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WO1995025539A1 - Novel remedy for respiratory-tract viral disease - Google Patents

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WO1995025539A1
WO1995025539A1 PCT/JP1995/000513 JP9500513W WO9525539A1 WO 1995025539 A1 WO1995025539 A1 WO 1995025539A1 JP 9500513 W JP9500513 W JP 9500513W WO 9525539 A1 WO9525539 A1 WO 9525539A1
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WO
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virus
alp
influenza
therapeutic
viral
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/000513
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Kido
Masato Tashiro
Shozaburo Sekido
Original Assignee
Tokyo Tanabe Company Limited
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for a viral disease comprising antileukoprotease (hereinafter referred to as ALP) as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to an agent for treating or preventing a respiratory tract viral disease, which is activated by a lipase, comprising ALP as an active ingredient.
  • ALP antileukoprotease
  • ALP is present in exocrine fluids such as bronchial mucosa, saliva, semen, cervical mucus, and nasal secretion, and Secretory Leukoprotease Inhibitor (SLPI), Bronchial mucous inhibitor, Mucous protease inhibitor
  • exocrine fluids such as bronchial mucosa, saliva, semen, cervical mucus, and nasal secretion, and Secretory Leukoprotease Inhibitor (SLPI), Bronchial mucous inhibitor, Mucous protease inhibitor
  • ALP serine protease inhibitor having a molecular weight of 12 kDa and consisting of 107 residues of amino acid, which is the same substance as human seminal inhibitor.
  • the amino acid sequence of ALP has already been determined (WO86 / 03497), and its protein gene has been isolated and sequenced (W086 / 03519).
  • ALP is known to be composed of two inhibitor domains, the first (N-terminal) domain of which inhibits various enzymes similar to triscine.
  • the second (C-terminal) domain is bound to chymotribcine from X-ray crystallography studies, and is believed to have more elastase inhibitory activity [MG Gruetter, The EMBO. Journal, vol. 7, no.2, pp.345-351 (1988)].
  • ALP functions as chymotryms such as leukocyte elastase and cathepsin G It has an inhibitory activity on psin-like enzymes and an inhibitory activity on trypsin-like enzymes such as trypsin, plasmin, calicrein, and thrombin. It is known to be associated with diseases, tumor invasion (W086 Z034997), chronic bronchitis, chronic cervical inflammation (Japanese Patent Laid-Open No. 62-259591). However, there is still no known link between ALP and viral diseases.
  • Virus infection involves the following processes: 1) binding of the virus to the target cell membrane receptor, 2) fusion of the virus membrane with the target cell membrane, and 3) entry of the viral gene into the target cell.
  • the viral outer membrane glycoprotein precursor is limited to the mature viral outer membrane glycoprotein having membrane fusion activity, so that the viral membrane in the respiratory tract and the target cell membrane are bound. It is believed that fusion is induced.
  • Lee F 0 of influenza virus to the Muaguruchinin (HA) and Sendai virus (para Mi click Sowirusu genus Parai influenza virus type 1) is Ri outer membrane glycoprotein precursor der, infectivity of these proteolytic cleavage virus Expression and viral replication are essential for the replication cycle.
  • the present inventors have isolated a novel arginine-specific serine protease, designated tryptase clara, from rat lung [THE Journal of Biological Chemistry]. Vol. 267, Vol. 1 357 7 3-pp. 135 79, 1992].
  • the preparative descriptor hydratase Clara activates cleavage to Sabuyuni' Bok F ⁇ and F 2 of F 0 of Sendai virus, activates infectivity in a dose-dependent manner the sender Iwirusu by Lee down-bi Bok port. It is also known that an antibody against the lipase of Zetrala inhibits the activation of Sendai virus in the lungs of infected rats and suppresses the viral replication cycle and pathological changes in rat lungs [Journal 'Ob' Journal of Virology 6 6 Vol. 7 2 1 1 — 7 2 16 pages, 1992].
  • tryptase Clara is thought to be a host factor involved in the pulmonary virulence of these viruses that develop in the respiratory tract.
  • pulmonary surfatatant inhibits the cleavage of viral outer membrane glycoprotein precursors by tryptase Clara and prevents viral infection and viral proliferation of bronchial mucosal epithelial cells.
