if possible, exclusively in the differentiated cells which will result therefrom, in particular the T lymphocytes, the monocytes and dendritic cells.
- this gene it will be necessary for this gene to be activated only in the presence of infection with the retrovirus, so that only the infected cells are destroyed by administration of GCV or ACV.
- the HIV LTR it has been shown that in the absence of HIV infection, the HIV LTR always has a weak but real basal expression (6).
- This basal expression may be a problem with certain suicide genes and certain nucleoside analogs; for example, lymphoid cells which express the HSV1-TK gene under the control of the HIV LTR express this gene weakly and continuously, which does not allow ganciclovir to be used as a nucleostide analog because the latter s is far too toxic.
- this drug can be used at a concentration of 10 microMolars which respects uninfected cells and which makes it possible to kill infected cells (7).
- HSV1 thymidine kinase limits the therapeutic index of A.N. used and it is not possible, by use of this system, to increase the concentrations of aciclovir beyond 10 microMolar, which in some cases might be highly desirable.
- the “bystander” or metabolic cooperation effect described above could have the consequence of making A.N. toxic for cells neighboring the target cells, but not initially targeted, and conferring side effects on the treatment; one of the ways to reduce this “bystander” effect is to include in the construction a promoter specific for the tissue or cells targeted for treatment. However, residual expression of thymidine kinase may remain even under the dependence of a specific promoter in tissues or in cells transfected with the plasmid.
- the weakly expressed suicide gene is well tolerated during treatment with aciclovir or ganciclovir, but which, when its expression is activated for example by transactivation during a HIV infection is as toxic as the wild-type HSV1-TK gene.
- the present invention relates to a recombinant vector carrying a suicide gene dependent on a promoter and capable, when expressed in cells transformed by said vector, of phosphorylating nucleoside analogs such as aciclovir or ganciclovir leading to cell death by blocking replication, said vector being characterized in that the suicide gene is the thymidine kinase gene of the Herpes Simplex virus type 1 (HSV1 -TK) deleted in its 5 'part of all or part of the sequence 5 'upstream of the second ATG codon corresponding to methionine 46 of the complete protein, in particular when the deletion includes all or part of the 1st initiation codon corresponding to methionine No. 1.
- HSV1 -TK Herpes Simplex virus type 1
- the present invention results from the discovery that the HSV * ⁇ -TK gene contains, between the first two ATG codons, a cryptic promoter and several transcription initiation sites leading in certain situations to the synthesis of functional and truncated thymidine kinase in its terminal N part. It has been shown, in fact, that transgenic male mice having the HSV1-TK gene as a transgene with conditional toxicity to destroy certain cell categories and study their effects, become sterile, making their reproduction impossible; this sterility was due (15) to hyper-expression of the HSV1-TK gene in the testes accompanied by the formation of shorter transcripts initiated in the coding sequence of HSV1-TK. Subsequent experiments have shown that this cryptic promoter to the HSV1-TK gene was specifically activated in the testes leading to this hyper production of truncated and nonetheless functional HSV-TK (15).
- HSV1-TK In the use of plasmids carrying HSV1-TK as suicide genes in the presence of A.N., the conditional toxicity of HSV1-TK depends on the quantity of both nucleoside analogs and of the enzyme synthesized by the HSV1-TK gene. What is surprising in the construction of the invention is that not only does it make it possible to express, from the truncated HSV1-TK gene, a kinase activity but also that this activity makes it possible to phosphorylate nucleoside analogs such as aciclovir or ganciclovir, in the same way as HSV1-TK, as demonstrated below in example 2 and reference 15.
- HSV1- ⁇ TK truncated HSV1-TK
- the construction of the invention and in particular the nature of the promoter in 5 ′ of the coding sequence HSV1-TK will be chosen according to the use which one wishes to make of the conditional toxicity of the gene HSV1- ⁇ TK in the presence of nucleoside analogs; for example, in the treatment of cells infected or infectable with HIV, it will preferably be chosen a promoter of the HIV LTR type, in particular HIV1 or HIV2 comprising at 3 ′ a sequence transactivable by TAT of the TAR type as described in patent WO 93 / 08844.
- kinase activity capable of phosphorylating nucleoside analogs, such as ACV or GCV
- the construction of the invention comprising the HSV1- ⁇ TK gene can be introduced into any packaging cell line described in the prior art and in particular that cited above: these packaging cell lines containing a construction of the invention are capable of transferring the active principle of a toxic drug in the presence of nucleoside analogs for dividing cells and in particular cancer cells.
- the packaging cell lines transformed by a recombinant vector containing the thymidine kinase gene carrying a deletion upstream of the 2nd ATG initiation codon coding for methionine at position 46 of the whole protein are part of the invention.
- cell lines producing a retrovirus in which the env gene has been deleted in whole, or in part, and substituted by HSV1- ⁇ TK and a nucleic acid sequence including a sequence coding for an envelope protein. , which sequence is under the control of a promoter and is associated where appropriate with said transgene, and flanked at its 3 ′ end a site of polyadé ⁇ ylatio ⁇ said recombinant viral genome and said sequence being capable of complementing in trans and allowing said cell host to produce infectious viruses lacking the env gene, the whole forming a vector host system which could be injected as such into tumor cells.
- the recombinant pseudoviral sequence contained in the cell line can be derived from a Moloney MuLV genome or from that of an HIV virus.
- said cells may be transfected with a construct containing a sequence HSV1- ⁇ TK, under the dependence of a specific promoter of the virus capable of infecting said cells, for example HIV and T lymphocytes, the construct further comprising a gene transactivable by TAT, causing activation of the promoter and of transcription of the gene in the presence of an infectious virus.
- a construct containing a sequence HSV1- ⁇ TK under the dependence of a specific promoter of the virus capable of infecting said cells, for example HIV and T lymphocytes
- the construct further comprising a gene transactivable by TAT, causing activation of the promoter and of transcription of the gene in the presence of an infectious virus.
- the population of cells, in particular hematopoietic and containing the type of construct of the invention also forms part of the invention.
- the characteristic cited above of the construction containing HSV1- ⁇ TK of phosphorylating the nucleoside analogs when transcription is activated and of not phosphorylating them when the expression is weak, has the consequence that in the latter case, the cells expressing said gene Suicide are insensitive to AN and in particular GCV at doses between 0 and 10 microMolar, whereas after transactivation the cells are sensitive to doses between 10 "2 and 10 " 1 microMolar of GCV.
- the populations of cells which can thus be transfected and contain the constructs of the invention can be:
- the promoter may be an HIV LTR
- the promoter capable of being activated can be a cytokine promoter
- the invention also relates to:
- the invention relates to a process for the preparation of a recombinant viral vector carrying a suicide gene under the dependence of a specific transactivable promoter, the toxicity of the gene product in the presence of nucleoside analogs dependent on said transactivation, characterized in that the suicide gene is an HSV1 thymidine kinase gene (HSV1-TK) deleted in its 5 ′ part of all or part of the sequence upstream from the second ATG initiation codon corresponding to methionine 46 of the complete protein, in particular when the deletion includes all or part of the 1st initiation codon corresponding to methionine n ° 1.
- HSV1-TK HSV1 thymidine kinase gene
- the invention relates to the very gene for the thymidine kinase of HSV1-TK truncated in its 5 ′ region of all or part of the sequence upstream from the second initiation codon ATG corresponding to methionine 46 of the complete protein, in particular when the deletion includes all or part of the 1st initiation codon corresponding to methionine n ° 1 and capable of retaining a phosphorylation activity of nucleoside analogs and having a conditional toxicity in the presence of GCV above 10 microMolar analogues, when said gene is weakly expressed and exhibits a conditional toxicity between 10 and 10 '1 microMolar AN, essentially GCV when the gene is activated.
