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WO1995000660A1 - Procede d'evaluation de la vitalite des microorganismes - Google Patents

Procede d'evaluation de la vitalite des microorganismes Download PDF

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WO1995000660A1
WO1995000660A1 PCT/FR1994/000770 FR9400770W WO9500660A1 WO 1995000660 A1 WO1995000660 A1 WO 1995000660A1 FR 9400770 W FR9400770 W FR 9400770W WO 9500660 A1 WO9500660 A1 WO 9500660A1
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WO
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microorganisms
efflux
marker
buffer
fluorescein
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Application number
PCT/FR1994/000770
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English (en)
Inventor
Pieter Breeuwer
Jean-Louis Drocourt
Original Assignee
Chemunex
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Chemunex filed Critical Chemunex
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring and evaluating the vitality of living microorganisms (bacteria, yeasts, recombinant microorganisms) and to its applications, in particular in assessing the quality of the inoculum ( evaluation of beer fermentation, lactic ferments) and monitoring of fermentation.
  • living microorganisms bacteria, yeasts, recombinant microorganisms
  • cell viability ability of microorganisms to reproduce, appreciation of membrane integrity
  • cell vitality for example , acidifying power
  • viability is defined as the ability of microorganisms not to stain with methylene blue; that is, only the dead cells are stained blue (TREVORS et al., cited document); however during this test has the drawback of overestimating viability;
  • the fluorescence intensity of the individual cells can, for example, be measured by cytometry flow (HM SHAPIRO, document cited) or by microscopy (TREVORS et al., document cited).
  • the criterion of membrane integrity for assessing viability has limits; in particular, the distinction between marked cells (which are considered to be viable) and cells which are not marked (considered to be non-viable) is not absolute. Indeed, cells that have lost the ability to reproduce (i.e. cells considered to be non-viable), can nevertheless be stained if they have an intact membrane.
  • the Applicant has consequently to the aim of providing a method for assessing in more s * ure viability live microorganisms, which does not have the disadvantages of proce- dice the prior art (aspen positive, false negative, difficult interpretation, long response time, etc.) and which allows to follow in particular the evolution of a fermentation process, in a reliable manner.
  • the subject of the present invention is a method for evaluating and measuring the viability of microorganisms, comprising:
  • the time necessary for the disappearance of half of the intra ⁇ cellular fluorescence of microorganisms, in the presence of an energy source is a function of the vitality of the microorganisms, defined as the capacity of the microorganisms to metabolize quickly after transfer from a nutrient-poor environment to a nutrient-rich environment.
  • the marker is chosen from FDA, 6-CFDA, 5-CFDA, 5-maleimide FDA, fluorescein dilaurate, fluorescein dibutyrate, 5 ( 6) 2 ', 7' dichloro-CFDA, 5 (6) sulfo-FDA, 5 (6) 2 ', 7' dichloro-FDA, 5,6-CFDA ester N-hydroxy succinimide, dipropionate of fluorescein, di-beta-D-galactoside fluorescein, 3-O-methylfluorescein phosphate, pentaacetoxy ester of 2 ', 7' -bis (carboxyethyl) -5 (6) - carboxyfluorescein (BCECF / AM), 2 ', 7' pentaacetoxy ester -bis (carboxyethyl) -5 (6) -fluorescein (BCECF / AM), azidofluorescein diacetate, cororomethylflu
  • Such a marker is, as specified above, a non-fluorescent or weakly fluorescent substance, which penetrates into the microorganism and is hydrolyzed therein, so as to provide a fluorescent product which is trapped inside said microorganism .
  • said marker is carboxyfluorescein diacetate (cFDA).
  • the fluorescent product remains correctly trapped in the microorganisms stored at 0 °, but from 10 °, an efflux of marked marked product is observed, in the presence of said energy source, if microorganisms are vital.
  • said energy source is a sugar.
  • said sugar is chosen from glucose, fructose, mannose and lactose.
  • said sugar is 10 M glucose.
  • labeling buffer and / or efflux buffer of an acetate-NaCl buffer at pH 7, a PBS buffer at pH 7, a citrate-phosphate buffer at pH 4 or 7.3 or a buffer phosphate at pH 7.
  • the efflux buffer can either be of identical composition to the marking buffer (same pH), or of different composition (different pH).
  • the elimination of the non-incorporated marker is preferably carried out by rapid washing of the labeled microorganisms.
  • the process in accordance with the invention comprises, after the removal of the non-incorporated marker (step (ii)),
  • step (iii) the implementation of step (b) on two sets of samples of microorganisms:
  • - assembly A in which the intensity of intracellular fluorescence of the microorganisms is measured at regular time intervals for 5 to 60 min, in an efflux buffer at a pH between 4 and 8 and at a temperature between 10 ° C and 40 ° C, preferably between 20 "C and 40 ° C;
  • - assembly B in which the intensity of intracellular fluorescence of the microorganisms is measured at regular time intervals for 5 to 60 min, in an efflux buffer at a pH between 4 and 8, to which an energy source has been added, and at a temperature between 10 ° C and 40 ° C, preferably between 20 'C and 40 "C; and (iv) evaluation of the vitality of the microorganisms as a function of the ratio of the intensities of intracellular fluorescence: set B / set A.
  • the differential assessment of the efflux of fluorescent product between the microorganisms of set B and the microorganisms of set A makes it possible to assess the vitality of living microorganisms reliably.
  • the efflux buffer associated with an energy source added to the microorganisms (set B) significantly stimulates the efflux of fluorescent product (at pH 7.3 or at pH 4, for example and at a tempe ⁇ rature between 20 ° C and 40 ° C), only if said microorganisms have a certain vitality.
  • the results obtained by flow cytometry are in the form of histograms.
  • the loss of fluorescence (efflux from 10 or 20 "C) is characterized by a shift down the fluorescence channels, in the histograms.
  • the process according to the invention has the advantage of assessing the viability of microorganisms reliably, by bringing in other parameters than membrane integrity.
  • the present invention also relates to a kit or kit for implementing the method according to the invention, characterized in that it comprises: at least one marker for viable microorganisms (fluorescein esters),
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention.
  • 2 ml of a yeast suspension (approximately 5.10 'cells / ml) are centrifuged for 90 seconds at 13,490 g; the supernatant is removed by aspiration, then the pellet is resuspended in 2 ml of labeling buffer comprising, for example, Mcllvaine buffer at pH 4 (the Mcllvaine buffer is composed of 30.7 ml of citric acid (100 itiM ) and 19.3 ml of dihydrogen hydrogen phosphate dihydrate (200 mM)); the suspension is again centrifuged for 90 seconds at 13,490 g, then the supernatant from this second centrifugation is removed by suction; a second washing of the yeasts is carried out by resuspending the pellet in 2 ml of labeling buffer as defined above; the yeast sample thus washed is placed in ice until marking.
  • labeling buffer comprising, for example, Mcllvaine buffer at pH 4 (the Mcllvaine buffer is composed of 30.7 ml
  • the washed yeast suspension should not contain less than 2.10 6 cells / ml.
  • the washing step can be replaced by a dilution step.
  • the suspension is then incubated for 15 min at 40 ° C. and placed in ice, to avoid any efflux. It should be noted that the fluorescence intensity of the yeasts after loading with cF depends on the concentration of marker fluorochrome.
  • the concentration of marker must be adjusted so that the average fluorescence intensity of the yeast population is preferably to the right of channel 100 on the histogram.
