WO1996041642A1 - Composition lyophilisee stable contenant de la thrombopoietine (tpo) - Google Patents

Description

明 柳 官 安定な Τ Ρ 0 含有凍結乾燥組成物 発明の背景

発明の技術分野

本発明は、 Τ Ρ Ο タ ンパ ク 質を含有す る 組成物、 特に安定な Τ Ρ 0 含有凍結乾燥組成物 に関す る 。

従来技術の 開示

ヒ ト Τ Ρ Ο ( t h r omb 0 ρ 0 i e t i η) は 、 サ イ ト 力 イ ン の レ セ プ 夕 一 ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー の ひ と つ で あ る Μ ρ 1 の リ ガ ン ド と し て ク ロ ー ニ ン グ さ れた タ ンパ ク 質であ る （ de SaiiTa geら 、 Na t u re

(Lon d on) 369巻、 533 - 565 頁、 （1994)、 Ba r t l e y, T. D. ら 、 Ce l l 77 巻、 U 17- 1124 頁、 （19M) ) 。 こ れ ら の M p 1 リ ガ ン ド は いずれ も血小板減少症の動物 （ ヒ ト 、 マ ウ ス、 ィ ヌ ） の血 清や血漿中 に検出 さ れ、 巨核球形成や血小板形成への関与が確 認さ れて い る 。

血小板減少症の治療剤の 開発を念頭に お い て、 本出願人 も 、 ラ ッ ト 骨髄 よ り 高度に純化 し た 巨核球前駆細胞か ら の 巨核球生 成を促進す る 活性を指標に し て、 血小板減少症の ラ ッ ト 血漿よ り ラ ッ ト T P O を精製 し 、 そ の部分ア ミ ノ 酸配列 に基づい て、 ラ ッ ト T P O c D N A 、 さ ら に は ヒ ト T P O c D N A を ク ロ 一 ニ ン グ し 、 遺伝子組換え技術に よ っ て大量 に均一な ヒ ト T P O を取得す る こ と に成功 し た （ H. M i y a z a k i ら 、 Exp. H e m a t o 1. 22卷、 838 頁、 （1994) ) 。 本出願人が取得に成功 し た こ の ヒ ト T P O は、 前述の ヒ M p 1 の リ ガ ン ド と し て取得さ れた因子 と 同一の ア ミ ノ 酸配列を有す る こ と が判明 し て い る （配列表 ： 配列番号 1 ) 。

本発明者 ら は、 該 ヒ ト T P O を制ガ ン剤や免疫抑制剤の投与 あ る い は放射線照射や B M T に よ っ て骨髄抑制の起 き た血小板 減少症の マ ウ ス に投与 し た と こ ろ、 血小板減少阻止効果、 血小 板増加促進効果、 さ ら に は、 造血機能の亢進が認め ら れ、 本発 明の T P 0 が こ れ ら の血小板減少症 に有効であ る こ と を見い だ し てい る 。

T P O は、 そ の高活性ゆ え に極めて微量で使用 さ れ、 活性成 分 と し て通常 0 . 0 5 // g Z k g 体重 ~ l πl g k g 体重、 好 ま し く は 0 . 5 tz g Z k g 体重〜 5 0 U g Z k g 体重を、 病状 性別お よ び投与経路 に応 じ て、 一 日 数回程度投与 さ れ得る 。 従 つ て、 極めて微量で製剤化す る こ と が要求 さ れ、 有効成分の活 性低下を十分に防止で き る よ う な安定な製剤の提供が望 ま れ る そ こ で、 本発明者 は、 長期保存に耐え得 る 安定な T P O タ ン パ ク 質組成物を得 る べ く 、 種々 の検討を行 っ た。 そ の結果、 T P O タ ンパ ク 質に、 薬学的 に許容 さ れ得 る 糖類を加え凍結乾燥 す る こ と に よ り 安定性が顕著に 向上す る こ と 、 糖類の他に界面 活性剤を加え る と 、 得 ら れた T P 0 含有凍結乾燥組成物の安定 性がよ り 向上す る も に得 ら れた T P 0 凍結乾燥組成物の再 溶解時の溶解性が改善 さ れ る こ と 、 さ ら に ア ミ ノ 酸ゃ タ ンパ ク 質を添加す る と 得 ら れた T P 0 含有凍結乾燥組成物の安定性が よ り 向上す る こ と を見い だ し 、 本発明を完成 さ せた。

発明の要約

本発明は、 T P O タ ン パ ク 質 と 薬学的に許容 さ れ得 る 糖類 と か ら な る T P O 含有凍結乾燥組成物、 好 ま し く は T P O タ ンパ ク 質 と 薬学的に許容 さ れ得 る 糖類の他に、 界面活性剤、 ァ ミ ノ 酸、 タ ンパ ク 質か ら な る 群 よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種の薬学 的に許容さ れ得 る 添加剤を含有す る 安定な T P 0 含有凍結乾燥 組成物を提供す る 図面の簡単な説明

図 1 は、 糖類 （マ ン ニ ト ー ル、 ラ ク ト ー ス、 シ ュ ク ロ ー ス又 はマ ル ト ー ス） の添加に よ る T P O タ ンパ ク 質の安定化作用 を

T P 0 の残存率 （％ ) で示 し た グ で あ る

図 2 は、 糖類の他に さ ら に界面活性剤 （ポ リ ソ ルベ ー ト 20又 は ポ リ ソ ルベー ト 80 ) を添加 し た と き の T P 0 タ ン パ ク 質の安 定化作用を、 T P O の残存率 （％ ) で示 し た グラ フ で あ る 。

図 3 は、 糖類及び界面活性剤の他に さ ら に ア ミ ノ 酸 （ア ルギ ニ ン又は グ リ シ ン） 又は タ ンパ ク 質 （ゼラ チ ン） を添加 し た と き の T P 0 タ ンパ ク 質の安定化作用 を、 T P O の残存率 （％ ) で示 し た グラ フ であ る 。

発明の詳細な説明

本発明に お け る T P 0 と は、 純度が高 く 、 単離 さ れた タ ンパ ク 質であればそ の製法に よ る 由来 は問わ な いが、 配列番号 1 に 記載の ア ミ ノ 酸配列か ら な る タ ンパ ク 質が用 い ら れ る 。 配列番 号 1 に示 さ れた ア ミ ノ 酸配列の う ち 、 T P O活性を保持す る 限 り に お い て そ の一部が改変 （置換、 欠失、 挿入、 お よ び ま た は付加） さ れて い る よ う な ア ミ ノ 酸配列か ら な る タ ンパ ク 質 も 本発明の T P O と し て用 い る こ と がで き る 別の言い方をすれば、 ア ミ ノ 酸配列が実質的に配列番号 1 に 示 さ れた ァ ミ ノ 酸配列で あ る よ う な 夕 ンパ ク 質を も 用 い る こ と がで き る 。 こ こ で言 う 「実質的 に配列番号 1 に示 さ れた ァ ミ ノ 酸配列」 と は、 配列番号 1 に示 さ れた ア ミ ノ 酸配列 に加え て、 Γ Τ Ρ Ο 活性を保持す る 限 り に お い て、 配列番号 1 に示 さ れた ア ミ ノ 酸配列の一部 に 置換、 欠失、 挿入、 お よ び Zま た は付加 な どがあ る ア ミ ノ 酸配列」 を含む こ と を意味す る 。

本出願人 は、 ヒ ト T P 0 の C 末端側 につ いて は配列番号 1 に 示さ れた ア ミ ノ 酸配列の 1 5 2 位ま で欠失 さ せて も 活性を保持 し て い る こ と 、 N末端側につ い て は 6 位ま で欠失 さ せて も 活性 を保持 し て い る こ と を確認 し て い る 。 具体的な デー タ につ いて は表 1 に示 し た

表 1

誘 体 活性の有無

2 3 位 +

2 1 位 +

1 9 位 +

1 一 1 7 1 位 +

1 一 1 6 3 位 +

1 — 1 5 7 位 +

1 一 1 5 6 位 +

1 一 1 5 5 位 +

1 — 1 5 4 位 +

1 一 1 5 3 位 +

1 — 1 5 1 位 +

1 一 1 5 0 位

7 一 1 6 3 位 +

8 一 1 6 3 位

. 3 — 2 3 1 位

従 っ て、 本発明の T P O と し て は、 配列番号 1 に示 さ れた ァ ノ 酸配列 の 7 位か ら 1 5 1 位の ア ミ ノ 酸配列 を含み 、 かつ T P 0活性を有す る 夕 ンパ ク 質 も 含 ま れ る 。 よ り 具体的に は配 列番号 1 に示 さ れた ァ ミ ノ 酸配列の う ち 、 1 位か ら 2 3 1 位、 位 か ら 2 位、 1 位 か ら 1 9 1 位、 1 位か ら 1 7 1 位、

1 位か ら 1 6 3 位、 1 位〜 1 5 7 位、 1 位か ら 1 5 6 位、 1 位 か ら 1 5 5 位、 1 位か ら 1 5 4 位、 1 位か ら 1 5 3 位、 1 位か ら 1 5 1 位お よ び 7 位か ら 1 6 3 位か ら な る タ ンパ ク 質が本発 明の T P O と し て挙げ ら れ る 。

