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WO1995026409A1 - ADENOVIRUS RECOMBINANTS CODANT POUR LES FACTEURS DE CROISSANCE DES FIBROBLASTES BASIQUES (bFGF) - Google Patents

ADENOVIRUS RECOMBINANTS CODANT POUR LES FACTEURS DE CROISSANCE DES FIBROBLASTES BASIQUES (bFGF) Download PDF

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WO1995026409A1
WO1995026409A1 PCT/FR1995/000374 FR9500374W WO9526409A1 WO 1995026409 A1 WO1995026409 A1 WO 1995026409A1 FR 9500374 W FR9500374 W FR 9500374W WO 9526409 A1 WO9526409 A1 WO 9526409A1
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WO
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bfgf
adenovirus
dna sequence
promoter
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/000374
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English (en)
Inventor
Marc Abitbol
Jacques Mallet
Michel Perricaudet
Frédéric Revah
Paul Roustan
Emmanuelle Vigne
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
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Publication date
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Priority to JP7525005A priority patent/JPH09510621A/ja
Priority to EP95914419A priority patent/EP0753067A1/fr
Priority to US08/718,482 priority patent/US6685934B1/en
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    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the DNA sequence, coding for all or part of bFGF or one of its derivatives, can also be an antisense sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of bFGF.
  • the heterologous DNA sequence comprises a gene coding for an antisense RNA capable of controlling the translation of the mRNA of bFGF.
  • the antisense sequence may be all or only part of the DNA sequence, coding for bFGF, inserted in the reverse orientation into the vector according to the invention.
  • these expression sequences can be modified by adding activation, regulation sequences or allowing tissue-specific expression. It may in fact be particularly advantageous to use expression signals which are active specifically or mainly in nerve cells, so that the DNA sequence is only expressed and produces its effect when the virus has actually infected a nerve cell.
  • expression signals which are active specifically or mainly in nerve cells, so that the DNA sequence is only expressed and produces its effect when the virus has actually infected a nerve cell.
  • the invention relates to a defective recombinant adenovirus comprising a cDNA sequence coding for the human basic fibroblast growth factor (hbFGF) under the control of the LTR-RSV promoter.
  • hbFGF human basic fibroblast growth factor
  • the particularly advantageous properties of the vectors of the invention derive in particular from the construction used (defective adenovirus, deleted from certain viral regions), from the promoter used for the expression of the sequence coding for bFGF (viral promoter or tissue-specific preferably ), and methods of administration of said vector, allowing efficient expression and in appropriate tissues of bFGF.
  • the present invention thus provides viral vectors usable directly in gene therapy, particularly suitable and effective for directing the expression of bFGF in vivo.
  • the present invention thus offers a particularly advantageous new approach for the treatment and / or prevention of neurodegenerative diseases.
  • the cultured cells are then infected with recombinant adenoviruses, to give them the capacity to produce bFGF.
  • the infection is carried out in vitro according to techniques known to those skilled in the art. In particular, according to the type of cells used and the number of copies of virus per cell desired, a person skilled in the art can adapt the multiplicity of infection and possibly the number of infection cycles carried out. It is understood that these steps must be carried out under conditions of appropriate sterility when the cells are intended for administration in vivo.
  • the doses of recombinant adenovirus used for the infection of the cells can be adapted by a person skilled in the art according to the aim sought.
  • the conditions described above for administration in vivo can be applied to infection in vitro.
  • compositions according to the invention advantageously comprise a support allowing the anchoring of the cells.
  • anchoring designates any form of biological and / or chemical and / or physical interaction resulting in the adhesion and / or fixing of the cells on the support.
  • the cells can either cover the support used, or penetrate inside this support, or both. It is preferred to use within the framework of the invention a solid, non-toxic and / or biocompatible support.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • Figure 1 Representation of the vector pLTR IX-hbFGF
  • This example describes the construction of a vector comprising a DNA sequence coding for rat bFGF under the control of a promoter constituted by the LTR of RSV.