  • 2 ml of suspension of labeled yeasts are centrifuged for 90 seconds at 13,490 g, then the supernatant is removed by suction; the pellet is resuspended in 2 ml of efflux buffer, maintained at 0 ° C. and constituted by an Mcllvaine buffer at pH 7.3; centrifugation is again carried out for 90 seconds at 13,490 g, the supernatant is removed by suction and the pellet obtained is resuspended in 2 ml of efflux buffer at 0 ° C. as defined above.
  • the volume of the sample analyzed and / or the dilution in the efflux buffer will be adapted according to the initial concentration of cells.
  • the efflux temperature can vary between 0 ° (no efflux) and 40 'C
  • the cF is trapped in cells stored at 0 ° C., but at 30 °, an efflux rapid cF occurs, dependent on pH.
  • Figure 1 shows the measurement of the efflux at pH 7.3, at 0 ° C (M), 30 ° C ( ⁇ ) and 30 "C in the presence of 10 mM glucose (A).
  • the efflux at pH 4 was measured at 30 ° C (O) and at 30 ° C in the presence of 10 mM glucose (•).
  • the initial intracellular cF concentration is approximately 0.5 mM.
  • the efflux, in the absence and in the presence of 1 mM extracellular cF is comparable, in the presence of an energy source; the efflux therefore takes place against the concentration gradient.
  • FIG. 2 illustrates the effect of DNP (1 mM) and benzoic acid (10 mM) on the efflux of cF.
  • the cells are preincubated for 20 min at 40 ° C. with an Mcllvaine buffer pH 4, in the absence (•) or in the presence of 2.4 DNP 1 mM (A) or benzoic acid 10 mM (M). After washing, the cells are loaded into cF by incubation at 40 ° C with 43 ⁇ M cFDA in Mcllvaine buffer pH 4, washed and resuspended in Mcllvaine buffer pH 7.3. The efflux test is carried out at 30 ° C. This figure 2 shows that DNP is more effective in inhibiting the efflux of cF than benzoic acid.
  • FIG. 3 shows that TPP + , at a concentration of 10 M, completely inhibits the efflux of cF.
  • the addition of TPP + does not cause a significant decrease in the intracellular ATP concentration. This suggests that the efflux of cF is related to the proton pump.
  • FIG. 3 which shows, on the abscissa, the time in minutes and, on the ordinate, the percentage of trapped carboxyfluorescein, illustrates the effect of TPP + on the efflux of cF (A) and on the intracellular concentration of ATP (B) in energized S. cerevisiae cells, as follows: the cells are loaded into cF by incubation at 40 ° C with 43 ⁇ M cFDA in Mcllvaine buffer pH 4, washed and put back in addition - board in Mcllvaine buffer pH 7.3. The test is carried out at 30 ° C, the efflux is measured in the absence (•) or in the presence of TPP + 10 mM (A).
  • H + ions The production of H + ions is measured continuously, with a pH electrode (determination directly from the slope (in nmol H + / min / mg of protein).
  • glucose (10 mM) energized yeasts
  • the initial release of H + is increased to approximately 540 nmol H + / min / mg of proteins.
  • DES 150 ⁇ M is the most effective: the production of H + in the presence of glucose (10 mM) is 122 nmol H + / min / mg of proteins.
  • Figure 4 which includes, on the abscissa, the time in minutes, and on the ordinate, the percentage of trapped cF, illustrates the effect on the efflux of cF (A) and on the intracellular concentration of ATP (B) of different compounds on cells of S. cerevisiae energized by different compounds.
  • the cells are loaded into cF by incubation at 40 "C with 43 ⁇ M cFDA in Mcllvaine buffer pH 4, washed and resuspended in Mcllvaine buffer pH 7.3.
  • the test is carried out at 30 ° C.
  • the curve (O) corresponds to the addition of no product
  • the curve ( ⁇ ) corresponds to the addition of DES (150 ⁇ M)
  • the curve (•) corresponds to the addition of DCCD (100 ⁇ M).
  • FIG. 5 comprises on the abscissa, the intracellular concen ⁇ tration in cF (mM) and on the ordinate, the efflux speed of cF ( ⁇ mol / min), after loading of S.
  • the results are analyzed in the form of an Eadie-Hofstee plot and the K m of the 0.25 mM cF transport is calculated.
  • the results indicate that the cF is released using a membrane transport system, from loaded S. cerevisiae cells as described above (incubation at 40 ° C. with different concentrations of cFDA in Mcllaine pH 4 buffer. ), washing and resuspension in Mcllvaine buffer pH 7.3).
  • the efflux is measured at 30 ° in the presence of glucose (10 mM).
  • the flow cytometer used is a Chemflow® flow cytometer.
  • the fluidic system comprises a closed laminar flow with a maximum flow rate of 0.4 ml / min.
  • a sample of 200 ⁇ l is analyzed.
  • the maximum concentration of fluorescent particles which can be measured by this flow cytometer is limited to approximately 1.10-Vml.
  • the instrument includes a light source constituted by an arc of mercury HPO 100.
  • the excitation wavelength is selected by the use of 2 band filters and is between 450 and 490 nm.
  • the emission wavelength is 515 nm and is selected using a dichroic filter of 500 nm (eliminating signals less than 500 nm) and an interference filter (FI 515) at 515 nm.
  • the data are presented in the form of a histogram in which the Y axis corresponds to the number of fluorescent particles and the X axis is divided into channels (0 to 255) corresponding to the fluorescence intensity of the particles. .
  • Logarithmic amplification (logl mode) of the incoming signal is applied to directly measure a larger number of signals on a histogram; the data can be, if necessary, recalculated on a linear scale.
  • Figure 8 illustrates the determination
  • the average intracellular cF concentration of a culture of S. cerevisiae loaded with cFDA is about 0.1 to 0.4 mM, which is approximately equivalent to 1.10 'fluorescent molecules / cell.
  • the minimum intra-cellular fluorescein concentration that could be measured is approximately between 0.05 and 0.1 mM.
  • FIG. 8 illustrates a shift to the left of the histograms due to the loss of fluorescence at 40 ° of a culture of yeasts loaded with cF.
  • the addition of glucose leads to a significant additional shift to the left, of the fluorescence intensity of the cells.
  • washed cells preincubated with benzoic acid show no decrease in CFUs, but the reduction in the displacement of the histogram is significantly significant compared to the control.
  • the posterior addition of glucose induces a shift to the left (decrease in the intensity of intracellular fluorescence); this indicates that the cells are stressed, but still have some vitality.
  • DNP the cells are severely stressed, insofar as there is a decrease in the concentration of intracellular ATP and a decrease in CFUs, but the slight displacement of the histogram towards the left after addition of glucose indicates that at least a significant part of the population has lost much of its vitality.
  • the loss of fluorescence at 40 ° C after 0, 20, 40 and 60 minutes is measured with a flow cytometer for non-energized cells (histograms A to D) and for cells energized with glucose (10 mM) (histograms E to F).
  • the cells were pretreated as follows: no treatment (histograms A and E), preincubation with DNP (1 mM) (histograms B and F), heat treatment at 60 ° C for 90 seconds (histograms C and G) and preincubation with benzoic acid (10 mM) (histograms D and H).
  • FIG. 9 shows that there is an excellent correlation between the viable cells (method of counting on nutritive medium: counting after 5 days of incubation, on Sabouraud agar medium) and the fraction of yeast cells that have lost most of their cF after 30 min at 40 ° C, so that they can no longer be detected by the flow cytometer.
  • Mcllvaine pH 7.3 The efflux test is carried out at 40 ° C. The fluorescent cells are counted at time 0 and after 30 min.
  • 2 ml of suspension of labeled bacteria are centrifuged for 4 to 5 min at 13,490 g, then the supernatant is removed by suction; the pellet is returned to sus ⁇ pension in 2 ml of efflux buffer, maintained at 0 ° C, and consisting of 50 mM phosphate buffer pH 7; optionally, again centrifugation is carried out for 4 to 5 min at 13,490 g, the supernatant is removed by suction and the pellet obtained is resuspended in 2 ml of efflux buffer at 0 "C. .
