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WO1995011307A1 - Vecteur nucleotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation a l'encontre d'une hepatite - Google Patents

Vecteur nucleotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation a l'encontre d'une hepatite Download PDF

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WO1995011307A1
WO1995011307A1 PCT/FR1994/000483 FR9400483W WO9511307A1 WO 1995011307 A1 WO1995011307 A1 WO 1995011307A1 FR 9400483 W FR9400483 W FR 9400483W WO 9511307 A1 WO9511307 A1 WO 9511307A1
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WO
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vector according
vector
gene
protein
promoter
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PCT/FR1994/000483
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Inventor
Heather Lynn Davis
Robert Gérald WHALEN
Marie-Louise Michel
Original Assignee
Institut Pasteur
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Universite D'ottawa
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Publication date
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present application relates to a vector for immunization against hepatitis.
  • ULMER et al. obtained protection against the Influenza virus by induction of cytotoxic T lymphocytes by injecting into a mouse quadriceps a plasmid coding for the nucleoprotein Influenza A.
  • the plasmid used is either promoter of the Rous sarcoma virus or the promoter of the cytomegalo virus.
  • WANG et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,4156-4160, 1993), injected into the muscles of mice a plasmid carrying a gene coding for the envelope protein of the HIV-1 virus.
  • the injection of the plasmids was preceded by treatment with bupivacaine in the same place in the muscle.
  • the authors demonstrate the presence of antibodies capable of neutralizing infection with the HIV-1 virus. It will nevertheless be noted that the DNA has been injected twice a week for a total number of four injections.
  • DAVIS et al. Report of the 28th European Congress on muscle, Bielefeld, Germany, September 21-25, 1992 injected plasmids carrying a gene coding for luciferase or ⁇ -galactosidase by pretreating the muscles with sucrose or a cardiotoxin.
  • the authors observe the expression of luciferase or of ⁇ -galactosidase. More recently, an article in Science and
  • Encounter viruses such as that of hepatitis B.
  • the naked DNA used to vaccinate mice was pure DNA from the virus. This type of treatment is not possible for human vaccination, because of the risks it poses to patients.
  • the applicant therefore set out to find new constructs of vectors making it possible to immunize against hepatitis while having no negative consequences for human health.
  • the applicant has surprisingly shown that it is possible to obtain an effective and lasting level of antibody which is much higher than the level which makes it possible to obtain effective and lasting immune protection in humans against infection by the virus.
  • hepatitis by administering by intramuscular injection a vector having a defined construction, and a substance capable of inducing coagulatory necrosis of muscle fibers.
  • the present application therefore relates to a nucleotide vector comprising at least:
  • Said vector may not replicate in these cells. It can also be replicative, which makes it possible to obtain a high number of copies per cell and to improve the immune response.
  • the vector is also chosen in order to avoid its integration into cellular DNA, such integrations being known to activate oncogenes and induce cell cancerization.
  • the vector according to the present invention is advantageously a plasmid partly of bacterial origin and carrying in particular an origin of bacterial replication and a gene allowing its selection, such as a gene for resistance to an antibiotic.
  • This vector can also be provided with an origin of replication allowing it to replicate in the its host muscle cells, such as an origin of replication of the bovine papilloma virus.
  • the gene or complementary DNA included in this vector advantageously codes for a structural protein of a virus, but it can also code for a regulatory protein.
  • the gene or complementary DNA carried by this vector can code for at least part of a protein of the hepatitis virus, in particular of hepatitis B and preferably the HBs protein, in one of its S forms, S-preS2 or S-preS2-preSl, in which case the gene is the S gene.
  • the virus can also be responsible for another hepatitis such as hepatitis A or non-A, non-B hepatitis, such as hepatitis C, E or delta.
  • another hepatitis such as hepatitis A or non-A, non-B hepatitis, such as hepatitis C, E or delta.
  • the vector may also include genes coding at least in part for the gpl60 protein of the HIV1 virus associated with the p25 protein, and / or the p55 protein, and / or the p18 protein or at least one gene coding for the Rev protein. HIV1 virus.
  • the vector can also include, instead of a protein from a virus, a protein from a pathogenic microorganism such as a protein from the bacteria responsible for diphtheria, whooping cough, listeriosis, tetanus toxin, etc. ..
  • the promoter carried by this vector is advantageously the promoter of cytomegalovirus (CMV).
  • CMV cytomegalovirus
  • an internal or endogenous promoter that is to say a promoter of the virus from which the gene is derived; such a promoter may be supplemented by a regulatory element of the muscle or of another tissue, in particular an activating element,
  • a promoter of a gene of a cytoskeleton protein in particular desmin as described by BOLMONT et al. (Journal of submicroscopic cytology and pathology, 1990, 22, 117-122) and ZHENLIN et al. (Gene, 1989, 78, 243-254).
  • the promoter can be heterologous to the host, i.e. it is not found in the host naturally, but it is advantageously homologous, while being active at the origin in tissue other than muscle tissue.
  • the vector may include a transcription termination sequence, located downstream of the gene.
  • Such a vector can be the plasmid pCMV / HBS, or pRCCMV-HBS, having the sequence SEQ ID No. 1 “deposited under No. 1-1370 from the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur (CNCM) October 21, 1993.
  • plasmid pRSV / HBS deposited under the number 1-1371 with the CNCM on October 21, 1993.
  • This plasmid is similar in structure to pCMV / HBS but comprises the promoter of the Rous Sarcoma virus (RSV) instead of the promoter of the cytomegalovirus (CMV).
  • RSV Rous Sarcoma virus
  • CMV cytomegalovirus
  • Other plasmids can be:
  • pCMVHB-S2.S which was obtained by eliminating the pre-S1 part of the HBS gene from pCMVHB-Sl.S2.S by Kpnl / Mstl digestion, then by ligating, after treatment with nuclease SI, the two ends .
  • the pCMVHB-S2.S was deposited with the CNCM under the n ° I-1410.
  • the present invention further relates to nucleotide sequences comprising a promoter homologous to the host and another regulatory sequence for the expression of a gene or a complementary DNA. coding for one of the proteins mentioned above.
  • the present invention further relates to a vaccine or a medicament containing at least one vector, or a nucleotide sequence, as defined above.
  • composition capable of inducing a cytotoxic response consisting of at least one nucleotide sequence expressed in muscle cells and comprising a promoter as defined above.
  • a non-lipid pharmaceutical composition intended for immunization against a viral infection such as hepatitis comprising at least on the one hand a substance capable of inducing coagulatory necrosis of the muscle fibers and of on the other hand a vector as described above or comprising one of the nucleotide sequences as described above complete or partial.
  • a viral infection such as hepatitis
  • a vector as described above or comprising one of the nucleotide sequences as described above complete or partial.
  • said substance is bupivacaine.
  • said composition is characterized in that the vector is administered into the muscle of the individual to be immunized, at least 5 days after the administration of bupivacaine, and in substantially the same place.
  • Such a pre-administration of bupivacaine surprisingly makes it possible to increase the efficiency of the administration of the vector as well as the immunization of the individual.
  • the vector is administered ten days after administration of bupivacaine, and in substantially the same place in the muscle of 1 individual.
  • the present composition may also contain compatible and pharmaceutically acceptable adjuvants.
  • a composition is preferably administered by intramuscular injection.
  • the injection can be carried out using a syringe assigned to this use but also using a liquid jet gun such as that described by FURTH et al. (1992, Anal. Biochem. 205, 365-368).
  • the amounts of bupivacaine necessary to obtain a sufficient degeneration of the muscle tissue in order to obtain optimal immunization are of the order of 0.10 mg to 10 mg per dose of composition for injection.
  • the quantities of vectors to be injected in order to obtain optimal immunization of the individual against hepatitis vary according to the protein encoded by the gene carried by the vector. As an indication, between 0.1 and 1000 ⁇ g of vectors will be injected per individual.
  • the vectors may be obtained by the methods known to those skilled in the art, in particular by synthesis or by the methods of genetic engineering. Such methods are those described in particular in the technical manual:
  • Figure 1 is a schematic representation of the plasmid pRC / CMV-HBs.
  • Figures 2A to 2D are representations diagrams of the plasmids pCMVHB-S, pCMVHB-S2.S, pCMVHB-Sl.S2.S and pHBV-Sl.S2.S respectively.
  • Figures 3, 4 and 5 are schematic restriction maps of plasmids pCMVHB-S2.S, pCMVHB-S1 .S2.S and pRSV-HBS respectively.