  • W09400181, FEBS LETTERS, 322, 115-119 (1993) Disclosure of the invention
  • the present inventors have further studied for the purpose of searching for a substance that inhibits the virus activation by tryptase Clara.As a result, it was found that ALP markedly inhibits the virus activation by tryptic zeclara; In addition, the present invention has been found to inhibit virus growth in animals infected with a virus, and thus the present invention has been achieved.
  • a therapeutic or preventive agent for a viral disease comprising ALP as an active ingredient.
  • the ALP used in the present invention includes ALP isolated and purified from nature, genetic engineering techniques (for example, WO86 / 03519, W089 / 06239, and JP-A-62-25). No. 9591, the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-123490), not only ALP but also a part of the amino acid sequence of ALP is substituted, deleted, inserted, Shows the same activity as the added ALP It also contains proteins.
  • the viral diseases targeted by the therapeutic or prophylactic agent of the present invention include influenza virus, paramyxovirus, respiratory syncytial virus (RS virus), rhinovirus, coronavirus, and reovirus. , Adenovirus, coxsackivirus, echovirus, herpes simplex virus, oral tauvirus, enterovirus, poliovirus, cytomegalovirus, varicella, shingles virus and viral diseases caused by HIV.
  • viruses that are activated by tryptase Clara that is, viral diseases that cause infection in the respiratory tract by a virus having an outer membrane glycoprotein, such as influenza virus. Diseases caused by the lamixovirus, RS virus, measles virus or mumbus virus are preferred.
  • FIG. 1 shows the inhibitory effect of ALP on the cleavage of the Sendai virus outer membrane glycoprotein F0 by tryptolyticase.
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of ALP on the cleavage of influenza virus outer membrane glycoprotein HA by tryptase Clara.
  • FIG. 3 shows the inhibitory effect of ALP on the infection system of Sendai virus and Influenza virus using cultured cells.
  • Sendai virus is shown in A and influenza virus is shown in B.
  • FIG. 4 shows the effect of ALP on influenza virus (Mouse-adapted Influenza A / Asia / 1/57 (H2N2))-infected rats. ⁇
  • the Dils tannin value is indicated by A
  • the degree of lung injury is indicated by B.
  • the solid line indicates the virus titer in the absence of ALP
  • the broken line indicates the virus titer in the presence of ALP
  • the open circle indicates the total virus titer
  • the closed circle indicates the active virus titer.
  • ALP was administered at the time of the arrowhead.
  • the prepared natural ALP was used according to the method described in JP-A-62-259591.
  • Sendai virus Sendai virus
  • influenza virus Influenza A / Aichi / 2/68 (H 3 N 2) and Mouse-adapted Influenza A / Asia / 1/5 7 (H 2 N 2)
  • Sendai virus and influenza virus are grown in the amniotic cavity of embryonated chicken eggs and suspended in a calcium-free phosphate buffer at a rate of 255 HAU / m1 (hemagglutination units / m1). , Each used.
  • Tryptase Clara can be obtained from the lungs of rats by the method of Kido [The Journal of Biological Chemistry], Vol. 1359, pp. 1992].
  • the lungs of the rat are washed with physiological saline, cut into small pieces, homogenized under the condition of pH 5.5, and then centrifuged to obtain a supernatant, which is used as a crude extract.
  • the obtained crude extract was subjected to ion-exchange force column chromatography such as a CM-52 cellulose column (trade name) and a CM-52 Sephadex column (trade name), and then subjected to Boc-Gin-Ala-Arg- Collect a fraction that shows activity against the coloring substrate for measuring trypsin activity such as MCA.
  • This collected liquid Is chromatographed on an arginine sepharose column (trade name), a serine protease-specific adsorbent, to specifically adsorb and collect the trypsin-like enzyme. Finally, the enzyme solution obtained here is passed through a gel filtration column, and a fraction showing activity against the chromogenic base for the measurement of tribsine activity is isolated and purified to prepare tryptase clara. did.
  • test was performed according to the method described in [Journal of Virology, Vol. 66, Vol. 71, pp. 71, 1992].
  • ALP is a cleavage of the F Q of Sabuyuni' preparative F j and F 9 by Tryptase Clara concentration-dependently inhibits, 1 0 0% inhibition was observed at 1 / M.
