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WO1995034815A1 - Dispositif de diagnostic rapide de toute molecule glyquee et procede de mise en ×uvre - Google Patents

Dispositif de diagnostic rapide de toute molecule glyquee et procede de mise en ×uvre Download PDF

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WO1995034815A1
WO1995034815A1 PCT/FR1995/000776 FR9500776W WO9534815A1 WO 1995034815 A1 WO1995034815 A1 WO 1995034815A1 FR 9500776 W FR9500776 W FR 9500776W WO 9534815 A1 WO9534815 A1 WO 9534815A1
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WO
WIPO (PCT)
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zone
membrane
glycated
ligand
residues
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/000776
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English (en)
Inventor
Philippe Goumard
Jean Kadouche
Hamidou Samake
Original Assignee
Gks Technologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Gks Technologies filed Critical Gks Technologies
Publication of WO1995034815A1 publication Critical patent/WO1995034815A1/fr

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin

Definitions

  • the present invention relates to a rapid diagnostic test for the presence in a biological sample of a glycated or glycosylated substance when the latter is present simultaneously with the same non-glycated or non-glycosylated molecule; this is particularly indicated in the context of blood sugar monitoring in diabetics.
  • glycated substance or glycated protein is meant any type of substance to which at least one glucose molecule is linked in some way alone or in combination with other sugar molecules, the bond being preferably of covalent type, not enzymatic, while the sugar added by the enzyme on a substance generates a glycosylated molecule, or glycoprotein if the substance is a protein.
  • glycated substance can be glycated hemoglobin, glycated albumin for the former.
  • the device and method for rapid diagnosis of the present invention is particularly original in the sense that it makes it possible to discriminate in a biological liquid a glycoprotein or a glycated protein of the same protein devoid of any sugar residue.
  • a particularly crucial case where it is necessary to be able to dose glycated proteins in blood is the case for monitoring blood sugar in diabetics; it is also this type of assay which has made it possible to develop the most sophisticated techniques to allow finding a marker and assaying a particular protein which is glycated hemoglobin within the framework of the monitoring of a treatment; this monitoring can be carried out in different ways:
  • glycated proteins in particular albumin (1) or hemoglobin (2).
  • glycated hemoglobins (3-6) (in particular hemoglobin Aie) is of considerable interest in the long-term monitoring of the evolution of glycemia.
  • reaction products between hemoglobin and glucose form and accumulate in red blood cells throughout their existence (i.e. 120 days).
  • researchers have shown that there is a correlation between the level of circulating glycated hemoglobin in diabetics and their blood or urine free glucose concentration in the weeks preceding the examination (7). This is a good method for monitoring the development of diabetes (2) and preventing its complications (8,9).
  • Diabetic patients may have glycated hemoglobin levels 2 to 4 times higher than average, but may return to normal with appropriate therapies.
  • the first "glycohemoglobin” assay method was developed by TRIVELLI in 1971 (10). This method uses a cation exchange chromatography column so as to split the hemoglobin into 4 fractions depending on the charge: hemoglobin Ao (HbAo), hemoglobin Ala (HbAla), hemoglobin Alb (HbAlb) and hemoglobin Aie (HbAlc). Hemoglobin Ao represents the major part (approximately 92%), hemoglobins Ala and Alb are not completely separated (2.5%) and hemoglobin Aie represents 5.5% of total hemoglobin.
  • This method which is not easy to use in routine analysis, made it possible, on the one hand, to establish clinical values for the dosage of glycated hemoglobins, and on the other hand, to show significant differences in the distributions. of different hemoglobins in patients with diabetes and in normal patients.
  • hemoglobin Aie was considered to be the only glycated species of hemoglobin.
  • Hemoglobin Aie is a glycohemoglobin whose amino acid sequence is identical to that of hemoglobin. The only difference that distinguishes it is the non-enzymatic fixation (or glycation) of a glucose or glucose-6-phosphate molecule on the terminal valyl residue of the chain (beta) followed by a rearrangement of Amadori .
  • Affinity chromatography is the most recent glycated hemoglobin assay (35, 36). This method is based on the capacity of boronic acid to form a complex with the cis-diol groups of sugars, in particular fructose and glucose (35). Boronic acid (aminophenylboronic acid) is coupled to a matrix of suitable chromatography for binding glycated hemoglobins. The bound glycated species are eluted with sorbitol and quantified by spectrophotometry (35-42). This technique is less sensitive to variations in temperature and pH than ion exchange techniques. It is not influenced by the presence of hemoglobin Al, F, S, C, E or carbamylated.
  • This type of method uses only one support and allows the sandwich type test reaction or by competition; it further requires treatment of the support strip after the reaction and intended to block any excess binding sites on said support; finally, no type of internal control for the proper functioning of the reaction is provided for, which can sometimes make the interpretation of said test difficult.
  • Patent application WO 91/12528 in the name of HYGEIA SCIENCES describes a rapid diagnostic device comprising a solid support on which the constituent substances of affinity pairs migrate by capillarity. Sandwich or competition type reactions obtained by reaction of antigens with antibodies are then liable to be blocked by an avidin / biotin type capture system; the second part of a pair of affinities which must react with the substance to be assayed can be marked by a substance of the colloidal gold type and by a captureable substance of the biotin type.
  • this antigen-antibody immunological type test does not make it possible to discriminate in a biological fluid the percentage for a given protein of that which could be glycosylated or glycated compared to those which are not.
  • patent application WO 94/07141 which is a double test, part of which allows a control and the elimination of false positives
  • Patent applications EP 291 194 and EP 560 411 describing a device allowing rapid diagnosis of the presence of a substance in a biological sample, immunological test also involving antigen-antibody type reactions, the revelation being carried out by branding colloidal gold.
  • FIG. 1b represents a longitudinal cross-sectional profile view of the various elements of the device comprising the filter, the reservoir, a first nitrocellulose membrane, the activated capture membrane, the second nitrocellulose membrane comprising the control zone for proper operation, the zone hygroscopic blotter, all
  • the figure represents a longitudinal section view seen from the front.
  • FIG. 1d represents a section of the reservoir zone surmounted by a filter.
  • the invention relates to a method and a device for rapid dosing in a sample of a glycated or glycosylated substance; taking into account the importance of glycated proteins and in particular glycated hemoglobin in the monitoring of certain pathologies, reference will always be made more particularly to this application; however, a person skilled in the art will know how to adapt the method and the device described below to any dosage of glycated or glycosylated protein other than glycated hemoglobin.
  • the method for determining and dosing the amount of a glycated or glycosylated substance present in a sample comprises the following steps: a) applying said sample to the receptacle (16) of a plastic case, said receptacle (16) being superimposed to a zone consisting, where appropriate, of a filter (25), of a reservoir (20) containing a labeled ligand (A), this reservoir zone (20) being fixed on or contiguous to a membrane (22) having the property to allow the migration by capillarity of the solutions containing the molecules to be assayed and the pairs of affinities possibly formed in the reservoir zone, and to have a low affinity for the biological molecules.
  • b) allow the sample to migrate by capillarity through this first zone to a second capture zone constituted by an affinity support (30) capable of specifically retaining the glycated or glycosylated molecule sought, c) leaving the sample migrate by capillarity towards a third zone guaranteeing proper functioning of the reaction, said zone being impregnated with a specific ligand (B) of the first ligand (A), at the level of a strip (42), d) Read the response by the presence or absence of a strip (31) at the level of a first reading window (17) revealing the zone (30) of the reaction and the proper functioning of the reaction by observation of a strip (42) through a second reading window (18), e) The flow of liquid between the deposit in the receptacle (16) and the reading of the reaction result being produced by the existence of absorbent means (50) having significant hygroscopic properties and contiguous to the membrane (40) or to the affinity support (30).
  • the first reactive zone and the reservoir are advantageously one and the same zone, the reservoir containing the ligand (A) of the first affinity zone, which is then present therein in a dry form rehydratable by the application of the sample in which glycated protein to be assayed is optionally present.
  • the first reservoir zone (20) consists of a chosen material which can act as a container such as cellulose, cellulose derivatives, a polyester of nylon type, fibrous or microporous polymers high density polyester type, fibers of plant, animal, mineral or synthetic origin, in the form of powder, tablets or multiple layers, and having, with or without treatment, properties of low adsorption of biological molecules.
  • a chosen material which can act as a container such as cellulose, cellulose derivatives, a polyester of nylon type, fibrous or microporous polymers high density polyester type, fibers of plant, animal, mineral or synthetic origin, in the form of powder, tablets or multiple layers, and having, with or without treatment, properties of low adsorption of biological molecules.
  • said ligand may, depending on the glycated substance sought, be in particular an antibody, a glycan, a lectin, a substrate or an enzyme inhibitor, an enzyme, an element of the haptoglobin-hemoglobin pair, or any molecule having a particular affinity with the analyte to be assayed and capable of exhibiting chromatographic mobility after its coupling with said molecule to be assayed.
  • the method of the invention implies that the ligand present in the first zone is marked by a substance whose physicochemical characteristics make it possible to reveal the presence of the analyte sought by measuring an adsorption or a modification of a light at one or more wavelengths located in the ultraviolet, visible or infrared.
