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WO1995010775A1 - Lipase-labelled probe - Google Patents

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WO1995010775A1
WO1995010775A1 PCT/EP1994/003379 EP9403379W WO9510775A1 WO 1995010775 A1 WO1995010775 A1 WO 1995010775A1 EP 9403379 W EP9403379 W EP 9403379W WO 9510775 A1 WO9510775 A1 WO 9510775A1
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WO
WIPO (PCT)
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lipase
enzyme
activity
solution
alkaline phosphatase
Prior art date
Application number
PCT/EP1994/003379
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Fritz Pittner
Thomas Schalkhammer
Bernhard Ecker
Eva Kynclova
Werner Wakolbinger
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Priority to AU78557/94A priority Critical patent/AU671392B2/en
Priority to JP7511295A priority patent/JPH07509618A/en
Priority to EP94929543A priority patent/EP0679257A1/en
Publication of WO1995010775A1 publication Critical patent/WO1995010775A1/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)

Definitions

  • the invention relates to a sample or test substance labeled with lipase or the use of lipase for the determination of biological material.
  • the invention is therefore based on the object of creating a sample or test substance labeled with enzyme, which is distinguished by significantly improved stability and a substantially broadened range of applications and in this way makes substances accessible for analytical determination which have previously been labeled with enzyme or Test substances were in no way accessible.
  • the solution to this problem consists essentially in that a plant lipase, its isoenzymes or structural analogs with an amino acid homology of at least 70% and lipase activity are used as the enzyme.
  • Candida rugosa which has proven particularly suitable as a source and is also described in the literature as Candida Cylindracea, contains a lipase, the structure of which is largely determined. The cloning and analysis of the lipase sequence is described in particular in Gene 124: 1 (February 14, 1993, pages 45-55). The enzyme is given here as a 57-kDa protein with 534 amino acids, 5 isoenzymes with an amino acid homology of 80% having already been structurally elucidated.
  • a lipase from plants especially fungi.
  • a lipase from Candida rugosa DSM 2031 is particularly preferred.
  • the use of this lipase results in a significant improvement in the product properties compared to all previously known enzymes, but also compared to other known lipases, in particular animal lipases.
  • the thermostability achieved in this way creates the prerequisite for being able to carry out such tests in a reasonable time.
  • Another advantage of the lipase proposed according to the invention is that it does not in any way require metal ions for its activity.
  • metal ions In the case of alkaline phosphatase, magnesium and zinc ions are prerequisites for the enzymatic activity, and precisely these metal ions would activate nucleases, for example, which subsequently prevent the use of alkaline phosphatase for gene probes.
  • complex substances such as EDTA are often used. EDTA not only complexes metal ions and thus no longer allows the use of alkaline phosphatase, rather large amounts of EDTA also tend to denature proteins.
  • the lipase proposed according to the invention has not only distinguished itself by significantly higher thermal stability than known enzymes, but is also notable for complete stability against EDTA. Another clear superiority of the lipases which can be used according to the invention over known enzymes is that urea or corresponding derivatives in large quantities do not in any way impair the function of the lipase. When using lipase, EDTA can be used to protect SH groups, which was not possible with previous enzyme-labeled samples or test substances.
  • the lipases which can be used according to the invention are also distinguished by a significantly improved compatibility with organic solvents.
  • the lipases proposed according to the invention can also be used in toluene, as a result of which the analytical range of use of the samples or test substances according to the invention is significantly increased.
  • the high stability permits the analytical usability of the samples and test substances according to the invention in a pH range between 2.5 and 9, the insensitivity to ureas allowing the detection of highly hydrophobic substances.
  • lipase conjugates can be dried and, if necessary, lyophilized at room temperature or even air-dried for years without loss of activity.
  • turnover rate of the same order of magnitude with a simultaneous improved sensitivity, which is due to the improved detectability of the lipase.
  • lipase can still be determined precisely in a range up to about 5 pg, up to a range of 10 ng in addition to purely qualitative analysis a largely simple estimate of the amount is possible.
  • the lipase can be determined in a customary manner, for which purpose esters of phenols or their derivatives can be used as substrates.
  • the color reaction achieved in this way allows an immediate and simple evaluation. Appropriate methods are known to the person skilled in the art.
  • the sample or test substance is characterized in that the lipase with biotin, avidin,chthin, protein A, protein G, antibody-binding proteins, antibodies, antigens, viral protein antigens, bacterial surface proteins, digoxygenin, DNA, RNA, oligonucleotides or synthetic analogues of metal colloids or plastic microparticles ( ⁇ 5 ⁇ m) is conjugated.
  • conjugates have reactive groups and, in particular, biorecognitive groups for a wide range of applications, which thus open up an extremely large area of use for such labeled samples or test substances.
  • the invention relates to the use of lipase from plants, in particular from Candida rugosa DSM 2031, their isoenzymes or structural analogs with an amino acid homology of at least 70% and lipase activity for the preparation of analytical samples or test substances, the lipase conjugating to biorecognitive groups is used and such test substances are particularly suitable for bioassays, test strips, biosensors or as gene probes.
  • Classic oligonucleotide samples can be used as gene probes, which allow selective hybridization due to the favorable thermostability of the lipase using stringent conditions.
  • Fig. 1 shows the thermostability of the lipase of the Candida species. It is evident that the activity is almost constant over time at a pH of 5 at temperatures of 50 ° C. and that it still retains over 75% of the original activity even after more than an hour at a pH of 7 . Even at temperatures of 60 ° C and a pH of 5, values in the order of 80% of the original activity are retained after one hour.
  • Fig. 2 shows the detection limits for color reactions of lipase and alkaline phosphatase. It can be seen that with alkaline phosphatase the detection limit is largely reached at around 250 pg, whereas in the original a point could be detected as a color reaction at 5 pg in the original. With lipase, the diameter of the dots remains largely correlated with the actual amount up to a range of 10 ng, whereas a simple quantitative estimate for alkaline phosphatase from around 500 pg is no longer easily possible.
  • Fig. 3 the use of lipase for an oligonucleotide gene probe is illustrated schematically in the manner of a flow chart.
  • a structural gene 2 is immobilized on a microtiter plate 1 via a biotin-avidin coupling.
  • An oligonucleotide probe 4 is connected to lipase 3, whereby in the case of an analyte 5 the lipase is fixed on the microtiter plate if this analyte contains both the gene which is fixed on the microtiter plate 1 and the oligonucleotide 4 recombined.
  • the hybridization reaction results in immobilization of lipase 3 on the Mirotiter plate 1.
  • the qualitative detection is subsequently achieved by conventional methods, for example by a color reaction of the lipase with a corresponding one Substrate as reagent.
  • Fig. 4 shows a comparison of the optimal pH values of lipase, peroxidase and alkaline phosphatase.
  • Fig. 5 shows a comparison of dye precipitation assays for lipase and alkaline phosphatase.
  • Horseradish peroxidase was detected spectrophotometrically at 23 ° C by monitoring the rate of oxidation of ABTS (1.49 mM) in the presence of hydrogen peroxide (0.045%) in 0.1 M citrate / phosphate buffer, pH 4.5, at a wavelength of 420 ⁇ m.
  • 50 ⁇ l of an enzyme solution was mixed with 500 ⁇ l of the substrate solution mentioned above and the kinetics of the enzymatic reaction at a wavelength of 420 nm were monitored over a period of one minute.
  • the concentration of the oxidized substrate was calculated using the extinction coefficient for ABTS.
  • the concentration of the enzyme solution was adjusted so that a linear course of the extinction curve was ensured under working conditions.
  • Alkaline phosphatase was detected spectrophotometrically at 23 ° C by following the hydrolysis of 0.1 mM p-nitrophenyl phosphate in 0.1 M TRIS, 0.1 M NaCl and 50 mM MgCl2, pH 8.5, at a wavelength of 405 nm [Lazdunski, C. and Lazdunski, M. (1966) BBA 113, 551-566].
  • Lipase was detected spectrophotometrically at 23 ° C by monitoring the hydrolysis of 0.1 mM p-nitrophenyl butyrate in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0, at a wavelength of 405 nm.
  • Lipase (with a protein concentration of 0.09 mg / ml; determined using the Bradford method) was incubated for 1 to 60 min with a 20 to 44% (v / v) effector solution (e.g. tetrahydrofuran, 2-methylpentanediol , 2-isopropanol ”) in 0.1 M acetate buffer, 0.1% BSA, pH 5.0 at room temperature.
  • the enzyme solution was then diluted to a measurable concentration with 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 0.1% of BSA, or 0.2% (v / v) of Tween-20 in 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 0.1% of BSA.
  • the samples were stored at 4 ° C. The activity was determined using the pNPB assay.
  • HMB hydroquinone monobutyrate
  • the activity was related to the total protein concentration of the crude enzymatic preparation.
  • the lipase activity was determined at different pH values using the hydroquinone assay.
  • the enzyme lipase has a very broad pH optimum (between pH 3 - 8) and is therefore suitable for coupled enzyme assays (e.g. with peroxidase).
  • Horseradish peroxidase was determined with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5, 0.05% in BSA.
  • Alkaline phosphatase was diluted with 50 mM TRIS buffer, pH 7.6, 1 mM in MgCl2 and 0.1 mM in ZnCl2, 0.05% in BSA.
  • Lipase was diluted with 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 0.05% in BSA.
  • the comparison of the thermal stability of the above-mentioned enzymes was carried out at a protein concentration of 0.2 mg / ml by incubation at 50 ° C. for a period of 120 min.
  • Alkaline phosphatase was incubated in 50 mM TRIS, 1 mM MgCl2 and 0.1 mM ZnCl2, pH 7.6.
  • Lipase was diluted with 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 0.5% in BSA.
  • HRP Horseradish peroxidase
  • Alkaline phosphatase was diluted with 50 mM TRIS, 1 mM MgCl2 and 0.1 mM ZnCl2, 0.05% BSA, pH 7.6.
  • HRP Peroxidase
  • Alkaline phosphatase was diluted with 50 mM TRIS (pH 7.6), 1 mM MgCl2 and 0.1 mM ZnCl2, 0.05% BSA.
  • Lipase was diluted with 0.1 M acetate buffer (pH 5.0), 0.05% BSA.
  • thiol groups in lipase was carried out in 0.1 M EDTA, 01 M phosphate buffer, pH 7.5 at a final protein concentration of 3 mg / ml using a ten-fold excess of 2-iminothiolane.
  • heterobifunctional crosslinkers which have at least two different reactive groups allow sequential conjugations and minimize undesired polymerization or self-conjugation. These crosslinkers were tested as follows:
  • the protein concentration of the lipase fraction was determined by means of the Bradford test and was 3 mg / ml. The lipase showed no appreciable loss of enzyme activity.
