WO1996000240A1

WO1996000240A1 - Novel protein and process for producing the same

Info

Publication number: WO1996000240A1
Application number: PCT/JP1995/001270
Authority: WO
Inventors: Masaaki Goto; Eisuke Tsuda; Kazuki Yano; Fumie Kobayashi; Kyoji Yamaguchi; Naohiro Washida; Toshiko Satake; Tomonori Morinaga; Masatsugu Ueda; Kanji Higashio
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
Priority date: 1994-06-27
Filing date: 1995-06-26
Publication date: 1996-01-04
Also published as: EP0725080A1; FI960706A0; ZA955319B; AU2753595A; CA2169953A1; HU9600395D0; NO960766D0; FI960706L; KR960703943A; IL114356A0; NZ288352A; HU220130B; CN1129944A; US6046033A; MX9600765A; NO960766L; HUT76748A

Description

明細書新規蛋白質及びその製造方法技術分野

本発明は骨芽細胞増殖活性を示す新規な蛋白質、すなわち骨芽細胞増殖因子 ( basic Osteoblast Growth Factor- 11 ；以下' b O G F — IIという）及びその製造方法に関する。

背景技術

人の骨は絶えず吸収と再形成を繰り返しているが、この過程で中心的な働きをしていると考えられている細胞が、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞である。このような細胞が担当している骨代謝の異常により発生する疾患の代表としては骨粗鬆症が挙げられる。この疾患は骨芽細胞による骨形成を破骨細胞による骨吸収が上画ることにより発生する疾患である力く、この疾患の発生メ力ニズムについては未だ完全には解明されていない現状にある。この疾患は骨の疼痛を発生させ、骨の脆弱化による骨折の原因となる疾患である。従って、高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり老人の発生原因となるこの疾患は社会問題にもなつており、その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代謝異常による骨量減少症は骨吸収の抑制、骨形成の促進、あるいはこれらの'バランスの改善により治療されることが期待される。

骨形成は、骨形成を担当する細胞の増殖、分化、あるいは活性化によって促進されることが期待される。近年、このような活性を有する生理活性蛋白質（サイトカイン）への関心が高くなり、精力的な研究が行われている。骨細胞に分化する骨芽 ¾ 胞の増殖を促進するサイトカインとして線維芽細胞増殖因子フアミリー (f ibroblast growth factor; F G F： Rodan S. B. et al .， Endocrinology vol .121, P1917, 1987) 、インシュリン様増殖因子一 I (insul in l ike growth factor- 1； I G F - I ： Hock J. M. et al . , Endocrinology vol .122, p254, 1988) 、ィンシユリン様増殖因子— I I ( I G F - II ： McCarthy T. et al . , Endocrinology vol .124, p301 , 1989) 、及び異所骨形成因子ファミリ一 (bone morphogen i c protein; B M P： Sampa th T. K. et al . , J. Biol Chem. vol .267, p20532, 1992 、 Knut sen R . et a 1. , B i ochem . B i ophy s . Res . Commun . vol .194, P1352, 1993、及び山ロ朗他、実験医学 vol , 10, _Ρ2003, 1992) 等のサイトカインが報告されている。又、骨芽細胞の分化を促進するサイト力インとしては、トランスフォーミング増殖因子一 β (transforming growth factor— β ； ι G F — β ： Centre 11a M. et al . , J. Biol . Chem. vol .262, p2869> 1987) 、ィンシユリン様増殖因子、及び異所骨形成因子ファミリ一（Takuwa Y . et a 1. , Β l ochem . Β ι opn s . Res . Commun. vol , 1 (4, p96 , 199 及び Knutsen . et a 1. , B i ochem . B i ophy s . Res . Commun vol .194, P1352, 1993) 等が報告されている。これらのサイト力インは、骨形成の促進による骨量減少症の改善剤となる可能性が期待され、異所骨形成因子フアミリーのサイトカイン等、上記のサイト力ィンの一部については骨代謝改善剤として臨床試験が実施されている。

現在、骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮を図る医薬品として、臨床では活性型ビタミン D ₃ 、カルシトニン及びその誘導体、ェストラジオ一ル等のホルモン製剤、イブリフラボン又はカルシウム製剤等が使用されている。しかし、これらを用いた治療法はその効果並びに治療結果において満足できるものではなく、これらに代わる新しい治療薬の開発が望まれていた。前述したように骨代謝は骨形成と骨吸収のバランスによつて調節されており、骨芽細胞の増殖促進により骨新生を活発にするサイトカインは、骨粗鬆症等の骨量減少症の治療薬となることが期待される。

発明の開示

本発明者らはこのような現状に鑑み骨芽細胞増殖促進因子を広く求め鋭意探索の結果、新規な蛋白性骨芽細胞増殖因子を見出し、更に、高濃度に本発明蛋白質を蓄積せしめ、効率の良い精製方法を確立するに至った。次に、得られた天然型蛋白質のァミノ酸配列の情報に基づき、本蛋白質をコードする c D N A のクロ一ユングに成功した。更に、この c D N Aを用いて、遺伝子工学的手法により骨芽細胞増殖因子を生産させるに至った, 従って、本発明は新規な骨芽細胞増殖因子（蛋白質）及びその効率的な製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、種々の動物細胞培養液中の骨芽細胞増殖促進活性を測定したところ、ヒト線維芽細胞 I M R— 9 0 ( A T C C - C C L 1 8 6 ) 培養液中に高い骨芽細胞増殖促進活性が存在することを見出した。又、 I M R— 9 0細胞の培養法を検討し、アルミナセラミック片を細胞の担体として使用することにより培養液中に高濃度に骨芽細胞増殖促進因子を蓄積させる条件を確立した。更に、イオン交換カラム及びノ又はへパリン力ラムを効率良く組み合わせる条件を見出すことによって、効率の良い b 0 G F _Πの精製方法を確立した。

さらに、本発明者らはこの天然型 b O G F— IIのアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列に基づいてプライマ一を設計しこのプライマ一を用いて P C R法によって b O G F— IIの c D N A断片を得た。この c D N A断片をプローブとして用い、 I M R— 9 0細胞の c D N Aライブラリーをハイブリダィゼーシヨン法でスクリーニングして、本発明蛋白質全長をコードする c D N Aを得ることに成功した。さらに、この c D N Aをべクターに組込み、このべクタ一を用いて宿主細胞を形質転換し、この形質転換細胞を培養することによって b O G F— IIを回収採取する方法を確立した。

