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WO1994028159A1 - Anticorps humain reconstruit contre l'interleukine-6 humaine - Google Patents

Anticorps humain reconstruit contre l'interleukine-6 humaine Download PDF

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WO1994028159A1
WO1994028159A1 PCT/JP1994/000859 JP9400859W WO9428159A1 WO 1994028159 A1 WO1994028159 A1 WO 1994028159A1 JP 9400859 W JP9400859 W JP 9400859W WO 9428159 A1 WO9428159 A1 WO 9428159A1
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chain
region
thr
ser
antibody
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PCT/JP1994/000859
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French (fr)
Inventor
Masayuki Tsuchiya
Koh Sato
Yuichi Hirata
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Publication date
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Priority to AU68081/94A priority patent/AU6808194A/en
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Definitions

  • the present invention relates to a human Z mouse chimeric antibody comprising a variable region (V region) of mouse monoclonal antibody SK2 against human interleukin-16 (IL-6) and a constant region (C region) of a human antibody.
  • the complementarity determining regions (CDRs) of the human light chain (L chain) V region and the human heavy chain (H chain) V region were replaced by the CDR of mouse SK2, a mouse monoclonal antibody against human IL-16.
  • Reshaped human antibodies and the light or heavy chains that make up those antibodies The present invention further provides a DNA encoding the above antibody, particularly a V region thereof.
  • the present invention further relates to a vector comprising the DNA, especially an expression vector, and a host transformed with the vector.
  • the present invention further provides a method for producing a chimeric antibody against human IL-16, and a method for producing a reshaped human antibody against human IL-16.
  • Interleukin-6 is a multifunctional cytokine produced by a series of cells. It regulates the immune response, the acute phase response and hematopoiesis, and plays a central role in host defense mechanisms (Kishimoto et al., Blood, 74, 1—10, 1989). It acts on a wide range of tissues and exerts growth-inducing, growth-inhibiting, and differentiation-inducing effects depending on the properties of the target cells.
  • IL-16 gene Abnormal expression of IL-16 gene may cause various diseases, especially autoimmune diseases, It has been suggested to be involved in the pathogenesis of stromal cell proliferative glomerulonephritis and plasmacytoma myeloma (Hirano et al., Immu no 1. Today, 11, 4 4 3-4 49,1 Cylekine, B. et al., Eur. Cytokine N et. 1, 193-210-190). Therefore, antibodies that inhibit the function of IL-16 are expected to be useful as therapeutic agents in human patients.
  • Mouse monoclonal antibodies are highly immunogenic in humans (sometimes referred to as "antigenic"), and for this reason their therapeutic value in humans is limited. In addition, mouse antibodies cannot be administered as frequently without eliciting an immune response that not only interferes with the intended effect, but also poses a risk of an adverse allergic response in the patient.
  • Mouse antibodies can be humanized in two ways.
  • a simpler method is to produce a chimeric antibody in which the variable regions are derived from the original mouse monoclonal antibody and the constant regions are derived from a suitable human antibody.
  • the resulting chimeric antibody contains the complete variable region of the original mouse antibody and can be expected to bind to the antigen with the same specificity as the original mouse antibody o
  • chimeric antibodies have a substantially reduced proportion of non-human protein sequences and are therefore expected to be less immunogenic than the original mouse antibody. Chimeric antibodies bind antigen well and are less immunogenic, but may still produce an immune response to the mouse variable region (Lo Buglio et al., Proc. Natl.
  • the second method for humanizing mouse antibodies is more complex, but it further reduces the potential immunogenicity of the mouse antibodies.
  • a complementarity determining region (CDR) from the variable region of a mouse antibody is transplanted into a human antibody variable region to produce a "reshaped" human antibody variable region.
  • CDRs are composed of hypervariable protein sequences. They do not show species-specific sequences. For these reasons, reshaped human antibodies carrying mouse CDRs should no longer be more immunogenic than native human antibodies containing human CDRs.
  • reconstituted human antibodies are expected to be useful for therapeutic purposes, but no reconstituted human antibodies against human IL-16 are known. Furthermore, there is no method for producing reshaped human antibodies that is universally applicable to any particular antibody. Therefore, in order to produce a reshaped human antibody that is sufficiently active against a specific antigen, various measures are required (for example, Sato, K. et al., Cancer Res. 53, 8). 5 1-8 5 6 (1 9 9 3)) 0
  • an object of the present invention is to provide an antibody having low immunogenicity against human IL-16.
  • the present invention relates to a reshaped human antibody of the mouse monoclonal antibody SK2 against human IL-16.
  • the present invention also provides a human mouse chimeric antibody useful in the process of producing the reshaped human antibody.
  • Book The invention further relates to a genetically engineered method for the production of human monoclonal antibodies reconstituted with the mouse monoclonal antibody SK2 and chimeric antibodies.
  • an L chain comprising the L region of a human antibody L chain C region and the L chain V region of a mouse monoclonal antibody SK2 against human IL-16;
  • H chain comprising the H chain C region of a human antibody H chain and the H chain V region of a mouse monoclonal antibody SK2 against human IL-16;
  • a chimeric antibody against human IL-16 further comprising:
  • a reconstituted human light chain V region comprising:
  • SK2 a mouse monoclonal antibody against human IL-16 composed of the reshaped human heavy chain V region
  • the present invention also relates to L-chain or H-chain polypeptides constituting the various antibodies, and DNAs encoding them.
  • the present invention relates to an expression vector comprising the above DNA and a host transformed with the expression vector.
  • the present invention further relates to a method for producing a chimeric antibody against human IL-16 and a method for producing a reshaped human antibody against human IL-16.
  • Figure 1 shows that human EF is useful for the expression of light and heavy chains, respectively.
  • Expression plasmid HEF comprising I one shed promoter one Z Enhansa one - V L one gk and HE F- V H - indicates a g T l.
  • FIG. 2 shows an expression vector comprising a human cytomegalovirus (HCMV) promoter Z enhancer useful for expression of the antibody peptides of the present invention.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • FIG. 3 is an electrophoretogram showing that the SK2 antibody is glycosylated.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of ELISA for confirming the ability of the chimeric antibody of the present invention to bind to human IL-16.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of ELISA for confirming the ability of the chimeric antibody of the present invention to inhibit the binding of IL16 to human IL-16.
  • FIG. 6 is a diagram showing the production of the first purge ion (version “aJ”) of the reshaped human SK2 antibody L chain V region.
  • FIG. 7 is a diagram showing the preparation of the first purge ion (version “a”) of the reshaped human SK2 antibody H chain V region.
  • FIG. 8 is a graph showing the ability of an antibody consisting of a reshaped human L chain + a chimeric H chain to bind to human IL-16.
  • FIG. 9 is a graph showing the ability of the four reshaped human SK2 antibodies of the present invention to bind to human IL-16 as compared to that of a chimeric antibody.
  • Figure 10 shows the ability of the four reconstituted humanized SK2 antibodies of the present invention to inhibit IL-16R binding to IL-16R with those of the SK2 chimeric and mouse monoclonal antibodies SK2. It is a graph shown in comparison, Specific embodiments for carrying out the invention
  • RNA To clone DNA encoding the V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-16, all RNA must be prepared from living mouse monoclonal antibodies and then single-stranded by known methods. It is obtained by converting to cDNA and amplifying the target DNA using the polymerase chain reaction (PCR) method. As a source of this total RNA, it is necessary to produce a hybridoma that produces a monoclonal antibody against human IL-16. SK2 can be mentioned as such a high-priority dorma. The method of producing Hypri-Dorma SK 2 is described in Reference Example 1 below.
  • the hybridoma cells were destroyed, treated with guanidine thiosinate, and then subjected to a cesium chloride density gradient (Chir Gwin et al., Biochemistry, 18). , 529, 1979) have been used to clone genes for other proteins, such as surfactants in the presence of ribonuclease inhibitors such as vanadium complexes. (Berger & Birke nmeier, Biochemistry, 18, 51, 3, 197 9) can be used.
  • the total RNA is made into type III, and the oligo (dT) complementary to the p01yA chain at the 3 'end thereof is obtained.
  • dT oligo complementary to the p01yA chain at the 3 'end thereof is obtained.
  • cDNA single-stranded DNA
  • the mouse antibody V region is specifically amplified from the cDNA using the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the primers described in Johns, ST. Et al., Biotechnolgy, _9_, 88-89, 1991 can be used.
  • the SK2 antibody was typed using a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Amersham International plc). As a result, the SK2 antibody has a / type L chain and a type 1 H chain. It turned out to be. Refer to Reference Example 2 for SK2 typing.
  • the MKV primer hybridizes with a DNA sequence encoding a mouse kappa L chain leader sequence
  • the MKC primer hybridizes with a DNA sequence encoding a mouse kappa L chain C region.
  • the 5′-terminal primer contains the sequence GTCGAC providing a restriction enzyme S a 1 I cleavage site near its 5′-terminal.
  • the 3′-terminal primer has its 5′-terminal The one containing the nucleotide sequence CCCGGG which provides a restriction enzyme XmaI cleavage site is used.
  • These restriction enzyme cleavage sites may be other restriction enzyme cleavage sites as long as they are used for subcloning a DNA fragment encoding a variable region into a cloning vector.
  • the amplified product was digested with restriction enzymes Sa1I and XmaI, and then digested with low-melting point agarose or column (P Separate and purify using a CR product purification kit (QIAGEN, etc.) and a DNA purification kit (GEN ECLEANII, etc.).
  • an appropriate cloning vector such as the plasmid pUC19 is digested with the same restriction enzymes Sa1I and XmaI, and the DNA fragment is ligated to the pUC19 to obtain a mouse monoclonal.
  • ⁇ Sequencing of the cloned DNA can be performed by any conventional method, for example, Seekene Version 2.0 (United States). (States Biochemical Corporation).
  • CDR Complementarity determining region
  • variable regions on the L and H chains form an antigen binding site.
  • the variable regions on the L and H chains are linked by four common, relatively conserved frameworks and three hypervariable or complementarity determining regions (CDRs) (K abat, E A. et al., "Sequencesof Proteinsof Immu nological Internest", US Dept. Healthand Human an Services 1983).
  • FR framework regions
  • CDRs may form part of the / 5-sheet structure in some cases.
  • the three CDRs are held sterically very close to each other by the FRs, and together with the three CDRs of the paired region contribute to the formation of the antigen-binding site.
  • the basic method for producing a quinula antibody is to replace the mouse leader sequence and V region sequence present in the cloned cDNA with the sequence encoding the human antibody C region already present in the mammalian cell expression vector.
  • the human antibody C region can be any human L chain C region and human H chain C region, and examples thereof include human L chain C or H chain C ⁇ 1 and Cr4. it can.
  • chimeric antibodies For the production of chimeric antibodies, two types of expression vectors, a mouse L chain V region and a human L chain C region, are encoded under the control of an expression control region such as an enhancer promoter system. And an expression vector comprising DNA encoding a mouse H chain V region and a human H chain C region under an expression control region such as the Enhancer Z promoter system.
  • an expression vector comprising DNA encoding a mouse H chain V region and a human H chain C region under an expression control region such as the Enhancer Z promoter system.
  • host cells such as mammalian cells are co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vitro or in vivo to produce a chimeric antibody (eg, WO 91-16).
  • the DNA encoding the mouse L chain V region and the human L chain C region and the DNA encoding the mouse H chain V region and the human H chain C region can be expressed in a single expression vector.
  • the vector is introduced and a host cell is transformed with the vector, and the transformed host is cultured in vivo or in vitro to produce the desired chimeric antibody.
  • Example 4 The production of a chimeric antibody is described in Example 4.
  • Connect to The cDNA encoding the type 1 H chain leader and the V region of the mouse SK2 antibody is subcloned using PCR, and contains the genomic DNA encoding the human C region.
  • cDNAs encoding the V region of mouse SK2 were introduced with appropriate nucleotide sequences at their 5'- and 3'-ends, and they were inserted into an expression vector. They were designed to be easily inserted and to function properly in the expression vector (for example, the present invention is designed to increase the transcription efficiency by introducing a Kozak sequence).
  • the V region of mouse SK2 obtained by PCR amplification using these primers was inserted into a HEF expression vector (Fig. 1) already containing the desired human C region. Is suitable for transient or stable expression of genetically engineered antibodies in various mammalian cell lines.
  • NTS NTS-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-N-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-a
  • the mutant chimeric SK2 antibody NTS has no glycosylation site, whereas the glycosylation site at position 30 of the chain V region.
  • the chimeric SK2 antibody showed binding activity to human IL-16.
  • Chimera SK2 antibody NTS also binds to human IL-6.
  • the correct mouse V region had been cloned and sequenced. It was also shown that glycosylation of the V region of the H chain of the SK2 antibody was not required for the binding activity of the SK2 antibody.