  • the carboxyl groups of the lipase were modified in the presence of polyethylene glycol, l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). Description of the method:
  • a stock solution of EDC / NHS was prepared by mixing an aqueous solution of EDC with a solution of NHS in dimethylformamide (DMF) in a molar ratio of 15: 1. This stick solution was used immediately.
  • DMF dimethylformamide
  • Lipase (384 ⁇ g; 6.7 nmol) was mixed with a solution of DiaminoPEG (12.2 mg, 6.4 ⁇ mol).
  • a mixture of EDC / NHS (EDC: 0.15 mg, 780 nmol; NHS: 0.006 mg, 52 nmol) was then added and the mixture was incubated for 16 hours at 4 ° C. in the dark (pH of the reaction mixture was 6 ,8th).
  • the final protein concentration was 5 mg / ml.
  • the reaction was stopped with 500 mM acetate buffer, pH 5 and the excess DiaminoPEG was separated by electrodialysis against 50 mM acetate buffer, pH 5.0.
  • the reaction products were analyzed on a native polyacrylamide gel and detected with staining with indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt (NBT).
  • NBT indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt
  • a stock solution of EDC / NHS was prepared by mixing an aqueous solution of EDC with a solution of NHS in dimethylformamide (DMF) in a molar ratio of 15: 1. This stock solution was used immediately.
  • DMF dimethylformamide
  • Lipase (384 ⁇ g; 6.7 nmol) was mixed with a solution of DiaminoPEG (12.2 mg, 6.4 ⁇ mol).
  • a mixture of EDC / NHS (EDC: 0.61 mg, 3.2 ⁇ mol; NHS: 0.024 mg, 0.21 ⁇ mol) was then added and the mixture was incubated for 16 hours at 4 ° C. in the dark (pH the reaction mixture was 6.8).
  • the final protein concentration was 5 mg / ml.
  • the reaction was stopped with 500 mM acetate buffer, pH 5, and the excess of diaminoPEG was electrodialysed against 50 mM acetate buffer, pH 5.0. severed.
  • the reaction products were analyzed on a native polyacrylamide gel and detected with staining with indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt (NBT).
  • NBT indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt
  • a stock solution of EDC / NHS was prepared by mixing an aqueous solution of EDC with a solution of NHS in dimethylformamide (DMF) in a molar ratio of 15: 1. This stock solution was used immediately.
  • DMF dimethylformamide
  • Lipase (384 ⁇ g; 6.7 nmol) was mixed with a solution of DiaminoPEG (12.2 mg, 6.4 ⁇ mol).
  • a mixture of EDC / NHS (EDC: 0.61 mg, 3.2 ⁇ mol; NHS: 0.024 mg, 0.21 ⁇ mol) was then added and the mixture was incubated for 16 hours at 4 ° C. in the dark (pH the reaction mixture was 6.8).
  • the final protein concentration was 5 mg / ml.
  • the reaction was stopped with 500 mM acetate buffer, pH 5 and the excess DiaminoPEG was separated by electrodialysis against 50 mM acetate buffer, pH 5.0.
  • the reaction products were analyzed on a native polyacrylamide gel and detected with staining with indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt (NBT).
  • NBT indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt
  • Modification of lipase (modified with polyethylene glycol) with SMCC The modification of PEG-lipase was carried out in 20 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4 at a final protein concentration of 10 mg / ml using a 20-fold molar excess of SMCC (in relation to five amino groups to be modified). After incubation for 30 min at room temperature and in the dark, the excess crosslinker was separated on a Sephadex 10 column, which had previously been equilibrated with 20 mM phosphate buffer + 2 mM EDTA (pH 6.5).
  • the desired fractions of lipase activity were concentrated using Centricon 30 tubes at a room temperature of 4 ° C. and then lyophilized.
  • the modified lipase was stored at -20 ° C and used directly for coupling with oligonucleotides.
  • the oligonucleotides were synthesized using the phosphoramidite method.
  • the terminal sulfhydryl group at the 5 'end was introduced with C6-thiol modifiers during the last synthesis step.
  • the trityl group was split off using silver nitrate and stored in DTT at ⁇ 20 ° C. [working instructions from Clontech].
  • the reaction was carried out first at room temperature for one hour and then at 4 ° C. for 16 hours to complete the reaction.
  • the unbound proteins were removed by centrifugation at 1600 g for 15 minutes.
  • the supernatant was removed with a pipette and the precipitate was dissolved in 1000 ul 10% polyethylene glycol 20000 (PEG 20000) (Polyscience).
  • PEG 20000 polyethylene glycol 20000
  • Each solution step required 50 ⁇ l 10% SDS and the use of ultrasound (Bandelin SONOREX Sper RK510II) over a few minutes. This procedure was repeated three times.
  • the precipitate was dissolved in 50 ul 1% PEG 20000 and 200 ul PBST-3% BSA.
  • the supernatants and the dissolved precipitates were examined for lipase activity and antigen activity. Only the first supernatant showed lipase activity and thus represents unbound proteins. After the remaining centrifugation steps, no enzyme activity could be found in the supernatants. However, as expected, the dissolved precipitates showed lipase activity.
  • Substrate stock solution 50 mg indolylacetate in 1 ml 100% dimethylformamide (DMF); Stock solution of nitro-blue-tetrazolium chloride (NBT); 50 mg NBT dissolved in 1 ml 70% dimethylformamide.
  • the substrate solution was prepared by mixing 66 ul NBT stock solution in 10 ml 0.1 M phosphate buffer, pH 6.5. The mixture was used immediately.
  • Substrate stock solution 50 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) dissolved in 1 ml 100% dimethylformamide (DMF); NBT stock solution: 50 mg NBT dissolved in 1 ml 70% dimethylformamide (DMF).
  • the substrate solution was prepared by mixing 33 ul substrate stock solution and 66 ul NBT stock solution in 10 ml 0.1 M substrate buffer (0.1 M TRIS, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl 2 , pH 8.5). The mixture was used immediately.
  • the lipase used in this case was not optimally purified. Therefore, a better detection limit can be achieved with pre-cleaned and pre-treated lipase.

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Abstract

In order to improve the thermal and chemical stability of an enzyme-labelled probe, a lipase that is preferably extracted from Candida rugosa and whose isoenzymes or structural analogues have at least 70 % aminoacid homology and lipase activity is used as the enzyme.

Description

L I P A S E - M A R K I E R T E P R O B EL I P A S E - M A R K I E R T E P R O B E
Die Erfindung betrifft eine mit Lipase markierte Probe oder Testsubstanz bzw. die Verwendung von Lipase für die Bestimmung von biologischem Material.The invention relates to a sample or test substance labeled with lipase or the use of lipase for the determination of biological material.
Für die Detektion von biologisch relevanten Gruppen, bestimmten Genen, Anti- genen, Antikörpern, Bakterienoberflächenproteinen oder dgl., ist es bekannt ge¬ worden, Marker bzw. Testsubstanzen zu entwickeln, welche das Auffinden der gesuchten Stoffe erleichtern sollen.For the detection of biologically relevant groups, certain genes, antigens, antibodies, bacterial surface proteins or the like, it has become known to develop markers or test substances which should make it easier to find the substances sought.
Insbesondere im Bereich der Gentechnologie ist es bekannt, Gensonden radio¬ aktiv zu markieren, wobei mit einer derartigen Gensonde nach komplementären Nukleinsäuren gesucht werden kann. Im Fall von mit Enzymen markierten Test¬ substanzen wurde bisher als Enzym Peroxidase oder alkalische Phosphatase ein¬ gesetzt. Beide Enzyme zeichnen sich durch eine relativ gute Empfindlichkeit und eine relativ leichte Nachweisbarkeit aus, was ihre Eignung als Marker bzw. als Testsubstanz durchaus unterstreicht. Diese speziellen Enzyme sind jedoch mit Nachteilen verbunden. So sind beispielsweise Randbedingungen einzuhalten, welche die Verwendung derartiger Enzyme für den Nachweis bestimmter Sub¬ stanzen unmöglich macht. Des weiteren ist die Haltbarkeit und Thermostabilität derartiger Enzyme begrenzt. Darüber hinaus erfordern derartige Enzyme das Arbeiten in einem exakt definierten Milieu, wodurch der Anwendung deutliche Grenzen gesetzt sind. Schließlich ist bei einer Reihe von Tests die Anwesenheit von Metallionen, wie sie beispielsweise bei dem Arbeiten mit alkalischer Phos¬ phatase gefordert wird, für einen Nachweis hinderlich, wobei Metallionen kom- plexierende Substanzen wie EDTA nicht nur ein Arbeiten mit Phosphatase un¬ möglich machen, sondern gleichzeitig auch im Fall von Peroxidasen die Gefahr einer Denaturierung und damit eine wesentliche Verschlechterung der Nach¬ weisgrenzen zur Folge hat. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine mit Enzym markierte Probe oder Testsubstanz zu schaffen, welche sich durch wesentlich verbesserte Stabilität und ein wesentlich verbreitertes Anwendungsspektrum auszeichnet und auf diese Weise Substanzen für eine analytische Bestimmung zugänglich macht, welche mit bisher mit Enzym markierten Proben oder Testsubstanzen in keiner Weise zugänglich waren.In the field of genetic engineering in particular, it is known to radioactively label gene probes, it being possible to search for complementary nucleic acids with such a gene probe. In the case of test substances labeled with enzymes, peroxidase or alkaline phosphatase has hitherto been used as the enzyme. Both enzymes are characterized by a relatively good sensitivity and a relatively easy detectability, which underlines their suitability as a marker or as a test substance. However, these special enzymes have disadvantages. For example, boundary conditions must be observed which make it impossible to use such enzymes for the detection of certain substances. Furthermore, the shelf life and thermal stability of such enzymes is limited. In addition, such enzymes require working in a precisely defined environment, which places clear limits on their application. Finally, the presence of metal ions, as required, for example, when working with alkaline phosphatase, is a hindrance to detection in a number of tests, metal ion complexing substances such as EDTA not only making it impossible to work with phosphatase, but at the same time, in the case of peroxidases, there is the risk of denaturation and thus a substantial deterioration of the detection limits. The invention is therefore based on the object of creating a sample or test substance labeled with enzyme, which is distinguished by significantly improved stability and a substantially broadened range of applications and in this way makes substances accessible for analytical determination which have previously been labeled with enzyme or Test substances were in no way accessible.
