+

WO1995019976A1 - Derives chemoluminescents heterocycliques - Google Patents

Derives chemoluminescents heterocycliques Download PDF

Info

Publication number
WO1995019976A1
WO1995019976A1 PCT/BE1995/000007 BE9500007W WO9519976A1 WO 1995019976 A1 WO1995019976 A1 WO 1995019976A1 BE 9500007 W BE9500007 W BE 9500007W WO 9519976 A1 WO9519976 A1 WO 9519976A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
chemoluminescent
derivatives
formula
optionally substituted
Prior art date
Application number
PCT/BE1995/000007
Other languages
English (en)
Inventor
Roger Remy Renotte
Guy Nicolas Sarlet
Robert Ghislain Lejeune
Original Assignee
Biocode S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocode S.A. filed Critical Biocode S.A.
Priority to AU15292/95A priority Critical patent/AU1529295A/en
Priority to EP95906853A priority patent/EP0741720A1/fr
Publication of WO1995019976A1 publication Critical patent/WO1995019976A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/26—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
    • C07D219/04—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/06—Ring systems of three rings
    • C07D221/10—Aza-phenanthrenes
    • C07D221/12—Phenanthridines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to heterocyclic chemoluminescent derivatives of acridinium, substituted acridinium derivatives, phenanthridinium, substituted phenantridinium derivatives, quinolenium, substituted quinolenium derivatives, isoquinolenium and substituted isoquinolenium derivatives as well as a conjugate comprising one of these derivatives, linked to a specific biological component.
  • Another aspect of the invention relates to the diagnostic and / or assay kit comprising this conjugate or one of these derivatives, and the use of the conjugate or of one of these chemoluminescent derivatives for the assay and / or detection of a specific biological compound.
  • Chemoluminescence is a formation of light obtained by a chemical reaction.
  • the general mechanism of this reaction has been described in particular by Schuster et al (Advances in Physical Organic Chemistry, 187-238 (1984)) by the following reaction:
  • chemoluminescence immuno assay This chemoluminescence process is widely used in analytical chemistry and clinical biology, in particular for immunoassays (chemoluminescence immuno assay or "CLIA").
  • EP - A- 273115, EP - A - 257 541 and EP - A - 263657 describe heterocyclic chemoluminescent compounds derived from acr idinium, phenantr idinium, quinolenium and isoquinolenium and their isomers, optionally conjugated to antigens, antibodies or nucleic acids for use in chemoluminescence tests.
  • the chemoluminescent power of these derivatives is calculated by the emission of light generated in contact with hydrogen peroxide in an alkaline medium. Studies by F. McCapra (Accounts of Chemical Research (1976), 9, 6, p. 201-209) have established a mechanism of chemoluminescence of acridinium compounds.
  • the present invention aims to obtain heterocyclic derivatives of acridinium, phenant idinium, quinoline and isoquinolenium as well as their isomers and any derivatives obtained by substitution, improved, in particular stable derivatives and / or having chemoluminescence high, in particular when the pKa value of the leaving group is high, preferably when the pKa is greater than 12.
  • the present invention also aims to obtain chemoluminescent derivatives characterized by a dose-response curve allowing their use in the assay and / or diagnosis over a wide concentration range.
  • a final object of the present invention is to obtain a diagnostic kit comprising said active and / or stable chemoluminescent derivative. Characteristic elements of the invention.
  • the present invention relates to derivatives heterocyclic chemoluminescent, preferably derivatives chosen from the group consisting of acridinium, substituted acridinium, phenanthridinium, substituted phenantridinium, quinolenium, substituted quinolenium, isoquinolenium and substituted isoquinolenium corresponding to formulas I IV times in Figure 1, in which:
  • R x is H, a radical chosen from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl and heteroarylalkyl, optionally substituted, or a chain of formula [R ⁇ XR ⁇ ] n where n ⁇ 1 and X represents one or more heteroatoms, - R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 / R ⁇ o ' R n e R i2 are substituents which do not interfere with chemoluminescence (but which can modify it qualitatively and quantitatively), R 3 to R 12 are hydrogen or radicals chosen from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl and heteroarylalkyl, optionally substituted,
  • R 2 is an amine, a hydroxylamine, a chaicogenolamine, an oxi e or an isostere of oxime, and their phosphorus, aesene and antimony analogs the radical or radicals of which are chosen from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl arylalkyl, heteroaryl, heteroarylalkyl, acyl, arylacyl, hdisputedroarylacyle, alkylsulfonyl, alkénylsulfonyle, alkynylsulfonyle, arylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, alkylsulfinyl, alkénylsulfinyle, alkynylsulfinyle arylsulfinyl, heteroarylsulfinyl, alkylsulfinyl, alkénylsul
  • X and Y are elements chosen from the group consisting of 0, S, Se and Te and in which R 13 , R 14 and / or R 15 are radicals chosen from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl and heteroarylalkyl, optionally substituted, - or a chalcogenolamine of formula:
  • - Z represents an element chosen from the group consisting of O, S, Se and Te,
  • A represents an element chosen from the group consisting of N, P, As, Sb,
  • X represents an element chosen from the group consisting of C, O, S, Se and Te,
  • Y represents an element chosen from the group consisting of O, S, Se and Te and
  • R 13 , R 14 and / or R 15 are radicals chosen from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl and heteroarylalkyl, optionally substituted, - either an oxime or an isostere of oxime and its phosphorous derivatives , arsenic and antimony of formula:
  • X is an element chosen from the group consisting of N, P, As, Sb and C - R 15 and
  • R 13 , R 14 and R 1S are radicals chosen from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl and heteroarylalkyl, optionally substituted.
  • R x is a methyl
  • R 2 is an amine of formula: R 13
  • R-_ is a methyl
  • R 2 is an amine of formula:
  • R 13 and R 14 are aryl or heteroaryl radicals, optionally substituted.
  • R x is a methyl
  • R 2 is an amine of formula:
  • R 13 and R 14 are aryl or heteroaryl radicals, optionally substituted.
  • R x is a methyl
  • R 2 is a hydroxylamine or a chalcogenolamine of formula:
  • - 'R I3 is an alkyl, aryl or heteroaryl radical, possibly substituted and
  • R 14 is an acyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl or arylcarboxyl radical, optionally substituted.
  • R 1 is a methyl
  • R 2 is an oxime of formula:
  • R 13 and R 14 are optionally substituted alkyl, aryl or heteroaryl radicals.
  • the chemoluminescent derivatives are the compounds: N-phenyl-N- (N-methylpyr idinium -2 -yl) - 10 -methylacr idinium- 9 - carboxamide or
  • conjugate comprising a chemoluminescent derivative according to the invention linked to a specific biological component.
  • specific biological compound means any biological molecule (lipid, saccharide, protein, peptide, nucleic acid, ...) or set of biological molecules, specific to a species (viral, bacterial, plant, animal or other) , an individual, a pathology (such as cancer or caused by a viral, bacterial or other agent), an activity or a biochemical system (such as an enzymatic reaction, ).
  • Said biological component is capable of being detected and / or measured, or capable of being used for assaying and / or detecting a specific biological component.
  • this specific biological compound is chosen from the group consisting of antibodies, haptens, antigens, nucleic acids, agonists, cell transporters, fatty acids, lipids and / or a mixture of them.
  • the present invention also relates to the diagnostic and / or assay kit comprising the conjugate or one of the chemoluminescent derivatives according to the invention and the use of the conjugate and / or of a chemoluminescent derivative according to the invention for the assay and / or the detection of a specific biological compound.
  • the diagnostic and / or assay kit comprising the conjugate or one of the chemoluminescent derivatives according to the invention and the use of the conjugate and / or of a chemoluminescent derivative according to the invention for the assay and / or the detection of a specific biological compound.
  • FIG. 1 represents the general formulas of the chemoluminescent derivatives according to the present invention.
  • FIG. 2 represents the synthesis of the N-phenyl-N- iodomercurate (N-methylpyridinium-2-yl) -10- methylacridinium-9-carboxamide (BPACAM1) according to the invention.
  • FIG. 3 represents the synthesis of the iodomercurate of N- (N 1 -hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -N-
  • FIG. 4 represents the synthesis of the iodomercurate of N-pyridyl-N- (N-methylpyridinium-2-yl) -10- methylacridinium-9-carboxamide (PPACAM1) according to the invention.
  • FIG. 5 represents the synthesis of the i o d o m e r c u r a t e of (N - hydroxysuccinimidylformylpropionanilide) -10-methylacridinium-9-carboxylate (FA6) according to the invention.
  • FIG. 6 represents the synthesis of the i o d o m e r c u r a t e of (N - hydroxysuccinimidylformylpropioperfluoroanilide) -10 - methylacridinium-9-carboxylate (FA13) according to the invention.
  • FIG. 7 represents the synthesis of the iodomercurate of 4 - (-methylsulfonamido- (N-hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -methylacridinium-9 - carboxylate (SHA1) according to the invention.
  • FIG. 8 represents the synthesis of 4- (N-perfluorophenylsulfonamido- (N-hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -methylacridinium-9-carboxylate iodomercurate according to the invention.
  • Figure 9 shows the synthesis of
  • FIG. 10 represents the synthesis of the iodomercurate of (1- (N-hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -1-perfluorophenyl-1-iminomethane) -10-methylacridinium-9 - carboxylate (FA12) according to the invention.
  • FIG. 12 represents the synthesis of the iodomercurate of 4 - (N-phenylsulfonamido - (N-hydroxysuccinimidyl) ' -benzoate) -10 -methylacridinium-9 - carboxylate (SHA2) according to the invention.
  • FIG. 13 represents a comparative study of the stability of FA6, FA10 and DMAE (measurement of chemoluminescence as a function of time).
  • Figures 14 to 29 show the mass spectra of the products of the invention.
  • Figures 30 to 47 show the infrared spectra of the products of the invention.
  • EXAMPLE 1 SYNTHESIS OF BPACAM1 (fi ⁇ . 2).
  • the acid chloride is suspended in 40 ml of anhydrous tetrahydrofuran (THF) containing three equivalents of triethylamine (Et 3 N). The mixture is stirred, and 1.52 g of
  • EXAMPLE 2 SYNTHESIS OF BPCAM3. (fia. 3).
  • the purification of product III is carried out by solubilization of the acid in basic medium, passage over active carbon and reprecipitation in acid medium.
  • EXAMPLE 3 SYNTHESIS OF PPACAM1. (fia. 4)
  • Product III is isolated from the solution by precipitation with petroleum ether (100/140).
  • N-phenylhvdroxylamine 500 ml of water, 25 g of ammonium chloride (NH 4 C1) are placed in a 2-liter berlin and 50 g of nitrobenzene (I). This mixture is mechanically stirred and 62 g of powdered zinc are added in portions to the solution. After 15 minutes the solution heats up and the rest of the zinc (about 30 g) is carefully added to the solution. The temperature of the reaction mixture is between 65 and 80 ° C throughout the duration of the reduction.
  • the solution is filtered to remove the zinc oxide.
  • the filtrate is then saturated with NaCl and cooled as quickly as possible to 0 ° C.
  • the N-phenylhydroxylamine (II) which crystallizes from the solution is isolated by filtration and freed from nitrobenzene which may be present by washing with petroleum ether.
  • the product is then dried over P 2 O s and stored under nitrogen at -20 ° C.
  • product VI 1 g is dissolved in 30 ml of anhydrous dioxane. To this solution, 0.23 g of N-hydroxysuccinimide (NHS) and 0.41 g of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) are added. The disappearance of product VI is followed by thin layer chromatography. When the reaction is complete, the dicyclohexylurea formed is removed by filtration and the solvent distilled under reduced pressure. The residue is taken up in 10 ml of ethyl acetate to precipitate the remaining dicyclohexylurea. The product (VII) is purified by chromatography on a silica column, the mobile phase being a mixture of toluene and ethyl acetate (v / v: 2: 1).
  • EXAMPLE 6 SYNTHESIS OF SHA1 (Fi ⁇ 7). Iodomercurate of 4- (N-methylsulfonamido - (N- hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -methylacridinium-9 - carboxylate
  • EXAMPLE 8 SYNTHESIS OF SHA3 (Fi ⁇ . 8).
  • the N-perfluorophenylhydroxylamine (II) crystallizes from the solution. It is isolated by filtration and dried under vacuum. The product is stored under nitrogen at -20 ° C.
  • the residue is dissolved in chloroform, the chloroform phase is washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • the crude product (IV) is obtained after evaporation of the solvent on a rotary evaporator.
  • the pure product is obtained by recrystallization from toluene.
  • EXAMPLE 10 SYNTHESIS OF FA12 (Fig. 10). (1- (N-hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -1- perfluorophenyl-1-iminomethane) -10 -methylacridinium-9-carboxylate iodomercurate
  • the residue is taken up in 10 ml of ethyl acetate to precipitate the remaining dicyclohexylurea.
  • the product (VII) is purified by chromatography on a silica column, the mobile phase consisting of a mixture of toluene and ethyl acetate (v / v: 4: 1).
  • a solution of chloramine (IV) is also prepared by reaction of 2 g of diethylamine dissolved in 10 ml of ice water with 5.5 ml of ice cold solution of sodium hypochlorite with 13% active chlorine.
  • EXAMPLE 12 CHEMOLUMINESCENCE TESTS.
  • the derivatives having, like the products of the invention, a leaving group Y, with a pKa greater than that of hydrogen peroxide (pKa> 12) would not give a sufficient chemoluminescent signal.
  • Table I shown on the next page gives the values obtained by integration of the chemoluminescent signal caused by chemical reaction between the substance and hydrogen peroxide in an alkaline medium. It also provides the approximate pKa values of the leaving group Y of the substances tested.
  • substances (1) and (2) give very weak signals. This is easily explained by the values of pKa which are much higher than that of H 2 0 2 .
  • the phenolic ester DMAE-NHS produces a high chemoluminescence which can be explained by a relatively low pKa value.
  • FA6 generates a higher concentration of luninecence at a higher concentration than that of acridinium phenol esters, but when the quantity used is less than 10 "14 mole, the signal given by FA6 is higher and this effect is even more marked when the quantities are reduced further; on the other hand, the linear response extends for FA6 over almost 6 orders of magnitude while it is limited to four in the case of the phenolic esters d 'acridinium.
  • SHA1 The marked difference between SHA1 and FA5 would be linked to the replacement of the carboxyl of FA5 by a sulfonyl more sensor in SHA1.
  • EXAMPLE 13 DETERMINATION OF TSH USING AN ANTIBODY MARKED BY
  • the elution is monitored by measuring the luminescence of the fractions and the fraction corresponding to molecular weights between 100,000 and 200,000 is collected and characterized by a high luminescent power.
  • the collected solution is concentrated on an ultrafiltering membrane and the absence of luminescent products in the ultrafiltrate is checked.
  • the samples are prepared in a similar way to the calibration curve, but replacing the standards by them will be to be dosed.
  • the supernatant present in the standards and the samples is removed by aspiration. 2 ml of washing solution are added to each tube (0.1 M phosphate buffer 0.5 M NaCl adjusted to pH 7.4; protein and detergent). It is left to act for one minute and then the solution is aspirated. We repeat the procedure.
  • the tubes are introduced into the luminometer which performs the measurement and the automated addition of the reagents (300 ⁇ l of 0.1 M nitric solution of 0.5% hydrogen peroxide followed by 300 ⁇ l of 0.25 M hydroxide solution sodium.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

