WO1995020653A1 - Utilisation du gene de la luciferase de vargula pour la selection d'embryons transgeniques - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a process for selecting transgenic embryos.
- Transgenesis is widely used in mice, but still little developed in other animals, such as farm animals. This situation is explained by the high cost of this technology linked mainly to the low rate of integration of a transgene into the transcriptionally active nucleus of the egg: it is estimated that in most domestic species, less than 1% of embryos injected which develop over time after transfer to a recipient female are transgenic, whereas this rate is approximately 10% in mice. This situation implies in these species to resort to an even higher number of embryos and recipient females. As a result, the cost of the first transgenic calf produced was estimated at around 3 million francs [SEIDEL, J. Anim. Sci., 71, 26-33, (1993)].
- the present invention proposes to remove these two obstacles, by allowing the analysis of embryos at the blastocyst (or morula) stage by a non-invasive method (which does not require micromanipulation), which is rapid because it allows batch analysis. blastocysts from microinjected eggs, retaining only those which are actually transgenic, at a stage compatible with their preservation by freezing. To this end, the inventors had the idea of carrying out the injection of a transgene simultaneously with another reporter transgene which would serve to identify the embryos where integration has actually occurred.
- reporter genes are already used in genetic engineering to select transformed cells. Among those which are used in eukaryotic cells, mention may be made, for example, of alcohol dehydrogenase [NIELSEN and PEDERSEN, J. Exp. Zool., 257, 128-133, (1991)], the CAT enzyme, ⁇ -galactosidase or firefly luciferase.
- NIELSEN and PEDERSEN the CAT enzyme
- ⁇ -galactosidase or firefly luciferase.
- these reporter systems In order for these reporter systems to be compatible with an in situ analysis of living cells, they must be pretreated, either to permeabilize their membranes or to limit the background noise, which increases rapidly during the measurement in the presence of the substrates. This pretreatment involves manipulations incompatible with rapid and routine analysis. The use of reporter genes whose product is secreted in the environment could remove these obstacles.
- the only gene used as a reporter gene for sorting transgenic animals is a tyrosinase minigene which transforms albino mice into pigmented mice [OVERBEEK et al., Transgenic Research, 1, 31-37, (1991)], which has been used in mice to visualize transgenic newborns.
- this gene cannot be used for early visualization before transplanting the injected embryos.
- the inventors have now selected a reporter gene, the product of which is secreted in the medium and easily detectable: it is the Vargula luciferase gene (Vargula hilgendorfii) [THOMPSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571, (1989); THOMPSON et al., Gene, 199-204 (1990)].
- the activity of this luciferase is detectable qualitatively and quantitatively by measuring the luminescence induced in the medium, in the presence of its substrate (luciferin), and of O 2 _
- Vargula luciferase The turnover of Vargula luciferase is much higher than that of other known luciferases (1600 molecules per minute whereas it is only a few tens for fly luciferase), which increases the sensitivity accordingly detection, and is an important advantage in luminescence imaging.
- the inventors have further found that the expression of the Vargula luciferase gene was detectable in the embryo from the earliest stages of development (stage 2 cells), and did not interfere with subsequent development.
- stage 2 cells The inventors have further noted that the detection of the light signal resulting from the activity of Vargula luciferase could be used to separate at the blastocyst stage the embryos which express the transgene in the non-integrated state (transient expression) from those where integration has effectively taken place (transgenic embryo).
- the subject of the present invention is the use of a gene coding for Vargula luciferase, placed under the control of an appropriate promoter, as a reporter gene for the detection of transgenic embryos.
- An "appropriate promoter” is a functional promoter in eukaryotic cells, in particular mammalian cells; any type of promoter which can be used for obtaining transgenic animals may be suitable; by way of example, mention may be made of the cytomegalovirus promoter, the metallothionein promoter, that of thymidine kinase, that of the elongation factor EF1.
- a strong promoter will preferably be chosen, in order to obtain a significant expression of the luciferase, which increases the sensitivity of the method.
- HSP 70-1 the coding sequences of the Vargula luciferase gene are placed under the dependence of the promoter HSP 70-1 [HUNT and CALDER OOD, Gene, 87, 199-204, (1990) ]. This construction will be referred to below as HSP-70-1-VL.
- the luciferase activity in the culture medium of blastocysts taken from transgenic mice having only 2 copies of the HSP-70-1-VL construct can be directly viewed, after simple addition of the luciferase substrate, under an optical microscope equipped with 'a camera.
- This visualization is rapid (10 to 30 seconds of image accumulation is sufficient), can be carried out at several stages of evolution of the blastocyst and is compatible with the simultaneous screening of several embryos.
- the inventors have also found that when the promoter / gene of Vargula luciferase is flanked in 5 'and 3' of SAR sequences, the average level of luciferase activity measured in the culture media of blastocysts carrying this construction integrated into the genome is increased significantly (about 10 times).
- SAR sequences also known as MAR sequences (Matrix Attached Regions) have been demonstrated 5 'and 3' from the gene for human ⁇ interferon, [BODE and MAASS, Biochemistry, 27, 4706-4711 ( 1988)].