Die Lösung dieser Aufgabe besteht im wesentlichen darin, daß als Enzym eine pflanzliche Lipase, deren Isoenzyme oder strukturelle Analoga mit einer Aminosäurehomologie von wenigstens 70 % und Lipaseaktivität verwendet wird. Candida rugosa, welche sich als Quelle besonders geeignet erwiesen hat, und in der Literatur auch als Candida-Cylindracea beschrieben ist, enthält eine Lipase, deren Struktur weitestgehend bestimmt ist. Die Klonierung und die Analyse der Lipasesequenz ist insbesondere in Gene 124: 1 (Februar 14, 1993, Seiten 45-55) ausführlich beschrieben. Das Enzym wird hier als 57-kDa Protein mit 534 Aminosäuren angegeben, wobei 5 Isoenzyme mit einer Aminosäurenhomologie von 80 % bereits strukturell aufgeklärt wurden. In jedem Fall handelt es sich um eine Lipase aus Pflanzen, insbesondere Pilzen. Besonders bevorzugt ist eine Lipase aus Candida rugosa DSM 2031. Die Verwendung dieser Lipase hat gegen¬ über allen bisher bekannten Enzymen, aber auch gegenüber anderen bekannten Lipasen, insbesondere tierischen Lipasen, eine wesentliche Verbesserung der Produkteigenschaften zur Folge. Insbesondere wurde herausgefunden, daß bei Verwendung der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Lipase eine Thermostabilität bis wenigstens 60 °C sicher-gestellt ist, welche weder mit alkalischer Phospha¬ tase noch mit Peroxidase erreicht werden kann. Insbesondere für Hybridi- sierungstests, bei denen die Anwendung erhöhter Temperatur für eine akzeptable Reaktionsgeschwindigkeit von wesentlicher Voraussetzung ist, wird durch die auf diese weise erzielte Thermostabilität die Voraussetzung geschaffen, derartige Tests in einer vertretbaren Zeit durchführen zu können.The solution to this problem consists essentially in that a plant lipase, its isoenzymes or structural analogs with an amino acid homology of at least 70% and lipase activity are used as the enzyme. Candida rugosa, which has proven particularly suitable as a source and is also described in the literature as Candida Cylindracea, contains a lipase, the structure of which is largely determined. The cloning and analysis of the lipase sequence is described in particular in Gene 124: 1 (February 14, 1993, pages 45-55). The enzyme is given here as a 57-kDa protein with 534 amino acids, 5 isoenzymes with an amino acid homology of 80% having already been structurally elucidated. In any case, it is a lipase from plants, especially fungi. A lipase from Candida rugosa DSM 2031 is particularly preferred. The use of this lipase results in a significant improvement in the product properties compared to all previously known enzymes, but also compared to other known lipases, in particular animal lipases. In particular, it was found that when the lipase proposed according to the invention is used, a thermal stability of up to at least 60 ° C. is ensured, which cannot be achieved either with alkaline phosphate or with peroxidase. In particular for hybridization tests, in which the use of elevated temperature is an essential prerequisite for an acceptable reaction rate, the thermostability achieved in this way creates the prerequisite for being able to carry out such tests in a reasonable time.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Lipase besteht darin, daß sie für ihre Aktivität in keiner Weise Metallionen benötigt. Im Fall von alkalischer Phosphatase sind Magnesium- und Zinkionen Voraussetzung für die enzymatische Aktivität, und eben diese Metallionen würden beispielsweise Nukleasen aktivieren, welche in der Folge die Verwendung von alkalischer Phosphatase für Gensonden verhindern. Um insbesondere bei der Verwendung von mit Enzym markierten Gensonden die Aktivierung von Nukleasen sicher zu verhindern, wird vielfach mit komple- xierenden Substanzen, wie beispielsweise EDTA gearbeitet. EDTA komplexiert nicht nur Metallionen und erlaubt auf diese Weise nicht mehr die Verwendung von alkalischer Phosphatase, vielmehr haben entsprechend große Mengen von EDTA auch die Tendenz, Proteine zu denaturieren. Die erfmdungsgemäß vorgeschlagene Lipase hat sich nicht nur durch wesentlich höhere Thermo¬ stabilität als bekannte Enzyme ausgezeichnet, sondern zeichnet sich auch durch eine völlige Stabilität gegen EDTA aus. Eine weitere, deutliche Überlegenheit der erfindungsgemäß verwendbaren Lipasen gegenüber bekannten Enzymen besteht darin, daß auch Harnstoff bzw. entsprechende Derivate in großen Mengen die Funktion der Lipase in keiner Weise beeinträchtigen. Bei Verwendung von Lipase kann zum Schutz von SH-Gruppen mit EDTA gearbeitet werden, was mit bisherigen mit Enzym markierten Proben oder Testsubstanzen in keiner Weise möglich war.Another advantage of the lipase proposed according to the invention is that it does not in any way require metal ions for its activity. In the case of alkaline phosphatase, magnesium and zinc ions are prerequisites for the enzymatic activity, and precisely these metal ions would activate nucleases, for example, which subsequently prevent the use of alkaline phosphatase for gene probes. In order to reliably prevent the activation of nucleases, especially when using gene labels labeled with enzyme, complex substances such as EDTA are often used. EDTA not only complexes metal ions and thus no longer allows the use of alkaline phosphatase, rather large amounts of EDTA also tend to denature proteins. The lipase proposed according to the invention has not only distinguished itself by significantly higher thermal stability than known enzymes, but is also notable for complete stability against EDTA. Another clear superiority of the lipases which can be used according to the invention over known enzymes is that urea or corresponding derivatives in large quantities do not in any way impair the function of the lipase. When using lipase, EDTA can be used to protect SH groups, which was not possible with previous enzyme-labeled samples or test substances.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Lipasen zeichnen sich auch durch eine wesentlich verbesserte Verträglichkeit gegenüber organischen Lösungsmitteln aus. Insbesondere sind die erfmdungsgemäß vorgeschlagenen Lipasen auch in Toluol einsetzbar, wodurch sich die analytische Anwendungsbreite der erfindungsgemäßen Proben oder Testsubstanzen wesentlich erhöht.The lipases which can be used according to the invention are also distinguished by a significantly improved compatibility with organic solvents. In particular, the lipases proposed according to the invention can also be used in toluene, as a result of which the analytical range of use of the samples or test substances according to the invention is significantly increased.
Die hohe Stabilität erlaubt die analytische Verwendbarkeit der erfindungs¬ gemäßen Proben und Testsubstanzen in einem pH-Bereich zwischen 2,5 und 9, wobei die Unempfmdlichkeit gegenüber Harnstoffen den Nachweis hochhydro¬ phober Substanzen ermöglicht. Die Verwendung von großen Mengen von bei¬ spielsweise Harnstoff, welche mit anderen mit Enzym markierten Proben oder Testsubstanzen nicht zulässig wäre, ermöglicht darüber hinaus, die Sekundär¬ struktur einer DNA soweit aufzuweiten, daß die Zuverlässigkeit von Gensonden wesentlich verbessert wird.The high stability permits the analytical usability of the samples and test substances according to the invention in a pH range between 2.5 and 9, the insensitivity to ureas allowing the detection of highly hydrophobic substances. The use of large amounts of urea, for example, which would not be permissible with other samples or test substances labeled with enzyme, furthermore makes it possible to expand the secondary structure of a DNA to such an extent that the reliability of gene probes is significantly improved.
Aufgrund der wesentlich höheren Stabilität der erfindungsgemäß vorgeschla¬ genen Lipase bestehen auch kaum Grenzen bezüglich der Art der Koppelung an reaktive Substanzen und insbesondere biorekognitive Gruppen. Lipasekonjugate können aufgrund ihrer hohen Stabilität getrocknet und bei Raumtemperatur gegebenenfalls lyophilisiert oder auch nur luftgetrocknet über Jahre ohne Aktivitätseinbuße gelagert werden. Insgesamt ergibt sich gegenüber bekannten mit Enzymen markierten Proben eine Umsatzrate in gleicher Grö¬ ßenordnung bei gleichzeitig verbesserter Empfindlichkeit, die auf die verbesserte Nach-weisbarkeit der Lipase zurückzuführen ist.Because of the significantly higher stability of the lipase proposed according to the invention, there are hardly any limits with regard to the type of coupling to reactive substances and in particular biorecognitive groups. Because of their high stability, lipase conjugates can be dried and, if necessary, lyophilized at room temperature or even air-dried for years without loss of activity. In total, compared to known samples labeled with enzymes, there is a turnover rate of the same order of magnitude with a simultaneous improved sensitivity, which is due to the improved detectability of the lipase.
Während beispielsweise im Vergleichsversuch mit alkalischer Phosphatase eine Nachweisgrenze bei etwa 250 bis 100 pg vorliegt, haben Versuche ergeben, daß sich Lipase noch in einem Bereich bis etwa 5 pg exakt bestimmen läßt, wobei bis in einem Bereich von 10 ng neben einer rein qualitativen Analyse sogar eine weitestgehend einfache Ab-schätzung der Menge möglich ist.For example, while in the comparative experiment with alkaline phosphatase there is a detection limit of around 250 to 100 pg, tests have shown that lipase can still be determined precisely in a range up to about 5 pg, up to a range of 10 ng in addition to purely qualitative analysis a largely simple estimate of the amount is possible.
Die Bestimmung der Lipase kann in üblicher Weise erfolgen, wofür bei¬ spielsweise Ester von Phenolen oder deren Derivate als Substrate eingesetzt werden können. Die auf diese Weise erzielte Farbreaktion läßt eine unmittelbare und einfache Auswertung zu. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann bekannt.The lipase can be determined in a customary manner, for which purpose esters of phenols or their derivatives can be used as substrates. The color reaction achieved in this way allows an immediate and simple evaluation. Appropriate methods are known to the person skilled in the art.