  • FIG. 6 illustrates the secretion of HBs antigen particles (HBs Ag) in ng / ml (on the ordinate) as a function of the number of days (on the abscissa) by cells carrying the plasmids pCMVHB-S, pCMVHB-S1.S2.S, pHBV-Sl.S2.S, pSVS or pCMVHB-S2.S
  • FIG. 7A and 7B illustrate the detection of some particles of Figure 6 ofêt- antigens ⁇ and PreS 2 respectively by anti-books- ⁇ and anti-preS2 antibodies.
  • the formation of antibody-antigen complexes is demonstrated by the optical density (on the ordinate), as a function of the concentration of antigen.
  • FIGS. 8A to 8D represent the anti-HBS (HBs Ab on the ordinate, expressed in mUI / ml) and anti-preS2 (preS2 Ab on the ordinate, expressed in DO) responses of mice vaccinated with pCMVHB-S (8A) respectively, pCMVHB-S2.S (8B), pCMVHB-Sl .S2.S (8C) and pHBV-Sl.S2.S (8D).
  • FIG. 9 illustrates the antibody response, immunoglobulins Ig G and IgM (titers on the ordinate), of a mouse vaccinated with pCMVHB-S2.S as a function of the number of weeks (on the abscissa).
  • FIGS. 10A to 10C represent the anti-group and anti-sub-type ay responses induced by pCMV-S DNA (DNA) or the HBS antigen (prot), respectively in B10 (10A), BIOS mice (10B) and B10M (10C).
  • FIGS. 10D to 10F represent the anti-group responses a induced by pCMV-S DNA (DNA) or of the HBS (prot) antigen, respectively in B10 (10D), BIOS (10E) and B10M (10F) mice.
  • FIG. 11 represents a linear restriction map of the plasmid pBS-SKT-Sl.S2.S. EXAMPLE 1:
  • the plasmid used was constructed by cloning into a modified pBluescript vector of the restriction fragment Xho I-Bgl II of the plasmid pCPlO which contains the gene coding for the surface antigen HBS and untranslated sequences upstream and downstream including the polyadenylation signal.
  • the S gene was then recovered by digestion using the enzymes Kpnl-BssHII and the fragment was cloned into the vector site pRC / CMV marketed by In Vitrogen.
  • the final plasmid construct was called pCMV-HBS and was deposited under the number 1-1370 with the CNCM.
  • This plasmid is shown schematically in " Figure 1.
  • the CMV promoter is located between nucleotide 228 which is the cleavage site of the MluI and nucleotide 896, which is the cleavage site of the KpnI.
  • the DNA fragment comprising the structural gene for the HBs antigen was cloned between nucleotides 896 and 2852 (BssH III site). HBs gene extends between nucleotides 911
  • the purified plasmid DNA was prepared by standard methods, redissolved in PBS buffer and stored at -20 ° C until injection. 1.3 DNA injection
  • the DNA solution which contains 50 ⁇ q of plasmid DNA and 50 ⁇ l of PBS buffer was injected through the skin into the muscles during regeneration of the anterior tibia by a single intramuscular injection.
  • Injections were carried out bilaterally, in the two legs of the mice, each animal thus receiving a total of 100 ⁇ g of plasmid DNA recombinant.
  • the DNA solution is injected using the tuberculosis syringe and the needle previously described.
  • a dose of 10 ⁇ g of plasmid DNA of the vector SV40-Luciferase commercially available '("pGL2- Control Vector" from Promega, reference El 11) in 50 ⁇ l of physiological solution is injected into a muscle pretreated with sucrose according to the method of Davis et al. (Hum. Gene Ther. 4: 151-159 (1993)).
  • the injected DNA is mixed beforehand with lipids such as dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS) or the following mixtures: DOGS + spermidine, and DOGS + polyethyleneglycol (PEG).
  • DOGS dioctadecylamidoglycyl spermine
  • PEG polyethyleneglycol
  • mice and rabbits Comparison of the responses of mice and rabbits to plasmids carrying various promoters and envelope genes of the HBV virus.
  • plasmids were constructed allowing the expression of one, two or three envelope proteins of the HBV virus.
  • the genes coding for the envelope proteins of the HBV virus are placed under the transcriptional control of the promoter of the early genes of the CMV virus ( Figure 1, Figure 2 A to 2C, Figures 3 and 4).
  • the fourth plasmid uses as a transcriptional control element the promoter of the surface genes of the HBV virus contained in the pre-S1 region of this virus (Cattaneo et al. (1983) Nature, 305, 336 ) ( Figure 2D).
  • the polyadenylation signal used is contained in the HBV sequences present 3 ′ of the S gene.
  • FIG. 6 shows the secretion kinetics of HBs particles in culture supernatants.
  • the low levels of antigen produced by transfection of the vector pCMVHB-Sl .S2.S are compatible with a strong synthesis of the large envelope protein from the CMV promoter.
  • composition of the secreted particles was analyzed in a sandwich ELISA system using, as capture antibody, a mouse monoclonal antibody specific for the pre-S1 (FIG. 7A) or pre-S2 (FIG. 7B) determinants and as a second antibody a polyclonal rabbit serum. anti-HBs.
  • These experiments show that the particles of AgHBs produced from the vector pCMVHB-Sl .S2.S carry pre-S1 and pre-S2 determinants signifying the presence of the large and medium envelope protein of the HBV virus.
  • the particles secreted after transfection of the vector pCMVHB-S2.S and pHBV-Sl.S2.S carry, in addition to the Hbs determinants, pre-S2 determinants characteristic of the average envelope protein. 2) DNA inoculation
  • the DNA purified on a Quiagen column was injected intramuscularly in a single injection of 100 ⁇ g (50 ⁇ g / paw) into the anterior muscle of the tibia of C57 / BL6 mice (8 mice per group). Five days before the injection, the muscle was pretreated with cardiotoxin to induce a degeneration followed regeneration of muscle cells, thus promoting the capture of DNA by these cells.
  • DNA injection experiments have also been carried out in rabbits.
  • the pCMVHB-S DNA was administered into the normal muscle without degeneration, either by means of a needle-free injection gun, the Biojector, or by means of conventional syringes fitted with needles.
  • An anti-HBs antibody response is induced by a single injection of one or other of the four plasmids used.
  • Anti-preS2 antibodies are detected in an ELISA system using on the solid phase a peptide from the pre-S2 region (AA 120-145) corresponding to the major B epitope carried by this domain (Neurath et al., (1985) , Nature, 315, 154).
  • FIGS. 8A to 8D show the kinetics of the anti-HBs response (HBs-Ab) expressed in international milli-units / ml and of the anti-pre-S2 response (preS2Ab) measured in optical density (492 nm) for sera diluted 1/100.
  • the revelation is carried out using a peroxidase-labeled mouse anti-immunoglobulin (IgG) antibody.
  • ELISA systems relating to the solid phase of HBs antigens of various compositions vis-à-vis determinants presented and using, as second antibody, antibodies specific for mouse IgM or IgG made it possible to qualitatively analyze the antibody response obtained.
  • the single injection of DNA into mice is characterized by the early appearance of IgM specific for HBsAg followed immediately by the conversion into antibodies of IgG isotypes characteristic of the memory response induced with l using helper T cells.
  • the antibody response to DNA injection is characterized by its precocity. In fact, seroconversion is obtained 8 to 15 days after the injection, depending on the type of DNA used, and in all cases the plateau is reached in four weeks and maintained for 12 weeks.
  • HBs antigen of heterologous sub-type (ad) fixed on the ELISA plates makes it possible to demonstrate the presence, in the serum of the immunized mice, of antibodies specific for anti-a group, and by difference in reactivity vis -in respect of HBsAg of the same subtype (ay), of specific antibodies of anti-y subtype.
  • the presence of antibodies specific to the group determinants of HBsAg is very important since they are capable of conferring protection against heterologous subtype viruses during virulent tests in the chimpanzee (Szmuness et al. (1982) N. Engl. J. Med. 307, 1481-1486).
  • the response obtained with the other three vaccine DNAs shows the switching of the IgM ⁇ IgG class characteristic of the secondary response.
  • the response is first directed against the subtype before being directed against the group determinants of HBsAg.
  • the previously described pCMVHB-S construct was injected into the muscles of B10 (H- 2 b ) B10.S (H-2 S ) and B10.M (H-2 f ) mice.
  • the B10 strain responds to the three envelope proteins of the virus, the B10.S strain does not respond to AgHBs but non-response can be overcome by immunization with HBsAg antigens carrying pre-S2 determinants.