  • Example 2 Influenza virus
  • the test was performed according to the method described in WO94 / 00131. That is, tryptase Clara (20 g / ml) was previously dissolved in physiological saline at 0 for 20 minutes at various concentrations (0, 1, 10, 0, 100, and 100 mg / ml). ) ALP. Then, reaction by LLC-MK 2 inactive Sendai virus grown in fine vesicles and 3 7 ° C, 5 minutes activated by this mixture is added Apurochinin (1 0 0 / g / m 1) Stopped.
  • Influenza virus (Influenza A / Aichi /
  • Fig. 3 also shows the results of the ALP-mediated infection control test for Sendai virus and influenza virus.
  • All viruses add ALP (1 nM-1 ⁇ M) during cleavage of viral outer membrane glycoproteins by tryptozeclara, resulting in ALP.
  • the virus infection titer was reduced depending on the concentration of ALP, and ALP of ⁇ ⁇ ⁇ -1 / zM showed an infection control effect of almost 100%.
  • mice SD strain rats; Lee down Funoreenza (3 weeks old, body weight 1 2 0 g ⁇ Chi catcher one Rusuriba made one company) in 1 X 1 0 4 plaque forming units (PFU) ⁇ Innoles (Mouse— adapted Influenza A / Asia / 1/5 7 (H 2 N 2)) was transnasally infected.
  • ALP was intranasally administered at a rate of 6 / g (501) per animal every 15 hours after the infection treatment. Controls received 50/1 saline. Rats were killed every 24 hours, and total virus titer and active virus titer in lung homogenate were measured.
  • the degree of inflammation in the whole lung was indicated by lung lesion score based on gross findings.
  • the degree of lung injury was expressed as a percentage of the area exhibiting liver changes, that is, brown, with respect to the total lung surface area, on a 5-point scale from 0 to 4.
  • 0 means 0% of liver change to the total lung surface area
  • 1 means the same percentage is 1-25%
  • 2 means 2-50%
  • 3 means 51-75%
  • 4 means 76-100%, respectively.
  • Figure 4 shows the results together.
  • ALP clearly prevented the expansion of the range of lung injury caused by virus infection, and it was confirmed that ALP was effective against virus infection and proliferation.
  • the therapeutic or prophylactic agent for a viral disease of the present invention is preferably 0.1 ⁇ g-500 mg, preferably l / zg-100 mg, particularly preferably 10 g-10 mg for infants and infants, and It contains 0.5 ⁇ g—l OOO mg, preferably 5 ⁇ g—500 mg, particularly preferably 50 zg—50 mg of ALP as a single dose.
  • This dose is dissolved in an electrolyte solution, such as water or saline, and 0.1 to 50 Omg m 1, preferably 0.5 to 200 mg Zm 1, particularly preferably 1 to 100 mg gZm 1 Adjust to a suitable concentration and inject or spray into the respiratory tract before virus infection or after the onset of viral disease, or use as a mouthwash.
  • the therapeutic or prophylactic agent of the present invention may be, if necessary, a pharmaceutical additive such as a stabilizer, a preservative, an isotonic agent, a buffer or a suspending agent or a bronchodilator, an antitussive, an antiallergic agent, and an antipyretic analgesic.
  • a pharmaceutical additive such as a stabilizer, a preservative, an isotonic agent, a buffer or a suspending agent or a bronchodilator, an antitussive, an antiallergic agent, and an antipyretic analgesic.
  • Pharmaceutical products such as antibiotics, synthetic antibacterial agents or other antiviral agents may be contained.
  • Appropriate dosage form is liquid, powder or aerosol that is suspended at the time of use, and filled into a vial, ampoule or other sealed container to make a sterile preparation.
  • a drug containing ALP as an active ingredient is a viral disease, in particular, a virus whose causative virus is activated by the lipase, ie, a virus having an outer membrane glycoprotein that infects and proliferates in the respiratory tract, For example, it can be effectively applied to viral diseases caused by influenza virus, parainfluenza virus, RS virus, measles virus or mumps virus.