- Other SAR sequences have also been demonstrated in 3 ′ and 5 ′ of various genes: [KAS AND CHASIN, J. Mol. Biol.
- SAR sequences therefore makes it possible to increase the difference between the level of luciferase activity due to the transient expression, and that due to the expression of the integrated DNA.
- the inventors have furthermore found that the activity of stimulating the expression of the transgene by the flanking SAR sequences, which is observed in the embryo, no longer exerts in the differentiated tissues of the newborn and transgenic animals. adults, which has the advantage of limiting the risks of interference of a high production of luciferase with the physiology of animals.
- the heterologous gene whose integration is to be detected can be placed on the same DNA fragment as the chimeric reporter gene according to the invention. It can also be located on another DNA fragment which is then co-injected with the fragment carrying the chimeric reporter gene. It has in fact been observed that coinjection into the egg of mice of different DNAs is compatible with the normal expression of each DNA in the adult animal [EINAT et al. Genes Devel., 1, 1075-1084, (1987), OVERBECK et al., Transgenic Research, 1, 31-37, (1991)].
- the heterologous gene can optionally be placed under the control of the same promoter as the luciferase gene; however, it is preferable that it be provided with its own control sequences (promoter, enhancer, etc.).
- the present invention relates to a chimeric gene, usable as a reporter gene to detect the insertion of a heterologous gene, characterized in that it comprises:
- the inventors established, with different constructions in accordance with the invention and comprising SAR sequences, several lines of transgenic mice. By quantifying the luciferase activity of their embryos, it is possible to finely measure the effect of disturbances of the chromatin environment on the activity of the embryonic nucleus at different stages of the preimplantation period.
- the present invention can be implemented to make it usable routinely in different animal species, including mammals, but also other animals such as fish, and in particular in farm animals, sorting, at different stages. of development, effectively transgenic embryos after microinjection at the pronauau stage.
- mice it is known that approximately half of the blastocysts positive for the presence of exogenous DNA after injection at the pronal stage (and detection after amplification by PCR) are effectively transgenic.
- This species can be used to calibrate the constructs by defining, during the observation of the embryos under luminescence microscopy, a threshold time for recording the images obtained, time from which only the activity of the transgenic morulas or blastocysts will be effectively taken. into account.
- the inventors have also obtained several lines of pluripotent and totipotent cells, derived from transgenic animals according to the invention.
- a 800 bp HincII fragment comprising the essential elements of the promoter of the mouse HSP70-1 gene [HUNT and CALDERWOOD, Gene, 87, 199-204, (1990)], namely 4 elements inducible by thermal shock, arranged in tandem , and allowing the binding of specific transcription factors of thermal shock; a CCAAT box in reverse orientation; a TATA box in reverse orientation; two binding sites for the transcription factor SP1, and one binding site for the transcription factor AP2, was obtained from a BglII-NcoI fragment isolated from an EcoRI fragment of the plasmid pM2.3 from HUNT and CALDERWOOD (Gene 87, 199-204, 1990) and cloned at the HincII site of the plasmid pBluescript SK (STRATAGENE).
- the plasmid thus obtained was designated pBHS
- the 3 kb BglIII fragment was cloned into the BamHI site of the plasmid pBHSVL described above to give the plasmid pSHSVL.
- the 2.2 kb EcoRI fragment previously provided at each of its ends with XhoI-EcoRI adapters was inserted into the Xhol site of pSHSVL, 5 ′ of the HSP70.1 promoter.
- the plasmid obtained was designated pSHSVLS.
- EXAMPLE 3 OBTAINING TRANSGENIC MICE
- transgenic mice were obtained from the two different constructs, pBHSVL (SAR-) and pSHSVLS (SAR + ) obtained according to the protocols described in Examples 1 and 2 respectively.
- the Kpnl-BamHI fragments of pBHSVL and Kpnl-Notl of pSHSVLS were purified from agarose gels (GENE CLEAN kit; BIO 101), and the DNA was injected at a concentration of 2ng / ⁇ l into the pronuclei. fertilized eggs obtained by crossing F1 hybrids (male and female) C57BL6 / CDA.
- transgenic founders were identified by PCR using primers specific for the Vargula luciferase gene. The number of copies of the gene was determined by densitometric analysis of quantitatively performed Southern blots. After identifying the founders, they were crossed with each other in order to obtain animals homozygous for the transgene.
- EXAMPLE 4 OBTAINING EMBRYOS AND TISSUES OF TRANSGENIC ANIMALS
- Over-ovulation was induced in female FI hybrids C57BL6 / CBA, by injecting 10 U of pregnant mare serum gonadotropin (PMSG; INTERVET) in 0.1 ml of physiological saline, this injection being followed 46 to 48 hours later by l injection of 5U of human chorionic gonadotropin (HCG; INTERVET), in 0.1 ml of the same solution.
- PMSG pregnant mare serum gonadotropin
- HCG human chorionic gonadotropin
- Treated females were mated with transgenic males homozygous for the transgene, and 1-cell stage embryos were recovered from the oviducts 21 to 23 hours after the injection of HCG.