  • the B10M strain is completely nonresponsive to the HBs antigen and to the pre-S2 antigen. A response in this strain could be obtained by immunization with HBsAg carrying pre-S1 determinants.
  • mice immunized with DNA received a single injection (100 ⁇ g) in the regenerating muscle.
  • Control mice received the protein in two intraperitoneal injections at one month apart, the first of 2 ⁇ g HBsAg adjuvanted in complete Freund's adjuvant (CFA) and the second of 2 ⁇ g HBsAg adjuvanted in incomplete Freund's adjuvant (IFA).
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • FIGS. 10A to 10F The results obtained with the pCMVHB-S DNA are illustrated by FIGS. 10A to 10F.
  • strain B10 good responder the response induced by DNA is earlier than the response induced by protein after a single injection.
  • DNA immunization makes it possible to obtain an anti-HBs response specific for the group and subtype whereas the protein induces a response of subtype only and requires two injections.
  • the vector pCMVHB-S2.S makes it possible to obtain in 8 days a very high level of anti-pre-S2 antibodies and we know that these are capable, on their own, to confer protection (Itoh et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9174-9178).
  • anti-HBs antibodies persist at a high level for more than 6 months.
  • the antibodies obtained are of the IgG type characteristic of a response dependent on T helper cells and therefore of a memory response.
  • the antibodies are specific for the viral subtype but above all group-specific and therefore capable of providing cross-protection.
  • CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC 720

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Abstract

Vecteur nucléotidique comprenant au moins un gène ou un ADN complémentaire codant pour au moins une partie d'une protéine d'un virus, et un promoteur permettant l'expression de ce gène dans des cellules musculaires. Le gène peut être le gène S du virus de l'hépatite B. Une préparation vaccinale contenant cet ADN nu est injectée à l'hôte préalablement prétraité par une substance capable d'induire une nécrose coagulatrice des fibres musculaires.

Description

VECTEUR NUCLEOTIDIQUE, COMPOSITION LE CONTENANT ET VACCIN POUR L'IMMUNISATION A L*ENCONTRE D'UNE HEPATITE.
La présente demande a pour objet un vecteur pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
Elle est en outre relative à une composition contenant ce vecteur .
L'immunisation par injection d'ADN nu dans les tissus musculaires a fait l'objet de plusieurs travaux depuis le début des années 1990.
Ainsi, ULMER et al . ( Science, 259, 1745-1749, 1993) ont obtenu une protection à l'encontre du virus Influenza par induction des lymphocytes T cytotoxiques en injectant dans des quadriceps de souris un plasmide codant pour la nucléoprotéine Influenza A. Le plasmide utilisé porte soit le promoteur du virus du sarcome de Rous soit le promoteur du cytomégalo virus.
RAZ et al. ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4523-4527, 1993) ont injecté des vecteurs comprenant le promoteur du virus du sarcome de Rous et un gène codant pour 1 ' interleukine-2, 1' interleukine-4 ou le facteur de croissance transformant de type βl(TGF-βl). Les réponses immunitaires humorale et cellulaire, des souris auxquelles ont été administrés par voie intramusculaire ces plasmides, sont améliorées.
WANG et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,4156-4160, 1993), ont injecté dans les muscles de souris un plasmide portant un gène codant pour la protéine d'enveloppe du virus HIV-1. L'injection des plasmides a été précédée par un traitement par de la bupivacaine au même endroit dans le muscle. Les auteurs mettent en évidence la présence d'anticorps capables de neutraliser l'infection par le virus HIV- 1. On remarquera néanmoins que l'ADN a été injecté deux fois par semaine pour un nombre total de quatre injections .
DAVIS et al . ( Compte-Rendu du 28ème Congrès Européen sur le muscle, Bielefeld, Allemagne, 21-25 Septembre 1992) ont injecté des plasmides portant un gène codant pour la luciférase ou la β-galactosidase en prétraitant les muscles par du sucrose ou une cardiotoxine. Les auteurs observent l'expression de la luciférase ou de la β-galactosidase. Plus récemment, un article paru dans Science et
Avenir (Septembre 1993, pages 22-25) indique que WHALEN et DAVIS ont réussi à immuniser des souris contre le virus de l'hépatite B en leur injectant de l 'ADN pur du virus dans les muscles. Une injection préalable de toxine de venin de serpent suivie de l'injection d'ADN 5 à 10 jours plus tard est citée de manière générale. Il est précisé que cette méthode n'est pas pratique.
Ces travaux avaient été précédés par d'autres expérimentations dans lesquelles différents ADN avaient été injectés, en particulier dans des tissus musculaires. Ainsi, la demande PCT/US 90/01 515 (publiée sous le n° WO-90/11 092) divulgue diverses constructions plasmidiques pouvant être injectées, en particulier dans des tissus musculaires pour le traitement de la dystrophie musculaire. Néanmoins, ce document précise que 1 'ADN est preferentiellement injecté dans des liposomes.
Il en est de même du .brevet canadien CA 362.966 (publié sous le n° 1.169.793) qui décrit l'injection intramusculaire de liposomes contenant de l'ADN codant en particulier pour les antigènes HBs et HBc. Les résultats décrits dans ce brevet mentionnent l'expression d'antigènes HBs. La présence d'anticorps anti-HBs n'a pas été recherchée.
La demande Internationale PCT/FR 92/00 898 (publiée sous le n° W0-93/06 223) décrit des vecteurs viraux pouvant être acheminés par la voie sanguine jusqu'à des cellules cibles. Ces vecteurs sont ainsi reconnus par les récepteurs de cellules, telles que des cellules musculaires et peuvent être employés dans le traitement de la dystrophie musculaire ou de la thrombose. Cette demande ne concerne pas l'immunisation à
1'encontre de virus tels que par exemple celui de l'hépatite B.
Il ressort donc de l'état de la technique cité que, si l'on connaissait déjà des techniques d'immunisation à l'encontre de l'hépatite par injection d'ADN nu, celles-ci présentaient un grand nombre d'inconvénients ne les rendant pas pratiques à mettre en oeuvre.
D'autre part, l'ADN nu utilisé pour vacciner des souris était l'ADN pur du virus. Ce type de traitement n'est pas envisageable pour la vaccination humaine, du fait des risques qu'il fait courir aux patients .
Enfin, les expérimentations plus anciennes dans lesquelles l'ADN injecté est contenu dans des liposomes n'ont pas démontré de réponse immunitaire.
Le demandeur s'est donc attaché à trouver de nouvelles constructions de vecteurs permettant d'immuniser à l'encontre de l'hépatite tout en n'ayant pas de conséquences négatives pour la santé humaine.
Il s'est d'autre part attaché à trouver un additif à des compositions contenant ces constructions permettant une dégénérescence efficace du tissu musculaire avant l'injection de l'ADN, et compatible avec les impératifs de la santé humaine.
Le demandeur a montré de manière surprenante que l'on pouvait obtenir un niveau d'anticorps efficace et durable largement supérieur au niveau permettant d'obtenir chez l'homme une protection immunitaire efficace et durable à l'encontre de l'infection par le virus de l'hépatite en administrant par injection intramusculaire un vecteur ayant une construction définie, et une substance capable d'induire une nécrose coagulatrice des fibres musculaires .
La présente demande a donc pour objet un vecteur nucléotidique comprenant au moins :
- un gène ou un ADN complémentaire codant pour au moins une partie d'une protéine de virus, et
- un promoteur permettant l'expression de ce gène dans des cellules musculaires.
Ledit vecteur peut ne pas se répliquer dans ces cellules . II peut aussi être réplicatif ce qui permet d'obtenir un nombre élevé de copies par cellule et d'améliorer la réponse immunitaire.
Le vecteur est en outre choisi afin d'éviter son intégration au sein de l'ADN cellulaire, de telles intégrations étant connues pour activer les oncogènes et induire la cancérisation des cellules.
Le vecteur selon la présente invention est avantageusement un plasmide en partie d'origine bactérienne et portant notamment une origine de réplication bactérienne et un gène permettant sa sélection, tel qu'un gène de résistance à un antibiotique.
Ce vecteur peut être aussi pourvu d'une origine de réplication lui permettant de se répliquer dans les cellules musculaires de son hôte, telle qu'une origine de réplication du virus du papillome bovin.
Le gène ou l'ADN complémentaire compris dans ce vecteur code avantageusement pour une protéine de structure d'un virus mais il peut aussi coder pour une protéine régulatrice.