更 に は 、 上記 7 位 か ら 1 5 1 位の 配列 内部 ま た は 外部 に 、 T P 0活性を損な わ な い範囲で、 少な く と も 1 つ の ア ミ ノ 酸の 置換、 欠失、 挿入、 お よ び Zま た は付加を有 し て い る ア ミ ノ 酸 配列か ら な る タ ンパ ク 質 も 本発明の T P 0 に含 ま れる 。

本発明の T P 0 を更 に例示すれば、 少な く と も 、 配列番号 1 の ア ミ ノ 酸配列を有す る ヒ ト T P O の 1 位 の セ リ ン残基がァ ラ ニ ン残基に、 かつ 3 位の ァ ラ ニ ン残基がバ リ ン残基に 置換 さ れ た タ ンパ ク 質、 2 5 位の ア ルギニ ン残基がァ ス パ ラ ギ ン残基に 置換 さ れた タ ンパ ク 質、 3 3 位の ヒ ス チ ジ ン残基が ト レ ォ ニ ン 残基 に 置換 さ れた タ ン パ ク 質、 2 5 位の ア ルギニ ン残基がァ ス パ ラ ギ ン残基に、 かつ 2 3 1 位の ダル 夕 ミ ン酸残基が リ ジ ン残 基に置換 さ れた タ ンパ ク 質、 更に こ れ ら の タ ンパ ク 質の C末端 に T h r S e r l 1 e G l y T y r P r o T y r A s p V a 1 P r o A s p T y r A l a G 1 y V a 1 H i s H i s H i s H i s H i s H i s の ポ リ ペプチ ドが付加 さ れた タ ン ノ、。 ク 質を 挙げ る こ と がで き る

更 に は 、 配列 番号 1 の ア ミ ノ 酸配列 に 対 し 、 少 な く と も

3 3 位の ヒ ス チ ジ ン残基が欠失 し た タ ン パ ク 質、 6 位の グ リ シ ン残基が欠失 し た タ ン パ ク 質、 7 位の ア ルギニ ン残基 が欠失 し た タ ンパ ク 質、 3 3 位の ヒ ス チ ジ ン残基 と 3 4 位の プ 口 リ ン 残基 の 間 に ト レ オ ニ ン 残基が挿入 さ れた タ ン パ ク 質、 3 3 位の ヒ ス チ ジ ン残基 と 3 4 位の プ ロ リ ン残基の間に ァ ラ ニ ン 残基 が挿入 さ れ た タ ン パ ク 質、 3 3 位の ヒ ス チ ジ ン 残基 と 3 4 位の プ ロ リ ン残基の 間に グ リ シ ン残基が挿入 さ れた タ ン パ ク 質、 3 3 位の ヒ ス チ ジ ン残基 と 3 4 位の プ ロ リ ン残基の 間に グ リ シ ン 残基が挿入 さ れ、 かつ 3 8 位の プ ロ リ ン 残基がセ リ ン 残基 に 置換 さ れた タ ン パ ク 質、 6 位の グ リ シ ン残基

7 位の ア ルギニ ン残基の 間に ァ ス パ ラ ギ ン残基が挿入 さ れ た 夕 ンパ ク 質、 6 位の ダ リ シ ン残基 と 7 位の ア ルギニ ン残基の間に ァ ラ ニ ン残基が挿入 さ れた 夕 ンパ ク 質、 6 位 の グ リ シ ン残基 7 位の ア ルギニ ン残基の間に グ リ シ ン残 基が挿入 さ れた タ ンパ ク 質を挙げ る こ と がで き る 。 ま た、 少な く と も 、 1 2 9 位の ロ イ シ ン残基がア ルギニ ン残基に 置換 さ れ た 夕 ンパ ク 質、 1 3 3 位の ヒ ス チ ジ ン残基がア ルギニ ン残基に 置換 さ れた 夕 ンパ ク 質、 1 4 3 位の メ チォ ニ ン残基がア ルギニ ン残基に置換さ れた タ ン パ ク 質、 8 2 位の グ リ シ ン残基が ロ イ シ ン残基に 置換 さ れた 夕 ン パ ク 質、 1 4 6 位の グ リ シ ン残基が ロ イ シ ン残基に置換 さ れた タ ン パ ク 質、 1 4 8 位のセ リ ン残基 がプ ロ リ ン残基に置換 さ れた タ ンパ ク 質、 5 9 位の リ ジ ン残基 がア ルギニ ン残基に置換さ れた タ ン パ ク 質、 1 1 5 位の グル タ ミ ンがア ルギニ ン残基に置換さ れた 夕 ンパ ク 質が挙げ ら れ る 。 ま た、 本発明の T P O と し て は、 配列番号 1 に示 さ れる ア ミ ノ 酸配列を有す る ヒ ト T P O お よ び前述の誘導体の 一 2 位に メ チォ ニ ン残基、 かつ 一 1 位に リ ジ ン残基が付加 さ れた タ ン パ ク 質、 一 1 位に メ チォ ニ ン残基が付加 さ れた タ ンパ ク 質 も 含 ま れ る o

本発明の T P O は、 c D N A、 染色体 D N A、 ま た は化学合 成に よ り 得 ら れ る D N A を含む組換え べ ク タ ー で、 形質転換 さ れた宿主細胞か ら 分離 · 精製 し て得 ら れた も ので あ る こ と が好 ま し い。 宿主 と し て は、 原核細胞 （例え ば細菌、 好 ま し く は大 腸菌） 、 真核生物 （例え ば、 酵母、 昆虫、 哺乳動物） 細胞を用 い る こ と がで き る 。 哺乳動物細胞の例 と し て は、 c o s細胞、 チ ャ イ ニ ー ズハ ム ス タ ー卵巣 （ C H O ) 細胞、 X 63. 6. 5. 3. 細 胞、 C - 127細胞、 B H K ( B a b y H am s t e r K i d n e y ) 細胞、 ヒ ト 由来細胞 （例え ば、 H e L a細胞） 等が挙げ ら れる 。 酵母の例 と し て は、 ' ン酵母 ( S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e； や メ タ ノ ー ノレ資 化性酵母 （ P i c h i a p a s t o r i s ) 等が挙げ ら れ る 。 昆虫細胞の例 と し て は、 蚕培養細胞 （例えば、 S f 21細胞） 等が挙げ ら れ る 。

C H O 細胞を用 い た本発明 T P O の製造例、 お よ び大腸菌を 用 い た本発明 T P O の製造例を後述の参考例 1 、 お よ び 2 に そ れぞれ示 し た。

大腸菌を用 い て T P O タ ンパ ク 質を製造す る 場合に は、 該夕 ンパ ク 質を コ ー ドす る D N A に、 制限酵素に よ る 切断部位の供 与、 お よ び Z ま た は、 発現を容易にす る よ う な D N A を付加 し た も の を、 適切な発現ベ ク タ ー に組み込み、 該ベ ク タ ーで形質 転換 さ れた原核細胞 （例え ば細菌、 好ま し く は大腸菌） を培養 し、 産生 さ れた T P 0 活性を有す る タ ンパ ク 質を分離 · 精製す る こ と に よ っ て得 る がで き る 。 宿主 と し て大腸菌を選択す る 場合に は、 大腸菌 に お け る 発現 に好ま し い コ ド ン （優先 コ ド ン） を組み込んで も 良い。

大腸菌を形質転換す る た め に用 い ら れ る ベ ク タ ー に は、 PKC30 ( S h i m a t a k e H. and M. Ro s enbe r g, a t u r e, 292, 128 - 132, 1981) 、 pT r c 99 A ( Ama n n E. ら 、 G e n e、 108 、 pl93 - 200、 1991) PCFM 536 ( ATCC No. 39934、 特表昭 6 0 — 5 0 1 9 8 8 号参 照） 等が挙げ ら れ る 。

例え ば、 配列番号 1 に示 さ れた ア ミ ノ 酸配列 1 〜 3 3 2 位か ら な る T P O タ ンパ ク 質を製造す る 場合、 1 〜 3 3 2 位の ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る D N A を合成 し 、 そ の N末端に メ チォ二 ン残基 と リ ジ ン残基を コ ー ドす る D N A配列、 更に そ の上流に Xba I 部位 と な る よ う な D N A 配列 を 付加 し 、 ま た C 末端 に s t opコ ド ン を コ ー ドす る D N A 配列、 更に そ の下流に Hi i DI部 位 と な る よ う な D N A 配列 を付加す る 。

こ の D N A 断片を、 Xba I Z Hi ndUI で処理す る こ と に よ り 、 例 え ば配列 番号 2 に 示す よ う な D N A 断片 を 得 る こ と がで き る。 こ の D N A を、 Xba I 、 Hi ndDI で消化 し た p C F M 5 3 6 ( ATCC No. 39934、 特表昭 6 0 — 5 0 1 9 8 8 号参照） に ク ロ 一二 ン グ し 、 p M W l ( ATCC No. 39933 ) で予め形質転換 さ れ た E . c o 1 i J M 1 0 9 を使用 し 、 発現ベ ク タ ー を有す る 丄