  • This can be a simple visual detection by labeling with colloidal particles containing a metal, for example gold, labeling carried out by techniques now conventional and as described for example in US Patents 4,859,612, US 4,313,734 or patent applications EP 291,194 or EP 560,411, EP 398,913.
  • the ligand according to the method of the invention can also be coupled to an organometallic marker making it possible to reveal the presence of the product having reacted by infrared detection, the wavelength being dependent on said marker used.
  • the second hot spot is a catch area. Capture means that the glycated molecule-ligand complex must be specifically retained, excluding the non-glycated protein-ligand complex, knowing that, for example in the case where the protein to be sought is glycated hemoglobin, a monoclonal antibody specific for hemoglobin or haptoglobin can bind both glycated hemoglobin and non-glycated hemoglobin.
  • the matrix of the second reactive zone will therefore be a different matrix from that of the first reactive zone and will be modified so as to exhibit properties of selective adsorption of the ligand / protein pair sought, discriminating with respect to the same pair when the protein is not glycated.
  • This selective reactivity of the second reactive zone can be obtained either by the use of an ion-exchange membrane, for example of cation, which will be capable of specifically retaining substances having a negative charge, this may also be an activated nitrocellulose membrane. in particular with aminophenylboronic acid so as to form a complex with the cis-diol groups of sugars and in particular of fructose, and in particular of the glucose present in covalent bond on the glycated hemoglobin; this reactivity can also be obtained:
  • residues or ionizable molecules such as residues R-NH 2 , R-OH, R-SH,
  • grafting residues having hydrophobic properties such as polycarbon chains, residues of R-CH 3 , R-phenyl type, by grafting residues having reactive chemical properties such as epoxy, aldehyde, carboxyl, halogenyl residues, by grafting residues having appropriate biochemical or immunological properties such as a glycan, a lectin, an enzyme substrate or inhibitor, an element of the avidin-biotin pair, an element of the hemoglobin-haptoglobin pair, or any molecule having a particular affinity with the analyte to dose sought.
  • the second zone should include for example an ion exchange resin capable of specifically absorbing glycated hemoglobin or a chromatography matrix grafted with a lectin, or finally a membrane activated with boronate; if on the contrary, the first reactive zone contains a specific ligand for a glycated protein, for example a lectin, then the second reactive zone must comprise for example a substance such as an anti-hemoglobin antibody coupled to the affinity support which will be able to discriminate among all glycated proteins present in the glycated hemoglobin sample.
  • the membrane of the second zone can be composed of any material, alone or in mixture, having the properties of selective adsorption of the analyte to be assayed and of migration and capillarity allowing the sample to move and entrain the 'analyte to be assayed through the reactive zones; this second reactive zone can be composed of two distinct and contiguous parts having one of the two or the two properties set out above.
  • the reactivity of the membrane of the second zone can be obtained directly by its intrinsic properties, for example adequate hydrophobicity / hydrophilicity ratio, ionic charge or absorption capacity, or after appropriate treatment with grafting of residues or molecules such as mentioned above, it will however be preferred for a simple test to use in the first zone a labeled ligand specifically recognizing the protein part of the glycated or glycosylated protein and in the second zone an ion exchange resin, for example cationic, or an affinity support comprising a lectin making it possible to discriminate in the first affinity couple formed in the first zone comprising the ligand (A), the one which will comprise the sugar molecule, to block it at this second zone affinity and, by a direct and simple reading, to measure the presence and the quantity.
  • a labeled ligand specifically recognizing the protein part of the glycated or glycosylated protein and in the second zone an ion exchange resin, for example cationic, or an affinity support comprising a lect
  • the method of the invention is characterized in that the flow of liquid through the device is generated by a hygroscopic material (50), for example cellulose wadding, cellulose derivatives, polyesters of nylon type, polymers fibrous or microporous of the high density polyester type, or all fibers of vegetable, animal, mineral or synthetic origin, in the form of compressed powder or of multiple layers and capable of draining by capillarity the liquid deposited in the reservoir, thus playing a role of blotter.
  • a hygroscopic material for example cellulose wadding, cellulose derivatives, polyesters of nylon type, polymers fibrous or microporous of the high density polyester type, or all fibers of vegetable, animal, mineral or synthetic origin
  • This blotter zone can, in addition, be preceded upstream by a zone (40) for controlling the proper functioning of the reaction and eliminating any reaction between a monoclonal antibody used as a ligand with anti-mouse, rat and anti-antibody antibodies. or other species that could have pre-existed in the sample to be assayed.
  • a zone (40) for controlling the proper functioning of the reaction and eliminating any reaction between a monoclonal antibody used as a ligand with anti-mouse, rat and anti-antibody antibodies. or other species that could have pre-existed in the sample to be assayed.
  • This zone (40) can also contain a witness of good functioning of the reaction (42).
  • the present invention also relates to a device (10) for the detection and determination of a glycated or glycosylated protein present in a sample and characterized in that it comprises at least three zones: a) A reservoir zone (20) containing a specific ligand for the glycated protein, if necessary surmounted by a filtration means (25), this reservoir zone (20 ) being fixed on a membrane (22) having the property of allowing migration by capillarity, b) A reactive zone composed of an activated membrane (30) having properties of selective adsorption of the substance to be measured and of migration properties by capillarity, contiguous, or partially superimposed on the membrane (22), and made of a material different from the membrane (22), c) If necessary, an area made up of a membrane (40) on which has been adsorbed a biological molecule (42) making it possible to verify the proper functioning of the reaction, d) an absorbent means (50) making it possible to promote the flow of liquid through the various zones described in a), b), c
  • the reservoir zone (20) contains a ligand (A) capable of forming a first affinity pair with the substance to be measured, the ligand being modified or capable of being modified by a marker allowing to locate it alone or included in a first affinity pair, this reservoir (20) being superimposed or adjacent to a membrane (22) treated in such a way that it has low capacities for adsorption of biological molecules and strong properties migration and capillary action allowing the sample to move and entrain the substance to be assayed through the reactive zones.
  • A ligand
  • the second reactive zone of the assembly (12) is composed of an activated membrane (30) having properties of selective absorption of the substance to be assayed (for example by ionic interaction, by hydrophobic interaction, by affinity, by immunoaffinity) .
  • An important property of this second zone is that it can be composed of a material or of a mixture of several materials which in any event are different from those of the material of the first reactive zone.
  • the support itself is modified so that it has an affinity with the affinity couple formed in the first zone, and therefore this second zone serves at the same time for capture and stopping the migration of all the affinity complexes formed containing the sought molecule, with the exclusion of the affinity complexes formed not having the sought molecule.
  • the device also includes an absorbent element, the role of which is to cause or promote the flow of liquid through the preceding zones.
  • This element can be composed of one or more materials having hygroscopic properties.
  • This element can also and if necessary be preceded by a zone for checking the proper functioning of the reaction: by example if an antihemoglobin antibody was used in the first affinity zone, the non-glycated hemoglobin could be used in the control zone in order to eliminate non-specific reactions which could have taken place between substances present in the biological fluid and the affinity membrane (30).
  • the set of contiguous or partially superimposed elements (20), (25), (30), (40) and (50) or a part of this set devoid of the elements (25) or (40) or both, is placed on a plastic support (60), revealing windows. These three parts can also be placed superimposed or in layers.
  • the device of the invention described above allows in a simple, rapid test in a single step to discriminate in a given liquid, a molecular form devoid of sugar and a molecular form having undergone glycation or glycosylation.
  • the device of the invention therefore combines the principle of chromatography with that of dry chemistry; in fact, the device of the invention comprises, in its two reactive zones, on the one hand the labeled ligand of the protein to be sought, and on the other hand an affinity membrane having either intrinsic properties making it possible to specifically capture the pair of affinities thus marked, for example an ionic charge, or else after appropriate treatment carrying grafted groups of the ionizable molecule type, for example R-NH 2 , R-OH, R-COH, R-SH, or hydrophobic of the type R-CH 3 , R-phenyl or reactive chemical properties such as epoxy, aldehyde, carboxyl, halogenyl or finally appropriate biochemical or immunological properties, for example antibodies, glycans, peptides or any type of molecule already mentioned above with affinity particular with the analyte to be assayed.
  • an affinity membrane having either intrinsic properties making it possible to specifically capture the pair of affinities thus marked, for example an ionic charge
  • the reservoir (20) is prior to its use saturated with PBS buffer supplemented with 10% sucrose and 5% semi-skimmed milk powder; after 15 minutes at room temperature, the tank is dried at 37 ° C ⁇ 2 for one hour.
  • the migration zones, in particular zones (25) and (40) are made of a nitrocellulose type material which have a strong affinity for biological molecules; this strong affinity is used in particular in the zone (40) for testing the proper functioning of the reaction to fix the molecule making it possible to verify this proper functioning, for example an anti-haptoglobin antibody or hemoglobin in the case of the l test 'glycated hemoglobin. Then after the fixation of the biological molecules, the membranes are saturated with a buffered solution containing proteins, in particular skimmed milk powder.
  • the assembly comprising the ligand and optionally the grafted molecules is then dehydrated by any suitable technique and in particular lyophilization, which allows this device ready for use to be stored for several months.
  • the present invention also relates to the use of a device as described above for measuring the amount of glycated or glycosylated substance in a sample containing the same substance, either in the glycated state or in the glycosylated state.