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Description

明 細 書 新規気道部ウィルス疾患治療剤 技術分野
本発明は、 アンチロイコプロテア一ゼ （ Antileukoprotease ； 以下、 A L Pという。 ） を有効成分とするウィルス疾患治療又は予防剤に関す る。 詳しく は、 A L Pを有効成分とする ト リプタ一ゼクララにより活性 化される気道部ウィルス疾患の治療又は予防剤に関する。 背景技術
A L Pは、 気管支粘膜、 唾液、 精液、 子宮頸部粘液、 鼻汁のような外 分泌液中に存在し、 Secretory Leukoprotease Inhibitor (S LP I ) 、 Bronchial mucous inhibitor、 Mucous protease inhibitor
、 Human seminal inhibitorと同一物質とされるアミ ノ酸 1 0 7 残基からなる分子量 1 2 k D aのセリ ンプロテアーゼインヒビターであ る。 A L Pのアミノ酸配列は、 既に決定されており （WO 86ノ 03 49 7 号公報） 、 その蛋白質遺伝子も単離され、 配列決定されている （W08 6 / 0 3 5 1 9号公報） 。
また、 相同性の比較に基づいて、 A L Pは二つのィンヒビター ドメィ ンよりなつていることが知られており、 その第一の （N末端） の ドメイ ンは ト リブシン類似の種々の酵素の阻害をもち、 第二の （C末端） の ド メイ ンは X線結晶構造解析研究からキモ ト リブシンに結合しており、 ェ ラスターゼ阻害作用をもっと考えられている [M. G. Gruetter, The EMBO. Journal, vol. 7, no.2, pp.345-351 ( 1988) ] 。
A L Pの作用として白血球エラスターゼ、 カテブシン G等のキモ ト リ プシン様酵素に対する阻害活性及びト リプシン、 プラスミ ン、 カ リ ク レ イン、 トロンビン等の ト リプシン様酵素に対する阻害活性を有している ので、 肺気腫、 関節炎、 糸球体腎炎、 歯周炎、 筋肉萎縮症、 腫瘍侵襲 （W086 Z 0 3 4 9 7号公報） 、 慢性気管支炎、 慢性頸部炎症 （特開昭 6 2 - 2 5 9 5 9 1号公報） 等との関連が知られている。 しかしながら、 未だ A L Pとウィルス疾患との関連については知られていない。
ウィルスの感染は、 1 ) ウィルスの標的細胞膜レセプターへの結合、 2 ) ウィルス膜と標的細胞膜との融合、 3 ) ウィルス遺伝子の標的細胞 内への侵入、 の過程からなる。 このうち、 2 ) の融合の過程では、 ウイ ルス外膜糖蛋白質前駆体が膜融合活性をもつ成熟型ウィルス外膜糖蛋白 質に限定分解されることにより気道部におけるゥィルス膜と標的細胞膜 との融合が誘導されると考えられている。 イ ンフルエンザウイルスのへ ムァグルチニン （HA) 及びセンダイウィルス （パラ ミ ク ソウィルス属 パライ ンフルエンザウイルス 1型） の F 0は、 外膜糖蛋白質前駆体であ り、 これらの蛋白質分解性切断がウィルスの感染性の発現及びウィルス 複製反復サイクルには必要不可欠である。
本発明者らは、 ラッ ト肺から ト リプターゼクララと命名した新規なァ ルギニン特異性セリ ンプロテアーゼを分離した [ザ · ジャーナル ·ォブ . バイオ口ジカル · ケミス ト リー （THE Journal of Biological Chemistry) 第 2 6 7巻、 第 1 3 5 7 3— 1 3 5 7 9頁、 1 9 9 2年] 。
この ト リプターゼクララは、 センダイウイルスの F 0のサブュニッ 卜 F }及び F 2への解裂を活性化し、 イ ン · ビ卜口で用量依存的にセンダ ィウィルスの感染力を活性化する。 また、 ト リプタ一ゼクララに対する 抗体は、 感染ラッ 卜の肺中でセンダイウィルスの活性化を阻害し、 ウイ ルス複製反復サイクル及びラッ ト肺中の病理変化を抑制することが知ら れている [ジャーナル ' ォブ ' ビロロジー （Journal of Virology) 第 6 6 卷、 第 7 2 1 1 — 7 2 1 6頁、 1 9 9 2年] 。