大腸菌株を Τ Ρ 0 タ ンパ ク 質発現用 の形質転換体 と す る 。

発現プラ ス ミ ド p C F M 5 3 6 の発現制御 は ス P L プ ロ モ ー 夕 一 に よ る が、 こ れ 自 体が、 c 1 8 5 7 リ ブ レ ッ サ ー遺伝子の 制御下に あ る 。 上記の よ う な方法で得 ら れた形質転換株を培養 し、 発現 さ れた T P O タ ンパ ク 質を分離精製す る 。

精製の段階で、 カ テ ブ シ ン処理等を行 う こ と に よ っ て、 N末 端に付加 さ れた メ チォ ニ ン — リ ジ ン残基が切断さ れ、 ア ミ ノ 酸 1 〜 3 3 2 位か ら な る T P O タ ンパ ク 質を得 る こ と がで き る 。 な お、 ア ミ ノ 酸配列 1 〜 3 3 2 位を コ ー ドす る D N A (配列 番号 3 参照） を有す る プラ ス ミ ド p H T F l は大腸菌 D H 5 に 担持さ れ、 1 9 9 4 年 3 月 2 4 日 付で 日 本国茨城県つ く ば市東 一丁 目 1 番 3 号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術 研究所に受託番号 F E R M B P — 4 6 1 7 と し て ブ タ ペ ス ト 条約下で国際寄託 さ れ、 こ れは ま た、 中国寄託機関 C C T C C ( Lou J i a Shan, Wuhan 430072, Ch i na ) に受託番号 C C T C C - M 9 5 0 0 4 で寄託 さ れて い る 。

本発明の安定な T Ρ 0 含有凍結乾燥組成物を得 る た め に使用 し 得 る 添加剤 と し て は、 糖類、 界面活性剤、 ア ミ ノ 酸、 タ ン パ ク 質な どが挙げ ら れ る 。 こ れ ら の添加剤 は、 Τ Ρ Ο 組成物の安 定性 を 向上す る も の で あ れ ば、 そ の 種類 を 問 わ な い が、 例 え ば 下記 の も の が挙 げ ら れ る 。

糖類 と し て は 、 マ ン ニ ト ー ル、 ラ ク ト ー ス 、 シ ュ ク ロ ー ス 、 マ ノレ ト 一 ス 、 グ ル コ ー ス 、 イ ノ シ ト ー ル、 キ シ ロ ー ス 、 ソ ル ビ ト ー ル、 フ ル ク ト ー ス 、 ガ ラ ク ト ー ス 、 リ ボ ー ス 、 マ ン ノ ー ス セ ロ ビオ ー ス 、 シ ク ロ デ キ ス ト リ ン な ど が利用 で き る 。

界面活性剤 と し て は、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン硬化 ヒ マ シ油、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ヒ マ シ 油、 ポ リ ソ ノレ べ一 ト 8 0 や モ ノ ラ ウ リ ン 酸 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ル ビ タ ン （ 別 名 ： ポ リ ソ ル ベ ー ト 2 0 ) な ど の ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ル ビ タ ン脂肪酸エ ス テ ル、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ポ リ オ キ シ プ ロ ピ レ ン グ リ コ ー ル、 モ ノ ォ レ イ ン 酸 ソ ノレ ビ タ ン な ど の ソ ル ビ タ ン 脂肪酸エ ス テ ル 、 シ ョ 糖 モ ノ ラ ウ リ ン 酸 エ ス テ ル な ど の シ ョ 糖脂肪酸エ ス テ ル、 塩化べ ン ゼ ト ニ ゥ ム 、 塩化ベ ン ザ ル コ ニ ゥ ム な ど の芳香族四級ア ン モ ニ ゥ ム 塩、 カ プ リ ル酸 ナ ト リ ゥ ム 、 亜硫酸 ナ ト リ ゥ ム な ど が利 用 で き る 。

ア ミ ノ 酸 と し て は 、 グ リ シ ン 、 ァ ラ ニ ン 、 メ チ ォ ニ ン 、 シ ス テ ィ ン 、 ァ ス パ ラ ギ ン 、 ァ ス ノ、° ラ ギ ン 酸 お よ び そ の 塩、 グ ル タ ミ ン 、 グ ル タ ミ ン酸お よ び そ の 塩、 シ ス テ ィ ン 、 ヒ ス チ ジ ン 、 _{Λ t}

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リ ジ ン 、 ア ルギニ ン な どが利用 で き る 。

タ ン パ ク 質 と し て は 、 ゼ ラ チ ン 、 ヒ ト 血清ア ル ブ ミ ン 、 カ ゼ イ ン 、 コ ラ ー ゲ ン、 ヒ ト 血清 グ ロ ブ リ ン な どが利用 で き る 。

本発明 に お い て用 い ら れ る こ れ ら の添加剤 は、 T P O 含有凍 結乾燥組成物中 に含有 さ れ る T P 0 を 1 重量部 と し た場合 に、 該添加剤が糖類の場合に は 1 0 〜 1 0 0 0 0 重量部、 界面活性 剤の場合に は 0 . 0 1 〜 1 0 重量部、 ア ミ ノ 酸の場合に は 1 〜 1 0 0 0 重量部、 タ ンパ ク 質の場合に は 1 〜 1 0 0 0 重量部の 範囲で使用 さ れ う る。

さ ら に本発明の T P 0 含有凍結乾燥組成物は、 そ の製剤化の 目的に応 じ て希釈剤、 可溶化剤、 防腐剤、 酸化防止剤、 賦形剤 お よ び等張化剤な どを含有す る こ と がで き る 。

本発明に お け る 凍結乾燥技術は常法に従い行 う こ と がで き る 例 え ば、 水溶液状態の 本発明 T P 0 組成物をバ イ ア ル瓶 に 1 m 1 ずつ充填 し 、 こ れを あ ら か じ め 一 4 0 °C に冷却 し てお い た 凍結乾燥機の乾燥庫内へ入れ凍結を行 う 。 バイ ア ル瓶内容物が 充分に凍結 し た こ と を確認 し た後 （通常 2 〜 3 時間） 、 真空ポ ン プを作動 さ せバイ ア ル瓶内 の凍結体か ら 水分を昇華除去 さ せ る 。 こ の際乾燥庫内の温度を 一 1 0 °C と し 、 低温で乾燥を行 う < _c

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本乾燥操作を充分に行 っ た後 （通常半 日 〜 2 曰 ） さ ら に乾燥庫 内 を室温 と し 仕上げの乾燥 （通常数時間〜 1 曰 ） を行 い 目 的の T P O 凍結乾燥組成物を 得 る 。

以下に、 実施例、 実験例、 参考例 に よ っ て本発明を具体的 に 説明す る 。

実 施 例

< 実施例 1 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン 酸緩衝液 l m 1 あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 ^ g . マ ン ニ ト ー ル 3 0 m g を含有す る よ う に水溶液を調製 し 、 l m 1 ずつバイ ア ル に 充填 し た後凍結乾燥を行い、 密封 し 凍結乾燥組成物を得た。 < 実施例 2 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン 酸緩衝液 l m 1 あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 / g 、 ラ ク ト ー ス 3 0 m g を含有す る よ う に水溶液を調製 し 、 l m 1 ずつ バイ ア ル に充 填 し た後凍結乾燥を行い、 密封 し 凍結乾燥組成物を得た。

< 実施例 3 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン酸緩衝液 l m 1 あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 ^ g . シ ュ ク ロ ー ス 3 0 m g を含有す る よ う に水溶液を調製 し 、 l m 1 ずつバイ ア ル に 充填 し た後凍結乾燥を行い 、 密封 し 凍結乾燥組成物を得た。

< 実施例 4 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン酸緩衝液 l m l あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 β g , マ ル ト 一 ス 3 0 m g を含有す る よ う に水溶液を調製 し 、 l m 1 ずつバイ ア ル に充 填 し た後凍結乾燥を行い、 密封 し 凍結乾燥組成物を得た。

< 実施例 5 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン酸緩衝液 l m 1 あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 /z g 、 マ ル ト ー ス 3 0 m g 、 ポ リ ソ ルベ ー ト 2 0 4 0 ju g を含有す る よ う に水溶液を 調製 し 、 l m l ずつバ イ ア ル に充填 し た後凍結乾燥を行い、 密 封 し 凍結乾燥組成物を得た。

< 実施例 6 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン 酸緩衝液 l m 1 あ た .り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 〃 g 、 マ ル ト 一 ス 3 0 m g 、 ポ リ ソ ル ベ ー ト 8 0 4 0 〃 g を含有す る よ う に水溶液を 調製 し 、 1 m 1 ずつバ イ ア ル に充填 し た後凍結乾燥を行い、 密 封 し 凍結乾燥組成物を得た < 実施例 7 >

p H 6 . 0 の 5 m M リ ン酸緩衝液 l m 1 あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 ju g 、 マ ル ト ー ス 2 9 m g 、 ポ リ ソ ルベ ー ト 8 0 4 0 g 、 ア ル ギ ニ ン l m g を含有 す る よ う に水溶液を調製 し 、 1 m l ずつバイ ア ル に充填 し た後 凍結乾燥を行い、 密封 し 凍結乾燥組成物を得た。