  • the efflux is measured, under the conditions of Example 1, in the presence of 10 mM glucose or 10 mM lactose, the efflux buffer being, as above, a 50 mM phosphate buffer pH 7.

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Abstract

Procédé de mesure et d'évaluation de la vitalité de microorganismes vivants et ses applications. Ce procédé comprend: (a) le chargement des microorganismes en produit fluorescent, et (b) la mesure de l'intensité de fluorescence intracellulaire par cytométrie de flux, et est caractérisé en ce qu'il comprend: (i) l'incubation desdits microorganismes pendant 5 à 20 minutes avec ledit marqueur à une concentration comprise entre 1 νM et 300 νM, en présence d'un tampon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, por l'obtention de microorganismes chargés en produit fluorescent (étape de chargement (a)); (ii) l'élimination du marqueur non incorporé dans les microorganismes; (iii) l'addition d'une source énergétique, préalablement à l'étape (b) et; (iv) la mesure du temps nécessaire à la disparition de la moitié de la fluorescence intracellulaire des microorganismes, par cytométrie de flux, dans une fenêtre d'intensité prédéterminée, à un pH compris entre 4 et 8 (tampon d'efflux) et à une température comprise entre 10 °C et 40 °C, de préférence entre 20 °C et 40 °C.

Description

PROCEDE D'EVALUATION DE LA VITALITE DES MICROORGANISMES
La présente invention est relative à un pro¬ cédé de mesure et d'évaluation de la vitalité de micro- organismes vivants (bactéries, levures, microorganismes recombinants) et à ses applications, notamment dans l'appréciation de la qualité de 1 ' inoculum (évaluation de la fermentation des bières, ferments lactiques) et le suivi de la fermentation. De manière générale, pour apprécier l'état biologique (vivant vs mort) des microorganismes, il existe de nombreuses méthodes qui évaluent la viabilité cellulaire (capacité des microorganismes à se reproduire, appréciation de l'intégrité membranaire) ou la vitalité cellulaire (par exemple, pouvoir d'acidification) .
Parmi ces différentes méthodes d'évaluation de la viabilité ou de la vitalité des microorganismes (J.T. TREVORS et al., Biotechnology Letters, 1983, 5., n° 2, 131-134) ; M.J. CHILVER et al., Amer. Soc. Bre ing Chemists, 1978, 26., 13-18 ; J.C. SLAUGHTER et al., Enzyme Microb. Technol. , 1992, 14., 64-67 ; B.V. KARA et al., J. Inst. Bre ., 1988, 94., 153-159 ; H.M. SHAPIRO, 1988, Practical Flow Cytometry, Allan R. LISS, Inc. New-York ; Demande de Brevet EP 333 560), on peut citer notamment : A. Méthodes d'évaluation de la viabilité :
- la méthode de comptage sur milieu nutritif, qui définit la viabilité comme la capacité des microorga¬ nismes vivants à former des colonies visibles (TREVORS et al. ; SHAPIRO et al., documents cités) ; cette méthode, bien que fiable, a l'inconvénient de nécessiter un temps de réponse long (24 à 72 heures), qui n'est pas adapté aux applications précitées
- le test d'exclusion au bleu de méthylène dans lequel la viabilité est définie comme la capacité des microorganismes à ne pas se colorer au bleu de méthy¬ lène ; c'est-à-dire que seules les cellules mortes sont colorées en bleu (TREVORS et al., document cité) ; cepen- dant ce test a l'inconvénient de surestimer la viabi¬ lité ;
- évaluation intracellulaire en glycogene et en tréhalose ; ce test est basé sur l'hypothèse que la concentration intracellulaire de glycogene (ou de tréha¬ lose) est correlée à la viabilité des microorganismes (SLAUGHTER et al., document cité) ; il faut cependant noter qu'il n'existe pas de corrélation unique entre le contenu en glycogene ou tréhalose intracellulaire et la viabilité et que ce test est donc d'interprétation diffi¬ cile ; le test aux esters de fluorescéine (FDA notamment) , basé sur l'utilisation de précurseurs non- fluorescents (fluorochromes tels que esters de fluores- céine) , qui lorsqu'ils pénètrent dans les cellules de mammifères ou les microorganismes, sont hydrolyses par des estérases non-spécifiques et produisent un produit fluorescent qui reste piégé dans sa majeure partie ou totalement à 1 ' intérieur desdites cellules ou desdits microorganismes (B. ROTMAN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1966, J55., 134-141 ; SHAPIRO et al., document cité) , lorsque ces derniers présentent une membrane intacte (capacité d'accumuler le produit fluorescent) .
De nombreux Auteurs ont mis ce dernier test en application pour déterminer la viabilité de microorga¬ nismes, levures ou autres cellules eucaryotes (lymphocytes) et bactéries dans différents environnements (eaux, sols...) (J. BRUNING et al., J. Immunol. Meth. , 1980, 23, 33-44 ; M.J. CHILVER, document cité ; T.H. CHRZANO SKI et al., Microb. Ecol. , 1984, 10., 179- 185 ; J.P. TIAPER et al., Appl . Microbiol. Biotechnol. , 1992, 28., 268-272 ; B.E. SOTERSTRÔM, Biol. Biochem. , 1977, 9_, 59-63 ; T. TALBOT et al., J. Immunol. Meth., 1987, 99., 137-140) . L'intensité de fluorescence des cellules indi¬ viduelles, peut, par exemple, être mesurée par cytométrie de flux (H.M. SHAPIRO, document cité) ou par microscopie (TREVORS et al., document cité) .
Toutefois, comme SHAPIRO l'a clairement mon¬ tré, le critère de l'intégrité membranaire pour 1 ' évalua- tion de la viabilité présente des limites ; en particu¬ lier, la distinction entre les cellules marquées (qui sont considérées comme viables) et les cellules qui ne sont pas marquées (considérées comme non-viables) , n'est pas absolue. En effet, des cellules qui ont perdu la capacité à se reproduire (c'est-à-dire des cellules considérées comme non-viables) , peuvent néanmoins être colorées si elles présentent une membrane intacte.
B. Méthode d'évaluation de la vitalité cellu¬ laire : - le test du pouvoir d'acidification : ce test est basé sur l'hypothèse que les levures viables sont capables d'acidifier le milieu alors que les levures mortes ne le sont pas (KARA et al., document cité) ; cette méthode a l'inconvénient d'être une mesure globale, qui ne permet pas d'apprécier l'état cellulaire de la population étudiée.
L'ensemble des méthodes de détermination de la viabilité ou de la vitalité des microorganismes de l'Art antérieur présentent donc l'inconvénient majeur de ne pas être fiables ou de présenter un trop long délai de ré¬ ponse (méthode de comptage sur milieu nutritif) et ne permettent donc pas, pour la plupart, de distinguer effectivement les cellules viables des cellules non- viables (faux-positifs, faux-négatifs, difficulté d'interprétation, long délai de réponse, etc...) .
La Demanderesse s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une méthode, permettant d'évaluer de manière plus s*ûre la viabilité des microorganismes vivants, qui ne présente pas les inconvénients des procé- dés de l'Art antérieur (faux-positifs, faux-négatifs, interprétation difficile, long délai de réponse, etc..) et qui permet de suivre notamment l'évolution d'un processus de fermentation, de manière fiable.