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Abstract

La présente invention concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue codant pour les facteurs de croissance des fibroblastes basiques (bFGF), leur préparation, et leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des maladies neurodégénératives.

Description

ADENOVIRUS RECOMBINANTS CODANT POUR LES FACTEURS DE CROISSANCE DES
FIBROBLASTES BASIQUES (bFGF)
La présente invention concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN codant pour les facteurs de croissance des fibroblastes basiques. L'invention concerne également la préparation de ces vecteurs, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation thérapeutique, notamment en thérapie génique pour le traitement et/ou la prévention des maladies neurodégénératives.
L'augmentation de la durée de vie dans les pays occidentaux s'accompagne d'une croissance régulière des maladies neurodégénératives de type maladie d'Alzheimer, maladie de Parkinson, chorée de Huntington, sclérose latérale amyotrophique, etc. C'est ainsi que la maladie de Parkinson, par exemple, atteint 4% des personnes âgées de plus de 65 ans, et la maladie d'Alzheimer atteint 10% des plus de 70 ans et 30% des plus de 80 ans. De manière générale, toutes ces maladies résultent d'une perte progressive de cellules neuronales dans le système nerveux central, voire au sein de structures très localisées comme dans le cas de la maladie de Parkinson.
Au cours de ces dernières années de nombreuses recherches ont été développées en vu de comprendre les mécanismes de ces dégénérescences liées aux vieillissement pour mettre au point des moyens de traitement mais également des moyens de prévention, par la thérapie génique.
Les facteurs trophiques sont une classe de molécules ayant des propriétés de stimulation de la croissance neuritique ou de la survie des cellules nerveuses. Le premier facteur possédant des propriétés neurotrophiques, le NGF ("Nerve Growth Factor"), a été caractérisé il y a une quarantaine d'années (pour revue, voir Levi- Montalcini et Angelleti, Physiol. Rev. 48 (1968) 534). D'autres facteurs neurotrophiques ont été identifiés, et notamment les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF). Les facteurs de croissance des fibrobastes (FGF) dont les formes acides et basiques ont été identifiées, subissent un transport rétrograde dans plusieurs population neuronales dont le sytème nigro-strié (Fergusson et Johnson, 1991J. Comp. Neurol. 313:693) et permettent in vitro la survie de neurones dopaminergique du mésencéphale (Knûsel et al, 1990, J. Neurosci. 10, 558). Les formes majoritaires de bFGF humains possèdent respectivement des poids moléculaires de 22,5 kd, 21 kd et 18 kd.( Prats H., Kagahd M., Parts A.C., Klagsbrun M., Lelias J.M., Liauzun P.,
ACEMENT RÈGLE 26) Chalon P., Tauber J.P., Amalric F., Smith J.A. and Caput D.. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 1836-1840 (1989)).
Les facteurs de croissances des fibroblastes humains, sous leur orme basique, (bFGF) sont notamment préconisés pour prévenir et/ou traiter les rétinopathies héréditaires ou aquises, de caractère dégénératif . De même, ils peuvent restaurer une morphologie normale des photorécepteurs.
Pour ce faire, les bFGF sont classiquement injectés directement par voie intravitréenne ou sous rétinienne au niveau du site à traiter. Toutefois, cette forme d'administration n'est pas totalement satisfaisante. En effet, compte-tenu du caractère tumorigène des bFGF, il importe de maitriser leur localisation essentiellement au niveau de la région désirée de l'organisme. L'injection par voie générale ne peut prévenir de manière sûre la diffusion des bFGF au sein de la circulation sanguine.
La présente invention a notamment pour objectif de proposer une solution particulièrement avantageuse à ce problème.
La présente invention réside dans la mise au point de vecteurs particulièrement efficaces pour délivrer in vivo et de manière localisée des quantités thérapeutiquement actives de bFGF et donc permettant de s'affranchir d'effets secondaires indésirables.
La présente invention est particulièrement avantageuse pour l'application de bFGF à titre d'agent thérapeutique.