< 実施例 8 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン酸緩衝液 l m 1 あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 ju g 、 マ ル ト 一 ス 2 9 m g 、 ポ リ ソ ルベ ー ト 8 0 4 0 β g ^ グ リ シ ン l m g を含有す る よ う に水溶液を調製 し 、 1 m 1 ずつ バイ ア ルに充填 し た後凍 結乾燥を行い、 密封 し 凍結乾燥組成物を得た。

< 実施例 9 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン酸緩衝液 l m 1 あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 g 、 マ ル ト ー ス 2 9 m g 、 ポ リ ソ ルべ 一 ト 8 0 4 0 〃 g 、 ゼラ チ ン l m g を含有す る よ う に水溶液を調製 し 、 l m 1 ずつ バイ ア ル に充填 し た後凍 結乾燥を行い、 密封 し 凍結乾燥組成物を得た く 比較例 1 >

p H 6 . 0 の 5 m M リ ン酸緩衝液 ： L m 1 あ た り に参考例 1 に 記載の方法で得 ら れ る T P O 2 5 0 /z g を含有す る よ う に水 溶液を調製 し 、 1 m l ずつ バイ ア ル に充填 し た後密封 し、 水溶 液組成物を得た。

以上、 実施例 1 〜 9 で調製 し た T P O含有組成物各々 に お け る 添加剤 と そ の含量を表 2 に ま と め た。

表 2

実施例番号 糖 類 界面活性剤 アミノ酸 タンパク質

1 3 %マンニト一ル - - -

2 3 %ラク トース 一 -

3 3 %シュクロース

4 3 %マルトース

5 3 %マルト一ス 0. 0 0 4 %ボリソルべ一ト 2 0

6 3 %マルト一ス 0. 0 0 4 %ポリソルベー ト 8 0

7 2. 9 %マルト一ス 0. 0 0 4 %ポリソルべ一 ト 8 0 0. 1 %アルギニン

8 2. 9 %マルト一ス 0. 0 0 4 %ポリソルベート 8 0 0. 1 %グリシン

9 2. 9 %マルトース 0. 0 0 4 %ポリソルべ一ト 80 0. 1 %ゼラチン

―

以下に実験例を示す な お、 以下の実験例 に お け る T P 0 の逆相液体 ク ロ マ ト グ フ 法お よ び生物学的活性測定法 は以下の と お り で あ る 逆相液体 ク ロ マ ト グ ラ フ 法

C 8 逆相 カ ラ ム （ 4 . 6 m m x 2 5 0 m m ) を用 い、 n — プ ロバ ノ ー ル、 ト リ フ ルォ ロ 酢酸を移動相 に使用 し 、 T P O と し て 1 β g 以上を注入 し 、 以下の グ ジ ェ ン ト 条件で残存力価の 測定をす る （表 3 参照） 表 3 時間 溶媒 （ A ) 溶媒 （ B ) グ ラ ジ ン ト 条件

0 分 0 0 % 0 %

直線的 グラ ジ ュ ン ト 3 0 分 0 % 0 0 %

3 5 分 0 % 0 0 %

直線的 グ ラ ジ ュ ン ト

4 0 分 0 0 % 0 % 溶媒 （A) 20 % π -プ ロ パ ノ 一 ノレ 、 0. 1 % ト リ フ ノレ オ 口 酢酸 溶媒 (B) 60 % II -プ ロ ノ、。 ノ ー ノレ 、 0. 1 % ト リ フ ル ォ ロ 酢酸 測定波長 2 8 0 n m 所定時間経過後の残存量

残存率 （％ ) = X 1 0 0

初期値 生物学的活性測定法

( a ) 3 2 D - h u - m p 1 + 細胞を用 い た ア ツ セ ィ 系 （ 3 2 D - m p 1 ア ツ セ ィ ）

「ア ツ セ ィ 法」

( 1 ) ア ツ セ ィ に用 い る マ ウ ス 3 2 D - h u - m 1 ⁺ 細胞の 樹立

完全長の ヒ ト M p 1 レ セ プ タ ー の遺伝子 （ Vi gDn, し 等 PNAS 89巻 、 5640 - 56 頁、 ( 1992 ) ) ^ Mo l one y Mu r i n e Sa r c oma Vi rus の L T R 由来の転写 ( t r ansc r i t i ona l ) プ ロ モ ー タ 一 を含む発現べ ク タ ー に サ ブ ク ロ ー ニ ン グす る 。

.こ の組換 =L f? 6 / g と am p h o t o r o p h i c r e t r o v i a 1 a c k a i n cons t ruc t ( Landau, N. R. , L i t tman, D. R. , J . V i o 1 o g y 66卷 5110- 5113 頁 、 ( 1992 ) ) 6 〃 g を 、 C a P 0 ₄ m a no a I t a n t r a n s f e c t i o n K i t ( S t ra t e gene社製） を用 いて 3 x 1 0 ⁶ 個の 2 9 3 細胞 に形質転換す る 。 2 日 後 と 4 日 後に再度形質転換す る 。 最後の形質転換を行 っ た翌 日 、 そ の 2 9 3 細胞を、 - 3依 存性の マ ウ ス細胞株 （ 3 2 D 、 ク ロ ー ン ; G【 eenbe r ge r 等、 PNAS 80 巻、 293卜 2936 頁、 （ 1983 ) ) と 共に培養す る 。 2 4 時 間 の 培 養 後、 そ の 3 2 D 細胞 を 取 り 出 し 、 B S A g r a d i e n t ( Pa t h-o-c y t e ; Mi l l s I n c. ) に よ る 密度勾配で細胞を分離す る。 細胞を l ng/ nilの マ ウ ス IL- 3存在下で増や し た後、 20%の A P K 9 ( Vi gnon等、 PNAS 89 巻、 5640-5644 頁、 （1992)、

( L a nd a u, N. R. , L i t tma n, D. R. , J. V i o 1 o g y 66卷、 5110- 5113頁、 （1992) ) を用 い て選抜を行 う 。 ヒ ト M p 1 レ セ プ タ ー ペ プ チ ド に 対す る ゥ サ ギ抗血清 を 用 い た FACSに よ り 、 M p 1 レ セ プ タ ー を 細胞表面 に 発現 し て い る 細胞 （ 3 2 D - h u - m p l ⁺ 細胞） を分離す る 。

( 2 ) 3 2 D - h u - m p 1 + 細胞に よ る ア ツ セ ィ

マ ウ ス IL-3存在下に継代培養 し て い る 32 D - h u - m p 1 + 細胞を回収 し、 マ ウ ス - 3を除 く ため十分に洗浄 し た後、 増殖 培地 （ 10% FCS を含む MEM 培地） に再浮遊 さ せ る 。

一方、 標準品、 お よ び被験検体を増殖培地で希釈 し 、 希釈液 を プ レ ー ト に 1 0 0 〃 1 / ゥ ヱ ルずつ加え る 。 さ ら に、 前述の と お り 調製 さ れた 3 2 D - h u - m p 1 + 細胞浮遊液を細胞数 が 1 X 1 0 ⁵ 細胞 m lと な る よ う に増殖培地で希釈 し 、 上記プ レ ー ト の ゥ ヱ ル に Ι Ο Ο μ Ι ずつ加え る 。 こ の プ レ ー ト を 3 7 1 0 % C 0 2 、 高湿度の イ ン キ ュ ベ ー タ ー で 4 8 時間培養 す る 。 その後、 MTS 溶液を ゥ エ ルあ た り 2 0 〃 1 ずつ加え、 プ _{n n}

2 3

レ ー ト を 3 7 で、 1 0 % C O ₂ 、 高湿度の イ ン キ ュ ベ ー タ ー で 4 時間培養す る 。 培養終了後、 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダー を用 いて 4 9 0 n m に お け る 吸光度を測定す る 。

( b ) ヒ ト 巨核芽球性細胞株を用 い た ア ツ セ ィ 系 （ M — 0 7 e ア ツ セ ィ ）

ヒ ト 巨核芽球性細胞株で あ る M- e 細胞 は、 GM- CSF、 - 3、

SCF、 IL-2な ど に応答 し て増殖す る 細胞株であ る こ と が知 ら れ てい る が （ Avan z iら 、 J. Ce l l. Phy s i o l. 、 145 巻、 458-464 頁、 （ 1990) 、 Ki ssら 、 Leukemi a、 7 卷、 ） 、 T P O に も 応答 す る こ と が判明 し た。