Le gène ou l'ADN complémentaire porté par ce vecteur peut coder pour au moins une partie d'une protéine du virus d'une hépatite en particulier de l'hépatite B et preferentiellement la protéine HBs, sous l'une de ses formes S, S-préS2 ou S-préS2-préSl, auquel cas le gène est le gène S.
Le virus peut aussi être responsable d'une autre hépatite telle qu'une hépatite A ou qu'une hépatite non-A, non-B, telle qu'une hépatite C, E ou delta.
Les séquences des gènes ou des protéines des virus de ces hépatites sont décrites ou peuvent être déduites des documents suivants : brevet FR-79 21 811, brevet FR 80.09.039, brevet EP-81.400.634, brevet FR 84.03.564, brevet EP 91.830.479 et article de Najarian et al. ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82,
2627-2631) . Le vecteur peut aussi comprendre des gènes codant au moins en partie pour la protéine gpl60 du virus HIV1 associée à la protéine p25, et/ou à la protéine p55, et/ou à la protéine pl8 ou au moins un gène codant pour la protéine Rev du virus HIV1. Le vecteur peut aussi comprendre au lieu d'une protéine d'un virus, une protéine d'un microorganisme pathogène tel qu'une protéine de la bactérie responsable de la diphtérie, de la coqueluche, d'une listériose , la toxine du tétanos etc.. Le promoteur porté par ce vecteur est avantageusement le promoteur du cytomégalovirus (CMV) .
Il peut néanmoins être tout autre promoteur permettant une expression efficace du gène dans les cellules musculaires.
Il peut ainsi être :
- un promoteur interne ou endogène, c'est-à- dire un promoteur du virus dont est issu le gène; un tel promoteur peut être complété par un élément régulateur du muscle ou d'un autre tissu, en particulier un élément activateur,
- un promoteur d'un gène d'une protéine du cytosquelette, en particulier de la desmine tel que décrit par BOLMONT et al. (Journal of submicroscopic cytology and pathology, 1990, 22, 117-122) et ZHENLIN et al. (Gène, 1989, 78, 243-254).
- le promoteur des gènes de surface du virus HBV.
De manière générale , le promoteur peut être hétérologue à l'hôte, c'est-à-dire qu'il n'est pas trouvé chez l'hôte de manière naturelle, mais il est avantageusement homologue, tout en étant actif à l'origine dans un tissu autre que le tissu musculaire.
Outre le promoteur, le vecteur peut comprendre une séquence de terminaison de la transcription, située en aval du gène.
Un tel vecteur peut être le plasmide pCMV/HBS, ou pRCCMV-HBS, ayant la séquence SEQ ID N°l« déposé sous le N° 1-1370 auprès de la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de l'Institut Pasteur ( CNCM) le 21 Octobre 1993.
Il peut aussi être le plasmide pRSV/HBS déposé sous le n°1-1371 auprès de la CNCM le 21 Octobre 1993.. Ce plasmide est de structure similaire au pCMV/HBS mais comprend le promoteur du virus du Sarcome de Rous (RSV) au lieu du promoteur du cytomégalovirus (CMV) . D'autres plasmides peuvent être :
- le pCMVHB-Sl.S2.S qui a ' été construit par insertion du fragment Bgl II-Bgl II du gène S, obtenu à partir du pCPlO, dans un vecteur pBlueScript modifié' pour contenir des sites de clonage supplémentaires dans la partie "polylinker" . Le fragment contenant le gène S a été ensuite enlevé par digestion Kpnl-BssH II puis clone dans les sites correspondants du pcDNA 3 (In vitrogen, Rad Systems Europe Ltd, Abingdon UK) afin d'obtenir le pCMVHB-Sl.S2.S . Ce plasmide a été déposé sous le n° 1-1411 auprès de la CNCM.
- le pCMVHB-S2.S qui a été obtenu en éliminant la partie pré-Sl du gène HBS du pCMVHB-Sl.S2.S par digestion Kpnl/Mstl, puis en liguant, après traitement par de la nucléase SI, les deux extrémités. Le pCMVHB-S2.S a été déposé auprès de la CNCM sous le n°I-1410.
- le pHBV-Sl.S2.S, déposé auprès de la CNCM sous le n° 1-1409, a été obtenu par insertion du fragment Bgl II- Bgl II du gène S, obtenu à partir du pCPlO, dans un vecteur pBlueScript modifié pour contenir des sites supplémentaires de clonage dans la partie "polylinker", le pBS-SKT-Sl.S2.S, code pour les trois protéines d'enveloppe S, S-préS-^ et S-préS1-préS2 du virus HBV.
La présente invention est en outre relative à des séquences nucleotidiques comprenant un promoteur homologue à l'hôte et une autre séquence de régulation pour l'expression d'un gène ou d'un ADN complémentaire codant pour une des protéines citées ci-dessus.
La présente invention a en outre pour objet un vaccin ou un médicament contenant au moins un vecteur, ou une séquence nucléotidique, tel que défini ci- dessus.
Elle a de plus pour objet une composition capable d'induire une réponse cytotoxique constituée par au moins une séquence nucléotidique exprimée dans les cellules musculaires et comportant un promoteur tel que défini ci-dessus.
Elle est encore relative à une composition pharmaceutique non lipidique destinée à l'immunisation à l'encontre d'une infection virale telle qu'une hépatite comprenant au moins d'une part une substance capable d'induire une nécrose coagulatrice des fibres musculaires et d'autre part un vecteur tel que décrit ci-dessus ou comportant une des séquences nucleotidiques telles que décrites ci-dessus complètes ou partielles. On entend par séquence partielle ou séquence codant pour au moins 6 acides aminés.
Avantageusement ladite substance est la bupivacaine.
D'une manière avantageuse, ladite composition est caractérisée en ce que le vecteur est administré dans le muscle de l'individu à immuniser, au minimum 5 jours après l'administration de la bupivacaine, et sensiblement au même endroit.
Une telle pré-administration de bupivacaine permet de manière surprenante d'augmenter l'efficacité de l'administration du vecteur ainsi que l'immunisation de l'individu .
Avantageusement, le vecteur est administré dix jours après administration de la bupivacaine, et sensiblement au même endroit dans le muscle de 1 ' individu.
La présente composition peut en outre contenir des adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables . Une telle composition est preferentiellement administrée par injection intramusculaire. L'injection peut être effectuée à l'aide d'une seringue affectée à cet usage mais aussi à l'aide d'un pistolet à jet liquide tel que celui décrit par FURTH et al . ( 1992, Anal. Biochem.205, 365-368).
Les quantités de bupivacaine nécessaires pour obtenir une dégénérescence suffisante du tissu musculaire afin d'obtenir une immunisation optimale sont de l'ordre de 0,10 mg à lOmg par dose de composition injectable.
Les quantités de vecteurs à injecter afin d'obtenir une immunisation optimale de l'individu à 1 'encontre d'une hépatite varient en fonction de la protéine codée par le gène porté par le vecteur. A titre indicatif, on injectera entre 0,1 et 1000 μg de vecteurs par individu.
Les vecteurs pourront être obtenus par les méthodes connues de l'homme du métier, en particulier par synthèse ou par les méthodes du génie génétique. De telles méthodes sont celles décrites en particulier dans le manuel technique :
Maniatis T. et al. 1982 - Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor - Ed. New York.
La présente invention est illustrée sans aucunement être limitée par les exemples qui suivent dans lesquels :
La figure 1 est une représentation schématique du plasmide pRC/CMV-HBs. _ Les figures 2A à 2D sont des représentations schématiques respectivement des plasmides pCMVHB-S, pCMVHB-S2.S, pCMVHB-Sl.S2.S et pHBV-Sl.S2.S
Les figures 3, 4 et 5 sont des cartes de restriction schématiques respectivement des plasmides pCMVHB-S2.S, pCMVHB-Sl .S2.S et pRSV-HBS.
La figure 6 illustre la sécrétion de particules antigeniques HBs (HBs Ag) en ng/ml (en ordonnée) en fonction du nombre de jours ( en abscisse ) par des cellules portant les plasmides pCMVHB-S, pCMVHB- S1.S2.S, pHBV-Sl.S2.S, pSVS ou pCMVHB-S2.S
Les figures 7A et 7B illustrent la mise en évidence sur certaines particules de la figure 6 des antigènes préS-^ et PréS2 par respectivement des anticorps anti-prés-^ et anti-préS2. La formation des complexes anticorps-antigène est mise en évidence par la densité optique (en ordonnée), en fonction de la concentration en antigène.