Plus précisément, la présente invention vise la mise au point de vecteurs particulièrement efficaces pour délivrer in vivo et de manière localisée, des quantités thérapeutiquement actives du gène spécifique codant pour le bFGF dans le système nerveux. Dans la demande copendante n° PCT/EP93/02519, il a été montré que les adénovirus pouvaient être utilisés comme vecteur pour le transfert d'un gène étranger in vivo dans le système nerveux et l'expression de la protéine correspondante.
La présente invention concerne plus particulièrement des constructions nouvelles, particulièrement adaptées et efficaces pour le transfert des facteurs de croissance des fibroblastes basiques (bFGF).
Plus précisément, elle se rapporte à un adénovirus recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour le bFGF ou un de ses dérivés, sa préparation, et son utilisation pour le traitement et/ou la prévention des maladies neurodégénératives. La demanderesse a ainsi mis en évidence qu'il est possible de construire des adénovirus recombinants contenant une séquence codant pour le bFGF, d'administrer ces adénovirus recombinants in vivo, et que cette administration permet une expression stable et localisée de quantités thérapeutiquement actives de bFGF in vivo, dans le système nerveux et en particulier dans le traitement des rétinopathies et sans effet cytopathologique.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou une partie active du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) ou d'un de ses dérivés.
Le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le bFGF humain ou un bFGF animal. Il peut en particulier s'agir de celui du rat.
La séquence d'ADN codant pour le bFGF, utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg.
Selon un mode préféré de l'invention, il s'agit une séquence d'ADNg codant pour le bFGF. Son utilisation peut permettre une meilleure expression dans les cellules humaines.
Bien entendu, préalablement à son incorporation dans un vecteur adénovirus selon l'invention, la séquence d'ADN est avantageusement modifiée, par exemple par mutagénèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes.
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé du bFGF, toute séquence obtenue par modification et codant pour un produit conservant l'une au moins des propriétés biologiques du bFGF (effet trophique et/ou différentiateur). Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après). Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.
Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des séquences permettant une expression améliorée in vivo, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques.
Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièrement les variants naturels, les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion de régions n'intervenant pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés ou exprimant une activité indésirable, et les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus supplémentaires, tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un peptide de jonction.
Selon un mode de réalisation privilégié de l'invention, la séquence d'ADN, codant pour le bFGF ou l'un de ses dérivés, intègre également un signal de sécrétion permettant de diriger le bFGF synthétisé dans les voies de sécrétion des cellules infectées. De cette manière, le bFGF synthétisé est avantageusement libéré dans les compartiments extracellulaires et peut ainsi activer ses récepteurs. Toutefois, il peut également s'agir d'un signal de sécrétion hétérologue ou même artificiel. Dans la mesure du possible, le signal de sécrétion est avantageusement le propre signal du bFGF. Ce sera notamment le cas pour le bFGF de rat qui dispose de son propre peptide signal. En revanche, le bFGF humain n'en dispose pas.
La séquence d'ADN, codant pour tout ou partie du bFGF ou d'un de ses dérivés, peut également être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression du bFGF. Préf érentiellement, la séquence d'ADN hétérologue comporte un gène codant pour un ARN antisens capable de contrôler la traduction de l'ARNm du bFGF. La séquence antisens peut être tout ou seulement une partie de la séquence d'ADN, codant pour le bFGF, insérée dans l'orientation inverse dans le vecteur selon l'invention.
Avantageusement, la séquence codant pour le bFGF est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses dont en particulier les cellules rétiniennes. Préférentiellement, il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression du bFGF. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs El A, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules nerveuses, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs de l'énolase neurone-spécifique, de la GFAP, et plus particulièrement ceux de la rodopsine et de la tyrosinase.