- the embryos were placed in drops of M16 medium [HOGAN et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1986)] at a density of approximately 1 embryo / ml of culture medium.
- the embryos
- the constitutive expression is measured throughout the culture period by taking a little medium at desired time intervals, and replacing it each time with fresh medium. Each fraction removed is immediately frozen at -80 "C until detection of luciferase activity.
- the culture dishes containing blastocysts (101-112 hours after HCG) sealed with a sealing film, were immersed in a water bath at 43 ° C for 30 minutes. The sealing film has been removed, and the dishes placed again in the incubator at 37 "C.
- the Vargula luciferase begins to accumulate in the medium after approximately 3 hours. The kinetics of accumulation can be followed by of successive samples, or measure the total amount accumulated at the end of the culture.
- the activity of the luciferase secreted by the embryos is analyzed by two different methods: 1st method: An aliquot of the culture medium of the embryos is taken. This aliquot is then diluted with 200 mM Tris-HCl, pH 7.6, to a volume of 100 ⁇ l. The sample thus diluted is placed at the bottom of a 5 ml measuring tube (SARSTEDT) and introduced into the measuring chamber of a LUMAT LB 9501 photometer (BERTHOLD Instruments). Luciferin, substrate of Vargula luciferase, is prepared according to one of the protocols described by TSUJI [Methods Enzy ol.
- luciferase activity 100 ⁇ l of the solution of Luciferin is injected into the tube comprising the sample, and the intensity of the light emitted is measured by the photometer.
- 2nd method The luciferase activity can also be viewed directly under a microscope, equipped with a camera (Argus-50, HAMMAMATSU instruments). 2 ⁇ l drops of a 50 ⁇ M solution of luciferin in PBS buffer are placed in the microscopy chamber, and covered with oil. The embryos are introduced into these drops, and the whole is placed under an inversion microscope equipped with a camera.
- transgenic embryos containing the constructs with or without the SAR sequences is the same as that of the non-transgenic embryos used as control.
- the SAR + lines show a higher expression than the SAR- lines both at the 2-cell stage and at the blastocyte stage. At the 2-cell stage, all the SAR- lines show practically the same basic level of expression, which does not appear to depend on the number of copies.
- transgenic SAR + lines express luciferase at higher levels, and expression is a function of the number of copies. On average, an expression 6 times higher is observed in the SAR + group than in the SAR- group. When this expression is reduced to the number of copies, there is an increase 2.5 times greater in the SAR + group than in the SAR- group.
- the SAR- lines express the luciferase independently of the number of copies, whereas in SAR + lines the expression of luciferase is positively correlated with the number of copies.
- Copy expression in SAR + lines is 4.1 times greater than copy expression in SAR- lines.
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Abstract
L'invention est relative à l'utilisation d'un gène codant pour la luciférase de Vargula, placé sous contrôle d'un promoteur approprié, en tant que gène rapporteur pour la détection d'embryons transgéniques. Avantageusement, ledit gène de luciférase de Vargula est flanqué de séquences SAR.
Description
UTILISATION Du GENE DE LA LUCIFERASE DE VARGULA POUR LA SELECTION D'EMBRYONS TRANSGENIQUES.
La présente Invention est relative a un procédé de sélection d'embryons transgéniques. La transgénèse est largement utilisée chez la souris, mais encore peu dével.oppée chez d'autres animaux, tels que les animaux de ferme. Cette situation s'explique par le coût important de cette technologie liée principalement au faible taux d'intégration d'un transgène dans le noyau transcriptionnellement actif de 1'oeuf : on estime que chez la plupart des espèces domestiques, moins de 1% des embryons injectés qui se développent à terme après transfert dans une femelle receveuse sont transgéniques, alors que ce taux est d'environ 10% chez la souris. Cette situation implique chez ces espèces de recourir à un nombre d'autant plus élevé d'embryons et de femelles receveuses. De ce fait, le coût du premier veau transgénique produit a été estimé à environ 3 millions de francs [SEIDEL, J. Anim. Sci., 71, 26-33, (1993) ] .
Pour diminuer ce coût, il a été proposé d'augmenter le taux d'intégration de l'ADN exogène en recherchant de nouveaux vecteurs s' intégrant plus facilement dans le génome de l'embryon. Cette approche n'a toutefois pas encore débouché actuellement sur des résultats applicables industriellement.
Une autre voie, plus directe et potentiellement plus intéressante à court terme, consisterait à réaliser un tri des embryons transgéniques avant leur transfert. En effet, chez plusieurs espèces, ce n'est pas tant le coût de production de ces embryons qui constitue l'obstacle économique principal, que celui lié à 1' accès à un grand nombre de femelles receveuses une fois l'injection réalisée : il faut par exemple chez les bovins, l'équivalent d'environ 150 receveuses pour produire un animal transgénique fondateur [HILL et al.,
Theriogenology, 37, 222, (1992)] . Dans ces conditions, le coût technique de production de blastocystes microinjectés ne représente que seulement 10% du coût d'entretien du troupeau de receveuses. Le tri des embryons avant leur transfert peut remédier à cette situation et une littérature abondante est consacrée à ce sujet. Toutes les méthodes proposées à ce jour ont recours à la biopsie de morula ou de blastocystes, associée à la détection directe du transgène après amplification par PCR. Elles impliquent de manipuler les embryons individuellement plusieurs jours après les avoir microinjectés et en outre ne permettent de réaliser qu'un tri négatif en éliminant les embryons pour lesquels aucun signal n'est obtenu après amplification : ceux-ci représentent selon les auteurs 50% [HORVAT et al., Transgenic research, 2, 134-140 (1993)] à 80% [SEIDEL, (1993), publication précitée] des blastocystes bovins issus d'oeufs microinjectés.