Insbesondere im Zusammenhang mit Oligonucleotidsonden zeigen sich die Stabilitätsvorteile der erfindungsgemäßen Lipase besonders deutlich.The stability advantages of the lipase according to the invention are particularly evident in connection with oligonucleotide probes.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist die Probe oder Testsubstanz dadurch gekennzeichnet, daß die Lipase mit Biotin, Avidin, Leichthin, Protein A, Protein G, Antikörperbindenden Proteinen, Antikörpern, Antigenen, viralen Proteinantigenen, Bakterienoberflächenproteinen, Digoxygenin, DNS, RNS, Oligonucleotiden oder syn-thetischen Analoga Metallkolloiden oder Kunststoffmikropartikel (< 5 μm) konjugiert ist. Derartige Konjugate weisen für eine weite Anwendungsbreite bestimmte reaktive Grup-pen und im besonderen biorekognitive Gruppen auf, welche damit ein überaus großes Einsatzgebiet für derartige markierte Proben oder Testsubstanzen eröffnen. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von Lipase aus Pflanzen, insbesondere aus Candida rugosa DSM 2031, deren Isoenzyme oder strukturelle Analoga mit einer Aminosäurehomologie von wenigstens 70 % und Lipase- aktivität zur Herstellung von analytischen Proben oder Testsubstanzen, wobei die Lipase mit biorekognitiven Gruppen konjugiert eingesetzt wird und wobei derartige Testsubstanzen sich ganz besonders für Bioassays, Teststreifen, Biosensoren oder als Gensonden eignen. Als Gensonden können hierbei im besonderen klassische Oligonucleotidproben eingesetzt werden, welche aufgrund der günstigen Thermostabilität der Lipase eine selektive Hybridi-sierang unter Anwendung stringenter Bedingungen zulassen.According to a preferred development of the invention, the sample or test substance is characterized in that the lipase with biotin, avidin, Leichthin, protein A, protein G, antibody-binding proteins, antibodies, antigens, viral protein antigens, bacterial surface proteins, digoxygenin, DNA, RNA, oligonucleotides or synthetic analogues of metal colloids or plastic microparticles (<5 μm) is conjugated. Such conjugates have reactive groups and, in particular, biorecognitive groups for a wide range of applications, which thus open up an extremely large area of use for such labeled samples or test substances. Furthermore, the invention relates to the use of lipase from plants, in particular from Candida rugosa DSM 2031, their isoenzymes or structural analogs with an amino acid homology of at least 70% and lipase activity for the preparation of analytical samples or test substances, the lipase conjugating to biorecognitive groups is used and such test substances are particularly suitable for bioassays, test strips, biosensors or as gene probes. Classic oligonucleotide samples can be used as gene probes, which allow selective hybridization due to the favorable thermostability of the lipase using stringent conditions.
Die Überlegenheit der erfindungsgemäß vorgeschlagenen pflanzlichen Lipase, insbesondere aus Candida rugosa bzw. ihrer Isoenzyme sowie der eingangs genannten strukturellen Analoga wird anhand der folgenden Abbildungen und Beispiele näher erläutert.The superiority of the plant lipase proposed according to the invention, in particular from Candida rugosa or its isoenzymes and the structural analogs mentioned at the outset, is explained in more detail with reference to the following figures and examples.
Abb. 1 zeigt die Thermostabilität der Lipase der Candidaspezies. Es ist ersicht¬ lich, daß die Aktivität bei einem pH-Wert von 5 bei Temperaturen von 50 °C über die Zeit nahe zu konstant verläuft und bei einem pH- Wert von 7 auch nach über einer Stunde noch über 75 % der ursprünglichen Aktivität beibehält. Selbst bei Temperaturen von 60 °C und einem pH- Wert von 5 bleiben Werte in der Größenordnung von 80 % der ursprünglichen Aktivität nach einer Stunde erhalten.Fig. 1 shows the thermostability of the lipase of the Candida species. It is evident that the activity is almost constant over time at a pH of 5 at temperatures of 50 ° C. and that it still retains over 75% of the original activity even after more than an hour at a pH of 7 . Even at temperatures of 60 ° C and a pH of 5, values in the order of 80% of the original activity are retained after one hour.
Abb. 2 zeigt die Nachweisgrenzen bei Farbreaktionen von Lipase und alkalischer Phosphatase. Es ist ersichtlich, daß bei alkalischer Phosphatase bei etwa 250 pg die Nachweis-grenze weitestgehend erreicht ist, wohingegen im Original bei Lipase noch bei 5 pg ein Punkt als Farbreaktion detektiert werden konnte. Die Durchmesser der Punkte bleiben bei Lipase bis in einem Bereich von 10 ng weitestgehend korreliert mit der tatsächlichen Menge, wohingegen eine einfache quantitative Abschätzung bei alkalischer Phosphatase ab etwa 500 pg schon nicht mehr ohne weiters möglich ist. In Abb. 3 ist die Verwendung von Lipase für eine Oligonucleotidgensonde schematisch nach Art eines Flußdiagrammes verdeutlicht. Bei der Verfahrens¬ weise wird an eine Mikrotiterplatte 1 über eine Biotin-Avidin-Kopplung ein strukturelles Gen 2 immobilisiert. Mit Lipase 3 wird eine Oligonucleotidsonde 4 verbunden, wobei bei einem Ana-lyten 5 dann eine Festlegung der Lipase an der Mikrotiterplatte erfolgt, wenn dieser Ana-lyt sowohl mit dem Gen, welches an der Mikrotiterplatte 1 festgelegt ist, als auch mit dem Oligonucleotid 4 rekom¬ biniert. Insgesamt ergibt sich auf diese Weise bei Anwesenheit einer bestimmten zu detektierenden biologischen Substanz 5 durch die Hybridisierungsreaktion eine Immobilisierung der Lipase 3 an der Mirotiterplatte 1. Der qualitative Nach¬ weis gelingt in der Folge durch konventionelle Methoden, beispielsweise durch eine Farbreaktion der Lipase mit einem entsprechenden Substrat als Reagenz.Fig. 2 shows the detection limits for color reactions of lipase and alkaline phosphatase. It can be seen that with alkaline phosphatase the detection limit is largely reached at around 250 pg, whereas in the original a point could be detected as a color reaction at 5 pg in the original. With lipase, the diameter of the dots remains largely correlated with the actual amount up to a range of 10 ng, whereas a simple quantitative estimate for alkaline phosphatase from around 500 pg is no longer easily possible. In Fig. 3 the use of lipase for an oligonucleotide gene probe is illustrated schematically in the manner of a flow chart. In the method, a structural gene 2 is immobilized on a microtiter plate 1 via a biotin-avidin coupling. An oligonucleotide probe 4 is connected to lipase 3, whereby in the case of an analyte 5 the lipase is fixed on the microtiter plate if this analyte contains both the gene which is fixed on the microtiter plate 1 and the oligonucleotide 4 recombined. Overall, in the presence of a specific biological substance 5 to be detected, the hybridization reaction results in immobilization of lipase 3 on the Mirotiter plate 1. The qualitative detection is subsequently achieved by conventional methods, for example by a color reaction of the lipase with a corresponding one Substrate as reagent.
Abb. 4 zeigt einen Vergleich der optimalen pH-Werte von Lipase, Peroxidase und alkalischer Phosphatase.Fig. 4 shows a comparison of the optimal pH values of lipase, peroxidase and alkaline phosphatase.
Abb. 5 zeigt einen Vergleich von Farbstoff-Präzipitationsassays für Lipase und alkalische Phosphatase.Fig. 5 shows a comparison of dye precipitation assays for lipase and alkaline phosphatase.
BeispieleExamples
Allgemeine VorschriftenGeneral regulations
Meerrettich-Peroxidase-Aktivitätsassay unter Verwendung von ABTSHorseradish peroxidase activity assay using ABTS
Prinzip:Principle:
Meerrettich-Peroxidase wurde spektrophotometrisch bei 23 °C nachgewiesen, durch Verfolgen der Oxidationsrate von ABTS (1,49 mM) im Gegenwart von Wasserstoffperoxid (0,045 %) in 0,1 M Citrat-/Phosphatpuffer, pH 4,5, bei einer Wellenlänge von 420 um.Horseradish peroxidase was detected spectrophotometrically at 23 ° C by monitoring the rate of oxidation of ABTS (1.49 mM) in the presence of hydrogen peroxide (0.045%) in 0.1 M citrate / phosphate buffer, pH 4.5, at a wavelength of 420 µm.
Beschreibung der Methode:Description of the method:
Es wurde eine Substrat-Mischung aus 0,5 ml ABTS (20 mg/ 10 ml Wasser), 1 ml Wasser-stoffperoxid (0,6 % in Wasser) und 9,5 ml 0, 1 M Citrat-/Phosphatpuffer, pH 4,5, hergestellt. 50 μl einer Enzymlösung wurden mit 500 μl der oben genannten Substratlösung ver- ischt und die Kinetik der enzymatischen Reaktion bei einer Wellenlänge von 420 nm über einen Zeitraum von einer Minute verfolgt. Die Konzentration des oxidierten Substrats wurde mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten für ABTS berechnet. Die Konzen-tration der Enzymlösung wurde so eingestellt, daß ein linearer Verlauf der Extinktions-kurve unter Arbeitsbedingungen gewährleistet war.A substrate mixture of 0.5 ml ABTS (20 mg / 10 ml water), 1 ml hydrogen peroxide (0.6% in water) and 9.5 ml 0.1 M citrate / phosphate buffer, pH 4 , 5, manufactured. 50 μl of an enzyme solution was mixed with 500 μl of the substrate solution mentioned above and the kinetics of the enzymatic reaction at a wavelength of 420 nm were monitored over a period of one minute. The concentration of the oxidized substrate was calculated using the extinction coefficient for ABTS. The concentration of the enzyme solution was adjusted so that a linear course of the extinction curve was ensured under working conditions.
Bestimmung der Aktivität Alkalischer Phosphatase mit p- Nitrophenylphosphate als SubstratDetermination of the activity of alkaline phosphatase with p-nitrophenyl phosphate as substrate
Prinzip:Principle:
Alkalische Phosphatase wurde spektrophotometrisch bei 23 °C nachgewiesen durch Ver-folgen der Hydrolyse von 0, 1 mM p-Nitrophenylphosphat in 0, 1 M TRIS, 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl2, pH 8,5, bei einer Wellenlänge von 405 nm [Lazdunski, C. and Lazdunski, M. (1966) BBA 113, 551-566].Alkaline phosphatase was detected spectrophotometrically at 23 ° C by following the hydrolysis of 0.1 mM p-nitrophenyl phosphate in 0.1 M TRIS, 0.1 M NaCl and 50 mM MgCl2, pH 8.5, at a wavelength of 405 nm [Lazdunski, C. and Lazdunski, M. (1966) BBA 113, 551-566].
Beschreibung der Methode:Description of the method:
5 μl einer Enzymlösung wurden mit 500 μl 0, 1 M TRIS, 0, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, pH 8,5, gemischt. Nach Zugabe von 100 μl einer 0,6 mM p-Nitro- phenylphosphatlösung, wurde der Reaktionsverlauf bei 405 nm kinetisch über einen Zeitraum von einer Minute verfolgt. Die Konzentration der Enzymlösung wurde so eingestellt, daß ein linearer Verlauf der Extinktionskurve unter Arbeitsbedingungen gewährleistet war. Die Konzentration des hydrolysierten Substrats wurde mit Hilfe einer p-Nitrophenol-Eichkurve bei pH = 8,5 bestimmt.5 ul of an enzyme solution were mixed with 500 ul 0.1M TRIS, 0.1M NaCl, 50mM MgCl2, pH 8.5. After adding 100 μl of a 0.6 mM p-nitrophenyl phosphate solution, the course of the reaction at 405 nm was monitored kinetically over a period of one minute. The concentration of the enzyme solution was adjusted so that a linear course of the extinction curve was ensured under working conditions. The concentration of the hydrolyzed substrate was determined using a p-nitrophenol calibration curve at pH = 8.5.
