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WO1996000299A1 - Nucleic acid fragments, derivatives of the mycobacterium xenopi genome, and applications thereof - Google Patents

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Publication number
WO1996000299A1
WO1996000299A1 PCT/FR1995/000831 FR9500831W WO9600299A1 WO 1996000299 A1 WO1996000299 A1 WO 1996000299A1 FR 9500831 W FR9500831 W FR 9500831W WO 9600299 A1 WO9600299 A1 WO 9600299A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fragment
xenopi
sequence
seq
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/000831
Other languages
French (fr)
Inventor
Mathieu Picardeau
Véronique VINCENT
Original Assignee
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Publication of WO1996000299A1 publication Critical patent/WO1996000299A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)

Definitions

  • the present invention relates to fragments of nucleic acids, derived from the genome of Mycobacterium xenopi, to their applications in typing and to the specific identification of MycoJbacteriuin xenopi and to screening for Mycobacterium xenopi infections thus believed to be plasmids containing said fragments.
  • M. xenopi represents one of the frequently isolated species, among the pathogenic mycobacteria and constitutes, with M. kansasii and M. avium, the main agent of pulmonary infections due to opportunistic mycobacteria in sero-negative patients against the human immunodeficiency virus.
  • M. kansasii and M. avium the main agent of pulmonary infections due to opportunistic mycobacteria in sero-negative patients against the human immunodeficiency virus.
  • the pulmonary diseases due to these different mycobacteria cannot be distinguished clinically, radiologically or histologically.
  • Nosocomial lung diseases have also been demonstrated and are due to the presence of M. xenopi in the environment and in particular in tap water.
  • the presence or absence of mycobacteria can also be determined by hybridization with probes, preferably non-radioactive, which are either probes specific for the DNA sequences of the different species of mycobacteria; or probes specific to a conserved portion of 16S RNA, which have simplified and reduced the identification time for mycobacteria.
  • probes preferably non-radioactive, which are either probes specific for the DNA sequences of the different species of mycobacteria; or probes specific to a conserved portion of 16S RNA, which have simplified and reduced the identification time for mycobacteria.
  • These probes have shown their interest in the identification of the tuberculosis bacillus, M. avium, M. intracellulare and M. gordonae (M. GOTO et al., J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 2473 -2476; L. LEBRUN et al., 1992, J. Clin. Microbiol., 30, 2476- 24778), but cannot be used
  • Direct sequencing of the amplified product provides a certain means of identification, but requires, for routine application, an automatic sequencer, which is an investment that is far too large for most laboratories.
  • the present invention has, therefore, given itself the aim of providing a specific identification and / or screening method for M. xenopi, allowing rapid identification of a species and / or detection of small quantities of DNA extracted from the germs, themselves in limited number, and revealing the presence of said mycobacteria, directly in the pathological samples.
  • the subject of the present invention is a nucleotide sequence, characterized in that it consists of a nucleotide sequence, specific for M. xenopi, contained in a Pstl-Pstl sequence of 1200 base pairs (bp) of the genomic DNA of M. xenopi or a fragment thereof, and in that it does not hybridize, under stringent hybridization conditions, with any other nucleotide sequence of mycobacterium.
  • nucleotide sequence means both a double-stranded DNA sequence, a single-stranded DNA sequence and the transcripts of said sequences.
  • Such hybridization conditions can in particular be defined as follows: 6 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.5% SDS, 100 ⁇ g of sperm DNA from denatured sau ⁇ my / ml, DNA probe labeled with 32 p ( 10 ⁇ cpm / ml), for 16 h at 68 ° C.
  • This 1200 bp sequence is unexpectedly common to all strains of M. xenopi.
  • the present invention also includes the fragments of this 1200 bp sequence, useful for the identification of the species M. xenopi, and in particular:
  • CACACCGATTGTG - GGAATAGTCAGAGCCCG (XENl) (SEQ n ° 3) and
  • the invention also relates to nucleotide fragments complementary to the previous ones, as well as fragments modified, compared to the previous ones, by removal or addition of nucleotides in a proportion of about 15% relative to the length of the above fragments. above, and / or modified at the level of the nature of the nucleotides, since the modified nucleotide fragments retain a capacity for hybridization with the DNA sequence of M. xenopi, analogous to that presented by the corresponding unmodified fragments .
  • the subject of the present invention is also reagents for identifying M. xenopi, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence or a fragment thereof, as defined above, possibly associated with a appropriate marker.
  • Such a reagent unexpectedly allows the specific identification of M. xenopi, to the exclusion of any other mycobacterium.
  • reagents consist of pairs of primers for the synthesis of a DNA or RNA fragment of M. xenopi, each primer comprising a sequence or a fragment of nucleotide sequence such as defined above.
  • a pair of primers according to the invention consists in particular of the oligonucleotide XEN1 (SEQ No. 3), paired with the oligonucleotide XEN2 (SEQ No. 4).
  • primers allow in particular the synthesis of the sequence SEQ No. 2 defined above and / or of its complementary strand.
  • said reagents consist of a probe for detection and / or identification of a DNA or RNA fragment of M. xenopi.
  • said detection probe is selected from the group consisting of the Pstl-Pstl sequence of 1200 bp of the genomic DNA of M. xenopi, the sequence SEQ No. 1 and the sequence SEQ No. 2, as defined above.
  • the marker is chosen from the group which notably includes radioactive isotopes, suitable enzymes, fluorochromes, appropriate chemical markers, haptens and basic antibodies or analogs such as those described in French Patent 2,518,755 or European Patent Application 0,158,758.
  • Said reagents can be used in a very large number of diagnostic techniques, based on the detection of nucleic acid by hybridization.
  • the present invention also relates to a family of recombinant plasmids, characterized in that they contain at least one nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • said plasmid comprises the 1200 bp Pstl-Pstl nucleotide sequence as defined above or a fragment thereof.
  • said plasmid comprises said sequence associated with a vector pBS.
  • said plasmid comprises the nucleotide sequence SEQ No. 1.
  • said plasmid comprises said sequence associated with a vector pUC18.
  • the present invention also relates to a rapid and specific identification method for M. xenopi, characterized in that it comprises: (1) a step in which the nucleic acid of the mycobacterium to be identified is brought into contact with a pair of primers as defined above, in order to amplify a nucleic acid fragment specific for M. xenopi and
  • step (1) a step in which the product obtained in step (1) is detected by any suitable means.
  • step (1) prior to step (1), the mycobacteria are lysed and step (1) is carried out directly on said lysates, constituting the source of DNA, and this , without requiring any other purification.
  • said pair of primers corresponds to the pair XEN1-XEN2, capable of hybridizing the 5 ′ and 3 ′ ends of a specific fragment of M xenopi.
  • step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by detection at using an appropriate dye.
  • step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by membrane transfer (Southern method) and hybridization with a non-radioactive probe as defined above.
  • the present invention also relates to a method for screening for an infection with M. xenopi, in a biological sample, characterized in that it comprises: (1) a step in which the biological sample is brought into contact with at least one diagnostic reagent according to the invention and
  • step (1) a step in which the product obtained in step (1) is detected by any suitable means.
  • the diagnostic reagent of step (1) is a pair of primers in accordance with the invention and makes it possible to obtain amplification products of the nucleotide sequence to be detected .
  • the amplification step is in particular one of the gene amplification techniques, such as the Q ⁇ -replicase method (LIZARDI PM. Et al., Biotechnol., 1988, 6) or the so-called PCR method (Polymerase Chain. Reaction ) described in European Patent Applications 0 200 363, 0 201 184 and 0 229 701 filed by CETUS CO.
  • Q ⁇ -replicase method LIZARDI PM. Et al., Biotechnol., 1988, 6
  • PCR method Polymerase Chain. Reaction
  • the amplification step of the DNA fragment containing the specific sequence of 288 bp is carried out in accordance with the process described in French Patent Application 92 13562, in the name of BIOMERIEUX.
  • step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by detection using an appropriate colourant.
  • step (2) comprises an electrophoretic tion choira ⁇ amplification products obte ⁇ bare at the end of step (1), followed 'by transfer to a membrane (Southern method) and '' hybridization with a non-radioactive probe as defined above.
  • the diagnostic reagent of step (1) is a probe as defined above.
  • the present invention further relates to a kit, ready to use, for implementing the identification process and / or the screening method according to the invention, characterized in that it includes, in addition to useful quantities of appropriate buffers and reagents:
  • kit it comprises: a pair of primers constituted by the sequences SEQ No. 3 (XEN1) and SEQ No. 4 (XEN2) defined above, - the reagents necessary for carrying out a amplification,
  • a component making it possible to verify the sequence of amplified fragments more particularly a nucleic probe having a length of at least 20 bases, capable of hybridizing with part of the sequence SEQ No. 1 or SEQ No. 2 , lying between the two fragments of the above-mentioned primer pair.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.
  • the mycobacteria are cultivated on a Middlebrook 7H9 medium containing glycine at 1.4% (w / v), lysozyme (400 ⁇ g / ml) and D-cycloserine (200 ⁇ g / ml) for 24 h at 37 ° vs.
  • the cultures are then centrifuged at 3000 rpm for 20 min.
  • the pellets are returned to suspension in a TEN buffer (pH 8), comprising 50 mM Tris, 50 mM ⁇ DTA and 10 mM NaCl, treated with proteinase K at 2.25 mg / ml and SDS. (Sodium Dodecyl Sulfate) at 0.6% (w / v) and incubated overnight at 37 ° C.
  • the digestion products are separated for 1 night by electrophoresis on an agarose gel at 0.7% at 1.5 volts / cm. There is thus obtained in particular a Pstl-Pstl fragment of 1200 bp, present in all the M. xenopi strains.
  • 288 bp fragment (SEQ n ° 1): This fragment is obtained by PCR, carried out either from the 1200 bp fragment, or directly from a sample of M. xenopi, under the following conditions: at. Lysis of mycobacteria: Mycobacteria of the species M. xenopi are suspended in distilled water and subjected to 3 cycles of boiling-freezing, each comprising 5 min at 100 ° C and 5 min at -20 ° C; a cell lysate is thus obtained, which is used as a direct source of DNA, without requiring further purification.
  • DNA amplification The amplification is carried out as follows: 100 ⁇ l of a reaction mixture containing:
  • a Taq polymerase buffer 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , gelatin at
  • DKU49 a single primer, called DKU49, of sequence 5 '-CCGCCGACCGAG-3' (P.S. PALITTAPONGARNPIM et al., 1993, J. Infect. Dis., 161,975-978), and
  • FIG. 1 illustrates the specificity of the 288 bp fragment, with respect to the species M. xenopi.