La présente invention concerne des dérivés chemoluminescents hétérocycliques d'acridinium, de dérivés substitués d'acridinium, de phénanthridinium, de dérivés substitués de phénanthridinium, de quinolénium, de dérivés substitués de quinolénium, d'isoquinolénium et de dérivés substitués d'isoquinolénium correspondant aux formules (I) à (IV).

Description

DERIVES CHEMOLUMINESCENTS HETEROCYCLIQUES. Objet de l'invention.
La présente invention concerne des dérivés chemoluminescents heterocycliques d'acridinium, de dérivés substitués d'acridinium, de phénanthridinium, de dérivés substitués de phenantridinium, de quinolenium, de dérivés substitués de quinolenium, d' isoquinolenium et de dérivés substitués d' isoquinolenium ainsi qu'un conjugué comprenant un de ces dérivés, lié à un composant biologique spécifique.
Un autre aspect de l'invention concerne la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant ce conjugué ou un de ces dérivés, et l'utilisation du conjugué ou d'un de ces dérivés chemoluminescents pour le dosage et/ou la détection d'un composé biologique spécifique. Arrière-plan technologique à la base de l'invention.
La chemoluminescence est une formation de lumière obtenue par une réaction chimique. Le mécanisme général de cette réaction a été notamment décrit par Schuster et al (Advances in Physical Organic Chemistry, 187-238 (1984)) par la réaction suivante :
A > B* > B + hv Le composé A, par une réaction chimique , physique ou biochimique ( le plus souvent par une oxydation avec un peroxyde) donne un produit à un état excité ( "B* " ) qui revient à l ' état fondamental par l ' émission de lumière (hv) .
Ce procédé de chemoluminescence est largement utilisé en chimie analytique et en biologie clinique , notamment pour les immunodosages (chemoluminescence immuno assay ou " CLIA" ) .
Les demandes de br evet EP - A- 273115 , EP - A - 257 541 et EP - A - 263657 décr ivent des composés chemoluminescents heter ocycliques dér ivés d ' acr idinium, de phenantr idinium, de quinolenium et d' isoquinolenium et leurs isomères, éventuellement conjugués à des antigènes, des anticorps ou des acides nucléiques pour être utilisés dans des tests de chemoluminescence . Le pouvoir chemoluminescent de ces dérivés est calculé par l'émission de lumière engendrée au contact de l'eau oxygénée en milieu alcalin. Des études réalisées par F. McCapra (Accounts of Chemical Research (1976) , 9, 6, p. 201-209) ont permis d'établir un mécanisme de chemoluminescence des composés d'acridinium. Il postule la formation d'un intermédiaire réactionnel excité (dioxétane) qui se décompose en C02 et en méthylacridone. Il implique également le déplacement par H202 d'un groupement partant Y. Ce déplacement serait, selon la théorie généralement admise, possible pour des dérivés présentant un groupement Y possédant un pKa inférieur à celui de l'eau oxygénée (pKa < 12) . Buts de l'invention.
La présente invention a pour but d'obtenir des dérivés heterocycliques d'acridinium, de phenant idinium, de quinoléinium et d'isoquinolenium ainsi que leurs isomères et dérivés quelconques obtenus par substitution, améliorés, en particulier des dérivés stables et/ou présentant une chemoluminescence élevée, notamment lorsque la valeur du pKa du groupement partant est élevée, de préférence lorsque le pKa est supérieur à 12.
La présente invention a également pour but d'obtenir des dérivés chemoluminescents caractérisés par une courbe dose - réponse permettant leur utilisation dans le dosage et/ou le diagnostic sur une large plage de concentration.
Un dernier but de la présente invention est d'obtenir une trousse de diagnostic comprenant ledit dérivé chemoluminescent actif et/ou stable. Eléments caractéristiques de l'invention.
La présente invention concerne des dérivés chemoluminescents heterocycliques, de préférence des dérivés choisis parmi le groupe constitué par les dérivés d'acridinium, d'acridinium substitué, de phénanthridinium, de phenantridinium substitué, de quinolenium, de quinolenium substitué, d' isoquinolenium et d'isoquinolenium substitué correspondant aux formules I à IV reprises à la figure 1, dans lesquelles :
B représente un élément choisi parmi le groupe constitué par 0, S, Se et Te, - Rx est H, un radical choisi parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués, ou une chaîne de formule [R^XR^]n où n ≥ 1 et X représente un ou plusieurs hétéroatomes, - R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9/ Rιo' Rn e Ri2 sont des substituants n'interférant pas avec la chemoluminescence (mais pouvant la modifier qualitativement et quantitativement) , R3 à R12 sont l'hydrogène ou des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués,
R2 est une aminé, une hydroxylamine, une chaicogénolamine, une oxi e ou un isostère d'oxime, et leurs analogues phosphores, aeseniés et antimoniés dont le ou les radicaux sont choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle, hétéroarylalkyle, acyle, arylacyle, hétéroarylacyle, alkylsulfonyle, alkénylsulfonyle, alkynylsulfonyle, arylsulfonyle, hétéroarylsulfonyle, alkylsulfinyle, alkénylsulfinyle, alkynylsulfinyle arylsulfinyle, hétéroarylsulfinyle, alkylsulfényle, alkénylsulfényle, alkynylsulfényle, arylsulfényle, hétéroarylsulfényle éventuellement substitués et dans lesquels le soufre peut être remplacé par un quelconque chalcogène. De préférence, R2 est soit une aminé de formule
R_3 R13 Y R13 R15 / / / / /
- N - X - - R14 , - N - X - R14 OU - N - X - R H.4 ' dans laquelle X et Y sont des éléments choisis parmi le groupe constitué par 0, S, Se et Te et dans lequel R13, R14 et/ou R15 sont des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués, - soit une chalcogénolamine de formule:
R13 R13 Y R13 R15
/ / / / /
- Z - A - X - R14 , - Z - A - X - R14 , - Z - A - X - R14
R13
/ ou — Z — A — R14 dans laquelle - Z représente un élément choisi parmi le groupe constitué par O, S, Se et Te,
A représente un élément choisi parmi le groupe constitué par N, P, As, Sb,
X représente un élément choisi parmi le groupe constitué par C, O, S, Se et Te,
Y représente un élément choisi parmi le groupe constitué par O, S, Se et Te et
R13, R14 et/ou R15 sont des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués, - soit une oxime ou un isostère d'oxime et ses dérivés phosphores, arséniés et antimoniés de formule:
- O - X = C - R14 ,
dans lequel X est un élément choisi parmi le groupe constitué par N, P, As, Sb et C - R15 et
R13, R14 et R1S sont des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués.
De préférence, dans les dérivés chemoluminescents selon l'invention, Rx est un methyle, R2 est une aminé de formule : R13
/
- N - S - R14 , dans laquelle R13 et R14 sont des radicaux aryle ou hétéroaryle, éventuellement substitués. De préférence, dans les dérivés chemoluminescents selon l'invention, R-_ est un methyle, R2 est une aminé de formule :
Figure imgf000007_0001
- N - SO - R14 , dans laquelle R13 et R14 sont des radicaux aryle ou hétéroaryle, éventuellement substitués.
De préférence, dans les dérivés chemoluminescents selon l'invention, Rx est un methyle, R2 est une aminé de formule :
Figure imgf000007_0002
- N - R14 , dans laquelle R13 et R14 sont des radicaux aryle ou hétéroaryle, éventuellement substitués.
De préférence, dans les dérivés chemoluminescents selon l'invention, Rx est un methyle, R2 est une hydroxylamine ou une chalcogénolamine de formule :
R13 R13 / /
_ O - N - R14 ou - S - N - R14, dans laquelle
- ' RI3 est un radical alkyle, aryle ou hétéroaryle, éventuellement substitué et
R14 est un radical acyle, alkylsulfonyle, arylsulfonyle ou arylcarboxyle, éventuellement substitué.
De préférence, dans les dérivés chemoluminescents selon l'invention, R1 est un methyle, R2 est une oxime de formule :
Figure imgf000008_0001
/ - O - N = C - R14 , dans laquelle R13 et R14 sont des radicaux alkyle, aryle ou hétéroaryle éventuellement substitués.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, les dérivés chemoluminescents sont les composés: N-phényl-N- (N-méthylpyr idinium -2 -yl) - 10 -méthylacr idinium- 9 - carboxamide ou
N- (N' - hyd oxy succinimidy lbenzoate - 4 -yl) -N- (N' ' - méthylpyridinium-2-yl) - 10 -méthylacr idinium- 9 -carboxamide ou
N-pyridyl-2-yl-N- (N-méthylpyridinium-2-yl) -10 - méthylacr idinium- 9 -carboxamide ou
(N - hydr oxy succinimi'dy lf ormy lpr opionanilide ) -10 - méthylacr idinium- 9 -carboxylate ou
(N-hydroxysuccinimidylf ormylpropioperf luoroanilide) -10 - méthylacr idiniu -9 -carboxylate ou 4- (N-méthylsulfonamido- (N-hydroxysuccinimidyl) -benzoate) -
10 -méthylacridinium-9 -carboxylate ou
4- (N-perf luorophénylsulf onamido- (N-hydroxysuccinimidyl) - benzoate) - 10 -méthylacr idinium- 9 -carboxylate ou
( 1 - méthy 1 - 1 - per f luor ophény 1 - 1 - iminométhane ) -10 - méthylacridinium-9-carboxylate ou
(1- (N-hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -1-perfluorophényl- 1-iminométhane) -10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
(N,N-diéthyla ino) -10-méthylacridinium-9-thio-S-carboxylate ou
(N,N-diéthylamino) -10-méthylacridinium-9-thio-O-carboxylate ou 4- (N-phénylsulfonamido- (N-hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10-méthylacridinium-9-carboxylate.
Un autre aspect de l'invention concerne le conjugué comprenant un dérivé chemoluminescent selon l'invention lié à un composant biologique spécifique. On entend par "composé biologique spécifique", toute molécule biologique (lipide, saccharide, protéine, peptide, acide nucléique, ...) ou ensemble de molécules biologiques, spécifiques d'une espèce (virale, bactérienne, végétale, animale ou autre) , d'un individu, d'une pathologie (telle que le cancer ou causée par un agent viral, bactérien ou autre) , d'une activité ou d'un système biochimique (telle qu'une réaction enzymatique, ...) .
Ledit composant biologique est susceptible d'être détecté et/ou dosé, ou susceptible de servir au dosage et/ou à la détection d'un composant biologique spécifique.
De préférence, ce composé biologique spécifique est choisi parmi le groupe constitué par les anticorps, les haptènes, les antigènes, les acides nucléiques, les agonistes, les transporteurs cellulaires, les acides gras, les lipides et/ou un mélange d'entre eux.
La présente invention concerne également la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant le conjugué ou un des dérivés chemoluminescents selon l'invention et l'utilisation du conjugué et/ou d'un dérivé chemoluminescent selon l'invention pour le dosage et/ou la détection d'un composé biologique spécifique. Brève description des ficaires.
La figure 1 représente les formules générales des dérivés chemoluminescents selon la présente invention.
La figure 2 représente la synthèse de 1'iodomercurate de N-phényl-N- (N-méthylpyridinium-2-yl) -10- méthylacridinium-9-carboxamide (BPACAM1) selon l'invention.