更に、 ト リプターゼクララが、 イ ンフルエンザ Aノ AichiZ 2ノ 6 8 (H 3 N 2) の HAの HA j及び HA 9への解裂を活性化することも知 られている [ジャーナル . ォブ . ノくィォロジカル · ケミ ス ト リー （THE Journal of Biological Chemistry) 第 267巻、 第 1 3573— 1 3579 頁、 1 9 9 2年] 。
このように ト リプターゼクララは、 気道部で感染発症するこれらウイ ルスの肺病原性に関与する宿主因子であると考えられている。
先に、 本発明者らは、 肺サーファタタン トがト リプターゼクララによ るウィルス外膜糖蛋白質前駆体の解裂を抑制し、 気管支粘膜上皮細胞の ウィルス感染及びウィルス増殖を防止することを発見した （W09 4 0 0 1 8 1号公報、 FEBS LETTERS, 322, 115-119 (1993) ) 。 発明の開示
本発明者らは、 ト リプターゼクララによるウィルスの活性化を阻害す る物質の探索を目的として更に研究を進めた結果、 AL Pが、 トリプター ゼクララによるウィルスの活性化を顕著に阻害すること、 及びウィルス 感染動物におけるゥィルス増殖を阻止することを発見し、 本発明に到達 した。
本発明によれば、 A L Pを有効成分として含有するウィルス疾患治療 又は予防剤が提供される。
本発明に使用される A L Pとは、 天然から単離精製された A L P、 遺 伝子工学的手法 （例えば WO 86/035 1 9号公報、 W089ノ 06239 号公報、 特開昭 6 2— 2 5 9 5 9 1号公報、 特開平 3 - 1 2 3 4 9 0号 公報等記載の方法） により製造された A L Pのみならず A L Pのァミ ノ 酸配列の一部が置換、 欠失、 挿入、 付加された AL Pと同様の活性を示 す蛋白質をも含むものである。
本発明の治療又は予防剤の対象となるウィルス疾患としては、 イ ンフ ルェンザウイルス、 パラ ミ ク ソウイルス、 レスビラ ト リーシンシンャル ウィルス （Respiratory Syncytial Virus；以下 R Sウィルスという。 ） 、 ライ ノ ウィルス、 コロナウィルス、 レオウィルス、 アデノ ウイルス、 コ クサツキ一ウィルス、 エコーウィルス、 単純へルぺスウィルス、 口タウ ィルス、 ェンテロウィルス、 ポリオウイルス、 サイ トメガロウィルス、 水痘 ·帯状疱疹ウィルス及び H I Vを原因とするウィルス疾患が挙げら れるが、 ト リプターゼクララにより活性化されるウィルス、 すなわち、 外膜糖蛋白質を有するウィルスにより気道部で感染発症するウィルス疾 患、 例えば、 イ ンフルエンザウイルス、 、。ラ ミ ク ソウィルス、 R S ウイ ルス、 麻疹ウィルス又はムンブスウィルスを原因とする疾患が好ましい。 図面の簡単な説明
第 1図はセンダイウイルス外膜糖蛋白質 F 0の ト リプタ一ゼクララによ る解裂への A L Pの抑制効果を表す。
第 2図はィンフルェンザウィルス外膜糖蛋白質 H Aの ト リプターゼクラ ラによる解裂への A L Pの抑制効果を表す。
第 3図は培養細胞を用いたセンダイウィルス及びィ ンフルェンザウィル スの感染系における A L Pの感染抑制効果を表す。 センダイウィルスを A、 イ ンフルエンザウイルスを Bに表示した。
第 4図はインフルエンザウイルス （Mouse- adapted I nf luenza A /Asi a / 1 / 5 7 ( H 2 N 2 ) ) 感染ラッ トに対する A L Pの作用を表す。 ゥ ィルスカ価を A、 肺障害度を Bで表示した。 実線は A L P非存在下、 破 線は A L P存在下のウィルス力価を表し、 白丸は全ウィルス力価、 黒丸 は活性型ウイルスカ価を表す。 矢じりの時点で A L Pを投与した。 発明を実施するための最良の形態
A L Pのウィルス疾患に対する効果を以下に説明する。 以下の各試験 に使用した A L P、 ウィルス及びト リプターゼクララは以下の通りであ な。
A L P
特開昭 6 2 - 2 5 9 5 9 1号公報記載の方法に準じて、 調製した天然 A L Pを使用した。
ウィルス