本発明は、ヒト線維芽細胞に由来し、還元及び非還元条件下ソジゥムドデシルサルフェポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E ) における分子量が約 1 5 k Dであり、陽イオン交換体及びへパリンに強い親和性を有し、 7 0 て、 1 0分間の加熱処理により骨芽細胞増殖活性が低下、 9 0 て、 1 0分間の加熱処理により不活化されることを特徴とする蛋白質に関する。本発明の蛋白質 b 0 G F— IIの構造は、既知の骨芽細胞増殖因子とは N末端ァミノ酸配列において明確に相違する。また、本発明の蛋白質 b 0 G F — IIの N—末端アミノ酸配列を配列表配列番号 1及び 2 に示す。

さらに本発明は、ヒト線維芽細胞を培養し、培養液をへパリンカラム処理し、吸着画分を溶出し、溶出液を陰イオン交換力ラム処理して非吸着画分を得て、この画分を陽イオン交換カラムにかけ、さらにへパリンカラムで精製して上記蛋白質を採取する蛋白質 b O G F— Ι の製造法に閬する。

本発明におけるカラム処理は、単に培養液等をへパリンセファロースカラム等に流下させるものばかりではなくツチ法で培養液をへパリンセファロース等と混合し、カラムで処理した場合と同等の効果を奏するものも包舍する。

本発明の蛋白質 b 0 G F— IIはヒト線維芽細胞の培養液から効率良く、しかも高収率で単離精製することができる。この原料からの b O G F— IIの製造は、生体物質からの蛋白性物質の分離に汎用される通常の方法と同様にして、目的とする b O G F— IIの物理的、化学的性質を利用した各種の精製手段に従い実施することができる。この濃縮手段として限外濾過、凍結乾燥、及び塩折等の通常の生化学的処理手段が挙げられる。又、精製手段としてはイオン交換クロマトグラフィー、ァフィニティ一クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、調製用電気泳動等の通常の蛋白性物質の精製に利用される各種の手段を組み合わせて用いることができる。特に好ましくは、ヒト線維芽細胞として I M R— 9 0を用いることが望ましい。そして原料となるヒト線維芽細胞 I M R— 9 0 の培養液は、ヒト線維芽細胞

I M R— 9 0をセラミックに吸着させ、 5 %ゥシ新生仔血清を添加した D M E M培地を培養液として用い、ローラーボトル中で一週間程度静置培養することにより得たものを使用するとよい。又、精製処理を実施する際に緩衝液に界面活性剤として 0.1% C H A P S (3- [ (3-cholamidoprop l) -dimethylammonioj -l-propane sulfonate) を添加して精製を行うのが良い。

本発明の蛋白質の精製方法は、先ず培養液をへパリンカラム (へノ、。リン一セファロース C L 6 B、フアルマシア社製）にカゝけ、 2 M NaClを舍む 2 0 Tr i s - HC 1緩衝液、 ρίΐ 7.5で溶出させ、へパリン吸着性の O G F画分を得、この画分を Q · 陰ィォン交換カラム（HiLoad— Q/ F F、フアルマシア社製）にかけ. その非吸着画分を集めることによりへパリン吸着性で塩基性の b 0 G F画分を得ることができる。得られた b 0 G F活性画分は S ' 陽イオン交換カラム (HiLoad - S / H P , フアルマシア社製）で更に見かけ上 3つの活性ピークに分画され、より低濃度の NaClで溶出される順に b 0 G F— I (0.15M)、 b O G F—

II (0.35M)、 b 0 G F— III (0.55M)となる。

本発明の b 0 G F— 11は前述した方法、即ちへパリンカラムクロマトグラフィー（へパリン一 5 P W、トーソ一社製）を更に繰り返し行なうことによつて単離 · 精製することができ、この物質は前述した特性で特定される。また、 b O G F _III は 7 0て、 1 0分間の熱処理により失活し、へパリンカラムから約 1. 8 M の NaClで溶出され、更に抗塩基性線維芽細胞増殖因子 (basic Fibroblast Growth Fac tor )中和抗体でその活性が中和されることから、塩基性線維芽細胞増殖因子である可能性が高いと判断される。

また、本発明の b O G F— II蛋白質の遺伝子工学的手法による製造方法は、天然型 b 0 G F - Πのアミノ酸配列に基づいてプライマーを設計し、このプライマーを用いて P C R法によつて b O G F— IIの c D N A断片を得る。次に、この c D N A断片をプローブとして用い、 I M R— 9 0細胞の c D N Aライブラリーをハイブリダイゼーション法でスクリー二ングして、 b 〇 G F— Π全長をコードする c D N Aを得る。更にこの b 0 G F - II cD N Aを適当な発現用プロモーターを有したベクターに挿入し、哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスターォバリー細胞）などの真核細胞や、細菌（例えば大腸菌）などの原核細胞のうち適当な宿主にこの発現べクタ一をトランスフユクトし、この細胞を培養することにより、培養液あるいは細胞中から本発明蛋白質である b 0 G F— IIを面収.. 精製するものである。

本発明は、このような b O G F— II cD N A、それから推定されるアミノ酸配列をもつ、あるいはこのアミノ酸配列を部分配列として舍有する、またはこのアミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有する、骨芽細胞増殖活性を有する蛋白質に閔する。

0 G F活性は、骨芽細胞株あるいは正常骨芽細胞を標的細胞として用い、その細胞数の増加や ³ H—チミジンの取り込み促進を試験することにより測定できる。好ましい標的細胞としては、マウス骨芽細胞株 M C 3 T 3 — E 1 (J. Oral. Biol. 23, 899, 1981 及び J. Cell. Biol . 96, 191, 1983)を用いることができる。この細胞株はビタミン D ₃ や副甲状腺ホルモン反応性があり、また in vitro で in ν ί voの過程に似た過程で石灰化することが報告されている細胞株である。また、活性の測定には好ましくは無血清培地を用い、 ³H—チミジンの取り込み促進を試験することにより高感度で正確な測定ができる。