  • FIG. 1A corresponds to a 1.5% agarose gel electrophoresis of the 288 bp sequence, which is then detected by staining with ethidium bromide.
  • the gel obtained is stirred for 20 min in a 0.25 M HCl solution (13 ml HCl + 500 ml distilled water), then rinsed 3 times with distilled water. * Denaturation: The gel is then stirred 20 min with a buffer
  • the membrane is pre-hybridized for 1 h at 42 ° C and at 6 rpm with 30 ml, for a blot of 320 cm * 2 , of a hybridization buffer supplied in the ECL kit Amersham RPN 3001, and preheated to 42 ° C, for 30 min to 1 h);
  • buffer A 1.6 ml of 10% SDS, 1 ml of 20x SSC, 37.4 ml of distilled water per 320 cm 2 , preheated to 55 ° C;
  • 2nd wash identical to the first wash; 3rd wash, carried out with stirring: the mem ⁇ brane is washed for 5 min at room temperature in a campon B (2x SSC);
  • the membrane is hybridized with a buffer comprising 6xSSC (lxSSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate buffer) 5 ⁇ Denhardt reagent a 50 ⁇ stock solution of Denhardt reagent comprises: 5 g of Ficoll, 5 g of polyvinylpyrrolidone, 5 g of bovine albumin serum and 500 ml of I ⁇ O), 0.5% SDS, 100 ⁇ g of denatured salmon sperm DNA / ml, in the presence of a DNA probe labeled with 32 P (10 ⁇ cpm / ml), for 16 h at 68 ° C. . 4 washes are then carried out as follows:
  • 1st wash the membrane is washed for 10 min, at 65 ° C., in a 2xSSC buffer.
  • 3rd wash the membrane is washed 30 min, at 65 ° C, in a buffer comprising 2xSSC and 0.1% SDS.
  • the membranes are then quickly dried.
  • the probe having hybridized (1st protocol) is detected as follows: the membrane is incubated for 1 min in an Amersham detection solution (ECL detection reagent, reference RPN 2105), the excess solution is quickly dried detection and revealed by autoradiography. d. Demonstration of the hybridization of the 288 bp frag ⁇ ment with the 1200 bp sequence:
  • the amplified DNA (sequence of 288 bp) is separated by electrophoresis on 1.5% agarose gel; the frag ⁇ ment thus separated is then recovered by electroelution through a dialysis membrane, immersed in sterile water.
  • the DNA thus obtained is then purified by precipitation with chloroform and ethanol.
  • the probe is then labeled with horseradish peroxidase using the Amersham ECL kit (direct nucleic acid labeling and detection Systems (ref. RPN 3001)).
  • the gels obtained are transferred to nylon mem ⁇ branes by the Southern method and hybridized with the labeled probe according to the invention, as mentioned above in c ..
  • FIG. 3 illustrates the results obtained and shows that under the hybridization conditions specified above, the 288 bp fragment hybridizes exclusively with the strains of the species M. xenopi (28 strains tes- tees) and more particularly with the PstI digestion fragment of about 1200 bp which is found in all strains of M. xenopi, while this probe does not recognize any fragment of other mycobacterial DNAs.
  • the comparison of FIGS. 1A and 3 shows a perfect correlation between the results obtained by the two methods: PCR and Southern blot analysis.
  • tracks 1 to 4 and 11 to 16 correspond to strains of M. xenopi
  • lanes 5 and 8 correspond to strains of M. tuberculosis
  • tracks 6 and 7 correspond to strains of M. avium
  • tracks 9 and 10 correspond to strains of M. bovis and M. celatum respectively.
  • This 288 bp fragment produced by PCR using the primer DKU49 as specified above in 2) b. , was cloned into a vector pUC18, previously digested with the restriction enzyme Smal.
  • the recombinant colonies were selected on LB solid medium supplemented with isopropyl ⁇ -D-thiogalactoside, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (X-gal) and 1 ampicillin at 100 ⁇ g / ml.
  • the pUC18 plasmids which contain the inserts are purified using Qiagen® mini-columns (Qiagen® "Midi” kit, Qiagen Inc, USA).
  • primers are significantly more specific than the primer DKU49. Indeed, the latter although allowing the production of the 288 bp fragment described above and also highly specific for M. xenopi, when used to carry out amplifications, results in the production of an additional fragment of 800 bp ( Figure 1A), for the majority of strains.
  • Both the 288 bp product and the 263 bp product are highly specific for M. xenopi and do not hybridize with any of the strains of other mycobacterial species; even M. DCatum, a new species of mycobacterium recently isolated and which presents phenotypic similarities with M. xenopi does not show cross hybridization with these specific probes.
  • the primers XEN1 and XEN2 which allow the amplification of this 263 bp fragment in all strains of M. xenopi, even in those which additionally accumulate an 800 bp fragment when the primer DKU49 is used (FIG. 4) , are particularly interesting for obtaining a unique PCR profile, shared by all strains of M. xenopi and consisting of a single band.
  • EXAMPLE 2 identification test of M. xenopi.
  • the sensitivity of the PCR tests was determined by an amplification carried out with 10 th dilutions in series, from the template DNA.
  • lanes 1 to 10 correspond to dilutions at lOth, starting with approximately 10 ng of DNA.
  • Lane 11 corresponds to ⁇ DNA digested with the restriction enzyme PstI (control); dilutions were made in sterile water.
  • the 288 bp fragment can be detected by staining with ethydium bromide up to 100 ⁇ g of DNA, while hybridization with the probe increases the sensitivity of detection by a factor of 1000 (FIGS. 2A and 2B ).
  • the detection threshold is as low as 10 ⁇ cells, which is well below the minimum required when considering that a colony contains 10 * ⁇ cells.
  • EXAMPLE 3 Screening test for M. xenopi.

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Abstract

Nucleic acid fragments, derivatives of the Mycobacterium xenopi genome, their applications to the typing and specific identification of the Mycobacterium xenopi, and to the screening for Mycobacterium xenopi infections, as well as to plasmids containing said fragments. Such a nucleotide sequence is comprised of a nucleotide sequence, specific to M. xenopi which does not hybridize in stringent hybridation conditions, with any other nucleotide sequence of mycobacteria; it is particularly contained in a sequence PstI-PstI of 1200 pairs of bases (pb) or a fragment of such sequence, such as the fragment of 288 pb, which has formula (SEQ n°1).

Description

FRAGMENTS D'ACIDES NUCLEIQUES, DERIVES DU GENOME DE MYCO¬ BACTERIUM XENOPI ET LEURS APPLICATIONS.FRAGMENTS OF NUCLEIC ACIDS, DERIVATIVES OF THE GENOME OF MYCO¬ BACTERIUM XENOPI AND THEIR APPLICATIONS.
La présente invention est relative à des frag¬ ments d'acides nucléiques, dérivés du génome de Myco- bacterium xenopi , à leurs applications au typage et à l'identification spécifique de MycoJbacteriuin xenopi et au dépistage des infections à Mycobacterium xenopi ainsi cru'à des plasmides contenant lesdits fragments .The present invention relates to fragments of nucleic acids, derived from the genome of Mycobacterium xenopi, to their applications in typing and to the specific identification of MycoJbacteriuin xenopi and to screening for Mycobacterium xenopi infections thus believed to be plasmids containing said fragments.
En Europe, M. xenopi représente l'une des espèces fréquemment isolée, parmi les mycobactéries pathogènes et constitue avec M. kansasii et M. avium, 1 ' agent principal des infections pulmonaires dues à des mycobactéries opportunistes chez les patients séro¬ négatifs vis-à-vis du virus de 1 ' immunodéficience humaine. Toutefois, les maladies pulmonaires dues à ces différentes mycobactéries ne peuvent pas être distinguées cliniquement, radiologiquement ou histologiquement.In Europe, M. xenopi represents one of the frequently isolated species, among the pathogenic mycobacteria and constitutes, with M. kansasii and M. avium, the main agent of pulmonary infections due to opportunistic mycobacteria in sero-negative patients against the human immunodeficiency virus. However, the pulmonary diseases due to these different mycobacteria cannot be distinguished clinically, radiologically or histologically.
Chez les patients atteints de SIDA, des infec¬ tions disséminées dues à M. xenopi ont été signalées aussi bien en Europe qu'aux Etats-Unis (V. AUSINA et al., 1988, Ann. Intern. Med. , 109., 927-928 ; R. . SHAFER et al., 1992, AIDS. Clin. Infect. Dis., lu, 161-162) et peuvent être de diagnostic difficile.In AIDS patients, disseminated infections due to M. xenopi have been reported in both Europe and the United States (V. AUSINA et al., 1988, Ann. Intern. Med., 109., 927-928; R.. SHAFER et al., 1992, AIDS. Clin. Infect. Dis., Lu, 161-162) and can be difficult to diagnose.
Des maladies pulmonaires nosocomiales ont éga- lement été mises en évidence et sont dues à la présence de M. xenopi dans 1 ' environnement et notamment dans 1 'eau du robinet.Nosocomial lung diseases have also been demonstrated and are due to the presence of M. xenopi in the environment and in particular in tap water.
L'existence de mycobactérioses pulmonaires dues à plusieurs types de mycobactéries et la difficulté de les distinguer par des signes cliniques, nécessite la mise au point de méthodes rapides de détection et d'iden¬ tification spécifique de chacune de ces mycobactéries, notamment dans la mesure où les traitements applicables sont différents. En outre, dans les différentes infections à mycobactéries, ces dernières sont souvent présentes en faibles quantités, et lorsqu'elles sont en quantités détectables par les méthodes classiquement utilisées, la maladie est déjà en évolution et les malades sont conta¬ gieux pour leur entourage. Plusieurs techniques sont actuellement utili¬ sées en clinique, pour identifier l'espèce impliquée dans une infection mycobacterienne ; on peut citer notamment :The existence of pulmonary mycobacteriosis due to several types of mycobacteria and the difficulty of distinguishing them by clinical signs, requires the development of rapid methods of detection and specific identification of each of these mycobacteria, in particular in the measurement where the applicable treatments are different. In addition, in the various mycobacterial infections, the latter are often present in small quantities, and when they are in quantities detectable by the conventionally used methods, the disease is already in evolution and the patients are contagious for those around them. Several techniques are currently used clinically to identify the species involved in a mycobacterial infection; we can cite in particular:
- la détection directe des microorganismes au microscope ; cette technique est rapide mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobacterienne observée et manque de sensibilité, dans la mesure où un grand nombre de microorganismes doit être présent dans l'échan¬ tillon (supérieur à 10^/ml) pour permettre une détection fiable. - les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100.% et permettent l'identification de l'espèce mycobacterienne isolée (tests biochimiques) ,* néanmoins, il s'agit d'un proces¬ sus à long terme qui nécessite au moins 4 semaines pour la formation de colonies et lorsque peu de mycobactéries sont présentes au site de l'infection, des cultures répé¬ tées sont nécessaires pour s'assurer d'un résultat posi¬ tif.- direct detection of microorganisms under the microscope; this technique is rapid but does not allow the identification of the mycobacterial species observed and lacks sensitivity, insofar as a large number of microorganisms must be present in the sample (greater than 10 ^ / ml) to allow reliable detection. - cultures, when positive, have a specificity approaching 100.% and allow the identification of the isolated mycobacterial species (biochemical tests), * nevertheless, it is a long-term process which requires at least 4 weeks for colony formation and when few mycobacteria are present at the site of infection, repeated cultures are necessary to ensure a positive result.