Le recours à une biopsie qui ne permet de réaliser un diagnostic que sur une partie des morula et blastocystes manipulés se heurte à deux obstacles majeurs :
- d'une part, il compromet les possibilités de développement après congélation, ce qui constitue un obstacle important à la diffusion des embryons ;
- d'autre part, il conduit à la détection d'embryons "faux positifs" (à cause de problèmes techniques lors de la réalisation de l'amplification) pouvant représenter jusqu'à 10% des embryons analysés [HORVAT et al., (1993), publication précitée], ainsi qu'à celle d'embryons "faux-transgéniques" [SEIDEL, (1993), publication précitée] car la plupart des méthodes ne permettent pas de distinguer véritablement 1 'ADN intégré de celui qui ne l'est pas et qui sera progressivement dégradé aux stades ultérieurs de l'embryogenèse.
Chez les bovins, environ 20% des embryons microinjectés au stade "une cellule" se divisent ensuite normalement en culture, et la moitié des blastocystes obtenus (soit 10% des embryons injectés) sont détectés comme positifs [ROSCHLAU et al., J. Reprod. Fert., Suppl 58, 53-60 (1989) ; HORVAT et al., (1993), publication précitée] . Or, 20% des blastocystes (et morula) issus d'oeufs injectés sont capables de donner un veau. De ces données il ressort que 2% des embryons injectés sont susceptibles de donner naissance à un animal transgénique.
Il semble que ce pourcentage soit en réalité plus faible, de l'ordre de 0.2% [HILL et al., (1992) , publication précitée] à 0.1% seulement [SEIDEL, (1993), publication précitée] . Cette différence traduit probablement le fait que pour une partie des blastocystes obtenus, l 'ADN injecté est sous forme non intégrée. La réalisation d'un tri positif permettant de repérer les embryons où l'ADN injecté s'est effectivement intégré devient un objectif d'autant plus intéressant en pratique.
La présente Invention se propose de lever ces deux obstacles, en permettant l'analyse des embryons au stade blastocyste (ou morula) par une méthode non invasive (qui ne fait pas appel à la micromanipulation) , rapide, car permettant l'analyse de lots de blastocystes issus d'oeufs microinjectés, en ne retenant que ceux qui sont effectivement transgéniques, à un stade compatible avec leur conservation par congélation. Dans ce but, les Inventeurs ont eu 1 ' idée d'effectuer l'injection d'un transgène simultanément avec un autre transgène rapporteur qui servirait à repérer les embryons où l'intégration s'est effectivement produite.
Ceci nécessite toutefois de disposer d'un gène rapporteur s ' exprimant chez l'embryon de manière aisément détectable, et de telle sorte que ni l'expression dudit
gène, ni la détection de son activité ne compromettent la survie des embryons.
De très nombreux gènes rapporteurs sont déjà utilisés en génie génétique pour sélectionner les cellules transformées. Parmi ceux qui sont utilisés dans des cellules eucaryotes, on citera par exemple l'alcool déshydrogénase [NIELSEN et PEDERSEN, J. Exp. Zool., 257, 128-133, (1991)], l'enzyme CAT, la β-galactosidase ou la luciférase de luciole. Pour que ces systèmes rapporteurs soient compatibles avec une analyse in situ des cellules vivantes il faut les prétraiter, soit pour perméabiliser leurs membranes soit pour limiter le bruit de fond, qui augmente rapidement lors de la mesure en présence des substrats. Ce prétraitement implique des manipulations incompatibles avec une analyse rapide et en routine. L'utilisation de gènes rapporteurs dont le produit est sécrété dans le milieu pourrait lever ces obstacles. Tel est le cas avec la phosphatase alcaline du placenta humain, dont 1'activité peut être détectée dans le milieu de culture par bioluminescence. Bien que sensible, cette méthode présente plusieurs inconvénients majeurs qui la rendent difficilement applicable pour la sélection d'embryons transgéniques : elle implique de cultiver les embryons séparément, de réaliser des prélèvements répétés dans le milieu de culture ; d'autre part la détection du signal est obtenue en deux étapes, ce qui entraîne une dilution rapide du signal dans le milieu environnant, rendant en pratique la mise en oeuvre délicate.