- FIG. 1b represents the construction of the invention deleted from the region upstream of the 2nd ATG codon.
- FIG. 2 represents the toxicity of increasing doses of ganciclovir on cells expressing the HSV1-TK or HSV1- ⁇ TK gene under the control of LTR-HIV (LTR-TK or LTR- ⁇ TK) in the absence or presence of Tat.
- the indication C1 indicates that the 1st clone of the cell line has been used, C2 referring to a 2nd clone and “bulk” to a mixture or to the non-cloned line.
- FIG. 3 represents the profiles obtained by FPLC of the different phosphorylated forms of GCV, after cell transfection by a construct comprising HSV1-TK (FIG.
- FIG. 4 represents the sensitivity to ganciclovir of bone marrow cells cultured in the presence of GM-CSF and previously transfected with a construct comprising HSV1-TK (black squares) or HSV1- ⁇ TK (- ⁇ Tk40 and - ⁇ TK72) under the control of LTR -HIV.
- FIG. 5 represents the effect of GCV in vivo on control mice (D), transgenic mice expressing weakly TK (transgenic mice in which TK is under the control of HIV-LTR (A) expressing weakly ⁇ -TK (transgenic mice in which ⁇ -TK is under the control of HIV-LTR) (B), strongly expressing ⁇ -TK (mouse transgenics in which ⁇ -TK is under the control of HIV-LTR are crossed with transgenic mice expressing Tat under the control of a ubiquitous promoter (•).
- the graphs show the depletions of the dendritic cells obtained after 7 days of treatment with GCV expressed in mg / kg / day.
- the HSV1-TK gene or the HSV1- ⁇ TK gene were integrated into a plasmid under the control of HIV 5 'LTR according to the experimental protocol described by Caruso et al 1992 (7) and by Salomon et al 1995 (15).
- the LTR has two remarkable characteristics:
- a ⁇ TK sequence is amplified by PCR using the TK gene as a template.
- the pair of primers used for the PCR amplification is as follows: a) the oligonucleotide in 5 ′ of sequence:
- 5'CCGAATTCAAGCTTATGCCCACGCTACTGCCGG3 'contains an Eco R1 site and a Hindlll site. stuck to the sequence downstream of the 2nd ATG initiation codon of TK indicated in bold; b) the oligonucleotide in 3 ′ of sequence
- a 1.05 Kb PCR fragment is then digested with HindIII and Bam HI and ligated downstream of the HIV LTR sequence of the plasmid p LTR-TK deleted from its TK sequence by digestion with HindIII and Bam HI.
- the retroviral plasmid pNCTat was constructed by insertion of the cDNA fragment obtained by digestion with Bam HI of the Tat fragment of the plasmid pCV-1 as described by Arya et al (12) downstream of an immediate early promoter of cytomegalovirus of the pNC vector. The latter has the neomycin gene and the cytomegalovirus promoter between the two LTRs of Moloney MLV virus.
- the plasmid can also contain 3 'of the LTR the HIV TAR gene.
- the constructions used will be chosen according to the use which one wishes to make of the toxicity of the suicide gene.
- the plasmid pMTK will preferably be used as described in Caruso et al. 1993 (8).
- HSV1-TK The presence of a cryptic promoter in the coding sequence of HSV1-TK was initially suggested by a Northern Blot analysis; in transfection experiments with an HSV1-TK gene lacking a promoter and then selection according to the criterion of obtaining a functional protein, Roberts et al (13) detected two transcripts of 1.1 Kb and 0.9 Kb. Furthermore, Al Shawi et al (14) detected transcripts in the testes of transgenic mice carrying the HSV1-TK gene.
- S riboprobe The first probe used, called S riboprobe in Figure 1, has been described in Salomon et al (10);
- the second probe called ribosonde P in Figure 1
- ribosonde P was obtained as follows; a Bglll-Sacl restriction fragment of the thymidine kinase HSV1-TK was integrated into the plasmid PGEM3Z marketed by the company Promega; the PGEM-TK was then linearized by the enzyme Pvull then the T7 RNA polymerase was used on the PGEM-TK, linearized to finally give the ribosonde P.
- Example 1 Sensitivity to ganciclovir of L cells transfected with a construct containing HSV1- ⁇ TK
- the constructs carrying the LTR- ⁇ TK, or the LTR-TK control were first transfected into L cells deficient in cellular thymidine kinase and selected by the presence of a functional thymidine kinase by selection at HAT.
- Clones of cells transfected with LTR-TK normally grow in the selection medium, while clones of cells transfected with LTR- ⁇ TK appear transiently and then die during the second week in selective medium.
- L cells deficient in cell thymidine kinase were again co-transfected with a plasmid expressing hygromycin and the LTR- ⁇ TK construct.
- the different clones were selected in a medium containing hygromycin.
- Clone C1 stably transfects with LTR- ⁇ TK was then infected with a retrovirus expressing the HIV TAT protein (obtained from the retroviral plasmid pNCTat) which transactivates the HIV LTR in 5 ′ of ⁇ TK, then a selection is made. in HAT.
- the ID50 of the clone LTR- ⁇ TK (C1) is 20 ⁇ M, namely the same sensitivity to GCV as the parental cells whereas the ID50 of two clones tested LTR- ⁇ TK + TAT is between 0.03 and 0.08 ⁇ M.
- truncated thymidine kinase has the same efficiency as normal thymidine kinase when the gene is activated (LTR- ⁇ TK + TAT), while at a low level of expression, that is to say - say without transactivation by TAT, the level of sensitivity to ganciclovir is identical to that found in control cells lacking the TK or ⁇ TK gene.
- LTR- ⁇ TK transactivated by Tat obtained only after selection in hygromycin are killed at concentrations of GCV lower than 0.1 ⁇ M.
- FIG. 3 shows the profiles obtained after chromatography by FPLC (Pharmacia) of the lysates of L cells transfected either by LTR-TK (FIG. 3a), or by LTR- ⁇ TK (FIG. 3c) or by LTR- ⁇ TK + TAT (FIG. 3b)
- Example 3 Transfection of the LTR- ⁇ TK gene in mouse lines. thirteen transgenic lines carrying the LTR- ⁇ TK were carried out, the males of all these lines being fertile and transmitting the transgene to their descendants according to a Mandeleian transmission.
- Bone marrow cells were cultured in the presence of GM-CSF for 6 days, thereby generating proliferative dendritic cells.
- the ID50 is 40 ⁇ M for non-transgenic mice, 0.035 ⁇ M for transgenic lines comprising the complete LTR-TK gene, 2 ⁇ M for the transgenic line LTR- ⁇ TK 72 and 20 ⁇ M for the LTR- ⁇ TK 40 line.
- GCV was additionally administered to mice of 12 different transgenic lines: the dose of 20 to 50 mg per kilogram per day which was used for the ablation of the cells in the transgenic line LTR-TK 14 has no effect on the LTR- ⁇ TK line; only the high doses of GCV (70 to 120 mg per kilo per day) which are non-toxic for non-transgenic mice have a moderate effect on 6 of these lines.
- the dendritic cells are partially depleted since they represent 0.4 to 0.9% of the splenocytes; this is to be compared with the 1.5% obtained with non-transgenic mice.
- LTR- ⁇ TK mice the expression of ⁇ -TK is very low and explains the partial depletion of dendritic cells.
- GCV-treated double transgenic mice have a depletion of dendritic cells in the spleen equivalent to GCV-treated LTR-TK transgenic mice as shown in Figure 5.