- les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faible.- serological techniques may prove useful under certain conditions, but their use is limited by their low sensitivity and / or specificity.
- la présence ou l'absence de mycobactéries peut également être déterminée par hybridation avec des sondes, de préférence non-radioactives, qui sont soit des sondes spécifiques des séquences d'ADN des différentes espèces de mycobactéries ; soit des sondes spécifiques d'une portion conservée de l'ARN 16S, qui ont permis de simplifier et de réduire la durée d'identification des mycobactéries. Ces sondes ont montré leur intérêt pour l'identification du bacille de la tuberculose, de M. avium, de M. intracellulare et de M. gordonae (M. GOTO et al., J. Clin. microbiol . , 1991, 29, 2473-2476 ; L. LEBRUN et al., 1992, J. Clin. Microbiol., 3_0, 2476- 24778) , mais ne sont pas utilisables pour M. xenopi .- The presence or absence of mycobacteria can also be determined by hybridization with probes, preferably non-radioactive, which are either probes specific for the DNA sequences of the different species of mycobacteria; or probes specific to a conserved portion of 16S RNA, which have simplified and reduced the identification time for mycobacteria. These probes have shown their interest in the identification of the tuberculosis bacillus, M. avium, M. intracellulare and M. gordonae (M. GOTO et al., J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 2473 -2476; L. LEBRUN et al., 1992, J. Clin. Microbiol., 30, 2476- 24778), but cannot be used for M. xenopi.
- plusieurs méthodes ont été récemment déve¬ loppées, utilisant la PCR, pour l'amplification d'un fragment sélectionné pour sa séquence hypervariable dans un gène conservé parmi les mycobactéries ,* il s'agit, en particulier, de fragments correspondant à l'ARN 16S ou au gène codant pour la protéine de 65 kDa (PLIKAYTIS B.B. et al., J. Clin. Microbiol., 1992, 30, 7, 1815-1822) .- several methods have recently been developed, using PCR, for the amplification of a fragment selected for its hypervariable sequence in a gene conserved among mycobacteria, * these are, in particular, fragments corresponding to the 16S RNA or to the gene coding for the 65 kDa protein (PLIKAYTIS BB et al., J. Clin. Microbiol., 1992, 30, 7, 1815-1822).
Le séquençage direct du produit amplifié assure un moyen d'identification certain, mais nécessite, pour une application en routine, un séquenceur automati¬ que, qui est un investissement bien trop important pour la plupart des laboratoires.Direct sequencing of the amplified product provides a certain means of identification, but requires, for routine application, an automatic sequencer, which is an investment that is far too large for most laboratories.
- pour éviter le séquençage du produit ampli- fié, certains Auteurs ont mis au point une analyse des fragments de digestion obtenus à partir des produits de la PCR (A. TELENTI et al., 1993, J. Clin. Microbiol., 3_1,- to avoid sequencing of the amplified product, some Authors have developed an analysis of the digestion fragments obtained from the PCR products (A. TELENTI et al., 1993, J. Clin. Microbiol., 3_1,
175-178, PLIKAYTIS B.B. et al., précité) .175-178, PLIKAYTIS B.B. et al., Cited above).
Cependant, de telles méthodes nécessitent plu- sieurs digestions et plusieurs enzymes pour établir une identification certaine et sont donc également difficiles à mettre en oeuvre en routine.However, such methods require several digestions and several enzymes to establish a certain identification and are therefore also difficult to implement in routine.
Les différentes méthodes de détection de l'Art antérieur ne permettent donc pas d'identifier et/ou de dépister rapidement une infection à M. xenopi ; or une telle identification d'espèce est cruciale, pour donner aux patients, dans les meilleurs délais, le traitement le plus adapté.The various detection methods of the prior art therefore do not allow rapid identification and / or detection of an infection with M. xenopi; however such identification of species is crucial, to give patients, as soon as possible, the most suitable treatment.
La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé d'identification et/ou de dépistage spécifique de M. xenopi , permettant une identification d'espèce rapide et/ou une détection de faibles quantités d'ADN extraits des germes, eux-mêmes en nombre restreint, et de révéler la présence desdites mycobactéries, directement dans les échantillons patholo- giques.The present invention has, therefore, given itself the aim of providing a specific identification and / or screening method for M. xenopi, allowing rapid identification of a species and / or detection of small quantities of DNA extracted from the germs, themselves in limited number, and revealing the presence of said mycobacteria, directly in the pathological samples.
C'est également un but de l'invention de pour¬ voir à des réactifs d'identification et de dépistage spé¬ cifique de M. xenopi .It is also an object of the invention to provide reagents for identification and specific screening for M. xenopi.
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique, spécifique de M. xenopi , contenue dans une séquence Pstl-Pstl de 1200 paires de bases (pb) de l'ADN genomique de M. xenopi ou un fragment de celle-ci, et en ce qu'elle ne s 'hybride, dans des conditions stringentes d'hybridation, avec aucune autre séquence nucléotidique de mycobactérie.The subject of the present invention is a nucleotide sequence, characterized in that it consists of a nucleotide sequence, specific for M. xenopi, contained in a Pstl-Pstl sequence of 1200 base pairs (bp) of the genomic DNA of M. xenopi or a fragment thereof, and in that it does not hybridize, under stringent hybridization conditions, with any other nucleotide sequence of mycobacterium.
On entend par séquence nucléotidique, dans la présente invention, aussi bien une séquence d'ADN double brin, une séquence d'ADN simple brin que les produits de transcription desdites séquences .In the present invention, the term “nucleotide sequence” means both a double-stranded DNA sequence, a single-stranded DNA sequence and the transcripts of said sequences.
De telles conditions d'hybridation peuvent être notamment définies comme suit : 6xSSC, 5x solution de Denhardt, SDS à 0,5 %, 100 μg d'ADN de sperme de sau¬ mon dénaturé/ml, sonde d'ADN marqué au 32p (10^ cpm/ml) , pendant 16 h à 68°C.Such hybridization conditions can in particular be defined as follows: 6 × SSC, 5 × Denhardt solution, 0.5% SDS, 100 μg of sperm DNA from denatured sau¬ my / ml, DNA probe labeled with 32 p ( 10 ^ cpm / ml), for 16 h at 68 ° C.
Cette séquence de 1200 pb est, de manière inattendue, commune à toutes les souches de M. xenopi .This 1200 bp sequence is unexpectedly common to all strains of M. xenopi.
La présente invention englobe également les fragments de cette séquence de 1200 pb, utiles pour l'identification de l'espèce M. xenopi , et notamment :The present invention also includes the fragments of this 1200 bp sequence, useful for the identification of the species M. xenopi, and in particular:
- un fragment de 288 pb, de formule (SEQ n°l) suivante : XEN1 > 50- a 288 bp fragment, of formula (SEQ No. 1) below: XEN1> 50
CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTA DKU49 >CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTA DKU49>
100100
CCACGATGGACACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCC 150CCACGATGGACACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCC 150
II
TTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGATTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGA
200 I200 I
GCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGCGCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGC
250250
I ATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTI ATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCT
< XEN2<XEN2
ATAGCTGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG < DKU49ATAGCTGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG <DKU49
- un fragment de 263 pb (SEQ n°2) suivante- a fragment of 263 bp (SEQ n ° 2) following
50 GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGAC50 GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGAC
100100
ACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAG IAACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAG IA
150150
GGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGC 200 AAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAAC ICGGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGC 200 AAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAAC IC
250 |250 |
CTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTATAGCTGCTGCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTATAGCTGCTGC
CACACCGATTGTG, - GGAATAGTCAGAGCCCG (XENl) (SEQ n°3) etCACACCGATTGTG, - GGAATAGTCAGAGCCCG (XENl) (SEQ n ° 3) and
GTGTTAGCCACACCGTC (XEN2) (SEQ n°4) L'invention vise aussi des fragments nucléoti- diques complémentaires des précédents, ainsi que des fragments modifiés, par rapport aux précédents, par enlè¬ vement ou addition de nucléotides dans une proportion d'environ 15 % par rapport à la longueur des fragments ci-dessus, et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec la séquence d'ADN de M. xenopi , analogue à celle que présen- tent les fragments correspondants non modifiés.GTGTTAGCCACACCGTC (XEN2) (SEQ n ° 4) The invention also relates to nucleotide fragments complementary to the previous ones, as well as fragments modified, compared to the previous ones, by removal or addition of nucleotides in a proportion of about 15% relative to the length of the above fragments. above, and / or modified at the level of the nature of the nucleotides, since the modified nucleotide fragments retain a capacity for hybridization with the DNA sequence of M. xenopi, analogous to that presented by the corresponding unmodified fragments .
La présente invention a également pour objet des réactifs d'identification de M. xenopi , caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléoti¬ dique ou un fragment de celle-ci, tels que définis ci- dessus, éventuellement associés à un marqueur approprié.The subject of the present invention is also reagents for identifying M. xenopi, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence or a fragment thereof, as defined above, possibly associated with a appropriate marker.
Un tel réactif permet, de manière inattendue, l'identification spécifique de M. xenopi , à l'exclusion de toute autre mycobactérie.Such a reagent unexpectedly allows the specific identification of M. xenopi, to the exclusion of any other mycobacterium.
Selon un mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils sont constitués par des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi , chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique telle que définie ci- dessus . Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, une paire d'amorces conforme à l'inven¬ tion est notamment constituée par 1 ' oligonucléotide XENl (SEQ n°3) , apparié à 1 ' oligonucléotide XEN2 (SEQ n°4) .According to an advantageous embodiment of said reagents, they consist of pairs of primers for the synthesis of a DNA or RNA fragment of M. xenopi, each primer comprising a sequence or a fragment of nucleotide sequence such as defined above. According to an advantageous arrangement of this embodiment, a pair of primers according to the invention consists in particular of the oligonucleotide XEN1 (SEQ No. 3), paired with the oligonucleotide XEN2 (SEQ No. 4).