  • Mouse monoclonal antibody CDRs have been transplanted into human antibodies.To produce reshaped human antibodies, high homology exists between the mouse monoclonal antibody FRs and the human antibody FRs. Is desirable. Therefore, the V regions of the L chain and H chain of the mouse SK2 antibody were compared with the V regions of all known antibodies whose structures were elucidated using the Protein Data Bank. Table 1 summarizes the results.
  • Mouse SK2 L chain V region is most similar to the consensus sequence of human L chain V region subgroup I (HSGI), with 60.3% There is homology.
  • the H chain V region of mouse SK2 is most similar to the consensus sequence of human H chain V region subgroup II (HS GII), with 59.2% homology.
  • the human L chain V region belonging to subgroup I is used for the design of the chain V region
  • the subgroup II is used for the design of the reshaped human SK2 antibody H chain V region. It is preferable to use the V region of the human antibody H chain belonging to GII), and it is best to select those with as high homology as possible within the subgroup (Kabat, EA et al., USD ep. H ⁇ man Services, US G over nment Printing Offices, 1991).
  • the first step in the design of the reshaped human SK2 antibody V region was to select the human antibody V region on which to base the design.
  • Mouse SK 2 The antibody L chain V region was most similar to the human type II antibody L chain V region belonging to subgroup I (Table 1).
  • the mouse SK2 antibody L chain V region has 63% of the human L chain V region REI, which is a member of subgroup I of the human L chain V region, compared to the known human antibody L chain V region. Showed similarity. Therefore, REI FR was used as a starting material for the construction of the reshaped human SK2 antibody L chain V region.
  • RVLb Note: The five underlined amino acids in the FR of REI are the amino acid sequences of human REI (Palm, W. et al., Hoppe—Seyler's, Z. Physiol. The position of the amino acid is different from that of Chem., 356, 167-191, 19775).
  • the FRs in the H chain V region of the mouse SK2 antibody are most similar to the human H chain V region belonging to subgroup II (Table 1).
  • Mouse SK 2 antibody In comparison with known human antibody H chain V regions, the H chain V region of human H chain V region DAW (Press, EM Et al., Biochim. J. 117, 641, 197 0)) (60.8%). Furthermore, the size of the CDRs was very similar between the mouse SK2 antibody and the human antibody DAW. For this reason, FR of the human antibody DAW was used as a starting material for the production of the H chain V region of the reshaped human SK2 antibody.
  • Table 3 shows the amino acid sequences of the mouse SK2 antibody H chain V region, FR of DAW, and versions “a” and “b” of the reshaped SK2 antibody H chain V region.
  • the production of the reshaped human SK antibody V region is specifically described in Example 5, and the reshaped human SK2 antibody of the present invention comprises:
  • the L chain V region has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52 or 53
  • the H chain V region is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54 or 55. It has an acid sequence.
  • the human light chain C region can be any human light chain C region, such as a human C region; and the human heavy chain C region is any human heavy chain C region. For example, a bit ⁇ -1C region, a human 7-4C region, and the like.
  • two types of expression vectors including DNA encoding the reshaped human light chain as defined above under the control of an expression control region such as the Enhancer ⁇ promoter system, are included.
  • the resulting expression vector and another expression vector comprising a DNA encoding a reconstituted human ⁇ chain as defined above under an expression control region, such as the Enhansa ⁇ promoter system.
  • host cells such as mammalian cells, are co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vivo or in vitro to produce reshaped human antibodies (eg, WO 9 1 — 1 6 9 2 7) ⁇
  • the DNA encoding the reconstituted L chain and the DNA encoding the reconstituted human H chain are introduced into a single expression vector, and the vector is used to transform a host. Then, the transformed host cell is cultured in vivo or in vitro to produce the desired reshaped human antibody.
  • the transformant transformed with the gene encoding the chimeric or humanized antibody of interest as described above is cultured, and the chimeric or humanized antibody produced is produced intracellularly or intracellularly. It can be separated from outside the cell and purified to homogeneity.
  • a chimeric antibody or a humanized antibody Isolation and purification of the body can be performed using a protein A agarose column.
  • other separation / purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • a chimeric antibody or a humanized antibody can be separated and purified by appropriately selecting and combining various types of chromatography, ultrafiltration, salting, dialysis and the like.
  • any expression system such as a eukaryotic cell, such as an animal cell, such as an established mammalian cell line, a fungal cell, And yeast cells, as well as prokaryotic cells, such as bacterial cells, such as E. coli cells, and the like.
  • a mammalian cell such as a C0S cell or a CHO cell.
  • conventional promoters useful for expression in mammalian cells can be used overnight.
  • expression vectors containing the HCMV promoter include: HC MV-V favour-HC r 1, HC MV- VL-H HC k, etc., which are derived from p SV 2 neo (see FIG. 2) ) (W09 2—1 9 7 5 9) is included.
  • promoters for gene expression in mammalian cells include viruses such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40).
  • a promoter derived from a mammalian cell such as a promoter, a human polypeptide, a chain “longation” factor la (HEF-1H) may be used.
  • a promoter derived from a mammalian cell
  • a human polypeptide such as a promoter, a human polypeptide, a chain “longation” factor la (HEF-1H)
  • a promoter derived from a mammalian cell such as a promoter, a human polypeptide, a chain “longation” factor la (HEF-1H) may be used.
  • the method of Mu11igan et al. Na ture 2 7 7 10 8 (1 9 7 9)
  • HE F-la motor the method of Mizushima, S. et al.
  • Origins of replication include those derived from SV40, poliovirus, adenovirus, bovine papillomavirus (BPV), and the like.
  • the expression vector is selected from the group consisting of phosphotransferase gene (3 ') II or I (ne0) gene, thymidine kinase (TK) gene, and Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (E). cogpt) gene, dihydrofolate reductase (DHFR) gene, and the like.
  • DNA encoding the variable region of mouse monoclonal antibody SK2 against human IL-16 was cloned as follows.
  • RNA from hybridoma SK2 was prepared according to the method described by Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5, 294 (19779). That is, the cells of the hybridoma SK2 were completely homogenized in 2 Oml of 4 M guanidine thiosocyanate (Fu1ka). The homogenate was layered on a 5.3 M cesium chloride solution layer in a centrifuge tube. The RNA was precipitated by centrifugation at 31.000 rpm in a W40 rotor at 20 ° C. for 24 hours.
  • RNA precipitate is washed with 80% ethanol and dissolved in 150 mM Tris—HC1 (pH 7.5) 150 ⁇ 1 containing ImM EDTA and 0.5% SDS, and Proteinase (Boehringer) was added thereto to a concentration of 0.5 mg / ml, and the mixture was incubated at 37 for 20 minutes. The mixture was extracted with phenol and black form, and the RNA was precipitated with ethanol. Next, the RNA precipitate was dissolved in 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5) 200 ⁇ 1 containing 1 mM EDTA.
  • RNA prepared as described above to synthesize single-stranded cDNA according to the method described by JW Larrick et al., Biotechnology, 7, 934 (19989).
  • RAV-2 Rousassociated virus 2; Amersham
  • RAV-2 Rousassociated virus 2; Amersham
  • human placental ribonuclease inhibitor Amersham. Dissolve in 50 mM Tris-HCl (pH 8.3) buffer containing 10 // // 1 and incubate the reaction mixture at 37 for 60 minutes and proceed with the next polymerase chain reaction.
  • the primers used for the PCR method are the MKV (Mouse K appa Variable) primers shown in SEQ ID NOs: 1 to 11, which hybridize with the mouse force saliva type L chain leader sequence (ST J ones et al., Biotechnology , 9, 8 8, 1 9 9 1), and the MKC (Mouse K appa Constant) primer shown in SEQ ID NO: 12 that hybridizes with the mouse / c-type L chain C region (ST Jones et al. Biotechnology, 9, 8 8, 1 9 9 1) was used.
  • the PCR solution 100 ⁇ 1 is 1 OmM Tris-HC1 (pH 8.3) 50 mM KC 1, 0.25 mM d NT P s (d ATP, d GTP, d CTP, d TTP) , 1. 5 mM Mg C l 2 , 2. 5 units of DNA Helsingborg isomerase Amp li T aq (P erkin E lmer C etus Co.), each of the MKV primers 0.2 5 ⁇ M, 2.7 5 Contains reaction mixture 11 for MKC primer and single-stranded cDNA synthesis.
  • 1 ⁇ HV (Mouse Heavy V ariab 1 e) primers 1 to 12 shown in SEQ ID NOS: 13 to 24 and MHC-Gl (SEQ ID NO: 25) shown in SEQ ID NO: 25 Mouse Heavy Constant) primer ST Jones et al., Biotechnology, 9, 88, 1991.
  • c DNA amplification was performed using 1 ⁇ M MHV primer and 1 ⁇ M MH C Amplification was carried out in the same manner as described for the amplification of the L chain V region gene in 3. (1) above, except that each MHV 1-2 primer was separately amplified as one Gl primer combination. I went.
  • the DN A fragment amplified by PCR as the low-melting ⁇ Garosu (FMC B i o. P roducts , USA) was purified by. Then 1 0mM Mg C l 2 and 1 5 0mM N a C l The digestion was carried out at 37'C for 3 hours in the contained 10 OmM Tris-HCl (pH 7.6) using 10 units of restriction enzyme Sal I (GIBC 0 BRL).
  • the digestion mixture was extracted with phenol and black form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation. Then, the DNA precipitate 1 0 Units restriction enzyme Xm a I (manufactured by N ew E ngland B io 1 abs, Inc.) by 2 hours digestion at 3 7 e C, and the resulting DN A fragment 1.
  • a piece of agarose containing a DNA fragment of about 45 Obp in length was separated by agarose gel electrophoresis using 5% low melting point agarose (FMC Bio, Products, USA). After melting for 20 minutes, an equal volume of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 2 mM EDTA and 200 mM NaCl was added. The mixture was extracted with phenol and black-mouthed form, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation and dissolved in 1 OmM Tris-HCl (pH 7,5) containing IraM EDTA.
  • a DNA fragment comprising the gene encoding the mouse brim-type L chain variable region and a DN fragment comprising the gene encoding the mouse ⁇ chain variable region were obtained. All of the above DNA fragments were 5 It has a Sal I cohesive end at one end and an Xmal cohesive end at its 3'-end.
  • the transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 5 ml of 2 ⁇ YT medium containing 50 // gZml of ampicillin, and the culture was subjected to the alkaline method (Molecular C oning: AL abo Plasmid DNA was prepared in accordance with Ratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • a plasmid containing a gene encoding the mouse H chain V region derived from hybridoma SK2 was generated from the Sa1I-XmaI DNA fragment, and PUC— SK 2—named VH .
  • the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the above-mentioned plasmid was determined using a Seq ⁇ enase TM Versio n 2.0 kit (U, S. Biochemica1 Co., USA).
  • N a OH by modified sequence was determined for primer Aniru, and labeled from 36 S- dATP according to the formulation of the kit attached.
  • the labeled DNA was electrophoresed on a 6% boriatyl amide gel containing 8 M urea, the gel was fixed with 10% methanol and 10% acetic acid, dried, and The nucleotide sequence was determined by applying the procedure to the graph.
  • SEQ ID NO: 26 shows the nucleotide sequence of a gene encoding the L chain V region of the mouse SK2 antibody contained in plasmid pUC-SK2- VL . Also, shows the H chain V region of a mouse SK 2 antibody contained in plasmid p UC SK 2-V H nucleotide sequence of a gene encoding the SEQ ID NO: 2 7.
  • E. coli containing the plasmid pUC-SK2- VL is as follows.
  • E scherichiacoli DH 5 (p UC - E. coli containing the SK 2 V L and plasmid p UC- SK 2- V H is set to E scherichiacoli DH 5 «(p UC- SK 2 V H), AIST life
  • FE RM BP— 470 and FE RM BP—4 269 were registered at the Engineering Research Institute of Technology (1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture). Was deposited internationally under the Budapest Treaty.
  • the overall structures of the V regions of the L and H chains are similar to each other, with each of the four framework parts being linked by three hypervariable regions, the complementarity determining regions (CDRs). ing.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the amino acid sequence of the framework is relatively well conserved, while the amino acid sequence in the CDR region has extremely high variability (Kabat, EA et al., RSequences of Proteinsof Imm ⁇ nological I nterest] US D ept. H ea 1 thand Hum an Services, 1983).
  • the amino acid sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody against human IL-16 was applied to the amino acid sequence database of the antibody created by Kabat et al.
  • the CDR region was determined as shown in Table 4 by examining the results.
  • the rear primer SK2K2B (SEQ ID NO: 28) for the L chain V region and the rear primer SK2H1S (SEQ ID NO: 30) for the H chain V region are each V region. Hybridizing to the DNA encoding the beginning of the leader sequence of Kozak and the Kozak consensus sequence (Kazak,. Et al., J. Mo1, Biol. 196, 947, 950, 19). 8 7) and Hind III restriction sites.