- Gene therapy by suicide gene can then be considered in the event that the risk / benefit evaluation becomes unfavorable with the use of the complete gene.
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Abstract
Vecteur recombinant porteur d'un gène codant pour une kinase sous la dépendance d'un promoteur et apte, quand il est exprimé dans des cellules transformées par ledit vecteur, à phosphoryler des analogues de nucléosides tels l'aciclovir ou le ganciclovir conduisant à la mort de la cellule par blocage de la réplication, caractérisé en ce que le gène codant pour une kinase est le gène de la thymidine kinase du virus Herpès simplex de type 1 (HSV1-TK) délété dans sa partie 5' de tout ou partie de la séquence en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète.
Description
HSV1-TK MODIFIEE FONCTIONNELLE
La présente invention est relative à un perfectionnement apporté aux médicaments utilisés en thérapie génique par gène suicide, et en particulier pour tous les médicaments utilisant le système d'expression d'un gène de thymidine kinase dans des cellules infectées par un virus ou dans des cellules cancéreuses, rendant lesdites cellules spécifiquement sensibles à des analogues de nucléosides (A.N.), notamment le ganciclovir (GCV) ou l'aciclovir (ACV).
Le gène de la thymidine kinase du virus Herpès simplex de type I
(HSV1-TK) a acquis une importance considérable dans les développements de la thérapie antivirale ou anticancéreuse par utilisation d'une toxicité conditionnelle et IΗSV1-TK est l'enzyme qui a été l'objet du plus grand nombre d'investigations relatives aux gènes suicides.
Cette enzyme, atoxique pour les cellules eucaryotes, présente la caractéristique de pouvoir transformer certains analogues nucléosidiques tels l'ACV OU le GCV en molécules monophosphatées, ce dont sont normalement incapables les kinases cellulaires (1,2). Ces nucléosides monophosphatés sont ensuite convertis par des enzymes cellulaires en nucléosides triphosphates qui sont utilisés lors de la synthèse de l'ADN et bloquent le processus d'élongation entraînant ainsi la mort de la cellule.
D'autres thymidines kinases virales ayant les mêmes propriétés peuvent également être utilisées, notamment celle du virus Zona Varicelle (VZV) telles que décrite dans la demande de brevet EP 415 731. Dans tout ce qui suit où il est fait référence à HSV1-TK, l'homme du métier saura la généraliser aux enzymes équivalentes.
Cette toxicité conditionnelle de HSV1-TK a été d'abord démontrée in vitro puis est maintenant utilisée in vivo à plusieurs fins dont :
- la thérapie génique par destruction de cellules malades : cancéreuses ou infectées par des virus et notamment des rétrovirus (4,7,8),
- l'ablation de types cellulaires spécifiques tels les cellules lymphocytaires, ou des cellules sécretrices d'hormones de croissance, ou des cellules dendritiques (CD.) (10) dans des lignées d'animaux transgéniques ayant le gène HSV1-TK sous le contrôle de promoteurs cellulaires spécifiques ; ce système est un moyen de recherche très
puissant pour connaître le rôle physiologique de l'un ou l'autre de ces types cellulaires.
En thérapie antivirale c'est la transactivation, sous l'effet d'une infection virale, d'un promoteur régulant la synthèse de HSV1-TK qui augmente la synthèse de la thymidine kinase, dont l'effet toxique se manifeste en présence d'un A.N.
On conçoit donc tous les avantages qui peuvent être tirés de l'utilisation de ce type de toxines conditionnelles appliquée à la thérapie génique, notamment anticancéreuse ou antivirale.
En premier lieu, seule une toxicité conditionnelle permet de générer des clones cellulaires stables produisant les pseudo-particules virales capables de produire un tel transgène et transférer le gène suicide dans les cellules cibles. Il suffit en effet de cultiver ces cellules en l'absence d'ACV ou de GCV puisque la thymidine kinase de IΗSV1 n'est pas toxique pour la cellule en absence de ces drogues.
Ensuite, en cas d'effet secondaire du traitement chez le patient, l'arrêt de l'administration de l'ACV ou du GCV fait cesser immédiatement la toxicité due au transgène ; en outre, un ajustement des doses de l'analogue nucléosidique permet de détruire sélectivement les cellules qui expriment fortement le transgène tout en préservant au maximum les cellules dans lesquelles le gène est faiblement exprimé. Enfin la toxicité restreinte aux cellules en division est un avantage important notamment pour le traitement des cellules cancéreuses.
Enfin, des données expérimentales in vitro et ]n vivo ont montré que des cellules n'exprimant pas HSV1-TK, mais au contact de celles qui l'expriment étaient également détruites par le traitement par l'ACV ("Coopération métabolique" ou "effet bystander") (3, 4)
Le mécanisme de cet effet reste encore incompris, mais il est possible que les analogues nucléosidiques triphosphatés puissent passer d'une cellule à l'autre par l'intermédiaire des "gap junctions" ou communications intercellulaires.
Dans un transfert de gènes exogènes dans des cellules eucaryotes, notamment des cellules humaines, les rétrovirus apparaissent comme étant des vecteurs de choix. Cependant, un préalable indispensable pour leur utilisation à des fins thérapeutiques est de s'assurer de la sécurité de leur utilisation : la présente invention offre un moyen d'augmenter la sécurité du système sans diminuer l'index thérapeutique du traitement par un A.N. par administration de rétrovirus
recombinants contenant un gène codant pour la thymidine kinase, ledit gène étant modifié par délétion ou mutation dans sa partie 5' de telle façon que le gène exprime une activité kinase non toxique en présence de GCV si elle est exprimée faiblement et toxique si elle est exprimée fortement.
L'index thérapeutique est défini comme le rapport des doses létales 50% (DL50) du traitement par les A.N. des cellules contenant le gène suicide de celles qui ne le contienne pas ; dans certains cas, l'index thérapeuthique peut être augmenté si les cellules exprimant le gène suicide à faible niveau restent insensibles à l'effet toxique des A.N.
Dans le cas des cellules cancéreuses, la sécurité du système est apportée par l'utilisation de cellules d'empaquetage qui produisent uniquement des rétrovirus défectifs évitant ainsi la dissémination d'un virus sauvage reconstitué dans la population cellulaire ou le tissu traité ; le développement de telles lignées cellulaires d'empaquatage a augmenté de façon considérable l'utilisation des rétrovirus en thérapie génique ; dans ce cas, le vecteur viral proprement dit conserve les séquences indispensables : les LTR pour le contrôle de la réverse transcription et de l'intégration, la séquence ψ nécessaire à l'encapsidation, la séquence TB nécessaire à la répliquation virale ; les gènes viraux (gag, pol, env) sont délétés et remplacés par le gène de la thymidine kinase placé sous la dépendance de son propre promoteur ou un promoteur jugé plus puissant, spécifique ou régulable. Les gènes viraux gag, pol, env sont souvent intégrés dans un autre vecteur, parfois appelé Helper et défectif pour les séquences LTR et ψ. Leur expression permet l'encapsidation du transgène à l'exclusion des gènes nécessaires à la multiplication du génome viral et à la formation de particules virales complètes.