「ア ツ セ ィ 法」

GM-CSF存在下に継代培養 し て い る M — 0 7 e 細胞を回収 し 、 十分に洗浄後、 10XFCSを含む 1MDM培養液に再浮遊 さ せ る 。 組織 培養用 ゥ ェル平底プ レ ー 卜 へ 1 ゥ エ ル当 た り の細胞数が 10⁴ 個に な る よ う に M- 07e 細胞を入れ、 さ ら に標準品、 お よ び被検 検体を加えて、 最終液量を 2QQ ju l /ゥ エ ルにす る 。 プ レ ー ト を 55ί炭酸ガ ス培養器に入れ、 37°Cで、 3 日 間培養す る 。 3 日 目 の 培養終了 4 時間前に 1 C i (37 KBq) / ゥ エ ル の ³H - t hymi d i ne を添加 し 、 培養終了後、 セ ルハ ー べス タ ー で細胞を ガ ラ ス繊維 フ ィ ル タ ー上に集め、 ³H の放射活性を液体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー （例え ば、 ベ ー タ プ レ ー ト ； Pha rma c i a 社製） に て 測定す る

< 実験例 >

実施例 1 か ら 9 、 お よ び比較例 1 で調製 し た T P O 含有組成 物を 5 0 でで 1 力 月 間保存 し た の際の残存力価を逆相液体 ク ロ マ ト グ ラ フ 法お よ び生物学的活性測定法 （ a ) 3 2 D - m p i ア ツ セ ィ に よ り 、 ま た、 保存後の再溶解性を 目視に て観察 し た。 結果の一覧を表 4 に示す

表 4

表か ら 明 ら かな よ う に T P 0 に糖類を添加 し て凍結乾燥処理 を行 う こ と に よ り 、 安定性が顕著に 向上す る こ と が判明 し た。 ま た、 T P O と 糖類の他に更に、 界面活性剤、 ア ミ ノ 酸、 タ ン パ ク 質か ら な る 群よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種類の薬学的 に許 容さ れ る 添加剤を添加 し て凍結乾燥処理を行 う こ と に よ り 、 更 な る 安定性の 向上が認め ら れた。 ま た、 界面活性剤の添加 さ れ た実施例 5 〜 9 で調製 さ れた T P 0 含有凍結乾燥組成物で は、 再溶解時の溶解性が よ り 向上 し て い る こ と が判明 し た。

図 1 に糖類の安定化効果を、 図 2 に界面活性剤の安定化効果 を、 図 3 に ア ミ ノ 酸お よ び タ ンパ ク 質の安定化効果を示す。 い ずれの場合に おい て も 未添加の液剤 に比べて安定性が向上す る こ と が判明 し た。

な お、 生物学的活性測定法 （ b ) M — 0 7 e ア ツ セ ィ に お い て も 、 （ a ) 3 2 D - m p l ア ツ セ ィ に お け る 測定結果 と 同様 の結果が得 ら れた。

以下、 参考例 と し て本発明の有効成分であ る T P O の製造例 を示す。

< 参考例 1 > Τ Ρ Ο ( 1 - 332 ) / CH0 の製造例

( 1 ) C H O 細胞 （ dh i r— 株、 U r 1 a u bと Ch a s i n； P r o c. Na t l. Ac a d. S c i. USA ; 7 7 巻 4 2 1 6 頁、 1 9 8 0 年） を 6 cni径の プ レ ー ト （ Fa l c on社製） 中 1 0 %牛胎児血清を含む α 最小必須 培地 （ α - MEM ( — ） 、 チ ミ ジ ン 、 ヒ ポ キサ ン チ ン添加） で培養 増殖 さ せ、 こ れを リ ン酸カ ノレ シ ゥ ム法 （ Ce l l phe c t 、 フ ア ルマ シ ァ社製） に よ っ て、 プラ ス ミ ド P D E F 2 0 2 - h T P 0 - P I で形質転換 し た。

す な わ ち 、 配 列 番 号 4 の c D N A イ ン サ ー ト 部 分 を 含 む P D E F 2 0 2 - h T P 0 - P I プ ラ ス ミ ド 1 0 〃 g に ノく ッ フ ァ ー A 1 2 0 μ 1 お よ び H₂ 0 1 2 0 β \ を加え混合 し た の ち 室 温 で 1 0 分 間放 置 し た 。 つ ぎ に 、 こ の 溶液 に バ ッ フ ァ ー Β 1 2 0 u \ を加え、 再度混合 し たの ち 、 室温で 3 0 分間放置 し た。 こ の DNA 溶液を前述の プ レ ー ト に滴下 し たの ち 、 C0₂ イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中で 6 時間培養 し た。 プ レ ー ト か ら 培地を除去 し a -MEM ( 一 ） に て 2 回洗浄後、 1 0 % ジ メ チルス ルホ キ シ ド含 有 α -ΜΕΜ ( — ） を添加 し 、 室温で 2 分間処理 し た。 次 い で、 1 0 %透析牛胎児血清含有非選択培地 （ α - MEM ( ― ) 、 ヒ ポ キ サ ン チ ン 、 チ ミ ジ ン 添加） を 添加 し て 2 日 間培養 し た の ち 、 1 0 %透析牛胎児血清含有選択培地 （ α -ΜΕΜ ( - ） 、 ヒ ポ キサ ン チ ン、 チ ミ ジ ン無添加） での選択を お こ な っ た。 選択 は細胞 を ト リ プ シ ン処理 し た後、 6 cra径プ レ ー ト 1 枚あ た り を、 1 0 era径プ レ ー ト 5 枚あ る い は 2 4 ゥ エ ル プ レ ー ト 2 0 枚に分割 し たの ち 、 2 曰 に選択培地に て培地交換を行い な が ら培養を 続行す る こ と に よ り 実施 し た。 細胞が増殖 し て き た プ レ ー ト ぁ る い は ゥ エ ル につ い て は そ の培養上清中の ヒ ト T P 0 活性を測 定 し た。 培養上清中 に ヒ ト T P 0 活性の認め ら れた も の につ い て は新 し い ブ レ ー ト あ る い は ウ エノレに 2 5 nMの メ ソ 卜 レ キ セ一 ト を含む選択培地で 1 ： 1 5 に細胞を分割 し 、 培養を続行す る こ と に よ り メ ソ ト レ キセ一 卜 に耐性の細胞を増殖さ せて ク ロ ー ニ ン グを行 っ た。

な お 、 C H 0 細胞 の形質転換 は C H 0 細胞 に 対 し pHTP- 1と pMGlを 同時形質転換 （ C o- t r a n s i e c t i o n ) す る こ と に よ つ て も 行 う こ と がで き る。

プ ラ ス ミ ド P D E F 2 0 2 — h T P O — P 1 に よ っ て形質転 換さ れた C H O 細胞株 （ CH0-DUKXB 11 ) は 1 9 9 5 年 1 月 3 1 日 付で 日 本国茨城県つ く ば市東一丁 目 1 番 3 号所在の通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F E R M B P — 4 9 8 8 と し て ブ タ ペ ス ト 条約下で国際寄託 さ れ、 こ れは ま た、 中国寄託機関 C C T C C ( L u 0 J i a Sh a n, Wu h a n 430072 Ch i n a ) に受託番号 C C T C C 一 C 9 5 0 0 4 で寄託 さ れて い る o

( 2 ) ヒ ト T P O 産生 C H O 細胞株の培養お よ び ヒ ト T P O の 精製

MTX 耐性化を繰 り 返 し て得 ら れた ヒ ト T P O 産生 C H O 細胞 株 （ CH028/1/1/3-C6株、 4 0 0 nM MTX耐性） は以下の よ う に し て実施 し た。 細胞を 4 0 0 nM MTXお よ び 10% FCS を含む DMEMZ F-12培地 （ GI BC0 社） を用 い て培養増殖さ せ た。 こ の細胞を ト リ ブ シ ン 溶液 を 用 い て剥離 し た の ち 、 200inl の 同培地を 含む Fa l con社性 ロ ー ラ ー ボ ト ル （ Fa l con300 ) に l x l O ⁷ 個の細 胞を接種 し 37 で l rpm の 回転速度で 3 日 間培養 し た。 3 曰 後 培養 液 を 吸 引 除去 し 、 50ra lの PBS で細胞 を リ ン ス し た の ち 、 400 nM MTX お よ び 10% FCS を含 ま ず、 2 〃 g/mlイ ン シ ュ リ ン 、 10 M 硫酸銅を含む DMEM/F-12 培地 （ GIBC0 社） を 3QDnil 加え 37でで lrpmの回転速度で 4 日 間培養 し 、 4 日 後そ の培養上清を 回収 し た （ハ ー べス ト 1 ) 。 更 に上記生産培地を 300iD l 加え、 同様 に 37 で l rpniの 回転速度で 4 日 間培養 し 、 4 日 後そ の培養 上清を回収 し た （ハ ー べ ス ト 2 ) 。