Ces amorces permettent notamment la synthèse de la séquence SEQ n°2 définie ci-dessus et/ou de son brin complémentaire.These primers allow in particular the synthesis of the sequence SEQ No. 2 defined above and / or of its complementary strand.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils sont constitués par une sonde de détection et/ou d'identification d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi . Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite sonde de détection est sélection¬ née dans le groupe constitué par la séquence Pstl-Pstl de 1200 pb de l'ADN genomique de M. xenopi , la séquence SEQ n°l et la séquence SEQ n°2, telles que définies ci- dessus .According to another advantageous embodiment of said reagents, they consist of a probe for detection and / or identification of a DNA or RNA fragment of M. xenopi. According to an advantageous arrangement of this embodiment, said detection probe is selected from the group consisting of the Pstl-Pstl sequence of 1200 bp of the genomic DNA of M. xenopi, the sequence SEQ No. 1 and the sequence SEQ No. 2, as defined above.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notam¬ ment les isotopes radioactifs, les enzymes appropriées, les fluorochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base tels que ceux décrits dans le Brevet français 2 518 755 ou la Demande de Brevet européen 0 158 758.According to another advantageous embodiment, the marker is chosen from the group which notably includes radioactive isotopes, suitable enzymes, fluorochromes, appropriate chemical markers, haptens and basic antibodies or analogs such as those described in French Patent 2,518,755 or European Patent Application 0,158,758.
Lesdits réactifs peuvent être utilisés dans un très grand nombre de techniques de diagnostic, basées sur la détection d'acide nucléique par hybridation.Said reagents can be used in a very large number of diagnostic techniques, based on the detection of nucleic acid by hybridization.
La présente invention a également pour objet une famille de plasmides recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention.The present invention also relates to a family of recombinant plasmids, characterized in that they contain at least one nucleotide sequence in accordance with the invention.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique Pstl-Pstl de 1200 pb telle que définie ci-dessus ou un fragment de celle-ci . Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit plasmide comprend ladite séquence as¬ sociée à un vecteur pBS.According to an advantageous embodiment of said plasmid, it comprises the 1200 bp Pstl-Pstl nucleotide sequence as defined above or a fragment thereof. According to a preferred arrangement of this embodiment, said plasmid comprises said sequence associated with a vector pBS.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique SEQ n°l.According to another advantageous embodiment of said plasmid, it comprises the nucleotide sequence SEQ No. 1.
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit plasmide comprend ladite séquence as¬ sociée à un vecteur pUC18.According to a preferred arrangement of this embodiment, said plasmid comprises said sequence associated with a vector pUC18.
La présente invention a également pour objet un procédé d'identification rapide et spécifique de M. xenopi , caractérisé en ce qu'il comprend : (1) une étape dans laquelle on met en contact l'acide nucléique de la mycobactérie à identifier, avec une paire d'amorces telle que définie ci-dessus, pour amplifier un fragment d'acide nucléique spécifique de M. xenopi etThe present invention also relates to a rapid and specific identification method for M. xenopi, characterized in that it comprises: (1) a step in which the nucleic acid of the mycobacterium to be identified is brought into contact with a pair of primers as defined above, in order to amplify a nucleic acid fragment specific for M. xenopi and
(2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1) .(2) a step in which the product obtained in step (1) is detected by any suitable means.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé d'identification, préalablement à l'étape (1) , les mycobactéries sont lysées et l'étape (1) est réalisée directement sur lesdits lysats, constituant la source d'ADN, et ce, sans nécessiter d'autre purifica¬ tion.According to an advantageous embodiment of said identification method, prior to step (1), the mycobacteria are lysed and step (1) is carried out directly on said lysates, constituting the source of DNA, and this , without requiring any other purification.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé d'identification, ladite paire d'amor¬ ces correspond à la paire XEN1-XEN2, capable d'hybrider les extrémités 5' et 3' d'un fragment spécifique de M. xenopi .According to another advantageous embodiment of said identification method, said pair of primers corresponds to the pair XEN1-XEN2, capable of hybridizing the 5 ′ and 3 ′ ends of a specific fragment of M xenopi.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé d'identification, l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'une détection à l'aide d'un colorant approprié.According to yet another advantageous embodiment of said identification method, step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by detection at using an appropriate dye.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé d'identification, l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d' amplifi¬ cation obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'un transfert sur membrane (méthode de Southern) et d'une hybridation avec une sonde non-radioactive telle que définie ci-dessus.According to another advantageous embodiment of said identification method, step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by membrane transfer (Southern method) and hybridization with a non-radioactive probe as defined above.
La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à M. xenopi , dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un réactif de diagnostic conforme à l'invention etThe present invention also relates to a method for screening for an infection with M. xenopi, in a biological sample, characterized in that it comprises: (1) a step in which the biological sample is brought into contact with at least one diagnostic reagent according to the invention and
(2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1) .(2) a step in which the product obtained in step (1) is detected by any suitable means.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une paire d'amorces conforme à l'invention et permet l'obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter.According to an advantageous embodiment of this method, the diagnostic reagent of step (1) is a pair of primers in accordance with the invention and makes it possible to obtain amplification products of the nucleotide sequence to be detected .
L'étape d'amplification est notamment l'une des techniques d'amplification géniques, telle que la méthode Qβ-réplicase (LIZARDI PM. et al., Biotechnol., 1988, 6) ou la méthode dite PCR ( Polymerase Chain .Réaction) décrite dans les Demandes de Brevet européen 0 200 363, 0 201 184 et 0 229 701 déposées par CETUS CO.The amplification step is in particular one of the gene amplification techniques, such as the Qβ-replicase method (LIZARDI PM. Et al., Biotechnol., 1988, 6) or the so-called PCR method (Polymerase Chain. Reaction ) described in European Patent Applications 0 200 363, 0 201 184 and 0 229 701 filed by CETUS CO.
En variante, l'étape d'amplification du frag¬ ment de l'ADN contenant la séquence spécifique de 288 pb, est réalisée conformément au procédé décrit dans la Demande de Brevet français 92 13562, au nom de BIOMERIEUX.Alternatively, the amplification step of the DNA fragment containing the specific sequence of 288 bp is carried out in accordance with the process described in French Patent Application 92 13562, in the name of BIOMERIEUX.
Conformément au mode de mise en oeuvre pré¬ cité, l'étape (2) comprend une séparation électrophoré¬ tique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'une détection à l'aide d'un colo¬ rant approprié.In accordance with the above-mentioned embodiment, step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by detection using an appropriate colourant.
En variante, l'étape (2) comprend une sépara¬ tion électrophorétique des produits d'amplification obte¬ nus à l'issue de l'étape (1) , suivie' d'un transfert sur membrane (méthode de Southern) et d'une hybridation avec une sonde non-radioactive telle que définie ci-dessus .Alternatively, step (2) comprises an electrophoretic tion sépara¬ amplification products obte¬ bare at the end of step (1), followed 'by transfer to a membrane (Southern method) and '' hybridization with a non-radioactive probe as defined above.
Un tel procédé a 1 ' avantage de fournir un test sensible et spécifique, direct et rapide (moins de 24 h) , de dépistage spécifique d'une infection à Mycobacterium xenopi , à l'exclusion de toute autre infection mycobacte¬ rienne (groupe du bacille de la tuberculose, groupe MAIP {M. avium, M. intracellulare , M. paratuberculosis) ou M. celatum) .Such a method has the advantage of providing a sensitive and specific, direct and rapid test (less than 24 hours), for specific screening for a Mycobacterium xenopi infection, to the exclusion of any other mycobacterial infection (group of tuberculosis bacillus, MAIP group {M. avium, M. intracellulare, M. paratuberculosis) or M. celatum).
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux de ce procédé, le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une sonde telle que définie ci-dessus.According to another advantageous embodiment of this method, the diagnostic reagent of step (1) is a probe as defined above.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du pro¬ cédé d'identification et/ou du procédé de dépistage conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés :The present invention further relates to a kit, ready to use, for implementing the identification process and / or the screening method according to the invention, characterized in that it includes, in addition to useful quantities of appropriate buffers and reagents:
- des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces conforme à l'invention,- appropriate doses of at least one pair of primers in accordance with the invention,
- et/ou des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique conforme à- And / or appropriate doses of at least one probe or a fragment of nucleotide probe conforming to
1 ' invention,The invention,
- et/ou des réactifs de visualisation de la réaction d'hybridation de ladite sonde et de l'ADN de l'échantillon à tester. ' Selon un mode de réalisation avantageux du kit, celui-ci comporte : une paire d'amorces constituée par les séquences SEQ n°3 (XENl) et SEQ n°4 (XEN2) définies plus haut, - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification,- And / or reagents for visualizing the hybridization reaction of said probe and the DNA of the sample to be tested. '' According to an advantageous embodiment of the kit, it comprises: a pair of primers constituted by the sequences SEQ No. 3 (XEN1) and SEQ No. 4 (XEN2) defined above, - the reagents necessary for carrying out a amplification,
- éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence de fragments amplifiés, plus parti¬ culièrement une sonde nucléique ayant une longueur d'au moins 20 bases, capable de s'hybrider avec une partie de la séquence SEQ n°l ou SEQ n°2, se situant entre les deux fragments de la paire d'amorces susdite.- optionally a component making it possible to verify the sequence of amplified fragments, more particularly a nucleic probe having a length of at least 20 bases, capable of hybridizing with part of the sequence SEQ No. 1 or SEQ No. 2 , lying between the two fragments of the above-mentioned primer pair.
Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti- ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré¬ sente invention.In addition to the foregoing provisions, the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
EXEMPLE 1 : séquences nucléotidiques conformes à l'inven¬ tion.EXAMPLE 1: nucleotide sequences in accordance with the invention
1) Fragment Pstl-Pstl de 1200 pb (séquence telle que définie ci-dessus) : a. Extraction de l'ADN :1) Pstl-Pstl fragment of 1200 bp (sequence as defined above): a. DNA extraction:
Les mycobactéries sont cultivées sur un milieu Middlebrook 7H9 contenant de la glycine à 1,4 % (p/v) , du lysozyme (400 μg/ml) et de la D-cyclosérine (200 μg/ml) pendant 24 h à 37°C.The mycobacteria are cultivated on a Middlebrook 7H9 medium containing glycine at 1.4% (w / v), lysozyme (400 μg / ml) and D-cycloserine (200 μg / ml) for 24 h at 37 ° vs.