La forme provirale du Helper est en général intégrée dans le génome d'une lignée cellulaire murine (par exemple la lignée fibroblastique NIH/3T3) qui joue à la fois un rôle d'hôte pour le vecteur et de Helper pour les fonctions qui lui font défaut. Après transfection du vecteur, la souche cellulaire devient capable de produire des particules virales infectieuses détectives. Cependant, ces particules ne contiennent que le transgène (HSV1-TK) mais ne contiennent pas l'information nécessaire à la reconstitution de particules virales complètes dans les cellules cibles. Ce système est donc conçu pour empêcher normalement toute propagation ultérieure de virus après la première infection, c'est-à-
4 dire si le virus porteur du transgène pénètre dans une cellule dépourvue de l'information de type Helper (gag, pol, env), sa production est arrêtée. Différents systèmes d'empaquetage permettant la production de virus recombinants défectifs susceptibles d'infecter des cellules en division ont été décrits, notamment dans les demandes de brevet
EP 0243204, WO 89/07150, WO 90/02806, WO 90/12087, EP 0 476
953, WO 93/04167 et WO 93/10218.
De même Caruso M. et al (8) et Yves Panis et col. (9), ont pu mettre en évidence un effet par injection directe de fibroblastes murins produisant des particules retrovirales recombinantes exprimant le gène
HSV1-TK.
Enfin a été mis au point récemment un nouveau système qui permet l'expression d' un transgène dans une cellule cible ou un tissu humain ou animal, ce système étant caractérisé en ce qu'il est constitué d'une cellule eucaryote établi en lignée dans laquelle ont été transfectées :
- d'une part, une séquence pseudo-rétrovirale recombinante dans laquelle le gène env a été délété dans sa totalité ou partiellement et substitué par ledit transgène au niveau du gène env, de sorte que le transgène en question soit exprimé sur des transcrits similaires à ceux du virus sauvage, sauf que la protéine env est substituée par la protéine
HSV1-TK,
-d'autre part, une séquence d'acide nucléique incluant une séquence codant pour une protéine d'enveloppe ou membranaire, laquelle séquence est sous la dépendance d'un promoteur et est associée le cas échéant audit transgène et flanquée à son extrémité 3* par un site de polyadénylation, le génome viral recombinant et la séquence d'acide nucléique incluant la séquence pour la protéine env étant susceptible de se complémenter en trans et permettre à la cellule hôte de produire des virus infectieux défectifs pourvus de la protéine d'enveloppe mais dépourvus du gène correspondant. Ce système, qui a fait l'objet de la demande de brevet FR
9401994 est particulièrement avantageux quand le transgène à exprimer est un gène suicide de type HSV1-TK. Ce système permet la production dans un premier temps de particules virales infectieuses portant notamment le gène HSV1-TK mais elles-mêmes dépourvues du gène enveloppe, ceci conduisant à un cycle infectieux abortif dès la deuxième infection.
Une cible thérapeutique du système HSV1-TK/A.N. est constitué par les cellules infectées ou infectables par un virus notamment le rétrovirus VIH. Ces cellules sont, au contraire des cellules cancéreuses, des cellules qui se divisent peu et donc peu susceptibles d'être infectées directement et avec une bonne efficacité par un vecteur rétroviral ; les cellules concernées sont alors infectées par une construction comportant le gène de la thymidine kinase sous le contrôle du LTR du HIV, cette construction étant elle-même incluse dans un rétrovirus recombiπant qui en assure la transduction avec l'efficacité requise. Dans ce cas, les cellules après infection par un rétrovirus tel le VIH produisent les signaux transactivateurs du LTR, entraînant l'expression du gène de la thymidine kinase et rendant les cellules sensibles aux A.N. administrés alors comme médicaments (5) . Dans ce cas, c'est bien l'infection elle-même par le virus qui va déclencher l'expression du gène tueur et conférer à la cellule une sensibilité particulière au ganciclovir ou l'aciclovir.
Il est capital dans l'un et l'autre cas que les gènes suicides, sous le contrôle de promoteur spécifique, soient régulés de telle façon que l'ensemble du traitement associant la transfection des cellules par le vecteur porteur du gène de la thymidine kinase et l'administration des médicaments de type aciclovir ou ganciclovir n'affectera en aucun cas les cellules saines, et c'est le but de la présente invention d'ajouter un élément de sécurité complémentaire.
Dans le cas par exemple du traitement de l'infection par le VIH, le transgène devra être introduit dans les cellules souches hematopoïetiques et exprimé, si possible, exclusivement dans les cellules différenciées qui en seront issues, en particulier les lymphocytes T, les monocytes et les cellules dendritiques. De plus, comme il a été vu plus haut, il sera nécessaire que ce gène ne soit activé qu'en présence d'une infection par le rétrovirus, de sorte que seules les cellules infectées soient détruites par administration de GCV ou d'ACV. Cependant, il a été montré qu'en l'absence d'infection par le VIH, le LTR du VIH a toujours une expression basale faible mais réelle (6).
Cette expression basale peut être un problème avec certains gènes suicides et certains analogues nucléosidiques ; par exemple, des cellules lymphoides qui expriment le gène HSV1-TK sous le contrôle du LTR de HIV expriment faiblement et de façon continue ce gène, ce qui ne permet pas d'utiliser le ganciclovir en tant qu'analogue de nucléostide car ce dernier s'avère beaucoup trop toxique. Au contraire, en ce qui
concerne l'aciclovir, cette drogue peut être utilisée à une concentration de 10 microMolaires qui respecte les cellules non infectées et qui permet de tuer les cellules infectées (7).
Cette expression basale de la thymidine kinase de HSV1 limite l'index thérapeutique de l'A.N. utilisé et il n'est pas possible, par utilisation de ce système, d'augmenter les concentrations d'aciclovir au-delà de 10 microMolaire, ce qui dans certains cas pourrait être hautement souhaitable.
L'effet «bystander» ou de coopération métabolique décrit plus haut pourrait avoir comme conséquence de rendre toxiques des A N. pour des cellules voisines des cellules cibles, mais non visées initialement, et conférant des effets secondaires au traitement ; une des façons de diminuer cet effet « bystander » est d'inclure dans la construction un promoteur spécifique du tissu ou des cellules cibles du traitement. Néanmoins, une expression résiduelle de la thymidine kinase peut subsister même sous la dépendance d'un promoteur spécifique dans les tissus ou dans les cellules transfectées par le plasmide.
Dans ce type de situation, il est important que le gène suicide s'exprimant faiblement soit bien toléré au cours d'un traitement par l'aciclovir ou la ganciclovir, mais qui, lorsque son expression est activée par exemple par transactivation lors d'une infection par HIV, s'avère aussi toxique que le gène HSV1-TK sauvage.
La présente invention est relative à un vecteur recombinant porteur d'un gène suicide sous la dépendance d'un promoteur et apte quand il est exprimé dans des cellules transformées par ledit vecteur à phosphoryler des analogues de nucléosides telle l'aciclovir ou le ganciclovir conduisant à la mort de la cellule par blocage de la replication, ledit vecteur étant caractérisé en ce que le gène suicide est le gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex de type 1 (HSV1 -TK) délété en sa partie 5' de tout ou partie de la séquence en 5' en amont du deuxième codon ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète, en particulier lorsque que la délétion inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine n° 1.
La présente invention résulte de la découverte selon laquelle le gène HSV*ι-TK contient, entre les deux premiers codons ATG, un promoteur cryptique et plusieurs sites d'initiation de la transcription conduisant dans certaines situations à la synthèse de thymidine kinase fonctionnelle et tronquée dans sa partie N terminale.
Il a été montré en effet que des souris mâles transgéniques ayant le gène HSV1-TK comme transgène à toxicité conditionnelle pour détruire certaines catégories cellulaires et en étudier les effets, devenaient stériles, rendant impossible leur reproduction ; cette stérilité était due (15) à une hyper expression du gène du HSV1-TK dans les testicules accompagnée de la formation de transcrits plus courts et initiés dans la séquence codante de HSV1-TK. Des expériences ultérieures ont montré que ce promoteur cryptique au gène HSV1-TK était activé de façon spécifique dans les testicules conduisant à cette hyper production d'HSV- TK tronquée et néanmoins fonctionnelle (15).