La figure 3 représente la synthèse de l'iodomercurate de N- (N1 -hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -N-
(N' ' -méthylpyridinium-2-yl) -10-méthylacridinium-9-carboxamide (BPACAM3) selon l'invention.
La figure 4 représente la synthèse de l'iodomercurate de N-pyridyl-N- (N-méthylpyridinium-2-yl) -10- méthylacridinium-9-carboxamide (PPACAM1) selon l'invention. La figure 5 représente la synthèse de 1 ' i o d o m e r c u r a t e d e ( N - hydroxysuccinimidylformylpropionanilide) -10-méthylacridinium- 9-carboxylate (FA6) selon l'invention.
La figure 6 représente la synthèse de 1 ' i o d o m e r c u r a t e d e ( N - hydroxysuccinimidylformylpropioperfluoroanilide) -10 - méthylacridinium-9-carboxylate (FA13) selon l'invention.
La figure 7 représente la synthèse de 1 ' iodomercurate de 4 - ( -méthylsulfonamido- (N- hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -méthylacridinium-9 - carboxylate (SHA1) selon l'invention.
La figure 8 représente la synthèse de 1'iodomercurate de 4- (N-perfluorophénylsulfonamido- (N- hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -méthylacridinium-9 - carboxylate (SHA3) selon l'invention. La figure 9 représente la synthèse de
1 ' iodomercurate de (1-méthyl-1-perfluorophényl-1- iminométhane) -10-méthylacridinium-9-carboxylate (FA10) selon 1' invention.
La figure 10 représente la synthèse de 1'iodomercurate de (1- (N-hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -1- perfluorophényl- 1-iminométhane) -10-méthylacridinium-9 - carboxylate (FA12) selon l'invention.
La figure 11 représente la synthèse de
1'iodomercurate de (N,N-diéthylamino) -10-méthylacridinium-9 - thio-S-carboxylate (TA1) et de 1' iodomercurate de (N,N- diéthylamino) -10-méthylacridinium-9-thio-O-carboxylate (TA2) selon l'invention.
La figure 12 représente la synthèse de 1 ' iodomercurate de 4 - (N-phénylsulfonamido - (N- hydroxysuccinimidyl)' -benzoate) -10 -méthylacridinium-9 - carboxylate (SHA2) selon l'invention.
La figure 13 représente une étude comparative de la stabilité du FA6, du FA10 et du DMAE (mesure de chemoluminescence en fonction du temps) . Les figures 14 à 29 représentent les spectres de masse des produits de l'invention.
Les figures 30 à 47 représentent les spectres infra-rouge des produits de l'invention.
EXEMPLE 1 : SYNTHESE DE BPACAM1 (fiσ. 2) .
(Iodomercurate de N-phényl-N- (N-méthylpyridinium-2-yl) -10- méthylacridinium-9-carboxamide) .
Préparation du chlorure d'acide dérivé de l'acide acridine carbo-cylique. 2 g d'acide acridine carboxylique sont mis en réaction avec 20 ml de chlorure de thionyle. Après une heure de réaction au reflux du solvant, l'excès d'agent chlorant est éliminé sous dépression et le résidu repris dans du toluène. Le solvant est de nouveau évaporé sous vide et le chlorure d'acide (II) récupéré. Synthèse de 1'amide.
Le chlorure d'acide est mis en suspension dans 40 ml de tetrahydrofuranne (THF) anhydre contenant trois équivalents de tr iéthy1amine (Et3 N) . Le mélange est agité, et additionné de 1,52 g de
2-anilinopyridine (I) . Après 24 heures de chauffage à 60 °C le solvant est éliminé du mélange par évaporation sous vide. Le résidu est repris par du chloroforme et lavé à l'eau. La solution chloroformique est séchée sur Na2S04, puis évaporée. L'amide III est obtenue par recristallisation du résidu obtenu dans un mélange de toluène et d'éther de pétrole. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 30 (vc=0=1656 cm"1) et 14 (FAB+, matrice NOBA : M+l=376) . éthylation de l'amide III. 100 mg d'amide (III) sont mis en réaction avec 150 mg de chlorure mercurique (HgCl2) et 150 μl d'iodure de methyle (CH3I) en vase clos pendant 4 heures à 90 °C. Après réaction, le résidu (IV) est solubilisé dans l'acétone et précipité par addition modérée d'éther. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 31 (vc=0=1775 cm"1) et 15 (FAB+, matrice NOBA : M=405) .
EXEMPLE 2 : SYNTHESE DE BPCAM3. (fia. 3).
Iodomercurate de N- (N1 -hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -N- (N1 ' -méthylpyridinium-2 -yl) - 10 -méthylacridinium- 9 - carboxamide.
Synthèse de l'acide 6-chloronicotiniσue (III) .
25 g de l'acide 6-hydroxynicotinique (I) sont mis en réaction avec 41 g de PC15 dans 5 ml de OPCl3.Le milieu réactionnel est chauffé pendant 1 heure au reflux de OPCl3.
Après réaction, OPCl3 est évaporé sous dépression et le résidu
(II) versé sur de la glace. Le précipité qui se forme au contact de cette dernière (III) est filtré et lavé à l'eau.
La purification du produit III s'effectue par solubilisation de l'acide en milieu basique, passage sur charbon actif et reprécipitation en milieu acide.
Synthèse de l'acide 6-anilinonicotiniσue (V).
579 μl d'aniline (IV) et 1 g d'acide 6- chloronicotinique (III) sont mis en contact dans un autoclave à 160°C. Après une heure de réaction, le résidu obtenu est solubilisé dans une solution aqueuse de carbonate sodique. La purification du produit V s'effectue par passage sur charbon actif et reprécipitation acido-basique comme décrit pour le produit III. Préparation de l'ester activé de l'acide 6-anilinonicotinique (VI) .
4,1 g de l'acide 6-anilinonicotinique sont mis en réaction avec 4,16 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et 2,34 g de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans 150 ml de dioxane à température ambiante. Après 4 heures de réaction, le précipité apparu (dicyclohexylurée) est éliminé par filtration et le filtrat évaporé sous dépression. Le résidu obtenu est repris dans 20 ml d'acétate d'éthyle. La partie insoluble dans le solvant est de nouveau éliminée par filtration. Le filtrat est évaporé et le solide restant (VI) est trituré dans de l'éther de pétrole (100/140), filtré, lavé par l'éther et séché. Synthèse de 1'amide VIII.
3 g de chlorure d'acide (VII) (obtenu par traitement de l'acide acridine carboxylique au chlorure de thionyle) sont mélangés avec 4,17 g du composé VI, 60 ml de THF, 11,22 ml de triéthylamine et 130 mg de diméthylaminopyridine (DMAP) . Le mélange est porté au reflux du THF durant 8 heures. Le solvant est ensuite éliminé et le résidu repris par du chloroforme. Après trois lavages successifs par H 20, la phase chloroformée est séchée sur Na2S04 et évaporée sous vide. L'huile restante est reprise dans le toluène et le solide non solubilisé éliminé par filtration. Le produit VIII est isolé du filtrat par précipitation à l'éther de pétrole (100/140) . Il est finalement lavé par l'éther et séché. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 32 (vc=0=l657 cm"1) et 16 (FAB+, matrice NOBA : M+l=517) .
N-méthylation des cycles pyridini ues de l'amide et obtention du produit IX. 100 mg du produit VIII sont mélangés intimement avec 100 mg de chlorure mercurique. Après addition de 2,5 ml d'iodure de methyle, le mélange est porté à 90°C durant 10 heures dans un autoclave. Le solide est dissous dans de l'acétone anhydre. Le produit IX est isolé de la solution par précipitation en présence de toluène. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 33 (vc.0=1780 cm"1) et 17 (FAB\ matrice NOBA : M-15=531) .
EXEMPLE 3 : SYNTHESE DE PPACAM1. (fia. 4)
Iodomercurate de N-pyridyl-N- (N-méthylpyridinium-2-yl) -10- méthylacridinium-9-carboxamide Synthèse de l'amide.
5 g d'acide acridine carboxylique sont transformés en chlorure d'acide par SOCl2. Le chlorure d'acide (II) est ensuite mis en réaction avec 3,83 g de 2,2' -dipyridylamine (I) dans 50 ml de THF contenant 18,6 ml de Et3N et 500 mg de DMAP. Après trois heures de réaction au reflux de THF, la réaction est arrêtée par refroidissement et le solvant éliminé sous dépression. Le résidu est redissous dans du chloroforme. La solution est lavée trois fois par H20, puis séchée avec Na2S04 anhydre. Le solvant est évaporé et le résidu obtenu est repris par du toluène. L'insoluble est éliminé par filtration et la solution traitée au charbon actif.
Le produit III est isolé de la solution par précipitation à l'éther de pétrole (100/140) . Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 34 (vc=0=1668 cm"1) et 18 (FAB+, matrice NOBA : M+3=379) . Synthèse de 1'amide méthylée.
100 mg de l'amide III sont mis en réaction avec 1,08 g de HgCl2 et 2,5 ml de CH3I dans un autoclave chauffé à 90°C. Après deux heures de réaction, le résidu obtenu (IV) est repris dans de l'acétone, puis précipité par un ajout modéré de toluène. Les spectres IR et-MS sont représentés respectivement par les figures 35 (\>c_0=1792 cm'1) et 19 (FAB\ matrice NOBA : M=406) . EXEMPLE 4 : SYNTHESE DE FA6 (Fia 5)
Iodomercurate de (N-hydroxysuccinimidylformylpropionanilide) - 10-méthylacridinium-9-carboxylate Synthèse de la N-phénylhvdroxylaminé (II) Dans un berlin de 2 litres on place respectivement 500 ml d'eau, 25 g de Chlorure ammonique (NH4C1) et 50 g de nitrobenzène (I) . Ce mélange est agité mécaniquement et 62 g de Zinc en poudre sont additionnés par portions à la solution. Après 15 minutes la solution s'échauffe et le reste de zinc (environ 30 g) est ajouté prudemment à la solution. La température du mélange réactionnel se situe entre 65 et 80 °C pendant toute la durée de la réduction. Dès que la température du milieu réactionnel diminue, la solution est filtrée pour éliminer l'oxyde de zinc. Le filtrat est ensuite saturé en NaCl et refroidi le plus rapidement possible à 0 °C. La N-phénylhydroxylamine (II) qui cristallise de la solution est isolée par filtration et débarrassée du nitrobenzène éventuellement présent par lavage à l'éther de pétrole. Le produit est ensuite séché sur P2Os et stocké sous azote à -20 °C.
Synthèse de l'acide mono N-phénylhvdroxamique de l'acide suceinique (IV) .
Dans un ballon de 250 ml, on met en réaction 3 g de N- phénylhydroxylamine (II) avec 2,75 g d'anhydride succinique (III) dans 100 ml d'un mélange de 50 ml de tétrahydrofurane et de 50 ml d'acétonitrile. La réaction est rapide. Les solvants sont éliminés sous dépression et le résidu est repris par 50 ml de tétrahydrofurane. Cette solution sera utilisée telle quelle dans l'étape suivante. Coupaσe de l'acide hydroxamique (IV) au chlorure d'acide de l'acide 9-acridinecarboxylique (V).
6,13 g d'acide acridine carboxylique préalablement transformés par SOCl2 en chlorure d'acide (V) sont mis en contact avec la solution contenant l'acide hydroxamique préparé au point précédent et 6 équivalents de triéthylamine. Après 2 heures de réaction à température ambiante, le solvant est éliminé sous pression réduite et le résidu obtenu solubilisé dans 150 ml de chloroforme. Après trois lavages successifs par H20, la solution chloroformique est séchée sur Na2S04 et concentrée par évaporation. Le résidu est repris par du toluène et le produit (VI) précipité par addition modérée d'éther de pétrole 100-140 °C.
Synthèse de l'ester activé du produit (VI) .