  • the forward primer SK2K2A (SEQ ID NO: 29) for the light chain V region and the 64 hch-A (SEQ ID NO: 31) forward primer for the heavy chain V region cover the end of the J region. And designed to have a splice donor sequence and a BamHI restriction site.
  • the PCR product was purified using a 1.5% low melting point agarose gel, digested with Hindlll and BamHI, and digested with the pUC19 vector (Yanishe-Perron et al., Gene (1989). ) 33: 103-109).
  • a HindIII-BamHI fragment having the correct DNA sequence was excised, and the H chain V region was introduced into an expression vector HEF— VH —gyl and HEF—SK2h - g to obtain a ⁇ l, for L chain V region was obtained by introducing the HE F- V L one gk HEF- SK 2 k- gk.
  • HEF—SK2h-gr1 was used as type III, and the rear primer SK2H1S and the front primer SK2HM1B (SEQ ID NO: 3) 2) and the forward primer 64 hch—A and the rear primer (SK 2 HM1) (SEQ ID NO: 33) were combined so that position 30 was changed from asparagine to serine by PCR mutagenesis. Designed.
  • Mutant H chain V region was obtained by using primers SK 2 H 1 S and SK 2 HM 1 B. or primers SK 2 HM 1 and 64 hch-A, and using plasmid HE F— SK 2 h— g as type I DNA. PCR was carried out in the same manner as described above using 71. After PCR amplification, the two PCR products were purified using a low melting point agarose gel and used for a second PCR. A 98 ⁇ l PCR mixture containing 1 ⁇ g of each of the two first PCR products and 5 u of Am p 1 i T aq was added at 94 ° C. for 2 minutes and at 50 ° C. for 2 minutes.
  • the cells treated with electroporation were supplemented with 10% ⁇ r-1 with or without 2 ⁇ g / ml of tunicamycin (Sigma). It was added to a DMEM culture solution (GIB CO) containing globulin-free fetal serum. 72 After incubation for 2 hours, the culture supernatant was collected, cell debris was removed by centrifugation, and a protein A agarose column (Affi-GelProtein AAPS II) equilibrated with 5 volumes of binding buffer. Kit, BioRad). The column was washed with 15 volumes of binding buffer and then eluted with 5 volumes of elution buffer. Eluate The solution was concentrated, and the buffer was changed to PBS using a microconcentrator (Centricon 100, Amicon).
  • An ELISA plate for antigen binding measurement was prepared as follows. 96 A mouse monoclonal antibody MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immu) which recognizes the 6-well plate with a human IL-16 epitope different from the epitope recognized by SK2. No_.1_8_, 951-956, 1988), and after blocking, recombinant human IL-16 was added. A sample of the chimeric SK2 antibody was serially diluted and added to each well, and then an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody (manufactured by Sigma) was added. After incubation and washing, the substrate solution was added and then the absorbance at 405 nm was measured.
  • an ELISA plate was prepared as follows. 96-well plates were prepared using the mouse monoclonal antibody MT-18 specific for human IL-16 receptor (IL-16R) (Hirata, Y. et al., J. Immunol., 14). 3, 290 00-290 7, 199 89), and after blocking, soluble recombinant human IL-6R CSR 344) (Y asuk awa, K. et al., J. B ioch em. 1 0 8, 6 7 3-6 76, 199 0) was added. Samples were serially diluted and added to each well along with the biotinylated IL-16, followed by alkaline phosphatase-bound streptavidin, and the absorbance at 405 nm was measured as described above. did.
  • Fab fragments and Fc fragments were prepared from the mouse SK2 antibody using an Immuno Pure Fab Preparation kit (Pierce), and then N-glycanase (Genzym) was prepared. Was used to prepare deglycosylated fragments.
  • the filter was applied to a panel of lectin (Lectin-Link, manufactured by Genzyme).
  • the Fd fragment from the mouse SK2 antibody exhibited bands of about 34 kd and 33 kd in SDSZPAGE, and the ratio was about 1: 1.
  • the Fd fragment deglycosylated by N-glycanase showed a molecular weight of about 29 kd, which was consistent with the value calculated from the amino acid composition of the Fd fragment.
  • the 34 kd Fd fragment and the 33 kd Fd fragment exhibited different reactivity to various lectins.
  • the Fd of 34 kd is D atura S tr onni um Agg 1 utinin (D SA) ten, Ricin ⁇ s C ommu nis A gg 1 ⁇ tinin (R CA) + ten, P haseolus V ulgaris E rythrolectin (PHA—E) + + +, Concanava 1 in A (C on A), W hea
  • the 33 kd Fd was DSA—, RCA +, PHA—E ++, ConA WCA—.
  • the mouse SK2 antibody has at least two types of N-type sugar chains in the V region of the H chain.
  • Reconstituted human SK2 antibody L chain was prepared by CDR-grafting by the PCR method. This method is schematically shown in FIG. Human antibody
  • PCR primers were used to generate reconstituted human antibody SK2 (version "aJ") with FR from REI.External primers A (SEQ ID NO: 34) and H (sequence) No .: 35) was designed to hybridize with the DNA sequence of the pUC vector.
  • SEQ ID NO: 37 and D have a sense DNA sequence and are CDR-grafting primers E (SEQ ID NO: 39), F (SEQ ID NO: 40) and G ( SEQ ID NO: 41) has an antisense DNA sequence and has a complementary DNA sequence (15-35 bp) to the DNA sequence at the 5 'end of primers B, C and D, respectively.
  • DNA was amplified (second PCR).
  • second PCR the reshaped human PM-1 antibody L chain V region bar based on FR from the human antibody REI was used. Plasmid coding for John "a" p UC— RVL— PM la-
  • PCR products A-E (187 bp), BF (87 bp), C-G (152 bp) and DH (65 bp) were combined with 1.5% low melting point agarose gel. And assembled in a second PCR. In the second PCR, l tz g of each first PCR product and 5 u of Am pli
  • a 9 8 ⁇ 1 PCR mixture containing T aq is added at 94 for 2 minutes.
  • the 39.9 bp DNA fragment generated by the second PCR was purified on a 1.5% low-melting point agarose gel, digested with BamHI and HindIII, and the resulting DNA fragment was subjected to the HEF expression vector HEF- VL. — Cloned to gk.
  • HEF—RVL—SK2a The plasmid containing the DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of aj is named HEF—RVL—SK2a.
  • the amino acid sequence and base sequence of the L chain V region contained in this plasmid HEF-RVL-SK2a are shown in SEQ ID NO: 52.
  • Version “b” of the reshaped human SK2 antibody L chain V region was generated by PCR mutagenesis.
  • the mutagenic primers FTY-1 (SEQ ID NO: 42) and FTY-2 (SEQ ID NO: 43) were designed so that phenylalanine at position 71 was mutated to tyrosine.
  • Plasmid HEF—RV1—SK2a was used as type I DNA. Purification of the final P CR product was digested with B AMH I and H ind lll, the resulting et DNA fragment HE F- expression vector HE F- V L - black to gk - training to plasmid HEF- RVL—SK 2b was obtained.
  • the amino acid sequence and the base sequence of the V region of the L chain contained in this plasmid HEF—RVL—SK2b are shown in SEQ ID NO: 53.
  • the DNA encoding the reshaped human SK2 antibody H chain V region was designed as follows.
  • the DNA sequence encoding the FRs of the human antibody DAW was ligated to the “codonusage” region of the V region (Kabat. EA et al., US Dept. Healthand Human Services, USG over nment Printing Offices, 1991).
  • the version "a" of the reshaped human SK2 antibody H chain V region was coded.
  • HindIII recognition site ZK0 ZAK consensus sequence and a BamHI recognition site Z splice donor sequence were added to the 5'-side and 3'-side of this DNA sequence, respectively, and added to the HEF expression vector. I was able to enter.
  • the DNA sequence thus designed was divided into six oligonucleotides and then analyzed for secondary structures in the oligonucleotides that could interfere with the assembly of these oligonucleotides. Analyzed overnight.
  • the six oligonucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 44-49. These oligonucleotides are 93-96 bases in length and have an overlap region of 20-24 bp. Three of the oligonucleotides, HP 1 (SEQ ID NO: 44), HP 3 (SEQ ID NO: 46) and HP 5 (SEQ ID NO: 48) have a sense DNA sequence, and The other three, HP2 (SEQ ID NO: 45), HP4 (SEQ ID NO: 47) and HP6 (SEQ ID NO: 49), have an antisense DNA sequence.
  • FIG. 7 shows a method of assembling these six oligonucleotides by the PCR method.
  • the 448 bp DNA fragment was purified using a 1.5% low melting point agarose gel, digested with Hind HI and BamHI, and then cloned into the HEF expression vector HEF- VH -gyl. .
  • the plasmid containing the DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of the H chain V region was named HEF-RVH-SK2a, and this plasmid HEF-RVH —
  • SEQ ID NO: 54 The amino acid sequence and base sequence of the H chain V region contained in SK 2a are shown in SEQ ID NO: 54. Version “bj was prepared by PCR-mediated mutagenesis.
  • Plasmid RVH—SK2a was used as type I DNA
  • the final PCR product was purified, digested with BamHI and HindIII, and Next, the plasmid was cloned into the HEF expression vector HEF—VH-gr1 to obtain plasmid HEF—RVH—SK2b H chain V contained in the plasmid HEF—RVH—SK2b
  • the amino acid sequence and base sequence of the region are shown in SEQ ID NO: 55.
  • To evaluate each chain of the reshaped human SK2 antibody first, two types of the reshaped human SK2 antibody L chain were used.
  • any of the expression vectors HE F—RVL—SK 2a (version “aj”) and HE F—RVL—SK 2b (version “b”); and chimeric SK 2 After cotransfection of COS cells with the expression vector HEF-SK2h-g71 for the body H chain as described above, and after recovering the antibody product as described above, The antigen binding assay was performed as described above.
  • FIG. 8 the chimeric antibody (ChLZChH) as a positive control, the antibody consisting of the reconstituted L chain purge ion "a” and the chimeric H chain (RVLaZChH), and the reconstituted L
  • the chain version “b” the antibody consisting of the chimeric H chain (RVL bZC hH)
  • the change of the tyrosine residue at position 71 to phenylalanine residue is It was shown to have no effect on connectivity.
  • the E. coli containing the plasmid HE F—RV L —SK 2b was Escherichiacoli DH5a (HE F-RV L
  • HE F- RV H Agency of Life Institute of Advanced Industrial Science and Technology as E. coli you containing SK 2 a
  • E scherichiacoli DH 5 a (HE F -RV "SK 2 a) ( 1-13 1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture), and on April 21, 1993, Budapest as F ERM BP—42467 and FE RM BP—42468, respectively. Deposited internationally under the treaty.
  • a combination of the reshaped human SK2 antibody light chain version “a” (RvLa) and the reshaped human SK2 antibody heavy chain version “a” (RvHa), and RvL The combination of a and RvHb shows low binding inhibitory activity, and antibodies with furalanine at position 71 in the L chain show good antigen-binding activity but re-form a functional antigen-binding site. was suggested.
  • Hybridomas producing anti-human IL-16 monoclonal antibody were obtained by using splenocytes of BAL BZc mice immunized with human IL-16 and mouse myeloma cell line P3U1 using polyethylene glycol. It was made by fusing according to the usual method. Screening was performed using the activity of inhibiting the binding between IL-16 and IL-16R as an index, and 17 clones having binding inhibiting activity were obtained. These clones were transplanted intraperitoneally into mice, and the obtained ascites was applied to a protein A agarose column to obtain purified mouse monoclonal antibodies.