La présente invention a pour objet un procédé d'évaluation et de mesure de la viabilité des microorga- nismes, comprenant :
(a) le chargement des microorganismes en pro¬ duit fluorescent, par incubation desdits microorganismes à une température comprise entre 20°C et 50 °C avec un marqueur (fluorochrome) , et (b) la mesure de l'intensité de fluorescence intracellulaire par cytométrie de flux, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) l'incubation desdits microorganismes pen¬ dant 5 à 20 minutes avec ledit marqueur à une concentra¬ tion comprise entre 1 μM et 300 μM, en présence d'un tam¬ pon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, pour l'ob¬ tention de microorganismes chargés en produit fluorescent (étape de chargement (a) ) ,
(ii) l'élimination du marqueur non incorporé dans les microorganismes,
(iii) l'addition d'une source énergétique, préalablement à l'étape (b) et
(iv) la mesure du temps nécessaire à la dispa¬ rition de la moitié de la fluorescence intracellulaire des microorganismes, par cytométrie de flux, dans une fenêtre d'intensité prédéterminée, à un pH compris entre 4 et 8 (tampon d'efflux) et à une température comprise entre 10°C et 40°C, de préférence entre 20°C et 40°C.
De manière inattendue, le temps nécessaire à la disparition de la moitié de la fluorescence intra¬ cellulaire des microorganismes, en présence d'une source énergétique, est fonction de la vitalité des microorga¬ nismes, définie comme la capacité des microorganismes à metaboliser rapidement après transfert d'un milieu pauvre en nutriments à un milieu riche en nutriments. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du- dit procédé, le marqueur est choisi parmi le FDA, le 6- CFDA, le 5-CFDA, le 5-maléimide FDA, le dilaurate de fluorescéine, le dibutyrate de fluorescéine, le 5 (6) 2 ',7' dichloro-CFDA, le 5 (6) sulfo-FDA, le 5 (6) 2 ',7' dichloro-FDA, l'ester de 5,6-CFDA N-hydroxy succinimide, le dipropionate de fluorescéine, la di-bêta-D-galactoside fluorescéine, le phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, le pentaacétoxy ester de 2 ', 7 ' -bis (carboxyéthyl) -5 (6) - carboxyfluorescéine (BCECF/AM) , le pentaacétoxy ester de 2' ,7 '-bis (carboxyéthyl) -5 (6) -fluorescéine (BCECF/AM), le diacétate d' azidofluorescéine, le diacétate de c loro- méthylfluorescéine, le diacétate d'éosine, le diacétate de carboxyéosine, l'acétate de 4-méthylumbelliferyl, le 4-méthylumbelliferyl bêta-D-galactoside, le 4-méthyl¬ umbelliferyl alpha-D-mannopyranoside, le nonanoate de 4- méthyllumbelliferyl, le phosphate de 4-méthylumbelli¬ feryl, 1 ' alanine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycine-7- amino-4-méthylcoumarine, la proline-7-amino-4- méthylcoumarine, la valine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycyl-L-proline-7-amino-4-méthylcoumarine, le 1,4-diacé- toxy-2, 3-dicyanobenzène (ABD) , 1 'hydroéthidine, 1 ' acétate de résorufine.
Un tel marqueur (fluorochrome) est, comme pré- cisé ci-dessus, une substance non fluorescente ou peu fluorescente, qui pénètre dans le microorganisme et y est hydrolysée, de manière à fournir un produit fluorescent qui est piégé à l'intérieur dudit microorganisme.
De manière préférée, ledit marqueur est du diacétate de carboxyfluorescéine (cFDA) .
Lors de l'étape de chargement (a) , le produit fluorescent reste piégé correctement dans les microorga¬ nismes stockés à 0°, mais à partir de 10°, on observe un efflux de produit marqué rapide, en présence de ladite source énergétique, si les microorganismes sont vitaux. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux dudit procédé, ladite source énergétique est un sucre.
Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, ledit sucre est choisi parmi le glucose, le fructose, le mannose et le lactose.
Selon une modalité préférée de cette disposi¬ tion, ledit sucre est du glucose 10 M.
On peut citer à titre indicatif, comme tampon de marquage et/ou tampon d'efflux, un tampon acétate-NaCl à pH 7, un tampon PBS à pH 7, un tampon citrate-phosphate à pH 4 ou 7,3 ou un tampon phosphate à pH 7.
Le tampon d'efflux peut être soit de composi¬ tion identique au tampon de marquage (même pH) , soit de composition différente (pH différent) .
L'élimination du marqueur non incorporé est réalisée de préférence par lavage rapide des microorga¬ nismes marqués .
En variante, le procédé conforme à l'invention comprend, après l'élimination du marqueur non incorporé (étape (ii) ) ,
(iii) la mise en oeuvre de l'étape (b) sur deux ensembles d'échantillons de microorganismes :
- l'ensemble A, dans lequel l'intensité de fluorescence intracellulaire des microorganismes est mesurée à des intervalles de temps réguliers pendant 5 à 60 min, dans un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8 et à une température comprise entre 10 °C et 40°C, de préférence entre 20"C et 40°C ; - l'ensemble B, dans lequel l'intensité de fluorescence intracellulaire des microorganismes est mesurée à des intervalles de temps réguliers pendant 5 à 60 min, dans un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8, auquel une source énergétique a été ajoutée, et à une température comprise entre 10 °C et 40 °C, de préfé¬ rence entre 20 'C et 40 "C ; et (iv) l'évaluation de la vitalité des microorganismes en fonction du rapport des intensités de fluorescence intracellulaire : ensemble B/ensemble A.
La mesure de l'intensité de fluorescence à des intervalles de temps réguliers permet d'apprécier le flux de sortie (efflux) du produit fluorescent ; plus la vitesse d'efflux est importante, plus les microorganismes sont métaboliquement actifs .
L'appréciation différentielle de 1 ' efflux de produit fluorescent entre les microorganismes de l'en¬ semble B et les microorganismes de l'ensemble A permet d'évaluer la vitalité des microorganismes vivants de manière fiable.
En effet, le tampon d'efflux, associé à une source énergétique ajoutée aux microorganismes (ensemble B) , stimule significativement l'efflux de produit fluo¬ rescent (à pH 7,3 ou à pH 4, par exemple et à une tempé¬ rature entre 20°C et 40°C), seulement si lesdits microor¬ ganismes présentent une certaine vitalité. De manière générale, les résultats obtenus par cytométrie de flux se présentent sous la forme d'histo¬ grammes.
La perte de fluorescence (efflux à partir de 10 ou 20 "C) se caractérise par un déplacement vers les bas canaux de fluorescence, dans les histogrammes.
L'addition de sucre (ensemble B) entraîne un déplacement (perte de fluorescence supérieure des microorganismes) . C'est ce déplacement vers les bas canaux de fluorescence, augmenté par l'addition de sucre, qui permet d'apprécier, comme précisé ci-dessus, la vita¬ lité de la population de microorganismes.
Le procédé conforme à 1 ' invention présente l'avantage d'apprécier la viabilité des microorganismes de manière fiable, en faisant intervenir d'autres para- mètres que l'intégrité membranaire. La présente invention a également pour objet un kit ou trousse pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il com¬ prend : au moins un marqueur de microorganismes viables (esters de fluorescéine) ,
- un tampon de marquage à un pH compris entre
4 et 8,
- un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8,
- un sucre.
Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti- ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré¬ sente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière.une limitation.