Les figures 8A à 8D représentent les réponses anti-HBS (HBs Ab en ordonnée, exprimée en mUI/ml) et anti-préS2 (preS2 Ab en ordonnée, exprimée en D.O.) de souris vaccinées par respectivement le pCMVHB-S (8A), le pCMVHB-S2.S (8B), le pCMVHB-Sl .S2.S (8C) et le pHBV-Sl.S2.S (8D).
La figure 9 illustre la réponse anticorps, immunoglobulines Ig G et IgM ( titres en ordonnée), d'une souris vaccinée par le pCMVHB-S2.S en fonction du nombre de semaines (en abscisse) .
Les figures 10A à 10C représentent les réponses anti-groupe et anti-sous type ay induites par de l'ADN de pCMV-S (ADN) ou de l'antigène HBS (prot), respectivement chez des souris B10 (10A), BIOS (10B) et B10M (10C) .
Les figures 10D à 10F représentent les réponses anti-groupe a induites par de l'ADN de pCMV-S (ADN) ou de l'antigène HBS (prot) , respectivement chez des souris B10 (10D), BIOS (10E) et B10M (10F).
La figure 11 représente une carte linéaire de restriction du plasmide pBS-SKT-Sl.S2.S. EXEMPLE 1 :
Induction d'anticorps à 1 'encontre d'un antigène de surface de l'hépatite B par injection séquentielle de bupivacaine et d'un plasmide portant' un gène codant pour l'antigène. 1) Matériels et méthodes
1.1 Prétraitement par la bupivacaine. Toutes les expérimentations ont été effectuées sur les muscles du tibia antérieur ( TA) de souris C57BL/6J âgées de 5 à 7 semaines. Un cycle unique de dégénération et de régénération des fibres musculaires est induit dans les muscles du tibia antérieur de souris non anesthésiées, par injection intramusculaire de 50 μl de marcaïne (bupivacaine 0,5 %, DMSO 1%) commercialisée par les Laboratoires Astra, France. La solution est injectée en utilisant une seringue à tuberculose et une aiguille insérée dans un manchon de polyethylene, afin de limiter la pénétration à une profondeur de 2 mm. La marcaïne étant un anesthésique, les injections dans les jambes droite et gauche sont espacées de 10 à 30 minutes afin d'éviter un surdosage.
1.2. Préparation de l'ADN Le plasmide utilisé a été construit par clonage dans un vecteur pBluescript modifié du fragment de restriction Xho I-Bgl II du plasmide pCPlO qui contient le gène codant pour l'antigène de surface HBS et des séquences non traduites en amont et en aval incluant le signal de poly-adénylation.
Le gène S a été ensuite récupéré par digestion à l'aide des enzymes Kpnl-BssHII et le fragment a été clone dans le site du vecteur pRC/CMV commercialisé par In Vitrogen. La construction plasmidique finale a été appelée pCMV-HBS et a été déposé sous le n°1-1370 auprès de la CNCM.
Ce plasmide est représenté schématiquement sur' la figure 1. Le promoteur CMV est situé entre le nucléotide 228 qui est le site de coupure de la MluI et le nucléotide 896, qui est le site de coupure de la Kpnl . Le fragment d'ADN comprenant le gène de structure de l'antigène HBs a été clone entre les nucléotides 896 et 2852 ( site de la BssH III). Le gène HBs s'étend entre les nucléotides 911
(site Xhol) et 2768 (site Bgl II).
La séquence complète de ce plasmide est la séquence SEQ ID N'1.
L'ADN plasmidique purifié a été préparé par les méthodes standard, redissous dans du tampon PBS et stocké à -20°C jusqu'à l'injection. 1.3 Injection de l'ADN
Un à cinq jours après injection de la marcaïne, on a injecté au même endroit l'ADN, la souris étant anesthésiée à l'aide de pentobarbital de sodium (75mg/kg voie intrapéritonéale ).
La solution d'ADN qui contient 50 μq d'ADN plasmidique et 50 μl de tampon PBS a été injectée à travers la peau dans les muscles en cours de régénération du tibia antérieur par une injection unique intramusculaire.
Des injections ont été effectuées de manière bilatérale, dans les deux pattes des souris, chaque animal recevant ainsi au total lOOμg d'ADN plasmidique recombinant. Comme pour l'injection de la marcaïne, on injecte la solution d'ADN en utilisant la seringue à tuberculose et l'aiguille précédemment décrite.
Dans chaque patte on a effectué une seule injection intramusculaire d'ADN.
2. Résultats
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau I ci-après .
Ils montrent de manière très claire que l'injection d'ADN après traitement par la marcaine permet d'obtenir des taux importants d'anticorps sériques à l'encontre de l'antigène de surface de l'hépatite B.
Ces résultats sont surprenants, l'analyse de l'état de la technique ne permettant pas de supposer qu'un plasmide permettrait l'induction d'anticorps- anti-HBs pouvant être retrouvés dans le sérum et permettant ainsi une vaccination efficace.
La facilité de mise en oeuvre de la vaccination par des plasmides, et le fait qu'il ne soit pas nécessaire de faire des rappels, permet d'envisager une vaccination à grande échelle. EXEMPLE 2 :
Comparaison de l'efficacité d'injection d'un plasmide en présence et en absence de lipides.
Une dose de 10 μg d'ADN plasmidique du vecteur SV40-Luciférase disponible dans le commerce' ("pGL2- Control Vector" de Promega, référence El 11) dans 50 μl de solution physiologique est injectée dans un muscle prétraité avec du sucrose selon la méthode de Davis et al. (Hum. Gène Ther. 4:151-159 (1993)). L'ADN injecté est préalablement mélangé avec des lipides tels que le dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou des mélanges suivants : DOGS + spermidine, et DOGS + polyethyleneglycol (PEG). L'activité de la luciférase est mesurée 5 jours après l'injection.
Ces résultats figurent dans le tableau II ci- après . Ils montrent que la présence de lipides (DOGS) diminue de manière très importante l'efficacité d'injection du plasmide par rapport à une composition sans lipides (témoin) . EXEMPLE 3:
Comparaison des réponses de souris et de lapins à 1 'encontre de plasmides portant divers promoteurs et gènes d'enveloppe du virus HBV.
Quatre plasmides ont été construits permettant l'expression de une, deux ou trois protéines d'enveloppe du virus HBV. Dans trois des constructions (pCMVHB-S, pCMVHB-S2.S, pCMVHB-Sl.S2.S) les gènes codant pour les protéines d'enveloppe du virus HBV sont placés sous le contrôle transcriptionnel du promoteur des gènes précoces du virus CMV ( figure 1, figure 2 A à 2C , figures 3 et 4). Le quatrième plasmide (pHBV-Sl.S2.S) utilise comme élément de contrôle transcriptionnel le promoteur des gènes de surface du virus HBV contenu dans la région pré-Sl de ce virus (Cattaneo et al. (1983) Nature, 305, 336) (figure 2D) . Dans les quatre constructions, le signal de polyadénylation utilisé est contenu dans les séquences HBV présentes en 3' du gène S.
1- Contrôle in vitro de l'efficacité des vecteurs .
Pour contrôler l'efficacité de ces vecteurs in vitro dans des cellules eucaryotes, des fibroblastes ou des myoblastes de souris ont été transfectes. Un plasmide exprimant les trois protéines d'enveloppe sous contrôle du promoteur SV40 (pSVS) a été utilisé comme contrôle (Michel et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7708-7712)). La figure 6 montre la cinétique de sécrétion des particules HBs dans les surnageants de culture. Les faibles taux d'antigène produits par transfection du vecteur pCMVHB-Sl .S2.S sont compatibles avec une forte synthèse de la grande protéine d'enveloppe à partir du promoteur CMV. Cette protéine étant myristillée dans sa partie amino- terminale, est retenue dans le réticulum endoplasmique (Ganem, (1991), Current Topics in Microbiology and Immunology, 168, 61-83). La rétention dans la cellule de protéines portant des déterminants pré-Sl a été confirmée par immunofluorescence.