Bestimmung der Lipase-Aktivität mit p-NitrophenylbutyratDetermination of lipase activity with p-nitrophenyl butyrate
Prinzip:Principle:
Lipase wurde spektrophotometrisch bei 23 °C nachgewiesen durch Verfolgen der Hydrolyse von 0,1 mM p-Nitrophenylbutyrat in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, bei einer Wellenlänge von 405 nm.Lipase was detected spectrophotometrically at 23 ° C by monitoring the hydrolysis of 0.1 mM p-nitrophenyl butyrate in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0, at a wavelength of 405 nm.
Beschreibung der Methode:Description of the method:
Eine Stammlösung von p-Nitrophenylbutyrat (pNPB) wurde durch Vermischen von 23 μl pNPB mit 5 ml 1 % Polyvinylalkohol in Wasser unter heftigem Schütteln hergestellt. Die Phase mit ungelöstem pNPB wurde durch Zentrifugation (4 °C, 1500 g, 7 min) abgetrennt. Die Konzentration der verbleibenden wäßrigen Lösung von pNPB wurde mit Hilfe einer Eichkurve von p-Nitrophenol bei pH = 7,0 bestimmt.A stock solution of p-nitrophenyl butyrate (pNPB) was prepared by mixing 23 ul pNPB with 5 ml of 1% polyvinyl alcohol in water with vigorous shaking. The undissolved pNPB phase was separated by centrifugation (4 ° C, 1500 g, 7 min). The concentration of the remaining aqueous solution of pNPB was determined using a calibration curve of p-nitrophenol at pH = 7.0.
5 μl Enzymlösung wurden mit 500 μl 0, 1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, vermischt. Nach Zugabe von 100 μl der 0,6 mM p-Nitrophenylbutyratlösung wurde die Kinetik der Reak-tion bei einer Wellenlänge von 405 nm über einen Zeitraum von 1 Minute verfolgt. Die Konzentration der Enzymlösung wurde so eingestellt, daß ein linearer Verlauf der Extinktionskurve unter Arbeitsbedingungen ge¬ währleistet war. Die Konzentration des hydrolysierten Substrats wurde mit Hilfe einer p-Nitrophenol-Eichkurve bei pH = 7,0 bestimmt.5 ul enzyme solution were mixed with 500 ul 0.1M phosphate buffer, pH 7.0. After adding 100 μl of the 0.6 mM p-nitrophenylbutyrate solution, the kinetics of the reaction were monitored at a wavelength of 405 nm over a period of 1 minute. The concentration of the enzyme solution was adjusted so that a linear course of the extinction curve under working conditions was ensured. The concentration of the hydrolyzed substrate was determined using a p-nitrophenol calibration curve at pH = 7.0.
Vorbehandlung der Lipase:Pretreatment of the lipase:
Röntgenkristallographische Studien diverser Lipasen zeigten, daß das aktive Zentrum eine Rille darstellt, die von einem helikalen Proteinteil deckelartig abgedeckt wird [Schräg, J. D. and Cygler, M., J. Mol. Biol. 230, 575-591 (1993); Derewenda, U., Brzozowski, A. M., Lawson, D. M. and Derewenda, Z. S., Biochemistry 31, 1532-1541 (1992)]. Diverse Effektoren sind in der Lage, eine extensive räumliche Umstrukturierung herbeizuführen, wobei das aktive Zentrum für das Substrat freier zugänglich wird.X-ray crystallographic studies of various lipases showed that the active center is a groove which is covered like a lid by a helical protein part [Schräg, J.D. and Cygler, M., J. Mol. Biol. 230, 575-591 (1993); Derewenda, U., Brzozowski, A.M., Lawson, D.M. and Derewenda, Z. S., Biochemistry 31, 1532-1541 (1992)]. Various effectors are able to bring about extensive spatial restructuring, with the active center being more freely accessible to the substrate.
Lipase (mit einer Proteinkonzentration von 0,09 mg/ml; bestimmt mittels Bradford-Methode) wurde 1 bis 60 min lang inkubiert mit einer 20 bis 44 % (v/v) Effektorlösung (z. B. Tetrahydrofuran, 2-Methyl-pentandiol, 2-Isopropanol...) in 0,1 M Acetatpuffer, 0,1 % an BSA, pH 5,0 bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die Enzymlösung auf eine meßfähige Konzentration verdünnt mit 0, 1 M Acetatpuffer, pH 5,0, 0, 1 % an BSA, oder 0,2 % (v/v) an Tween-20 in 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,0, 0, 1 % an BSA. Die Proben wurden bei 4 °C aufbewahrt. Die Aktivität wurde mit Hilfe des pNPB-Assays bestimmt.Lipase (with a protein concentration of 0.09 mg / ml; determined using the Bradford method) was incubated for 1 to 60 min with a 20 to 44% (v / v) effector solution (e.g. tetrahydrofuran, 2-methylpentanediol , 2-isopropanol ...) in 0.1 M acetate buffer, 0.1% BSA, pH 5.0 at room temperature. The enzyme solution was then diluted to a measurable concentration with 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 0.1% of BSA, or 0.2% (v / v) of Tween-20 in 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 0.1% of BSA. The samples were stored at 4 ° C. The activity was determined using the pNPB assay.
Bestimmung der Lipaseaktivität mit Hilfe von HydrochinonmonobutyratDetermination of lipase activity using hydroquinone monobutyrate
Prinzip:Principle:
Lipase wurde spektrophotometrisch bei 23 °C durch Verfolgen der Hydrolyse von 0,38 mM Hydrochinonmonobutyrat in 0, 1 M Puffer pH = 1,5 bis 9,0 bei einer Wellen-länge von 295 nm nachgewiesen. Beschreibung der Methode:Lipase was detected spectrophotometrically at 23 ° C. by monitoring the hydrolysis of 0.38 mM hydroquinone monobutyrate in 0.1 M buffer pH = 1.5 to 9.0 at a wavelength of 295 nm. Description of the method:
Eine Stammlösung von Hydrochinonmonobutyrat (HMB) wurde durch Ver¬ mischen von 10 mg HMB in 6 ml einer 1 % wäßrigen Polyvinylalkohollösung unter heftigem Schütteln hergestellt. Die Konzentration der HMB-Lösung wurde mit Hilfe einer Hydrochinon-Eichkurve festgestellt und betrug 3,08 mmol 1.A stock solution of hydroquinone monobutyrate (HMB) was prepared by mixing 10 mg of HMB in 6 ml of a 1% aqueous polyvinyl alcohol solution with vigorous shaking. The concentration of the HMB solution was determined using a hydroquinone calibration curve and was 3.08 mmol 1.
20 μl einer Enzymlösung wurden zu 700 μl 0, 1 M Puffer, der auf den ge¬ wünschten pH- Wert eingestellt war, zugegeben. Nach Zugabe von 100 μl einer 3,08 mM HMB-Lösung wurde die Kinetik der enzymatischen Reaktion bei einer Wellenlänge von 295 nm über einen Zeitraum von 2 min verfolgt. Die Konzentration der Enzymlösung wurde so einge-stellt, daß ein linearer Verlauf der Extinktionskurve unter Arbeitsbedingungen gewährleistet war. Die Konzentration an hydrolisiertem Substrat wurde mit Hilfe einer Hydrochinon- Eichkurve bestimmt.20 μl of an enzyme solution were added to 700 μl of 0.1 M buffer which had been adjusted to the desired pH. After adding 100 μl of a 3.08 mM HMB solution, the kinetics of the enzymatic reaction at a wavelength of 295 nm were monitored over a period of 2 min. The concentration of the enzyme solution was adjusted so that a linear course of the extinction curve was ensured under working conditions. The concentration of hydrolyzed substrate was determined using a hydroquinone calibration curve.
Beispiel 1:Example 1:
Vergleich der spezifischen Aktivitäten von Lipase und Alkalischer Phosphatase mit Hilfe von p-Nitrophenylbutyrat bzw. p-NitrophenylphosphatComparison of the specific activities of lipase and alkaline phosphatase with the help of p-nitrophenyl butyrate and p-nitrophenyl phosphate
1. gereinigte Meerrertich-Peroxidase 1050 μmol/min • mg (ABTS, pH = 4,5, 23 °C)1. Purified horseradish peroxidase 1050 μmol / min • mg (ABTS, pH = 4.5, 23 ° C)
2. gereinigte Alkalische Phosphatase 900 μmol/min • mg (p-Nitrophenylphosphat, pH = 8,5, 23 °C)2. Purified alkaline phosphatase 900 μmol / min • mg (p-nitrophenyl phosphate, pH = 8.5, 23 ° C)
3. Rohpräparation einer Lipase aus Candida rugosa 2700 μmol/min • mg (p-Nitrophenylbutyrat, pH = 7,0, 23 °C)3. Crude preparation of a lipase from Candida rugosa 2700 μmol / min • mg (p-nitrophenyl butyrate, pH = 7.0, 23 ° C)
Die Aktivität wurde auf die Totalproteinkonzentration der enzymatischen Roh-präparation bezogen.The activity was related to the total protein concentration of the crude enzymatic preparation.
Bei gereinigten Lipase-Isoenzymen ist eine signifikante Erhöhung der spezifischen Aktivität zu erwarten. Beispiel 2:With purified lipase isoenzymes, a significant increase in specific activity can be expected. Example 2:
Bestimmung und Vergleich der pH-Optima von Lipase, Meerrettich- Peroxidase und Alkalischer PhosphataseDetermination and comparison of the pH optima of lipase, horseradish peroxidase and alkaline phosphatase
Die Lipaseaktivität wurde bei unterschiedlichen pH- Werten mit Hilfe des Hydrochinon-Assays bestimmt. Das Enzym Lipase besitzt ein sehr breites pH- Optimum (zwischen pH 3 - 8) und ist daher für gekoppelte Enzymassays (z. B. mit Peroxidase) geeignet. Alkalische Phosphatase ist bei pH- Werten über 7 aktiv, Meerrettich-Peroxidase besitzt ein pH-Optimum um pH = 5, wenn ABTS als Substrat verwendet wird (Abb. 4).The lipase activity was determined at different pH values using the hydroquinone assay. The enzyme lipase has a very broad pH optimum (between pH 3 - 8) and is therefore suitable for coupled enzyme assays (e.g. with peroxidase). Alkaline phosphatase is active at pH values above 7, horseradish peroxidase has a pH optimum around pH = 5 if ABTS is used as a substrate (Fig. 4).