  • glycated hemoglobin which appears in diabetic patients; such a dosage of glycated hemoglobin can allow a doctor or the patient himself to monitor his blood sugar level either in prevention or in follow-up of drug treatment.
  • any type of application can be considered; it may in particular be a question of checking the glycosylation state of a recombinant molecule secreted in a culture of eukaryotic cells; such monitoring can be particularly advantageous for scientists who would seek to determine the best host cell to express a recombinant protein using the criterion of the quality of glycosylation.
  • the originality of the type of device and implementation method described above is to include different types of reactive zones juxtaposed or superimposed, some of which directly use the properties of affinity chromatography, or by exchange of ions used in conventional chromatography methods, and this combined with classical affinity reactions, in a mobile phase described in the rapid diagnostic test of the state of the art as mentioned above.
  • This diagnostic test makes it possible to measure the presence of a glycated protein in a sample in a single step, without washing step or enzymatic revelation, or use of apparatus or specific technical knowledge.
  • the manipulator directly applies the sample to be dosed to the reservoir containing the specific tracer of the glycated protein to be dosed, as well as the buffers intended to promote the bond between the glycated protein to be dosed, and the reactive membrane.
  • the assembly enters the device thanks to the receptacle (16) and crosses the various reactive zones by capillary action thanks to the action of the zone playing the role of absorbent.
  • the sample contains the analyte to be assayed, it reacts with the labeled ligand previously present in the reservoir (20); the complex is then entrained by the capillary flow of the sample through the membrane to the second reactive surface where it is trapped thanks to the very nature of this reactivity zone. If a color appears, the test is positive. Otherwise, the sample does not contain the glycated or glycosylated analyte sought.
  • This test is sensitive, the second reactive zone, also capture zone, by its very nature, leads to a phenomenon of concentration of the reagents on the membrane; it can also be quantitative thanks to the intrinsic characteristics of the reagents: in fact, a coloration appears from a predetermined concentration of the analyte to be assayed, linked to an equilibrium between the ligand and the labeling of the ligand. Finally, this type of test has a very low unit cost. Other advantages and details will appear on reading the examples below concerning the determination of glycated hemoglobin and in the figures.
  • Example 1 Preparation of a device according to the invention making it possible to assay glycated hemoglobin: technique by affinity.
  • the tracer may be composed, for example of a polyclonal or monoclonal antibody coupled to particles of colloidal gold. a) Case of a polyclonal antibody
  • the antibody is dialyzed against a 2 mM sodium borate solution buffered at pH 9 for two hours at room temperature.
  • the concentration of the antibody solution is adjusted to 0.1 mg / ml with the 2 mM sodium borate solution buffered to pH 9.
  • the mixture is stirred for five minutes at room temperature.
  • the reaction mixture is again centrifuged twice under the same conditions.
  • the pellet is taken up in 1 ml of a 20 mM Tris solution buffered to 7.4 and containing 1% bovine serum albumin, 0.1% Tween and 0.5 % of polyethylene glycol 3000.
  • the optical density of the solution is measured at 595 nm.
  • the isoelectric point of the antibody considered is determined beforehand by isoelectrofocusing electrophoresis (IEF).
  • the antibody is dyalized against a 2 mM sodium borate solution buffered to a pH greater than 0.5 unit at the isoelectric point of the antibody considered, for two hours and at room temperature.
  • the first reactive zone or "reservoir” (20) is prepared by impregnating the solid phase with a buffer allowing the sample to be measured to be placed under ideal conditions of pH and ionic strength.
  • This buffer will be chosen according to the nature of the second reactive zone or "reaction support” (30).
  • reaction support is a nitrocellulose membrane activated by aminophenylboronic acid
  • a buffer based on ammonium acetate a buffer based on ammonium acetate
  • a sheet of cellulose wadding is immersed in a 30 mM ammonium acetate solution buffered at pH 8.2 for fifteen minutes at room temperature and with gentle stirring. The sheet is put to dry in an oven at 37 ° C for three hours.
  • the sheet can be stored under vacuum, in the presence of desiccant and at room temperature. Under these conditions, it is stable for one year.
  • the sheet is cut to the desired dimensions and the tracer is deposited therein at the rate of 20 ⁇ l of an optical density solution at 595 nm between ten and fifteen absorption units (AU).
  • the tanks thus obtained are dried in an oven at 37 ° C for three hours.
  • the second reactive zone or "reaction support” consists, for example, of a nitrocellulose membrane chemically activated by aminophenylboronic acid.
  • the membrane is immersed in a 30 mM ammonium acetate solution buffered at pH 8.2, for fifteen minutes at room temperature and with gentle stirring.
  • the membrane is put to dry in an oven.
  • the membrane is cut to the desired dimensions.
  • the membrane can be stored under vacuum, in the presence of desiccant and at room temperature. Under these conditions, it is stable for one year. II - ASSEMBLY OF THE DEVICE
  • the reactive zones thus obtained and cut to the desired dimensions are freeze-dried and joined together in a plastic module (14).
  • the devices obtained are vacuum packed in the presence of a desiccant. Under these conditions, they are stable for one year at room temperature.
  • Example 2 Preparation of a device for assaying glycated hemoglobin: technique by ion exchange.
  • a sheet of cellulose wadding is immersed in a 25 mM sodium malonate solution buffered to pH 5.7 for fifteen minutes at room temperature and with gentle stirring.
  • the sheet is put to dry in an oven at 37 ° C for three hours.
  • the sheet can be stored under vacuum, in the presence of desiccant and at room temperature. Under these conditions, it is stable for one year.
  • the sheet is cut to the desired dimensions and the tracer is placed therein at the rate of 20 ⁇ l of an optical density solution at 595 nm between ten and fifteen absorption units (AU).
  • the tanks thus obtained are dried in an oven at 37 ° C for three hours.
  • the second reactive zone or "reaction support” consists, for example, of a Sartobind "S type cation exchange membrane.
  • the membrane is immersed in a 25 mM sodium malonate solution buffered to pH 5.7, for fifteen minutes at room temperature and with gentle stirring.
  • the membrane is put to dry in an oven at 37 ° C for three hours.
  • the membrane is cut to the desired dimensions.
  • the membrane can be stored under vacuum, in the presence of desiccant and at room temperature. Under these conditions, it is stable for one year. D ⁇ Preparation of the third hotspot
  • Example 3 Performing a diagnostic test
  • the user of the device of the invention can deposit in the receptacle (16) 50 ⁇ l of whole blood and 150 ⁇ l of migration buffer in the receptacle (16) provided for this purpose. If the desired substance is in the urine, the user will then deposit in the receptacle (16) provided for this purpose 150 ⁇ l of urine.
  • the test user can after depositing his sample observe the presence or absence of a band violet in the reading window (16), the presence or absence of this strip being a direct reflection of the presence or absence of glycated hemoglobin sought in the sample.
  • the presence of a second purple strip in the window for checking the correct functioning of the reaction (18) is necessary for the interpretation of the reading of the presence of a strip in the window for reading the test (17).

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Abstract

Dispositif pour la détection et la détermination de protéine glyquée ou glycosylée présentée dans un échantillon comprenant une juxtaposition d'une zone réservoir contenant un ligand spécifique de la protéine glyquée, une zone d'absorption sélective constituée d'un matériau différent, le cas échéant une zone de contrôle de bon fonctionnement de la réaction, et un moyen absorbant favorisant le flux de liquide à travers les zones précédentes.

Description

DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC RAPIDE DE TOUTE MOLECULE GLYQUEE ET PROCEDE DE MISE EN OEUVRE
La présente invention est relative à un test de diagnostic rapide de la présence dans un échantillon biologique d'une substance glyquée ou glycosylée quand celle-ci est présente simultanément avec la même molécule non glyquée ou non glycosylée ; cela est particulièrement indiqué dans le cadre du suivi de la glycémie chez les diabétiques.
Par substance glyquée ou protéine glyquée. on entend tout type de substance à laquelle est liée de quelque façon au moins une molécule de glucose seule ou en association avec d'autres molécules de sucre, la liaison étant de préférence de type covalant, non enzymatique, alors que le sucre ajouté par voie enzymatique sur une substance génère une molécule glycosylée, ou glycoprotéinée si la substance est une protéine.
Des exemples particuliers de substance glyquée peuvent être l'hémoglobine glyquée, l'albumine glyquée pour les premiers.
Le dispositif et le procédé pour le diagnostic rapide de la présente invention est particulièrement original en ce sens qu'il permet de discriminer dans un liquide biologique une glycoprotéine ou une protéine glyquée de la même protéine dépourvue de tout résidu de sucre.
Etat de la technique de dosage de protéines glyguées
Les numéros de références entre parenthèses renvoient à une liste de références en fin de la description.
Un cas particulièrement crucial où il est nécessaire de pouvoir doser des protéines glyquées dans le sang est le cas du suivi de la glycémie chez les diabétiques ; aussi c'est ce type de dosage qui a permis de mettre au point les techniques les plus sophistiquées pour permettre de trouver un marqueur et de doser une protéine particulière qui est l'hémoglobine glyquée dans le cadre du suivi d'un traitement ; ce suivi peut être réalisé de différentes manières :
- le dosage du glucose,
- le dosage du fructosamine,
- le dosage des protéines glyquées, notamment l'albumine (1) ou l'hémoglobine (2).