Jusqu'à présent, le seul gène utilisé en tant que gène rapporteur pour le tri d'animaux transgéniques est un minigène de la tyrosinase qui transforme des souris albinos en souris pigmentées [OVERBEEK et al., Transgenic Research, 1, 31-37, (1991)], et qui a été mis en oeuvre chez la souris pour visualiser les nouveaux-nés transgéniques. Ce gène n'est toutefois pas utilisable
pour une visualisation précoce avant transplantation des embryons injectes.
Les Inventeurs ont maintenant sélectionné un gène rapporteur dont le produit est sécrété dans le milieu et aisément détectable : il s'agit du gène de la luciférase de Vargula ( Vargula hilgendorfii ) [THOMPSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571, (1989) ; THOMPSON et al., Gène, 199-204 (1990)].
L'activité de cette luciférase est détectable qualitativement et quantitativement par mesure de la luminescence induite dans le milieu, en présence de son substrat (luciférine) , et d'02_
Le turn-over de la luciférase de Vargula est beaucoup plus élevé que celui des autres luciférases connues (1600 molécules par minute alors qu'il n'est que de quelques dizaines pour la luciférase de mouche) , ce qui augmente d'autant la sensibilité de détection, et constitue un avantage important en imagerie de luminescence. Les Inventeurs ont en outre constaté que l'expression du gène de la luciférase de Vargula était détectable chez 1'embryon dès les premiers stades du développement (stade 2 cellules), et n'interférait pas avec le développement ultérieur. Les Inventeurs ont en outre constaté que la détection du signal lumineux résultant de l'activité de la luciférase de Vargula pouvait être utilisée pour séparer au stade blastocyste les embryons qui expriment le transgène à l'état non-intégré (expression transitoire) de ceux où une intégration a effectivement eu lieu (embryon transgénique) .
La présente Invention a pour objet l'utilisation d'un gène codant pour la luciférase de Vargula, placé sous contrôle d'un promoteur approprié, en tant que gène rapporteur pour la détection d'embryons transgéniques.
Un "promoteur approprié" est un promoteur fonctionnel dans les cellules eucaryotes, en particulier les cellules de mammifères ; n'importe quel type de promoteur utilisable pour l'obtention d'animaux transgéniques peut convenir ; à titre d'exemple, on citera le promoteur du cytomégalovirus, le promoteur de métallothionéine, celui de la thymidine kinase, celui du facteur d'élongation EF1.
Pour une mise en oeuvre optimale de l'objet de l'Invention, on choisira de préférence un promoteur fort, afin d'obtenir une expression importante de la luciférase, ce qui augmente la sensibilité de la méthode.
Les Inventeurs ont obtenu plusieurs lignées de souris transgéniques homozygotes dans lesquelles les séquences codantes du gène de la luciférase de Vargula sont placées sous la dépendance du promoteur HSP 70-1 [HUNT et CALDER OOD, Gène, 87, 199-204, (1990)]. Cette construction sera dénommée ci-après HSP-70-1-VL.
L'activité luciférase dans le milieu de culture de blastocystes prélevés sur des souris transgéniques possédant seulement 2 copies de la construction HSP-70-1-VL peut être directement visualisée, après simple addition du substrat de la luciférase, sous un microscope optique équipé d'une caméra.
Cette visualisation est rapide (10 à 30 secondes d'accumulation d'image suffisent), peut être effectuée à plusieurs stades d'évolution du blastocyste et est compatible avec le criblage simultané de plusieurs embryons.
Les Inventeurs ont en outre constaté que lorsque l'ensemble promoteur/gène de la luciférase de Vargula est flanqué en 5' et 3' de séquences SAR, le niveau moyen d'activité luciférase mesuré dans les milieux de culture de blastocystes portant cette
construction intégrée dans le génome est augmenté de façon importante (environ 10 fois) .
Des séquences SAR (Scaffold Attached Régions) également dénommées séquences MAR (Matrix Attached Régions) ont été mises en évidence en 5 ' et 3 ' du gène de 1 ' interféron β humain, [BODE et MAASS, Biochemistry, 27, 4706-4711 (1988)] . D'autres séquences SAR ont également été mises en évidence en 3 ' et 5 ' de divers gènes : [KAS AND CHASIN, J. Mol. Biol. 198: 677-692, (1987) ; GASSER AND LAEMMLI, Cell 46: 521-530, (1986) ; COCKERILL AND GARRARD, Cell 44: 273-282, (1986) ; PHI-VAN AND STRATLING, EMBO, 7: 655-664, (1988) ; JARMAN AND HIGGS, EMBO 7: 3337-3344 (1988)].
Il a été montré que ces séquences SAR augmentent, indépendamment de leur orientation, la transcription des gènes qu'elles flanquent, lorsque ceux- ci sont à l'état intégré, mais en revanche répriment l'expression de ces gènes lorsque ceux-ci sont portés par une molécule d'ADN sous forme linéarisée [KLEHR et al., Biochemistry, 30, 1264-1270 (1991)].
D'autre part, les Inventeurs ont constaté que ces mêmes séquences SAR n'exercent pas d'effet stimulateur sur l'expression du gène qu'elles flanquent lorsque 1'ADN portant cette construction est présent à l'état non-intégré, mais sous forme super-enroulée, alors que les observations faites par KLEHR et al concernaient uniquement 1'ADN linéaire déroulé.