Dans l'utilisation de plasmides porteurs de HSV1-TK comme gènes suicides en présence d' A.N. la toxicité conditionnelle de HSV1-TK dépend de la quantité aussi bien des analogues de nucléosides que de l'enzyme synthétisée par le gène HSV1-TK. Ce qui est surprenant dans la construction de l'invention c'est que non seulement elle permet d'exprimer, à partir du gène HSV1-TK tronqué, une activité de kinase mais qu'en outre cette activité permet de phosphoryler des analogues nucléosidiques comme l'aciclovir ou le ganciclovir, de la même façon que HSV1-TK, comme cela est démontré plus loin dans l'exemple 2 et la référence 15.
Cette propriété de phosphorylation des analogues de nucléotides par la HSV1-TK tronquée (HSV1-ΔTK) a ceci de surprenant qu'elle ne se manifeste que dans le cas où l'expression, c'est-à-dire la transcription et la traduction du gène est forte. Par contre, si l'expression du gène est faible, alors l'enzyme résiduelle synthétisée est incapable de phosphoryler les analogues de nucléotides, contrairement à la protéine complète HSV1-TK (voir figures 2, 3 et 5)(15).
Différentes modalités dans les traitements par thérapie génique ont déjà été décrites plus haut comme spécifiques de l'activation du gène ainsi transfecte aussi bien dans le cas de cellules infectées par HIV, où il s'agit d'une transactivation du gène LTR par le virus lui-même comme ceci a été décrit dans la demande de brevet PCT WO93/08844, que dans le cas de cellules cancéreuses, où l'activation proviendrait de la division anormale de cellules qui activerait un promoteur spécifique de cellules cancéreuses contrôlant le gène HSV1-ΔTK.
La construction de l'invention et notamment la nature du promoteur en 5' de la séquence codante HSV1-TK sera choisi en fonction de l'utilisation que l'on souhaite faire de la toxicité conditionnelle du gène
HSV1-ΔTK en présence d'analogues de nucléosides ; par exemple, dans le traitement de cellules infectées ou infectables par HIV, il sera choisi de préférence un promoteur de type LTR de HIV notamment HIV1 ou HIV2 comportant en 3' une séquence transactivable par TAT de type TAR tel que décrit dans le brevet WO 93/08844.
Si en revanche, l'on souhaite réaliser une thérapie génique de cellules cancéreuses, on pourra avantageusement utiliser un LTR issu du virus de Moloney et notamment des variantes Mov3 et/ou Mov9 et/ou Mov13 tel que décrit par Caruso et al. 1993 (8). Ce qui est inattendu dans la construction de l'invention, c'est la double caractéristique du gène HSV1-ΔTK de :
- d'une part, exprimer une activité kinase capable de phosphoryler les analogues de nucléosides, tel l'ACV ou le GCV,
- et d'autre part, de ne présenter cette activité que quand la thymidine kinase tronquée est exprimée fortement ; exprimer fortement signifie qu'il y ait au moins une cinquantaine de transcrits par cellule.
Cette double propriété se retrouve quelque soit le vecteur dans lequel le gène est intégré et quelque soit le promoteur de transcription placé en 5' de ce gène. La construction de l'invention comportant le gène HSV1-ΔTK peut être introduite dans toute lignée cellulaire d'empaquetage décrite dans l'état de la technique et notamment celui cité ci-dessus : ces lignées cellulaires d'empaquetage contenant une construction de l'invention sont susceptibles de transférer le principe actif d'une drogue toxique en présence d'analogues de nucléosides pour les cellules en division et notamment les cellules cancéreuses. Les lignées cellulaires d'empaquetage transformées par un vecteur recombinant contenant le gène de la thymidine kinase portant une délétion en amont du 2éme codon d'initiation ATG codant pour le méthionine en position 46 de la protéine entière font partie de l'invention.
Il en est de même des lignées cellulaires produisant un rétrovirus dans lequel le gène env a été délété dans sa totalité, ou partiellement, et substitué par le HSV1-ΔTK et une séquence d'acides nucléiques incluant une séquence codant pour une protéine d'enveloppe, laquelle séquence est sous la dépendance d'un promoteur et est associée le cas échéant audit transgène, et flanquée à son extrémité 3' un site de polyadéπylatioπ ledit génome viral recombinant et ladite séquence étant susceptibles de se complémenter en trans et permettre à ladite cellule hôte de produire
des virus infectieux dépourvus du gène env, le tout formant un système hôte vecteur qui pourrait être injecté en tant que tel au niveau de cellules tumorales.
La séquence pseudovirale recombinante contenue dans la lignée cellulaire peut être dérivée d'un génome de Moloney MuLV ou de celui d'un virus HIV.
Dans le cas de traitement de cellules qui se divisent peu mais susceptibles d'être infectées par un virus, notamment des cellules hematopoïetiques, lesdites cellules pourront être transfectées par une construction contenant une séquence HSV1-ΔTK, sous la dépendance d'un promoteur spécifique du virus susceptible d'infecter lesdites cellules, par exemple le HIV et les lymphocytes T, la construction comprenant en outre un gène transactivable par TAT, provoquant l'activation du promoteur et de la transcription du gène en présence d'un virus infectieux. La population de cellules, notamment hematopoïetiques et contenant le type de construction de l'invention, font également partie de l'invention.
La caractéristique citée plus haut de la construction contenant HSV1-ΔTK de phosphoryler les analogues de nucléosides quand la transcription est activée et de ne pas les phosphoryler lorsque l'expression est faible, a pour conséquence que dans ce dernier cas, les cellules exprimant ledit gène suicide sont insensibles aux A.N. et notamment le GCV à des doses comprises entre 0 et 10 microMolaire, alors qu'après transactivation les cellules sont sensibles à des doses comprises entre 10"2 et 10"1 microMolaire de GCV. Les populations de cellules qui peuvent être ainsi transfectées et contenir les constructions de l'invention, peuvent être :
- soit des cellules de la lignée lymphocytaire infectables notamment par un HIV, auquel cas le promoteur pourra être un LTR de HIV,
- soit des lymphocytes T, le promoteur susceptible d'être transactivé pouvant être un promoteur de cytokine,
- soit encore les cellules souches de moelle osseuse. L'invention est également relative à :
- l'utilisation pour la production des médicaments destinés à la prévention ou au traitement de maladies induites par des virus, notamment des rétrovirus pathogènes ayant un tropisme spécifique pour certains types de cellules notamment hematopoïetiques, d'une construction porteuse d'un gène suicide sous la dépendance d'un promoteur spécifique transactivable caractérisé en ce que ledit gène
suicide est le gène de la thymidine kinase de HSV1-TK délété de tout ou partie de la séquence en 5' en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète, en particulier lorsque que la délétion inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine n° 1 , ledit vecteur rétroviral étant introduit par tout moyen approprié dans lesdites cellules ;
- l'utilisation pour la production de médicaments actifs pour induire une tolérance à des antigènes et prévenir ou traiter un rejet de greffe par thérapie génique d'une construction recombinante porteuse d'un gène HSV1-ΔTK ;
- l'utilisation pour la production de médicaments destinés au traitement par thérapie génique du cancer d'une construction recombinante appropriée porteuse du même gène HSV1 -ΔTK ;
- l'utilisation de ce type de construction pour générer des souris transgéniques exprimant l'activité HSV1-TK mais, du fait de la délétion dans la région 5' du gène, l'activation spécifique observée dans les animaux transgéniques au niveau de leurs testicules rendant ces animaux stériles est supprimée du fait de la délétion de la région concernée.