L'analyse de la littérature révèle que le dosage des hémoglobines glyquées (3-6) (en particulier l'hémoglobine Aie), présente un intérêt considérable dans le suivi à long terme de l'évolution de la glycémie. En effet, des produits de réaction entre l'hémoglobine et le glucose se forment et sont accumulés dans les globules rouges durant toute leur existence (soit 120 jours) . Les chercheurs ont montré qu'il existe une corrélation entre le taux d'hémoglobine glyquée circulante chez les diabétiques et leur concentration sanguine ou urinaire en glucose libre dans les semaines précédant l'examen (7). Il s'agit là d'une bonne méthode pour suivre l'évolution du diabète (2) et prévenir ses complications (8,9). Les patients diabétiques peuvent avoir des taux d'hémoglobine glyquée de 2 à 4 fois supérieurs à la moyenne, mais qui peuvent revenir à la normale dans le cas de thérapies adaptées.
La première méthode de dosage des "glycohémoglobines" a été mise au point par TRIVELLI en 1971 (10) . Cette méthode utilise une colonne de chromatographie d'échange de cations de façon à fractionner l'hémoglobine en 4 fractions en fonction de la charge : hémoglobine Ao (HbAo) , l'hémoglobine Ala (HbAla) , hémoglobine Alb (HbAlb) et hémoglobine Aie (HbAlc) . L'hémoglobine Ao représente la majeure partie (environ 92 %) , les hémoglobines Ala et Alb ne sont pas complètement séparées (2,5 %) et l'hémoglobine Aie représente 5,5 % de l'hémoglobine totale. Cette méthode qui n'est pas d'un usage facile en analyse de routine, a permis d'une part, d'établir des valeurs cliniques du dosage des hémoglobines glyquées, et d'autre part, de montrer des différences significatives dans les distributions des différentes hémoglobines chez les patients atteints de diabète et chez les patients normaux.
Au milieu des années 1970, des firmes commerciales (par exemple ISOLAB en 1977) ont développé et commercialisé des tests de dosage des hémoglobines glyquées (essentiellement HbAl) par échange d'ions. A cette époque, l'hémoglobine Aie était considérée comme étant la seule espèce glyquée de l'hémoglobine. L'hémoglobine Aie est une glycohémoglobine dont la séquence des aminoacides est identique à celle de l'hémoglobine. La seule différence qui l'en distingue est la fixation par voie non enzymatique (ou glycation) d'une molécule de glucose ou de glucose-6-phosphate sur le résidu valyl terminal de la chaîne (bêta) suivi par un réarrangement d'Amadori.
Une autre technique permet de quantifier l'hémoglobine Aie : il s'agit de l'isoélectrophorèse en gel d'agarose ou IEF (11-14) proposée par certaines firmes commerciales depuis le début des années 1980. Cette technique, bien que très performante, est très lourde à mettre en oeuvre et nécessite un matériel complexe et un personnel technique très qualifié.
En 1976, une technique de dosage utilisant l'acide thiobarbiturique (TBA) a été décrite par FLϋCKIGER et INTHERHALTER (15). Elle a été modifiée en 1979 (16, 17) et a révélé des applications intéressantes pour le dosage de nombreuses protéines glyquées (18, 19).
Par la suite, des systèmes HPLC utilisant des résines échangeuses d'ions pour séparer HbAl et HbAlc ont été développés (20-22) .
A la fin des années 1970, des travaux portant sur les hémoglobines glyquées mettent en évidence l'existence d'une fraction labile intermédiaire "glycosylable" de façon réversible et dont la concentration dépend du taux de glucose circulant (25-28). Les techniques de dosage par échange d'ions ne permettent pas de faire la distinction entre les hémoglobines glyquées labiles et stables. Il est donc nécessaire de prétraiter l'échantillon avant le dosage de façon à éliminer la fraction labile (29, 30). De plus, d'une part, ces techniques sont influencées par la température qui doit être impérativement contrôlée (31), et d'autre part, les variants de l'hémoglobine interfèrent et rendent l'interprétation des résultats difficile (32-34) .
Au milieu des années 1980, avec l'avènement des anticorps monoclonaux, les chercheurs ont tenté de mettre au point des dosages de type ELISA (22-24) . Aucun de ces tests n'a pu être commercialisé, ni même utilisé dans des laboratoires de recherche. La difficulté technologique réside dans le fait que les anticorps monoclonaux mis en oeuvre doivent être très spécifiques de l'hémoglobine glyquée et ne doivent pas reconnaître l'hémoglobine normale.
La chromatographie d'affinité est la méthode de dosage de l'hémoglobine glyquée la plus récente (35, 36). Cette méthode est basée sur la capacité de l'acide boronique à former un complexe avec les groupes cis- diol des sucres en particulier du fructose et du glucose (35). L'acide boronique (acide aminophenylboronique) est couplé à une matrice de chromatographie adaptée permettant de lier les hémoglobines glyquées. Les espèces glyquées liées sont éluées avec du sorbitol et quantifiées en spectrophotométrie (35-42). Cette technique est moins sensible aux variations de température et de pH que les techniques d'échange d'ions. Elle n'est pas influencée par la présence d'hémoglobine Al, F, S, C, E ou carbamylée.
Actuellement, trois méthodes peuvent être utilisées en routine : chromatographie d'échange d'ions, électrophorèse en gel d'agarose et chromatographie d'affinité (43). Toutes ces méthodes sont corrélées entre elles et ont une bonne précision, mais la ealibration et les procédures de contrôle de qualité sont difficilement standardisables.
En revanche, la technique dite au boronate (43) qui semble présenter le meilleur potentiel présente malgré tout des inconvénients qui sont un appareillage lourd et complexe, coût élevé de l'analyse, nécessité d'utiliser des personnels de haut niveau technique.
Etat de la technique sur les tests de diagnostic rapide
Il existe de nombreux tests de diagnostic rapide utilisant le principe de la chromatographie allié à celui de la constitution de paires d'affinité et de révélation par tout moyen simple et direct, notamment colorimétrique, et mettant en oeuvre plus particulièrement des réactions de type antigène- anticorps soit par formation de sandwich, soit par compétition ; à titre d'exemple, on pourra citer : le brevet EP 306 772 au nom de ABBOTT ; ce brevet décrit un dispositif de test rapide de type chromatographique qui fonctionne par capillarité, qui possède une zone dans laquelle est fixée un ligand de la substance à analyser, ainsi qu'un matériau de fixation spécifique marqué permettant la révélation de la réaction des deux parties de la paire d'affinité l'une avec l'autre. Le support de cette réaction est constitué de matériaux déjà utilisés pour la chromatographie, de type fibreux non tissé ou encore des substrats microporeux ou microgranulés.
Ce type de procédé ne met en oeuvre qu'un seul support et permet la réaction de test de type sandwich ou par compétition ; il nécessite en outre un traitement de la bande de support postérieure à la réaction et destiné à bloquer les sites de fixation éventuellement en excès sur ledit support ; enfin aucun type de contrôle interne de bon fonctionnement de la réaction n'y est prévu, ce qui peut rendre parfois l'interprétation dudit test difficile.
La demande de brevet WO 91/12528 au nom de HYGEIA SCIENCES décrit un dispositif de diagnostic rapide comprenant un support solide sur lequel les substances constitutives de paires d'affinité migrent par capillarité. Des réactions de type sandwich ou compétition obtenues par réaction d'antigènes avec des anticorps sont ensuite susceptibles d'être bloquées par un système de capture de type avidine/biotine ; la deuxième partie d'une paire d'affinités devant réagir avec la substance à doser peut être marquée par une substance de type or colloïdal et par une substance capturable de type biotine. Cependant ce test de type immunologique antigène-anticorps ne permet pas de discriminer dans un liquide biologique le pourcentage pour une protéine donnée de celle qui pourrait être glycosylée ou glyquée par rapport à celles qui ne le sont pas. En outre, rien dans ce brevet ne permet non plus d'éliminer une éventuelle réaction due à des faux positifs et notamment en cas de réaction contre des anticorps d'espèce qui auraient servi comme révélateurs de la réaction. D'autres demandes de brevet ou brevets décrivent des tests rapides de type bandelette, la totalité de ceux-ci étant basée sur des réactions de type antigène-anticorps. A titre d'exemple, on peut citer le brevet US 4 868 109, plus particulièrement appliqué à la sérologie, la demande de brevet WO 94/07141 qui est un double test dont une partie permet un contrôle et l'élimination des faux positifs, les demandes de brevet EP 291 194 et EP 560 411 décrivant un dispositif permettant le diagnostic rapide de la présence d'une substance dans un échantillon biologique, test immunologique faisant jouer également des réactions de type antigène-anticorps, la révélation étant réalisée par marque à l'or colloïdal.
Il en est de même des brevets EP 183 442, EP 286 371, EP 250 137, EP 207 152, EP 398 913, WO 94/07136, EP 174 247.
Aucun de ces tests dans aucun de leur mode de réalisation ne permet de discriminer clairement entre une protéine glyquée d'une protéine non glyquée lorsqu'elles sont présentes simultanément dans le liquide biologique à doser.
La figure la représente le dispositif dans son boîtier. La figure lb représente une vue en coupe longitudinale de profil des différents éléments du dispositif comprenant le filtre, le réservoir, une première membrane de nitrocellulose, la membrane activée de capture, la deuxième membrane de nitrocellulose comprenant la zone témoin de bon fonctionnement, la zone buvard hygroscopique, le tout
R posé sur un support plastique de type "Mylar"
La figure le représente une vue en coupe longitudinale vue de face.