Les cultures sont ensuite centrifugées à 3 000 rpm pendant 20 min. Les culots sont remis en sus¬ pension dans un tampon TEN (pH 8) , comprenant du Tris 50 mM, de 1 ΕDTA 50 mM et du NaCl 10 mM, traités avec de la protéinase K à 2,25 mg/ml et du SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) à 0,6 % (p/v) et incubés pendant une nuit à 37°C.The cultures are then centrifuged at 3000 rpm for 20 min. The pellets are returned to suspension in a TEN buffer (pH 8), comprising 50 mM Tris, 50 mM ΕDTA and 10 mM NaCl, treated with proteinase K at 2.25 mg / ml and SDS. (Sodium Dodecyl Sulfate) at 0.6% (w / v) and incubated overnight at 37 ° C.
On ajoute ensuite du SDS et les tubes sont à nouveau incubés pendant 30 min à 60°C. L'ADN est purifié avec un mélange phénol-chloroforme, précipité avec 1 ' éthanol et dissous dans un tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) . b. Digestion par l'enzyme PstI :SDS is then added and the tubes are again incubated for 30 min at 60 ° C. The DNA is purified with a phenol-chloroform mixture, precipitated with ethanol and dissolved in TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA). b. Digestion by the enzyme PstI:
Environ 1 μg de l'ADN mycobactérien genomique, obtenu en a., est digéré avec l'enzyme de restriction PstI, pendant 16 h à 37°C.About 1 μg of the genomic mycobacterial DNA, obtained in a., Is digested with the restriction enzyme PstI, for 16 h at 37 ° C.
Les produits de la digestion sont séparés pen¬ dant 1 nuit par electrophorese sur un gel d'agarose à 0,7 % à 1,5 volt/cm. On obtient ainsi notamment un fragment Pstl- Pstl de 1200 pb, présent dans toutes les souches M. xenopi .The digestion products are separated for 1 night by electrophoresis on an agarose gel at 0.7% at 1.5 volts / cm. There is thus obtained in particular a Pstl-Pstl fragment of 1200 bp, present in all the M. xenopi strains.
2) Fragment de 288 pb (SEQ n°l) : Ce fragment est obtenu par PCR, réalisée soit à partir du fragment de 1200 pb, soit directement à par¬ tir d'un échantillon de M. xenopi , dans les conditions suivantes : a. Lyse des mycobactéries : Des mycobactéries de 1 ' espèce M. xenopi sont mises en suspension dans de l'eau distillée et soumises à 3 cycles d' ébullition-congélation, comprenant cha¬ cun 5 min à 100°C et 5 min à -20°C ; on obtient ainsi un lysat cellulaire, qui est utilisé comme source directe d'ADN, sans nécessiter d'autre purification. b. Amplification de l'ADN : L'amplification est réalisée comme suit : 100 μl d'un mélange réactionnel contenant :2) 288 bp fragment (SEQ n ° 1): This fragment is obtained by PCR, carried out either from the 1200 bp fragment, or directly from a sample of M. xenopi, under the following conditions: at. Lysis of mycobacteria: Mycobacteria of the species M. xenopi are suspended in distilled water and subjected to 3 cycles of boiling-freezing, each comprising 5 min at 100 ° C and 5 min at -20 ° C; a cell lysate is thus obtained, which is used as a direct source of DNA, without requiring further purification. b. DNA amplification: The amplification is carried out as follows: 100 μl of a reaction mixture containing:
- 1 x d'un tampon Taq polymérase (Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gélatine à- 1 x of a Taq polymerase buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , gelatin at
0,01 % (p/v)) ,0.01% (w / v)),
- 200 μM de chaque désoxynucléoside triphos- phate,- 200 μM of each triphosphate deoxynucleoside,
- 0, 3 μM d'une seule amorce, dénommée DKU49, de séquence 5 ' -CCGCCGACCGAG-3 ' (P.S. PALITTAPONGARNPIM et al., 1993, J. Infect. Dis., 161,975-978) , et- 0.3 μM of a single primer, called DKU49, of sequence 5 '-CCGCCGACCGAG-3' (P.S. PALITTAPONGARNPIM et al., 1993, J. Infect. Dis., 161,975-978), and
- 2 unités de Taq polymérase, recouvert d'huile minérale et soumis à 35 cycles compre¬ nant chacun 1 min à 95°C, 1 min à 60°C, 1 min à 72°C, puis à une extension de 10 min à 72°C en utilisant un thermocycleur Techné®.- 2 units of Taq polymerase, covered with mineral oil and subjected to 35 cycles each comprising 1 min at 95 ° C, 1 min at 60 ° C, 1 min at 72 ° C, then at an extension of 10 min to 72 ° C using a Techné® thermocycler.
De manière inattendue, l'utilisation de cette amorce DKU49 (PALITTAPONGARNPIM P. et al., J. Infect.Unexpectedly, the use of this primer DKU49 (PALITTAPONGARNPIM P. et al., J. Infect.
Dis., 1993, 167. 975-978), préalablement utilisée pour l'amplification de M. tuberculosis , permet effectivement d'amplifier, dans des conditions plus stringentes, c'est- à-dire en réalisant l'hybridation à 60°C et non à 40°C, un fragment de 288 pb spécifique de M. xenopi . c. Analyse de la séquence amplifiée : La figure 1 illustre la spécificité du frag¬ ment de 288 pb, vis-à-vis de l'espèce M. xenopi .Dis., 1993, 167. 975-978), previously used for the amplification of M. tuberculosis, effectively allows to amplify, under more stringent conditions, that is to say by carrying out the hybridization at 60 ° C. and not at 40 ° C., a 288 bp fragment specific for M. xenopi. vs. Analysis of the amplified sequence: FIG. 1 illustrates the specificity of the 288 bp fragment, with respect to the species M. xenopi.
En effet, toutes les souches de M. xenopi pro¬ duisent un fragment de 288 pb, lorsque leur ADN est sou¬ mis à une PCR qui utilise l'amorce DKU49, aussi bien après electrophorese sur gel d'agarose des produits amplifiés (figure 1A) , qu'après analyse en Southern blot desdits produits amplifiés (figure 1B) , alors que les souches d'autres espèces ne produisent pas un tel frag¬ ment dans les mêmes conditions : les pistes 1 à 3 et 14 correspondent à des isolats de M. xenopi ,* les pistes 4, 8, 11, 12 et 13 correspondent respectivement à M. celatum, M. chelonae, M. simiae et M. scrofulaceum ,* les pistes 5 et 6 correspondent à des souches de M. avium ; les pistes 7 à 9 correspondent à des souches de M. tuber- culosis . La piste 10 correspond à de l'ADN λ digéré par l'enzyme de restriction PstI, utilisé comme produit de contrôle.In fact, all the strains of M. xenopi produce a 288 bp fragment, when their DNA is subjected to a PCR which uses the primer DKU49, as well after electrophoresis on agarose gel of the amplified products (FIG. 1A), only after Southern blot analysis of said amplified products (FIG. 1B), whereas the strains of other species do not produce such a frag¬ ment under the same conditions: tracks 1 to 3 and 14 correspond to isolates from M. xenopi, * tracks 4, 8, 11, 12 and 13 correspond respectively to M. celatum, M. chelonae, M. simiae and M. scrofulaceum, * tracks 5 and 6 correspond to strains of M. avium ; lanes 7 to 9 correspond to strains of M. tuberculosis. Lane 10 corresponds to λ DNA digested with the restriction enzyme PstI, used as a control product.
La figure 1A correspond à une electrophorese en gel d'agarose à 1,5 % de la séquence de 288 pb, qui est ensuite détectée par coloration au bromure d'éthi- dium.FIG. 1A corresponds to a 1.5% agarose gel electrophoresis of the 288 bp sequence, which is then detected by staining with ethidium bromide.
La figure 1B correspond à l'analyse du produit d'amplification (fragment de 288 pb) par une méthode de Southern effectuée dans les conditions' suivantes : * Dépurination :1B corresponds to the analysis of the amplification product (288 bp fragment) by a Southern method performed under the conditions' as follows: * depurination:
Le gel obtenu est agité 20 min dans une solu¬ tion d'HCl 0,25 M (13 ml HC1 + 500 ml eau distillée) , puis rincé 3 fois avec de l'eau distillée. * Dénaturation : Le gel est ensuite agité 20 min avec un tamponThe gel obtained is stirred for 20 min in a 0.25 M HCl solution (13 ml HCl + 500 ml distilled water), then rinsed 3 times with distilled water. * Denaturation: The gel is then stirred 20 min with a buffer
1 (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) . * Neutralisation :1 (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH). * Neutralization:
Le gel est ensuite rincé rapidement avec un tampon 2 (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 1 M à pH 8) , puis incubé avec ce même tampon 2 pendant 30 min. * Transfert :The gel is then quickly rinsed with buffer 2 (1.5 M NaCl, 1 M Tris-HCl at pH 8), then incubated with this same buffer 2 for 30 min. * Transfer:
Le transfert sur une membrane de nylon Hybond®, humidifiée dans une solution lx SSC (NaCl, citrate de sodium), est effectué pendant une nuit.Transfer to a Hybond® nylon membrane, moistened in a 1x SSC solution (NaCl, sodium citrate), is carried out overnight.
* Hybridation : Les séquences obtenues ci-dessus sont soumises aux conditions d'hybridation suivantes :* Hybridization: The sequences obtained above are subject to the following hybridization conditions:
- 1er protocole :- 1st protocol:
. la membrane est pré-hybridée pendant 1 h à 42°C et à 6 rpm avec 30 ml, pour un blot de 320 cm*2, d'un tampon d'hybridation fourni dans le kit ECL Amersham RPN 3001, et préchauffé à 42°C, pendant 30 min à 1 h) ;. the membrane is pre-hybridized for 1 h at 42 ° C and at 6 rpm with 30 ml, for a blot of 320 cm * 2 , of a hybridization buffer supplied in the ECL kit Amersham RPN 3001, and preheated to 42 ° C, for 30 min to 1 h);
. on ajoute une sonde telle que préparée comme précisé en d. ci-dessous, à une concentration de 10 ng/ml, puis . la membrane est hybridée à 42°C pendant 1 nuit ,*. adding a probe as prepared as specified in d. below, at a concentration of 10 ng / ml, then. the membrane is hybridized at 42 ° C for 1 night, *
. 4 lavages sont ensuite réalisés comme suit :. 4 washes are then carried out as follows:
1er lavage : la membrane est lavée 10 min, à1st wash: the membrane is washed for 10 min, at
55°C, dans un tampon A (1,6 ml de SDS à 10 %, 1 ml de 20x SSC, 37,4 ml d'eau distillée pour 320 cm2, préchauffé à 55°C) ;55 ° C, in buffer A (1.6 ml of 10% SDS, 1 ml of 20x SSC, 37.4 ml of distilled water per 320 cm 2 , preheated to 55 ° C);
2ème lavage : identique au premier lavage ; 3ème lavage, réalisé sous agitation : la mem¬ brane est lavée 5 min à température ambiante dans un campon B (2x SSC) ;2nd wash: identical to the first wash; 3rd wash, carried out with stirring: the mem¬ brane is washed for 5 min at room temperature in a campon B (2x SSC);
4ème lavage : identique au troisième lavage.4th wash: identical to the third wash.