La présence de séquences SAR permet donc d'augmenter l'écart entre le niveau d'activité luciférase due à l'expression transitoire, et celui dû à 1' expression de 1'ADN intégré.
Les Inventeurs ont en outre également constaté que 1' activité de stimulation de 1'expression du transgène par les séquences flanquantes SAR, qui est observée chez l'embryon, ne s'exerce plus dans les tissus différenciés des animaux transgéniques nouveaux-nés et
adultes, ce qui offre l'avantage de limiter les risques d'interférence d'une production élevée de luciférase avec la physiologie des animaux.
Le gène hétérologue dont on souhaite détecter l'intégration peut être placé sur le même fragment d'ADN que le gène chimérique rapporteur conforme à l'Invention. Il peut également être situé sur un autre fragment d'ADN qui est alors co-injecté avec le fragment portant le gène chimérique rapporteur. On a en effet observé que la coinjection dans l'oeuf de souris d'ADN différents est compatible avec 1'expression normale de chaque ADN dans l'animal adulte [EINAT et al. Gènes Devel., 1, 1075-1084, (1987), OVERBECK et al., Transgenic Research, 1, 31-37, (1991)] . Le gène hétérologue peut éventuellement être placé sous contrôle du même promoteur que le gène de la luciférase ; toutefois, il est préférable qu'il soit muni de ses propres séquences de contrôle (promoteur, enhancer, etc ... ) La présente Invention a pour objet un gène chimérique, utilisable en tant que gène rapporteur pour détecter l'insertion d'un gène hétérologue, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une séquence codant pour la luciférase de Vargula, laquelle séquence est placée sous contrôle d'un promoteur approprié ;
- 1'ensemble étant flanqué en 5' et 3 ' de séquences SAR.
Les Inventeurs ont établi, avec différentes constructions conformes à l'Invention et comprenant des séquences SAR, plusieurs lignées de souris transgéniques. En quantifiant l'activité luciférase de leurs embryons, il est possible de mesurer finement l'effet de perturbations de 1'environnement chromatinien sur l'activité du noyau embryonnaire à différents stades de la période préimplantatoire.
La présente Invention peut être mise en oeuvre pour rendre utilisable en routine chez différentes espèces animales, y compris les mammifères, mais également d'autres animaux tels que les poissons, et en particulier chez les animaux d'élevage, le tri, à différents stades du développement, des embryons effectivement transgéniques après microinjection au stade pronoyau.
Chez la souris, on sait que environ la moitié des blastocystes positifs pour la présence d'ADN exogène après injection au stade pronoyau (et détection après amplification par PCR) sont effectivement transgéniques. On peut utiliser cette espèce pour réaliser un calibrage des constructions en définissant lors de l'observation des embryons en microscopie de luminescence un temps seuil d'enregistrement des images obtenues, temps à partir duquel seule l'activité des morulas ou blastocystes transgéniques sera effectivement prise en compte. Les Inventeurs ont en outre obtenu plusieurs lignées de cellules pluripotentes et totipotentes, dérivées d'animaux transgéniques conformes à l'invention.
La présente Invention sera mieux comprise à 1'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de construction d'animaux transgéniques conformes à l'Invention, et de détection de l'activité luciférase chez les embryons de ces animaux.
Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Un fragment HincII de 800 pb comprenant les éléments essentiels du promoteur du gène HSP70-1 de souris [HUNT et CALDERWOOD, Gène, 87, 199-204, (1990)] ., à savoir 4 éléments inductibles par choc thermique, disposés en tandem, et permettant la liaison de facteurs de transcription spécifiques du choc thermique ; une boîte CCAAT en orientation inverse; une boîte TATA en orientation inverse ; deux sites de liaison pour le facteur de transcription SP1, et un site de liaison pour le facteur de transcription AP2, a été obtenu à partir d'un fragment BglII-NcoI isolé d'un fragment EcoRI du plasmide pM2.3 de HUNT et CALDERWOOD (Gène 87, 199-204, 1990) et clone au site HincII du plasmide pBluescript SK (STRATAGENE) . Le plasmide ainsi obtenu a été dénommé pBHS
Un fragment HindIII-BamHI de 2000 pb codant pour la luciférase de Vargula a été obtenu à partir du plasmide PRSWL [THOMSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571 (1989)] et clone entre les sites Hind III et BamHI du vecteur pBHS. Le plasmide obtenu de la sorte a été dénommé pBHSVL. EXEMPLE 2 - CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE COMPRENANT DES SEQUENCES SAR 3' et 5'
D'autre part, des séquences SAR 5' et 3 ' ont été obtenues comme suit :
A partir d'une banque d'ADNc humain, il est possible d'amplifier la séquence du gène codant pour 1 ' interféron β, en utilisant des amorces appropriées, dérivées de la séquence publiée par OHNO et TANIGUCHI,
[Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 5305-5309, (1981)]. Après purification du fragment amplifié par électrophorèse sur gel d'agarose, des sondes marquées au 32P sont obtenues par amorçage aléatoire à partir de ce fragment ; ces sondes sont alors utilisées pour cribler une banque d'ADN
génomique humain, afin d'obtenir des clones génomiques comprennant les séquences flanquantes 5 ' et 3 ' du gène de 1' interféronβ.