本発明の蛋白質である b 0 G F— IIは、骨粗鬆症等の骨量減少症或いはその他の骨代謝異常疾患の治療あるいは改善を目的とした医薬組成物として、又、このような疾患の免疫学的診断を確立するための抗原として有用である。

本発明の蛋白質は、製剤化して経口あるいは非経口的に投与することができる。すなわち、製剤は骨芽細胞増殖因子を有効成分として舍む医薬組成物として、ヒトに対して安全に投与されるものである。医薬組成物の形態としては、注射用組成物、点滴用組成物、座剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収テープ等が挙げられる。注射用組成物の場合は、本発明の骨芽細胞増殖促進因子の薬理的有効量及び製薬学的に許容しうる担体の混合物であり、その中にはアミノ酸、糖類、セルロース誘導体、及びその他の有機/無機化合物などの一般的に注射用組成物に添加される賦形剤/賦活剤を用いることもできる。また、本発明の骨芽細胞増殖促進因子とこれらの賦形剤/賦活剤を用い注射剤を調製する場合は、必要に応じて PH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加して常法によって各種注射剤とする。

図面の簡単な説明

第 1図は、陽イオン交換カラム（HiLoad- S/HP®、 2.6 X 10cm. フアルマシア社製）による b O G F画分の溶出パターンを示す図中、ピーク 1 は b 〇 G F— I , ビーク 2 は b 〇 G F — II及びピーク 3 は b 〇 G F _ 111 をそれぞれ示す。

第 2図は、ァフニティカラム（へパリン 5 P W ®、 0.8X7.5 cm、ト一ソ一社製）による本発明の b ◦ G F— IIの溶出パターンを示す。

第 3図は、非還元条件下ソジゥムドデシルザルフヱート —ボリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E ) による本発明の b O G F— IIの電気泳動パターンを示す。

図中、レーン 1 は分子量マーカー、レーン 2 はフラクション k、レーン 3 はフラクション B、レーン 4 はフラクション C -、レーン 5 はフラクション D及びレーン 6 はフラクション Eをそれぞれ示す。

なお、フラクション A〜 Eについては第 2図を参照。

第 4図は、逆相カラム（0 D— 300、 C 1 8、 2. 1 X 200 mm. アプライト社製）によるエンドプロティナーゼ A s p — N (ベ一リンガー社製）消化した還元 P E化 b 0 G F— II由来べプチドの溶出パターンを示す。

第 5図は、 b ◦ G F— IIの骨芽細胞増殖促進活性を示す。第 6図はプラスミド P Q E 3 0 — O G F — IIの構造を示す。図中、 6 H i s はヒスチジンクラスタ一を、 Phage T5 promo ter はファージ T5プロモーターを、 b 1 a はアンピシリン耐性遺伝子を、 O r i は大腸菌での複製開始点を、 0 G F IIは b 〇

G F - II cD N Aをそれぞれ示す。

第 7図は、 H i s 6 — b O G F - IIの骨芽細胞増殖促進活性を示す。

図中、カラム 1 はコントロールを、カラム 2 は H i s 6 - b 〇 G F— II溶液 1 0 %添加時の活性をそれぞれ示す。発明を実施するための最良の形態

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。しかしこれらは単に例示するのみであり、本発明はこれらにより限定されるものではない。

荬旆例 1 天然型 b 0 G F — I Iの採取

(1) ヒト線維芽細胞 I M R — 9 0培養液の調製

ヒト胎児肺線維芽細胞 ' I M R — 9 0 ( A T C C - C C L 1 8 6 )は、ローラ一ボトル（490cm²ヽ 110 X 171mm. コーニング社製）中で 8 0 g のアルミナセラミック片（アルミナ 9 9. 5 %、東芝セラミック社製）に付着させ培養した。培養には 6 0個のローラーボトルを使用し、ローラ一ボトル 1 個当たり 5 %仔牛血清を添加した 500mlの 1 O mM H E P E S緩衝液添加 D M E M 培地（ギブコ社製）を用い、 3 7 'C、 5 % C 0 ₂ 存在下で 7〜 1 0 日間静置培養した。培養後培養液を回収し、新たな培地を添加することにより 1 回の培養で 3 0 1 の I M R — 9 0培養液を得た。得られた培養液を試料 1 とした。

(2) 骨芽細胞増殖促進活性の測定方法

本発明の蛋白性骨芽細胞増殖因子の 0 G F活性測定は、マウス骨芽細胞株 ♦ M C 3 T 3 — E 1 (明海大学歯学部久米川正好教授より譲受）に対する D N A合成促進活性を測定することによって行った。すなわち、 9 6 ウェルマイク口プレートに 0. 2 % B S Aを舍む核酸不舍一 M E M培地（ギブコ社製）で希釈したサンプル 5 0 1を入れ、 M C 3 T 3 — E 1 細胞を 2 X 1 0 ³ cel ls/ 5 0 μ \ の o — M E M培地で播種し、 5 % C 0₂、 3 7 ΐにて 1 5〜 2 0時間培養した。培養後、リン酸塩緩衝生理食塩水で 0. lmCi /mUこ希釈した ³ H —チミジン（ T R K 686 、ァマシャム社製）を 1 0 1 ノウル添加し、更に 2時間培養した後、細胞に取り込まれた ³H—チミジンの放射活性をマトリックスカウンター（パッカード社製）で測定した。得られた放射活性（cpm)を 0 G F活性とした。