EXEMPLE 1 : Mesure de la vitalité de levures. A) Lavaσe des levures :
2 ml d'une suspension de levures (approximativement 5.10' cellules /ml) sont centrifugés 90 secondes à 13 490 g ; le surnageant est éliminé par aspiration, puis le culot est remis en suspension dans 2 ml de tampon de marquage comprenant, par exemple, du tampon Mcllvaine à pH 4 (le tampon Mcllvaine est composé de 30,7 ml d'acide citrique (100 itiM) et 19,3 ml de di- sodium hydrogène phosphate dihydrate (200 mM) ) ; la sus¬ pension est à nouveau centrifugée 90 secondes à 13 490 g, puis le surnageant de cette deuxième centrifugation est éliminé par aspiration ; on procède à un deuxième lavage des levures par remise en suspension du culot dans 2 ml de tampon de marquage tel que défini ci-dessus ; l'échantillon de levures- ainsi lavé est placé dans de ,1a glace jusqu'au marquage.
La suspension de levures lavée ne doit pas contenir moins de 2.106 cellules/ml. Lorsque la concentration cellulaire initiale est importante (> à 2.106 cellules/ml) , l'étape de lavage peut être remplacée par une étape de dilution.
B) Marσuaσe :
On prélève 2 ml de suspension de levures lavées que l'on agite vigoureusement, puis on ajoute 30 μl de cFDA, de manière à obtenir une concentration finale de 43 μM.
La suspension est ensuite incubée 15 min à 40°C et placée dans de la glace, pour éviter tout efflux. II faut noter que l'intensité de fluorescence des levures après chargement en cF dépend de la concen¬ tration en fluorochrome marqueur.
En conséquence, pour obtenir une bonne ana¬ lyse, la concentration en marqueur doit être ajustée de telle sorte que l'intensité de fluorescence moyenne de la population de levures se trouve, de préférence, à droite du canal 100 sur l'histogramme.
C) Lavaσe après marσuaσe :
2 ml de suspension de levures marquées sont centrifugés pendant 90 secondes à 13 490 g, puis on éli¬ mine le surnageant par aspiration ; le culot est remis en suspension dans 2 ml de tampon d'efflux, maintenu à 0°C et constitué par un tampon Mcllvaine à pH 7, 3 ; on pro¬ cède à nouveau à une centrifugation pendant 90 secondes à 13 490 g, on élimine le surnageant par aspiration et on remet en suspension le culot obtenu dans 2 ml de tampon d'efflux à 0'C tel que défini ci-dessus.
L'échantillon est ensuite placé dans de la glace jusqu'au moment où l'on effectuera la mesure de l' efflux proprement dite. D) Mesure de l'efflux :
* Méthode différentielle : a) Prélever un aliquot de 1 ml à partir de la suspension obtenue en C) et la diluer dans 30 ml de tam- pon d'efflux tel que défini ci-dessus, l'agiter et l'ana¬ lyser directement à l'aide d'un cytomètre de flux (à température ambiante) . b) Prélever un autre aliquot de 1 ml, à partir de la suspension obtenue en C) et la diluer, soit dans 30 ml de tampon d'efflux tel que défini ci-dessus (ensemble A), soit dans 30 ml de tampon d'efflux auquel on a ajouté 200 μl de glucose (ensemble B) , de manière à obtenir une concentration finale en glucose de 10 mM ; on agite et on place ladite suspension dans un bain-marie à une température comprise entre 10 et 40 °C, de préférence entre 20°C et 40°C.
On prélève, à intervalles de temps régulier, des aliquots de chacune de ces suspensions (3 ml) que l'on analyse directement par cytomètre de flux. De manière idéale, la population de levures qui va être analysée par cytométrie de flux doit contenir environ 5.10^ à 10^ cellules/ml (équivalent à approxima¬ tivement 1.104 à 2.104 cellules sur l'histogramme) .
Le volume de l'échantillon analysé et/ou la dilution dans le tampon d'efflux sera adapté en fonction de la concentration initiale en cellules. La température d'efflux peut varier entre 0° (pas d'efflux) et 40 'C
(efflux important) .
* Méthode au glucose seul : Dans les conditions du b) ci-dessus, à 40 "C, l'histogramme d'une suspension de levures mises en cul¬ ture pendant une nuit va "disparaître" après approximati¬ vement 25 min (lorsque le glucose est ajouté) . A 30°C, l'histogramme d'une suspension de levures viables dispa- raîtra après approximativement 50 min (lorsque le glucose est ajouté) . * Résultats : a) Mesure de l'efflux :
Des cellules de S. cerevisiae ont été char¬ gées, comme précisé ci-dessus, à pH 4 et la rétention de cF esl étudiée dans différentes conditions (ensembles A et B) .
Comme le montre la figure 1 (qui comporte en abscisse, le temps en minute, et en ordonnée, le pourcen¬ tage de carboxyfluorescéine piégé) , le cF est piégé dans des cellules stockées à 0°C, mais à 30°, un efflux rapide de cF se produit, dépendant du pH.
L'addition de glucose aux cellules à pH 7,3 entraîne une stimulation significative de l'efflux de cF, qui suggère que le cF est libéré d'une manière dépendante de l'énergie. Le fructose et le mannose stimulent l'ef¬ flux de cF de la même manière que le glucose, tandis que le galactose et le glycérol n'ont aucun effet.
La figure 1 montre la mesure de l'efflux à pH 7,3, à 0°C (M) , 30°C (Δ) et 30 "C en présence de 10 mM glucose (A) . L'efflux à pH 4 a été mesuré à 30°C (O) et à 30 °C en présence de glucose 10 mM (•) .
Pour cette expérience, des cellules de S. cerevisiae ont été chargées en cF par incubation à 40 "C avec du cFDA 0,22 mM ; les cellules ont été lavées et remises en suspension dans un tampon Mcllvaine pH 4, comme précisé ci-dessus.
La stimulation du transport du cF à pH 7, 3 , après addition de glucose (figure 1), suggère que le transport est effectivement actif. L'efflux du cF peut être déterminé comme mon¬ tré ci-dessus par cytométrie de flux ; l'histogramme va subir un déplacement vers les bas canaux de fluorescence sur l'axe des X comme résultat de la perte de la fluores¬ cence intracellulaire et ce phénomène est corrélé à la capacité des cellules à créer ou maintenir une force pro¬ tonique active (ensemble B) . L'intensité de fluorescence intracellulaire en cF des microorganismes de l'ensemble B à 15 min est infé¬ rieure à celle de l'ensemble A d'un facteur compris entre 2 et 4, le rapport intensité de fluorescence ensemble B/intensité de fluorescence ensemble A étant inférieur à 1.
Dans la méthode au glucose seul, on mesure le temps nécessaire à la disparition de la moitié de la fluorescence intracellulaire, dans une fenêtre prédéter- minée (voir figure 9) . b) Mise en évidence d'un système de transport actif :
- efflux de cF contre un gradient de concen¬ tration : Pour déterminer si l'efflux de cF est lié à l'énergie métabolique et non à un flux passif, l'efflux est étudié en présence d'une concentration de cF extra¬ cellulaire importante (1 mM) . Ensuite, l'efflux est cal¬ culé, après la détermination de la concentration de cF intracellulaire.
La concentration de cF intracellulaire ini¬ tiale est d'environ 0,5 mM. L'efflux, en l'absence et en présence de cF extracellulaire 1 mM est comparable, en présence d'une source d'énergie ; l'efflux s'effectue donc contre le gradient de concentration.
Ces résultats suggèrent effectivement que l'efflux de cF chez S. cerevisiae est réalisé à l'aide d'un système de transport actif.
- Inhibition de l'efflux de cF : . l'effet de différents composés sur l'efflux de cF a été étudié de manière à conforter l'hypothèse du système de transport actif de cF.