  • Sequence type nucleic acid
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  • Organism name mouse and human
  • AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AGA GCA AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser
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Description

明 細 書 ヒ トイ ンターロイキン一 6に対する再構成ヒ ト抗体 技術分野
本発明は、 ヒ トイ ンターロイキン一 6 ( I L— 6 ) に対するマウ スモノ クローナル抗体 S K 2の可変領域 （V領域） とヒ ト抗体の定 常領域 （C領域） とから成るヒ ト Zマウスキメラ抗体、 ヒ トライ ト 鎖 （L鎖） V領域及びヒ トヘビー鎖 （H鎖） V領域の相補性決定領 域 （CDR) がヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クローナル抗体 S K 2の CD Rにより置き換えられている再構成 （ r e s h e p e d) ヒ ト抗体およびそれらの抗体を構成する L鎖または H鎖に関する。 本発明はさらに、 上記の抗体特にその V領域をコー ドする DNA を提供する。 本発明はさらに、 前記 DNAを含んで成るベクター、 特に発現ベクター、 並びに該ベクターにより形質転換された宿主に 関する。 本発明はさらに、 ヒ ト I L一 6に対するキメラ抗体の製造 方法、 及びヒ ト I L一 6に対する再構成ヒ ト抗体の製造方法を提供 する。 背景技術
イ ンターロイキン一 6 ( I L - 6 ) は一連の細胞により生産され る多機能サイ トカインである。 このものは免疫応答、 急性期反応及 び造血を調節し、 そして宿主防御機構において中心的役割を演ずる (K i s h i m o t oら、 B l o o d, 7 4 , 1 — 1 0, 1 9 8 9 ) このものは広範な組織に作用して、 標的細胞の性質に応じて成長誘 導効果、 成長阻害効果及び分化誘導効果を発揮する。
I L一 6遺伝子の異常発現が種々の疾患、 特に自己免疫疾患、 メ サンジゥム細胞増殖性糸球体腎炎、 及び形質細胞腫 骨髄腫の発病 に関与することが示唆されている （H i r a n oら、 I mmu n o 1. T o d a y, 1 1 , 4 4 3 - 4 4 9, 1 9 9 0 ; C l e i n, B . ら、 E u r . C y t o k i n e N e t . 1， 1 9 3 - 2 0 1 1 9 9 0 ) 。 従って、 I L一 6の機能を阻害する抗体はヒ ト患者に おける治療剤として有用であることが期待される。
現に、 形質細胞腫を有する末期患者を治療するためにヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クローナル抗体を用いた臨床研究において、 形質細胞腫細胞の増殖のブロッ ク、 並びに循環 M蛋白質、 血清カル シゥム、 血清 I g G及び C一反応性蛋白質の低下が示された （K 1 e i n, B . ら、 B l o o d, 7 8, 1 1 9 8— 1 2 0 4， 1 9 9 l ; K l e i n, Bら、 R e s . I mmu n o l . , 1 4 3, 7 7 4 - 7 7 6 , 1 9 9 2 ) ο
マウスのモノ クローナル抗体はヒ トにおいて高度に免疫原性 ( 「抗原性」 という場合もある） があり、 そしてこの理由のため、 ヒ トにおけるそれらの療法的価値は制限される。 さらに、 マウス抗 体は、 予定された効果を妨害するのみならず、 患者における不都合 なァレルギ一応答の危険をもたらす免疫応答を惹起することなく し て頻回投与することはできない。
これらの問題を解決するため、 ヒ ト型化 （h um a n i z e d) 抗体の製造方法が開発された。 マウス抗体は 2つの方法でヒ ト型化 することができる。 より簡単な方法は、 可変領域がもとのマウスモ ノ クローナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒ ト抗体に由来 するキメラ抗体を作製する方法である。 得られるキメラ抗体はもと のマウス抗体の完全な可変領域を含有し、 そしてもとのマウス抗体 と同一の特異性をもって抗原に結合することを期待することができ る o さらに、 キメラ抗体ではヒ ト以外に由来する蛋白質配列の比率が 実質的に減少しており、 そしてそれ故にもとのマウス抗体に比べて 免疫原性が低いと予想される。 キメラ抗体は抗原によく結合しそし て免疫原性が低いが、 マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ず る可能性がある （L o B u g l i oら、 P r o c . N a t l . A c a d. S c i . U SA, 8 4 , 4 2 2 0 - 4 2 2 4 , 1 9 8 9 ) 。 マウス抗体をヒ ト型化するための第二の方法は一層複雑であるが. しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさらに大幅に低下させるも のである。 この方法においては、 マウス抗体の可変領域からの相補 性決定領域 ( c omp l e m e n t a r i t y d e t e r m i n i n g r e g i o n ; CDR) をヒ ト抗体可変領域に移植して 「再構成」 ( r e s h a p e d) ヒ ト抗体可変領域を作製する。
次に、 これらの再構成ヒ ト可変領域をヒ ト抗体定常領域に連結す る。 最終的に再構成されたヒ ト型抗体のヒ ト以外の蛋白質配列に由 来する部分は C D Rと極く一部のフ レームワーク （FR) のみであ る。 CDRは超可変蛋白質配列により構成されている。 これらは種 特異的配列を示さない。 これらの理由のため、 マウス C DRを担持 する再構成ヒ ト抗体はもはやヒ ト CDRを含有する天然ヒ ト抗体よ り強い免疫原性を有しないはずである。
再構成ヒ ト抗体についてはさらに、 R i c hm a n n, L . ら、 N a t u r e, 3_2 2, 3 2 3— 3 2 7, 1 9 8 8 ; V e r h o e y e , M. ら、 S c i e n c e, 2 3 9 , 1 5 3 4 - 1 5 3 6 , 1 9 8 8 ; K e t t l e b o r o u g h, C . A. ら、 P r o t e i n E n g n g . ±, 7 7 3 - 7 8 3， 1 9 9 1 ； a e d a, H ら、 Hum a n An t i b o d i e s a n d H y b r i d o m a , 2, 1 2 4 - 1 3 4 , 1 9 9 1 ; G o r m a n, S . G . ら P r o c . N a t l . A c a d. S c i . US A, 8 8， 4 1 8 1 - 4 1 8 5 , 1 9 9 1 ； T e m p e r t , P. R. ら、 B i oZT e c h n o l o g y, 9， 2 6 6 - 2 7 1 , 1 9 9 1 ； C o , M. S. ら、 P r o c . N a t l . A c a d. S c に USA, 8 8 , 2 8 6 9 - 2 8 7 3 , 1 9 9 1 ； C a r t e r , P. ら、 P r o c . N a t l . A c a d. S c i . U SA, 8 9 , 4 2 8 5 - 4 2 8 9 , 1 9 9 2 ； C o . M. N. ら、 J. I mmu n o l . 1 4 7, 1 1 4 9 - 1 1 5 4 , 1 9 9 2 ;及び S a t o, K. ら、 C a n c e r R e s . _5 3 , 1 — 6 , 1 9 9 3を参照のこと。 発明の開示
前記のごとく、 再構成ヒ ト抗体は治療目的のために有用であると 予想されるが、 ヒ ト I L一 6に対する再構成ヒ ト抗体は知られてい ない。 さらに、 再構成ヒ ト抗体の製造方法であって任意の特定の抗 体に普遍的に適用し得る方法は存在しない。 従って、 特定の抗原に 対して十分に活性がある再構成ヒ ト抗体を作製するためには種々の 工夫が必要である （例えば、 S a t o, K. ら、 C a n c e r R e s . 5 3 , 8 5 1 - 8 5 6 ( 1 9 9 3 ) ) 0
本発明者らはヒ ト I L一 6に対するマウスモノ ク口一ナル抗体 S Κ 2が i n v i v o動物実験で I L一 6の機能を強く阻害し、 従 つて、 I L一 6関連疾患に対する治療剤として期待できることを見 い出した （S a i t o, H. ら、 第 2 1回日本免疫学会総会、 学術 集会記録、 _^J_, 1 1 6 , 1 9 9 1 ) 。 従って、 本発明は、 ヒ ト I L一 6に対する、 免疫原性の低い抗体を提供しょう とするものであ る
従って、 本発明はヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クローナル抗 体 S K 2の再構成ヒ ト抗体に関する。 本発明はまた、 該再構成ヒ ト 抗体の作製の過程で有用なヒ ト マウスキメラ抗体を提供する。 本 発明はさらに、 マウスモノ クローナル抗体 SK 2の再構成ヒ ト抗体 並びにキメラ抗体の製造のための遺伝子工学的方法に関する。
具体的には、 本発明は、
( 1 ) ヒ ト抗体 L鎖 C領域、 及びヒ ト I L一 6に対するマウスモ ノ クローナル抗体 SK 2の L鎖 V領域を含んで成る L鎖 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト抗体 H鎖 C領域、 及びヒ ト I L一 6に対するマウスモ ノ クローナル抗体 SK 2の H鎖 V領域を含んで成る H鎖 ；
を含んで成る、 ヒ ト I L一 6に対するキメラ抗体、 さらには、
( 1 ) ヒ ト抗体 L鎖 V領域のフ レームワーク領域 （FR) 、 及び
( 2) ヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クローナル抗体 S K 2の L鎖 V領域の CDR、
を含んで成る、 再構成ヒ ト L鎖 V領域 ； 並びに
( 1 ) ヒ ト抗体 H鎖 V領域の F R、 及び
( 2) ヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クローナル抗体 SK 2の H鎖 V領域の CDR、
を含んで成る、 再構成ヒ ト H鎖 V領域から構成されるヒ ト I L一 6 に対するマウスモノ クローナル抗体 SK 2の再構成ヒ ト抗体に関す ο
本発明はまた、 前記種々の抗体を構成する L鎖または H鎖のポリ ペプチ ド、 およびそれらをコー ドする DNAに関する。
さらに、 本発明は、 上記 DNAを含んで成る発現べクタ一および それら発現ベクターにより形質転換された宿主に関する。
本発明はさらにまた、 ヒ ト I L一 6に対するキメラ抗体の製造方 法、 及びヒ ト I L一 6に対する再構成ヒ ト抗体の製造方法に関する, 図面の簡単な説明
図 1は、 それぞれ L鎖及び H鎖の発現のために有用な、 ヒ ト E F I一ひプロモータ一 Zェンハンサ一を含んで成る発現プラスミ ド H E F - VL 一 g k及び HE F— VH — g T lを示す。
図 2は、 本発明の抗体ペプチ ドの発現のために有用な、 ヒ トサイ トメガロウィルス （HCMV) プロモーター Zェンハンサ一系を含 んで成る発現ベクターを示す。
図 3は、 S K 2抗体がグリ コシル化されていることを示す電気泳 動図である。
図 4は、 ヒ ト I L一 6に結合する本発明のキメラ抗体の能力の確 認のための E L I S Aの結果を示すグラフである。
図 5は、 ヒ ト I L一 6への I L一 6の結合を阻害する本発明のキ メラ抗体の能力の確認のための E L I S Aの結果を示すグラフであ る。
図 6は、 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖 V領域の第一パージヨ ン （バ 一ジョ ン 「aJ ) の作製のダイヤグラムである。
図 7は、 再構成ヒ ト S K 2抗体 H鎖 V領域の第一パージヨ ン （バ 一ジョ ン 「a」 ） の作製のダイヤグラムである。
図 8は、 ヒ ト I L一 6への結合についての、 再構成ヒ ト L鎖+キ メラ H鎖から成る抗体の能力を示すグラフである。
図 9は、 ヒ ト I L一 6への結合についての、 本発明の 4種類の再 構成ヒ ト SK 2抗体の能力をキメラ抗体のそれと比較して示すグラ フである。
図 1 0は、 I L一 6 Rへの I L一 6の結合を阻害する本発明の 4 種類の再構成ヒ ト化 SK 2抗体の能力を、 SK 2キメラ抗体及びマ ウスモノ クローナル抗体 SK 2のそれと比較して示すグラフである, 発明を実施するための具体的な形態
マウス抗体 V領域をコ一 ドする DNAのクローニング
ヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クローナル抗体の V領域をコ一 ドする DNAをクローン化するためには、 マウスモノ クローナル抗 体產生細胞から全 RN Aを調製した後、 既知の方法により一本鎖 c DNAに変換し、 ボリ メラーゼ連鎖反応 （P CR) 法を用いて、 目 的とする DNAを増幅することで得られる。 この全 RNAの供給源 として、 ヒ ト I L一 6に対するモノ クローナル抗体を生産するハイ プリ ドーマを作製することが必要である。 この様なハイプリ ドーマ として、 S K 2を挙げることができる。 ハイプリ ドーマ SK 2の作 製方法を参考例 1に後記する。
( 1 ) 全 RN Aの採取