(3) b 0 G F— IIの精製

i) へノ、。リン ' セファロ一ス C L一 6 Bによる精製

約 9 0 1 の I M R— 9 0培養液（試料 1 ) を、 0.22 m のフィルター（親水性ミリディスク、 2000cm² 、ミリポア社製）で濾過した後、 3面に分けて 0. 3 M N'aClを舍む 1 0 mM Tris-HCl, pH 7.5で平衡化させた 8 0 m 1のへパリン · セファロース C L一 6 B ( 5 X4. 1 cm) にかけた。流速 500m 1 ,/hrにて、 1 0 mM Tris-HCl, pH 7.5で洗った後、 1 0 mM Tris-HCl/ 2 M NaCl, pH 7.5で溶出を行い、へパリン · セファロース C L一 6 B吸着画分 900mlを得、得られた画分を試料 2 とした。

ii ) Hi Load— Q/ F Fによる精製

へパリン . セファロース吸着画分（試料 2 ) を 1 0 mM Tris -HC1, pH 7.5に対して透析した後、 0. 1 %になるように C H A P Sを加え 4 てで一晩放置したものを、 2 回に分けて 5 0 Tris-HCl/0. 1 % C H A P S , pH 7.5で平衡化した陰イオン交換カラム（Hi Load— Q / F F _N 2. 6 X 1 0 cm. フアルマシア社製）にかけ、非吸着画分 1000mlを得た。得られた画分を試料 3 とした。

iii) Hi Load — S / H Pによる精製

HiLoad— Q非吸着画分（試料 3 ) を、 5 0 mM Tris-HCl/0.1 % C H A P S , pH 7.5で平衡化した陽イオン交換カラム（IHLoad - S / H P . 2.6X 1 0 cm. フアルマシア社製）にかけた。 50 mM Tris-HCl/0. 1 % C H A P S , pH 7.5で洗浄した後、 100 分間で NaClを 1 M にする直線勾配、流速 8 ml/分にて溶出を行い、 1 2 ml /フラクションにて分取を行った。各フラクション 1 0 1 を用いて前記（2) の測定法に従って 0 G F活性を測定した。 O G F活性は 3つのピーク（ピーク 1 ： b O G F _ I、ピーク 2 ： b O G F— II、ピーク 3 ： b O G F— ΠΙ)に認められた。結果を第 1図に示す。

ピーク 3 の画分に認められた 0 G F活性は、 7 0 て 1 0分間の熱処理により失活し、へパリンカラムから約 1. 8 M の NaClで溶出され、更に抗ヒト b F G F抗体で中和されることから、 b F G Fであると推測された。

iv) ァフィ二ティ一カラム（へパリン一 5 P W ) による精製ピーク 2 ( b 0 G F - II ) 画分 120mlを 240mlの 5 0 mM Tris -11(：1/0. 1 %〇 11八？ 3 _> 11 7.5で希釈した後、 5 0 mM Tris -HCl/0. 1 % C H A P S , pH 7.5で平衡化したァフィ二ティーカラム（へパリン一 5 P W、 0. 8 7. 5 cm. ト一ソ一社製）にかけた。 5 0 mM む15-11{ 1/0. 1 %〇 11八？ 3 , 1] 7.5で洗浄した後、 6 0分間で NaCl を 2 M にする直線勾配、流速 0. 5 ml /分にて溶出を行い、 0. 5 m 1 /フラクションにて分取を行った _£ 各フラクションを用いて O G F活性を測定し、約 1. 0〜 1. 2 M NaClで溶出される 0 G F活性画分 5 mlを得、得られた画分を試料 4 とした。

5 mlの試料 4を 1 0 mlの 5 0 mil Tris-HCl/0. 1 % C H A P S , pH 7.5で希釈した後、 5 0 mM Tris-HCl/0. 1 % C H A P S , pH 7.5で平衡化したァフィ二ティ一カラム（へパリン一 5 P W、 0. 8 X 7. 5 cm、ト一ソ一社製）にかけた。 5 0 mM Tris -HCl/0. 1 % C H A P S , pH 7.5で洗浄した後、 6 0分間で NaClを 2 M にする直線勾配、流速 0. 5 mlノ分にて溶出を行い、 0. 5 ml /フラクションにて分取を行った。各フラクション 2〃】を用いて 0 G F活性を測定し、約 1. 0〜1. 2 NaClで溶出される 0 G F活性画分 5 mlを得、得られた画分を試料 5 とした。 5 mlの試料 5 を 1 O mlの 5 O mM Tris-HCl./O. 1 % C H A P S , pH 7.5で希釈した後、 5 O mM Tris-HCl /0.1 % C H A P S , pH7. 5 で平衡化したァフィ二ティーカラム（へパリン一 5 P W、 0. 5 X 7. 5 cm、トーソ一社製）にかけた。 5 O mM Tris- HCl /0. 2 M NaCl/0. 1 % C H A P S , _PH 7.5で洗浄した後、 6 0分間で NaClを 0. 8 M にする直線勾配で流速 0. 5 m 1 /分にて溶出を行い、 0. 5 ml/フラクションにて分取を行つた。各フラクシヨン 4 1 を用いて O G F活性を測定した。結果を第 2図に示す。

(4) b 0 G F 一 11の分子量測定

得られた〇 G F活性画分を 2 mlづっ 5 つに分画し（図 2、フラクシヨン A〜E ) 、各フラクションの 100 / 1 を用いて非還元条件下で S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つた, 即ち、得られた溶出フラクション A〜 E各 100〃 1 を水に対して透析した後、凍結乾燥し、 1. 5 1 の 1 0 mfl Tris -HC1, _PH

8/1 mM E D T A/2. 5 % S D S /0.01 %ブロモフエノールブルーに溶解した。 3 7 てで一晩放置後、このサンプル 1 を S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。電気泳動は 8 — 2 5 %アクリルアミドのグラジェントゲル（ファルマシア社製）を使用し、電気泳動装置（ファストシステム、フアルマシア社製）を用いて行った。分子量マーカ一として、ホスホリパーゼ b ( 9 4 k D ) 、血清アルブミン（ 6 7 k D ) 、オボアルブミン（ 4 3 k D ) 、カルボニックアンヒドラーゼ

( 3 0 k D ) 、トリプシンインヒビター（ 20. 1 k D ) 、 a - ラクトアルブミン（14.4 k D ) を用いた。電気泳動終了後、フアルマシア社のプロトコ一ルに従って銀染色を行った。結果を第 3図に示す。

その結果、 1 5 k D付近に◦ G F活性の強さに比例した蛋白質のバンドが検出され、フラクション D及び Eには 1 5 k D以外の蛋白質のバンドは検出されなかった。又、この活性蛋白質にっき還元条件下で S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、非還元条件下とほぼ同じ分子量の一本の蛋白質バンドのみが検出された。