(i) effet du DNP et de l'acide benzoïque : la figure 2 illustre l'effet du DNP (1 mM) et de l'acide benzoïque (10 mM) sur l'efflux de cF. Pour réaliser cet essai, i, les cellules sont préincubées 20 min à 40 °C avec un tampon Mcllvaine pH 4, en l'absence (•) ou en présence de 2,4 DNP 1 mM (A) ou d'acide benzoïque 10 mM (M) . Après lavage, les cellules sont chargées en cF par incubation à 40 °C avec 43 μM cFDA dans un tampon Mcllvaine pH 4, lavées et remises en suspension dans un tampon Mcllvaine pH 7,3. Le test d'efflux est réalisé à 30°C. Cette figure 2 montre que le DNP est plus efficace dans l'inhibition de l'efflux de cF que l'acide benzoïque.
Ces résultats confortent la présence d'un efflux énergie-dépendant. (ii) effet du TPP+ (ions tétraphénylphospho- nium) : la figure 3 montre que le TPP+, à une concen¬ tration de 10 M, inhibe complètement l'efflux de cF. L'addition de TPP+ n'entraîne pas une diminution impor- tante de la concentration intracellulaire en ATP. Ceci suggère que l'efflux de cF est lié à la pompe à protons.
De manière plus précise, la figure 3 qui com¬ porte, en abscisse, le temps en minute et, en ordonnée, le pourcentage de carboxyfluorescéine piégée, illustre l'effet du TPP+ sur l'efflux de cF (A) et sur la concen¬ tration intracellulaire en ATP (B) dans des cellules de S. cerevisiae énergisées, comme suit : les cellules sont chargées en cF par incubation à 40°C avec du cFDA 43 μM dans un tampon Mcllvaine pH 4, lavées et remises en sus- pension dans un tampon Mcllvaine pH 7,3. L'essai est réa¬ lisé à 30 °C, l'efflux est mesuré en absence (•) ou en présence de TPP+ 10 mM (A) .
(iii) effet des inhibiteurs de l'ATP-ase : De tels composés sont notamment le vanadate, le DES et le DCCD (N,N' -dicyclohexylcarbodiimide) ; l'ef¬ fet de ces composés sur la pompe à protons dans les cel- Iules de levures entières énergisées est illustré à la figure 4.
La production d'ions H+ est mesurée de manière continue, avec une électrode à pH (détermination directe- ment à partir de la pente (en nmol H+/min/mg de pro¬ téine)) . Après l'addition de glucose (10 mM) (levures énergisées) , la libération initiale d'H+ est augmentée à environ 540 nmol H+/min/mg de protéines. Parmi les inhi¬ biteurs testés, le DES (150 μM) est le plus efficace : la production d'H+ en présence de glucose (10 mM) est de 122 nmol H+/min/mg de protéines. L'incubation avec le DCCD (200 μM) diminue la production d'H+ approxi¬ mativement de 50 % à environ 330 nmol H+/min/mg de pro¬ téines, tandis que le vanadate, qui est un analogue de phosphate, ne montre qu'un faible effet (436 nmol/min/mg de protéines) .
Une plus longue pré-incubation des cellules (45 min avec le DCCD ou le vanadate) ne change pas l'ef¬ fet obtenu. La figure 4, qui comprend, en abscisse, le temps en minute, et en ordonnée, le pourcentage de cF piégé, illustre l'effet sur l'efflux de cF (A) et sur la concentration intracellulaire d'ATP (B) de différents composés sur des cellules de S. cerevisiae énergisées, par différents composés.
Comme dans les essais précédents, les cellules sont chargées en cF par incubation à 40 "C avec du cFDA 43 μM dans un tampon Mcllvaine pH 4, lavées et remises en suspension dans un tampon Mcllvaine pH 7,3. L'essai est réalisé à 30 °C. La courbe (O) correspond à l'addition d'aucun produit, la courbe (Δ) correspond à l'addition de DES (150 μM) ou la courbe (•) correspond à l'addition de DCCD (100 μM) .
Cette figure montre que 1 ' inhibition de la pompe à protons est corrélée avec l'inhibition de l'ef¬ flux de cF. Dans les cellules entières énergisées, le DES inhibe de manière importante l'efflux de cF, • tandis que le DCCD ne montre qu'un faible effet.
La concentration en ATP intracellulaire n'est pas influencée, ni par le DES, ni par le DCCD. Le vana- date (1 mM) ne montre aucun effet. c) Etude de la cinétique de l'efflux de cF : Les cellules sont chargées avec différentes concentrations de cF et la vitesse d'efflux initiale est déterminée (figure 5) . La figure 5 comporte en abscisse, la concen¬ tration intracellulaire en cF (mM) et en ordonnée, la vitesse d'efflux de cF (μmol/min) , après chargement de cellules de S. cerevisiae avec du cF, par incubation à 40 °C, pendant des temps variables, avec du cFDA (0,22 mM) dans un tampon Mcllvaine pH 4, lavage et remise en suspension dans un tampon Mcllvaine pH 7,3, comme précisé ci-dessus ; à partir de la pente, dans le plot d'Arrhénius (figure 6), une énergie d'activation de 50 kJ/mol est calculée, ce qui confirme l'implication d'un système de transport ; apparemment le système de transport (flux de sortie du cF) obéit à la cinétique de Michaelis-Menten.
Les résultats sont analysés sous la forme d'un plot d'Eadie-Hofstee et le Km du transport de cF de 0,25 mM est calculé. Les résultats indiquent que le cF est libéré à l'aide d'un système de transport membra- naire, à partir de cellules S. cerevisiae chargées comme décrit précédemment (incubation à 40 °C avec différentes concentrations de cFDA dans un tampon Mcllvaine pH 4) , lavage et remise en suspension dans un tampon Mcllvaine pH 7,3) . L'efflux est mesuré à 30° en présence de glucose (10 mM) .
L'efflux, mesuré à différentes températures (figure 7) montre que cet efflux est dépendant de la température. E) Analyse des données obtenues en cytométrie de flux :
Le cytomètre de flux utilisé est un cytomètre de flux Chemflow®. Le système fluidique comprend un flux lami¬ naire fermé avec un débit maximum de 0,4 ml/min. Pour 1 ' énumération par cytométrie de flux, un échantillon de 200 μl est analysé. Dans des conditions normales, la concentration maximale de particules fluorescentes qui peuvent être mesurées par ce cytomètre de flux est limi¬ tée approximativement à 1.10-Vml.
L'instrument comprend une source lumineuse constituée par un arc de mercure HPO 100 . La longueur d'onde d'excitation est sélectionnée par l'utilisation de 2 filtres de bandes et est compris entre 450 et 490 nm. La longueur d'onde d'émission est de 515 nm et est sélec¬ tionnée à l'aide d'un filtre dichroïque de 500 nm (éliminant les signaux inférieurs à 500 nm) et un filtre interférentiel (FI 515) à 515 nm. Les données sont présentées sous forme d'his¬ togramme dans lesquels 1 'axe des Y correspond au nombre de particules fluorescentes et l'axe des X est divisé en canaux (0 à 255) correspondant à l'intensité de fluores¬ cence des particules. Une amplification logarithmique (mode logl) du signal entrant est appliquée pour mesurer directement un nombre plus grand de signaux sur un histogramme ; les données peuvent être, si nécessaire, recalculées selon une échelle linéaire. La figure 8 illustre la détermination
(histogramme) de l'efflux de cF. La concentration en cF intracellulaire moyenne d'une culture de S. cerevisiae chargée par du cFDA est d'environ 0,1 à 0,4 mM, qui est approximativement équivalent à 1.10' molécules fluores- centes/cellule. La concentration en fluorescéine intra¬ cellulaire minimale qui pourrait être mesurée (canal 1 dans le mode log 1 du .-cytomètre de flux) est approximati¬ vement compris entre 0,05- et 0,1 mM.