La composition des particules sécrétées a été analysées dans un système ELISA sandwich utilisant comme anticorps de capture un anticorps monoclonal de souris spécifique des déterminants pré-Sl ( figure 7A) ou pré-S2 (figure 7B) et comme second anticorps un sérum polyclonal de lapin anti-HBs. Ces expériences montrent que les particules d'AgHBs produites à partir du vecteur pCMVHB-Sl .S2.S portent des déterminants pré-Sl et pré-S2 signant la présence de la grande et de la moyenne protéine d'enveloppe du virus HBV. Les particules sécrétées après transfection du vecteur pCMVHB-S2.S et pHBV-Sl.S2.S portent, en plus des déterminants Hbs, des déterminants pré-S2 caractéristiques de la protéine moyenne d'enveloppe. 2) Inoculation de l'ADN
L'ADN purifié sur colonne Quiagen a été injecté par voie intramusculaire en une seule injection de lOOμg (50 μg/patte) dans le muscle antérieur du tibia de souris C57/BL6 (8 souris par groupe). Cinq jours avant l'injection, le muscle a été prétraité par la cardiotoxine afin d'induire une dégénération suivie d'une régénération des cellules musculaires favorisant ainsi la capture de l'ADN par ces cellules.
Des expériences d'injection de l'ADN ont été également réalisées chez le lapin. Dans ce cas l'ADN pCMVHB-S a été administré dans le muscle normal sans dégénération, soit au moyen d'un pistolet d'injection sans aiguille le Biojector , soit au moyen de seringues conventionnelles munies d'aiguilles.
3) Réponses anti-HBs des souris vaccinées par l'ADN
Une réponse anticorps anti-HBs est induite par une seule injection de l'un ou l'autre des quatre plasmides utilisés.
La réponse anticorps a été analysée au moyen de kit commerciaux de détection des anticorps anti-HBs (Monolisa anti-HBs, Diagnostic Pasteur). Les anticorps anti-préS2 sont détectés dans un système ELISA utilisant sur la phase solide un peptide de la région pré-S2 (AA 120-145) correspondant à l'épitope B majeur porté par ce domaine (Neurath et al., (1985), Nature, 315, 154).
Les figures 8A à 8D montrent la cinétique de la réponse anti-HBs (HBs-Ab) exprimée en milli-unités internationales/ml et de la réponse anti-pré-S2 (préS2Ab) mesurée en densité optique (492 nm) pour des sérums dilués au 1/100. La révélation est effectuée à l'aide d'un anticorps anti-immunoglobuline (IgG) de souris marqué à la péroxydase.
L'injection du plasmide pCMVHB-S (figure 8A) induit une synthèse constante des anticorps anti-HBs. La séroconversion est obtenue chez 100% des souris dès une semaine après l'injection avec un taux moyen d'anticorps de 48 mUI/ml (de 12 à 84 mUI/ml, écart- type (SD) =28), ce qui est 4 à 5 fois supérieur au seuil requis chez l'homme pour conférer la protection (10 mUI/ml) .
La réponse induite par une seule injection du plasmide pCMVHB-S2.S (figure 8B) se caractérise par l'apparition très précoce d'anticorps anti-HBs. Ces anticorps atteignent un taux moyen de 439 mUI/ml ( de 104 à 835 mUI/ml; SD = 227) à une semaine puis diminuent pour réaugmenter et atteindre à 13 semaines le taux initial. La signification de ce pic d'anticorps sera discutée plus loin. Un pic d'anticorps IgG anti-pré-S2 est observé à deux semaines.
L'apparition des anticorps anti-HBs induits par l'injection des plasmides pCMVHB-Sl.S2.S ( figure 8C) et pHBV-Sl.S2.S ( figure 8D) est légèrement retardée puisque les souris ne séroconvertissent à 100 % qu'à partir de deux semaines. Le profil de la séroconversion est identique, il est caractérisé par une réponse initiale spécifique de l'antigène pré-S2 suivie d'une réponse anti-HBs augmentant graduellement pour atteindre des taux de 488 mUI/ml (de 91 à 1034 mUI/ml; SD=552) (pCMVHB-Sl.S2.S) et 1725 mUI/ml (de 143 à 6037 mUI/ml; SD=1808) (pHBV-Sl.S2.S) à 13 semaines. 4) Réponse anti-HBs des lapins vaccinés par
1'ADN.
Les résultats présentés sur les tableaux III et IV montrent que les taux d'anticorps détectés à 8 semaines chez les lapins immunisés au Biojector sont significativement supérieurs à ceux obtenus par injection de l'ADN à l'aiguille.
5. Analyse qualitative de la réponse humorale. Des systèmes ELISA portant sur la phase solide des antigènes HBs de compositions variées vis-à-vis des déterminants présentés et utilisant comme second anticorps des anticorps spécifiques des IgM ou des IgG de souris ont permis d'analyser qualitativement la réponse anticorps obtenue. Dans tous les cas, l'injection unique de l'ADN chez la souris se caractérise par l'apparition précoce d'IgM spécifiques de l'AgHBs suivie immédiatement par la conversion en anticorps d' isotypes IgG caractéristiques de la réponse mémoire induite avec l'aide des cellules T auxiliaires. La réponse anticorps à l'injection de l'ADN se caractérise par sa précocité. En effet, la séroconversion est obtenue 8 à 15 jours après l'injection selon le type d'ADN utilisé et dans tous les cas le plateau est atteint en quatre semaines et maintenu de façon soutenue pendant 12 semaines.
L'utilisation d'antigène HBs de sous type hétérologue (ad) fixé sur les plaques ELISA permet de mettre en évidence la présence, dans le sérum des souris immunisées, d'anticorps spécifiques de groupe anti-a, et par différence de réactivité vis-à-vis d'AgHBs de même sous-type (ay), d'anticorps spécifiques de sous-type anti-y. La présence des anticorps spécifiques des déterminants de groupe de l'AgHBs est très importante puisque ceux-ci sont capables de conférer la protection contre des virus de sous-type hétérologues lors d'épreuves virulentes chez le chimpanzé (Szmuness et al. (1982) N. Engl. J. Med. 307, 1481-1486). L'analyse de la réponse induite par le vecteur pCMV-S2.S montre que celle-ci présente une remarquable similitude avec celle que l'on peut observer chez l'homme au cours de l'infection. Elle est caractérisée par un pic d'IgM spécifiques de la région pré-S2 extrêmement précoce (8 jours) immédiatement suivi par une conversion en IgG anti-pré-S2 ( figure 9). Cette réponse est suivie par l'apparition des anticorps anti-HBs IgM puis IgG. La production des anticorps anti-HBs est constante et atteint un maximum à 4 semaines. A 13 semaines des IgG anti-HBs et anti-pré- S2 persistent à un niveau constant.
La réponse anti-sous-type (y) précède la réponse anti-groupe (a) de la même manière que cela a été décrit lors de la vaccination avec le vaccin recombinant (Tron et al., (1989) (J. Infect. Dis.160, 199-204) .
La réponse obtenue avec les trois autres ADN vaccin montre la commutation de classe IgM ^IgG caractéristique de la réponse secondaire. La réponse étant d'abord dirigée contre le sous-type avant de l'être contre les déterminants de groupe de l'AgHBs.
La réponse à long terme, étudiée pour l'ADN pCMVHB-S, montre que le pic d'anticorps est atteint en 3 mois et que ceux-ci persistent à taux égal 6 mois plus tard (Tableau V) .
6) Vaccin génétique et non réponse Un problème majeur de la vaccination contre l'hépatite B reste le nombre élevé de non-répondeurs à la vaccination classique (2,5 à 5%) . La non réponse chez l'homme a pu être corrélée à certains types HLA (Krustall et al., (1992) J. Exp. Med. 175, 495-502) et à un défaut de la présentation de l'antigène ou de la stimulation des cellules T auxiliaires. Pour étudier l'impact possible de la vaccination génétique sur la non réponse à l'AgHBs , un panel de souches de souris dont la réponse aux différentes protéines d'enveloppe du virus HBV est régulée génétiquement et a été bien caractérisée par Millich et Coll. ( 1986 J. Immunol. 137, 315) a été utilisé. La construction pCMVHB-S précédemment décrite a été injectée dans les muscles des souris B10(H- 2b)B10.S (H-2S) et B10.M (H-2f). La souche B10 répond aux trois protéines d'enveloppe du virus, la souche B10.S ne répond pas à l'AgHBs mais la non-réponse peut être contournée par immunisation avec des antigènes HBsAg portant des déterminants pré-S2. La souche B10M est totalement non répondeuse à l'antigène HBs et à l'antigène pré-S2. Une réponse dans cette souche a pu être obtenue par immunisation avec des AgHBs portant des déterminants pré-Sl .