- 2ème protocole :- 2nd protocol:
La membrane est hybridée avec un tampon comprenant 6xSSC (lxSSC : NaCl 0,15 M, tampon citrate de sodium 0,015 M) 5x de réactif de Denhardt une solution stock 50x de réactif de Denhardt comprend : 5 g de Ficoll, 5 g de polyvinylpyrrolidone, 5 g de sérum albu¬ mine bovine et 500 ml d'I^O) , SDS à 0,5 %, 100 μg d'ADN de sperme de saumon dénaturé/ml, en présence d'une sonde d'ADN marqué au 32P (10β cpm/ml) , pendant 16 h à 68°C. . 4 lavages sont ensuite réalisés comme suit :The membrane is hybridized with a buffer comprising 6xSSC (lxSSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate buffer) 5 × Denhardt reagent a 50 × stock solution of Denhardt reagent comprises: 5 g of Ficoll, 5 g of polyvinylpyrrolidone, 5 g of bovine albumin serum and 500 ml of I ^ O), 0.5% SDS, 100 μg of denatured salmon sperm DNA / ml, in the presence of a DNA probe labeled with 32 P (10 β cpm / ml), for 16 h at 68 ° C. . 4 washes are then carried out as follows:
1er lavage : la membrane est lavée 10 min, à 65°C, dans un tampon 2xSSC.1st wash: the membrane is washed for 10 min, at 65 ° C., in a 2xSSC buffer.
2ème lavage : identique au premier.2nd wash: identical to the first.
3ème lavage : la membrane est lavée 30 min, à 65°C, dans un tampon comprenant 2xSSC et du SDS à 0,1 %.3rd wash: the membrane is washed 30 min, at 65 ° C, in a buffer comprising 2xSSC and 0.1% SDS.
4ème lavage : la membrane est lavée 10 min, à 65°C, dans un tampon 0,lxSSC.4th wash: the membrane is washed for 10 min, at 65 ° C., in a buffer 0.1 xSSC.
* Détection :* Detection:
Les membranes sont ensuite rapidement séchées . La sonde ayant hybridée (1er protocole) est détectée comme suit : on incube la membrane, 1 min, dans une solu¬ tion de détection Amersham (réactif de détection ECL, référence RPN 2105), on sèche rapidement l'excès de solu- tion de détection et on révèle par autoradiographie. d. Mise en évidence de l'hybridation du frag¬ ment de 288 pb avec la séquence de 1200 pb :The membranes are then quickly dried. The probe having hybridized (1st protocol) is detected as follows: the membrane is incubated for 1 min in an Amersham detection solution (ECL detection reagent, reference RPN 2105), the excess solution is quickly dried detection and revealed by autoradiography. d. Demonstration of the hybridization of the 288 bp frag¬ ment with the 1200 bp sequence:
- Préparation de la sonde :- Preparation of the probe:
L'ADN amplifié (séquence de 288 pb) est séparé par electrophorese sur gel d'agarose à 1,5 % ; le frag¬ ment ainsi séparé est alors récupéré par electroelution à travers une membrane de dialyse, immergée dans de l'eau stérile. L'ADN ainsi obtenu est ensuite purifié par précipitation au chloroforme et à l'éthanol. La sonde est alors marquée avec de la peroxy- dase de raifort en utilisant le kit Amersham ECL { direct nucleic acid labelling and détection Systems (réf. RPN 3001) ) .The amplified DNA (sequence of 288 bp) is separated by electrophoresis on 1.5% agarose gel; the frag¬ ment thus separated is then recovered by electroelution through a dialysis membrane, immersed in sterile water. The DNA thus obtained is then purified by precipitation with chloroform and ethanol. The probe is then labeled with horseradish peroxidase using the Amersham ECL kit (direct nucleic acid labeling and detection Systems (ref. RPN 3001)).
- Echantillons d'ADN : On utilise un fragment de 1200 pb tel que pré¬ paré en 1) ci-dessus, ou de l'ADN mycobacterien genomique extrait à partir de souches de M. xenopi et digéré avec l'enzyme de restriction PstI, dans les mêmes conditions que ci-dessus.- DNA samples: We use a 1200 bp fragment as prepared in 1) above, or genomic mycobacterial DNA extracted from M. xenopi strains and digested with the restriction enzyme PstI, under the same conditions as above.
Les gels obtenus sont transférés sur des mem¬ branes de nylon par la méthode de Southern et hybrides avec la sonde marquée conforme à l'invention, comme pré¬ cisé ci-dessus en c..The gels obtained are transferred to nylon mem¬ branes by the Southern method and hybridized with the labeled probe according to the invention, as mentioned above in c ..
Un test d'hybridation comparatif a été réa¬ lisé, dans les mêmes conditions que ci-dessus, avec 21 différentes espèces de mycobactéries répertoriées, ci- après, au Tableau I.A comparative hybridization test was carried out, under the same conditions as above, with 21 different species of mycobacteria listed below in Table I.
TABLEAU ITABLE I
Nombre de souches testéesNumber of strains tested
Espèces Identification Analyse enSpecies Identification Analysis in
PCR Southern blotPCR Southern blot
M xenopi 38 28M xenopi 38 28
M avium 8 3M avium 8 3
M celatum 5 2M celatum 5 2
M chelonae 5 NF*M chelonae 5 NF *
M flavescens 5 2M flavescens 5 2
M fortui tum 5 2 g as tri 2 1 _- gordonae 6 2M fortui tum 5 2 g as tri 2 1 _- gordonae 6 2
7 r kansasii 6 17 r kansasii 6 1
K malmoense 5 1 r.' marinum 5 NFK malmoense 5 1 r. ' marinum 5 NF
11 non chromogenicum 3 111 non chromogenicum 3 1
•*• r scrofulaceum 3 1• * • r scrofulaceum 3 1
1 shimoïdei 1 11 shimoidi 1 1
11 simiae 5 111 simiae 5 1
Λ' smegmatis 1 1Λ 'smegmatis 1 1
*,f εzulgaï 1 1 lV terrae 5 1*, f εzulgaï 1 1 lV terrae 5 1
M uicerans 1 1M uicerans 1 1
M vaccae 1 1M vaccae 1 1
M tuberculosis 6 2M tuberculosis 6 2
TVf bovis 1 1TVf bovis 1 1
M bovis BCG 1 1M bovis BCG 1 1
7,T africanum 1 1 7 , T africanum 1 1
NF : non faitNF: not done
La figure 3 illustre les résultats obtenus et montre que dans les conditions d'hybridation précisées ci-dessus, le fragment de 288 pb s 'hybride exclusivement avec les souches de l'espèce M. xenopi (28 souches tes- tées) et plus particulièrement avec le fragment de diges¬ tion PstI d'environ 1200 pb que l'on retrouve dans toutes les souches de M. xenopi , alors que cette sonde ne recon¬ naît aucun fragment d'autres ADN mycobactériens . La comparaison des figures 1A et 3 montre une parfaite corrélation entre les résultats obtenus par les deux méthodes : PCR et analyse en Southern blot.FIG. 3 illustrates the results obtained and shows that under the hybridization conditions specified above, the 288 bp fragment hybridizes exclusively with the strains of the species M. xenopi (28 strains tes- tees) and more particularly with the PstI digestion fragment of about 1200 bp which is found in all strains of M. xenopi, while this probe does not recognize any fragment of other mycobacterial DNAs. The comparison of FIGS. 1A and 3 shows a perfect correlation between the results obtained by the two methods: PCR and Southern blot analysis.
Dans cette figure 3 (analyse en Southern blot de l'ADN digéré par l'enzyme de restriction PstI de dif- ferentes souches mycobacteriennes avec la sonde spécifi¬ que de M. xenopi de 288 pb) , les pistes 1 à 4 et 11 à 16 correspondent à des souches de M. xenopi , - les pistes 5 et 8 correspondent à des souches de M. tuberculosis ; les pistes 6 et 7 correspondent à des souches de M. avium, les pistes 9 et 10 correspondent à des souches de M. bovis et de M. celatum respectivement. e. Séquençage :In this FIG. 3 (Southern blot analysis of the DNA digested with the restriction enzyme PstI of different mycobacterial strains with the probe specific for M. xenopi of 288 bp), tracks 1 to 4 and 11 to 16 correspond to strains of M. xenopi, lanes 5 and 8 correspond to strains of M. tuberculosis; tracks 6 and 7 correspond to strains of M. avium, tracks 9 and 10 correspond to strains of M. bovis and M. celatum respectively. e. Sequencing:
Ce fragment de 288 pb, produit par PCR en uti¬ lisant l'amorce DKU49 comme précisé ci-dessus en 2) b. , a été clone dans un vecteur pUC18, préalablement digéré avec l'enzyme de restriction Smal.This 288 bp fragment, produced by PCR using the primer DKU49 as specified above in 2) b. , was cloned into a vector pUC18, previously digested with the restriction enzyme Smal.
Les clones obtenus ont été transformés dans les souches d ' E. coli TG1.The clones obtained were transformed into the E. coli TG1 strains.
Les colonies recombinantes ont été sélection- nées sur milieu solide LB complémenté avec de 1 ' isopropyl β-D-thiogalactoside, du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactopyranoside (X-gal) et de 1 ' ampicilline à 100 μg/ml.The recombinant colonies were selected on LB solid medium supplemented with isopropyl β-D-thiogalactoside, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) and 1 ampicillin at 100 μg / ml.
Les plasmides pUC18 qui contiennent les in- serts sont purifiés en utilisant des mini-colonnes Qiagen® (kit "Midi" Qiagen®, Qiagen Inc, USA) .The pUC18 plasmids which contain the inserts are purified using Qiagen® mini-columns (Qiagen® "Midi" kit, Qiagen Inc, USA).