双方を あ わせて得 ら れた C H O細胞無血清培養上清約 Π0 L を 0. 5 /z m フ ィ ル タ ー （ 日 本ポ ー ル社製、 FILTER CARTRIDGE) で濾過 し 、 こ れを限外濾過 （ FILTR0N 社製、 CENTRASETTETM OMEGA 30k cu t ) で濃縮かつ 溶媒を lOmMリ ン酸カ リ ウ ム緩衝液 ( PH6. 8 ) に 置換 し 、 容量を約 5 し と し た。 こ れに蛋白質分解 酵素阻害剤であ る E-64 (ペ プチ ド研） を最終濃度 と な る よ う に加え、 予め mMリ ン酸カ リ ウ ム緩衝液 （ pHfi. 8 ) で平衡 化 し て お い た S P S e p h a r 0 s e F F カ ラ ム （フ ア ルマ シ ア社製、 直 径 11 cm, べ ッ ド高 10 cm) に流速 10 Q πι 1 /m i m で添加 し た。 そ の後 平衡化緩衝液で洗浄 し た後、 0. 3M塩化ナ ト リ ウ ム を含む mMリ ン酸カ リ ウ ム緩衝液 （ pH 6. 8 ) 1700mlで溶出 し た。 こ の溶出液 に 363gの硫酸ア ン モ ニ ゥ ム を加え、 nQQdxg で 20分遠心後、 上 清を 1. 2 M硫酸ア ン モ ニ ゥ ム を含む ΙϋιηΜリ ン酸カ リ ゥ ム緩衝液 ( Η6. 8 ) で平衡化 し てお い た Mac roPr ep Met hy l H I C カ ラ ム ( B i o - R a d 社製、 直径 6 c m, ベ ッ ド高 30 c m ) に流速 100 m 1 /m i m で 添加 し た。 添加終了後、 平衡化緩衝液で洗浄 し た後、 0. 5 M 硫酸ア ン モニ ゥ ム を含む Ι ΟΙΒΜリ ン酸カ リ ウ ム緩衝液 （ pH6. 8 ) 700 ml で溶出 し た。 こ の溶出液に プ ロ パ ノ ー ルを 80ml加え た後 S0URCE15RPC カ ラ ム （ フ ア ル マ シ ア社製、 直径 3. 5cm, べ ッ ド 高 lQcm) に流速 16ml /miniで添加 し た。 添加終了後、 10% プ ロ パ ノ ー ルを含む ldfflMト リ ス緩衝液 （ pH7. 5 ) (展開溶媒 A ) で洗 浄後、 展開溶媒 A か ら 80% プ ロ パ ノ ー ルを含む 10πΜト リ ス緩衝 液 （ Ρ Η 7. 5 ) (展開溶媒 Β ) で プ ロ パ ノ ー ル濃度が 70 % に な る ま で 60分間の直線 グ ラ ジェ ン 卜 で溶出 し た。 直線 グ .ラ ジェ ン ト を始め てか ら 25分付近の画分 192ra l を回収 し 、 こ れを 2 问に わ けて P B S で平衡化 し て お い た S u p e r d e x 200 P g カ ラ ム （ フ ア ルマ シ ァ社製、 直径 l O cm, べ ッ ド高 56 cm) に供 し 、 流速 40ni l/m i mで 溶出 し た。 溶出液を SDS- PAGEで分析 し た と こ ろ 、 T P 0 と 思わ れ る 分子量約 650 D ()_ 1 G D00 Gの分子は、 保持時間 42-52 分付近に 得 る こ と がで き 、 単一なバ ン ドであ る こ と が確認で き た。 さ ら に ゥ ヱ ス タ ー ン分析 に よ り 、 こ の タ ン パ ク 質が T P O であ る こ と を確認 し た。 こ の サ ン プ ル の一部を取 り 、 N末端ア ミ ノ 酸分 析お よ びア ミ ノ 酸組成分析を行 っ た結果、 非常に高度 に精製さ れ、 配列番号 1 の ア ミ ノ 酸配列 1 位〜 3 3 2 位を有す る T P O が約 230 m g 得 ら れた こ と がわか っ た。

く 参考例 2 >大腸菌に お け る T P O ( 1- 163 ) / E. c 01 i の製 造例

( 1 ) h M K T ( 1- 163 ) の大腸菌発現用 プ ラ ス ミ ド pAMG l l - h M K T ( 1-163 ) の構築、 大腸菌に お け る 発現

配列番号 1 の 1 位〜 1 6 3 位 ま での ア ミ ノ 酸配列を有す る タ ンパ ク 質 （以下、 T P O ( 1-163 ) Z E. c o l iと い う 。 ） を大腸 菌で発現 さ せ る た め に、 そ の 了 ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る D N A を大腸菌に お け る 優先 コ ド ン を用 い て化学合成 し た。 更に、 そ の N 末端 に メ チ ォ ニ ン 残基 と リ ジ ン 残基 を 、 ま た C 末端側 に s t opコ ド ン を コ ー ドす る D N A 配列を付加 し た。 こ の D N A配 列に よ り コ ー ド さ れ る タ ン パ ク 質、 即 ち 配列番号 1 の 1 位か ら 1 6 3 位の ア ミ ノ 酸配列の N 末端に M e t - L y s が付加 さ れ てい る タ ンパ ク 質 （以下、 「 h M K T ( 1-163 ) J と い う ） の ア ミ ノ 酸配列につ い て は配列番号 5 に示 し た。

合成 さ れた h M K T ( 1-163 ) 遣伝子 フ ラ グ メ ン ト は、 そ の

5 ' 末端、 3 ' 末端に そ れぞれ Xba I 、 Hi ndDI制限酵素部位を 有 し てお り 、 リ ボ ソ ー ム結合部位、 A T G 開始 コ ド ン 、 h M K T ( 1-163 ) の ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る 配列、 お よ び s t 0 pコ ド ン を含んでい る。

上記フ ラ グ メ ン ト は ラ ク ト ー ス誘導性発現ベ ク タ ー、 pAMGll の ] (ba I 、 H dm部位に ク ロ ー ニ ン グ さ れた。 卩 AMG11ベ ク タ ー は、 pRlQQ 由来の複製起源を も つ低コ ピ ー数の プラ ス ミ ドで あ る。 発現ベ ク タ ー、 pAMGl l は プ ラ ス ミ ド pCFM1656 ( ATCC No.

69576 、 1 9 9 4 年 2 月 2 4 日 付で寄託 さ れて い る 。 ） か ら P C R を利用 し た変異導入法に よ り 一連の部位特異的塩基の変異 を起 こ す こ と に よ っ て得 る こ と がで き る 。 こ の プラ ス ミ ドの複 製プ ロ モ ー タ ー、 P c o p B のす ぐ 5 ' 側 に あ る Bg l I I 部位

(プラ ス ミ ド bp #18G ) か ら 始 ま っ て、 プラ ス ミ ド複製遺伝子 が続いて い る が、 塩基対の変異は以下、 表 5 に示す と お り であ る o

表 5 pAMGU bp I bp i n pCFM1656 bp changed t o i n pAMGl l

204 T/A C/G

428 A/T G/C

509 G/C A/T

617 2対の G/C を挿入

679 G/C T/A

980 T/A C/G

994 G/C A/T

# 1004 A/T C/G

# C/G T/A

# 1028 A/T T/A

# 1047 C/G T/A

# 1178 G/C T/A

# 1466 G/C T/A

# 2028 G/C 欠失

# 2187 C/G T/A

% 2480 A/T T/A

I 2499-2502 AGTG GTCA

TCAC CAGT

f 2642 TCCGAGC 欠失

AGGCTCG

# 3435 G/C A/T

# 3446 G/C A/T

# 3643 A/T T/A

以下の塩基対を挿入

GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG

CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC 更に、 特異的な Aa t 1 1 部位 と （； 1 3 I 部位 と の間の D N A配 列を以下の ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドで置換 し た。

Aa t I I ( #4358 )

5'

3'

GATTAATATTCTCAATTGTGAG CGCTCACAATTTAT 3'

C T A A T T A T A A G A G T T A A C A C T C G C G A G T G T T A A A T A G C 5'

C 1 a I (# 4438 )

p A M G l l に導入 さ れた h M K T ( 1-163 ) 遣伝子の発現 は以下に示 し た配列を有す る P s 4 プ ロ モ ー タ 一 の よ う な 合成 ラ ク ト ー ス誘導性プ ロ モ ー タ ー に よ っ て誘導 さ れ る 。

5' GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-

-ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3'

P s 4 プ ロ モ ー タ ー に よ る 、 h M K T ( 1-1-63) 遺伝子の発 現は、 大腸菌 l a c I 遺伝子産物であ る ラ ク ト ー ス リ プ レ ッ サ ー ( Lac I ) 、 に よ り 抑制 さ れ る。 続 い て 、 pAMGl i- h M K T ( 1-163 ) プ ラ ス ミ ド に よ っ て aq I ^q 対立遺伝子を含む大腸菌 K- 12株を形質転換 し た a q