Les souris immunisées par l'ADN ont reçu une seule injection (100 μg) dans le muscle en régénération. Les souris témoins ont reçu la protéine en deux injections intrapéritonéales à un mois d'intervalle, la première de 2 μg AgHBs adjuvé en adjuvant complet de Freund (CFA) et la seconde de 2 μg AgHBs adjuvé en adjuvant incomplet de Freund (IFA).
Les résultats obtenus avec l'ADN pCMVHB-S sont illustrés par les figures 10A à 10F.
- Dans la souche B10 (bonne répondeuse) la réponse induite par l'ADN est plus précoce que la réponse induite par la protéine après une seule injection.
Dans la souche BIOS ( non répondeuse à l'AgHBs en l'absence de pré-S2) on observe l'apparition d'anticorps anti-HBs spécifiques de sous- type puis spécifiques de groupe après immunisation par l'ADN pCMVHB-S. Des anticorps anti-HBs spécifiques de groupe ne sont obtenus chez les souris immunisées avec la protéine HBs qu'après la 2ème injection.
Dans la souche B10M ( non répondeuse à l'AgHBs en l'absence de pré-Sl) l'immunisation par l'ADN permet d'obtenir une réponse anti-HBs spécifique de groupe et de sous-type alors que la protéine induit une réponse de sous-type seulement et nécessite deux injections.
La réponse induite par les trois types de vecteurs est comparée dans les trois souches de souris. CONCLUSION II est généralement admis que la réponse humorale à l'antigène HBs est suffisante à elle seule pour conférer la protection. La présence d'anticorps dirigés contre d'autres déterminants (pré-Sl et pré- S2) portés par les protéines d'enveloppe du virus, eux-mêmes protecteurs, pourrait améliorer la qualité de cette réponse. L'ensemble des expériences rapportées ici montre que la réponse humorale induite par la vaccination génétique anti-hépatite B est dans plusieurs domaines supérieure à celle qui peut être obtenue par la vaccination classique.
En termes de taux de séroconversion: le taux de 100% est obtenu dès 8 jours pour les souris immunisées avec les ADN pCMV-HBs et pCMVHB-S2.S et cela après une seule injection. En termes de niveau de réponse: le seuil.de 10 mUI/ML considéré suffisant chez l'homme pour conférer la protection est toujours largement dépassé.
En termes de précocité de la réponse: le vecteur pCMVHB-S2.S permet d'obtenir en 8 jours un niveau très élevé d'anticorps anti-pré-S2 et l'on sait que ceux-ci sont capables, à eux seuls, de conférer la protection (Itoh et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9174-9178) .
En termes de persistance de la réponse: les anticorps anti-HBs persistent à un niveau élevé pendant plus de 6 mois.
En, termes de qualité de la réponse: les anticorps obtenus sont de type IgG caractéristiques d'une réponse dépendante de cellules T auxiliaires et donc d'une réponse mémoire.
En termes d'activité anti-virale: les anticorps sont spécifiques du sous-type viral mais surtout spécifiques de groupe et donc susceptibles de conférer une protection croisée.
En termes de signification biologique: le profil de la réponse obtenue par immunisation avec pCMVHB-S2.S mime complètement celui que l'on peut observer, chez l'homme, lors d'une infection virale résolue.
TABLEAU I Induction d'anticorps à l'encontre de l'antigène de surface de l'hépatite B.
Taux d'anticorps à 1 'encontre de l'antigène de surface de l'hépatite B dans le sérum (mlU/ml)
Description Nombre de avant 15 jours après 35 jours souris 1 ' injection 1' injection après l'injec¬ d'ADN d'ADN tion d'ADN
ADN injecté 1 jour après le 5 0 moyenne: 56 moyenne: 59 traitement par de 5 à plus de 140 la marcaine
ADN injecté 5 jours après le traitement par 5 0 moyenne : 71 la marcaine de 21 à plus de 108 moyenne : 47
Figure imgf000025_0001
TABLEAU I I
RLU/sec/muscle de Luciférase Pourcentage par rapport
Groupe (Moyenne + SEM) RLU = Unité de. au témoin Lumière Relative
Témoin 43 082 + 5 419 100 %
4X DOGS 28 ± 7 0,06 %
DOGS -Spermidine 50 + 23 0,12 %
PEG-DOGS 0 + 0 0,00 %
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
TABLEAU IV Immunisation par injection à l'aide d'une aiguille
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
TABLEAU V Réponse à long terme d'une souris vaccinée par le pCMVHB-S
1 mois 2 mois 3 mois 6 mois
* Titre a-HBs 227 662 1299 1082 en mUI/ml
* Titre a-HBs 3,5.10~4 5.10"4 8.5.10"4 9.10"4 ELISA
Figure imgf000029_0002
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT PASTEUR
(B) RUE: 28, rue du Docteur Roux
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75724
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation a l'encontre d'une hépatite
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 5618 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: circulaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(B) SOUCHE: pRCCMV-HBS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1
GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT 40
CAGTACAATC TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGTAT 80
CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120
CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA 160
CAATTGCATG AAGAATCTGC TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG 200
CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 240 GAT ATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC 280
ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA 320
CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360
CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT 400
AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAC 440
TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 480
ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG 520
TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA 560
TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 600
TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA 640
TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT 680
CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC 720
AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC 760
CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG 800
GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA 840
CTGCTTAACT GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA 880
GGGAGACCCA AGCTTGGTAC CGGGCCCCCC CTCGAGGATT 920
GGGGACCCTG CGCTGAACAT GGAGAACATC ACATCAGGAT 960
TCCTAGGACC CCTTCTCGTG TTACAGGCGG GGTTTTTCTT 1000
GTTGACAAGA ATCCTCACAA TACCGCAGAG TCTAGACTCG 1040
TGGTGGACTT CTCTCAATTT TCTAGGGGGA ACTACCGTGT 1080
GTCTTGGCCA AAATTCGCAG TCCCCAACCT CCAATCACTC 1120
ACCAACCTCT TGTCCTCCAA CTTGTCCTGG TTATCGCTGG 1160
ATGTGTCTGC GGCGTTTTAT CATCTTCCTC TTCATCCTGC 1200
TGCTATGCCT CATCTTCTTG TTGGTTCTTC TGGACTATCA 1240
AGGTATGTTG CCCGTTTGTC CTCTAATTCC AGGATCCTCA 1280
ACAACCAGCA CGGGACCATG CCGGACCTGC ATGACTACTG 1320
CTCAAGGAAC CTCTATGTAT CCCTCCTGTT GCTGTACCAA 1360
ACCTTCGGAC GGAAATTGCA CCTGTATTCC CATCCCATCA 1400
TCCTGGGCTT TCGGAAAATT CCTATGGGAG TGGGCCTCAG 1440
CCCGTTTCTC CTGGCTCAGT TTACTAGTGC CATTTGTTCA 1480
GTGGTTCGTA GGGCTTTCCC CCACTGTTTG GCTTTCAGTT 1520
ATATGGATGA TGTGGTATTG GGGGCCAAGT CTGTACAGCA 1560
TCTTGAGTCC CTTTTTACCG CTGTTACCAA TTTTCTTTTG 1600
TCTTTGGGTA TACATTTAAA CCCTAACAAA ACAAAGAGAT 1640 GGGGTTACTC TCTAAATTTT ATGGGTTATG TCATTGGATG 1680 TTATGGGTCC TTGCCACAAG AACACATCAT ACAAAAAATC 1720 AAAGAATGTT TTAGAAAACT TCCTATTAAC AGGCCTATTG 1760 ATTGGAAAGT ATGTCAACGA ATTGTGGGTC TTTTGGGTTT 1800 TGCTGCCCCT TTTACACAAT GTGGTTATCC TGCGTTGATG 1840 CCTTTGTATG CATGTATTCA ATCTAAGCAG GCTTTCACTT 1880 TCTCGCCAAC TTACAAGGCC TTTCTGTGTA AACAATACCT 1920 GAACCTTTAC CCCGTTGCCC GGCAACGGCC AGGTCTGTGC 1960 CAAGTGTTTG CTGACGCAAC CCCCACTGGC TGGGGCTTGG 2000 TCATGGGCCA TCAGCGCATG CGTGGAACCT TTTCGGCTCC 2040 TCTGCCGATC CATACTGCGG AACTCCTAGC CGCTTGTTTT 2080 GCTCGCAGC GGTCTGGAGC AAACATTATC GGGACTGATA 2120 ACTCTGTTGT CCTATCCCGC AAATATACAT CGTTTCCATG 2160 GCTGCTAGGC TGTGCTGCCA ACTGGATCCT GCGCGGGACG 2200 TCCTTTGTTT ACGTCCCGTC GGCGCTGAAT CCTGCGGACG 2240 ACCCTTCTCG GGGTCGCTTG GGACTCTCTC GTCCCCTTCT 2280 CCGTCTGCCG TTCCGACCGA CCACGGGGCG CACCTCTCTT 2320 TACGCGGACT CCCCGTCTGT GCCTTCTCAT CTGCCGGACC 2360 GTGTGCACTT CGCTTCACCT CTGCACGTCG CATGGAGACC 2400 ACCGTGAACG CCCACCAAAT ATTGCCCAAG GTCTTACATA 2440 AGAGGACTCT TGGACTCTCA GCAATGTCAA CGACCGACCT 2480 TGAGGCATAC TTCAAAGACT GTTTGTTTAA AGACTGGGAG 2520 GAGTTGGGGG AGGAGATTAG GTTAAAGGTC TTTGTACTAG 2560 GAGGCTGTAG GCATAAATTG GTCTGCGCAC CAGCACCATG 2600 CAACTTTTTC ACCTCTGCCT AATCATCTCT TGTTCATGTC 2640 CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG GGTGGCTTTG 2680 GGGCATGGAC ATCGACCCTT ATAAAGAATT TGGAGCTACT 2720 GTGGAGTTAC TCTCGTTTTT GCCTTCTGAC TTCTTTCCTT 2760 CAGTACGAGA TCTGGCCAGG ATCCACTAGT TCTAGAGCGG 2800 CCGCCACCGC GGTGGAGCTC CAGCTTTTGT TCCCTTTAGT 2840 GAGGGTTAAT TGCGCGCATG CCCGACGGCG AGGATCTCGT 2880 CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG 2920 GAAAATGGCC GCTTTTCTGG ATTCATCGAC TGTGGCCGGC 2960 TGGGTGTGGC GGACCGCTAT CAGGACATAG CGTTGGCTAC 3000 CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATGGGCTGAC 3040 CGCTTCCTCG TGCTTTACGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC 3080 AGCGCATCGC CTTCTATCGC CTTCTTGACG AGTTCTTCTG 3120 AGCGGGACTC TGGGGTTCGA AATGACCGAC CAAGCGACGC 3160 CCAACCTGCC ATCACGAGAT TTCGATTCCA CCGCCGCCTT 3200 