Beispiel 3:Example 3:
Stabilität von Lipase, Meerrettich-Peroxidase und Alkalischer Phosphatase gegenüber EDTAStability of lipase, horseradish peroxidase and alkaline phosphatase against EDTA
Alle oben erwähnten Enzyme wurden in Gegenwart von 50 mM EDTA bei 4 °C inkubiert. Alle gemessenen Enzymkonzentrationen wurden auf einen Proteingehalt von 20 nmol eingestellt.All of the above-mentioned enzymes were incubated in the presence of 50 mM EDTA at 4 ° C. All measured enzyme concentrations were adjusted to a protein content of 20 nmol.
• Meerrettich-Peroxidase wurde mit 0, 1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,05 % an BSA, bestimmt.• Horseradish peroxidase was determined with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5, 0.05% in BSA.
• Alkalische Phosphatase wurde mit 50 mM TRIS-Puffer, pH 7,6, 1 mM an MgCl2 und 0, 1 mM an ZnCl2, 0,05 % an BSA, verdünnt.• Alkaline phosphatase was diluted with 50 mM TRIS buffer, pH 7.6, 1 mM in MgCl2 and 0.1 mM in ZnCl2, 0.05% in BSA.
• Lipase wurde mit 0, 1 M Acetatpuffer, pH 5,0, 0,05 % an BSA, verdünnt.• Lipase was diluted with 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 0.05% in BSA.
Tabelle 1 t = 0 min t = 30 min t = 16 Std.Table 1 t = 0 min t = 30 min t = 16 hours
Lipase 100 % 100 % 100 %Lipase 100% 100% 100%
Alkalische Phosphatase 100 % < 14 % < 4 %Alkaline phosphatase 100% <14% <4%
Peroxidase 100 % 100 % 100 % Beispiel 4:Peroxidase 100% 100% 100% Example 4:
Thermostabilität von Lipase, Meerrettich-Peroxidase und Alkalischer Phosphatase bei 50 °CThermostability of lipase, horseradish peroxidase and alkaline phosphatase at 50 ° C
Der Vergleich der Thermostabilität der oben angeführten Enzyme wurde bei einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/ml durch Inkubation bei 50 °C während einer Zeitspanne von 120 min durchgeführt.The comparison of the thermal stability of the above-mentioned enzymes was carried out at a protein concentration of 0.2 mg / ml by incubation at 50 ° C. for a period of 120 min.
• Meerrettich-Peroxidase wurde in 0, 1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, inkubiert.• Horseradish peroxidase was incubated in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5.
• Alkalische Phosphatase wurde in 50 mM TRIS, 1 mM MgCl2 und 0, 1 mM ZnCl2, pH 7,6, inkubiert.• Alkaline phosphatase was incubated in 50 mM TRIS, 1 mM MgCl2 and 0.1 mM ZnCl2, pH 7.6.
• Lipase wurde mit 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,0, 0,5 % an BSA, verdünnt.• Lipase was diluted with 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 0.5% in BSA.
Tabelle 2 t - 0 min t = 30 min t = 90 min t = 120 minTable 2 t - 0 min t = 30 min t = 90 min t = 120 min
Lipase 100 % 100 % 100 % 89 %Lipase 100% 100% 100% 89%
Alkalische Phosphatase 100 % 100 % 96 % 87 %Alkaline phosphatase 100% 100% 96% 87%
Peroxidase 100 % 90 % 82 % 75 %Peroxidase 100% 90% 82% 75%
Beispiel 5:Example 5:
Stabilität von Lipase, Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Alkalischer Phosphatase in Gegenwart von Azid-TonenStability of lipase, horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase in the presence of azide clays
Alle oben genannten Enzyme wurden in Gegenwart von 0,05 % Natriumazid bei 25 °C und 4 °C inkubiert. Um diese Enzyme miteinander zu vergleichen, wurden äquivalente molare Proteinkonzentrationen von 20 nmol/ml verwendet.All of the above enzymes were incubated in the presence of 0.05% sodium azide at 25 ° C and 4 ° C. To compare these enzymes with each other, equivalent molar protein concentrations of 20 nmol / ml were used.
• Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurde verdünnt mit 0, 1 M Phosphatpuffer, 0,5 % BSA, pH 7,5.• Horseradish peroxidase (HRP) was diluted with 0.1M phosphate buffer, 0.5% BSA, pH 7.5.
• Alkalische Phosphatase wurde verdünnt mit 50 mM TRIS, 1 mM MgCl2 und 0,1 mM ZnCl2, 0,05 % BSA, pH 7,6.• Alkaline phosphatase was diluted with 50 mM TRIS, 1 mM MgCl2 and 0.1 mM ZnCl2, 0.05% BSA, pH 7.6.
• Lipase wurde verdünnt mit 0,1 M Acetatpuffer, 0,05 % BSA, pH 5,0. Azide können zur Konservierung aller oben genannten Enzyme verwendet werden. In Be-zug auf Alkalische Phosphatase wurde eine geringfügige Abnahme der Enzymaktivität (10 - 20 % pro Tag) beobachtet. Außerdem führt Azid zur Verringerung der Peroxidaseaktivität, indem es Peroxidase (HRP) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid inaktiviert (während des Assays).• Lipase was diluted with 0.1 M acetate buffer, 0.05% BSA, pH 5.0. Azides can be used to preserve all of the above enzymes. With respect to alkaline phosphatase, a slight decrease in enzyme activity (10-20% per day) was observed. Azide also reduces peroxidase activity by inactivating peroxidase (HRP) in the presence of hydrogen peroxide (during the assay).
Beispiel 6:Example 6:
Stabilität von Lipase, Meerrettich-Peroxidase und Alkalischer Phosphatase in Gegenwart von 7 M HarnstofflösungenStability of lipase, horseradish peroxidase and alkaline phosphatase in the presence of 7 M urea solutions
Alle oben angeführten Enzyme wurden in Lösungen mit 7 M Harnstoff bei 25 °C und 4 °C inkubiert. Um diese Enzyme zu vergleichen, wurden Proteinkonzentrationen von 0 nmol/ml verwendet.All of the above enzymes were incubated in solutions with 7 M urea at 25 ° C and 4 ° C. To compare these enzymes, protein concentrations of 0 nmol / ml were used.
• Peroxidase (HRP) wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), 0,05 % BSA, verdünnt.Peroxidase (HRP) was diluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5), 0.05% BSA.
• Alkalische Phosphatase wurde mit 50 mM TRIS (pH 7,6), 1 mM MgCl2 und 0, 1 mM ZnCl2, 0,05 % BSA, verdünnt.• Alkaline phosphatase was diluted with 50 mM TRIS (pH 7.6), 1 mM MgCl2 and 0.1 mM ZnCl2, 0.05% BSA.
• Lipase wurde mit 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,0), 0,05 % BSA, verdünnt.• Lipase was diluted with 0.1 M acetate buffer (pH 5.0), 0.05% BSA.
Bei 4 °C führt 7 M Harnstofflösung nur zur geringfügigen Denaturierung aller oben ge-nannten Enzyme (10 % Aktivitätsabnahme pro Tag). Bei 25 °C nimmt die Aktivität dieser Enzyme um 50 % ab.At 4 ° C, 7 M urea solution only leads to a slight denaturation of all of the above-mentioned enzymes (10% decrease in activity per day). At 25 ° C the activity of these enzymes decreases by 50%.
Beispiel 7:Example 7:
Einfuhrung von Sulfhvdryl-Gruppen (-SH) in Lipase (zur Kopplung an Reporter-Moleküle die Maleimid-oder Todacetat-Gruppen enthalten)Introduction of sulfhvdryl groups (-SH) in lipase (for coupling to reporter molecules containing maleimide or death acetate groups)
Die Einführung von Thiol-Gruppen in Lipase wurde durchgeführt in 0, 1 M EDTA, 01, M Phosphatpuffer, pH 7,5 bei einer Protein-Endkonzentration von 3 mg/ml unter Verwendung eines zehnfachen Überschusses an 2-Iminothiolan.The introduction of thiol groups in lipase was carried out in 0.1 M EDTA, 01 M phosphate buffer, pH 7.5 at a final protein concentration of 3 mg / ml using a ten-fold excess of 2-iminothiolane.
Nach 20 min Inkubation bei Raumtemperatur, wurde überschüssiges 2- Iminothiolan durch Ultrafiltration mit Centricon-30-Röhrchen vom modifizierten Enzym abgetrennt. Das Ausmaß der Modifizierung wurde unter Verwendung von Ellman's Reagenz [5,5'-Dithio-Bis-(2-Nitro-benzoesäure)] bestimmt. Das mit SH- Gruppen modifizierte Protein wurde in 0, 1 M EDTA, 0, 1 M Acetatpuffer, pH 5 bei 4 °C gelagert.After 20 min incubation at room temperature, excess 2-iminothiolane was modified by ultrafiltration with Centricon 30 tubes Enzyme separated. The extent of the modification was determined using Ellman's reagent [5,5'-dithio-bis (2-nitro-benzoic acid)]. The protein modified with SH groups was stored in 0.1 M EDTA, 0.1 M acetate buffer, pH 5 at 4.degree.
Beispiel 8:Example 8:
Einführung von Maleimid-Resten in Lipase mittels heterobifunktioneller Crosslinker (zur Kopplung an Reporter-Moleküle, die Thiol-Gruppen enthalten)Introduction of maleimide residues in lipase using heterobifunctional crosslinkers (for coupling to reporter molecules that contain thiol groups)
(Sulfo)succinimidyl-4-(N-maleimidomethylcyclohcxan); (PIERCE 22322X) m-Malemidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid-ester; (PIERCE 22312X) (Sulfo)succinimidyl-4-(ρ-maleimidophenyl)butyrat; (PIERCE 22317X) (Sulfo)succinimidyl-(4-iodacctyl)aminobenzoat; (PIERCE 22327X)(Sulfo) succinimidyl-4- (N-maleimidomethylcyclohcxan); (PIERCE 22322X) m-malemidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester; (PIERCE 22312X) (sulfo) succinimidyl 4- (ρ-maleimidophenyl) butyrate; (PIERCE 22317X) (sulfo) succinimidyl (4-iodo-octyl) aminobenzoate; (PIERCE 22327X)
Oben angeführte und kommerziell verfügbare heterobifunktionelle Crosslinker, die mindestens zwei verschiedene reaktive Gruppen besitzen, erlauben se¬ quentielle Konjuga-tionen und minimieren eine unerwünschte Polymerisation oder Selbst-Konjugation. Diese Crosslinker wurden wie folgt getestet:The above-mentioned and commercially available heterobifunctional crosslinkers which have at least two different reactive groups allow sequential conjugations and minimize undesired polymerization or self-conjugation. These crosslinkers were tested as follows:
Die Modifizierung von Lipase mit den angeführten Crosslinkem wurde durchge¬ führt in 50 mM Borat-Puffer, 0, 1 M EDTA, pH = 7, mit einem 50 molaren Überschuß an heterobifunktionellem Crosslinker. Die Proteinkonzentration der Lipase-Fraktion wurde mit-tels Bradford-Test bestimmt und betrug 3 mg/ml. Die Lipase zeigte keinen nennenswerten Verlust an Enzymaktivität.The modification of lipase with the crosslinkers mentioned was carried out in 50 mM borate buffer, 0.1M EDTA, pH = 7, with a 50 molar excess of heterobifunctional crosslinker. The protein concentration of the lipase fraction was determined by means of the Bradford test and was 3 mg / ml. The lipase showed no appreciable loss of enzyme activity.