1 g de produit VI est solubilisé dans 30 ml de dioxanne anhydre. A cette solution on ajoute 0,28 g de N- hydroxysuccinirrd.de (NHS) et 0,5 g de dicyclohexylcarbodiimide
(DCC) . La disparition du produit VI est suivie par chromatographie sur couche mince. Lorsque la réaction est terminée la dicyclohexylurée formée est éliminée par filtration et le solvant distillé sous pression réduite. Le résidu est repris par 10 ml d'acétate d'éthyle pour précipiter la dicycclohexylurée restante. Le produit (VII) est purifié par chromatographie sur colonne de silice la phase mobile étant un mélange de toluène et d'acétate d'éthyle (v/v : 2:1) . Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 36 (vc=0=1792 cm"1) et 20 (ES+: M+l=512) .
N-méthylation du produit VII et obtention de FA6 100 mg du composé VII sont mis en présence de 2 ml de CH3I et de 100 mg de HgCl2 dans un autoclave. La réaction est réalisée en portant cette dernière à 90 °C pendant 2 heures. Le résidu obtenu après chauffage est solubilisé dans l'acétone. Le produit est précipité de la solution acétonique par addition modérée d'éther diéthylique. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 37 (vc.0=1758 cm'1) et 21 (FAB+, matrice NOBA : M=526) .
EXEMPLE 5 : SYNTHESE DE FA13 (Fia. 6)
I o d o m e r c u r a t e d e ( N - hydroxysuccinimidylformylpropioperfluoroanilide) - 10 - méthylacridinium-9 -carboxylate Synthèse de la N-perfluorophénylhvdroxylaminé (II)
Dans un ballon de 500 ml on place respectivement 150 ml d'eau, 8 g de chlorure ammonique (NH4C1) et 25 g de perfluoronitrobenzène (I) . Ce mélange est agité mécaniquement et 15 g de Zinc en poudre sont additionnés par portions à la solution. Après 15 minutes la solution s'échauffe et le reste de zinc (environ 30 g) est ajouté prudemment à la solution. La température du mélange réactionnel se situe entre 65 et 80 °C pendant toute la durée de la réduction. Dès que la température du milieu réactionnel diminue, on ajoute 100 ml de toluène et, sans se préoccuper de l'existence de deux phases, on filtre la solution pour éliminer l'oxyde de zinc. La solution toluénique est recueillie et déshydratée sur sulfate sodique anhydre. Par évaporation du toluène et dilution à l'éther de pétrole, la N- perfluorophénylhydroxylamine (II) cristallise de la solution. Elle est isolée par filtration et séchée sous vide. Le produit est stocké sous azote à -20 °C. Synthèse de l'acide mono N-perfluorophénylhydroxamique de l'acide suceinique (IV) .
Dans un ballon de 250 ml, on met en réaction 5,5 g de N- perfluorophénylhydroxylamine (II) avec 2,75 g d'anhydride succinique (III) dans 100 ml d'un mélange de 50 ml de tétrahydrofurane et de 50 ml d'acétonitrile. La réaction est rapide. Les solvants sont éliminés sous dépression et le résidu est repris par 50 ml de tétrahydrofurane. Cette solution sera utilisée telle quelle dans l'étape suivante. Coupage de l'acide hydroxamique (IV) au chlorure d'acide de l'acide 9-acridinecarboxylique (V). 6,16 g d'acide acridine carboxylique préalablement transformés par SOCl2 en chlorure d'acide (V) sont mis en contact avec la solution contenant l'acide hydroxamique préparé au point précédent et 6 équivalents de triéthylamine. Après 2 heures de réaction à température ambiante, le solvant est éliminé sous pression réduite et le résidu obtenu solubilisé dans 150 ml de chloroforme. Après trois lavages successifs par H20, la solution chloroformique est séchée sur Na2S04 et concentrée par évaporation. Le résidu est repris par du toluène et le produit (VI) précipité par addition modérée d'éther de pétrole 100-140 °C. Synthèse de l'ester activé du produit (VI) .
1 g de produit VI est solubilisé dans 30 ml de dioxanne anhydre. A cette solution, on ajoute 0,23 g de N- hydroxysuccinimide (NHS) et 0,41 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) . La disparition du produit VI est suivie par chromatographie sur couche mince. Lorsque la réaction est terminée, la dicyclohexylurée formée est éliminée par filtration et le solvant distillé sous pression réduite. Le résidu est repris par 10 ml d'acétate d'éthyle pour précipiter la dicyclohexylurée restante. Le produit (VII) est purifié par chromatographie sur colonne de silice, la phase mobile étant un mélange de toluène et d'acétate d'éthyle (v/v : 2:1) .
N-méthylation du produit VII et obtention de FA13 100 mg du composé VII sont mis en réaction avec 2 ml de CH3I et 100 mg de HgCl2 dans un autoclave pendant 2 heures à 90 °C. Le résidu est solubilisé dans l'acétone. Le produit est précipité par addition modérée d'éther diéthylique.
EXEMPLE 6 : SYNTHESE DE SHA1 (Fiσ 7) . Iodomercurate de 4- (N-methylsulfonamido - (N- hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -méthylacridinium-9 - carboxylate
Synthèse du chlorure de 4-carboxybenzène sulfonyle (III) 40 g de 4-carboxybenzènesulfonate de potassium sont mis en réaction avec 70 g de PC15 et 2 ml de OPCl3 pendant 4 heures à 130 °C. Après réaction, le mélange est versé sur un mélange d'eau et de glace pilée. Le précipité résultant est isolé de la phase aqueuse par décantation. On solubilise le solide dans 200 ml de tetrahydrofuranne et on dilue cette solution par ajout de 2 litres d'eau glacée qui provoque la précipitation du produit désiré qui est recueilli par filtration et séché.
Synthèse de l'acide 4-carboxybenzène N-méthylsulfhvdroxamique (IV) .
5,8 g de chlorhydrate de N-méthylhydroxylamine et 2,8 g de NaOH sont dissous dans 75 ml d'eau. Dans cette solution, on laisse couler 7 g de chlorure de 4-carboxybenzène suifonyle (III) solubilisés dans 140 ml de dioxanne. 15 minutes après la fin de l'addition, la réaction est complète et le mélange eau-dioxanne est concentré jusqu'à début de précipitation du produit. Cette solution est alors extraite par 3 x 50 ml d'acétate d'éthyle. Les fractions organiques sont rassemblées et séchées sur sulfate sodique anhydre. Après évaporation du solvant, le produit (IV) est cristallisé dans l'éther de pétrole, filtré, lavé par l'hexane et séché à l'air. Synthèse de l'ester activé de l'acide 4-carboxybenzène N- méthylsulfhvdroxamique (V) .
1,2 g d'acide 4-carboxybenzène N-méthylsulfhydroxamique (IV) sont dissous dans 50 ml de dioxanne anhydre. A cette solution, on ajoute 0,59 g de N-hydroxysuceinimide (NHS) et 1,07 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) . Par chromatographie sur couche mince, on peut suivre la disparition du produit IV et l'apparition de l'ester activé (V) . La réaction terminée, la dicyclohexylurée formée est éliminée par filtration et le solvant distillé sous pression réduite. Le résidu est repris par 10 ml d'acétate d'éthyle pour précipiter la dicyclohexylurée restante. Le produit (VII) est purifié par chromatographie sur colonne de silice, la phase mobile étant un mélange de toluène et d'acétate d'éthyle
(v/v : 1:4) Couplage du produit V à l'acide acridine carboxylique (VII) .
3,4 g d'acide acridine carboxylique préalablement transformés par SOCl2 en chlorure d'acide (VI) sont mis en réaction avec
5 g de l'acide suifhydroxamique préparé au point précédent
(5) dans 150 ml de tetrahydrofuranne contenant 6 équivalents de triéthylamine. Après 4 heures de réaction à température ambiante, le produit de départ a complètement. disparu. Après avoir éliminé le solvant sous dépression, le résidu est repris par du chloroforme (200 ml) et lavé 3 fois par 150 ml d'eau. Le produit (VII) est purifié par chromatographie sur colonne de silice, la phase mobile étant un mélange de toluène et d'acétate d'éthyle (v/v: 2:1) . Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 38 (vc,0=1779 cm'1) et 22 (ES+: M+l=534) .
N-méthylation du produit VII et obtention de SHA1 (VIII) . 100 mg du composé VII sont mis en réaction avec 2 ml de CH3I et 100 mg de HgCl2 dans un autoclave pendant 2 heures à 90 °C. Le produit de la réaction est solubilisé dans l'acétone et le produit est précipité par addition modérée d'éther diéthylique. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 39 (vc=0=1792 cm"1) et 23 (FAB*: matrice NOBA: M=548) .
EXEMPLE 7 : SYNTHESE DE SHA2 (Fia. 12) .
Iodomercu ate de 4- (N-phénylsulfonamido - (N- hydroxysuccinimidyl) -benzoate) -10-méthylacridinium-9 - carboxylate
Synthèse du chlorure de 4-carboxybenzène sulfonyle (III) 40 g de 4-carboxybenzène sulfonate de potassium sont mis en réaction avec 70 g de Pcl5 et 2 ml de OPCl3 pendant 4 heures à 130 °C. Après réaction, le mélange est versé sur un mélange d'eau et de glace pilée. Le précipité résultant est isolé de la phase aqueuse par décantation. On solubilise le solide dans 200 ml de tetrahydrofuranne et on dilue cette solution par ajout de 2 litres d'eau glacée, ce qui provoque la précipitation du produit désiré qui est recueilli par filtration et séché.
Synthèse de l'acide -carboxybenzène N-phénylsulfhydroxamique
(IV)
7 g de N-phénylhydroxylamine sont dissous dans 75 ml d'eau.
Dans cette solution, on laisse couler 7 g de chlorure de 4- carboxybenzène sulfonyle (III) solubilisés dans 140 ml de dioxanne. 15 minutes après la fin de l'addition, la réaction est complète, et le mélange eau-dioxanne est concentré jusqu'à début de précipitation du produit. Cette solution est alors extraite par 3 X 50 ml d'acétate d'éthyle. Les fractions organiques sont rassemblées et séchées sur sulfate sodique anhydre. Après évaporation du solvant, le produit (IV) est cristallisé dans l'éther de pétrole, filtré, lavé par 1'hexane et séché à l'air.
Synthèse de l'ester activé de l'acide 4-carboxybenzène N- phénylsulfhydroxamique 5 g d'acide 4-carboxybenzène N-ohénylsuifhydroxamique (IV) sont dissous dans 50 ml de dioxanne anhydre. A cette solution, on ajoute 2 g de N-hydrosuccinimide (NHS) et 3,5 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) . Par chromatographie sur couche mince, on peut suivre la disparition du produit IV et l'apparition de l'ester activé (V) . La réaction terminée, la dicyclohexylurée formée est éliminée par filtration et le solvant distillé sous pression réduite. Le résidu est repris par 20 ml d'acétate d'éthyle pour précipiter la dicyclohexylurée restante. Le produit (VII) est purifié par chromatographie sur colonne de silice, la phase mobile étant un mélange de toluène et d'acétate d'éthyle (v/v : 1 : 4) . Couplage du produit V à l'acide carboxylique (VII) 1,29 g d'acide acridine carboxylique préalablement transformés par SOCl2 en chlorure d'acide et neutralisés par la triéthylamine (VI) sont mis en réaction avec 2,27 g de l'acide suifhydroxamique préparé au point précédent et préalablement salifié'par 660 mg de terbutylate de potassium
(5) dans 50 ml de tetrahydrofuranne. Après 4 heures de réaction à température ambiante, le produit de départ a complètement disparu. Après avoir éliminé le solvant sous dépression, le résidu est repris par du chloroforme (200.ml) et lavé 3 fois par 150 ml d'eau. Le produit (VII) est purifié par chromatographie sur colonne de silice, la phase mobile étant un mélange de toluène et d'acétate d'éthyle (v/v : 2:1) . Les spectres IR et MS sont réprésentés respectivement par les figures 40 (vc_0=1781 cm. et 24 (ES" : instable) . N-méthylation du produit VII et obtention de SHA2 (VIII)