La figure ld représente une coupe de la zone réservoir surmontée d'un filtre.
DESCRIPTION DE L'INVENTION :
L'invention concerne un procédé et un dispositif permettant le dosage rapide dans un échantillon d'une substance glyquée ou glycosylée ; compte tenu de l'importance des protéines glyquées et en particulier de l'hémoglobine glyquée dans le suivi de certaines pathologies, il sera toujours plus particulièrement fait référence à cette application ; cependant, l'homme du métier saura adapter le procédé et le dispositif décrits ci-dessous à tout dosage de protéine glyquée ou glycosylée autre que l'hémoglobine glyquée.
Le procédé de détermination et de dosage de la quantité d'une substance glyquée ou glycosylée présente dans un échantillon comprend les étapes suivantes : a) Appliquer ledit échantillon dans le réceptacle (16) d'un boitier plastique, ledit réceptacle (16) étant superposé à une zone constituée le cas échéant d'un filtre (25), d'un réservoir (20) contenant un ligand (A) marqué, cette zone réservoir (20) étant fixée sur ou contigύe à une membrane (22) ayant la propriété de permettre la migration par capillarité des solutions contenant les molécules à doser et les paires d'affinités éventuellement formées dans la zone réservoir, et d'avoir une faible affinité pour les molécules biologiques. b) Laisser l'échantillon migrer par capillarité à travers cette première zone jusqu'à une deuxième zone de capture constituée d'un support d'affinité (30) susceptible de retenir spécifiquement la molécule glyquée ou glycosylée recherchée, c) Laisser l'échantillon migrer par capillarité vers une troisième zone garante (40) de bon fonctionnement de la réaction, ladite zone étant imprégnée d'un ligand spécifique (B) du premier ligand (A), au niveau d'une bande (42), d) Lire la réponse par la présence ou l'absence d'une bande (31) au niveau d'une première fenêtre de lecture (17) laissant apparaître la zone (30) de la réaction et le bon fonctionnement de la réaction par observation d'une bande (42) à travers une deuxième fenêtre de lecture (18) , e) Le flux de liquide entre le dépôt dans le réceptacle (16) et la lecture du résultat de la réaction étant réalisé par l'existence d'un moyen absorbant (50) possédant des propriétés hygroscopiques importantes et contigύ à la membrane (40) ou au support d'affinité (30).
La première zone réactive et le réservoir sont avantageusement une seule et même zone, le réservoir contenant le ligand (A) de la première zone d'affinité, lequel y est présent alors sous une forme sèche réhydratable par l'application de l'échantillon dans lequel la protéine glyquée à doser est éventuellement présente.
Dans le procédé selon l'invention, la première zone réservoir (20) est constituée d'un matériau choisi pouvant jouer le rôle de contenant tel que la cellulose, les dérivés de la cellulose, un polyester de type nylon, des polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique, sous forme de poudre, de comprimés ou de couches multiples, et présentant avec ou sans traitement des propriétés de faible adsorption des molécules biologiques.
Dans cette première zone réactive, constituée du réservoir contenant le premier ligand (A) de la réaction, ledit ligand peut selon la substance glyquée recherchée, être notamment un anticorps, un glycane, une lectine, un substrat ou un inhibiteur enzymatique, une enzyme, un élément du couple haptoglobine- hémoglobine, ou toute molécule présentant une affinité particulière avec l'analyte à doser et susceptible de présenter une mobilité chromatographique après son couplage avec ladite molécule à doser. Le procédé de l'invention implique que le ligand présent dans la première zone soit marqué par une substance dont les caractéristiques physico-chimiques permettent de révéler la présence de l'analyte recherchée par mesure d'une adsorption ou d'une modification d'une lumière à une ou plusieurs longueurs d'ondes situées dans l'ultra-violet, le visible ou l'infrarouge. Cela peut être une simple détection visuelle par un marquage par des particules colloïdales contenant un métal, par exemple de l'or, marquage réalisé par des techniques maintenant classiques et telles que décrites par exemple dans les brevets US 4.859.612, US 4.313.734 ou les demandes de brevet EP 291.194 ou EP 560.411, EP 398.913.
Le ligand selon le procédé de l'invention peut également être couplé à un marqueur organo-métallique permettant de révéler la présence du produit ayant réagi par détection infrarouge, la longueur d'ondes étant dépendante dudit marqueur utilisé.
Il apparaît clairement que ce type de composé permet, en utilisant différents types de marqueur organo-métallique dont la présence est révélable à des longueurs d'ondes différentes en infrarouge, de procéder sur le même test à des détections de plusieurs analytes recherchées.
La deuxième zone réactive est une zone de capture. La capture signifie que le complexe molécule glyquée - ligand doit être spécifiquement retenu, à l'exclusion du complexe protéine non glyquée - ligand sachant que, dans le cas par exemple où la protéine à rechercher est l'hémoglobine glyquée, un anticorps monoclonal spécifique de l'hémoglobine ou l'haptoglobine pourra se lier aussi bien sur l'hémoglobine glyquée que sur l'hémoglobine non glyquée.
Dans le procédé de l'invention, la matrice de la deuxième zone réactive sera donc une matrice différente de celle de la première zone réactive et sera modifiée de façon à présenter des propriétés d'adsorption sélective du couple ligand/protéine recherchée, discriminante vis à vis du même couple lorsque la protéine n'est pas glyquée.
Cette réactivité sélective de la deuxième zone réactive peut être obtenue soit par utilisation d'une membrane échangeuse d'ions, par exemple de cations qui elle sera capable spécifiquement de retenir des substances présentant une charge négative, cela peut être également une membrane de nitrocellulose activée notamment par de l'acide aminophénylboronique de telle façon à former un complexe avec les groupes cis-diol des sucres et en particulier du fructose, et en particulier du glucose présent en liaison covalente sur l'hémoglobine glyquée ; cette réactivité peut être également obtenue :
- par greffage de résidus ou de molécules ionisables tels les résidus R-NH2, R-OH, R-SH,
- par greffage de résidus possédant des propriétés hydrophobes, tels des chaînes polycarbonées, des résidus de type R-CH3, R-phényl, par greffage de résidus ayant des propriétés chimiques réactives tels des résidus époxy, aldéhyde, carboxyl, halogényl, par greffage de résidus ayant des propriétés biochimiques ou immunologiques appropriées tels un glycane, une lectine, un substrat ou inhibiteur enzymatique, un élément du couple avidine-biotine, un élément du couple hémoglobine-haptoglobine, ou toute molécule présentant une affinité particulière avec 1'analyte à doser recherché.
Il apparaît clairement que ce qui est important dans le principe du procédé décrit ci-dessus, c'est qu'au niveau de la deuxième zone réactive, il y ait capture spécifique d'un complexe préalablement formé entre la protéine recherchée et le ligand marqué présent dans la première zone réactive ; aussi il y a réversibilité des positions entre les première et deuxième zone du ligand marqué et de la substance ayant une affinité particulière pour les sucres portés par la substance recherchée. A titre d'exemple, toujours dans le cas de l'hémoglobine glyquée, si la première zone réactive comprend un anticorps anti-hémoglobine ou de 1'haptoglobine, l'un ou l'autre marqué par de l'or colloïdal, la deuxième zone devra comprendre par exemple une résine d'échange d'ions susceptible d'absorber spécifiquement l'hémoglobine glyquée ou une matrice de chromatographie greffée avec une lectine, ou enfin une membrane activée au boronate ; si au contraire, la première zone réactive contient un ligand spécifique d'une protéine glyquée, par exemple une lectine, alors la deuxième zone réactive devra comprendre par exemple une substance telle un anticorps anti-hémoglobine couplé au support d'affinité qui pourra discriminer parmi toutes les protéines glyquées présentes dans l'échantillon l'hémoglobine glyquée.
La membrane de la deuxième zone peut être composée de tout matériau, seul ou en mélange, présentant les propriétés d'adsorption sélective de l'analyte à doser et de migration et de capillarité permettant à l'échantillon de se déplacer et d'entraîner l'analyte à doser à travers les zones réactives ; cette deuxième zone réactive peut être composée de deux parties distinctes et contigues ayant l'une des deux ou les deux propriétés énoncées ci-dessus.
Si la réactivité de la membrane de la deuxième zone peut être obtenue directement par ses propriétés intrinsèques, par exemple rapport hydrophobicité/ hydrophilicité adéquat, la charge ionique ou la capacité d'absorption, ou après traitement approprié par des greffages de résidus ou des molécules telles que citées plus haut, il sera cependant préféré pour un test simple d'utiliser dans la première zone un ligand marqué reconnaissant spécifiquement la partie proteique de la protéine glyquée ou glycosylée et dans la deuxième zone une résine d'échange d'ions, par exemple cationique, ou un support d'affinité comportant une lectine permettant de discriminer dans le premier couple d'affinité formé dans la première zone comprenant le ligand (A) , celui qui comprendra la molécule de sucre, de le bloquer au niveau de cette deuxième zone d'affinité et, par une lecture directe et simple, d'en mesurer la présence et la quantité.