La figure 8 illustre un déplacement vers la gauche des histogrammes dû à la perte de fluorescence à 40° d'une culture de- levures chargée en cF. L'addition de glucose entraîne un déplacement supplémentaire significa¬ tif vers la gauche, de l'intensité de fluorescence des cellules .
Pour montrer que ce déplacement supplémentaire est bien un paramètre de l'analyse de la vitalité des levures, des essais comparatifs sont effectués avec des levures S. cerevisiae stressées par une incubation courte à haute température (60 °C, 1,5 min), du DNP (1 mM) ou de l'acide benzoïque (10 mM) . Les histogrammes obtenus montrent que ni le nombre initial de particules fluorescentes, ni l'inten¬ sité de fluorescence initiale des cellules chargées en cF, sont significativement diminués.
Cependant, la diminution des CFU après traite- ment à la température de la suspension de S. cerevisiae est supérieure à 4 unités log et le déplacement vers la gauche de l'histogramme est significativement réduit.
Dans ce cas, l'addition du glucose n'a prati¬ quement aucun effet ; ceci suggère donc que les cellules ne sont pas vitales.
A l'opposé, des cellules lavées préincubées avec de l'acide benzoïque ne montrent aucune diminution des CFU, mais la réduction du déplacement de l'histo¬ gramme est significativement importante comparée au contrôle.
Cependant, l'addition postérieure de glucose induit un déplacement vers la gauche (diminution de l'in¬ tensité de fluorescence intracellulaire) ; ceci indique que les cellules sont stressées, mais ont encore une cer- taine vitalité. Dans le cas du DNP, les cellules sont sévère¬ ment stressées, dans la mesure où on note une diminution de la concentration de l'ATP intracellulaire et une dimi¬ nution des CFU, mais le faible déplacement de l'histo- gramme vers la gauche après addition de glucose indique qu'au moins une partie importante de la population a perdu beaucoup de sa vitalité.
Dans les histogrammes de la figure 8, les cel¬ lules ont été chargées par 15 minutes d'incubation avec du cFDA 43 μM à 40"C dans un tampon Mcllvaine pH 4, lavées et remises en suspension dans un tampon Mcllvaine à pH 7,3.
La perte de fluorescence à 40 °C après 0, 20, 40 et 60 minutes est mesurée avec un cytomètre de flux pour des cellules non énergisées (histogrammes A à D) et pour des cellules énergisées avec du glucose (10 mM) (histogrammes E à F) .
Les cellules ont été prétraitées comme suit : aucun traitement (histogrammes A et E) , préincubation avec du DNP (1 mM) (histogrammes B et F) , traitement par la chaleur à 60°C pendant 90 secondes (histogrammes C et G) et préincubation avec de l'acide benzoïque (10 mM) (histogrammes D et H) .
La relation viabilité-vitalité des cellules est illustrée à la figure 9 qui montre qu'il existe une excellente corrélation entre les cellules viables (méthode de comptage sur milieu nutritif : comptage après 5 jours d'incubation, sur un milieu agar Sabouraud) et la fraction de cellules de levures qui ont perdu la plupart de leur cF après 30 min à 40°C, de telle sorte qu'elles ne peuvent plus être détectées par le cytomètre de flux.
Les résultats obtenus sur cette figure 9 ont été effectués en chargeant les cellules avec du cF par incubation avec du cFDA 43 μM dans un tampon Mcllvaine pH 4, lavées et remises en suspension dans un tampon
Mcllvaine pH 7,3. Le test d'efflux est réalisé à 40 °C. Les cel¬ lules fluorescentes sont comptées au temps 0 et après 30 min.
EXEMPLE 2 : Mesure de la vitalité de bactéries. A) Lavaσe des bactéries :
Des bactéries Lactococcus lactis cultivées pendant une nuit dans un milieu Ml7, sont lavées et remises en suspension dans un tampon phosphate 50 mM pH 7. B) Marσuaσe :
On prélève 2 ml de suspension de bactéries lavées que l'on agite vigoureusement, puis on ajoute du cFDA, de manière à obtenir une concentration finale de 43 μM. La suspension est ensuite incubée 10 min à
40°C et placée dans de la glace (0°C), pour éviter tout efflux.
C) Lavaσe après marσuaσe :
2 ml de suspension de bactéries marquées sont centrifugés pendant 4 à 5 min à 13 490 g, puis on élimine le surnageant par aspiration ; le culot est remis en sus¬ pension dans 2 ml de tampon d'efflux, maintenu à 0°C, et constitué par du tampon phosphate 50 mM pH 7 ; on pro¬ cède, éventuellement, à nouveau à une centrifugation pen- dant 4 à 5 min à 13 490 g, on élimine le surnageant par aspiration et on remet en suspension le culot obtenu dans 2 ml de tampon d'efflux à 0"C.
D) Mesure de l'efflux :
On mesure l'efflux, dans les conditions de l'exemple 1, en présence de glucose 10 mM ou de lactose 10 mM, le tampon d'efflux étant, comme ci-dessus, un tam¬ pon phosphate 50 mM pH 7.
Les résultats sont illustrés à la figure 10 (abscisse : temps en min, ordonnée : pourcentage de cFDA retenu) . Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1' invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve¬ nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar¬ ter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Procédé d'évaluation et de mesure de la viabilité des microorganismes, comprenant :
(a) le chargement des microorganismes en pro- duit fluorescent, par incubation desdits microorganismes à une température comprise entre 20 °C et 50°C avec un marqueur (fluorochrorne) , et
(b) la mesure de l'intensité de fluorescence intracellulaire par cytométrie de flux, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) l'incubation desdits microorganismes pen¬ dant 5 à 20 minutes avec ledit marqueur à une concentra¬ tion comprise entre 1 μM et 300 μM, en présence d'un tam¬ pon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, pour 1 ' ob- tention de microorganismes chargés en produit fluorescent (étape de chargement (a) ) ,
(ii) l'élimination du marqueur non incorporé dans les microorganismes,
(iii) l'addition d'une source énergétique, préalablement à l'étape (b) et
(iv) la mesure du temps nécessaire à la dispa¬ rition de la moitié de la fluorescence intracellulaire des microorganismes, par cytométrie de flux, dans une fe¬ nêtre d'intensité prédéterminée, à un pH compris entre 4 et 8 (tampon d'efflux) et à une température comprise entre 10°C et 40°C, de préférence entre 20°C et 40°C.
2°) Procédé d'évaluation et de mesure de la viabilité des microorganismes, comprenant :
(a) le chargement des microorganismes en pro- duit fluorescent, par incubation desdits microorganismes à une température comprise entre 20'C et 50 °C avec un marqueur (fluorochrorne) , et
(b) la mesure de l'intensité de fluorescence intracellulaire par cytométrie de flux, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : (i) l'incubation desdits microorganismes pen¬ dant 5 à 20 minutes avec ledit marqueur à une concentra¬ tion comprise entre 1 μM et 300 μM, en présence d'un tam¬ pon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, pour 1 ' ob- tention de microorganismes chargés en produits fluores¬ cents,
(ii) l'élimination du marqueur non incorporé dans les microorganismes,
(iii) la mise en oeuvre de l'étape (b) sur deux ensembles d'échantillons de microorganismes :
- l'ensemble A, dans lequel l'intensité de fluorescence intracellulaire des microorganismes est mesurée à des intervalles de temps réguliers pendant 5 à 60 min, dans un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8 et à une température comprise entre 10 °C et 40 °C, de préférence entre 20 °C et 40°C ;
- l'ensemble B, dans lequel l'intensité de fluorescence intracellulaire des microorganismes est mesurée à des intervalles de temps réguliers pendant 5 à 60 min, dans un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8, auquel une source énergétique a été ajoutée, et à une température comprise entre 10°C et 40 °C, de préfé¬ rence entre 20 "C et 40 °C ; et
(iv) l'évaluation de la vitalité des microorganismes en fonction du rapport des intensités de fluorescence intracellulaire : ensemble B/ensemble A.