100 mg du composé VII sont mis en réaction avec 2 ml de CH3I et 100 mg de HgCl2 dans un autoclave pendant 2 heures à 90 °C. Le produit de la réaction est solubilisé dans l'acétone et le produit est précipité par addition modéré d'éther diéthylique. Les spectres IR et MS sont réprésentés respectivement par les figures 41 (vc_0=1774 cm. et 25 (ES+ : M=611) .
EXEMPLE 8 : SYNTHESE DE SHA3 (Fiσ. 8) .
Iodomercurate de 4- (N-perfluorophénylsulfonamido- (N- hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -méthylacridinium- 9 - carboxylate Synthèse de la N-perfluorophénylhvdroxylamine (II)
Dans un ballon de 500 ml on place respectivement 150 ml d'eau, 8 g de chlorure ammonique (NH4C1) et 25 g de perfluoronitrobenzène (I) . Ce mélange est agité mécaniquement et 15 g de Zinc en poudre sont additionnés par portions à la solution. Après 15 minutes la solution s'échauffe et le reste de zinc (environ 30 g) est ajouté prudemment à la solution. La température du mélange réactionnel se situe entre 65 et 80 °C pendant toute la durée de la réduction. Dès que la température du milieu réactionnel diminue, on ajoute 100 ml de toluène et, sans se préoccuper de ' 1 'existence de deux phases, on filtre la solution pour éliminer l'oxyde de zinc. La solution toluénique est recueillie et déshydratée sur sulfate sodique anhydre. Par évaporation du toluène et dilution à l'éther de pétrole, la N- perfluorophénylhydroxylamine (II) cristallise de la solution. Elle est isolée par filtration et séchée sous vide. Le produit est stocké sous azote à -20 °C.
Synthèse de 1 ' acide 4 - carboxybenzène perfluorophénylsuifhydroxamique (IV) . 6,31 g de N-perfluorophénylhydroxylamine (II) et 7 g de chlorure de 4 -carboxybenzène sulfonyle (III) sont mis en solution dans 120 ml de dioxanne. Dans cette solution, on laisse couler 4,4 ml de triétylamine diluée dans 20 ml de dioxanne. 15 minutes après addition complète de la base, on filtre le chlorhydrate de triéthylamine formé et on évapore le solvant sous pression réduite. Le résidu est solubilisé dans le chloroforme, la phase chloroformique est lavée à l'eau et séchée sur sulfate sodique anhydre. Le produit brut (IV) est obtenu après évaporation du solvant au rotavapor. Le produit pur est obtenu par recristallisation du toluène.
Synthèse de l'ester activé de l'acide 4-carboxybenzène N- perfluorophénylsulfhvdroxamique (V) .
1 g d ' acide 4 - carboxybenzène N - perfluorophénylsulfhydroxamique (IV) est dissout dans 50 ml de dioxanne anhydre. A cette solution, on ajoute 0,3 g de N- hydroxysuccinimide (NHS) et 0,54 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) . Par chromatographie sur couche mince, on peut suivre la disparition du produit IV et l'apparition de l'ester activé V. La réaction terminée, la dicycclohexyluree formée est éliminée par filtration et le solvant distillé sous pression réduite. Le résidu est repris par 10 ml d'acétate d'éthyle pour précipiter la dicycclohexyluree restante. Le produit (V) est purifié par chromatographie sur colonne de silice, la phase mobile étant un mélange de toluène et d'acétate d'éthyle (v/v : 1:4)
Couplage du produit V à l'acide acridine carboxylique (VII) . 3,4 g d'acide acridine carboxylique préalablement transformés par SOCl2 en chlorure d'acide (VI) sont mis en réaction avec 5 g de l'acide suifhydroxamique (V) préparé au point précédent dans 150 ml de tetrahydrofuranne contenant 6 équivalents de triéthylamine. Après 4 heures de réaction à température ambiante, le produit de départ a complètement disparu. Après avoir éliminé le solvant sous dépression, le résidu est repris par du chloroforme (200 ml) et lavé 3 fois par 150 ml d'eau. Une chromatographie sur colonne permet d'isoler et de purifier le produit désiré (VII), la phase mobile étant constituée d'un mélange toluène acétate d'éthyle (v/v: 2:1) . N-méthylation du produit VII et obtention de SHA3 (VIII) .
100 mg du composé VII sont mis en réaction avec 2 ml de CH3I et 100 mg de HgCl2 dans un autoclave pendant 2 heures à 90 °C. Le produit de la réaction est solubilisé dans l'acétone et le produit est précipité par addition modérée d'éther diéthylique.
EXEMPLE 9 : SYNTHESE DE FA10 (fia. 9)
Iodomercurate de (1-méthyl-l-perfluorophényl-1-iminométhane) - 10-méthylacridinium-9 -carboxylate
Synthèse de l'oxime de la pentafluoroacétophénone (II) . 1360 μl de pentafluoroacétophénone et 3 g de chlorhydrate d' ydroxylamine sont mis en solution dans 15 ml d'ethanol et 5 ml d'eau. Le pH de cette solution est amené et maintenu à la valeur de 6 au moyen d'une solution de NaOH à 10 %. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux jusqu'à disparition complète du produit de départ. L'éthanol est éliminé sous dépression et la phase aqueuse extraite par le dichorométhane. Après séchage de la fraction organique et évaporation du solvant, on récupère 1 'oxime (II) sous forme d'une huile qui sera utilisée telle quelle à l'étape suivante . Couplage de l'oxime (II) à l'acide acridine carboxylique via le chlorure d'acide (IV) .
1,54 g d'acide acridine carboxylique transformés par SOCl2 en chlorure d'acide (III) sont mis en réaction avec 1,55 g de 1 ' oxime (II) synthétisée au point précédent dans 40 ml de tetrahydrofuranne contenant 6 ml de triéthylamine et 100 mg de DMAP. Après 1 heure de réaction à température ambiante, le produit de départ a complètement disparu. Après avoir éliminé le solvant sous dépression, le résidu est repris par du chloroforme (100 ml) et lavé 3 fois par 50 ml d'eau. La solution chloroformique est séchée sur Na2S04 et concentrée par évaporation. Le résidu est repris par du toluène et le produit (IV) précipité par addition modérée d'éther de pétrole 100-140 °C. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 42 (vc=0=1761 cm"1) et 26 (ES*: M+l=431) . N-méthylation du produit IV et obtention de fA10 (V) .
100 mg du composé VII sont mis en réaction avec 2 ml de CH3I et 100 mg de HgCl2 dans un autoclave pendant 2 heures à 90 °C. Le produit de la réaction est solubilisé dans l'acétone. Le produit (V) est précipité par addition modérée d'éther diéthylique. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 43 (vc=0=1763 cm"1) et 27 (ES*: M=445) .
EXEMPLE 10 : SYNTHESE DE FA12 (Fia. 10) . Iodomercurate de (1- (N-hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -1- perfluorophényl-1-iminométhane) -10 -méthylacridinium-9 - carboxylate
Synthèse de l'organomagnésien du l-éthyl-4-bromobenzène (II) . Dans un ballon à 3 tubulures de 100 ml, on place 1,05 g de tournures de magnésium que l'on recouvre par un minimum de tetrahydrofuranne anhydre et d'un cristal d'iode. Dans une ampoule d'addition, on prépare une solution de 8 g de l-éthyl-4-bromobenzène (I) dans 50 ml de tetrahydrofuranne anhydre. On verse cette seconde solution dans la suspension de magnésium en réglant la température de la réaction aux environs de 45 °C par modulation du débit d'addition de la solution de dérivé halogène. On élimine l'excès de magnésium par décantation avant d'utiliser le composé (II) formé. Synthèse de la 4' -éthyl-2,3-4,5,6-pentafluorobenzophénone. Dans un ballon à 3 tubulures de 250 ml, on dilue 6,22 ml de chlorure de pentafluorobenzoyle (III) par 100 ml de tetrahydrofuranne anhydre. Dans cette solution, on laisse couler la solution du réactif de Grignard préparée lors de l'étape précédente. Après réaction, on élimine partiellement le solvant sous dépression et on reprend le résidu par une solution aqueuse à 5 % de bicarbonate de sodium. On extrait le produit par le dichlorométhane . La phase organique est séchée, le solvant éliminé et le liquide résiduel est recueilli .
Oxydation de la 4 ' -éthyl-2, 3,4,5-6-pentafluorobenzophénone (IV) en 4' -carboxyméthylène-2,3-4,5,6-pentafluorobenzophénone
(V) .
Dans un ballon de 100 ml, on dissout 3 g de 4' -éthyl- 2, 3, 4, 5, 6 -pentafluorobenzophénone (IV) dans 50 ml d'acide acétique. A cette solution on ajoute 2 g de trioxyde de chrome dissous dans 4 ml d'eau puis on porte à reflux pendant 2 heures. On évapore partiellement la solution. On dilue par 10 volumes d'eau. Le précipité de 4 ' -carboxyméthylène- 2, 3 , 4, 5, 6 -pentafluorobenzophénone (V) est filtré, lavé et séché sous vide. Synthèse de 1'oxime de la 4' -carboxyméthylène-2,3,4,5,6- pentafluorobenzophénone (VI) .
1 g de 4 ' -carboxyméthylène-2, 3,4, 5,6 -pentafluorobenzophénone (V) et 3 g de chlorhydrate d'hydroxylamine sont mis en solution dans 15 ml d'ethanol et 5 ml d'eau. Le pH de cette solution est amené et maintenu à la valeur de 6 au moyen d'une solution de NaOH à 10 %. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux jusqu'à disparition complète du produit de départ. L'éthanol est éliminé sous dépression et, après acidification, la phase aqueuse est extraite par le dichorométhane. Après séchage de la fraction organique et évaporation du solvant, on cristallise 1 'oxime (VI) dans un mélange toluène-éther de pétrole.
Synthèse de l'ester activé de l'oxime de la 4'- carboxyméthylène-2,3,4,5.6-pentafluorobenzophénone (VII) . 1 g du produit (VI) est dissout dans 50 ml de dioxanne anhydre. A cette solution on ajoute 0,33 g de N- hydroxysuccinimide (NHS) et 0,60 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) . Par chromatographie sur couche mince, on peut suivre la disparition du produit VI et l'apparition de l'ester activé VII. La réaction terminée, la dicyclohexylurée formée est éliminée par filtration et le solvant distillé sous pression réduite. Le résidu est repris par 10 ml d'acétate d'éthyle pour précipiter la dicyclohexylurée restante. Le produit (VII) est purifié par chromatographie sur colonne de silice, la phase mobile étant constituée d'un mélange de toluène et d'acétate d'éthyle (v/v: 4:1) .
Couplage de l'oxime (VII) à l'acide acridine carboxylique via le chlorure d'acide (VIII) . 3 g d'acide acridine carboxylique transformés par SOCl2 en chlorure d'acide (III) sont mis en réaction avec 5,75 g de 1'oxime (VII) synthétisée au point précédent dans 100 ml de tetrahydrofuranne contenant 11 ml de triéthylamine et 200 mg de DMAP. Après 1 heure de réaction à température ambiante, le produit de départ a complètement disparu. Après avoir éliminé le solvant sous dépression, le résidu est repris par du chloroforme (200 ml) et lavé à l'eau. La solution chloroformique est séchée sur Na2S04 et concentrée par évaporation. Le résidu est repris par du toluène et le produit (VIII) précipité par addition modérée d'éther de pétrole 100-140 °C. Le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de silice, la phase mobile étant constituée de toluène et d'acétate d'éthyle en proportion v/v: 2:1. N-méthylation du produit VIII et obtention de fA12 (IX) .