本発明において、 全 RNAを採取するため、 ハイプリ ドーマ細胞 を破壊し、 グァニジンチオシァネー ト処理後、 塩化セシウム密度勾 配 is 、を行った （ c h i r gw i nら、 B i o c h em i s t r y, 1 8 , 5 2 9 4 , 1 9 7 9 ) が、 すでに他の蛋白質の遣伝子をクロ 一二ングする際に用いられた方法、 例えばバナジウム複合体等のリ ボヌク レアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、 フヱノール 処理を行う （B e r g e r & B i r k e nm e i e r, B i o c h em i s t r y, 1 8 , 5 1 4 3, 1 9 7 9 ) 方法を用いるこ とができる。
( 2 ) —本鎖 c DN Αの採取
上記の如く して得た全 RNAから一本鎖 DN Aを得るには、 全 R N Aを铸型にして、 その 3 ' 末端にある p 0 1 y A鎖に相補的なォ リゴ （d T) をプライマーとして逆転写酵素で処理して全 RNAに 相補的な一本鎖 DNA ( c DNA) を合成する （L a r r i k, J W. ら、 B i o t e c h n o l o g y, 7, 9 3 4, 1 9 8 9 ) こ とができる。 また、 その時に、 ランダムプライマーを用いてもよい t
( 3 ) ポリ メラーゼ連鎖反応 ( P C R ) 法によるマウス抗体 V領 域の増幅
次にポリ メラ一ゼ連鎖反応 （P CR) 法を用いて前記 c DN Aか らマウス抗体 V領域の特異的増幅を行う。 マウス抗体 V領域の増幅 には、 J o n e s , S. T . ら B i o t e c h n o l o g y, _9_, 8 8— 8 9 , 1 9 9 1 に記載されているプライマ一を用いることが できる。 ハイプリ ドーマ S K 2が産生するマウスモノ クロ一ナル抗 体 S K 2のクローニングに用いるプライマーを決定するにあたり、 H鎖および L鎖のタイ ビングをして両鎖の型を決める必要がある。 マウスモノ クローナル抗体アイソタイ ピングキッ ト （アマシャム インタ一ナショナル p 1 c社製） を用いて、 S K 2抗体のタイ ピン グを行った結果、 S K 2抗体は / 型 L鎖および 1型の H鎖を有 することが明らかになった。 S K 2のタイ ピングについて参考例 2 に後記する。
次に、 ボリ メラーゼ連鎖反応 （P CR) 法を用いてマウスモノ ク ローナル抗体のカッパ （ ) 型 L鎖 V領域を増幅するため、 配列番 号 ： 1〜 1 1 に示す 1 1種のオリゴヌ ク レオチ ドプライマ一 （Mo u s e K a p p a V a r i a b 1 e ； M K V ) 及び配列番号 ： 1 2に示すオリゴヌク レオチ ドプライマー （Mo u s e K a p p a C o n s t a n t ; MKC) をそれぞれ 5 ' —末端プライマー 及び 3 ' —末端プライマーとして使用する。
前記 MKVプライマーはマウスカッパ型 L鎖リーダー配列をコー ドする DNA配列とハイブリダィズし、 そして前記 MKCプライマ —はマウスカ ッパ型 L鎖 C領域をコー ドする DN A配列とハイプリ ダイズする。
マウスモノ クローナル抗体の H鎖 V領域の増幅のため、 配列番号 1 3〜2 4に示す 1 2種のオリゴヌ ク レオチ ドプライマ一 （Mo u s e H e a v y V a r i a b 1 e ； M H V ) 及び配列番号 ： 2 5に示すオリゴヌク レオチ ドプライマー （Mo u s e H e a v y
C o n s t a n t ； MHO をそれぞれ 5 ' —末端プライマ一及 び 3 ' —末端プライマ一として使用する。
なお、 本実施例では 5 ' —末端プライマーはその 5 ' —末端近傍 に制限酵素 S a 1 I切断部位を提供する配列 G T C G A Cを含有し. そして 3 ' —末端プライマ一はその 5 ' —末端近傍に制限酵素 Xm a I切断部位を提供するヌ ク レオチ ド配列 C C C G G Gを含有する ものを使用している。 これらの制限酵素切断部位は可変領域をコ一 ドする目的の DNA断片をクローニングベクターにサブクロ一ニン グするために用いられる限り、 他の制限酵素切断部位でもよい。
次に、 マウスモノ クローナル抗体の目的とする可変領域をコー ド する DNA断片を得るために、 増幅生成物を制限酵素 S a 1 I及び Xm a Iで切断した後、 低融点ァガロースまたはカラム 〔P CR産 物精製用キッ ト （Q I AGEN等） 、 DNA精製用キッ ト （GEN E C L EANII等） など〕 により、 分離 · 精製を行う。 他方、 ブラ スミ ド p UC l 9のごとき適当なクローニングベクターを同じ制限 酵素 S a 1 I及び Xm a Iにより切断させ、 この p UC l 9に前記 DN A断片を連結することにより、 マウスモノ クローナル抗体の目 的とする可変領域をコー ドする DN A断片を含むプラスミ ドを得る < クローン化された DN Aの配列決定は任意の常法例えば、 シーク エネ一ス バージョ ン 2. 0 (ユナイテッ ドステイツバイオケミ カ ルコーポレーショ ン社製） を用いて行う ことができる。
目的とする DNAのクローン化及びその配列決定を実施例 1及び 2に具体的に記載する。 相補性決定領域 （C DR)
L鎖及び H鎖の各対の V領域は抗原結合部位を形成する。 L鎖及 び H鎖上の可変領域は共通性のある比較的保存された 4個のフ レー ムワークと 3個の超可変又は相補性決定領域 （CDR) により連結 されている （K a b a t , E . A. ら、 「 S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I mmu n o l o g i c a l I n t e r e s t」 ， US D e p t . H e a l t h a n d H um a n S e r v i c e s 1 9 8 3 ) 。
前記 4個のフ レームワーク領域 （FR) の多くの部分は ; δ—シ一 ト構造をとり、 その結果 3個の CDRはループを形成する。 CDR はある場合には /5—シー ト構造の一部分を形成することもある。 3 個の C DRは F Rによって相互に立体的に非常に近い位置に保持さ れ、 そして対をなす領域の 3個の C DRと共に抗原結合部位の形成 に寄与する。
これらの CD R領域は、 得られた抗体の V領域のアミ ノ酸配列と 既知抗体の V領域の既知ァミ ノ酸配列とを照合することによって、 K a b a t , E . A. ら、 「S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I mmu n o l o g i c a l I n t e r e s t J の経験則から見出すことができ、 実施例 3において具体的に説明す る
キメラ抗体の作製
ヒ ト I L一 6に対する抗体の再構成ヒ ト V領域を設計するに先立 つて、 使用する C D Rが実際に抗原結合領域を形成することを確か める必要がある。 この目的のため、 キメラ抗体を作製した。 さらに 実施例 1 に記載されるモノ クローナル抗体 S K 2のクローン化され た DNAのヌク レオチ ド配列から推定されるマウス抗ヒ ト I L一 6 抗体のア ミ ノ酸配列を既知のマウス及びヒ トの抗体の V領域と比較 した。
モノ ク ローナル抗体 S K 2のマウス L鎖及び H鎖 V領域をコー ド する D N A断片がクローニングされれば、 これらのマウス V領域を ヒ ト抗体定常領域をコー ドする D N Aと連結して発現させることに よってキメラ抗ヒ ト I L一 6抗体が得られる。
キヌラ抗体を作製するための基本的な方法は、 クローン化された c D N Aに存在するマウスリーダー配列及び V領域配列を、 哺乳類 細胞発現ベクター中にすでに存在するヒ ト抗体 C領域をコー ドする 配列に連結することを含んで成る。
前記ヒ ト抗体 C領域は任意のヒ ト L鎖 C領域およびヒ ト H鎖 C領 域であることができ、 例えばヒ ト L鎖 C あるいは H鎖 C γ 1 や C r 4を各々挙げることができる。
キメラ抗体の製造のためには 2種類の発現べクタ一、 すなわちェ ンハンサー プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のも とでマウス L鎖 V領域及びヒ ト L鎖 C領域^コー ドする D N Aを含 んで成る発現ベクター、 並びにェンハンサー Zプロモータ一系のご とき発現制御領域のもとでマウス H鎖 V領域及びヒ ト H鎖 C領域を コー ドする D N Aを含んで成る発現ベクターを作製する。 次に、 こ れらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質 転換し、 そして形質転換された細胞をィンービトロ又はイ ンービボ で培養してキメラ抗体を製造する （例えば W O 9 1 — 1 6 9 2 8 ) , あるいは、 マウス L鎖 V領域及びヒ ト L鎖 C領域をコー ドする D N A並びにマウス H鎖 V領域及びヒ ト H鎖 C領域をコー ドする D N Aを単一の発現べクターに導入し、 そして該ベクターを用いて宿主 細胞を形質転換し、 次にこの形質転換された宿主をィンー ビボ又は イ ンービトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。
キメラ抗体の作製を実施例 4 に記載する。 マウス S K 2 型 L鎖リーダー領域及び V領域をコー ドする c D NAを P CR法を用いてサブクローンし、 ヒ トゲノム L鎖 C /c鎖領 域をコー ドする DNAを含有する発現べクターに連結する。 マウス SK 2抗体の " 1型 H鎖リーダ一及び V領域をコー ドする c DNA を、 P C R法を用いてサブクローン化し、 ヒ ト ？ "一 1 C領域をコ一 ドするゲノム DN Aを含有する発現べクターに連結する。
特に設計された P CRプライマーを用いて、 マウス SK 2の V領 域をコー ドする c DNAをそれらの 5 ' —及び 3 ' —末端において 適当な塩基配列を導入して、 それらが発現ベクターに容易に挿入さ れるように、 且つそれらが該発現べクター中で適切に機能するよう にした （例えば、 本発明では K 0 z a k配列の導入により転写効率 を上げるように工夫されている） 。 次に、 これらのプライマーを用 いて P CRにより増幅して得たマウス S K 2の V領域を、 所望のヒ ト C領域をすでに含有する HE F発現ベクター （図 1 ) に挿入した, これらのベクターは、 種々の哺乳類細胞系における遗伝子操作され た抗体の一過性 （ t r a n s i e n t ) 発現又は安定な発現のため に適当である。
マウス S K 2抗体中に存在する V領域と同じ V領域を有するキメ ラ S K 2抗体の作製に加えて、 キメラ S K 2抗体の第二のバージョ ン （NTS) を作製した。 キメラ SK 2抗体 NTSにおいては、 H 鎖 V領域中の位置 3 0のアミ ノ酸がァスパラギンからセリ ンに変え られている。
マウス H鎖サブグループ I (F i s c hm a n n, T. 0. ら、 J . B i o l . C h e m. 2 6 6, 1 2 9 1 5, 1 9 9 1 ) に属す るマウス H鎖 V領域においては、 位置 3 0の最も典型的なア ミ ノ酸 はセリ ンである （K a b a t， E. A. ら、 US D e p t H e a 1 t h a n d Hum a n S e r v i c e s US G o v e r n m e n t P r i n t i n g O f f i c e s , 1 9 9 1 ) ( マウス S K 2抗体の H鎖 V領域中の位置 3 0に非典型的なァ ミ ノ 酸であるァスパラギンを有することの重要性を評価するため、 位置 3 0を典型的なア ミ ノ酸であるセリ ンに変えた。 この変更は、 P C R—変異誘発法 （M. K amm a nら、 Nu c 1. A c i d s R e s . 1 5, 5 4 0 4 , 1 9 8 9 ) を用いて H鎖 V領域をコー ドす る DN A配列中に必要な変更を行う ことにより達成された。 キメラ S K 2抗体は、 もとの S K 2抗体と同様に H鎖 V領域の位置 3 0に グリ コシル化部位を有するのに対して、 変異型キメラ SK 2抗体 N TSはグリ コシル化部位を有しない。
キメラ SK 2抗体はヒ ト I L一 6に結合する活性を示した。 キメ ラ SK 2抗体 NTSも同様にヒ ト I L— 6に結合する。 従って正し いマウス V領域がクローン化されそして配列が決定されていたこと が示された。 また、 SK 2抗体 H鎖 V領域のグリ コシル化は、 SK 2抗体の結合活性のためには必要でないことが示された。
再構成ヒ トの抗体の構築
マウスモノ クローナル抗体の CDRがヒ ト抗体に移植されている 再構成ヒ ト抗体を作製するためには、 マウスモノ クローナル抗体の F Rとヒ ト抗体の F Rとの間に高い相同性が存在することが望ま し い。 従って、 マウス SK 2抗体の L鎖及び H鎖の V領域を、 P r o t e i n D a t a B a n kを用いて構造が解明されているすべ ての既知抗体の V領域と比較した。 その結果を表 1にまとめる。
表 1
マウス S K 2抗体 V領域と種々のサブグル プの
ヒ ト V領域のコ ンセンサス配列との間の同 性 （％)
A. L鎖 V領域
H S G I HS GII H S G III H S G IV
S K 2 60.3% 51.3% 56.0% 56.6%
B. H鎖 V領域
H S G I H S G II H S G III S K 2 36.2% 59.2% 44.7% マウス S K 2の L鎖 V領域はヒ ト L鎖 V領域のサブグループ I (H S G I ) のコンセンサス配列に最も類似しており、 6 0. 3 % の相同性が存在する。 マウス S K 2の H鎖 V領域はヒ ト H鎖 V領域 のサブグループ II (HS GII) のコンセンサス配列に最も類似して おり、 5 9. 2 %の相同性が存在する。