(5) N—末端アミノ酸配列の決定

得られた溶出フラクション D 500 u 1 を、 0. 1 % トリフルォ口酢酸（ T F A ) / 1 0 % ァセトニトリルにて平衡化した逆相カラム ( B U - 200 、 C 4、 2. 1 X 220 mm、アプライド社製）にかけ、 5 0分間のァセトニトリル 1 0 %から 6 0 %の直線勾配で、流速 0. 2 ml/分にて溶出を行い、脱塩 · 濃縮した後、プロティンシーケンサー（477 A -120 A、アプライド社製）で N 一末端アミノ酸配列の分析を行った。得られたペプチドのアミノ酸配列を、配列表配列番号 1 に示す。尚、配列中一 X a a — は未同定のアミノ酸を示す。

(6) 蛋白暂ァミノ酸配列の決定

さらに、溶出フラクション C 2000 1 を濃縮した後、 1 mg のジチオスレィトールを舍む 300〃 1の 0. 5 M Tris-HCl , H8.5 / 1 0 mM E D T A/ 7 M 塩酸グァニジンを加え室温で 4時間放置し還元した後、 2 1 の 4 — ビニルピリジンを加え、室温暗所で一晩放置しピリジルェチル（ P E ) 化した。これらのサンブルに 3 1 の 2 5 % T F Aを加え、 1 0 %ァセトニトリル /0. 1 % T F Aで平衡化した逆相カラ厶（ B U — 300 、 C 4、 4. 6 X 3 0 mm. アプライド社製）にかけ、 5 0分間でァセトニトリル濃度を 5 0 %にする直線勾配、流速 1 ml/分で溶出を行い、還元 P E化 b 0 G F — IIを得た。得られた還元 P E化 b O G F — IIの四分の一につきプロティンシーケンサ一（477 A - 120 A、アプライド社製）で N末端アミノ酸配列の分析を行った。得られたァミノ酸配列を、配列表配列番号 2 に示す。

残り四分の三の還元 P E化 b O G F — IIを、 5 0 1 の 5 0 mMリン酸緩衝液， pH 8.5/ 1 M 尿素中で、 0. 5 g のヱンドプロティナーゼ A s - N (ベ一リンガ一社製）で 3 7 て、 1 5 時間消化し、 0. 1 % T F Aで平衡化した逆相カラム（0 D— 300、 C 1 8、 2. 1 X 220 mm、アプライド社製）にかけ、 8 0分間のァセトニトリル 0 %から 4 0 %の直線勾配で、流速 0. 2 ml Z分で溶出を行い、分画した。溶出パターンを図 4 に示す。検出された五つのピークにつき、プロティンシーケンサー（477 A— 120 A、アプライド社製）で N末端アミノ酸配列の分折を行った。得られた 5種類のぺプチドのァミノ酸配列を、各々配列表配列番号 3〜 7 に示す。

(7) bO G F - IIの容量依存的骨芽細胞増殖促進活性

溶出フラクション Dの蛋白質濃度を、 B S A (ゥシ血清アルブミン）をスタンダードとしてローリー法により測定した。このサンプルを用い、 100ng/mlから二分の一希釈で実施例 1 (2) 骨芽細胞増殖促進活性の測定方法に従い 0 G F活性を測定した。結果を図 5 に示す。

実施例 2 遺伝子工学的手法による b 0 G F - IIの採取

(1) b O G F — II遺伝子のクローユング

1) P C R法による b O G F — II c D N A断片のクローニング決定した b O G F — IIのァミノ酸配列を基に、遺伝子増幅用プライマ一を作製した。即ち、 N末端アミノ酸配列である Glu- Thr-Glu-Tyr-Gly-Pro-Cys からそれをコ一ドする D N A配列を推定し、 5' -GA (A/G) ACNGA (A/G)TA (T/C) GGNCCNTG - 3 ' の配列を持つミックスプライマ一を合成した。ここで A/G は A または G を、 T/C は T または C を、 N は A,G,C または T を表す。また、内部アミノ酸配列である Asp- Lys-Lys-Gly- Phe-Tyr-Lys からそれをコードする D N A配列を推定し、その相捕鎖 5' -TT(A/G)TA (A/G) AANCC(T/C)TT(T/C)TT(A/G)TC-3' の配列を持つミックスプライマーを合成した。ブライマーの合成にはアプライド社 D N A合成機 394 を用いた。この 2種のプライマー（各 200pmol) と、錶型 D N Aとしてヒト胎児肺線維芽細胞 1 M R 9 0 ポリ A R N A由来一本鎖 c D N A ( 1 μ g ) を用い、 P C R法（poly merase chain reac t i on)を行った。酵素は EX Taq (宝酒造社製）を使用し、反応溶液は、 1 0 X ExTaqバソファー 5 μ K 2.5mM d N T P 4 μ K c D Ν Α溶液 1 1、 EX Taq 0.25 1、蒸留水 29.75 μ 1 、プライマ一（各 4 0 ) 5 1 ずつで最終容量を 5 0 / 1 とした。反応は、 9 5 °Cで 3分保温後、 9 5 て 3 0秒、 5 0 °C 3 0秒、 7 0 て 2分の三段階の保温を 3 0 サイクルを行つた後、 7 0 'C 5分保温する条件で行った。反応終了後、反応液 8 1を 4 %ァガロースゲル電気泳動に供し、約 120bpのフラグメントを舍む数本のバンドを検出した。この反応液 4, 5 1、 pCRI I (original TA cloning ki t, I n v i tr ogen ¾t ) クロ一ニングベクター 0.5〃し及び D N A ライゲ一シヨンキット（version 2) 1 液（宝酒造社） 5 1 を混合し 16 で一晩保温した。ライゲーシヨン反応液 5 1 を用い、大腸菌 D H 5 α ( B R L社）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性菌中のプラスミドの挿入断片の長さを P C R法で推定し、約 120bp の挿入断片を持つ菌 4 株を分離した。反応には上記 2種のブライマ一を用いた。分離した 4株から、プラスミド D N Aを精製し、挿入断片の D N A配列を決定した。これらの塩基配列がコ一ドするアミノ酸配列を解折すると、いずれのクローンも b O G F — II蛋白質から決定されたアミノ酸配列と一致する読み枠が存在した。そのうちの 1 種（クローン 111 ) を以下の実験に供した。 2) b O G F — II全長 c D N Aのクローユング