Dans un premier mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques humain (hbFGF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
L'invention se rapporte également à un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques humain (hbFGF) sous le contrôle du promoteur de la rhodopsine ou de la tyrosinase ainsi qu'à un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le factexir de croissance des fibroblastes basiques du rat (bFGF) sous le contrôle du promoteur de la rhodopsine ou de la tyrosinase.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNg codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
La demanderesse a en effet montré que le promoteur LTR du virus du sarcome de rous (RS V) permettait une expression durable et importante du bFGF dans les cellules du système nerveux, notamment central. Toujours dans un mode préféré, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur neurotrophique bFGF sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le système nerveux. Un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de la présente invention réside dans un adénovirus recombinant défectif comprenant les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) ou un dérivé de celui-ci sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le système nerveux, et dans lequel le gène El et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 est non fonctionnel.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non- fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence d'ADN codant pour le bFGF.
Préférentiellement, le virus défectif de l'invention conserve les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. Encore plus préférentiellement, comme indiqué ci-avant, le génome du virus recombinant défectif selon l'invention comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène El non fonctionnel et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 non fonctionnel.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-
800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour le bFGF. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ϋ), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n° FR 93 05954 et FR 93 08596 qui sont incorporées à la présente par référence.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Les propriétés particulièrement avantageuses des vecteurs de l'invention découlent notamment de la construction utilisée (adénovirus défectif, délété de certaines régions virales), du promoteur utilisé pour l'expression de la séquence codant pour le bFGF (promoteur viral ou tissu-spécifique de préférence), et des méthodes d'aministration dudit vecteur, permettant l'expression efficace et dans les tissus appropriés du bFGF. La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utilisables directement en thérapie génique, particulièrement adaptés et efficaces pour diriger l'expression du bFGF in vivo. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrement avantageuse pour le traitement et/ou la prévention des maladies neurodégénératives.
La présente invention concerne également toute utilisation d'un adénovirus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies neurodégénératives. Plus particulièrement, elle concerne toute utilisation de ces adénovirus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer, de la sclérose latérale amyotrophique (ALS), de la maladie d'Huntington, de l'épilepsie, de la démence vasculaire et également des rétinopathies.
En ce qui concerne plus particulièrement les rétinopathies, il peut s'agir de toute dégénérescence rétiniaire, centrale, périphérique ou mixte, ainsi que toute rétinopathie, acquise ou non, et en particulier les rétinopathies diabétiques.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu- tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans le système nerveux du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans le système nerveux du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. L'injection directe dans le système nerveux central du patient est avantageusement réalisée au moyen d'un appareil d'injection stéréotaxique. L'emploi d'un tel appareil permet en effet de cibler avec une grande précision le site d'injection.
A cet égard, l'invention concerne également une méthode de traitement des maladies neurodégénératives comprenant l'administration à un patient d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode de traitement des maladies neurodégénératives comprenant l'administration stéréotaxique d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 10^ pfu/ml, et de préférence 10^ à 10^0 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, puis mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectée par ces adénovirus. Il peut s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules endothéliales, cellules Gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles- ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S' agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les adénovirus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies.
Les cellules en culture sont ensuite infectées par des adénovirus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire du bFGF. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses d'adénovirus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une quantité suffisante de virus recombinant défectif tel que décrit précédemment
Selon un mode de réalisation privilégié de l'invention, ces compositions sont tout particulièrement adaptées à un traitement des rétinopathies. En particulier, le virus recombinant défectif peut être sous forme de solution injectable, de collyre, de pommade ophtalmique, etc. Les véhicules pharmaceuti- quement acceptables pour de telles formulations adaptées à un usage oculaire sont notamment des solutions salines (phosphate monosodique, disodique, clrorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), la vaseline, l'huile de vaseline, etc.
Dans le cas de collyres ou de pommades ophtalmiques, il est entendu que les applications thérapeutiques peuvent être plus limitées en raison d'une diffusion plus faible du virus recombinant défectif.