A partir des clones génomiques obtenus, et en se basant sur la carte de restriction des régions SAR en 3 ' et 5' du gène de 1'interféron β qui a été publiée par BODE et MAASS, [Biochemistry, 27: 4706-4711, (1988)], l'on procède au sous-clonage d'un fragment EcoRI de 2,2 kb qui comprend la séquence SAR 5', et d'un fragment BglIII de 3 kb qui comprend la séquence SAR 3 ' .
Le fragment BglIII de 3 kb a été clone dans le site BamHI du plasmide pBHSVL décrit ci-dessus pour donner le plasmide pSHSVL. D'autre part, le fragment EcoRI de 2,2 kb préalablement pourvu à chacune de ses extrémités d'adaptateurs XhoI-EcoRI a été inséré dans le site Xhol de pSHSVL, en 5' du promoteur HSP70.1.
Le plasmide obtenu a été dénommé pSHSVLS. EXEMPLE 3 - OBTENTION DE SOURIS TRANSGENIQUES
Les souris transgéniques ont été obtenues à partir des deux constructions différentes, pBHSVL (SAR-) et pSHSVLS (SAR+) obtenues selon les protocoles décrits respectivement aux exemples 1 et 2.
Les fragments Kpnl-BamHI de pBHSVL et Kpnl- Notl de pSHSVLS ont été purifiés à partir de gels d'agarose (kit GENE CLEAN ; BIO 101), et l'ADN a été injecté à une concentration de 2ng/μl dans les pronuclei d'oeufs fertilisés obtenus par croisement d'hybrides Fl (mâles et femelles) C57BL6/CDA.
Les fondateurs transgéniques ont été identifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques du gène de la luciférase de Vargula. Le nombre de copies du gène a été déterminé par analyse densitometrique de transferts de Southern réalisés de façon quantitative. Après identification des fondateurs, ceux-ci ont été croisés entre eux afin d'obtenir des animaux homozygotes pour le transgène.
EXEMPLE 4 - OBTENTION DES EMBRYONS ET DES TISSUS D'ANIMAUX TRANSGENIQUES
1) Embryons
Une surovulation a été induite chez des hybrides FI femelles C57BL6/CBA, en injectant 10U de gonadotropine de sérum de jument gestante (PMSG ; INTERVET) dans 0,1 ml de sérum physiologique, cette injection étant suivie 46 à 48 heures plus tard par l'injection de 5U de gonadotropine chorionique humaine (HCG ; INTERVET), dans 0,1 ml de la même solution. Les femelles traitées ont été accouplées avec des mâles transgéniques homozygotes pour le transgène, et des embryons au stade 1 cellule ont été récupérés dans les oviductes 21 à 23 heures après l'injection d'HCG. Les embryons ont été placés dans des gouttes de milieu M16 [HOGAN et al., Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1986)] à une densité d'environ 1 embryon/ml de milieu de culture. Les embryons ont été cultivés en incubateur, à une température de 37 "C et en présence de 8% C02.
L'expression constitutive est mesurée tout au long de la période de culture en prélevant un peu de milieu à des intervalles de temps souhaités, et en le remplaçant à chaque fois par du milieu frais. Chaque fraction prélevée est immédiatement congelée à -80"C jusqu'à la détection de l'activité luciférase.
Pour déterminer l'expression inductible au stade blastocyte, des boîtes de cultures contenant des blastocytes (101-112 heures après HCG) scellées au moyen d'un film d'étanchéité, ont été immergées dans un bain d'eau à 43 *C pendant 30 minutes. Le film d' étanchéité a été enlevé, et les boîtes placées à nouveau dans l'incubateur à 37 "C. La luciférase de Vargula commence à s'accumuler dans le milieu après environ 3 heures. On peut suivre la cinétique d'accumulation par des
prélèvements successifs, ou mesurer la quantité totale accumulée à la fin de la culture.
2) Tissus d'animaux transgéniques Des femelles de génération Fl de la lignée hybride C57BL6/CBA ont été accouplées avec des mâles homozygotes pour le transgène. Les gestations ont été menées à terme, et deux lots d'animaux ont été choisis pour les expérimentations : ou bien des souriceaux de 1 jour, ou des adultes de 5 semaines. Les animaux ont été sacrifiés et des échantillons de tissu prélevés.