CTATGAAAGG TTGGGCTTCG GAATCGTTTT CCGGGACGCC 3240 GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT 3280 TCTTCGCCCA CCCCAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG 3320 TTACAAATAA AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA 3360 GCATTTTTTT CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC 3400 TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGGATCC CGTCGACCTC 3440 GAGAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT 3480 GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC 3520 CGGAAGCATA AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG 3560 AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT 3600 TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT 3640 CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC 3680 TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG 3720 TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT 3760 AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG 3800 AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA 3840 AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC 3880 CCCTGACGAG CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG 3920 TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC 3960 CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT 4000 GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA 4040 AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT AGGTATCTCA 4080 GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA 4120 CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT 4160 AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT 4200 CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC 4240 GAGGTATGTA GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG 4280 CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA TTTGGTATCT 4320 GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG 4360 TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT 4400 GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA 4440 AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC 4480 TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG 4520 GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT 4560 TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA 4600 TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT 4640 GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA 4680 TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG 4720 GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG 4760 CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA 4800 ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC 4840 AACTTTATCC GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG 4880 GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA 4920 ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC 4960 GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA 5000 TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG 5040 CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA 5080 GTTGGCCGCA GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG 5120 CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT 5160 CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA 5200 GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA 5240 CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC 5280 TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG 5320 GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT 5360 CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA 5400 GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC 5440 AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC 5480 ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG 5520 GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA 5560 GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA 5600 AAAGTGCCAC CTGACGTC 5618

Claims

REVENDICATIONS
1. Vecteur nucléotidique comprenant au moins :
- un gène ou un ADN complémentaire codant pour au moins une partie d'une protéine d'un virus, et - un promoteur permettant l'expression de ce gène dans des cellules musculaires.
2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le virus est celui d'une' hépatite .
3. Vecteur selon l'une des revendications 1 et
2, caractérisé en ce qu'il ne se réplique pas dans les cellules.
4. Vecteur selon l'une des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que le gène code pour au moins une partie d'une protéine du virus de l'hépatite B.
5. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que la protéine est la protéine S,S- prés2 ou S-préS2-PréS1.
6. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que le gène est le gène S.
7. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le virus est celui d'une hépatite A ou d'une hépatite non-A, non-B, telle qu'une hépatite C , E ou delta.
8. Vecteur selon l'une des revendications 1 à
7, caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur du cytomégalovirus.
9. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6 et 8, caractérisé en ce qu'il est le plasmide pCMV-HBS déposé sous le n° 1-1370 auprès de la CNCM le 21 Octobre 1993.
10. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6 et 8 , caractérisé en ce qu'il est le plasmide pCMVHB-Sl.S2.S déposé auprès de la CNCM sous le n°I- 14 1 1 .
11. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6 et 8 , caractérisé en ce qu'il est le plasmide pCMVHB-S2.S déposé auprès de la CNCM sous le n"1-1410.
12. Vecteur selon l'une des revendications 1 à
6 , caractérisé en ce qu'il est le plasmide pRSV-HBS déposé sous le N°1-1371 auprès de la CNCM le 21 Octobre 1993.
13. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit promoteur est celui des gènes de surface du virus HBV.
14. Vecteur selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est le plasmide pHBV-Sl.S2.S déposé auprès de la CNCM sous le n" 1-1409.
15. Vecteur selon l'une des revendications 1 à
7, caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur interne.
16. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur d'un gène d'une protéine du cytosquelette.
17. Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend le promoteur de la desmine.
18.Vecteur selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que le promoteur est homologue à l'hôte auquel doit être administré le vecteur.
19. Vecteur selon l'une des revendications 1 et 3 , caractérisé en ce qu'il comprend des gènes codant au moins en partie pour la protéine gpl60 du virus HIVl associée à la protéine p25, et/ou à la protéine p55, et/ou à la protéine pl8.
20. Vecteur selon l'une des revendications 1 et 3 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène codant pour la protéine Rev du virus HIVl.
21. Séquence nucléotidique comprenant un promoteur homologue à l'hôte et une autre séquence de régulation pour l'expression d'un gène ou d'un ADN complémentaire codant pour S, S-préS2 ou S-préSi- prés2•
22. Séquence nucléotidique comprenant un promoteur homologue à l'hôte et une autre séquence de régulation pour l'expression d'un gène ou d'un ADN complémentaire codant pour la protéine gpl60 associée à p25 et/ou à p55 et/ou à pl8.
23. Séquence nucléotidique comprenant un promoteur homologue à l'hôte et une autre séquence de régulation pour l'expression d'un gène ou d'un ADN complémentaire codant pour la protéine Rev.
24. Vaccin, caractérisé en ce qu'il contient au moins un vecteur selon l'une des revendications 1 à 20 ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 21 à 23.
25. Composition capable d'induire une réponse cytotoxique constituée par au moins une séquence nucléotidique exprimée dans les cellules musculaires et comportant un promoteur tel que défini dans l'une des revendications 15 à 18.
26. Composition pharmaceutique non lipidique destinée à l'immunisation à l'encontre d'une infection virale telle qu'une hépatite comprenant au moins d'une part une substance capable d'induire une nécrose coagulatrice des fibres musculaires et d'autre part un vecteur selon l'une des revendications 1 à 20 ou comportant la séquence nucléotidique complète ou partielle selon l'une des revendications 21 à 23.
27. Composition selon la revendication 26, caractérisée en ce que ladite substance est la bupivacaine.
28. Composition selon la revendication 27, caractérisée en ce que ledit vecteur est administré dans le muscle de l'individu à immuniser, au minimum cinq jours après administration de la bupivacaine, sensiblement au même endroit.
29. Composition selon la revendication 28, caractérisée en ce que le vecteur est administré dix jours après administration de la bupivacaine.
30. Composition selon l'une des revendications 26 à 29, caractérisée en ce que l'administration est effectuée par injection intramusculaire.
31. Composition selon la revendication 30, caractérisée en ce que l'injection intramusculaire est effectuée à l'aide d'un pistolet à jet liquide.
PCT/FR1994/000483 1993-10-22 1994-04-27 Vecteur nucleotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation a l'encontre d'une hepatite WO1995011307A1 (fr)

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