100 mg du composé VIII sont mis en réaction avec 2 ml de CH3I et 100 mg de HgCl2 dans un autoclave pendant 2 heures à 90 °C. Le produit de la réaction est solubilisé dans l'acétone. Le produit (IX) est précipité par addition ménagée d'éther diéthylique.
EXEMPLE 11 : SYNTHESE DE TA1 et de TA2 (fia. 1,1) Iodomercurate de (N,N-diéthylamino) -10-méthylacridinium-9- thio-S-carboxylate et iodomercurate de (N,N-diéthylamino) -10- méthylacridinium-9-thio-O-carboxylate
Synthèse de l'acide acridine-9-thiocarboxylique (II) 2,23 g d'acide acridinecarboxylique préalablement transformés en chlorure d'acide par le chlorure de thionyle sont repris par 25 ml de tétrahyrofuranne et 6 g de triéthylamine. Le mélange est refroidi à 0 °C et le précipité de chlorhydrate de triéthylamine est éliminé par filtration. Dans la solution maintenue à 0 °C, on fait barboter de l'acide suifhydrique gazeux anhydre. On suit la réaction par chromatographie sur couche mince dans une phase toluène-acétate d'éthyle (v/v: 2:1) . Lorsque le chlorure d'acide est consommé, la solution est évaporée sous dépression et le résidu est repris par de l'eau désoxygénée. La solution aqueuse est acidifiée par de l'acide sulfurique 1 N désoxygéné jusqu'à précipitation du produit. Celui-ci est séparé par filtration, lavé avec de l'eau désoxygénée et séché sous vide en présence de pentoxyde de phosphore. Le produit brut obtenu est utilisé tel quel dans l'étape suivante.
Synthèse du (N-N-diéthylamino) -acridine-9-thio-S-carboxylate et du (N-N-diéthylamino) -acridine-9-thio-O-carboxylate (V) 2,39 g de l'acide acridine-9-thio-S-carboxylique (II) sont dissous dans 10 ml d'eau contenant 500 mg d'hydroxyde de sodium. On refroidit la solution à 0 °C.
On prépare par ailleurs une solution de chloramine (IV) par réaction de 2 g de diéthylamine dissoute dans 10 ml d'eau glacée avec 5,5 ml de solution glacée d'hypochlorite de sodium à 13 % de chlore actif.
On mélange rapidement les deux solutions et on laisse réagir sous agitation pendant 15 minutes en maintenant la température à 0 °C. On recueille le précipité qui se forme par filtration, on le lave avec de l'eau glacée et on le sèche sous vide en présence de pentoxyde de phosphore. On sépare l'isomère O et l'isomère S par chromatographie sur colonne de silice dans une phase chloroforme isopropanol (98:2) . Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 44 et 45 (vc≈0=1772cm"1 et vc_s=1675cm'1) et 28 et 29 (ES+ : M+l=311) . N-méthylation du produit (V) et obtention du TA1 et du TA2
(VI) -
100 mg de chacun des composés V obtenus précédemment sont mis en réaction avec 2 ml de CH3I et 100 mg de HgCl2 dans un autoclave pendant 2 heures à 90 °C . Le produit de chaque réaction est solubilisé dans l'acétone. Les produits (VI) sont précipités par addition ménagée d'éther diéthylique. Les spectres IR et MS sont représentés respectivement par les figures 46 et 47 (vc=0=1714 cm"1 et vc_s=1714 cm"1) et 30 et 31 (ES+ : M+l=325) .
EXEMPLE 12 : TESTS DE CHEMOLUMINESCENCE.
Selon l'état de la technique (F. Me Capra) , les dérivés présentant comme les produits de l'invention, un groupement partant Y, avec un pKa supérieur à celui de l'eau oxygénée (pKa > 12) ne donneraient pas un signal chemoluminescent suffisant.
Cependant, les résultats obtenus avec plusieurs produits de l'invention infirment de manière inattendue ce préjugé défini par l'état de la technique.
Le tableau I repris à la page suivante donne les valeurs obtenues par intégration du signal chemoluminescent provoqué par réaction chimique entre la substance et l'eau oxygénée en milieu alcalin. Il fournit également les valeurs approximatives du pKa du groupement partant Y des substances testées .
Tableau I .
quantité signal pKa utilisée chemolumi-
Substance approximatif (picomole) nescent (RLU/s)
(1) 10-méthyl¬ 15-16 100 4200 acridinium-9 - 10 700 carboxylic acid 1 75
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
quantité signal pKa utilisée chemolumi-
Substance approximatif (picomole) nescent (RLU/s)
SHA1 10 6400000
1 1550000
0.1 200000
0.01 20000
0.001 6000
SHA2 10 6900000
1 1850000
0.1 285000
0.01 38000
0.001 11500
SHA3
TA1
On constate à la lecture du tableau que les substances (1) et (2) donnent des signaux très faibles. Ceci s'explique aisément par les valeurs de pKa largement supérieures à celle de H202. D'un autre côté, l'ester phenolique DMAE-NHS produit une chemoluminescence élevée expliquable par une valeur de pKa relativement faible.
Par contre dans le cas de l'amide PPACAM1 selon l'invention, l'importance du signal chemoluminescent détecté ne peut être expliquée par le pKa du groupement partant (largement supérieur à 12) . Cette observation permet d'envisager la synthèse et l'emploi de nouveaux composés d'acridinium ne répondant pas au critère de pKa précédemment défini par F. Me Capra. Aussi, d'autres composés appartenant aux séries FA, SHA et TA ont pu être synthétisés sans se soucier du pKa du groupement partant.
Parmi tous les produits obtenus dans les séries BPACAM, PPACAM, FA, SHA et TA, plusieurs se révèlent particulièrement intéressants par leurs caractéristiques de stabilité et de pouvoir luminescent ainsi que par leur courbe dose-réponse favorablement comparées aux dérivés d'acridine existants. On constate aussi, à la lecture du tableau I précédent, que les nouveaux dérivés appartenant aux séries FA et SHA se distinguent des esters phénoliques d'acridinium par une pente moins accentuée de la courbe dose-réponse. Cette caractéristique est particulièrement intéressante puisque la meilleure sensibilité comparée est obtenue aux concentrations les plus basses et que l'étendue des concentrations utilisables est augmentée. L'exemple de la sonde FA6 est très explicite : le FA6 génère à concentration élevée une luninecence inférieure à celle des esters phénoliques d'acridinium, mais lorsque la quantité mise en oeuvre est inférieure à 10"14 mole, le signal donné par FA6 est plus élevé et cet effet se marque encore plus quand les quantités sont réduites davantage; d'autre part, la réponse linéaire s'étend pour FA6 sur presque 6 ordres de grandeur alors qu'elle se limite à quatre dans le cas des esters phénoliques d'acridinium.
Les demi-vies de quelques composés selon l'invention sont données au tableau II et comparées au DMAE. Elles ont été déterminées à 60°C, dans un milieu aqueux tamponné à pH 8 et pour deux concentrations.
Il apparaît immédiatement que tous les composés montrent une stabilité que leur structure proche des produits communément appelés esters activés et utilisés pour la formation d'amides en conditions réactionnelles douces, ne permettait pas de prévoir. Certains d'entre eux, le FA6 et le FA10 notamment, se révèlent même très résistants à l'hydrolyse (voir aussi étude comparative de la stabilité; cf. fig. 13) .
On constate aussi, à la lecture de ce tableau ainsi que du tableau I, que des relations structure-activité précises peuvent être mises en évidence. Ainsi, l'encombrement du carboxyle lié au noyau acridine augmente de façon systématique la résistance à l'hydrolyse (la différence de stabilité entre le FA5 et le FA6 ou FA14 est liée au remplacement à ce niveau d'un groupement methyle par un groupement phényle ou xylyle) . De même, l'accroissement de stabilité observé lors du passage de FA9 à FA10 s'explique par le remplacement du groupement trifluorométhyle par un groupement perfluorophényle (les premiers essais comparatifs entre le SHA1 et le SHA2 confirment ce point de vue) tandis que le pouvoir luminescent dépend de l'effet capteur des substituants du carboxyle lié au noyau d'acridine.
La différence marquée entre le SHA1 et le FA5 serait liée au remplacement du carboxyle du FA5 par un sulfonyle plus capteur dans le SHA1.
De même, une augmentation du pouvoir luminescent entre le FA8 et le FA10 est due au remplacement du groupement phényle par le groupement perfluorophényle. En outre, des essais comparatifs entre le SHA2 et le SHA3 montrent assez logiquement un pouvoir luminescent plus important du SHA3.
Tableau II
PRODUIT CONCENTRATION DEMI-VIE (min. )
DMAE 5.10"9 M 1021 5.10"" M 1034
FA5 5.10"8 M 10
FA6 5.10"9 M 1724 5.10"" M 1877
FA8 5.10"9 M 45
FA9 5.10"9 M 13
FA10 5.10"9 M 680 5.10"" M 620
FA14 5.10'9 M 1992 5.10'" M 1884 SHA1 5 . 10 " 9 M 8
SHA2
SHA3
EXEMPLE 13 : DOSAGE DE TSH A L'AIDE D'UN ANTICORPS MARQUE PAR
LE FA6.
Marquage de l'anticorps de révélation par la sonde FA6. 50 μg de l'anticorps sont dissous dans 50 μl de tampon de marquage phosphate 0,1 M NaCl 0,5 M à pH 8. On ajoute à cette solution 5 μl d'une solution de FA6 à 6 mg/ml dans 1 'acétonitrile . On laisse incuber pendant 15 minutes à température ambiante. On neutralise ensuite la sonde en excès par addition de 50 μl de lysine 0,1 M. Après un délai de 15 minutes, on centrifuge pour éliminer un éventuel précipité et on chromatographie le surnageant sur une colonne d'exclusion pour éliminer la sonde libre et les produits de dégradation des anticorps. On suit l'élution par mesure de la luminescence des fractions et on recueille la fraction correspondante à des poids moléculaires compris entre 100000 et 200000 et caractérisée par un haut pouvoir luminescent. La solution recueillie est concentrée sur membrane ultrafiltrante et on vérifie l'absence de produits luminescents dans 1 'ultrafiltrat.
Préparation de la courbe de calibration.
Dans des tubes sensibiliséss par un 'anticorps monoclonal anti-tTSH, on introduit 200 μl de standard en sérum équin contenant respectivement 0; 0,15; 0,5; 1,5; 4; 15; 50 et 85 μlU/ml et 100 μl du traceur obtenu ci-dessus ajusté à 500000 RLU/100 μl . On laisse incuber sous agitation pendant deux heures à température ambiante. Préparation des échantillons.
On prépare les échantillons d'une façon similaire à la courbe de calibration, mais en remplaçant les standards par les sera à doser. Mesure de la luminescence.
Le surnageant présent dans les standards et les échantillons est éliminé par aspiration. On ajoute dans chaque tube 2 ml de solution de lavage (tampon phosphate 0,1 M NaCl 0,5 M ajusté à pH 7,4; protéine et détergent) . On laisse agir pendant une minute puis on aspire la solution. On répète la procédure. On introduit les tubes dans le luminomètre qui effectue la mesure et l'ajout automatisé des réactifs (300 μl de solution nitrique 0,1 M d'eau oxygénée à 0,5 % suivi de 300 μl de solution 0,25 M d'hydroxyde de sodium.
Les résultats sont donnés dans le tableau III.
Tableau III.
STANDARD/ECHANTILLON RLU CALCULE
STANDARD 0.00 μU l/ml 224 STANDARD 0.15 μU l/ml 2272 STANDARD 0.50 μU l/ml 5128 STANDARD 1.50 μU l/ml 11487 STANDARD 4.00 μU l/ml 20457 STANDARD 15.00 μU l/ml 51311 STANDARD 50.00 μU l/ml 103201 STANDARD 85.00 μU l/ml 124740
ECHANTILLON 2 μU l/ml 11957 1.82 ECHANTILLON 18 μU l/ml 59226 18.43 ECHANTILLON 35 μU l/ml 84550 32.91