L'invention est relative à un procédé de préparation d'un vecteur viral recombinant porteur d'un gène suicide sous la dépendance d'un promoteur spécifique transactivable, la toxicité du produit du gène en présence d'analogues de nucléosides dépendant de ladite transactivation, caractérisé en ce que le gène suicide est un gène de la thymidine kinase de HSV1 (HSV1-TK) délété dans sa partie 5' de tout ou partie de la séquence en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète, en particulier lorsque que la délétion inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine n° 1.
Enfin, l'invention est relative au gène même de la thymidine kinase de HSV1-TK tronqué dans sa région 5' de tout ou partie de la séquence en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète, en particulier lorsque que la délétion inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine n° 1 et susceptible de conserver une activité de phosphorylation des analogues de nucléosides et présentant une toxicité conditionnelle en présence de GCV au-dessus de 10 microMolaire d'analogues, quand ledit gène est faiblement exprimé et présentant une
toxicité conditionnelle entre 10 et 10'1 microMolaire de A.N., essentiellement le GCV lorsque le gène est activé.
Les expériences ci-après permettront d'illustrer dans différents cas cette surprenante capacité du gène de la thymidine kinase de HSV1 tronqué et permettront, à l'aide des figures, de montrer la supériorité de l'utilisation du gène de la HSV1-ΔTK en lieu et place de HSV1-TK à chaque fois qu'un risque de toxicité résiduelle peut conduire le praticien à rejeter l'utilisation du gène complet, lorsqu'il estime que le rapport risque/bénéfice n'est pas en faveur du traitement pour une pathologie donnée.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1a est une représentation de la construction de l'invention comportant en 5' le LTR de HIV et comportant en aval et dans la direction 5'=->3' la séquence TAR (inductible par TAT) de HIV et le gène de HSVl- TK.
La figure 1b représente la construction de l'invention délétée de la région en amont du 2ème codon ATG.
La figure 2 représente la toxicité de doses croissantes de ganciclovir sur des cellules exprimant le gène HSV1-TK ou HSV1-ΔTK sous le contrôle du LTR-HIV (LTR-TK ou LTR-ΔTK) en absence ou présence de Tat. L'indication C1 indique que le 1er clone de la lignée cellulaire a été utilisé, C2 se référant à un 2ème clone et « bulk » à un mélange ou à la lignée non clonée. La figure 3 représente les profils obtenus par FPLC des différentes formes phosphorylées du GCV, après transfection cellulaire par une construction comprenant le HSV1-TK (figure 3a), une construction HSV1- ΔTK n'ayant pas été transactivée et donc ayant été faiblement exprimée (3b), et une construction HSV1-ΔTK transactivité par Tat (figure 3c). La figure 4 représente la sensibilité au ganciclovir de cellules de moelle osseuse cultivées en présence de GM-CSF et préalablement transfectées par une construction comportant HSV1-TK (carrés noirs) ou HSV1-ΔTK (-ΔTk40 et -ΔTK72) sous le contrôle du LTR-HIV.
La figure 5 représente l'effet du GCV in vivo sur des souris contrôles (D), des souris transgéniques exprimant faiblement TK (souris transgéniques dans lesquelles TK est sous le contrôle de HIV-LTR (A) exprimant faiblement Δ-TK (souris transgéniques dans lesquelles Δ-TK est sous le contrôle de HIV-LTR)(B), exprimant fortement Δ-TK (souris
transgéniques dans lesquelles Δ-TK est sous le contrôle de HIV-LTR sont croisées avec des souris transgéniques exprimant Tat sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire (•). Les graphes montrent les déplétions des cellules dendritiques obtenues après 7 jours de traitement au GCV exprimé en mg/kg/jour.
MATERIELS ET METHODES a) Construction :
Tous les clonages et sous-clonages ont été réalisés en utilisant les techniques habituelles telles que décrites dans Maniatis et al (1989 Molecular cloning laboratory, Coldspring Harbour Laboratory, Coldspring Harbour NY).
Le gène HSV1-TK ou le gène HSV1-ΔTK ont été intégrés dans un plasmide sous le contrôle du 5' LTR de HIV selon le protocole expérimental décrit par Caruso et al 1992 (7) et par Salomon et al 1995 (15). Le LTR présente deux caractéristiques remarquables :
- d'être un promoteur faible dans nos conditions expérimentales,
- d'être facilement transactivable par la protéine Tat.
Pour la construction du plasmide p LTR-ΔTK, une séquence ΔTK est amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le gène TK. Le couple d'amorces utilisé pour l'amplification PCR est le suivant : a) l'oligonucléotide en 5' de séquence :
5'CCGAATTCAAGCTTATGCCCACGCTACTGCCGG3' contient un site Eco R1 et un site Hindlll. collé à la séquence en aval du 2ème codon ATG d'initiation de TK indiqué en gras ; b) l'oligonucléotide en 3' de séquence
5'CCGGATCCACCCGTGCGTTTTATTCTGTCT3' contenant le site Barn Hl, collé à la séquence entourant le second site de polyadenylation de TK lui-même indiqué en gras. Un fragment PCR de 1 ,05 Kb est ensuite digéré avec Hindlll et Bam Hl et ligué en aval de la séquence HIV LTR du plasmide p LTR-TK délété de sa séquence TK par une digestion par Hindlll et Bam Hl. Le plasmide rétroviral pNCTat a été construit par insertion du fragment ADNc obtenu par digestion par Bam Hl du fragment Tat du plasmide pCV-1 comme décrit par Arya et al (12) en aval d'un promoteur immédiat précoce de cytomégalovirus du vecteur pNC. Ce dernier possède le gène de la néomycine et le promoteur cytomégalovirus entre les deux LTR du virus de Moloney MLV.
Le plasmide peut également contenir en 3' du LTR le gène TAR de HIV.
Les constructions utilisées seront choisies en fonction de l'utilisation que l'on souhaite faire de la toxicité du gène suicide. Dans l'utilisation comme anticancéreux on utilisera de préférence le plasmide pMTK tel que décrit dans Caruso et al. 1993 (8).
L'homme du métier saura au cas par cas choisir le système hôte vecteur qui lui convient et sont intégrés ici par référence tous les types de constructions de HSV1-TK cités ci-dessus dans l'état de la technique. b) Délétion de la partie 5' du gène HSV1-TK pour l'obtention de
HSV1-ΔTK
La délétion représentée dans la figure 1 et explicitée ci-dessus est faite par action des enzymes de restriction Hindlll et Bam Hl. c) Evaluation de la taille des transcrits courts sous le contrôle du promoteur cryptique délété dans la construction de l'invention
La présence d'un promoteur cryptique dans la séquence codant de HSV1-TK a été initialement suggérée par une analyse en Northern Blot ; dans les expériences de transfection avec un gène HSV1-TK dépourvu de promoteur puis sélection selon le critère d'obtention d'une protéine fonctionnelle, Roberts et al (13) ont détecté deux transcrits de 1,1 Kb et de 0,9 Kb. Par ailleurs Al Shawi et al (14) a détecté des transcrits dans les testicules de souris transgéniques portant le gène HSV1-TK.
La technique utilisée par les demandeurs du brevet est la technique de RPA pour "RNase Protection Assay", laquelle technique a permis d'analyser la présence et la longueur des transcrits courts dans les testicules de souris transgéniques exprimant HSVITK, par hybridation avec une sonde ARN préalablement établie comme indiquée ci-dessous puis traitement à la RNase tel que décrit dans Salomon et al 1994 (10).