クローン Itlのプラスミドを精製し、制限酵素 EcoRI (宝酒造社）で切断しァガロースゲル電気泳動後、約 120bp の b 0 G F — II cD N A断片を単離した。この断片を Megaprime キット（Amers ham 社）および、 ³² P-dCTPを用い³² P 標識し、以下の実験用のプローブとした。ヒト胎児肺線維芽細胞 I M R 9 0 ポリ A R N A 5 // g 力、ら Great Lengths c D N A Synthesis kit (CI on tech 社）の説明書に従いニ本鑌 c D N Aを合成した。ポリ A R N Aは Fast Track ( S tra tagene社）を用いて調製した。ニ本鎮 c D N Aの合成法を以下に簡単に示す。 poly A RNA5 μ g と 01 i go (dT) _2S UN) プライマーを混合し蒸留水を加え最終容量を 12.5 1 とし、 7 0 'Cで 3分保温後、氷中で 2分冷却した。この溶液に蒸留水 3. 2 〃 1 、 5 X First-strand buffer 5 μ 1 、 D T T (ジチオスレィトール） 0. 5 〃 1 、 d N T P (各 2 0 mM) 1. 3 / 1 、 M M L V (RNaseH - ) 2. 5 ^ 1 ( 500 ュニット）を加え、 42てで 90分保温した。さらに、蒸留水を 123.5 〃 1、 5 X second-strand buffer 4 0 / d Ν Τ Ρ (各 2 0 mM) 1.5〃 1、 Second - strand enzyme cocktail 丄 0 〃】を加し、 1 6 °Cで 2時間保温した。この反応液に T4 polymerase 1 5 ュニットを加え、 1 6 てでさらに 3 0 分保温後 0.2M E D T A 1 0 u 1 添加して反応を停止し、クロロフオルム · イソアミルアルコール処理後エタノール沈殿を行った。このニ本鎮 c D N Aの末端に EcoRI-Sall-Notl リンカ一（Clontech社）を付加後、あらかじめ制限酵素 EcoRI 切断および CIAP (ゥシ精巣アルカリフォスファターゼ）処理した ZAP Express ファージ（Stratagene 社） D N Aに挿入した。得られた組み換えファージ D N Aをパッケ一ジングし大腸菌 X L 1 - B ] u e R F ' (Stratagene 社）に感染させ、 N Z Y寒天培地（0.5%NaCし 0.2%MgS0₄7Η _ζ0 , 0.5%Yeast Extract, 1¾NZ ァミン， pH7.5, 1.5% 寒天）上にプラークを形成させた。ノ、。ッケージングには G i ga pa c k II Gold packaging ex trac t (S tra tagene社）を用いた。寒天培地上に形成されたファージをナイロンメンブレン、 Hybond- N ( Amersham 社）に転写し、ファージ D N Aを固定した。得られたメンブレンを 100〃 g /m Iのサケ精子 D N Aを舍むハイブリダィゼーションバッファー（Amersham社）に浸し、 6 5 て 4時間処理した後、熱変性した上記³² P 標識 D N Aプローブ（2.5X10⁵cpm/ml) を舍む上記バッファーに浸し 6 5 てで一晩ハイブリダィゼーシヨンを行った。メンブレンを洗浄した後、 b 0 G F — 11 c D N

- 1

Aを持つ 3 クローンを約 100万個の 7ファージから選びだすことができた。この 3 クローンを、さらに 2 回スクリーニングを行うことにより純化した。純化したファージを大腸菌 X L 1 — B 1 u e M R F 'に感染させたのち、へルバ一ファージ Ex As s i s t

(Stratagene社）で多重感染を行い、その培養上清を大腸菌 X L 0 L R (S tra tagene社）に感染し、カナマイシン耐性となつた大腸菌を得た。これらの大腸菌中のプラスミド D N Aの構造を解析し、挿入断片の塩基配列を決定した。配列を配列表配列番号 8 に示す。また、これに基づいて b O G F — IIのアミノ酸配列を配列表配列番号 9 に示す。このアミノ酸配列を天然型 b 〇 G F — IIのアミノ酸配列と対比すると C末端のアミノ酸（第 8 5番目のアミノ酸） L y s が 1 個多いことが判明した。従つて I M R — 9 0培養液から精製した天然型 b 0 G F— IIは C末端リジン残基がカルボキシぺプチダーゼにより切断された蛋白質の可能性もある。その結果、 3 クローンとも b O G F — II N末端 Glu- Thr-Glu-Tyr から 8 5個のアミノ酸からなる open reading frameをコ一ドする D N Aを含んでいることがわかつた。 open reading f r ameは D N A配列中の最初の終止コドンの位置および b 0 G F — II蛋白質からのァミノ酸配列により決定した。得られたプラスミドの一つを PBK-CMV 0GF- I I (3) と名付けた。