ウィルスとして、 センダイウィルス （Sendai virus) 、 インフルェン ザウィルス [Influenza A/Aichi/ 2 /6 8 (H 3 N 2 ) 及び Mouse- adapted Influenza A/Asia/ 1 /5 7 (H 2 N 2 ) ] を使用した。 セ ンダイゥィルス及びィンフルェンザウイルスは、 発育鶏卵の羊膜腔で生 育させたものを 2 5 4 H AU/m 1 (赤血球凝集単位/ m 1 ) の割合で カルシウムフリーのリ ン酸緩衝液に浮遊させて、 それぞれ使用した。 ト リプタ一ゼクララ
ト リプターゼクララは、 ラッ トの肺より、 木戸の方法 [ザ · ジャーナ ノレ . ォブ ·バイオ口ジカル · ケミス トリー （THE Journal of Biological Chemistry) 第 2 6 7巻、 第 1 3 5 7 3— 1 3 5 7 9頁、 1 9 9 2年] により調製した。
すなわち、 ラッ 卜の肺を生理食塩水で洗浄した後、 細断し、 これを pH 5. 5の条件でホモジナイズし、 次いで遠心分離して上澄液を得、 これを粗 抽出液とする。 得られた粗抽出液を CM— 5 2セルロースカラム （商品 名） 及び CM— 5 2セフアデックスカラム （商品名） 等のィォン交換力 ラムクロマ トグラフィーに順次付し、 Boc- Gin- Ala- Arg- MCA等の ト リプシ ン活性測定用発色基剤に対して活性を示す画分を採取する。 この採取液 をセリ ンプロテアーゼ特異的吸着体であるアルギニンセファロースカラ ム （商品名） のクロマ トグラフィーに付し、 ト リプシン様酵素を特異的 に吸着採取する。 最後に、 ここで得られた酵素液をゲル濾過カラムに通 し、 ト リブシン活性測定用発色基剤に対して活性を示す画分を採取する ことにより単離精製し、 ト リプターゼクララを調製した。
A L Pによるウィルス蛋白質の解裂抑制試験
(実施例 1一センダイウィルス）
試験を [ジャーナル 'ォブ ' ビロロジー （Journal of Virology) 第 6 6 巻、 第 7 2 1 1 — 7 2 1 6頁、 1 9 9 2年] に記載の方法に準じて行つ た。
ト リプターゼクララ （ 5 0 g/m 1 ) 及び蒸留水に溶解した各種濃 度 （ 1 0 nM, 1 0 0 nM及び 1 M) の A L Pを 0 °Cで 5分間反応さ せてから、 L L C —MK 2細胞中で増殖させた [。 H] ダルコサミ ンラ ベル化不活性型センダイウィルス F 0蛋白質の切断性を調べた。 ドデシ ル硫酸ナ ト リウムポリアク リルァミ ド電気泳動での分析結果を図 1 に示 す。
A L Pは、 トリプターゼクララによる F Qのサブュニッ ト F j及び F 9 への解裂を濃度依存的に阻害し、 1 / Mで 1 0 0 %の抑制が認められた。 (実施例 2—ィンフルェンザウィルス）
[ザ · ジャーナル ·ォブ ·バイオ口ジカル ' ケミストリー （THE Journal of Biological Chemistry) 第 2 6 7巻、 第 1 3 5 7 3 - 1 3 5 7 9頁、 1 9 9 2年] に記載の方法及び [実施例 1 ] に準じて、 ィンフルェンザ ウィルス （Influenza A Aichi 2 6 8 (H 3 N 2 ) ) の H A蛋 白質の ト リプターゼクララによる と H A 2への解裂を調べた。 図 2に示したように、 A L Pは、 ト リプターゼクララによる H Aのサ ブュニッ ト H A 1及び H A 2への解裂を濃度依存的に阻害した。 A L Pによるウイルスの感染抑制試験 （イン . ビトロ）
(実施例 3—センダイウィルス）
試験を WO 9 4 / 0 0 1 3 1号公報に記載の方法に準じて行った。 す なわち、 ト リプターゼクララ （2 0〃 g/m l ) を、 あらかじめ 0 で 2 0分間、 生理食塩水に溶解した各種濃度 （0, 1 , 1 0 , 1 0 0及び Ι Ο Ο Ο ηΜ) の A L Pと共に反応させた。 次いで、 L L C— MK 2細 胞中で増殖した不活性型センダイウィルスをこの混合液で 3 7°C、 5分 間活性化し、 ァプロチニン （ 1 0 0 / g/m 1 ) を添加することにより 反応を停止した。 以上の処理において得られた活性型センダイウィルス を再び L L C一 MK 2細胞に加え、 1 5時間培養した後、 免疫蛍光細胞 計数法により、 C I U (Cell Infecting Unit) を測定し、 ウィルス感染 価を （log1QC I UZm 1 ) として表示した。