I ^q 対立遺伝子は La c I 遺伝子の発現を増加 さ せ る l a c I プ ロ モ ー タ ーの 内部に お け る 変異で あ り 、 そ の結果、 P s 4 プ ロ モ 一 夕 に よ る タ ンパ ク 質の発現 に関 し 、 よ り 厳密な コ ン ト ロ ー ル を う け る こ と に な る 。 従 っ て、 こ の株に お い て は、 ラ ク ト ー ス の非存在下で は、 h M K T ( 1-163 ) の発現は La c I に よ り 抑 制さ れ る ク ト ー ス の添加に よ り P s 4 プ ロ モ ー タ ーの オ ペ レ ー タ ー部位への La c I タ ンパ ク 質の結合が減少 し 、 P s 4 プ 口 モ ー タ ー に よ る h M K T ( 1-163 ) 遺伝子の転写が開始 さ れ る の実施例で宿主細胞 と し て用 い ら れた大腸菌は 1 9 9 4 年 月 3 0 日 付で米国 ATCCに ATCC No. 69T17 と し て寄託 さ れ てい る

そ の 大腸菌 （ ATCC No. 697 Π ) を 、 pAMGl l- h M K T ( 1 - 163 ) プラ ス ミ ド に よ り 形質転換 し 、 以下の培養条件に て培養 し た。

( 2 ) h M K T ( 1 - 163 ) を 発現す る 組換え大腸菌 の 培養、

T P O ( 1-163 ) Z E. cc l iの製造

得 ら れた形質転換株を L B 培地に て 3 0 °C、 約 1 2 時間培養 し た。 培養 し た細胞 は、 バ ッ チ用培地 （酵母抽出物 20g/ l ； ク ェ ン酸 3. / 1 ； K 2 HP0 4 15 g/ 1 ； Dow P 2000 15 m l ; グ ノレ コ ー ス 5g/l ; MgS0₄ · 7H₂ 0 1 /1 ； 微量金属類 5. 5nl/ l ; ビ タ ミ ン 5. 5m l/l を 含む） を含む発酵槽 に 無菌的 に 移 さ れ た。 ま ず、 最初の培養工程で は、 そ の培養液の O D が A ₆。。 で

5 . 0 0 に至 る ま で続け た

次 に 、 第 1 フ ィ ー ド培地 （ グ ル コ ー ス 700gZ l ； MgS0₄ · 7H₂ 0 6. 75g/lを含む） は添加速度を規定の方法に従 っ て、 2 時間 ご と に調整 し なが ら 培養を行 っ た。

第 2 フ ィ 一 ド培地 （ ト リ プチ カ ー ゼぺ プ ト ン （ t ryp t i ca s e pep t on e ) 129 g/l ; 酵母抽 出物 258g/l) の 添加 は 、 培養液の O D が A ₆。。 で 2 0〜 2 5 に な っ て か ら 開始 し た。 そ の第 2 フ ィ 一 ド培地の添加 は、 第 1 フ ィ ー ド培地の 添加を調整 し 続け る 一方で、 一定の流速を維持 し た

培養は全工程にわ た っ て約 3 0 でで行 っ た。 培養液 は必要に 応 じ て酸や塩基を添加す る こ と に よ り p H 約 7 . 0 に保たれた 望 ま し い溶存酸素濃度 は発酵槽に お け る 撹拌速度、 通気速度、 お よ び酸素流入速度を調整す る こ と に よ り 維持 し た。 そ の培養 液の O D が A ₆。。 で 5 7 〜 6 3 に達 し てか ら 、 第 3 フ ィ ー ド培 地 （ ラ ク ト ー ス 300g/l) を一定の速度で発酵槽に送 り こ んだ 第 1 フ ィ ー ド培地の添加を止め、 第 2 フ ィ ー ド培地の 流速を新 た に一定の速度に変更 し た。 培養を第 3 フ ィ ー ド培地の添加開 始後、 約 1 0 時間続 け た。 培養後、 そ の培養液を 1 5 ± 5 °C ま で冷却 し 、 細胞を遠心分離に よ り 回収 し た。 得 ら れたペ レ ツ ト は一 6 0 °C以下で保存 さ れた。

こ う し て組換え大腸菌で産生 さ れた h M K T ( 1-163 ) の精 製、 お よ び T P O ( 1-163 ) Z E. co l iの製造は次の よ う に行 つ た。

細胞菌体 1800gを約 1 8 L の 10mM EDTA に懸濁 し 、 高圧 ホ モ ジナ イ ザ ー に 15, G()()ps i に て通 し た。 破砕 し た細胞懸蔺液を遠 心分離に かけ、 そ の沈澱物を 1 0 L の i G m M EDTA に再懸濁 し た そ の懸蜀液を遠心分離に か け、 沈澱物 2QQgを、 2 L の 8M塩酸 グ ァ ニ ジ ン 、 10mM DTT、 5raM EDTAを含む mM T r i s 緩衝液、 pH 8. 7 で可溶化 し た。 こ の溶液を 2 0 0 L の 3M 尿素、 30% グ リ セ ロ ー ル、 3πιΜ シ ス タ ミ ン 、 laiM シ ス テ ィ ン を含有す る 10mM CAPS. ρΗΙΟ. 5でゆ つ く り と 希釈 し た。

こ の 希釈液 を 1 6 時間 、 室温 に て ゆ っ く り と 撹拌 し 、 pHを 6. 8 に調整 し た。 pH調整後、 清澄化 し 、 1. 5M尿素、 15% グ リ セ ロ ー ルを含む 1 ( Mリ ン酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液、 PH6. 8 で予め平衡 化 し た 2 L の C M S e p h a r 0 s eカ ラ ム （ フ ァ ノレマ シ ア ィ ォ テ ク 社 製） に添加 し た。 添加終了後、 15 % グ リ セ ロ ー ルを含有す る リ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液、 PH7. 2 で洗浄 し た。 h M K T ( 1- 163 ) は 10 railリ ン酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液 （ p H 7 · 2 ) 中で塩化ナ ト リ ゥ ム 濃度 0 か ら 0. 5Mの 直線濃度勾配に よ り 溶出 さ れた。

こ の よ う に し て得 ら れた CM S e p ha r o s eカ ラ ム の溶出画分を、 分子量 10, 00(1力 ッ ト の膜を用 い て 1 Mリ ン酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液

( H6. 5 ) で濃縮 し かつバ ッ フ ァ ー交換 し た。 そ の濃縮液 （ 夕 ン パ ク 濃度約 2 B g /m 1 ) は 、 9 0 分間、 室温 に て カ テ ブ シ ン C

(基質タ ンパ ク 質 ： 酵素 = 500 : 1 (モ ル比） ） に よ り 処理 し た。 こ の反応液を、 15% グ リ セ ロ ー ルを含有す る Ι ΟπιΜリ ン酸ナ ト リ ウ ム （PH7. 2) で予め平衡化 し た 1. 2Lの SP H i h P e r f o rma n c e S e ph a r s e カ ラ ム （ フ ア ルマ シ ア ィ ォ テ ク 社製） に添加 し た。 添加終了後、 h M K T ( 1-163 ) の N 末端の M e L y s が 切断 さ れた T P O 活性 タ ンパ ク 質、 即 ち 、 T P O ( 1- 1-63) / E. c 01 i は 1 Ο ΙΒΜリ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ pH7. 2 ) 中で塩化ナ ト リ ウ ム 濃度 0. 1 か ら 0. 25M の直線濃度勾記で溶出 し た。

の S P H i gh Pe r f o rma n c e カ ラ ム か ら の溶出液に 0. 6 Mに な る ま で硫酸ア ン モニ ゥ ム を添加 し 、 0. 6M硫酸ア ン モニ ゥ ム を含む 10mMリ ン酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液 （ PH7. 2 ) で予 め平衡化 し た 1. 6L © Pheny l Toyopea r lカ ラ ム （東 ソ 一社製） に添加 し た。 T P O ( 1-163 ) Z E. co l iの ピ ー ク は、 ΙΟπΜリ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 ( ρΗ7. 2 ) 中で硫酸ア ン モ ニ ゥ ム 濃度 0. 6 か ら 0Μの 直線濃度勾 配に よ り 溶出 さ れた

こ の よ う に し て得 ら れた Pheny l Toyopea r lの溶出液を、 分子 量 10 , 000カ ツ ト の膜を用 い て 5 % ソ ル ビ ト ー ル含有 10 in M T r i s 緩衝液 （ pH7. 5 ) で濃縮かつバ ッ 交換 し た

配 列 表

配列番号： 1

配列の長さ ： 332

配列の型：アミノ酸

配列の種類： タンパク質

起源： ヒ ト (Homo S a p i e n s)

配列：

Se r Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leo Leu

1 5 10 15

Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val

20 25 30

His Pro Leu Pio Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

35 40 45

Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp He Leu

50 55 60

Gly Ala Val Thr Leu Leo Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 75 80

Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin

85 90 95

Val Arg Leu Leu Leu G I y Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu

100 105 110

Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe

115 120 125

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Va I Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160

Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glti Leu Pro Asn

165 170 175

Arg Thr Ser Gly Leu Leu Gi u Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr

180 185 190

Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Ala Lys lie

195 200 205

Pro G 1 y Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin 11 e Pro Gly

210 215 220

Ty r Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225 230 235 240

Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp lie Ser Ser Gly

245 250 255

Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser

260 265 270

Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Leu

275 280 285

Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gin Leu His Pro Leu Leu Pro

290 295 300

Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305 310 315 320

Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly

325 330 配列番号： 2

配列の長さ ： 1043

配列の型：核酸

鎖の数：ニ本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：合成 DN A

¾源： ヒト (Homo S a p i e n s)