(2) b Q G F - II cD N Aの大腸菌での発現

0 G F - II cD N A全長を PCR により増幅し、単離した。用いたプライマーは、 Q30F 5' -GGGGATCCGAGACAGAATATGGTC-3' および Q30R 5' - CCAAGCTTCTACTTGCTCTGCATACT-3' で増幅後制限酵素 BamHI と Hindlll で切り出せるようデザインした。 pBK - CMV 0GF-II (3) 2 O ngを铸型とし、プライマー（Q30Fと Q30R) を用い P C Rをおこなった。反応溶液は、 1 0 X ExTaq バッファー 1 0 μ 1 、 2.5mM d N T P 8 n 1 、 Ex Taq 0.5 / 1 、 D N A溶液 9. 5 / 1 、蒸留水 7 0 1 、プライマ一（各 100 1 / 1 ずつで最終容量を 100 1 とした。反応は、 9 5 てで 3分保温後、 9 6 'C 3 0秒、 5 5 。C 3 0秒、 7 2 °C 3分のサイクルを 2 5 回繰り返し行った後、 7 0 'C 5分保温する条件で行つた。増幅後、プライマーをマイクロコン 100 (アミコン）により除去し、制限酵素 BamHI と Hindlll で切断し、あらかじめ BamHI と Hind I I I で切断しておいた PQE30 (QIAGEN社） 2 O ngと混合しライゲーシヨン反応に供した。ライゲーシヨン反応液を用い大腸菌 X L 2 - B 1 u e (Stratagene社）を形質転換した。得られたァンピシリン耐性株の中から、制限酵素切断地図、塩基配列等による解折により、目的の挿入断片を持つクローンを分離した。このクローン中のプラスミドを PQE30-OGF-IIと名付けた。このプラスミドを持つ大腸菌 X L 2 — B 1 u e ( _P8E30- 0GF- 11 ) は、 F E R M B P - 5 1 3 9 として通商産業省工業技術院生命ェ学工業技術研究所に寄託してある。寄託した大腸菌が保有するプラスミドの構造を図 6に示した。この菌を super medium (2.5% bac to- tryp tone , 1.5% bac to- yeas t extract, 0.5% NaC 1 , 50 ^ g /ml ampicillin) で振とう培養し、 OD600nm が 0. 8 になった時点で IPTG ( i sopropy 1 β -D- thio-galactopylanoside)を終濃度 0. 5 mMになるように添加し、さらに 2 0時間振とう培養を続け b 0 G F— IIを大腸菌で生産させた。培養終了後、集菌し S D Sポリアクリルァミドゲル電気泳動解析により、分子量約 1 5 k Dの主要バンドを確認した。この分子量は I M R 9 0培養上清から得られる b O G F— IIのものとよく一致した。

(3) H i s 6 — b O G F— Πの精製

b O G F— II遺伝子を翻訳して得られる蛋白質の骨芽細胞増殖促進活性を試験することを目的として、 aiAexpress Kit(QIA GEN 製）を用いた発現を試みた。このシステムはヒスチジンへキサマータグを有する蛋白質を発現させた後、このヒスチジンへキサマ一タグと高い親和性を有するニッケルキレ一トー二トリ口 3酢酸樹脂力ラムを用いて精製するシステムである。このシステムは発現させた蛋白質を効率よく精製するためのシステムとして一般的に用いられている。このシステムを利用すると b O G F— IIは N—末端にヒスチジン 6個のクラスタ一を持つ形（ H i s 6 — b O G F— Π ) で翻訳 · 発現される。 I P T G で誘導をかけた大腸菌の菌体 0.35 gに 8 M 尿素と 0. 1 M リン酸ナトリゥムを舍む 1 0 mM Tris-HCl, _PH 8 , 0を 1.75m 1加え、均一になるように攪拌した後、室温にて更に 1 時間攪拌した。攪拌後、室温にて 12,000回転で 1 5分間遠心し上清を集めた。この上清を、 8 M 尿素と 0. 1 H リン酸ナトリウムを舍む 1 0 mM Tris-HCl , pH 8.0で平衡化させた二ッケルキレート —ユトリロ 3酢酸樹脂 ickel- chelating nitrilotriacetic acid resin, QIAGEN製）の 5 0 %懸濁液 8 mlに加え室温にて 4 5分間攪拌した。この樹脂を内径 1. 6 cmのカラムに移し、 2 0 mlの 8 M 尿素と 0. 1 M リン酸ナトリウムを合む 1 0 mM Tris-HCl, _PH 8.0で流速約 0, 5 ml/min にて洗浄した。次に、このカラムを 8 M 尿素と 0. 1 M リン酸ナトリウムを舍む 1 0 Tris-HCl, pH 6.3 で流速約 0. 5 ml/min にて更に洗浄した。最後に、 250mM ィミダゾール、 8 M 尿素及び 0. 1 M リン酸ナトリウムを舍む 1 0 mM Tris-HCl, pH 6.3で流速約 0. 5 ml /mi n にて目的の H i s 6 — b O G F— IIを溶出した。精製した H i s 6 — b O G F— II画分をリン酸塩緩衝生理食塩水に透折した。

(4) H i s 6 — b 0 G F— Πの骨芽細胞増殖促進活性

H i s 6 — b 0 G F— IIの骨芽細胞増殖促進活性は実施例 1 (2) 骨芽細胞増殖促進活性の測定方法に従って測定した。即ち試験サンプルとして上記の精製した H i s 6 — b 0 G F - II画分を 1 0 %になるように添加し、マウス骨芽細胞株 M C 3 T 3 一 E 1細胞への ³H—チミジンの取り込みを試験した。結果を図 7 に示した。この結果から、本発明者らが b 0 G F— II遣伝子として同定した遺伝子の翻訳産物である蛋白質が天然型 b 0 G F— Πと同様に骨芽細胞増殖促進活性を有することが確認された。

産業上利用可能性

本発明により、骨芽細胞増殖活性を有する新規な蛋白質及びその効率的な製造方法が提供される。本発明の蛋 0質は骨芽細胞増殖活性を有するので、骨粗鬆症等各種の骨量減少性疾患の治療剤としてあるいはこれらの疾患の免疫学的診断のための抗原等として有用である。寄託された微生物への言及

当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名

通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3号

寄託機関に寄託した曰

平成 7年 5月 2 6 曰

寄託機関が寄託について付した受託番号

F E R M B P - 5 1 3 9

本寄託は平成 7年 5月 2 6 日に上記寄託機関に行なつた原寄託を（寄託番号微ェ研菌寄 F E R M P — 〗 4 9 4 2号）、平成 7年 6月 1 9 日にブタぺスト条約に基づく寄託に移管したものである。

配列番号： 1

配列の長さ： 2 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Glu Thr Glu Tyr Gly Pro Xaa Arg Arg Glu Met Glu Asp Thr Leu Asn 1 5 10 15

His Leu Lys Phe Leu Asn Val Leu Ser

20 25

配列番号： 2

配列の長さ： 4 0

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Glu Thr Glu Tyr Gly Pro Cys Arg Arg Glu Met Glu Asp Thr Leu Asn 1 5 10 15