Claims

REVENDICATIONS. 1. Dérivés chemoluminescents heterocycliques d'acridinium, de dérivés substitués d'acridinium, de phénanthridinium, de dérivés substitués de phenantridinium, de quinolenium, de dérivés substitués de quinolenium, d'isoquinolenium et de dérivés substitués d'isoquinolenium correspondant aux formules l à IV
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
dans lesquelles
B représente un élément choisi parmi le groupe constitué par O, S, Se et Te,
Rx est H, un radical choisi parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués, ou une chaîne de formule [R-.XR._-.]n où n ≥ 1 et X représente un ou plusieurs hétéroatomes,
R, R, R, R, Rc ; R-7 R0 RQ R 10 ' RX1 et R12 sont des substituants n'interférant pas avec la chemoluminescence, R3 à R12 sont l'hydrogène ou des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués,
R2 est une aminé, une hydroxylamine, une chalcogénolamine, une oxime ou un isostère d'oxime, et leurs dérivés phosphores, arséniés et antimoniés dont le ou les radicaux sont choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle, hétéroarylalkyle, acyle, arylacyle, hétéroarylacyle, alkylsulfonyle, alkénylsulfonyle, alkynylsulfonyle, arylsulfonyle, hétéroarylsulfonyle, alkylsulfinyle, alkénylsulfinyle, alkynylsulfinyle arylsulfinyle, hétéroarylsulfinyle, alkylsulfényle, alkénylsulfényle, alkynylsulfényle, arylsulfényle, hétéroarylsulfényle éventuellement substitués et dans lesquels le soufre peut être remplacé par un quelconque chalcogène.
2. Dérivés chemoluminescents selon la revendication 1, caractérisés en ce que R2 est :
- soit une aminé de formule:
Figure imgf000038_0001
- N - X - R14 , - N - X - R14 OU - N - X - R14, dans laquelle X et Y sont des éléments choisis parmi le groupe constitué par O, S, Se et Te et dans lequel R13, R14 et/ou R15 sont des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués,
- soit une chalcogénolamine de formule:
R13 R13 Y R13 R15 / / / / /
- Z - A - X - R14 , - Z - A - X - R14 , - Z - A - X - R14
R13
/ ou - Z - A - R14
dans laquelle
Z représente un élément choisi parmi le groupe constitué par O , S , Se et Te ,
A représente un élément choisi parmi le groupe constitué par N, P, As, Sb,
X représente un élément choisi parmi le groupe constitué par C, O, S, Se et Te,
Y représente un élément choisi parmi le groupe constitué par 0, S, Se et Te et
R13, R14 et/ou R15 sont des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués,
- soit une oxime ou un isostère d'oxime et ses dérivés phosphores, arséniés et antimoniés de formule:
Figure imgf000039_0001
- 0 - X = C - R14 , dans lequel
X est un élément choisi parmi le groupe constitué par N, P, As, Sb et C - R15 et - R13, R14 et R15 sont des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylalkyle, éventuellement substitués.
3. Dérivés chemoluminescents selon la revendication
1 ou 2, caractérisés en ce que R1 est un methyle, R2 est une aminé de formule :
/ - N - S - R14 , dans laquelle R13 et R14 sont des radicaux aryle ou hétéroaryle , éventuellement substitués .
4 . Dérivés chemoluminescents selon la revendication 1 ou 2 , caractérisés en ce que R__ est un methyle , R2 est une aminé de formule : R13 /
- N - SO - R14 , dans laquelle R13 et R14 sont des radicaux aryle ou hétéroaryle, éventuellement substitués.
5. Dérivés chemoluminescents selon la revendication
1 ou 2, caractérisés en ce que R__ est un methyle, R2 est une aminé de formule : R13
/
- N - R14 , dans laquelle R13 et R14 sont des radicaux aryle ou hétéroaryle, éventuellement substitués.
6. Dérivés chemoluminescents selon la revendication 5, de formule :
N-phényl-N- (N-méthylpyr idinium- 2 -yl) - 10 -méthylacr i'dinium- 9 - carboxamide ou
N- (N' - hydr oxy succinimidy lbenzoate - 4 -y 1 ) -N- (N1 ' - méthylpyr idinium- 2 -yl) -10 -méthylacridinium-9 -carboxamide ou
N-pyridyl-2-yl-N- (N-méthylpyr idinium-2 -yl) -10 - méthylacr idinium- 9 -carboxamide
7. Dérivés chemoluminescents selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que R___ est un methyle, R2 est une hydroxylamine ou une chalcogénolamine de formule : R13 R13
/ /
- O - N - R14 ou - S - N - R14 , dans laquelle R13 est un radical alkyle, aryle ou hétéroaryle, éventuellement substitué et R14 est un radical acyle, alkylsulf onyle, arylsulf onyle ou arylcarboxyle, éventuellement substitué.
8. Dérivé chemoluminescents selon la revendication 7, de formule :
N-hydroxysuccinimidylf ormylpropioperf luoroanilide) -10 - méthylacr idinium- 9 -carboxylate ou
4- (N-méthylsulf onamido- (N-hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -méthylacridinium-9 -carboxylate ou
4- (N-perf luorophénylsulf onamido- (N-hydroxysuccinimidyl) - benzoate) - 10 -méthylacr idinium- 9 -carboxylate ou
4- (N-phényl suif onamido- (N-hydroxysuccinimidyl) -benzoate) - 10 -méthylacr idinium- 9 -carboxylate . ou (N - hydr oxy succinimidyl f or my lpr opionani 1 ide ) - 10 - méthylacr idinium- 9 -carboxylate
9. Dérivés chemoluminescents selon la revendication
1 ou 2, caractérisés en ce que Rx est un methyle, R2 est une oxime de formule : R3
/
- 0 - N = C - R4 , dans laquelle R3 et R4 sont des radicaux alkyle, aryle ou hétéroaryle éventuellement substitués.
10. Dérivés chemoluminescents selon la revendication 9, de formule :
( 1 -méthyl - 1 -perfluorophényl - 1 - iminométhane) -10 - méthylacridinium-,9-carboxylate ou
1- (N-hydroxysuccinimidylbenzoate-4-yl) -1-perfluorophényl-1- iminométhane) -10-méthylacridinium-9-carboxylate.
11. Dérivés chemoluminescents selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que B est S ou o,
R_. est un methyle, R2 est un groupement de formule :
Figure imgf000042_0001
- S - N ou - O - N \ \
R14 R14 dans lequel R13 et R14 sont un radical alkyle, aryle ou hétéroaryle éventuellement substitué.
12. Dérivés chemoluminescents selon la revendication 11 de formule :
(N-N-diéthylamino) -10-méthylacridinium-9-thio-S-carboxylate ou
(N-N-diéthylamino) -10 -méthylacridinium- 9 - thio -O - carboxylate.
13. Conjugué comprenant un dérivé chemoluminescent selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 lié à un composant biologique spécifique choisi parmi le groupe constitué par les anticorps, les haptenes, les antigènes, les acides nucléiques, les agonistes, les transporteurs cellulaires, les acides gras, les lipides et/ou un mélange d'entre eux.
14. Trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant le conjugué selon la revendication 13 ou un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
15. Utilisation du conjugué selon la revendication 13 ou d'un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour le marquage de protéines, le dosage et/ou la détection d'un composant biologique spécifique choisi parmi le groupe constitué par les anticorps, les haptenes, les antigènes, les acides nucléiques, les agonistes, les transporteurs cellulaires, les acides gras, les lipides et/ou un mélange d'entre eux.
PCT/BE1995/000007 1994-01-25 1995-01-25 Derives chemoluminescents heterocycliques WO1995019976A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU15292/95A AU1529295A (en) 1994-01-25 1995-01-25 Heterocyclic chemoluminescent derivatives
EP95906853A EP0741720A1 (fr) 1994-01-25 1995-01-25 Derives chemoluminescents heterocycliques