E列：

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA 28 ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA 76 Met Lys Se r Pro Ala Pro Pro Ala Cys As Leu Arg Va 1 Leu Se r Lys - 2 +1 5 10

CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG 124 Leu Leo Arg Asp Se r His Va 1 Leu His Se r Arg Leu Ser Gin Cys Pro 15 20 25 30

GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC 172 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Va 1 Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe

35 40 45

TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC 220 Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp

50 55 60

ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT 268 He Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu G Gly Val Met Ala Ala Arg

65 70 75

GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT 316 Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser

80 85 90 m

usy naq naq nig sin usy na 』 ；） OJd iH 393 133 33V D99 DVV 913 91D VV9 丄 V3 01V 19D DVV 913 IV! D99 DOD

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B!V J3S «IV Hi usy j i nig naq J3S 】U 2 jy asy o J,] N9 939 30V 9D9 33V 丄丄丄 33V VV9 013 913 390 39V D3V 193 3VV 933

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SI0/96dT/XDd ひ 9 /96 OAV 配列番号： 3

配列の長さ ： 1721

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー ：直鎖状

配列の種類： c DNA t o mR N A

起源：ホモ サピエンス （H omo S a p i e n s)

組織の種類：肝臓

配列：

GCGGCACGAG GGGGGTGTCT GGCTGGCGTG GCTCCCTGTT TGGGGCCTCT CCCCTGAATC 60 CTTCCTGGGG CCATGGAGGC CAGACAGACA CCCCGGCCAG A 101 ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 149 Me t Gl u Leu Th r G 1 u Leo Leu Leu Va I Va 1 Met Leu Leu Leu Th r A I a

-20 -15 -10

AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 193 Arg Leu T r Leu Se r Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Va 1 - 5 1 5 10

CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 245 Leu Ser Lys Leo Leu Arg Asp Ser His Va 1 Leu His Ser Arg Leu Ser

15 20 25

CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT 293 Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala

30 35 40

GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 341 Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys

45 50 55 GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 389

Ala GID Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu G I u Gly Val Met 60 65 70 75

GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG 437

Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

80 85 90

CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC 485 Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leo Gin Ser Leu

95 100 105

CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT 533 Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

110 115 120

CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 581 Pro Asn Ala lie Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg G!y Lys Val

125 130 135

CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 629 Arg Phe Leu Me t Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg A I a

140 145 150 155

CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG 677 Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu

160 165 170

AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT 725 Asn Gl u Leu Pro Asn Arg Thr Ser G I y Leu Leu Gl a Thr Asn Phe Thr

175 180 185

GCC TCA GCC AGA ACA ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA 773 Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Ly s Trp Gin Gin Gly

190 195 200 TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG 821

Phe Arg Ala Lys lie Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Se r L-eu

205 210 215

GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA 869

Asp Gin 11 e Pro Gly Tyr Leu Asn Arg 11 e His Gl u Leu Leu Asn G 1 y

220 225 230 235

ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG 917

Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro

240 245 250

GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC 965

Asp He Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Set Leu Pro Pro Asn Leu

255 260 265

CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT 1013

Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr

270 275 280

ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC 1061

Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Va 1 Gin Leu

285 290 295

CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC 1109

His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser

300 305 310 315

CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA 1157

Pro Leu Leo Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser G Asn Leu Ser Gin Glu

320 325 330

GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC . 1210 Gly TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC -TCCTGAAACC 1270

CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT 1330

ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC 1390

TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA AATTTGCAAC TCACTGATTC TCTACATGCT CTTTTTCTGT 1450

GATAACTCTG CAAAGGCCTG GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG 1510

AGTCAGAAAA CAGAGAAAGG GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC 1570

CCATCCCCTT TACTATCATT CTCAGTGGGA CTCTGATCCC ATATTCTTAA CAGATCTTTA 1630

CTCTTGAGAA ATGAATAAGC TTTCTCTCAG AAATGCTGTC CCTATACACT AGACAAAACT 1690 G 以下ポリ A尾部 3 0塩基 1721

配列番号： 4

配列の長さ ： 1 0 8 6

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c DNA t o mRN A

起源： ヒ ト （H omo S a p i e n s )

組織の種類：肝職

配列：

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA 24

ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 72 Met GIu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Va 1 Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

-20 -15 - 10

AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 120 Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Al a Cys Asp Leu Arg Val

-5 1 5 10 SSI 8Π OH

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11V OVV 009 V9V 311

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S8I 081 SIT j i a usv J¾I nig 』H丄 usy oid naq n | g asy H 13V Oil OVV VOV 9Y9 Dll 911 V99 131 Ι3Ϋ 99V OVV V03 010 9V9 OVV

Oil S9I 091

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I9SI0/96df/lDd ひ 9 /96 OAV CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC 1032

His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro T r Pro T r Sei

300 305 310 315

CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA 1080

Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu

320 325 330

GGG TAA 1086 Gly 配列番号： 5

配列の長さ ： 535

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー ：直鎖状

配列の種類：合成 DN A

JE源： ヒ 卜 (Homo S a i e n s)

配列：

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA 28 ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA 76 Me t Lys Ser Pro Ala Pro Pro A I a Cys Asp Leu Arg Ya 1 Leu Ser Lys

+1 5 10

CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG 124 Leu Leu Arg Asp Ser His Va 1 Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro

15 20 25 30

GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC 172 Glu Ya 1 His Pro Leu Pro Thr Pro Va I Leu Leu Pro Ala Va I Asp Phe

35 40 45 TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC 220 Ser Leu Gly Glu Trp Lys T r Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp

50 55 60

ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT 268 He Leu Gly Ala Yal Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg

65 70 75

GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT 316 Gl Gin Leu Gly Pro Thi C" Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser

80 85 90

GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG CTT GGC ACC 364 Gly Gin Val Aig Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr 95 100 105 110

CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT CCG AAC GCT 412 Gin Lea Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala

115 120 125

ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC AAA GTT CGT TTC CTG 460 He Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu

130 135 140

ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC 508 Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Yal Arg Arg Ala Pro Pro Thr

145 150 155

ACT GCT GTT CCG TCT TAATGAAAGC TT 535 Thr Ala Val Pro Ser

160

Claims

請 求 の 範 囲

1 . ト ロ ン ボポ ェ チ ン （ T P O ) タ ン パ ク 質 と 薬学的 に許容 さ れ得 る 添加剤 と し て糖類を含む こ と を特徴 と す る T P O含有 凍結乾燥組成物。

2 . T P O含有凍結乾燥組成物中 に含有 さ れ る T P O を 1 重 量部 と し た場合に、 該糖類が 1 0 〜 1 0 0 0 0 重量部であ る 請 求項 1 に記載の T P 0 含有凍結乾燥組成物。

3 . 該糖類が、 マ ン ニ ト ー ル、 ラ ク ト ー ス、 シ ュ ク ロ ー ス、 マ ル ト ー ス か ら な る 群よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種類であ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 ま た は 2 に記載の T P O含有凍結乾燥 組成物。

4 . T P O タ ンパ ク 質 と 糖類の他に更 に 、 界面活性剤、 ア ミ ノ 酸、 タ ン パ ク 質か ら な る 群よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種類の 薬学的 に許容 さ れ得 る 添加剤 と を含む こ と を特徵 と す る 請求項 1 〜 3 に記載の T P 0含有凍結乾燥組成物。

5 T P 0 タ ンパ ク 質含有凍結乾燥組成物中 に含有 さ れ る T

P O を 1 重量部 と し た場合 に、 該界面活性剤が 0 . 0 1 〜 1 0 重量部であ る 請求項 4 に記載の T P 0 含有凍結乾燥組成物

6 . T P O タ ン パ ク 質含有凍結乾燥組成物中 に 含有 さ れ る Τ Ρ Ο を 1 重量部 と し た場合に、 該ア ミ ノ 酸カ 1 〜 1 0 0 0 重 量部で あ る 請求項 4 に記載の Τ Ρ 0含有凍結乾燥組成物。

7 . Τ Ρ Ο タ ン パ ク 質含 有凍結乾燥組成物中 に 含有 さ れ る Τ Ρ Ο を 1 重量部 と し た場合に、 該 タ ンパ ク 質が 1 〜 1 0 0 0 重量部であ る 請求項 4 に記載の Τ Ρ 0含有凍結乾燥組成物。

8 . 該界面活性剤が ポ リ オ キ シ ソ ル ビ タ ン脂肪酸エ ス テ ルで あ る こ と を特徴 と す る 請求項 4 ま た は 5 に記載の Τ Ρ 0含有凍 桔乾燥組成物。

9 . 該ア ミ ノ 酸がグ リ シ ン あ る い は ア ルギニ ン の少な く と も 1 種であ る こ と を特徵 と す る 請求項 4 ま た は 6 に記載の Τ Ρ 0 含有凍結乾燥組成物。

1 0 . 該 タ ンパ ク 質がゼ ラ チ ン で あ る こ と を特徴 と す る 請求 項 4 ま た は 7 に記載の Τ Ρ 0含有凍結乾燥組成物。