ヒ ト抗体中の V領域との比較から、 再構成ヒ ト S K 2抗体 V領域 の設計の基礎となるヒ ト V領域の FRを選択することが可能である, 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖 V領域の設計のためにはサブグループ I (S G I ) に属するヒ ト L鎖 V領域を使用し、 そして再構成ヒ ト S K 2抗体 H鎖 V領域の設計のためにはサブグループ II (S GII) に 属するヒ ト抗体 H鎖 V領域を用いるのがよく、 さらにサブグループ 内で、 できるだけ相同性の高いものを選ぶことが最善であろう （K a b a t , E. A. ら、 U S D e p. H e a l t h a n d H υ m a n S e r v i c e s , US G o v e r nm e n t P r i n t i n g O f f i c e s , 1 9 9 1 ) 。
再構成ヒ ト S K 2抗体 V領域の設計
再構成ヒ ト S K 2抗体 V領域の設計における第一段階は、 設計の 基礎となるヒ ト抗体 V領域を選択することであった。 マウス S K 2 抗体 L鎖 V領域は、 サブグループ I に属するヒ ト Λ型抗体 L鎖 V領 域に最も類似していた （表 1 ) 。 マウス S K 2抗体の L鎖 V領域は 既知ヒ ト抗体 L鎖 V領域との比較において、 ヒ ト L鎖 V領域のサブ グループ Iの 1構成員であるヒ ト L鎖 V領域 R E I に 6 3 %の類似 性を示した。 従って、 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖 V領域の作製のた めの出発材料として R E Iの F Rを使用した。
再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖 V領域の 2つのバージ ョ ンを設計した < 第一のバージ ョ ン （バージ ョ ン 「 a j ) においては、 ヒ ト F Rは再 構成ヒ ト CAMPATH— 1 H抗体中に存在する R E I に基く F R (R i e c hm a n n, L. ら、 N a t u r e 3 2 2, 2 1〜 2 5 , 1 9 8 8 ) (WO 9 2— 1 9 7 5 9に記載の再構成ヒ ト PM— 1の L鎖 V領域のバージョ ン 「a」 ） と同一であり、 そしてマウス C DRはマウス S K 2の L鎖 V領域中の C DRと同一とした。 第二 のバージョ ン （バージョ ン 「b」 ） はバージョ ン 「 a」 と比べて、 ヒ ト F R 3中の位置 7 1 におけるアミ ノ酸 1個のみを異にする。 すなわちバージョ ン 「 a j の設計に使用した修飾された R E Iの F Rにおいては位置 7 1 はフエ二ルァラニンであるのに対し、 バー ジョ ン 「b j においては、 位置 7 1のフエ二ルァラニンがマウス S K 2抗体 L鎖 V領域中に見出されるようにチロシンに変えられてい る。 表 2は、 マウス S K 2抗体の L鎖 V領域、 R E Iの F R及び再 構成 S K 2抗体の L鎖 V領域の 2種類のバージョ ンの、 それぞれの ァ ミ ノ酸配列を示す。
表 2
FR1 CDR1
1 2 3
12345678901234567890123 45678901234
VLSK2 DIQ TQSPASLSVSVGBTVTITC RASBNIYSNLA
REI DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RVLa DIQ TQSPSSLSASVGDRVTITC RASENIYSNLA
RVLb
FR2 CDR2
4 5
567890123456789 0123456
VLSK2 WYQQKQGKSPQLLVY AATYLAD
REI WYQQKPGKAPKLLIY RVLa WYQQ PGKAPKLLIY AATYLAD
RVLb
FR3 CDR3
6 7 8 9
78901234567890123456789012345678 901234567
VLSK2 GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYC QHFWGTPP- REI GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC
RVLa GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHFWGTPP-
RVLb Y
RF4
1
0
8901234567
VLSK2 FGSGT LEIK
REI FGQGT VEIK RVLa FGQGTKVBI
RVLb 注 ： R E Iの FR中の 5個の下線を付したァミ ノ酸はヒ ト R E I のァミ ノ酸配列 （P a l m, W. ら、 H o p p e— S e y l e r ' s， Z . P h y s i o l . C h em. ， 3 5 6 , 1 6 7 - 1 9 1 , 1 9 7 5 ) とは異なるアミ ノ酸の位置を示す。
マウス S K 2抗体の H鎖 V領域中の F Rはサブグループ IIに属す るヒ ト H鎖 V領域に最も類似している （表 1 ) 。 マウス S K 2抗体 の H鎖 V領域は既知のヒ ト抗体 H鎖 V領域との比較において、 ヒ ト H鎖 V領域のサブグループ IIの 1構成員であるヒ ト H鎖 V領域 D A W (P r e s s , E . M. ら、 B i o c h em. J . 1 1 7 , 6 4 1 , 1 9 7 0 ) に非常に類似していた （ 6 0. 8 %) 。 さらには、 CDRのサイズもマウス S K 2抗体とヒ ト抗体 DAWとの間で非常 に類似していた。 このため、 ヒ ト抗体 DAWの FRを、 再構成ヒ ト S K 2抗体の H鎖 V領域の作製のための出発材料として用いた。
再構成ヒ ト S K 2抗体 H鎖 V領域の 2種類のバージョ ンを設計し た。 バージョ ン 「 a」 においては FRは DAWのそれと同じであり. バージョ ン 「 b」 においてはヒ ト F R 1 中の 3 0位のみが異つてい る。 すなわち、 バージョ ン 「 a J においては 3 0位のアミ ノ酸はセ リ ンであり、 バージョ ン Γ b J の 3 0位のアミ ノ酸はァスパラギン である。
表 3は、 マウス S K 2抗体 H鎖 V領域、 DAWの F R、 並びに再 構成 S K 2抗体 H鎖 V領域のバージョ ン 「 a」 及び 「b」 のァミ ノ 酸配列を示す。
表 3
FR1 CDR1 FR2 j 9 3
123456789012345678901234567890 1234555 67890123456789
AB
VHSK2 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLN TSG TVG WIRQPSGKGLEWLA DAW QVTLRESGPALVRPTQTLTLTCTFSGFSLS WIRQPPGEALEWLA RVHa QVTLRESGPALVRPTQTLTLTCTFSGFSLS TSGMTVG WIRQPPGEALEWLA RVHb N
CDR2 FR3
5 6 7 8 9
0123456789012345 67890123456789012222345678901234
ABC
VHSK2 HIWWNDDKYYNPAL G RLTISKDTSNNQVFL IASVVTADTATYYCAR DAW RLAVSKDTSKNQVVLSMNTVGPGDTATYYCAR RVHa HIWWNDDKYYNPALKG RLAVS DTSKNQVVLSMNTVGPGDTATYYCAR RVHb
CDR3 FR4
1 1
0 1
5678900012 34567890123
AB
VHSK2 MEDYDEA DY WGQGTSVTVSS
DAW WGQGILVTVSS
RVHa MEDYDEAMDY WGQGILVTVSS
RVHb 再構成ヒ ト S K 2抗体の作製
再構成ヒ ト S K抗体 V領域の作製を実施例 5に具体的に記載する, 本発明の再構成ヒ ト S K 2抗体は、
(A) ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及び
( 2 ) ヒ ト L鎖 FR、 及びヒ ト I L一 6に対するマウスモ ノ クローナル抗体 S K 2の L鎖 V領域 CDRを含んで成る L鎖 V領 域、 を含んで成る L鎖 ； 並びに
(B) ( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域、 及び
( 2 ) ヒ ト H鎖 FR、 及びヒ ト I L一 6に対するマウスモ ノ クローナル抗体 S K 2の H鎖 V領域 CDRを含んで成る H鎖 V領 域、 を含んで成る H鎖 ； から構成される。
好ま しい態様においては、 前記 L鎖 V領域は配列番号 5 2又は 5 3に示されるア ミ ノ酸配列を有し、 前記 H鎖 V領域は配列番号 5 4 又は 5 5に示されるア ミ ノ酸配列を有する。 前記ヒ ト L鎖 C領域は 任意のヒ ト L鎖 C領域であることができ、 例えばヒ ト C領域であ り ； そして前記ヒ ト H鎖 C領域は任意のヒ ト H鎖 C領域であること ができ、 例えばビト γ— 1 C領域、 ヒ ト 7— 4 C領域等である。 再構成抗体の製造のためには、 2種類の発現ベクター、 すなわち ェンハンサー Ζプロモーター系のごとき発現制御領域による制御の もとに前に定義した再構成ヒ ト L鎖をコー ドする D N Aを含んで成 る発現ベクター、 及びェンハンサ一 Ζプロモーター系のごとき発現 制御領域のもとに前に定義した再構成ヒ ト Η鎖をコー ドする D N A を含んで成るもう一つの発現ベクターを作製する。 次に、 これらの 発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換 し、 そしてこの形質転換された細胞をィンービボ又はインービトロ で培養して再構成ヒ ト抗体を生産せしめる （例えば、 W O 9 1 — 1 6 9 2 7 ) ο
あるいは、 再構成 L鎖をコー ドする D N Α及び再構成ヒ ト H鎖を コー ドする D N Aを単一の発現べクターに導入し、 そしてこのべク ターを用いて宿主を形質転換し、 次にこの形質転換された宿主細胞 をインー ビボ又はイン一ビトロで培養して目的とする再構成ヒ ト抗 体を生産せしめる。
以上のようにして目的とするキメラ抗体あるいはヒ ト型化抗体を コー ドする遣伝子で形質転換した形質転換体を培養し、 産生したキ メラ抗体あるいはヒ ト型化抗体は、 細胞内または細胞外から分離し 均一にまで精製することができる。
なお、 本発明の目的蛋白質であるキメラ抗体あるいはヒ ト型化抗 体の分離 ' 精製を、 プロテイ ン Aァガロースカラムを用いて行う こ とができる。 また、 その他に、 通常の蛋白質で用いられる分離 · 精 製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば各 種クロマ トグラフィー、 限外滤過、 塩折、 透析等を適宜選択、 組合 せれば、 キメラ抗体あるいはヒ ト型化抗体は分離 · 精製することが できる。
ヒ ト I L一 6に対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒ ト抗体の 製造のために任意の発現系、 例えば真核細胞、 例えば動物細胞、 例 えば樹立された哺乳類細胞系、 真糸状菌細胞、 及び酵母細胞、 並び に原核細胞、 例えば細菌細胞、 例えば大腸菌細胞等を使用すること ができる。 好ましく は、 本発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳 類紬胞、 例えば C 0 S細胞又は C H 0細胞中で発現される。
これらの場合、 哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモ 一夕一を用いることができる。 例えば、 ヒ ト ' サイ トメガロウィル ス 期 （h um a n c y t om e g a l o v i r u s i mm e d i a t e e a r 1 y ; H C M V ) プロモーターを使用するのが 好ま しい。 HCMVプロモーターを含有する発現ベクターの例には. H C MV - V„ - H C r 1 , H C MV - VL 一 H C k 等であって、 p S V 2 n e oに由来するもの （図 2を参照のこと） （W09 2— 1 9 7 5 9 ) が含まれる。
また、 その他に、 本発明のために用いることのできる哺乳動物細 胞における遺伝子発現のプロモータ一としてはレ トロウイルス、 ポ リオ一マウィルス、 アデノウイルス、 シミアンウィルス 4 0 ( S V 4 0 ) などのウィルスプロモーターゃヒ ト · ポリペプチ ド · チェ一 ン ' ェロンゲーシヨ ン ' ファクター l a (HE F— 1 ひ） などの哺 乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。 例えば S V 4 0の プロモーターを使用する場合は、 Mu 1 1 i g a nらの方法 （N a t u r e 2 7 7 1 0 8 ( 1 9 7 9 ) ) 、 また、 HE F— l aプ 口モーターを使用する場合は、 M i z u s h i m a, S . らの方法
(Nu c l e i c A c i d s R e s e a r c h, 1 8 , 5 3 2 2 , 1 9 9 0 ) に従えば容易に実施することができる。
複製起原としては、 SV 4 0、 ポリオ一マウィルス、 アデノウィ ルス、 牛パピローマウィルス （B PV) 等の由来のものを用いるこ とができ、 さらに宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、 発 現ベクターは選択マーカ一として、 ホスホ トランスフェラーゼ Α Ρ Η ( 3 ' ) IIあるいは I (n e 0 ) 遣伝子、 チミ ジンキナーゼ （T K) 遣伝子、 大腸菌キサンチンーグァニンホスホリボシルトランス フェラーゼ （E c o g p t ) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （DH FR) 遺伝子等を含むことができる。 実施例
次に、 本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、 これに より本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例 1. ヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クローナル抗体の V 領域をコ一ドする DNAのクローン化
ヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クローナル抗体 S K 2の可変領 域をコー ドする DN Aを次の様にしてクローン化した。
1. 全 R N Aの調製
ハイブリ ドーマ SK 2からの全 RNAを、 C h i r g w i nら、 B i o c h em i s t r y, 1 8, 5 2 9 4 ( 1 9 7 9 ) により記 載されている方法に従って調製した。 すなわち、 ハイプリ ドーマ S K 2の細胞を 2 Omlの 4 Mグァニジンチオシァネー ト （F u 1 k a ) 中で完全にホモジナイズさせた。 ホモジネー トを遠心管中の 5. 3 M塩化セシウム溶液層上に重層し、 次にこれを B e c km a n S W 4 0ローター中で 3 1 , 0 0 0 rpm にて 2 0 °Cで 2 4時間遠心分 離することにより RN Aを沈澱させた。
RNA沈澱物を 8 0 %エタノールにより洗浄し、 そして I mM E DTA及び 0. 5 % S D Sを含有する 1 0mM T r i s— HC 1 (pH 7. 5 ) 1 5 0〃 1中に溶解し、 そしてそれに P r o t e i n a s e (B o e h r i n g e r ) を 0. 5 mg/mlとなるように添加 した後、 3 7でにて 2 0分間イ ンキュベー ト した。 混合物をフエノ ール及びクロ口ホルムで抽出し、 そして RNAをエタノールで沈澱 させた。 次に、 RNA沈澱物を 1 mM E DTAを含有する 1 0 mM T r i s— HC 1 (pH 7. 5 ) 2 0 0 ^ 1に溶解した。
2 · 一本鎖 c DN Aの合成
J. W. L a r r i c kら、 B i o t e c h n o l o g y, 7, 9 3 4 ( 1 9 8 9 ) により記載されている方法に従って一本鎖 c D NAを合成するため、 前記のようにして調製した全 RNAの約 5 gを 4 0mM K C 1 , 6 mM Mg C l 2 、 1 0mMジチオスレイ ト一 ル、 0. 5mM d A T P, 0. 5 mM d GTP, 0. 5 mM d C T P, 0. 5 mM d TTP, 3 5 ^ M o l i g o dTプライマー
(Am e r s h am) 、 4 8ユニッ トの R A V - 2逆転写酵素 （ R AV- 2 ： R o u s a s s o c i a t e d v i r u s 2 ； A m e r s h am) 及び 2 5ュニッ トのヒ ト胎盤リボヌ ク レアーゼ阻害 剤 （ Am e r s h a m) を含有する 5 0 mM T r i s—HC l (pH 8. 3 ) 緩衝液 1 0 // 1 に溶解し、 そしてこの反応混合物を 3 7 にて 6 0分間インキュベー ト しそして次のポリ メラーゼ連鎖反応
(P CR) 法のために直接使用した。
3. 抗体可変領域をコー ドする遺伝子の P CR法による増幅
Th e r m a l C y c l e r Mo d e l P H C - 2 ( P e r k i n E l m e r C e t u s社） を用いて P C R法を行った c ( 1 ) マウス L鎖 V領域をコー ドする遺伝子の増幅
P CR法に使用するプライマ一は、 マウス力ツバ型 L鎖リーダー 配列とハイブリ ダィズする配列番号 ： 1〜 1 1に示す MKV (Mo u s e K a p p a V a r i a b l e) プライマ一 （S. T. J o n e s ら、 B i o t e c h n o l o g y, 9, 8 8, 1 9 9 1 ) 、 及びマウス/ c型 L鎖 C領域とハイブリ ダィズする配列番号 ： 1 2に 示す MKC (Mo u s e K a p p a C o n s t a n t ) プライ マ— （S. T. J o n e s ら、 B i o t e c h n o l o g y, 9, 8 8, 1 9 9 1 ) を用いた。
P CR溶液 1 0 0〃 1 は、 1 OmM T r i s - HC 1 (pH8. 3) 5 0 mM KC 1 , 0. 2 5 mM d NT P s ( d A T P, d GTP， d CTP, d TTP) 、 1. 5 mM Mg C l 2 、 2. 5ユニッ トの DNAボリ メラーゼ Amp l i T a q (P e r k i n E l m e r C e t u s社） 、 0. 2 5〃Mのそれぞれの MKVプライマー、 2. 7 5 の MKCプライマー及び一本鎖 c DNA合成の反応混合物 1 1を含有する。 これを 5 0〃 1の鉱油で覆った後、 9 4での初 期温度にて 1. 5分間そして次に 9 4てにて 1分間、 5 0てにて 1 分間及び 7 2でにて 1分間、 この順序で加熱した。 この温度サイク ルを 2 5回反復した後、 反応混合物をさらに 7 2 °Cにて 1 0分間ィ ンキュペー トした。
( 2 ) マウス H鎖 V領域をコー ドする c DNAの増幅
P CRのためのプライマーとして配列番号 ： 1 3〜2 4に示す1^ H V (Mo u s e H e a v y V a r i a b 1 e ) プライマ一 1 〜 1 2、 及び配列番号 ： 2 5に示す MHC - G l (Mo u s e H e a v y C o n s t a n t ) プライマー 、 S. T . J o n e s ら、 B i o t e c h n o l o g y, 9, 8 8, 1 9 9 1 ) を使用した。
c DNAの増幅は、 1 〃Mの MH Vプライマーと 1 〃Μの MH C 一 G l プライマーの組合せとして各々の MHV 1〜 1 2プライマ ー について別々に増幅した点を除いて、 前記 3. ( 1 ) において L鎖 V領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により増幅を行 つた。
4. P C R生成物の精製および断片化
前記のようにして P C R法により増幅した DN A断片を低融点ァ ガロース （FMC B i o. P r o d u c t s , 米国） にて精製し. そして 1 0mM Mg C l 2 及び 1 5 0mM N a C l を含有する 1 0 OmM T r i s—HC l (pH7. 6 ) 中で 1 0ュニッ トの制限酵素 S a l I (G I B C 0 B R L社製） を用いて 3 7 'Cにて 3時間消 化した。
この消化混合物をフヱノール及びクロ口ホルムで抽出し、 そして DNAをエタノール沈澱により回収した。 次に、 DNA沈澱物を 1 0ユニッ トの制限酵素 Xm a I (N ew E n g l a n d B i o 1 a b s社製） により 3 7eCにて 2時間消化し、 そして生ずる DN A断片を、 1. 5 %低融点ァガロース （FMC B i o. P r o d u c t s , 米国） を用いるァガロースゲル電気泳動により分離した, 約 4 5 O bp長の DNA断片を含有するァガロース片を切り取りそ して 6 5でにて 5分間溶融せしめ、 そしてこれと同容積の 2mM E DTA及び 2 0 0 mM N a C 1を含有する 2 0 mM T r i s— HC 1 (pH7. 5 ) を加えた。 この混合物をフエノール及びクロ口ホル ムにより抽出し、 そして DNA断片をエタノール沈澱により回収し. そして I raM EDTAを含有する 1 OmM T r i s—HC l (pH7 , 5 ) に溶解した。
こう して、 マウス力ツバ型 L鎖可変領域をコー ドする遺伝子を含 んで成る DNA断片、 及びマウス Η鎖可変領域をコー ドする遺伝子 を含んで成る DN Α断片を得た。 上記 DN A断片はいずれもその 5 一末端に S a l I接着末端を有しそしてその 3 ' —末端に Xm a l 接着末端を有する。
5. 連結及び形質転換
上記のようにして調製したマウス力ツバ型 L鎖 V領域をコー ドす る遺伝子を含んで成る S a 1 I — Xm a I DNA断片約 0. 3 gを、 S a l I及び Xm a lで消化することにより調製した p UC 1 9ベクター約 0. l gと、 5 0 mM T r i s— HC 1 ( pH 7. 4 ) , 1 0 mM M g C 1 2 . l OmMジチオスレィ トール、 I mMスぺ ルミ ジン、 I mM ATP, 0. 1 g Zmlのゥシ血清アルブミ ン及 び 2ユニッ ト T 4 DNAリガーゼ （N e w E n l a n d B i o 1 a b s ) を含有する反応混合物中で、 1 6 °Cにて 1 6時間反 応させ連結した。
次に、 7 1 の上記連結混合物を大腸菌 DH 5 αのコンビテン ト 細胞 2 0 0〃 1 に加え、 そしてこの細胞を氷上で 3 0分間、 4 2で にて 1分間そして再び氷上で 1分間静置した。 次いで 8 0 0 u 1の S O C培地 （Mo l e c u l a r C 1 o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma n u a l , S amb r o o kら、 C o l d S P r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 9 8 9 ) を加え、 3 7 eCにて 1 時間インキュベー トした後、 2 X YT寒天培地 （Mo 1 e c u 1 a r C 1 o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma n u a l , S amb r o o kら、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 9 8 9 ) 上にこの大腸菌をまき、 3 7でにて一夜ィンキュベー ト して大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体を、 5 0 // gZmlのァンピシリ ンを含有する 2 X YT培地 5ml中で 3 7 °Cにて一夜培養し、 そしてこの培養物から、 アルカ リ法 （Mo l e c u l a r C 1 o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma n u a l , S amb r o o kら、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 9 8 9 ) に従ってプラスミ ド DNAを調製した。
こう して得られた、 ハイプリ ドーマ S K 2に由来するマウスカツ パ型 L鎖 V領域をコー ドする遺伝子を含有するプラスミ ドを p UC - S K 2 - VL と命名した。
上記の同じ方法に従って、 ハイプリ ドーマ S K 2に由来するマウ ス H鎖 V領域をコー ドする遣伝子を含有するプラスミ ドを S a 1 I 一 Xm a I DNA断片から作成し、 そして P UC— S K 2— VH と命名した。
実施例 2. DN Aの塩基配列の決定
前記のブラスミ ド中の c DNAコー ド領域の塩基配列を、 S e q υ e n a s e™V e r s i o n 2. 0キッ ト （U, S. B i o c h e m i c a 1 社製， 米国） を用いて決定した。
まず、 前記のようにして得られたプラスミ ド約 3〃 gを 0. 2 N
N a OHにより変性し、 配列決定用プライマーとァニールさせ、 そしてキッ ト添付の処方に従って36 S— dATPより標識した。
次に、 標識された DNAを、 8 M尿素を含有する 6 %ボリアタ リ ルアミ ドゲルにて電気泳動した後、 ゲルを 1 0 %メタノール及び 1 0 %酢酸により固定し、 乾燥し、 そしてオー トラジオグラフィ一に かけることにより塩基配列を決定した。
プラスミ ド pUC— SK 2— VL に含まれるマウス SK 2抗体の L鎖 V領域をコー ドする遣伝子の塩基配列を配列番号 2 6に示す。 また、 プラスミ ド p UC— SK 2— VH に含まれるマウス SK 2抗 体の H鎖 V領域をコー ドする遺伝子の塩基配列を配列番号 2 7に示 す。
なお、 前記プラスミ ド pUC— SK 2— VL を含有する大腸菌は. E s c h e r i c h i a c o l i DH 5 (p UC - S K 2 VL およびプラスミ ド p U C— S K 2— VH を含有する大腸菌は E s c h e r i c h i a c o l i DH 5 « (p UC— S K 2 VH ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市東 1丁 目 1番 3号） に、 平成 5年 4月 2 1 日に、 各々 F E RM B P— 4 2 7 0、 および F E RM B P— 4 2 6 9 としてブダペス ト条約に 基き国際寄託された。
実施例 3. C D Rの決定
L鎖及び H鎖の V領域の全般的構造は、 互いに類似性を有してお り、 それぞれ 4つのフ レームワーク部分が 3つの超可変領域、 即ち 相補性決定領域 （C DR) により連結されている。 フ レームワーク のアミ ノ酸配列は、 比較的良く保存されているが、 一方、 CDR領 域のア ミ ノ酸配列の変異性は極めて高い （K a b a t， E. A. ら、 rS e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I m m υ n o l o g i c a l I n t e r e s t ] US D e p t . H e a 1 t h a n d Hum a n S e r v i c e s , 1 9 8 3 ) 。
この様な事実に基づき、 ヒ ト I L一 6に対するマウスモノ クロー ナル抗体の可変領域のァミ ノ酸配列を K a b a t らにより作成され た抗体のァ ミ ノ酸配列のデータベースにあてはめて、 相同性を調べ ることにより C D R領域を表 4に示す如く決定した。
表 4 プラスミ ド 配列番号 CDR (1) CDR (2) CDR (3) psk2-k2 26 24- 34 50- 56 89 - 96 psk2-hl 27 31 - 37 52- 67 100- 109 実施例 4. クローン化 c DNAの発現の確認 （キメラ S K 2抗体 の作製）