Les séquences des inserts mycobactériens de trois souches différentes de M. xenopi ont ainsi été réa¬ lisées par la méthode de SANGER (F. SANGER et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 7_4, 5463-5467) en utilisant de la séquénase.The sequences of the mycobacterial inserts of three different strains of M. xenopi were thus produced by the SANGER method (F. SANGER et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7-4, 5463-5467) using sequenase.
Dans les 3 souches étudiées, les deux brins ont été séquences. La séquence nucléotidique du fragment amplifié est identique dans les 3 souches et la séquence complète du fragment de 288 pb est représentée à la séquence n°l.In the 3 strains studied, the two strands were sequenced. The nucleotide sequence of the amplified fragment is identical in the 3 strains and the complete sequence of the 288 bp fragment is shown in sequence No. 1.
Cette séquence ne présente pas d'homologie significative avec des séquences décrites précédemment. 3) Fragment de 263 pb (SEQ n°2) :This sequence has no significant homology with sequences described above. 3) Fragment of 263 bp (SEQ n ° 2):
Dans les mêmes conditions que celles de 2), lorsque l'on réalise la PCR avec les amorces conformes à l'invention, XENl (SEQ n°3) et XEN2 (SEQ n°4), on obtient le fragment de 263 pb, qui constitue une sonde hautement spécifique de détection de M. xenopi .Under the same conditions as those of 2), when the PCR is carried out with the primers according to the invention, XENl (SEQ n ° 3) and XEN2 (SEQ n ° 4), the 263 bp fragment is obtained which constitutes a highly specific probe for detecting M. xenopi.
Ces amorces sont significativement plus spéci¬ fiques que l'amorce DKU49. En effet, cette dernière bien que permettant la production du fragment de 288 pb décrit ci-dessus et également hautement spécifique de M. xenopi , lorsqu'elle est utilisée pour réaliser des amplifica¬ tions, entraîne la production d'un fragment additionnel de 800 pb (figure 1A) , pour la majorité des souches.These primers are significantly more specific than the primer DKU49. Indeed, the latter although allowing the production of the 288 bp fragment described above and also highly specific for M. xenopi, when used to carry out amplifications, results in the production of an additional fragment of 800 bp (Figure 1A), for the majority of strains.
Aussi bien le produit de 288 pb que le produit de 263 pb sont hautement spécifiques de M. xenopi et n'hybrident avec aucune des souches d'autres .espèces mycobacteriennes ; même M. ceiatum, une nouvelle espèce de mycobactérie récemment isolée et qui présente des similarités phénotypiques avec M. xenopi ne présente pas d'hybridation croisée avec ces sondes spécifiques. Les amorces XENl et XEN2 qui permettent l'amplification de ce fragment de 263 pb dans toutes les souches de M. xenopi , même dans celles qui accumulent en outre un fragment de 800 pb lorsque l'on utilise l'amorce DKU49 (figure 4) , sont particulièrement intéressantes pour obtenir un profil PCR unique, partagé par toutes les souches de M. xenopi et consistant en une seule bande. EXEMPLE 2 : test d'identification de M. xenopi .Both the 288 bp product and the 263 bp product are highly specific for M. xenopi and do not hybridize with any of the strains of other mycobacterial species; even M. ceiatum, a new species of mycobacterium recently isolated and which presents phenotypic similarities with M. xenopi does not show cross hybridization with these specific probes. The primers XEN1 and XEN2 which allow the amplification of this 263 bp fragment in all strains of M. xenopi, even in those which additionally accumulate an 800 bp fragment when the primer DKU49 is used (FIG. 4) , are particularly interesting for obtaining a unique PCR profile, shared by all strains of M. xenopi and consisting of a single band. EXAMPLE 2: identification test of M. xenopi.
1) Ce test est réalisé selon le protocole exposé à l'Exemple 1, à savoir obtention d'un fragment Pstl-Pstl, à partir d'ADN genomique, amplification avec les amorces XENl et XEN2 et détection des fragments amplifiés .1) This test is carried out according to the protocol set out in Example 1, namely obtaining a Pstl-Pstl fragment from genomic DNA, amplification with the primers XEN1 and XEN2 and detection of the amplified fragments.
2) Spécificité et de la sensibilité du test conforme à 1 ' invention :2) Specificity and sensitivity of the test according to the invention:
La sensibilité des tests PCR a été déterminée par une amplification réalisée avec des dilutions au lOème en série, à partir de l'ADN matrice.The sensitivity of the PCR tests was determined by an amplification carried out with 10 th dilutions in series, from the template DNA.
Les résultats sont illustrés à la figure 2, dans laquelle les pistes 1 à 10 correspondent à des dilu¬ tions au lOè e, commençant à environ 10 ng d'ADN. La piste 11 correspond à de l'ADN λ digéré avec l'enzyme de restriction PstI (contrôle) ; les dilutions ont été effectuées dans de l'eau stérile.The results are illustrated in FIG. 2, in which lanes 1 to 10 correspond to dilutions at lOth, starting with approximately 10 ng of DNA. Lane 11 corresponds to λ DNA digested with the restriction enzyme PstI (control); dilutions were made in sterile water.
Le fragment de 288 pb peut être détecté par coloration au bromure d'éthydium jusqu'à 100 pg d'ADN, tandis que l'hybridation avec la sonde augmente la sensi¬ bilité de la détection d'un facteur 1000 (figures 2A et 2B) .The 288 bp fragment can be detected by staining with ethydium bromide up to 100 μg of DNA, while hybridization with the probe increases the sensitivity of detection by a factor of 1000 (FIGS. 2A and 2B ).
Dans la mesure où 10^ cellules correspondent à environ 1 mg, on peut considérer que la limite de détec- tion du produit de la PCR sur gel d'agarose correspond grossièrement à 10^ cellules, qui constitue donc un seuil de sensibilité significativement plus faible que ceux nécessaires pour les tests PCR réalisés dans le but d'identification de souches. Pour déterminer la spécificité de ce test PCR, le fragment de 288 pb a été utilisé comme sonde après son marquage avec de la peroxydase de raifort dans les condi¬ tions de l'Exemple 1, 2) d..Since 10 ^ cells correspond to approximately 1 mg, it can be considered that the detection limit of the PCR product on agarose gel corresponds roughly to 10 ^ cells, which therefore constitutes a significantly lower sensitivity threshold. than those necessary for PCR tests carried out for the purpose of identifying strains. To determine the specificity of this PCR test, the 288 bp fragment was used as a probe after its labeling with horseradish peroxidase under the conditions of Example 1, 2) d ..
Les autoradiogrammes montrent l'hybridation spécifique de cette sonde avec le fragment de la PCR de 288 pb et il n'existe aucune autre bande, ni avec le pro- duit de 800 pb retrouvé pour certaines souches de M. xenopi , ni avec les souches d'autres espèces (figure IB et Tableau I ci-dessus) .Autoradiograms show the specific hybridization of this probe with the 288 bp PCR fragment and no other band exists, nor with the pro- 800 bp residue found for certain strains of M. xenopi, or with strains of other species (Figure IB and Table I above).
Le test PCR développé pour la détection de cette cible unique présente une sensibilité suffisante pour un test d'identification (figure 2).The PCR test developed for the detection of this unique target has sufficient sensitivity for an identification test (Figure 2).
Le seuil de détection est aussi bas que 10^ cellules, ce qui est largement en dessous de minimum requis lorsque l'on considère qu'une colonie contient 10*^ cellules.The detection threshold is as low as 10 ^ cells, which is well below the minimum required when considering that a colony contains 10 * ^ cells.
EXEMPLE 3 : Test de dépistage de M. xenopi .EXAMPLE 3: Screening test for M. xenopi.
Ce test peut être réalisé dans les mêmes con¬ ditions que celles de l'Exemple 2.This test can be carried out under the same conditions as those of Example 2.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve¬ nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar- ter du cadre, ni de la portée de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation, embodiment and application which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which can come to the mind of the technician in the matter, without departing from the framework or the scope of the present invention.
LISTE DE SEQUENCESLIST OF SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSANT:(i) DEPOSITOR:
(A) NOM: INSTITUT PASTEUR(A) NAME: INSTITUT PASTEUR
(B) RUE: 28 rue du Docteur Roux(B) STREET: 28 rue du Docteur Roux
(C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE(C) CITY: PARIS (E) COUNTRY: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75724 PARIS(F) POSTAL CODE: 75724 PARIS
(ii) TITRE DE L INVENTION: FRAGMENTS D'ACIDES NUCLEIQUES, DERIVES DU GENOME DE MYCOBACTERIUM XENOPI ET LEURS APPLICATIONS.(ii) TITLE OF THE INVENTION: FRAGMENTS OF NUCLEIC ACIDS, DERIVATIVES OF THE GENOME OF MYCOBACTERIUM XENOPI AND THEIR APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 4
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk(iv) COMPUTER-DETACHABLE FORM: (A) TYPE OF MEDIUM: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)(D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 288 paires de bases (B) TYPE: nucleotide(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 288 base pairs (B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGA 60 CACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGAGGCGCGGGT 120CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGA 60 CACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGAGGCGCGGGT 120
TCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAA 180TCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAA 180
GCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCC 240GCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCC 240
GCCTCAGGCTATAGCTGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG 288 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:GCCTCAGGCTATAGCTGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG 288 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 263 paires de bases(A) LENGTH: 263 base pairs
(B) TYPE: nucleotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGACACCGCGAGAG 60(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGACACCGCGAGAG 60
ACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCC 120ACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCC 120
GGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGC 180GGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGC 180
ACTGTCTGCATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTA 240ACTGTCTGCATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTA 240
TAGCTGCTGCCACACCGATTGTG 263 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 :TAGCTGCTGCCACACCGATTGTG 263 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple(B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE SENS"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "PRIMER SENSE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GGAATAGTCA GAGCCCG 17 GGAATAGTCA GAGCCCG 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE ANTI-SENS"(A) DESCRIPTION: / desc = "ANTI-SENSE PRIMER"
(iv) ANTI-SENS: OUI(iv) ANTI-SENSE: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GTGTTAGCCA CACCGTC 17 GTGTTAGCCA CACCGTC 17

Claims

REVENDICATIONS 1°) Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique, spécifique de M. xenopi , contenue dans une séquence Pstl- PstI de 1200 paires de bases (pb) de l'ADN genomique de M. xenopi ou un fragment de celle-ci, et en ce qu'elle ne s 'hybride, dans des conditions stringentes d'hybridation, avec aucune autre séquence nucléotidique de mycobactérie. 2°) Fragment d'une séquence selon la revendi- cation 1, caractérisé en ce qu'il comprend 288 pb et pré¬ sente la formule (SEQ n°l) suivante :CLAIMS 1°) Nucleotide sequence, characterized in that it is constituted by a nucleotide sequence, specific to M. xenopi, contained in a Pstl-PstI sequence of 1200 base pairs (bp) of the genomic DNA of M. xenopi or a fragment thereof, and in that it does not hybridize, under stringent hybridization conditions, with any other mycobacterial nucleotide sequence. 2°) Fragment of a sequence according to claim 1, characterized in that it comprises 288 bp and presents the following formula (SEQ no. 1):
XENl > 50 CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTA D U49 >XENl > 50 CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTA D U49 >
100100
CCACGATGGACACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCCCACGATGGACACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCC
150 TTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTG IA 200150 TTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTG IA 200
GCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGCGCAGGCCGAGCAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGC
250250
ATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCT
< XEN2 ATAGCTGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG< XEN2 ATAGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG
< DKU49 3°) Fragment d'une séquence selon la revendi¬ cation 1, caractérisé en ce qu'il comprend 263 pb et pré¬ sente la formule (SEQ n°2) suivante : 50<DKU49 3°) Fragment of a sequence according to claim 1, characterized in that it comprises 263 bp and presents the following formula (SEQ no. 2): 50
I GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGACI GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGAC
100100
I ACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGAI ACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGA
150150
I GGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGCI GGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGCCGAGC
200200
I AAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAACCI AAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAACC
250250
II
CTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTATAGCTGCTGCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTATAGCTGCTGC
CACACCGATTGTG.CACACCGATTGTG.