Le procédé de l'invention est caractérisé en ce que le flux de liquide à travers le dispositif est généré par un matériau hygroscopique (50) , par exemple de la ouate de cellulose, des dérivés de cellulose, des polyesters de type nylon, des polymères fibreux ou microporeux du type polyester haute densité, ou toutes fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique, sous forme de poudre comprimée ou de couches multiples et susceptibles de drainer par capillarité le liquide déposé dans le réservoir, jouant ainsi un rôle de buvard.
Cette zone buvard peut, en outre, être précédée en amont par une zone (40) de contrôle de bon fonctionnement de la réaction et éliminer toute réaction entre un anticorps monoclonal utilisé à titre de ligand avec des anticorps anti-anticorps de souris, de rat ou autre espèce qui auraient pu pré-exister dans l'échantillon à doser.
Cette zone (40) peut également contenir un témoin de bon fonctionnement de la réaction (42) .
La présente invention est également relative à un dispositif (10) pour la détection et la détermination d'une protéine glyquée ou glycosylée présente dans un échantillon et caractérisé en ce qu'il comprend au moins trois zones : a) Une zone réservoir (20) contenant un ligand spécifique de la protéine glyquée, le cas échéant surmonté d'un moyen de filtration (25) , cette zone réservoir (20) étant fixée sur une membrane (22) ayant la propriété de permettre la migration par capillarité, b) Une zone réactive composée d'une membrane activée (30) présentant des propriétés d'adsorption sélective de la substance à doser et des propriétés de migration par capillarité, contigùe, ou superposée partiellement à la membrane (22), et constituée d'un matériau différent de la membrane (22) , c) Le cas échéant, une zone constituée d'une membrane (40) sur laquelle a été adsorbée une molécule biologique (42) permettant de vérifier le bon fonctionnement de la réaction, d) Un moyen absorbant (50) permettant de favoriser le flux de liquide à travers les différentes zones décrites en a),b),c), et contigύ à la membrane activée (30) ou à la membrane (40) de la zone de bon fonctionnement, l'ensemble (12) comprenant la zone réservoir (20) , le moyen de filtration (25) , la membrane activée (30) , la membrane (40) et le moyen absorbant (50) étant fixés sur un film de polyethylène (60) de type "Mylar", l'ensemble (12) pouvant lui-même être positionné dans un boîtier (14) muni d'un réceptacle (16) permettant de recevoir 0,05 ml à 0,5 ml de liquide à tester, et de deux fenêtres, la première (17) laissant apparaître le résultat de la réaction et la deuxième (18) laissant apparaître le témoin de bon fonctionnement de la réaction.
La zone réservoir (20) contient un ligand (A) pouvant former une première paire d'affinité avec la substance à doser, le ligand étant modifié ou susceptible d'être modifié par un marqueur permettant de le localiser seul ou inclus dans une première paire d'affinité, ce réservoir (20) étant superposé ou adjacent à une membrane (22) traitée de telle façon qu'elle présente de faibles capacités d'adsorption de molécules biologiques et de fortes propriétés de migration et de capillarité permettant à l'échantillon de se déplacer et d'entraîner la substance à doser à travers les zones réactives.
La deuxième zone réactive de l'ensemble (12) est composée d'une membrane activée (30) présentant des propriétés d'absorption sélective de la substance à doser (par exemple par interaction ionique, par interaction hydrophobe, par affinité, par immunoaffinité) . Une propriété importante de cette deuxième zone est qu'elle peut être composée d'un matériau ou d'un mélange de plusieurs matériaux qui en tout état de cause sont différents de ceux du matériau de la première zone réactive. Dans cette deuxième zone d'affinité, le support lui-même est modifié de telle façon qu'il présente une affinité avec le couple d'affinité formé dans la première zone, et par conséquent cette deuxième zone sert en même temps de capture et d'arrêt de la migration de tous les complexes d'affinité formés contenant la molécule recherchée, à l'exclusion des complexes d'affinité formés n'ayant pas la molécule recherchée.
Il s'agit donc d'appliquer ici le principe de la chromatographie par interaction ou par affinité permettant ainsi de bloquer la substance recherchée.
Le dispositif comprend également un élément absorbant dont le rôle est de provoquer ou de favoriser le flux de liquide à travers les zones précédentes. Cet élément peut être composé d'un ou plusieurs matériaux ayant des propriétés hygroscopiques. Cet élément peut en outre et le cas échéant être précédé par une zone de contrôle de bon fonctionnement de la réaction : par exemple si un anticorps antihémoglobine a été utilisé dans la première zone d'affinité, l'hémoglobine non glyquée pourra être utilisée dans la zone de contrôle afin d'éliminer des réactions non spécifiques qui auraient pu avoir lieu entre des substances présentes dans le liquide biologique et la membrane d'affinité (30). L'ensemble des éléments contigùs ou partiellement superposés (20) , (25) , (30) , (40) et (50) ou une partie de cet ensemble dépourvu des éléments (25) ou (40) ou les deux, est placé sur un support plastique (60) , laissant apparaître des fenêtres. Ces trois parties peuvent également être placées de manière superposée ou en couches.
Le dispositif de l'invention décrit ci-dessus permet en un test simple, rapide en une seule étape de discriminer dans un liquide donné, une forme moléculaire dépourvue de sucre et une forme moléculaire ayant subi une glycation ou une glycosylation.
Le dispositif allie donc le principe de la chromatographie à celui de la chimie sèche ; en effet, le dispositif de l'invention comprend dans ses deux zones réactives, d'une part le ligand marqué de la protéine à rechercher, et d'autre part une membrane d'affinité ayant soit des propriétés intrinsèques permettant de capturer de façon spécifique le couple d'affinités ainsi marqué, par exemple une charge ionique, ou alors après traitement approprié portant des groupe greffés de type molécule ionisable par exemple R-NH2, R-OH, R-COH, R-SH, ou hydrophobe du type R-CH3, R-phényl ou des propriétés chimiques réactives de type époxy, aldéhyde, carboxyl, halogényl ou enfin des propriétés biochimiques ou immunologiques appropriées, par exemple anticorps, glycane, peptide ou tout type de molécule déjà cité plus haut présentant une affinité particulière avec l'analyte à doser. Certains des éléments de ce dispositif sont préalablement traités afin, d'une part d'éliminer des liaisons non spécifiques entre la protéine à doser et les différents supports et d'autre part, assurer une longue conservation sans altération des différentes molécules biologiques immobilisées dans le dispositif. Le réservoir (20) est préalablement à son utilisation saturé par du tampon PBS additionné de sucrose 10 % et de lait demi-écrémé en poudre à 5 % ; après 15 minutes à température ambiante, le réservoir est séché à 37°C±2 pendant une heure. Les zones de migration, notamment les zones (25) et (40) sont en un matériau de type nitrocellulose qui ont une forte affinité pour les molécules biologiques ; cette forte affinité est utilisée notamment dans la zone (40) de test de bon fonctionnement de la réaction pour fixer la molécule permettant de vérifier ce bon fonctionnement, par exemple un anticorps anti-haptoglobine ou de l'hémoglobine dans le cas du test de l'hémoglobine glyquée. Puis après la fixation des molécules biologiques, les membranes sont saturées par une solution tamponnée contenant des protéines, notamment du lait écrémé en poudre.
L'ensemble comportant le ligand et éventuellement les molécules greffées est ensuite déshydraté par toute technique appropriée et notamment la lyophilisation, ce qui permet une conservation de plusieurs mois de ce dispositif prêt à l'emploi. L'addition au moment de l'emploi dans le réservoir (20) de l'échantillon liquide, par l'intermédiaire du réceptacle (16), conduit à une réhydratation immédiate du ligand et permet la migration par capillarité dirigée par l'absorbant (50) grâce à ces propriétés hygroscopiques.
Les différentes zones décrites ci-dessus dans le dispositif de l'invention sont placées sans discontinuité dans un module en matière plastique ou boîtier (14) permettant à la fois une bonne préhension de ce dispositif et laissant apparaître les deux zones réactives, à savoir la zone de capture par l'intermédiaire d'une fenêtre (17) et la zone de contrôle (18) .
La présente invention est également relative à l'utilisation d'un dispositif tel que décrit ci-dessus pour mesurer la quantité de substance glyquée ou glycosylée dans un échantillon contenant la même substance, soit à l'état glyqué soit à l'état glycosylé.
Une utilisation qui parait tout à fait avantageuse compte tenu de 1*état de la technique décrite plus haut, est un dosage de l'hémoglobine glyquée qui apparait chez les patients diabétiques ; un tel dosage d'hémoglobine glyquée peut permettre à un médecin ou au patient lui-même de suivre son taux de glycémie soit en prévention soit en suivi de traitement médicamenteux.
Outre l'application au dosage de l'hémoglobine glyquée dans le suivi du diabète, tout type d'application peut être envisagé ; il peut s'agir notamment de vérifier l'état de glycosylation d'une molécule recombinante sécrétée dans une culture de cellules eucaryotes ; un tel suivi peut être particulièrement avantageux pour les scientifiques qui chercheraient à déterminer la meilleure cellule hôte pour exprimer une protéine recombinante en utilisant le critère de la qualité de la glycosylation.