Dans leur utilisation pour le traitement des pathologies oculaires, les virus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et notamment par injection sousrétinale, éventuellement précédée d'une vitrectomie, ou par injection intravitreuse, simples ou multiples. L'injection sous¬ rétinale peut être réalisée sélectivement dans différents compartiments de l'oeil, et notamment, l'injection peut être réalisée au niveau du vitré, de la chambre antérieure ou de l'espace rétrobulbaire. Ces différents modes d'injection permettent d'infecter de manière ciblée les différents tissus de l'oeil, et notamment, l'endothélium cornéen, les cellules photoréceptrices, les cellules bipolaires, les cellules ganglionaires ou encore les cellules des muscles oculomoteurs.
Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules mammifère infectées par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 10^ à 10^ cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 10^ à 10^.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. H peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du collagène de type I.
Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.
Les implants selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de l'organisme. En particulier, l'implantation peut être effectuée au niveau de la cavité péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon l'invention sont particulièrement avantageux en ce sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produit thérapeutique dans l'organisme : Celle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité d'infection et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête définitivement le traitement, soit par l'utilisation de systèmes d'expression régulable, permettant d'induire ou de réprimer l'expression des gènes thérapeutiques.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des maladies neurodégénératives comme les maladies d'Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, et de l'ALS mais également les rétinopathies. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, liés notamment à leur très haute efficacité d'infection des cellules nerveuses, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale. De plus, l'infection par les adénovirus de l'invention est très localisée au site d'injection, ce qui évite les risques de diffusion aux structures cérébrales voisines.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les murins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. JL-égenfle fles figures
Figure 1 : Représentation du vecteur pLTR IX-hbFGF
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. À (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed £hain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 22û (1985) 1350- 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin El er Cetus) selon les spécifications du fabricant La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1 : Construction du vecteur pLTR IX-rbFGF.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour le bFGF de rat sous le contrôle d'un promoteur constitué par le LTR du RSV.
1.1. Vecteur de départ (pLTR IX) : Le vecteur pLTR IX contient en particulier la région gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant ÎTTR et le site d'encapsidation, le promoteur LTR de RSV, et une région de l'adénovirus Ad5 allant du gène pIX jusqu'au site de restriction EagI, permettant la recombinaison homologue in vivo. Ce vecteur a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
1.2. Construction d'une séquence ADNc codant pour le rbFGF.
Pour permettre la réalisation de vecteurs selon l'invention, une séquence d'ADNc codant pour le bFGF de rat est construite comme suit :
Un fragment de 820 paires de base contenant la séquence codante du bFGF de rat et son propre peptide signal a été isolé à partir du plasmide pUC13-bFGF par digestion par l'enzyme EcoRI. Ce fragment a ensuite été sous-cloné au site correspondant du vecteur Bluescript (Pharmacia).
1.3. Construction du vecteur pLTR IX -rbFGF
Cet exemple décrit la construction du vecteur pLTR IX-bFGF contenant la séquence codant pour le bFGF de rat (Shimasaki S., Emoto N;, Koba A., Mercado M., Shibata F., Cooksey K., Baird A. and lin N. Complementary DNA cloning and sequencing of the rate ovarian basic fibroblasts growth f actor and tissue distribution study of its mRNA, B.B.R.C. 152, 256-263, 1988) sous contrôle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'adénovirus Ad5 permettant la recombinaison in vivo.
Le fragment DraTI-SacII a été isolé par digestion enzymatique à partir de la construction préparée dans l'exemple 1.2. Ce fragment contient la séquence codante du bFGF. Ce fragment a été isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose LMP ("Low Melting Point"), puis traité par l'ADN polymérase de T4 pour obtenir des extrémités franches. Ce fragment a ensuite été inséré au site EcoRV du vecteur pLTR IX (exemple 1.1.) pour générer le vecteur pLTR IX-rbFGF. L'ensemble de la séquence nucléotidique de l'insert rbFGF a ensuite été vérifiée par séquençage didéoxynùcléotides.
Exemple 2: Construction du vecteur pLTR IX-hbFGF.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour le bFGF humain sous le contrôle d'un promoteur constitué par le LTR du RSV.