4°) Fragment d'une séquence selon la revendi¬ cation 1, caractérisé en ce qu'il comprend 17 pb et pré- sente la formule (SEQ n°3) suivante : GGAATAGTCAGAGCCCG (XENl) .4°) Fragment of a sequence according to claim 1, characterized in that it comprises 17 bp and has the following formula (SEQ No. 3): GGAATAGTCAGAGCCCG (XENl).
5°) Fragment d'une séquence selon la revendi¬ cation 1, caractérisé en ce qu'il comprend 17 pb et pré¬ sente la formule (SEQ n°4) suivante : GTGTTAGCCACACCGTC (XEN2) .5°) Fragment of a sequence according to claim 1, characterized in that it comprises 17 bp and presents the following formula (SEQ No. 4): GTGTTAGCCACACCGTC (XEN2).
6°) Réactifs d'identification de M. xenopi , caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, éventuellement associés à un marqueur approprié.6°) Reagents for identifying M. xenopi, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence or a fragment thereof according to any one of claims 1 to 5, optionally associated with an appropriate marker.
7°) Réactifs selon la revendication 6, carac¬ térisés en ce qu'ils sont constitués par des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi , chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.7°) Reagents according to claim 6, characterized in that they consist of pairs of primers for the synthesis of a DNA or RNA fragment of M. xenopi, each primer comprising a sequence or a nucleotide sequence fragment according to any one of claims 1 to 5.
8°) Réactifs selon la revendication 7, carac¬ térisés en ce que ladite paire d'amorces est constituée par 1 ' oligonucléotide XENl selon la revendication 4, apparié à 1 'oligonucléotide XEN2 selon la revendication 5.8°) Reagents according to claim 7, characterized in that said pair of primers is constituted by the XENl oligonucleotide according to claim 4, paired with the XEN2 oligonucleotide according to claim 5.
9°) Réactifs selon la revendication 6, carac¬ térisés en ce qu'ils sont constitués par une sonde de détection et/ou d'identification d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi .9°) Reagents according to claim 6, characterized in that they consist of a probe for detection and/or identification of a DNA or RNA fragment of M. xenopi.
10°) Réactifs selon la revendication 9, carac¬ térisés en ce que ladite sonde de détection est sélec¬ tionnée dans le groupe constitué par la séquence Pstl- PstI de 1200 pb de l'ADN genomique de M. xenopi , la séquence SEQ n°l et la séquence SEQ n°2, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.10°) Reagents according to claim 9, characterized in that said detection probe is selected from the group consisting of the Pstl-PstI sequence of 1200 bp of the genomic DNA of M. xenopi, the sequence SEQ n °l and the sequence SEQ No. 2, according to any one of claims 1 to 3.
11°) Réactifs selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisés en ce que le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notamment les iso¬ topes radioactifs, les enzymes appropriées, les fluo- rochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptè- nes et les anticorps ou les analogues de base.11°) Reagents according to any one of claims 6 to 10, characterized in that the marker is chosen from the group which includes in particular radioactive isotopes, appropriate enzymes, fluorochromes, appropriate chemical markers, haptens and antibodies or base analogues.
12°) Famille de plasmides recombinants, carac- térisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.12°) Family of recombinant plasmids, characterized in that they contain at least one nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 5.
13°) Plasmide selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidi- que Pstl-Pstl de 1200 pb ou un fragment de celle-ci, selon la revendication 1.13°) Plasmid according to claim 12, characterized in that it comprises the Pstl-Pstl nucleotide sequence of 1200 bp or a fragment thereof, according to claim 1.
14°) Plasmide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidi¬ que Pstl-Pstl de 1200 pb associée à un' vecteur pBS . 15°) Plasmide selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidi¬ que SEQ n°l selon la revendication 2.14°) Plasmid according to claim 13, characterized in that it comprises the nucleotide sequence Pstl-Pstl of 1200 bp associated with a pBS vector. 15°) Plasmid according to claim 12, characterized in that it comprises the nucleotide sequence SEQ No. 1 according to claim 2.
16°) Plasmide selon la revendication 15, caractérisé en7 ce qu'il comprend la séquence nucléotidi- que SEQ n°l associée à un vecteur pUC18.16°) Plasmid according to claim 15, characterized in 7 that it comprises the nucleotide sequence SEQ No. 1 associated with a pUC18 vector.
17°) Procédé d'identification rapide et spéci¬ fique de M. xenopi , caractérisé en ce qu'il comprend : (1) une étape dans laquelle on met en contact l'acide nucléique de la mycobactérie à identifier, avec une paire d'amorces selon la revendication 7 ou la reven¬ dication 8, pour amplifier un fragment d'acide nucléique spécifique de M. xenopi et17°) Method for rapid and specific identification of M. xenopi, characterized in that it comprises: (1) a step in which the nucleic acid of the mycobacterium to be identified is brought into contact with a pair of primers according to claim 7 or claim 8, to amplify a nucleic acid fragment specific to M. xenopi and
(2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1) .(2) a step in which the product obtained in step (1) is detected, by any appropriate means.
18°) Procédé d'identification selon la reven¬ dication 17, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape (1) , les mycobactéries sont lysées et l'étape (1) est réalisée directement sur lesdits lysats.18°) Identification method according to claim 17, characterized in that, prior to step (1), the mycobacteria are lysed and step (1) is carried out directly on said lysates.
19°) Procédé d'identification selon la reven¬ dication 17 ou la revendication 18, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces correspond à la paire SEQ n°3 (XENl) -SEQ n°4 (XEN2) , capable d'hybrider les extrémités 5' et 3 ' d'un fragment spécifique de M. xenopi .19°) Identification method according to claim 17 or claim 18, characterized in that said pair of primers corresponds to the pair SEQ No. 3 (XENl) -SEQ No. 4 (XEN2), capable of hybridize the 5' and 3' ends of a specific fragment of M. xenopi.
20°) Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'une détection à l'aide d'un colorant appro¬ prié.20°) Identification method according to any one of claims 17 to 19, characterized in that step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by detection using an appropriate dye.
21°) Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'un transfert sur membrane et d'une hybrida¬ tion avec une sonde non-radioactive selon la revendica¬ tion 9. 22°) Procédé de dépistage d'une infection à M. xenopi , dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :21°) Identification method according to any one of claims 17 to 19, characterized in that step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by a transfer to a membrane and a hybridization with a non-radioactive probe according to claim 9. 22°) Method for screening for an infection with M. xenopi, in a biological sample, characterized in that which it includes:
(1) une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un réactif de dia- gnostic selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 et (2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1) .(1) a step in which the biological sample is brought into contact with at least one diagnostic reagent according to any one of claims 6 to 11 and (2) a step in which the product obtained in step (1) is detected, by any appropriate means.
23°) Procédé de dépistage selon la revendica¬ tion 22, caractérisé en ce que le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une paire d'amorces selon la revendi¬ cation 7 ou la revendication 8 et permet 1 ' obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter.23°) Screening method according to claim 22, characterized in that the diagnostic reagent of step (1) is a pair of primers according to claim 7 or claim 8 and allows the obtaining of amplification products of the nucleotide sequence to be detected.
24°) Procédé de dépistage selon la revendica- tion 22 ou la revendication 23, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'une détection à l'aide d'un colorant appro¬ prié. 25°) Procédé de dépistage selon la revendica¬ tion 22 ou la revendication 23, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'un transfert sur membrane et d'une hybrida- tion avec une sonde non-radioactive selon la revendica¬ tion 9.24°) Screening method according to claim 22 or claim 23, characterized in that step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed detection using an appropriate dye. 25°) Screening method according to claim 22 or claim 23, characterized in that step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed a transfer to a membrane and a hybridization with a non-radioactive probe according to claim 9.
26°) Procédé de dépistage selon la revendica¬ tion 22, caractérisé en ce que le réactif de l'étape (1) est une sonde selon la revendication 9. 27°) Kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé d'identification et/ou du procédé de dépistage selon l'une quelconque des revendications 17 à 26, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés : - des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces la revendication 7 ou la revendication 8,26°) Screening method according to claim 22, characterized in that the reagent of step (1) is a probe according to claim 9. 27°) Kit, ready to use, for implementation of the identification method and/or the screening method according to any one of claims 17 to 26, characterized in that it comprises, in addition to useful quantities of buffers and appropriate reagents: - appropriate doses of at least a pair of primers claim 7 or claim 8,
- et/ou des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique selon la revendication 9 , - et/ou des réactifs de visualisation de la réaction d'hybridation de ladite sonde et de l'ADN de l'échantillon à tester. - and/or appropriate doses of at least one probe or a nucleotide probe fragment according to claim 9, - and/or reagents for visualizing the hybridization reaction of said probe and the DNA of the sample to test.
PCT/FR1995/000831 1994-06-24 1995-06-22 Nucleic acid fragments, derivatives of the mycobacterium xenopi genome, and applications thereof WO1996000299A1 (en)

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