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9400087A BE1008216A4 (fr) 1994-01-25 1994-01-25 Derives chemoluminescents heterocycliques.
BE9400087 1994-01-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1995019976A1 true WO1995019976A1 (fr) 1995-07-27

Family

ID=3887915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/BE1995/000007 WO1995019976A1 (fr) 1994-01-25 1995-01-25 Derives chemoluminescents heterocycliques

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0741720A1 (fr)
AU (1) AU1529295A (fr)
BE (1) BE1008216A4 (fr)
WO (1) WO1995019976A1 (fr)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998056765A1 (fr) * 1997-06-11 1998-12-17 Biocode S.A. Derives chimioluminescents heterocycliques
WO2002099097A1 (fr) * 2001-06-01 2002-12-12 Roche Diagnostics Gmbh Nouveaux composes destines a des procedes de chimioluminescence
WO2005015215A1 (fr) * 2003-07-30 2005-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Nouveaux composes chimioluminescents et leur utilisation
US7262306B2 (en) 2003-07-08 2007-08-28 Roche Diagnostics Operations, Inc. Chemiluminescent compounds and their use
WO2008035359A3 (fr) * 2006-06-12 2008-05-15 Cadila Healthcare Ltd Acide oxyminophénoxyalcanoïque et dérivés de l'acide phenylalcanoïque
US7695980B2 (en) 2003-07-30 2010-04-13 Roche Diagnostics Operations, Inc. Chemiluminescent compounds and their use

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0257541A2 (fr) * 1986-08-22 1988-03-02 Hoechst Aktiengesellschaft Dérivés de l'acridine chimioluminescents et leur utilisation pour dosage immunologique par chimioluminescence
EP0273115A2 (fr) * 1986-10-22 1988-07-06 Abbott Laboratories Sels d'acridines et de phénantridines chimiluminescents
EP0330050A2 (fr) * 1988-02-20 1989-08-30 Hoechst Aktiengesellschaft Dérivés spéciaux d'acridine chimiluminescents et leur utilisation dans des tests d'immunoluminescence
WO1992009580A1 (fr) * 1990-11-21 1992-06-11 Beckman Instruments, Inc. Composes chimioluminescents
JPH05255264A (ja) * 1992-03-13 1993-10-05 Sanyo Chem Ind Ltd 標識剤および標識されたリガンドの製法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0257541A2 (fr) * 1986-08-22 1988-03-02 Hoechst Aktiengesellschaft Dérivés de l'acridine chimioluminescents et leur utilisation pour dosage immunologique par chimioluminescence
EP0273115A2 (fr) * 1986-10-22 1988-07-06 Abbott Laboratories Sels d'acridines et de phénantridines chimiluminescents
EP0330050A2 (fr) * 1988-02-20 1989-08-30 Hoechst Aktiengesellschaft Dérivés spéciaux d'acridine chimiluminescents et leur utilisation dans des tests d'immunoluminescence
WO1992009580A1 (fr) * 1990-11-21 1992-06-11 Beckman Instruments, Inc. Composes chimioluminescents
JPH05255264A (ja) * 1992-03-13 1993-10-05 Sanyo Chem Ind Ltd 標識剤および標識されたリガンドの製法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 18, no. 19 (C - 1152) 13 January 1994 (1994-01-13) *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998056765A1 (fr) * 1997-06-11 1998-12-17 Biocode S.A. Derives chimioluminescents heterocycliques
BE1011206A4 (fr) * 1997-06-11 1999-06-01 Biocode Sa Derives chimioluminescents heterocycliques.
WO2002099097A1 (fr) * 2001-06-01 2002-12-12 Roche Diagnostics Gmbh Nouveaux composes destines a des procedes de chimioluminescence
US7332354B2 (en) 2001-06-01 2008-02-19 Roche Diagnostics Operations, Inc. Compounds for chemiluminescense procedures
US7262306B2 (en) 2003-07-08 2007-08-28 Roche Diagnostics Operations, Inc. Chemiluminescent compounds and their use
WO2005015215A1 (fr) * 2003-07-30 2005-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Nouveaux composes chimioluminescents et leur utilisation
US7563902B2 (en) 2003-07-30 2009-07-21 Roche Diagnostics Operations, Inc. Chemiluminescent compounds and their use
US7695980B2 (en) 2003-07-30 2010-04-13 Roche Diagnostics Operations, Inc. Chemiluminescent compounds and their use
WO2008035359A3 (fr) * 2006-06-12 2008-05-15 Cadila Healthcare Ltd Acide oxyminophénoxyalcanoïque et dérivés de l'acide phenylalcanoïque

Also Published As

Publication number Publication date
BE1008216A4 (fr) 1996-02-20
EP0741720A1 (fr) 1996-11-13
AU1529295A (en) 1995-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FR2500165A1 (fr) Procede et reactifs d&#39;immunodetermination par polarisation de fluorescence utilisant des carboxyfluoresceines
EP0321353B1 (fr) Cryptates de terres rares, procédés d&#39;obtention, intermédiaires de synthèse et application à titre de marqueurs fluorescents
FR2748027A1 (fr) Derives de la fluoresceine 4&#39;-methyl-substituee
US5360819A (en) Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis
US5198537A (en) Digoxigenin derivatives and use thereof
EP0322926B1 (fr) Essais utilisant des esters, des thioesters et des amides chimioluminescents
JPH04230855A (ja) ポリ塩化ビフェニルの検出用試薬および方法
JP2602315B2 (ja) 化学ルミネセンス性アクリジン誘導体
FR2695387A1 (fr) Nouveaux composés benzopyraniques, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
NO314308B1 (no) Biotin-innholdende chemiluminiserende markör, anvendelse av markören for fremstilling av en diagnostisk analyse, diagnostisk analyse og settfor diagnostisk analysering
WO1995019976A1 (fr) Derives chemoluminescents heterocycliques
CA2132445A1 (fr) Nouveaux derives du tetrahydrocannabinol, et conjugues et etiquettes de celui-ci avec des proteines et des polypeptides
US5338847A (en) Hydrolytically stable chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom by adduct formation
SE446184B (sv) Polyfunktionell disulfidforening anvendbar som tverbindande medel
FR2487835A1 (fr) Marquage de composes biologiquement interessants par la dichlorotriazinyl-aminofluoresceine
EP2931740B1 (fr) Dérivés de testostérone avec une substitution carboxyalkyle en position 3 et leur utilitisation pour la production des stéroïdes marqués pour la détermination de la concentration de testostérone dans un échantillon biologique
FR2518096A1 (fr) Procede et reactifs de determination immunologique par polarisation de fluorescence
BE1011206A4 (fr) Derives chimioluminescents heterocycliques.
EP0114011B1 (fr) Dérivés estratriéniques radioactifs marqués à l&#39;iode, procédé et intermédiaires de préparation, application aux dosages radio-immunologiques et à la préparation d&#39;antigènes, antigènes obtenus
EP0162877B1 (fr) Méthode de dosage d&#39;enzymes
JP2001081082A (ja) 新規蛍光標識試薬４−アシルアミノ−７−メルカプト−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール
EP0432017B1 (fr) Dérivés de tétrahydro-2,3,6,7,1H,5H,11H-(1)benzopyrano(6,7,8,ij)quinolizinone-11 utilisables comme marqueurs de composés organiques en vue de la détection de ces composés par chimiluminescence ou fluorescence
JP2000319262A (ja) フェニルジアジリン化合物及び光親和性標識試薬
Cais et al. Metalloimmunoassay. IV. Manganese‐labelled metallohaptens via cymantrene derivatives
FR2625565A1 (fr) Esters, thioesters et amides chimioluminescents perfectionnes, et analyses les utilisant

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AM AU BB BG BR BY CA CN CZ EE FI GE HU JP KE KG KP KR KZ LK LR LT LV MD MG MN MW MX NO NZ PL RO RU SD SI SK TJ TT UA US UZ VN

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): KE MW SD SZ AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1995906853

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref country code: US

Ref document number: 1996 687351

Date of ref document: 19960919

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1995906853

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1995906853

Country of ref document: EP

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载