EXEMPLE 5 - DETERMINATION DE L'ACTIVITE LUCIFERASE
L'activité de la luciférase sécrétée par les embryons est analysée par deux méthodes différentes : 1ère méthode : On prélève un aliquot du milieu de culture des embryons. Cet aliquot est alors dilué avec 200 mM de Tris-HCl, pH 7,6, jusqu'à un volume de 100 μl. L'échantillon ainsi dilué est placé au fond d'un tube de mesure de 5 ml (SARSTEDT) et introduit dans la chambre de mesure d'un photomètre LUMAT LB 9501 (BERTHOLD Instruments) . La luciférine, substrat de la luciférase de Vargula, est préparée selon l'un des protocoles décrits par TSUJI [Methods Enzy ol. 57, 364-372, (1978)], ou par KISHI et al., [Tetrahedron Lett., 3445-3450, (1966)], INOUE et al. [Tetrahedron Lett., 1609-1610, (1969)], SUGIURA et al., [Yakugaku Zasshi, 90, 707-710 (1970]. Une solution 100 nM de luciférase dans 200 mM de tampon phosphate de sodium à pH 6,8 est placée dans un récipient de verre dans lequel on fait barboter en continu de l'argon (afin de prévenir l'auto-oxydation de la luciférine). Pour mesurer l'activité luciférase de l'échantillon, 100 μl de la solution de luciférine est injectée dans le tube comprenant l'échantillon, et l'intensité de la lumière émise est mesurée par le photometre.
2ème méthode : L'activité luciférase peut également être visualisée directement sous microscope, muni d'une caméra (Argus-50, HAMMAMATSU instruments) . Des gouttes de 2 μl d'une solution 50 μM de luciférine dans du tampon PBS sont disposées dans la chambre de microscopie, et recouvertes d'huile. Les embryons sont introduits dans ces gouttes, et l'ensemble est placé sous un microscope à inversion muni d'une caméra. Après exposition pendant une période de 10 à 30 secondes, la luminescence émise par les embryons transgéniques qui ont intégré le gène de la luciférase est détectée, ce qui permet la sélection des embryons. RESULTATS : Il est connu que le gène HSP70-1 s'exprime de façon constitutive chez l'embryon au stade 2-cellules et est inductible par le choc thermique au stade blastocyte [BENSAUDE et al., Nature, 305, 331-333, (1983)] .
Le développement in vi tro des embryons transgéniques contenant les constructions avec les séquences SAR, ou sans celles-ci, est le même que celles des embryons non transgéniques utilisés comme contrôle. Les lignées SAR+ montrent une expression plus élevée que les lignées SAR- aussi bien au stade 2-cellules qu'au stade blastocyte. Au stade 2-cellules, toutes les lignées SAR- montrent pratiquement le même niveau basai d'expression, qui n'apparaît pas dépendant du nombre de copies. En revanche, les lignées transgéniques SAR+ expriment la luciférase à des niveaux plus élevés, et l'expression est fonction du nombre de copies. En moyenne, on observe une expression 6 fois plus élevée dans le groupe SAR+ que dans le groupe SAR-. Lorsque cette expression est ramenée au nombre de copies, on observe une augmentation 2 fois et demi plus élevée dans le groupe SAR+ que dans le groupe SAR-. Au stade blastocyte, le même type d'observations a été fait : les lignées SAR- expriment la
luciférase de façon indépendante du nombre de copies, alors que dans les lignées SAR+ 1'expression de la luciférase est en corrélation positive avec le nombre de copies. L'expression par copie dans les lignées SAR+ est 4,1 fois plus importante que l'expression par copie dans les lignées SAR-.
Les résultats de 1'expression dans les tissus d'animaux nouveaux-nés et d'adultes montrent qu'il n'y a plus de stimulation de 1'expression du transgène par les séquences flanquantes SAR dans les tissus différenciés, à l'exception toutefois des biopsies de queue, dans lesquelles il semble que les séquences SAR confèrent encore un certain degré de stimulation de l'expression du transgène. En outre, l'expression du transgène décroît de la souris nouveau-né à la souris adulte dans le cas des lignées SAR-, alors que dans le cas des lignées SAR+ elle est sensiblement équivalente quelque soit 1'âge de 1'animal.
Claims
REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un gène codant pour la luciférase de Vargula, placé sous contrôle d'un promoteur approprié, en tant que gène rapporteur pour la détection d' embryons transgéniques.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit promoteur est le promoteur HSP70-1.
3) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que 1 'ensemble promoteur/gène de la luciférase de Vargula est flanqué en 5' et 3 ' de séquences SAR.
4) Gène chimérique, utilisable en tant que gène rapporteur pour détecter l'insertion d'un gène hétérologue, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une séquence codant pour la luciférase de Vargula, laquelle séquence est placée sous contrôle d'un promoteur approprié ;
- 1'ensemble étant flanqué en 5 ' et 3 ' de séquences SAR.
5) Animal transgénique, caractérisé en ce qu' il comprend au moins une copie du gène codant pour la luciférase de Vargula, sous contrôle d'un promoteur approprié. 6) Animal transgénique selon la revendication
5, caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimérique selon la revendication 4.
7) Animal transgénique selon 1 'une quelconque des revendictions 5 ou 6 caractérisé en ce que ledit animal est un mammifère.
8) Embryon d'un animal selon une quelconque des revendications 5 à 7.
9). Lignée cellulaire, caractérisée en ce qu'elle est dérivée d'un animal selon une quelconque des revendications 5 à 7, et en ce que chaque cellule de ladite lignée comprend au moins une copie du gène codant
pour la luciférase de Vargula, sous contrôle d'un promoteur approprié.
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