Beispiel 9:Example 9:
Kopplung von Lipase und PolyethylenglycolCoupling of lipase and polyethylene glycol
Prinzip:Principle:
Die Carboxyl-Gruppen der Lipase wurden in Gegenwart von Polyethylenglycol, l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und N- Hydroxysuccinimide (NHS) modifiziert. Beschreibung der Methode:The carboxyl groups of the lipase were modified in the presence of polyethylene glycol, l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). Description of the method:
Modifizierte Lipase mit isoelektrischen Punkten pl = 5,5 bis pl = 7,0Modified lipase with isoelectric points pl = 5.5 to pl = 7.0
Eine Stock-Lösung von 0,0'-Bis-(2-aminopropyl)polyethylenglykol 1900 (M.W. 2000) (DiaminoPEG) wurde in einer Konzentration von 0,59 g/ml in Wasser zubereitet und mit verdünnter Salzsäure auf pH = 4,6 eingestellt.A stock solution of 0.0'-bis (2-aminopropyl) polyethylene glycol 1900 (MW 2000) (DiaminoPEG) was prepared in a concentration of 0.59 g / ml in water and adjusted to pH = 4.6 with dilute hydrochloric acid set.
Eine Stock-Lösung von EDC/NHS wurde hergestellt, indem eine wäßrige Lösung von EDC mit einer Lösung von NHS in Dimethylformamid (DMF) im molaren Verhältnis 15: 1 gemischt wurde. Diese Stock-Lösung wurde sofort verwendet.A stock solution of EDC / NHS was prepared by mixing an aqueous solution of EDC with a solution of NHS in dimethylformamide (DMF) in a molar ratio of 15: 1. This stick solution was used immediately.
Lipase (384 μg; 6,7 nmol) wurde mit einer Lösung von DiaminoPEG (12,2 mg, 6,4 μmol) gemischt. Danach wurde eine Mischung von EDC/NHS (EDC: 0,15 mg, 780 nmol; NHS: 0,006 mg, 52 nmol) zugegeben und die Mischung 16 Stunden lang bei 4 °C in der Dun-kelheit inkubiert (pH der Reaktionsmischung war 6,8). Die Protein-Endkonzentration be-trug 5 mg/ml. Die Reaktion wurde mit 500 mM Acetatpuffer, pH 5 gestoppt, und der Überschuß an DiaminoPEG wurde mittels Elektrodialyse gegen 50 mM Acetatpuffer, pH 5,0, abgetrennt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem nativen Polyacrylamid-Gel analysiert und unter Färbung mit Indolylacetat/Nitro-blue-Tetrazolium-Salz (NBT) detektiert.Lipase (384 µg; 6.7 nmol) was mixed with a solution of DiaminoPEG (12.2 mg, 6.4 µmol). A mixture of EDC / NHS (EDC: 0.15 mg, 780 nmol; NHS: 0.006 mg, 52 nmol) was then added and the mixture was incubated for 16 hours at 4 ° C. in the dark (pH of the reaction mixture was 6 ,8th). The final protein concentration was 5 mg / ml. The reaction was stopped with 500 mM acetate buffer, pH 5 and the excess DiaminoPEG was separated by electrodialysis against 50 mM acetate buffer, pH 5.0. The reaction products were analyzed on a native polyacrylamide gel and detected with staining with indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt (NBT).
Modifizierte Lipase mit isoelektrischen Punkten von pl = 7 bis pl = 9Modified lipase with isoelectric points from pl = 7 to pl = 9
Eine Stock-Lösung von 0,0'-Bis-(2-aminopropyl)polyethylenglykol 1900 (M.W. 2000) (DiaminoPEG) wurde in einer Konzentration von 0,59 g/ml in Wasser zubereitet und mit verdünnter Salzsäure auf pH = 4,6 eingestellt.A stock solution of 0.0'-bis (2-aminopropyl) polyethylene glycol 1900 (MW 2000) (DiaminoPEG) was prepared in a concentration of 0.59 g / ml in water and adjusted to pH = 4.6 with dilute hydrochloric acid set.
Eine Stock-Lösung von EDC/NHS wurde hergestellt, indem eine wäßrige Lösung von EDC mit einer Lösung von NHS in Dimethylformamid (DMF) im molaren Verhältnis 15:1 gemischt wurde, Diese Stock-Lösung wurde sofort verwendet.A stock solution of EDC / NHS was prepared by mixing an aqueous solution of EDC with a solution of NHS in dimethylformamide (DMF) in a molar ratio of 15: 1. This stock solution was used immediately.
Lipase (384 μg; 6,7 nmol) wurde mit einer Lösung von DiaminoPEG (12,2 mg, 6,4 μmol) gemischt. Danach wurde eine Mischung von EDC/NHS (EDC: 0,61 mg, 3,2 μmol; NHS: 0,024 mg, 0,21 μmol) zugegeben und die Mischung 16 Stunden lang bei 4 °C in der Dun-kelheit inkubiert (pH der Reaktions¬ mischimg war 6,8). Die Protein-Endkonzentration be-trug 5 mg/ml. Die Reaktion wurde mit 500 mM Acetatpuffer, pH 5 gestoppt, und der Überschuß an Dia¬ minoPEG wurde mittels Elektrodialyse gegen 50 mM Acetatpuffer, pH 5,0, abgetrennt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem nativen Polyacrylamid-Gel analysiert und unter Färbung mit Indolylacetat/Nitro-blue-Tetrazolium-Salz (NBT) detektiert.Lipase (384 µg; 6.7 nmol) was mixed with a solution of DiaminoPEG (12.2 mg, 6.4 µmol). A mixture of EDC / NHS (EDC: 0.61 mg, 3.2 μmol; NHS: 0.024 mg, 0.21 μmol) was then added and the mixture was incubated for 16 hours at 4 ° C. in the dark (pH the reaction mixture was 6.8). The final protein concentration was 5 mg / ml. The reaction was stopped with 500 mM acetate buffer, pH 5, and the excess of diaminoPEG was electrodialysed against 50 mM acetate buffer, pH 5.0. severed. The reaction products were analyzed on a native polyacrylamide gel and detected with staining with indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt (NBT).
Modifizierte Lipase mit isoelektrischen Punkten von pl = 7 bis pl = 9Modified lipase with isoelectric points from pl = 7 to pl = 9
Eine Stock-Lösung von 0,0'-Bis-(2-aminopropyl)polyethylenglykol 1900 (M.W. 2000) (DiaminoPEG) wurde in einer Konzentration von 0,59 g/ml in Wasser zubereitet und mit verdünnter Salzsäure auf pH = 4,6 eingestellt.A stock solution of 0.0'-bis (2-aminopropyl) polyethylene glycol 1900 (MW 2000) (DiaminoPEG) was prepared in a concentration of 0.59 g / ml in water and adjusted to pH = 4.6 with dilute hydrochloric acid set.
Eine Stock-Lösung von EDC/NHS wurde hergestellt, indem eine wäßrige Lösung von EDC mit einer Lösung von NHS in Dimethylformamid (DMF) im molaren Verhältnis 15: 1 gemischt wurde, Diese Stock-Lösung wurde sofort verwendet.A stock solution of EDC / NHS was prepared by mixing an aqueous solution of EDC with a solution of NHS in dimethylformamide (DMF) in a molar ratio of 15: 1. This stock solution was used immediately.
Lipase (384 μg; 6,7 nmol) wurde mit einer Lösung von DiaminoPEG (12,2 mg, 6,4 μmol) gemischt. Danach wurde eine Mischung von EDC/NHS (EDC: 0,61 mg, 3,2 μmol; NHS: 0,024 mg, 0,21 μmol) zugegeben und die Mischung 16 Stunden lang bei 4 °C in der Dun-kelheit inkubiert (pH der Reaktions¬ mischung war 6,8). Die Protein-Endkonzentration betrug 5 mg/ml. Die Reaktion wurde mit 500 mM Acetatpuffer, pH 5 gestoppt, und der Überschuß an DiaminoPEG wurde mittels Elektrodialyse gegen 50 mM Acetatpuffer, pH 5,0, abgetrennt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem nativen Polyacrylamid-Gel analysiert und unter Färbung mit Indolylacetat/Nitro-blue-Tetrazolium-Salz (NBT) detektiert.Lipase (384 µg; 6.7 nmol) was mixed with a solution of DiaminoPEG (12.2 mg, 6.4 µmol). A mixture of EDC / NHS (EDC: 0.61 mg, 3.2 μmol; NHS: 0.024 mg, 0.21 μmol) was then added and the mixture was incubated for 16 hours at 4 ° C. in the dark (pH the reaction mixture was 6.8). The final protein concentration was 5 mg / ml. The reaction was stopped with 500 mM acetate buffer, pH 5 and the excess DiaminoPEG was separated by electrodialysis against 50 mM acetate buffer, pH 5.0. The reaction products were analyzed on a native polyacrylamide gel and detected with staining with indolylacetate / nitro-blue-tetrazolium salt (NBT).
Beispiel 10:Example 10:
Kopplung von Lipase an DesoxyoligonucleotideCoupling lipase to deoxyoligonucleotides
Modifikation von Lipase (modifiziert mit Polyethylenglykol) mit SMCC: Die Modifikation von PEG-Lipase wurde durchgeführt in 20 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 bei einer Protein- Endkonzentration von 10 mg/ml unter Verwendung eines 20fachen molaren Überschusses an SMCC (in Bezug auf fünf zu modifizierende Aminogruppen). Nach Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur und in der Dunkelheit wurde der überschüssige Crosslinker auf einer Sephadex-10-Säule, die zuvor mit 20 mM Phosphatpuffer + 2 mM EDTA (pH 6,5) äquilibriert wurde, abgetrennt. Die gewünschten Fraktionen an Lipaseaktivität wurden mit Hilfe von Centricon- 30-Röhrchen bei einer Raumtemperatur von 4 °C konzentriert und anschließend lyophilisiert. Die modifizierte Lipase wurde bei - 20 °C aufbewahrt und direkt für die Kopplung mit Oligonucleotiden verwendet.Modification of lipase (modified with polyethylene glycol) with SMCC: The modification of PEG-lipase was carried out in 20 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4 at a final protein concentration of 10 mg / ml using a 20-fold molar excess of SMCC (in relation to five amino groups to be modified). After incubation for 30 min at room temperature and in the dark, the excess crosslinker was separated on a Sephadex 10 column, which had previously been equilibrated with 20 mM phosphate buffer + 2 mM EDTA (pH 6.5). The desired fractions of lipase activity were concentrated using Centricon 30 tubes at a room temperature of 4 ° C. and then lyophilized. The modified lipase was stored at -20 ° C and used directly for coupling with oligonucleotides.