L'originalité du type de dispositif et de procédé de mise en oeuvre décrit ci-dessus, est de comporter différents types de zones réactives juxtaposées ou superposées, dont certaines d'entre elles utilisent directement les propriétés de chromatographie d'affinités, ou par échange d'ions utilisées dans les méthodes de chromatographie classique, et ce combinées avec les réactions d'affinités classiques, dans une phase mobile décrite dans le test de diagnostic rapide de l'état de la technique tel que mentionné plus haut.
Ce test de diagnostic permet en une seule étape, sans étape de lavage ni de révélation enzymatique, ni utilisation d'appareillages ou de connaissances techniques particulières, de doser la présence d'une protéine glyquée dans un échantillon. En effet, le manipulateur applique directement l'échantillon à doser sur le réservoir contenant le traceur spécifique de la protéine glyquée à doser, ainsi que les tampons destinés à favoriser la liaison entre la protéine glyquée à doser, et la membrane réactive. L'ensemble pénètre dans le dispositif grâce au réceptacle (16) et traverse les différentes zones réactives par capillarité grâce à l'action de la zone jouant le rôle d'absorbant. Si l'échantillon contient l'analyte à doser, celui-ci réagit avec le ligand marqué préalablement présent dans le réservoir (20) ; le complexe est ensuite entrainé par le flux capillaire de l'échantillon à travers la membrane jusqu'à la deuxième surface réactive où il est piégé grâce à la nature même de cette zone de réactivité. Si une coloration apparait, le test est positif. Dans le cas contraire, l'échantillon ne contient pas l'analyte glyqué ou glycosylé recherché. Ce test est sensible, la deuxième zone réactive, également zone de capture, par sa nature même, conduit à une phénomène de concentration des réactifs sur la membrane ; il peut en outre être quantitatif grâce aux caractéristiques intrinsèques des réactifs : en effet, une coloration apparait à partir d'une concentration prédéterminée de l'analyte à doser, liée à un équilibre entre le ligand et le marquage du ligand. Enfin, ce type de test présente un coût unitaire très faible. D'autres avantages et précisions apparaitront à la lecture des exemples ci-après concernant le dosage de l'hémoglobine glyquée et aux figures.
Exemple 1 : Préparation d'un dispositif selon l'invention permettant de doser l'hémoglobine glyquée : technique par affinité.
I - PREPARATION DES REACTIFS
A - Préparation de la solution de traceur
Le traceur pourra être composé, par exemple d'un anticorps polyclonal ou monoclonal couplé à des particules d'or colloïdal. a) Cas d'un anticorps polyclonal
L'anticorps est dialyse contre une solution de borate de sodium à 2 mM tamponnée à pH 9, pendant deux heures et à température ambiante.
La concentration de la solution d'anticorps est ajustée à 0,1 mg/ml avec la solution de borate de sodium à 2 mM tamponnée à pH 9.
A 2 ml de la solution d'anticorps sont ajoutés 20 ml d'une suspension de microparticules d'or colloïdal dont le diamètre moyen est compris entre 10 et 30 nm.
Le mélange est mis sous agitation pendant cinq minutes à température ambiante.
Il est centrifugé à 15 000 g pendant trente minutes et à 4°C.
Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 5 ml d'une solution de Tris à 20 mM tamponnée à 7,4 et contenant 1% de sérum-albumine bovine, 0,1% de Tween 20 et 0,5% de polyéthylène glycol 3000.
Le mélange réactionnel est à nouveau centrifugé deux fois dans les mêmes conditions.
A l'issue de la troisième centrifugation, le culot est repris dans 1 ml d'une solution de Tris à 20 mM tamponnée à 7,4 et contenant 1% de sérum-albumine bovine, 0,1% de Tween et 0,5% de polyéthylène glycol 3000. La densité optique de la solution est mesurée à 595 nm.
La solution de traceur ainsi obtenue est stable six mois à 4°C. b) Cas d'un anticorps monoclonal
Le point isoélectrique de l'anticorps considéré est préalablement déterminé par electrophorese en isoélectrofocalisation (IEF) .
L'anticorps est dyalisé contre une solution de borate de sodium à 2 mM tamponnée à un pH supérieur de 0,5 unité au point isoélectrique de l'anticorps considéré, pendant deux heures et à température ambiante.
La suite du protocole est rigoureusement identique à ce qui a été énoncé plus haut concernant un anticorps polyclonal. c) Cas particulier de l'haptoglobine
Le protocole adopté sera celui concernant les anticorps polyclonaux. B - Préparation de la première zone réactive
La première zone réactive ou "réservoir" (20) est préparée par imprégnation de la phase solide par un tampon permettant de placer l'échantillon à doser dans des conditions idéales de pH et de force ionique. Ce tampon sera choisi en fonction de la nature de la seconde zone réactive ou "support de la réaction" (30) .
Nous pouvons citer à titre d'exemple, dans le cas où le support de la réaction serait une membrane de nitrocellulose activée par l'acide aminophénylboronique, un tampon à base d'acétate d'ammonium.
Une feuille de ouate de cellulose est immergée dans une solution d'acétate d'ammonium à 30 mM tamponnée à pH 8,2 pendant quinze minutes à température ambiante et sous légère agitation. La feuille est mise à sécher dans une étuve à 37°C pendant trois heures.
Si son utilisation n'est pas immédiate, la feuille peut être stockée sous vide, en présence de dessicant et à température ambiante. Dans ces conditions, elle est stable un an.
Sinon, la feuille est découpée aux dimensions voulues et le traceur y est déposé à raison de 20 μl d'une solution de densité optique à 595 nm comprise entre dix et quinze unités d'absorption (UA) .
Les réservoirs ainsi obtenus sont séchés dans une étuve à 37°C pendant trois heures.
Si leur utilisation n'est pas immédiate, les réservoirs peuvent être stockés sous vide, en présence de dessicant et à température ambiante. Dans ces conditions, ils sont stables un an. C - Préparation de la deuxième zone réactive
La deuxième zone réactive ou "support de la réaction" est constituée, par exemple d'une membrane de nitrocellulose activée chimiquement par l'acide aminophénylboronique.
La membrane est immergée dans une solution d'acétate d'ammonium à 30 mM tamponnée à pH 8,2, pendant quinze minutes à température ambiante et sous légère agitation.
La membrane est mise à sécher dans une étuve.
La membrane est découpée aux dimensions voulues.
Si son utilisation n'est pas immédiate, la membrane peut être stockée sous vide, en présence de dessicant et à température ambiante. Dans ces conditions, elle est stable un an. II - MONTAGE DU DISPOSITIF
Les zones réactives ainsi obtenues et découpées aux dimensions voulues sont lyophilisées et assemblées de manière jointive dans un module en matière plastique (14) . Les dispositifs obtenus sont emballés sous vide en présence d'un dessicant. Dans ces conditions, ils sont stables un an à température ambiante.
Exemple 2 : Préparation d'un dispositif de dosage de l'hémoglobine glyquée : technique par échange d'ions.
I - PREPARATION DES REACTIFS
A - Préparation de la solution de traceur
Le protocole est identique à celui de l'exemple 1. B - Préparation de la première zone réactive
Dans le cas de la mise en oeuvre de la technique par échange d'ions, nous pouvons citer à titre d'exemple, si le support de la réaction est de nature échangeur de cations (par exemple, les membranes SartobindR S de Sartorius) , un tampon à base de malonate de sodium.
Une feuille de ouate de cellulose est immergée dans une solution de malonate de sodium à 25 mM tamponnée à pH 5,7 pendant quinze minutes à température ambiante et sous légère agitation.
La feuille est mise à sécher dans une étuve à 37°C pendant trois heures.
Si son utilisation n'est pas immédiate, la feuille peut être stockée sous vide, en présence de dessicant et à température ambiante. Dans ces conditions, elle est stable un an.
Sinon, la feuille est découpée aux dimensions voulues et le traceur y est déposé à raison de 20 μl d'une solution de densité optique à 595 nm comprise entre dix et quinze unités d'aborption (UA) .
Les réservoirs ainsi obtenus sont séchés dans une étuve à 37°C pendant trois heures.
Si leur utilisation n'est pas immédiate, les réservoirs peuvent être stockés sous vide, en présence de dessicant et à température ambiante. Dans ces conditions, ils sont stables un an. C - Préparation de la deuxième zone réactive La deuxième zone réactive ou "support de la réaction" est constituée, par exemple, d'une membrane échangeuse de cations de type Sartobind" S.
La membrane est immergée dans une solution de malonate de sodium à 25 mM tamponnée à pH 5,7, pendant quinze minutes à température ambiante et sous légère agitation. La membrane est mise à sécher dans une étuve à 37°C pendant trois heures.
La membrane est découpée aux dimensions voulues.
Si son utilisation n'est pas immédiate, la membrane peut être stockée sous vide, en présence de dessicant et à température ambiante. Dans ces conditions, elle est stable un an. D ~ Préparation de la troisième zone réactive
Le protocole est identique à celui de l'exemple 1. II - MONTAGE DU DISPOSITIF
Les trois zones réactives ainsi obtenues et découpées aux dimensions voulues sont lyophilisées et assemblées de manière jointive dans un module en matière plastique (14) . Les tests obtenus sont emballés sous vide en présence d'un dessicant. Dans ces conditions, ils sont stables un an à température ambiante. Exemple 3 : Réalisation d'un diagnostic
L'utilisateur du dispositif de l'invention pourra déposer dans le réceptacle (16) 50 μl de sang total et 150 μl de tampon de migration dans le réceptacle (16) prévu à cet effet. Si la substance recherchée est dans l'urine, l'utilisateur déposera alors dans le réceptacle (16) prévu à cet effet 150 μl d'urine.