Un fragment de 1,63 kb, codant pour le bFGF humain, a été isolé du plasmide pSCT40 par digestion enzymatique au niveau des sites Xhol et EcoRV. Ce fragment a ensuite été inséré au niveau des sites Sali (1028) et EcoRV(1119) du vecteur pLTR IX (exemple 1.1.) pour générer le vecteur pLTR IX-hbFGF (figure 1). L'ensemble de la séquence nucléotidique de l'insert bFGF a ensuite été vérifiée par séquençage didéoxynùcléotides.
Exemple 3. Construction des adénovirus recombinants contenant une séquence codant pour le BFGF humain.
Le vecteur pLTR IX-bFGF a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (El A et E1B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-bFGF a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pLTR IX-bFGF, selon le protocole suivant : le plasmide pLTR IX-bFGF et l'adénovirus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co- transf ectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 10*0 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient

Claims

REVENDICATIONS
1. Adénovirus recombinant défectif comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou une partie active du bFGF ou d'un de ses dérivés.
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNc.
3. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg
4. Adénovirus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour le bFGF humain.
5. .Adénovirus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour le bFGF du rat.
6. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence antisens dont l'expression permet de contrôler l'expression du gène bFGF.
7. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un gène codant pour un ARN antisens capable de contrôler la traduction de l'ARNm du bFGF.
8. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses.
9. Adénovirus selon la revendication 8 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs viraux, de préférence parmi les promoteurs El A, MLP, CMV et LTR-RSV.
10. Adénovirus selon la revendication 1 comprenant une séquence d'ADNg codant pour le bFGF humain sous le contrôle d'un promoteur LTR-RSV.
11. Adénovirus selon la revendication 1 comprenant une séquence d'ADN codant pour tout ou une partie active du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) ou d'un dérivé de celui-ci sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans les cellules nerveuses.
12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi le promoteur de l'énolase neurone spécifique et le promoteur de la GFAP et de préférence parmi les promoteurs de la rhodopsine et de la tyrosinase.
13. Adénovirus selon la revendication 1 comprenant une séquence d'ADNc codant pour le bFGF humain sous le contrôle d'un promoteur de la rhodopsine ou de la tyrosinase.
14 .Adénovirus selon la revendication 1 comprenant une séquence d'ADNc codant pour le bFGF du rat sous le contrôle d'un promoteur de la rhodopsine ou de la tyrosinase.
15. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible.
16. Adénovirus selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il comprend les ITR et une séquence permettant l'encapsidation, et dans lequel le gène El et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels.
17. Adénovirus selon la revendication 15 ou 16 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 2 ou Ad 5 ou canin de type CAV-2.
18. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 17 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies neurodégénératives.
19. Utilisation selon la revendication 18 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, d'Alzheimer, de Huntington ou de l'ALS.
20. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des rétinopathies.
21. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 17.
22. Composition pharmaceutique selon la revendication 21 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
23. Composition pharmaceutique selon la revendication 21 caractérisée en ce qu'elle est sous forme une forme adaptée à un usage oculaire.
24. Composition pharmaceutique selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité suffisante d'adénovirus recombinant défectif sous une forme de collyre ou de pommade ophtalmique adaptée à un usage oculaire.
25. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 21 à 24 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 10^ et 10^ pfu/ml, et de préférence 10^ à 10 0 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
26. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 17.
27. Cellule selon la revendication 26 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine.
28. Cellule selon la revendication 27 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine de type rétinienne, fibroblaste, myoblaste, hépatocyte, cellule endothéliale, cellule Gliales ou kératynocyte.
29. Implant comprenant des cellules infectées selon les revendications 26 à 28 et une matrice extracellulaire.
30. Implant selon la revendication 29 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant choisi de préférence parmi le collagène, la gélatine, les glucosaminoglycans, la fibronectine et les lectines.
31. Implant selon les revendications 29 ou 30 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend également un support permettant l'ancrage des cellules infectées.
32. Implant selon la revendication 31 caractérisé en ce que le support est constitué préférentiellement par des fibres de polyté rafluoroéthylène.
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