(実施例 4ーィンフルェンザウィルス Influenza A/ Aichi/ 2 / 68 (H 3 N 2 ) )
ウィルスとしてインフルエンザウイルス （Influenza A/Aichi/
2/6 8 (H 3 N 2 ) ) を用い、 L L C一 MK 2細胞に代えて M D C K 細胞を使用した以外は [実施例 3] に準じて処理し、 C I Uを測定し、 ゥィルスの感染価を求めた。
図 3に A L Pによるセンダイウィルス及びインフルエンザウイルスの 感染抑制試験の結果を合わせて示す。 ト リプターゼクララ処理前の不活 性型ウィルスの感染価は、 センダイウィルスが 1 X 1 0 4 C I U/m 1、 インフルエンザウイルスが 1. 2 x l 0 4 C I UZm l を示し、 ト リプ ターゼクララを処理することにより、 それぞれ 4 X 1 06 C I U/m 1、 1. 8 X 1 0 0 C I UZm 1 にまで活性化された。
いずれのウィルスも ト リプタ一ゼクララによるウィルス外膜糖蛋白質 の解裂時に AL P ( 1 nM- 1 ^M) を加えておく ことにより、 A L P の濃度依存性にゥィルス感染価は低下し、 Ι Ο Ο ηΜ— 1 /zMの A L P で、 ほぼ 1 0 0 %近い感染抑制効果を示した。
A L Pによるウィルスの感染抑制試験 （イ ン · ビボ）
(実施例 5— A L Pの抗ィンフルェンザ作用に関する動物実験） 試験は、 [ジャーナル ' ォブ · ビロロジ一 （Journal of Virology) 第
6 6巻、 第 7 2 1 1 — 7 2 1 6頁、 1 9 9 2年] に記載の方法に準じて 行った。
すなわち、 1群 3匹の S D系ラッ ト （3週齢、 体重 1 2 0 g ； 曰本チ ャ一ルスリバ一社製） に 1 X 1 0 4プラーク形成単位 （P F U) のイ ン フノレエンザゥイノレス （ Mouse— adapted Influenza A/ Asia / 1 /5 7 (H 2 N 2 ) ) を経鼻感染させた。 感染処理後 8時間おきに合 計 1 5回 A L Pを 1匹当たり 6 / g (5 0 1 ) 経鼻投与した。 コン ト ロールに対しては生理食塩水を 5 0 / 1投与した。 2 4時間おきにラ ッ トを殺し、 肺ホモジネー ト中の全ウィルス力価 （virus titer) と、 活性 型ウィルス力価をそれぞれ測定した。
また、 肺全体における炎症の程度を肉眼所見から肺障害度 （lung lesion score) で示した。 肺の障害度は、 全肺表面積に対する肝変、 すなわち 褐色を呈する面積の割合を 0から 4までの 5段階のスコア一で表示した。 肺の障害度スコア一において、 0 とは、 肺全表面積に対する肝変の百分 率が 0 %を、 1 とは同百分率が 1 一 2 5 %を、 2 とは 2 6 — 5 0 %を、 3 とは 5 1 — 7 5 %を、 4 とは 7 6— 1 0 0 %をそれぞれ意味する。 以上の結果を合わせて図 4に示す。
イ ンフノレェンザウイノレス (Mouse-adapted Influenza A/Asia/ 1 / 5 7 (H 2 N 2 ) ) を感染させ、 生理食塩水を投与したものは、 5 曰目 までに約 2 0 0 0倍にウィルス力価は増加し、 その 9 5 %以上は活性型 ウィルスであった。 このときの肺の炎症像は 7 日をピークに激しい炎症 像を示し、 9曰まで続いた。
一方、 A L Pを 6 匹合計 1 5回繰り返し経鼻投与したものはゥ ィルスカ価が 5曰目までわずか 1 0倍程度しか上昇せず、 A L P未処理 でみられるウィルス力価のわずか 0. 5 %にまで抑制された。 しかも、 この場合わずかに増殖しているウィルスの 9 5 %が不活性型のままにと どまっていた。 肺の炎症像も 5日目をピークにスコア一 1を示し、 ごく 軽微に経過していた。