La première sonde utilisée, appelée S ribosonde sur la figure 1 , a été décrite dans Salomon et al (10) ;
La deuxième sonde, appelée ribosonde P dans la figure 1, a été obtenue de la façon suivante ; un fragment de restriction Bglll-Sacl de la thymidine kinase HSV1-TK a été intégrée dans le plasmide PGEM3Z commercialisé par la société Promega ; le PGEM-TK a ensuite été linéarisé par l'enzyme Pvull puis l'ARN polymérase T7 a été utilisée sur le PGEM-TK, linéarisé pour donner finalement la ribosonde P.
d) Culture cellulaire et transfection.
La culture des cellules L et la transfection desdites cellules a été effectuée selon les techniques décrites dans Salomon et al (10). e) Prolifération cellulaire et essais de viabilité. La mesure de la prolifération cellulaire et de la viabilité des cellules après transfection par les plasmides contenant HSV1-TK ou HSV1-ΔTK puis traitement par l'analogue de nucléosides a été réalisée par comptage des cellules vivantes qui excluent le bleu trypan.
Exemple 1 : Sensibilité au ganciclovir de cellules L transfectées par une construction contenant HSV1-ΔTK Les constructions portant le LTR-ΔTK, ou le LTR-TK contrôle, ont d'abord été transfectées dans des cellules L déficientes en thymidine kinase cellulaire et sélectionnées par la présence d'une thymidine kinase fonctionnelle par sélection au HAT.
Des clones de cellules transfectées par LTR-TK poussent normalement dans le milieu de sélection alors que les clones de cellules transfectées par LTR-ΔTK apparaissent transitoirement puis meurent pendant la deuxième semaine en milieu sélectif.
Les cellules L déficientes en thymidine kinase cellulaire ont été à nouveau co-transfectées avec un plasmide exprimant l'hygromycine et la construction LTR-ΔTK. Les différents clones ont été sélectionnés dans un milieu contenant de l'hygromycine.
Le clone C1 transfecte de façon stable par LTR-ΔTK a ensuite été infecté par un rétrovirus exprimant la protéine TAT de HIV (obtenue à partir du plasmide rétroviral pNCTat) qui transactive le LTR de HIV en 5' du ΔTK, puis on opère une sélection en HAT.
Différents clones ont ainsi été sélectionnés puis testés pour leur sensibilité au ganciclovir.
Dans la figure 2 on peut voir que la dose inhibitrice 50% (ID50) du GCV est 20 μM pour les cellules L parentales et 0,02 μM pour les clones LTR-TK C1 et C2.
La ID50 du clone LTR-ΔTK (C1) est de 20 μM à savoir la même sensibilité au GCV que les cellules parentales alors que la ID50 de deux clones testés LTR-ΔTK + TAT est entre 0,03 et 0,08 μM.
On peut donc déduire de cette figure que la thymidine kinase tronquée a la même efficacité que la thymidine kinase normale lorsque le gène est activé (LTR-ΔTK + TAT), alors qu'à un faible niveau d'expression, c'est-à-dire sans transactivation par TAT, le niveau de sensibilité au ganciclovir est identique à celui trouvé dans les cellules témoins dépourvues du gène TK ou ΔTK.
Par ailleurs, nous avons vérifié cette observation sur des cellules humaines HeLa en l'absence de sélection HAT. Les clones exprimant
LTR-ΔTK transactivés par Tat obtenus uniquement après sélection en hygromycine sont tués à des concentrations de GCV inférieures à 0,1 μM.
Exemple 2 : Analyse par FPLC du degré de phosphorylation du ganciclovir.
La figure 3 montre les profils obtenus après chromatographie par FPLC (Pharmacia) des lysats de cellules L transfectées soit par LTR-TK (figure 3a), soit par LTR-ΔTK (figure 3c) ou par LTR-ΔTK + TAT (figure 3b)
L'observation de la figure indique que les profils de chromatographie sont similaires dans les deux premiers cas (3a et 3b), c'est-à-dire que en présence d'une transactivation du gène tronqué l'activité de phosphorylation de la thymidine kinase tronquée est semblable à celle de la thymidine kinase non tronquée : les pourcentages respectifs de GCV, GCV monophosphate, diphosphate et triphosphate sont comparables.
Au contraire, en l'absence de transactivation le gène LTR-ΔTK est faiblement exprimé et le lysat cellulaire ne contient que du GCV, à l'exclusion des formes phosphorylées.
Exemple 3 : Transfection du gène LTR- ΔTK dans des lignées de souris. treize lignées transgéniques portant le LTR-ΔTK ont été réalisées, les mâles de toutes ces lignées étant fertiles et transmettant le transgène à leur descendance selon une transmission mandeleienne.
Aucun transcrit court HSV1 -ΔTK n'a pu être détecté par le test RPA décrit ci-dessus dans les testicules.
Six des huit lignées transgéniques analysées quant à l'expression du transgène ont un niveau significatif de transcrits LTR-ΔTK dans la peau, lequel est comparable au niveau de transcrits TK dans les souris transgéniques LTR-TK décrits précédemment (10).
La fonctionnalité de cette expression de la thymidine kinase tronquée a été testée quant à la possible deplétion en cellules dendritiques dans lesdites souris transgéniques.
Des cellules de la moelle osseuse ont été cultivées en présence de GM-CSF pendant 6 jours, ce qui permet de générer des cellules dendritiques prolifératives.
Ont été comparées dans la figure 4 les sensibilités au GCV des cellules dendritiques de moelle osseuse provenant de souris transgéniques soit porteuses de LTR-TK, soit porteuses de LTR-ΔTK; les résultats obtenus avec les lignées transgéniques 40 et 72 portant LTR-Δ
TK y sont représentés.
La ID50 est de 40 μM pour les souris non transgéniques, de 0,035 μM pour les lignées transgéniques comportant le gène complet LTR-TK, de 2 μM pour la lignée transgénique LTR-ΔTK 72 et de 20 μM pour la lignée LTR-ΔTK 40.
Du GCV a été administré en outre à des souris de 12 lignées transgéniques différentes : la dose de 20 à 50 mg par kilo et par jour qui a été utilisée pour l'ablation des cellules dans la lignée transgénique LTR- TK 14 n'a aucun effet sur la lignée LTR-ΔTK ; seules les hautes doses de GCV (70 à 120 mg par kilo et par jour) non toxiques pour les souris non transgéniques ont un effet modéré sur 6 de ces lignées.
Les cellules dendritiques sont partiellement déplétées puisqu'elles représentent 0,4 à 0,9% des splénocytes ; ceci est à comparer au 1 ,5% obtenu avec des souris non transgéniques. Dans les souris LTR-ΔTK, l'expression de Δ-TK est très faible et explique la deplétion partielle des cellules dendritiques. Afin d'augmenter l'expression de ΔTK, nous avons croisé nos souris transgéniques LTR- ΔTK avec des souris transgéniques exprimant le gène Tat sous contrôle d'un promoteur ubiquitaire. Les souris doubles transgéniques traitées au GCV ont une deplétion des cellules dendritiques dans la rate équivalente aux souris transgéniques LTR-TK traitées au GCV comme le montre la figure 5.
L'ensemble de ces expériences montre que les cellules exprimant des faibles doses de HSV1-TK restent sensibles à l'effet toxique du GCV alors que les cellules exprimant lé HVS1-ΔTK à faible dose ne sont pas sensibles au GCV.