Darstellung von SH-Oligonucleotiden:Preparation of SH oligonucleotides:
Die Oligonucleotiden wurden mit der Phosphoramidit-Methode synthetisiert. Die ter-minale Sulfhydryl-Gruppe am 5'-Ende wurde während des letzten Synthese¬ schrittes mit C6-Thiol-Modifiern eingeführt. Nach Reinigung an einer Reverse Phase HPLC (01, M Triethylammoniumacetat, pH 7 und Methanol als mobile Phase), wurde die Trityl-Gruppe unter Verwendung von Silber-Nitrat abgespalten und in DTT bei - 20 °C aufbewahrt [Arbeitsvorschrift von Clontech].The oligonucleotides were synthesized using the phosphoramidite method. The terminal sulfhydryl group at the 5 'end was introduced with C6-thiol modifiers during the last synthesis step. After purification on a reverse phase HPLC (01, M triethylammonium acetate, pH 7 and methanol as the mobile phase), the trityl group was split off using silver nitrate and stored in DTT at −20 ° C. [working instructions from Clontech].
Kopplung von SMCC-Lipase und DesoxyoUgonucleotiden:Coupling of SMCC Lipase and DeoxyoUgonucleotides:
5 μg von Trityl-freiem Oligonucleotid in einem Volumen von 50 μl wurde über eine Sephadex G-25-Säule entsalzt und direkt mit dem lyophilisierten Enzym vermengt.5 μg of trityl-free oligonucleotide in a volume of 50 μl was desalted over a Sephadex G-25 column and mixed directly with the lyophilized enzyme.
Nachdem sich das Enzym gelöst hatte, wurde die Reaktion zuerst eine Stunde bei Raum-temperatur und anschließend zur Vervollständigung der Reaktion 16 Stunden lang bei 4 °C ausgeführt.After the enzyme had dissolved, the reaction was carried out first at room temperature for one hour and then at 4 ° C. for 16 hours to complete the reaction.
Beispiel 11:Example 11:
Immobilisierung von Lipase und Antigen an MetallkolloidenImmobilization of lipase and antigen on metal colloids
Die Synthese von kolloidalem Gold wurde nach Frens, G. et al. [Nature Lond. Phys.Sci. 241, 20 (1973)] durchgeführt. Lipase (10 μl, Proteinkonzentration von 1 mg/ml) in 0,1 M Phosphatpuffer und 6 μl virales Antigen (0,8 mg/ml) wurden mit einem Milliliter kol-loidaler Goldlösung gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.The synthesis of colloidal gold was carried out according to Frens, G. et al. [Nature Lond. Phys.Sci. 241, 20 (1973)]. Lipase (10 μl, protein concentration of 1 mg / ml) in 0.1 M phosphate buffer and 6 μl viral antigen (0.8 mg / ml) were mixed with one milliliter of coloidal gold solution and incubated for 30 min at room temperature.
Die ungebundenen Proteine wurden durch 15minütige Zentrifugation bei 1600 g entfernt. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt, und der Niederschlag wurde in 1000 μl 10 % Polyethylenglykol 20000 (PEG 20000) (Polyscience) gelöst. Jeder Lösungsschritt benötigte 50 μl 10 % SDS und den Einsatz von Ultraschall (Bandelin SONOREX Sper RK510II) über einige Minuten. Diese Prozedur wurde dreimal wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wurde der Niederschlag in 50 μl 1 % PEG 20000 und 200 μl PBST-3 % BSA aufgelöst. Die Überstände und die gelösten Nieder¬ schläge wurden auf Lipaseaktivität und Antigenaktivität hin untersucht. Nur der erste Überstand zeigte Lipaseaktivität und repräsentiert hiermit ungebundene Proteine. Nach den übrigen Zentrifugationsschritten konnte keine Enzymaktivität in den Überständen gefunden werden. Die gelösten Niederschläge zeigten hinge¬ gen, wie erwartet, Lipaseaktivität.The unbound proteins were removed by centrifugation at 1600 g for 15 minutes. The supernatant was removed with a pipette and the precipitate was dissolved in 1000 ul 10% polyethylene glycol 20000 (PEG 20000) (Polyscience). Each solution step required 50 μl 10% SDS and the use of ultrasound (Bandelin SONOREX Sper RK510II) over a few minutes. This procedure was repeated three times. After the last centrifugation, the precipitate was dissolved in 50 ul 1% PEG 20000 and 200 ul PBST-3% BSA. The supernatants and the dissolved precipitates were examined for lipase activity and antigen activity. Only the first supernatant showed lipase activity and thus represents unbound proteins. After the remaining centrifugation steps, no enzyme activity could be found in the supernatants. However, as expected, the dissolved precipitates showed lipase activity.
Beispiel 12:Example 12:
Vergleich von Farbstoff-Präzipitationsassav für Lipase und Alkalische PhosphataseComparison of dye precipitation assay for lipase and alkaline phosphatase
Präzipitationsassay mit Lipase:Precipitation assay with lipase:
Substrat-Stocklösung: 50 mg Indolylacetat in 1 ml 100 % Dimethylformamid (DMF); Stocklösung von Nitro-blue-Tetrazoliumchlorid (NBT); 50 mg NBT gelöst in 1 ml 70 % Dimethylformamid. Die Substratlösung wurde hergestellt durch Mixen von 66 μl NBT-Stocklösung in 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,5. Die Mischung wurde sofort verwendet.Substrate stock solution: 50 mg indolylacetate in 1 ml 100% dimethylformamide (DMF); Stock solution of nitro-blue-tetrazolium chloride (NBT); 50 mg NBT dissolved in 1 ml 70% dimethylformamide. The substrate solution was prepared by mixing 66 ul NBT stock solution in 10 ml 0.1 M phosphate buffer, pH 6.5. The mixture was used immediately.
Präzipitationsassay mit Alkalischer Phosphatase:Precipitation assay with alkaline phosphatase:
Substrat-Stocklösung: 50 mg 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) gelöst in 1 ml 100 % Dimethylformamid (DMF); NBT-Stocklösung: 50 mg NBT gelöst in 1 ml 70 % Dimethylformamid (DMF). Die Substratlösung wurde hergestellt durch Mixen von 33 μl Substrat-Stocklösung und 66 μl NBT-Stocklösung in 10 ml 0,1 M Substratpuffer (0,1 M TRIS, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2, pH 8,5). Die Mischung wurde sofort verwendet.Substrate stock solution: 50 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) dissolved in 1 ml 100% dimethylformamide (DMF); NBT stock solution: 50 mg NBT dissolved in 1 ml 70% dimethylformamide (DMF). The substrate solution was prepared by mixing 33 ul substrate stock solution and 66 ul NBT stock solution in 10 ml 0.1 M substrate buffer (0.1 M TRIS, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl 2 , pH 8.5). The mixture was used immediately.
Jedenfalls kommt es bei hohen Konzentrationen durch die geringe Löslichkeit des Lipase-Reaktionsproduktes zu einer besseren Auflösung (Abb. 5).In any case, at high concentrations, the low solubility of the lipase reaction product leads to better resolution (Fig. 5).
Die Lipase, die in diesem Fall verwendet wurde, war nicht optimal aufgereinigt. Daher kann mit vorgereinigter und vorbehandelter Lipase ein besseres Detek- tionslimit erzielt werden. The lipase used in this case was not optimally purified. Therefore, a better detection limit can be achieved with pre-cleaned and pre-treated lipase.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e - Patent claims -
1. Enzym-markierte Probe oder Testsubstanz, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine pflanzliche Lipase, ein entsprechendes Isoenzym oder ein strukturelles Derivat mit einer Aminosäurehomologie von wenigstens 70 % und Lipaseaktivität ist.1. Enzyme-labeled sample or test substance, characterized in that the enzyme is a plant lipase, a corresponding isoenzyme or a structural derivative with an amino acid homology of at least 70% and lipase activity.
2. Enzym-markierte Probe bzw. Testsubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipaseaktivität aufweisende Enzym aus Candida rugosa DSM 2031 erhältlich ist.2. Enzyme-labeled sample or test substance according to claim 1, characterized in that the enzyme having lipase activity is obtainable from Candida rugosa DSM 2031.
3. Enzym-markierte Probe oder Testsubstanz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipase mit Biotin, Avidin, Lecithin, Protein A, Protein G, Antikörper-bindenden Proteinen, Antikörpern, Antigenen, viralen Proteinantigenen, Bakterienoberflächenproteinen, Digoxygenin, DNS, RNS, Oligonucleotiden oder synthetischen Analoga Metallkolloiden oder Kunst¬ stoffmikropartikel (< 5 μm) konjugiert ist.3. Enzyme-labeled sample or test substance according to claim 1 or 2, characterized in that the lipase with biotin, avidin, lecithin, protein A, protein G, antibody-binding proteins, antibodies, antigens, viral protein antigens, bacterial surface proteins, digoxygenin, DNA , RNA, oligonucleotides or synthetic analogues metal colloids or plastic microparticles (<5 μm) is conjugated.
4. Verwendung von pflanzlicher Lipase, deren Isoenzyme oder strukturelle Analoga mit einer Aminosäurehomologie von wenigstens 70 % und Lipaseaktivität zur Her-stellung von analytischen Proben oder Test¬ substanzen, wobei die Lipase mit bio-rekognitiven Gruppen konjugiert eingesetzt wird.4. Use of plant lipase, its isoenzymes or structural analogs with an amino acid homology of at least 70% and lipase activity for the production of analytical samples or test substances, the lipase being used conjugated with bio-recognitive groups.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipase aus Candida rugosa DSM 2031 erhältlich ist.5. Use according to claim 4, characterized in that the lipase from Candida rugosa DSM 2031 is available.
6. Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, zur Herstellung von Testsubstanzen für Bio-assays, Teststreifen, Biosensoren oder Gensonden. 6. Use according to claim 4 or 5, for the production of test substances for bio-assays, test strips, biosensors or gene probes.
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