3 ° ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le marqueur est choisi parmi les esters de fluorescéine : le FDA, le 6- CFDA, le 5-CFDA, le 5-maléimide FDA, le dilaurate de fluorescéine, le dibutyrate de fluorescéine, le 5 (6) 2 ',7' dichloro-CFDA, le 5 (6) sulfo-FDA, le 5 (6) 2 ',7' dichloro-FDA, l'ester de 5,6-CFDA N-hydroxy succinimide, le dipropionate de fluorescéine, la di-bêta-D-galactoside fluorescéine, le phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, le pentaacétoxy ester de 2 ', 7 ' -bis (carboxyéthyl) -5 (6) - carboxyfluorescéine (BCECF/AM) , le pentaacétoxy ester de 2' ,7 '-bis (carboxyéthyl)-5 (6)-fluorescéine (BCECF/AM) , le diacétate d' azidofluorescéine, le diacétate de chloro- méthylfluorescéine, le diacétate d'éosine, le diacétate de carboxyéosine, l'acétate de 4-méthylumbelliferyl, le 4-méthylumbelliferyl bêta-D-galactoside, le 4-méthyl¬ umbelliferyl alpha-D-mannopyranoside, le nonanoate de 4- méthyllumbelliferyl, le phosphate de 4-méthylumbelli¬ feryl, 1 ' alanine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycine-7- amino-4-méthylcoumarine, la proline-7-amino-4- méthylcoumarine, la valine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycyl-L-proline-7-amino-4-méthylcoumarine, le 1,4-diacé- toxy-2, 3-dicyanobenzène (ABD) , 1 'hydroéthidine, l'acétate de résorufine. 4°) Procédé selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 3 , caractérisé en ce que ledit marqueur est du diacétate de carboxyfluorescéine.
5 ° ) Procédé selon 1 'une quelconque des reven¬ dications 1 à 4, caractérisé en ce que la source énergé- tique est un sucre.
6 * ) Procédé selon la revendication 5, caracté¬ risé en ce que le sucre est choisi parmi le glucose, le fructose, le mannose et le lactose.
7°) Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce que le sucre est du glucose 10 mM.
8°) Kit ou trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon 1 'une quelconque des revendications 1 à 7 , caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un marqueur de microorganismes viables,
- un tampon de marquage à un pH compris entre 4 et 8,
- un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8, et - un sucre. 9°) Application du procédé selon l'une quel¬ conque des revendications 1 à 7, à l'évaluation d'une fermentation.
10°) Application du procédé selon l'une quel¬ conque des revendications 1 à 7, au suivi d'une fermenta¬ tion.
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997017463A1 (fr) * 1995-11-08 1997-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Procedes de determination de la viabilite de cultures microbiennes
US5830666A (en) * 1996-03-28 1998-11-03 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Method of detecting nucleic acids or the like
WO1998055861A1 (fr) * 1997-06-04 1998-12-10 Chemunex Procede de numeration de cellules viables
EP0948639A4 (fr) * 1996-11-01 2001-12-19 Coulter Int Corp Identification de cellules blastiques dans une preparation de leucocytes
WO2007038130A3 (fr) * 2005-09-22 2007-05-31 Tate & Lyle Ingredients Souches ameliorees pour la production d'acides organiques
WO2010004567A1 (fr) * 2008-07-10 2010-01-14 Tacount Procédé, kit et système de numération de cellules cultivables
CN102967545A (zh) * 2012-11-06 2013-03-13 清华大学 一种检测活性细菌含量的方法
US8993259B2 (en) 2012-05-02 2015-03-31 Charles River Laboratories, Inc. Method of viability staining with membrane permeable fluorescent dye and membrane impermeable fluorescence quencher
US9709500B2 (en) 2012-05-02 2017-07-18 Charles River Laboratories, Inc. Optical method for detecting viable microorganisms in a cell sample
CN109715822A (zh) * 2016-07-28 2019-05-03 高级生物设计公司 Aldh同工酶的特异性底物
US10324036B2 (en) 2012-05-02 2019-06-18 Charles River Laboratories, Inc. Porous planar cell capture system

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0333560A1 (fr) * 1988-03-08 1989-09-20 Chemunex Procédé de détermination quantitative de micro-organismes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0333560A1 (fr) * 1988-03-08 1989-09-20 Chemunex Procédé de détermination quantitative de micro-organismes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B.ROTMAN ET AL.: "Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzymatic hydrolysis of fluorogenic substrates.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 55, 1966, pages 134 - 141 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997017463A1 (fr) * 1995-11-08 1997-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Procedes de determination de la viabilite de cultures microbiennes
US5830666A (en) * 1996-03-28 1998-11-03 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Method of detecting nucleic acids or the like
EP0948639A4 (fr) * 1996-11-01 2001-12-19 Coulter Int Corp Identification de cellules blastiques dans une preparation de leucocytes
WO1998055861A1 (fr) * 1997-06-04 1998-12-10 Chemunex Procede de numeration de cellules viables
WO2007038130A3 (fr) * 2005-09-22 2007-05-31 Tate & Lyle Ingredients Souches ameliorees pour la production d'acides organiques
US7473540B2 (en) 2005-09-22 2009-01-06 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Methods for selecting a yeast population for the production of an organic acid and producing an organic acid
AU2009269581C1 (en) * 2008-07-10 2014-09-25 Tacount Exact Ltd. Method, kit and system for culturable cell count
CN104250661A (zh) * 2008-07-10 2014-12-31 塔康特精确有限公司 可培养的微生物细胞的数目的测定方法
CN102089419A (zh) * 2008-07-10 2011-06-08 塔康特精确有限公司 用于进行可培养细胞计数的方法、试剂盒和系统
AU2009269581B2 (en) * 2008-07-10 2014-07-03 Tacount Exact Ltd. Method, kit and system for culturable cell count
WO2010004567A1 (fr) * 2008-07-10 2010-01-14 Tacount Procédé, kit et système de numération de cellules cultivables
US8993260B2 (en) 2012-05-02 2015-03-31 Charles River Laboratories, Inc. Fluorescence-based viability staining method using a membrane permeable flourescent dye and membrane impermeable fluorescence quencher
US8993259B2 (en) 2012-05-02 2015-03-31 Charles River Laboratories, Inc. Method of viability staining with membrane permeable fluorescent dye and membrane impermeable fluorescence quencher
US9709500B2 (en) 2012-05-02 2017-07-18 Charles River Laboratories, Inc. Optical method for detecting viable microorganisms in a cell sample
US10324036B2 (en) 2012-05-02 2019-06-18 Charles River Laboratories, Inc. Porous planar cell capture system
US10976258B2 (en) 2012-05-02 2021-04-13 Charles River Laboratories, Inc. Porous planar cell capture system and method of use
CN102967545A (zh) * 2012-11-06 2013-03-13 清华大学 一种检测活性细菌含量的方法
CN109715822A (zh) * 2016-07-28 2019-05-03 高级生物设计公司 Aldh同工酶的特异性底物
EP3491143A1 (fr) * 2016-07-28 2019-06-05 Advanced Biodesign Substrat spécifique d'une isoenzyme de l'aldh
US11519014B2 (en) 2016-07-28 2022-12-06 Advanced Biodesign Specific substrate of an ALDH isoenzyme

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