以上のように、 明らかに A L Pはウイルス感染による肺の障害範囲の 拡大を阻止しており、 ウィルスの感染増殖に対して奏効していることが 認められた。
用法 · 用量
本発明のウィルス疾患治療又は予防剤は、 乳幼児に対しては、 0. 1 〃 g— 500mg、 好ましくは l /z g— 1 00mg、 特に好ましくは 1 0 g— 1 0 m g、 成人に対しては 0. 5〃 g— l O O O mg、 好ま しく は 5〃 g— 5 0 0 mg、 特に好ましくは 5 0 z g— 5 0 mgの A L Pを 1回投与量として含有する。 この用量を水又は生理食塩水のような電解 質溶液に溶解し、 0. 1— 50 Omg m 1、 好ましくは 0. 5— 200mg Zm 1、 特に好ま しくは 1 一 1 0 0 m gZm 1 の濃度に調整し、 ウィル ス感染前又はウィルス疾患発症後に、 気道内に注入若しくは噴霧し、 又 は含嗽剤として使用する。
本発明の治療又は予防剤は、 必要に応じて安定剤、 保存剤、 等張剤、 緩衝剤若しく は懸濁剤等の医薬品添加物又は気管支拡張剤、 鎮咳剤、 抗 アレルギー剤、 解熱鎮痛剤、 抗生物質、 合成抗菌剤若しく は他の抗ウイ ルス剤等の医薬品を含有してもよい。 剤型は液剤、 用時に懸濁して用い る粉末剤又はエアゾール剤が適当であり、 バイアル瓶、 アンプル瓶又は その他の密封容器内に充填し、 無菌製剤とする。 産業上の利用可能性
上述のように A L Pは、 ト リプターゼクララによるウィルス活性化を 顕著に阻害し、 ゥィルス感染動物におけるウィルス増殖を阻止した。 従って、 A L Pを有効成分とする薬剤はウィルス疾患、 特に原因ウイ ルスがト リプタ一ゼクララにより活性化されるウィルス、 すなわち、 外 膜糖蛋白質を有するウィルスであつて気道部に感染し増殖するもの、 例 えば、 イ ンフルエンザウイルス、 パライ ンフルエンザウイルス、 R S ゥ ィルス、 麻疹ウィルス又はムンプスウィルスによって発症するウィルス 疾患に効果的に適用できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . アンチロイコプロテアーゼを有効成分とする ト リプターゼクララ阻 害剤。
2 . アンチロイコプロテアーゼを有効成分とするウィルス疾患治療又は 予防剤。
3 . ウィルスが、 外膜糖蛋白を有するウィルスであって、 気道部に感染 し増殖するものである請求項 2記載の治療又は予防剤。
4 . ウィルスがト リプタ一ゼクララにより活性化されるウィルスである 請求項 2または請求項 3記載の治療又は予防剤。
5 . ウィルスが、 イ ンフルエンザウイルス、 パライ ンフルエンザウィル ス、 R Sウィルス、 麻疹ウィルス又はムンプスウィルスである請求項 2、 請求項 3または請求項 4記載の治療又は予防剤。
6 . 医薬的有効量のアンチロイコプロテアーゼを患者に投与するウィル ス疾患の治療方法。
7 . ウィルスが、 外膜糖蛋白を有するウィルスであって、 気道部に感染 し増殖するものである請求項 6記載の治療方法。
8 . ウィルスがト リプターゼクララにより活性化されるウィルスである 請求項 6または請求項 7記載の治療方法。
9 . ウィルスが、 イ ンフルエンザウイルス、 パライ ンフルエンザウィル ス、 R Sウィルス、 麻疹ウィルス又はムンプスウィルスである請求項 6、 請求項 7または請求項 8記載の治療方法。
1 0 . ウィルス疾患の治療用薬剤組成物の製造のためのアンチロイコプ 口テアーゼの使用。
1 1 . ウィルスが、 外膜糖蛋白を有するウィルスであって、 気道部に感 染し増殖するものである請求項 1 0記載の使用。
1 2 . ウィルスが ト リプターゼクララにより活性化されるウィルスであ る請求項 1 0または請求項 1 1記載の使用。
1 3 . ウィルスが、 イ ンフルエンザウイルス、 パライ ンフルエンザウイ ルス、 R Sウィルス、 麻疹ウィルス又は厶ンブスウィルスである請求項 •5 1 0、 請求項 1 1 または請求項 1 2記載の使用。
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