Tout l'avantage des constructions de l'invention apparaît bien grâce aux expériences ci-dessus, notamment en ce qui concerne la
sécurité et la diminution des risques de ce type de traitement pour les patients, puisque seule une situation de transcription active du gène confère au gène suicide sa toxicité conditionnelle. Dans le cas d'une faible expression (ou non transactivation du promoteur), le gène tronqué est incapable de phosphoryler les analogues de nucléotides et donc ils ne présentent aucune toxicité pour les cellules, même en présence de ces analogues.
La thérapie génique par gène suicide peut alors être envisagée dans le cas où l'évaluation risque/bénéfice deviendrait défavorable avec l'utilisation du gène complet.
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Claims
1. Vecteur recombinant porteur d'un gène codant pour une kinase sous la dépendance d'un promoteur et apte, quand il est exprimé dans des cellules transformées par ledit vecteur, à phosphoryler des analogues de nucléosides tels l'aciclovir ou le ganciclovir conduisant à la mort de la cellule par blocage de la replication, caractérisé en ce que le gène codant pour une kinase est le gène de la thymidine kinase du virus Herpès simplex de type 1 (HSV1-TK) délété dans sa partie 5' de tout ou partie de la séquence en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète.
2. Vecteur recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que la délétion en 5' du gène de HSV1-TK inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine n° 1.
3. Vecteur recombinant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la construction est un vecteur retroviral notamment issu du HIV ou du MoMuLV.
4. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le promoteur est un LTR de HIV, notamment HIV1 ou HIV2.
5. Vecteur selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que le promoteur est un LTR issu du virus de Moloney et notamment des variantes MOV3, et/ou MOV9 et ou MOV13.
6. Lignée cellulaire d'empaquetage, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Lignée cellulaire transfectée : a) par une séquence pseudovirale recombinante dans laquelle le gène env a été substitué par un gène suicide ; b) par une séquence d'acides nucléiques incluant une séquence codant pour une protéine d'enveloppe, laquelle séquence est sous la dépendance d'un promoteur et est associée le cas échéant audit transgène, et flanqué à son extrémité 3' un site de polyadénylation ledit génome viral recombinant et ladites séquence étant susceptibles de se complémeπter en trans et permettre à ladite cellule hôte de produire des virus infectieux dépourvus du gène env, et caractérisée en ce que le gène suicide est un gène de la thymidine kinase de HSV1 délété dans sa partie 5' de tout ou partie de la séquence en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète.
8. Lignée cellulaire transfectée selon la revendication 6 caractérisé en ce que la délétion en 5' du gène de HSV1-TK inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine n° 1.
9. Lignée cellulaire selon la revendication 7, caractérisée en ce que la séquence pseudovirale recombinante est dérivée du génome de Moloney MuLV ou du génome de HIV.
10. Population de cellules, notamment hematopoïetiques, contenant une séquence codant pour un gène suicide dont le produit d'expression, normalement faiblement exprimé peut, lorsque sa production est accrue par transactivation du promoteur, réagir avec une substance pour former un produit conduisant à la destruction desdites cellules, et caractérisées en ce que le gène suicide est le gène de la thymidine kinase de HSV1 délété de tout ou partie de la séquence en 5' en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète, ladite délétion étant telle que en l'absence de transactivation, les cellules exprimant faiblement ledit gène suicide sont insensibles aux analogues de nucléostides à des doses comprises entre 10*2 et 10 μM, et après transactivation les cellules y sont sensibles à des doses comprise entre 10"2 et 10'1 μM sur le GCV et 1 à 10μM pour l'ACV.
11. Population de cellules selon la revendication 9 caractérisée en ce que la délétion en 5' du gène de HSV1-TK inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine n° 1.
12. Population de cellules selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que la HSV1-TK tronquée a la propriété à la fois de ne pas métaboliser le ganciclovir quand il est faiblement exprimé et de phosphoryler efficacement le ganciclovir quand sa synthèse est activée notamment par l'infection par un rétrovirus.
13. Population de cellules selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules du système hématopoïétique, notamment les lymphocytes T, et en ce que le promoteur susceptible d'être activé est un LTR de HIV.
14. Population de cellules selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules du système hématopoïétique, notamment les lymphocytes T, et ce que le promoteur susceptible d'être transactivé est un promoteur de cytokine (ou récepteur de cytokine).
15. Population de cellules selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce qu'if s'agit de cellules de moelle osseuse.
16. Procédé de préparation d'un vecteur viral recombinant porteur d'un gène suicide sous la dépendance d'un promoteur spécifique transactivable, la toxicité du produit du gène en présence d'analogues de nucléosides est dépendant de ladite transactivation, caractérisé en ce que le gène suicide est un gène de la thymidine kinase de HSV1 (HSV1-TK) délété dans sa partie 5' de tout ou partie de la séquence en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète.
17. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la la délétion en 5' du gène de HSV1-TK inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine n° 1.
18. Utilisation pour la production de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des maladies induites par des virus, et notamment des rétrovirus pathogènes ayant un tropisme spécifique pour certains types de cellules, notamment hematopoïetiques, d'un vecteur recombinant porteur d'un gène suicide sous la dépendance d'un promoteur spécifique transactivable, caractérisé en ce que ledit gène suicide est le gène de la thymidine kinase de HSV1 (HSV1-TK) délété de tout ou partie de la séquence en 5' en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète, ledit vecteur rétro viral étant introduit par tout moyen approprié dans lesdites cellules.
19. Utilisation pour la production de médicaments actifs pour induire une tolérance à des antigènes et prévenir ou traiter un rejet de greffe par thérapie génique, d'une construction recombinant porteur d'un gène suicide sous la dépendance d'un promoteur spécifique transactivable, caractérisé en ce que ledit gène suicide est le gène de la thymidine kinase de HSV1 (HSV1-TK) délété dans sa partie 5' de tout ou partie de la séquence en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète, ledit vecteur rétro viral étant introduit par tout moyen approprié dans les cellules responsables de la réaction immunitaire de rejet.
20. Utilisation pour la production de médicaments destinés au traitement par thérapie génique du cancer d'une construction recombinante appropriée porteur d'un gène suicide sous la dépendance d'un promoteur spécifique transactivable, caractérisé en ce que ledit gène suicide est le gène de la thymidine kinase de HSV1 (HSV1-TK) délété dans sa partie 5' de tout ou partie de la séquence en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète, ledit vecteur rétroviral étant introduit par tout moyen approprié dans les cellules tumorales.
21. Utilisation selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisé en ce que la délétion en 5' du gène de HSV1-TK inclue tout ou partie du 1 er codon d'initiation correspondant à la méthionine nβ 1.
22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisée en ce que le gène HSV1-TK délété est sous la dépendance d'un promoteur spécifique activable en trans directement ou indirectement par une substance exogène, de telle façon que en l'absence d'une telle activation, la population de cellules porteuses dudit gène est insensible à l'addition d'analogues de nucléosides et en présence d'une telle activation conduisant à une production accrue du produit du gène suicide, et est toxique pour la population de cellules porteuses du gène.
23. Utilisation selon l'une des revendications 18 à 22, caractérisée en ce que le produit du gène HSV1-TK délété est capable de phosphoryler les analogues de nucléotides, notamment le ganciclovir et l'aciclovir.
24. Gène de la thymidine kinase de HSV1 caractérisé en ce qu'il contient une délétion de tout ou partie de la séquence en 5' en amont du deuxième codon d'initiation ATG correspondant à la méthionine 46 de la protéine complète.
25. Gène selon la revendication 24 caractérisé en ce que la délétion en 5' du gène de HSV1-TK inclue tout ou partie du 1er codon d'initiation correspondant à la méthionine nβ 1.
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