Sachant que dans le réservoir (20), au moins 0,5 μg de protéine marquée à l'or colloïdal ont été préalablement fixés, l'utilisateur du test pourra après dépôt de son échantillon observer la présence ou l'absence d'une bande violette dans la fenêtre de lecture (16), la présence ou l'absence de cette bande étant le reflet direct de la présence ou de l'absence d'hémoglobine glyquée recherchée dans l'échantillon. La présence d'une deuxième bande violette dans la fenêtre de contrôle du bon fonctionnement de la réaction (18) est nécessaire à 1•interprétation de la lecture de la présence d'une bande dans la fenêtre de lecture du test (17).
L'homme du métier saura en faisant bon usage de la combinaison de ces différentes zones, adapter le dispositif de 1•invention à la protéine glyquée ou glycosilée qu'il souhaite rechercher et également à la dose minimum de ce type de protéine qu'il souhaite détecter.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination et de dosage de la quantité d'une substance glyquée ou glycosylée présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) Appliquer ledit échantillon dans le réceptacle (16) d'un boitier plastique, ledit réceptacle (16) étant à l'aplomb à une zone constituée le cas échéant d'un filtre (25), d'un réservoir (20) contenant un ligand (A) marqué, cette zone réservoir (20) étant contigùe à une membrane (22) ayant la propriété de permettre la migration par capillarité des solutions contenant les molécules à doser et les paires d'affinités éventuellement formées dans la zone réservoir et d'avoir une faible affinité pour les molécules biologiques, b) Laisser l'échantillon migrer par capillarité à travers cette première zone jusqu'à une deuxième zone de capture constituée d'un support d'affinité activé (30) susceptible de retenir spécifiquement la molécule glyquée ou glycosylée recherchée, ledit support étant de nature différente de la membrane (22) , c) Laisser l'échantillon migrer par capillarité vers une troisième zone garante (40) de bon fonctionnement de la réaction, ladite zone étant imprégnée au niveau d'une bande (42) d'un ligand spécifique (B) du premier ligand (A) , d) Lire une réponse par la présence ou l'absence d'une bande (31) au niveau d'une première fenêtre de lecture (17) laissant apparaître la zone (30) et le bon fonctionnement de la réaction par observation d'une bande (42) à travers une deuxième fenêtre de lecture (18) , e) Le flux de liquide entre le dépôt dans le réceptacle (16) et la lecture du résultat de la réaction étant réalisé par l'existence d'un moyen absorbant (50) possédant des propriétés hygroscopiques importantes, contigu à la membrane (40) .
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réservoir (20) est constitué d'un matériau choisi parmi la fibre de verre, la cellulose, les dérivés de cellulose, le nylon, des polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique sous forme de poudre, de comprimés ou de couches multiples.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le réservoir (20) est constitué d'une feuille de ouate de cellulose.
4. Procédé selon l'une des revendications l à 3, caractérisé en ce que le ligand (A) est un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique de la susbtance glyquée.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand (A) est l'haptoglobine.
6. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le ligand (A) est couplé à des particules colloïdales contenant un métal, notamment de l'or.
7. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le ligand est couplé à un marqueur organo- étal1ique.
8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support d'affinité (30) est une membrane échangeuse d'ions, notamment échangeuse de cations.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support d'affinité (30) est une membrane de nitrocellulose activée, notamment par l'acide aminé phénylboronique.
10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réactivité sélective du support d'affinité (30)est obtenue, soit :
- par greffage de résidus ou de molécules ionisables tels les résidus R-NH2, R-OH, R-COH, R-SH,
- par greffage de résidus possédant des propriétés hydrophobes tels des chaînes polycarbonnées, des résidus de type R-CH3, R-phényl, par greffage de résidus ayant des propriétés réactives tels des résidus époxy, aldéhyde, carboxyl, halogényl, par greffage de résidus ayant des propriétés biochimiques ou immunologiques appropriées tels un glycane, une lectine, un substrat ou inhibiteur enzymatique, un élément du couple avidine-biotine, un élément du couple hémoglobine-haptoglobine, ou toute molécule présentant une affinité particulière avec 1'analyte à doser.
11. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le support d'affinité (30) est contigu à une zone de contrôle de bon fonctionnement de la réaction (40) constituée d'une membrane préalablement imprégnée d'un ligand (B) spécifique du premier ligand (A) au niveau d'une bande (42).
12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la zone constituée d'un matériau hygroscopique, notamment la ouate de cellulose ou des dérivés de cellulose, de nylon, d'un polymère fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique, sous forme de poudre, de comprimés ou de couches multiples.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la lecture de la réaction est effectuée par moyen optique dans la lumière visible ou dans l'infrarouge.
14. Dispositif (10) pour la détection et la détermination d'une protéine glyquée ou glycosylée présente dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend au moins trois zones dont deux zones réactives : a) Une zone réservoir (20) contenant un ligand spécifique de la protéine glyquée, le cas échéant surmonté d'un moyen de filtration (25) , cette zone réservoir (20) étant fixée sur une membrane (22) ayant la propriété de permettre la migration par capillarité, b) Une zone réactive composée d'une membrane activée (30) présentant des propriétés d'adsorption sélective de la substance à doser et des propriétés de migration par capillarité, contigùe, ou superposée partiellement à la membrane (22) , et constitué d'un matériau différent de la membrane (22) , c) Le cas échéant une zone constituée d'une membrane (40) sur laquelle a été adsorbée une molécule biologique (42) permettant de vérifier le bon fonctionnement de la réaction, d) Un moyen absorbant (50) permettant de favoriser le flux de liquide à travers les différentes zones décrites en a),b),c), et contigu à la membrane activée (30) ou à la membrane (40) de la zone de bon fonctionnement, l'ensemble (12) comprenant la zone réservoir (20) , le moyen de filtration (25) , la membrane activée (30) , la membrane (40) et le moyen absorbant (50) étant fixés sur un film de polyéthylène (60) de type "Mylar" R , l'ensemble (12) pouvant lui- même être positionné dans un boîtier (14) muni d'un réceptacle (16) permettant de recevoir 0,05 ml à 0,5 ml de liquide à tester, et de deux fenêtres, la première (17) laissant apparaître le résultat de la réaction et la deuxième (18) laissant apparaître le témoin de bon fonctionnement de la réaction.
15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le réservoir (20) est constituée d'un matériau choisi parmi la fibre de verre, la cellulose, les dérivés de cellulose, le nylon, des polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique sous forme de poudre, de comprimés ou de couches multiples, et le réservoir est constitué d'une feuille de ouate de cellulose.
16. Dispositif selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce que avant usage, l'ensemble des éléments qui lui sont constitutifs sont déshydratés.
17. Dispositif selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que le ligand de la première zone réactive est choisie parmi les molécules présentant une affinité particulière pour la substance glyquée à doser, notamment les anticorps monoclonaux ou polyclonaux, l'haptoglobine, les lectines.
18. Dispositif selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce que le ligand (A) est couplé à des particules colloïdales contenant un métal, notamment de l'or.
19. Dispositif selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce que le ligand est couplé à un marqueur organo-métallique.
20. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que la zone réactive (30) est une membrane échangeuse d'ions, notamment échangeuse de cations.
21. Dispositif selon la revendication 14, la zone réactive (30) est une membrane de nitrocellulose activée, notamment par l'acide aminé phénylboronique.
22. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que la réactivité sélective de la zone réactive (30) est obtenue soit : - par greffage de résidus ou de molécules ionisables tels les résidus R-NH2, R-OH, R-COH, R-SH,
- par greffage de résidus possédant des propriétés hydrophobes tels des chaînes polycarbones, des résidus de type R-CH3, R-phényl, par greffage de résidus ayant des propriétés réactives tels des résidus époxy, aldéhyde, carboxyl, halogényl, par greffage de résidus ayant des propriétés biochimiques ou immunologiques appropriées tels un glycane, une lectine, un substrat ou inhibiteur enzymatique, un élément du couple avidine-biotine, un élément du couple hémoglobine-haptoglobine, ou toute molécule présentant une affinité particulière avec 1'analyte à doser.
23. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que la zone buvard est constituée d'un matériau hygroscopique, notamment la ouate de cellulose ou des dérivés de cellulose, de nylon, d'un polymère fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique, sous forme de poudre, de comprimés ou de couches multiples.
24. Dispositif selon l'une des revendications 14 à 23, caractérisé en ce que les différentes zones réactives sont placées sans discontinuité dans un module en matière plastique laissant apparaître les deux zones (30) et (40) réactives par l'intermédiaire de fenêtres (17) et (18) .
25. Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications 14 à 24 pour mesurer la quantité de substance glyquée ou glycosylée dans un échantillon contenant la même substance à l'état non glyquée ou glycosylée.
26. Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que la substance est l'hémoglobine glyquée et que l'utilisation en est le suivi de la glycémie chez les sujets diabétiques.
27. Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que la substance est une protéine glycosylée sécrétée par un hôte cellulaire recombinant contenant le gène de la protéine comme gène hétérologue.
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