His Leu Lys Phe Leu Asn Val Leu Ser Pro Arg Gly Val Xaa He Pro

20 25 30

Asn Cys Xaa Lys Lys Gly Phe Tyr

35 40 配列番号： 3

配列の長さ： 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Asp Val His Cys Tyr Ser Met Gin Ser

1 5

配列番号：

配列の長さ： 1 2

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Glu Thr Glu Tyr Gl y Pro Cys Arg Arg Glu Met Glu 1 5 10

配列番号： 5

配列の長さ： 1 6

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列 Asp Lys Tyr Gly Gin Pro Leu Pro Gly Tyr Thr Thr Lys Gly Lys Glu 1 5 10 15

配列番号： 6

配列の長さ： 2 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Asp Lys Lys Gly Phe Tyr Lys Lys Lys Gin Cys Arg Pro Ser Lys Gly 1 5 10 15

Arg Lys Arg Gly Phe Cys Trp Cys Val

20 25 配列番号： 7

配列の長さ： 2 2

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Asp Thr Leu Asn His Leu Lys Phe Leu Asn Val Leu Ser Pro Arg uly 1 5 10 15

Val His l ie Pro Asn Cys

20 配列番号： 8

配列の長さ： 2 5 8

配列の型：核酸

鎖の数：ニ本鎮

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to ni NA

起源：ヒト

配列の特徴

特徴を表す記号：

存在位置： 1. .258

特徴を決定した方法： E

配列

GAG ACA GAA TAT GGT CCC TGC CGT AGA GAA ATG GAA GAC ACA CTG AAT 48 CAC CTG AAG TTC CTC AAT GTG CTG AGT CCC AGG GGT GTA CAC ATT CCC 96 AAC TGT GAC AAG AAG GGA TTT TAT AAG AAA AAG CAG TGT CGC CCT TCC 144 AAA GGC AGG AAG CGG GGC TTC TGC TGG TGT GTG GAT AAG TAT GGG CAG 192 CCT CTC CCA GGC TAC ACC ACC AAG GGG AAG GAG GAC GTG CAC TGC TAC 240 AGC ATG CAG AGC AAG TAG 258 配列番号： 9

配列の長さ： 8 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：蛋白質 '

配列

Glu Thr Glu Tyr Gly Pro Cys Arg Arg Glu Met Glu Asp Thr Leu Asn 1 5 10 15

His Leu Lys Phe Leu Asn Val Leu Ser Pro Arg Gly Va l His l ie Pro

20 25 30

Asn Cys Asp Lys lys Gly Phe Tyr Lys Lys Lys Gin Cys Arg Pro Ser

35 40 45

lys Gly Arg Lys Arg Gly Phe Cys Trp Cys Val Asp Lys Tyr Gly Gin

50 55 60

Pro Leu Pro Gly Tyr Thr Thr Lys Gly Lys Glu Asp Val His Cys Tyr 65 70 75 80

Ser Met Gin Ser Lys ***

85

Claims

請求の範囲 . 次の特性を有する蛋白質。 ( a ) 還元及び非還元条件下ソジゥムドデシルサルフヱ一ト —ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S _ P A G E ) における分子量が約 1 5 k Dである。 ( b) 陽イオン交換体及びへパリンに強い親和性を有する。 ( c) 骨芽細胞を増殖させる活性を持つ。 (d ) 7 0 て、 1 0分間の加熱処理により骨芽細胞増殖活性が低下し 9 0 'C、 1 0分間の加熱処理により不活性化される。. ヒト線維芽細胞に由来する、請求項 1 記載の蛋白質。 . N —末端ァミノ酸配列が配列表配列番号 1 で特定される、請求項 1 または 2記載の蛋白質。 . N —末端アミノ酸配列が配列表配列番号 2 で特定される請求項 1 または 2記載の蛋白質。 . 配列表配列番号 9 で特定されるァミノ酸配列をコードする c D N A。. 全アミノ酸配列が配列表配列番号 9 で特定される、骨芽細胞を増殖させる活性を有する蛋白質。 . 配列表配列番号 9 で特定されたァミノ酸配列を部分配列として含有し、骨芽細胞を増殖させる活性を有する蛋白質。 . 配列表配列番号 9 で特定されるァミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有し、骨芽細胞を増殖させる活性を有する蛋白質。 . 配列表配列番号 9 で特定されるァミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有し、骨芽細胞を増殖させる活性を有する蛋白質のァミノ酸配列をコードする c D N A。 0 . ヒト線維芽細胞を培養し、培養液をへパリンカラム処理し、吸着画分を溶出し、この画分を陽イオン変換カラムにかけ、さらにへパリンカラムで精製して次の特性を有する蛋白質を製造する方法。 (a) 還元及び非還元条件下ソジゥムドデシルサルフエ一ト —ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S — P A G E ) における分子量が約 1 5 k Dである。 (b) 陽イオン交換体及びへパリンに強い親和性を有する。 (c) 骨芽細胞を増殖させる活性を持つ。 (d) 7 0 て、 1 0分間の加熱処理により骨芽細胞増殖活性が低下し、 9 0 、 1 0分間の加熱処理により不活性化される。

1 . 得られる蛋白質が配列表配列番号 9 で特定されるァミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有し、骨芽細胞を増殖さる活性を有する蛋白質である、請求項 1 0記載の蛋白質の製造方法。

2. 配列表配列番号 9 で特定されるァミノ酸配列またはそれと 8 0 %以上の相同性を有し、骨芽細胞を増殖させる活性を有する蛋白質のァミノ酸配列をコードする c D N Aを舍む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

3. 宿主細胞が哺乳類、細菌、酵母または昆虫由来の細胞である請求項 1 2記載の宿主細胞。

. 宿主細胞が大腸菌である請求項 1 3記載の宿主細胞。

5. 大腸菌が P Q E 3 0 — O G F II (受託番号 F E R M B P 一 5 1 3 9 ) である請求項 1 4記載の宿主細胞。

6. 配列表配列番号 9 で特定されるァミノ酸配列またはそれと 8 0 %以上の相同性を有し、骨芽細胞を増殖させる活性を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする c D N Aを舍む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、培養物中から請求項 1、 3、 4、 6、 7及び 8記載のいずれかの蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造法,