発現ベクターの作製
キメラ S K 2抗体を発現するベクターを作製するため、 それぞれ マウス S K 2 L鎖及び H鎖 V領域をコー ドする c DNAクローン p U C - S K 2 - V L 及び P U C — S K 2 — Vh を P C R法により 修飾した。 そして H E F発現ベクター （前記、 W0 9 2 — 1 9 7 5 9参照） （図 1 を参照のこと） に導入した。
L鎖 V領域のための後方プライマー S K 2 K 2 B (配列番号 ： 2 8 ) 及び H鎖 V領域のための後方プライマー S K 2 H 1 S (配列番 号 ： 3 0 ) は、 各々の V領域のリーダー配列の最初をコー ドする D NAにハイブリ ダィズし且つ K o z a kコンセンサス配列 （K a z a k, . ら、 J . M o 1 . B i o l . 1 9 6 , 9 4 7 - 9 5 0 , 1 9 8 7 ) 及び H i n d III 制限部位を有するように設計した。 L 鎖 V領域のための前方プライマー S K 2 K 2 A (配列番号 ： 2 9 ) 及び H鎖 V領域のための前方プライマー 6 4 h c h - A (配列番号 3 1 ) は、 J領域の末端をコー ドする DN A配列にハイプリ ダイズ し且つスプライス ドナー配列及び B a mH I制限部位を有するよう に設計した。
l O roM T r i s - H C 1 (pH8. 3 ) , 5 0 raM K C 1 ， 2 5 0 U U d NT P s , 1 . 5 m M g C l 2 、 l O O pmole ずつの 各プライマー、 1 0 0 ngの铸型 D N A ( p U C - S K 2 - VL 又は P U C— S K 2— VH ) 、 及び 5 uの Am p 1 i T a q酵素を含 有する 1 0 0 z l の P C R反応混合物を 5 0 〃 1 の鉱油で覆い、 9 4 °Cにて最初の変性の後、 9 4 にて 1分間、 5 0 にて 1分間、 7 2 °Cにて 1分間のサイクルを 3 0回行い、 最後に 7 2 °Cにて 1 0 分間イ ンキュベー ト した。
P CR生成物を 1. 5 %低融点ァガロースゲルを用いて精製し、 H i n d lll 及び B amH Iで消化し、 そして p U C l 9ベクター (Y a n i s h e - P e r r o nら、 G e n e ( 1 9 8 5 ) 3 3 : 1 0 3— 1 0 9 ) にサブクローニングした。 D N A配列決定の後、 正しい DN A配列を有する H i n d III 一 B amH I断片を切出し, H鎖 V領域については発現べクタ一 HE F— VH — g y l に導入し て HE F— S K 2 h— g < lを得、 L鎖 V領域については HE F— VL 一 g kに導入して H E F— S K 2 k— g kを得た。
さらに、 H鎖 V領域に於いて、 ほとんどの抗体の H鎖は、 位置 3 0のセリ ンが保存されているが、 マウス S K 2抗体 H鎖においては 位置 3 0がァスパラギンであることから、 キメラ SK 2抗体の抗原 結合活性に対するこの変化の効果を検討するため、 H E F— S K 2 h - g r 1を铸型として後方プライマー S K 2 H 1 Sと前方ブライ マー S K 2 HM 1 B (配列番号 ： 3 2) 及び前方プライマー 6 4 h c h— Aと後方プライマー （SK 2 HM 1 ) (配列番号 ： 3 3 ) の 組合せを用いて P CR変異誘導法により、 位置 3 0がァスパラギン からセリ ンに変るように設計した。
変異型 H鎖 V領域は、 プライマー S K 2 H 1 Sと S K 2 HM 1 B. 又はプライマー S K 2 HM 1 と 6 4 h c h— Aを用い、 铸型 DNA としてプラスミ ド HE F— S K 2 h— g 7 1を用い、 前記と同様に して P C Rを行った。 P CR増幅の後、 2つの P C R生成物を低融 点ァガロースゲルを用いて精製し、 第 2の P C Rのために用いた。 1 〃 gずつの 2つの第一 P C R生成物及び 5 uの Am p 1 i T a qを含有する 9 8〃 1の P CR混合物を 9 4 °Cにて 2分間、 5 0 °Cにて 2分間及び 7 2 °Cにて 5分間インキュベー ト した後、 1 0 0 pmole ずつの外部プライマ一 （SK 2 H 1 S及び 6 4 h c h— A) を加えた。 P C R混合物を 5 0 / 1の鉱油で覆い、 そして前記と同 じ条件で第二 P CRを行った。 4 1 2bpの DNA断片を精製し、 H i n d III 及び B amH Iで消化し、 そして発現ベクター HE F— VH - g r 1 に挿入し、 配列決定の後、 正しい配列を含むプラスミ ド HE F— SK 2 h— NTSを得た。
C OS細胞へのトランスフヱクショ ン
キメ ラ S K 2抗体の一過性発現を観察するため、 前記発現べクタ 一を C 0 S細胞において試験した。 H E F— S K 2 k— g kと、 H E F - SK 2 h - g r 1又は HE F— SK 2 h— NTSのいずれか とを、 G e n e P u l s e r装置 （B i oR a d社製） を用いて エレク トロポレーショ ンにより C 0 S細胞に同時形質転換した。 各 DNA ( 1 0 g ) を、 P B S中 1 X 1 07 細胞 Zmlの 0. 8 mlの ァリ コー トに加え、 し 9 0 0 V、 2 5 z Fの容量にてパルスを与 えた。
室温にて 1 0分間の回復期間の後、 エレク トロボレーシヨ ン処理 された細胞を、 ッニカマイシン （S i gm a社製） を 2〃 g/ml含 有するか、 又は含有しない 1 0 %の <r一グロブリ ンフリーゥシ胎児 血清を含有する DMEM培養液 （G I B CO社製） に加えた。 7 2 時間のイ ンキュベーショ ンの後、 培養上清を集め、 遠心分離により 細胞破片を除去し、 5倍量の結合緩衝液で平衡化したプロティ ン A ァガロースカラム （A f f i — G e l P r o t e i n A A P S IIキッ ト、 B i o R a d) に適用した。 カラムを 1 5倍量の結 合緩衝液で洗浄し、 次に 5倍量の溶出緩衝液で溶出した。 溶出液を 濃縮し、 そしてマイクロコ ンセ ン ト レー夕一 （C e n t r i c o n 1 0 0, Am i c o n社製） を用いて緩衝液を P B Sに変えた。
E L I S A
抗原結合測定のための E L I SAプレー トを次の様にして調製し た。 9 6穴プレー トを、 SK 2が認識するェピトープとは異るヒ ト I L一 6のェピトープを認識するマウスモノ クローナル抗体 MH 1 6 6 (Ma t s u d a, T . ら、 E u r . J. I mmu n o l . 1 _8_, 9 5 1 - 9 5 6 , 1 9 8 8 ) でコー ト し、 ブロッキングの後、 組換えヒ ト I L一 6を添加した。 キメラ S K 2抗体のサンプルを順 次希釈して、 各穴に加え、 次にアルカ リホスファターゼ結合ャギ抗 ーヒ ト I g G抗体 （S i gm a社製） を加えた。 インキュべ一ショ ン及び洗浄の後、 基質溶液を加え、 次に 4 0 5nmでの吸光度を測定 した。
結合阻害測定のため、 E L I SAプレー トを次の様にして調製し た。 9 6穴プレー トを、 ヒ ト I L一 6 レセブター （ I L一 6 R) に 対して特異的なマウスモノ クローナル抗体 MT— 1 8 (H i r a t a, Y. ら、 J. I mmu n o l . , 1 4 3, 2 9 0 0 - 2 9 0 7, 1 9 8 9 ) によりコー トし、 ブロッキングの後、 可溶性組換えヒ ト I L - 6 R CSR 3 4 4 ) (Y a s u k awa, K. ら、 J. B i o c h em. 1 0 8, 6 7 3 - 6 7 6, 1 9 9 0 ) を加えた。 サン プルを順次希釈して、 ピオチン化 I L一 6と共に各穴に加え、 次い でアルカ リホスファターゼ結合ス ト レプタビデイ ンを加えた後、 前 記のようにして、 4 0 5 nmにおける吸光度を測定した。
抗原結合測定の結果を図 4に示し、 結合阻害測定の結果を図 5に 示す。 H鎖 V領域の 3 0位がァスパラギンである。 キメラ抗体およ び H鎖 V領域の 3 0位がセリ ンに変異しているキメラ抗体 （NTS) は、 ッニカマイシンによる糖付加阻害の影響を受けることなく、 同 様の抗原結合性及び結合阻害活性を示した。 従って、 H鎖 V領域の 3 0位のアミ ノ酸の変異及び糖鎖の有無は抗原結合性に何ら影響を 与えないことが明らかになった。
S D SZPAG E及びウエスタンブ_口ッ トを用いたマウス S K 2 抗体の糖鎖の分析
マウス S K 2抗体から F a b断片および F c断片を I mmu n o P u r e F a b P r e p a r a t i o n k i t (P i e r c e社製） を用いて調製し、 次に N—グリカナ一ゼ （G e n z ym e社製） を用いて脱グリ コシル化された断片を調製した。
これらの断片を S D S—ボリアク リルアミ ドゲル電気泳動にかけ、 そして次にクマシ一ブリ リアン トブル一 （C o om a s s i e B r i 1 1 i a n t B l u e. B i o R a d社製） により染色する か、 又は電気泳動的に二トロセルロースフィルターに移行させた。
F d断片に付加されている糖を分析するため、 フィルターをレクチ ンのパネル （L e c t i n - L i n k , G e n z ym e社製） にか けた。
図 3に示すごとく、 マウス S K 2抗体からの F d断片は S D SZ P A G Eにおいて約 3 4 kd及び 3 3 kdのバン ドを示し、 この比率は 約 1 ： 1であった。 N—グリカナーゼにより脱グリ コシル化された F d断片は約 2 9 kdの分子量を示し、 これは F d断片のアミ ノ酸組 成から計算した値と一致した。 また、 3 4 kdの F d断片と 3 3 kdの F d断片は種々のレクチンに対して異る反応性を示した。
すなわち 3 4 kdの F dは D a t u r a S t r am o n i um A g g 1 u t i n i n (D SA) 十、 R i c i n υ s C ommu n i s A g g 1 υ t i n i n (R CA) +十、 P h a s e o l u s V u l g a r i s E r y t h r o l e c t i n (PHA— E) + + +、 C o n c a n a v a 1 i n A ( C o n A ) 一、 W h e a t G e r m A g g l u t i n i n (WGA) —であるのに対し て、 3 3 kdの F dは D S A— , R CA+, PHA— E + + +, C o n A WCA—であった。 これらの結果、 マウス S K 2抗体は、 H鎖 V領域に少なく とも 2つのタイプの N型糖鎖を有するこ とが明 らかになった。
実施例 5. 再構成ヒ ト S K 2抗体の作製
再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖 V領域の作製
再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖を、 P C R法による C DR—グラフテ イ ングにより作製した。 この方法を図 6に模式的に示す。 ヒ ト抗体
R E I由来の FRを有する再構成ヒ ト抗体 S K 2 (バージ ョ ン 「 a J ) の作製のために 8個の P C Rプライマーを使用した。 外部プライマ 一 A (配列番号 ： 3 4 ) 及び H (配列番号 ： 3 5 ) は、 p UCべク ターの DN A配列とハイブリ ダィズするように設計された。
CDR—グラフティ ングブライマー B (配列番号 ： 3 6 ) 、 C
(配列番号 ： 3 7 ) 及び D (配列番号 ： 3 8 ) はセンス DNA配列 を有し、 そして CDR—グラフティ ングプライマー E (配列番号 ： 3 9 ) 、 F (配列番号 ： 4 0 ) 及び G (配列番号 ： 4 1 ) はアンチ 一セ ンス D N A配列を有しそしてそれぞれプライマー B, C及び D の 5 ' 一末端の DN A配列に対する相補的 DN A配列 （ 1 5〜 3 5 bp) を有する。
第一 P C R段階において 4つの反応 A— E , B— F, C— G、 及 び D— Hを行い、 そして各 P CR生成物を精製した。 第一 P CRか らの 4つの P C R生成物をそれら自体の相補性によりアッセンプリ させた （WO 9 2— 1 9 7 5 9参照） 。 次に、 外部プライマー A及 び Hを加えて、 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖 V領域をコー ドする全長
DNAを増幅した （第 2 P CR) 。 前記 P C Rにおいては、 ヒ ト抗 体 R E Iからの FRに基く再構成ヒ ト PM— 1抗体 L鎖 V領域バー ジョ ン 「 a」 をコー ドするプラスミ ド p U C— R V L— PM l a -
4 (W0 9 2— 1 9 7 5 9 ) を铸型として用いた。
第一 P C R段階においては、 1 O mM T r i s — H C l (pH8. 3 ) , 5 0 m K C 1 , 2 5 0 d NT P s , 1 . 5 m M g C 1 2 、 1 0 O ngの铸型 DNA、 1 0 0 pmole の各プライマ一及び 5 uの Am p l i T a qを含有する 1 0 0 / 1 の P C R混合物を 用いた。 各 P C Rチューブは 5 0 1 の鉱油で覆膜した。 最初に 9 4 eCで変性した後、 9 4 °Cにて 1 分間、 5 0 °C又は 5 5 °Cにて 1 分 間及び 7 2でにて 1分間の反応サイクルを行い、 次に 7 2てにて 1 0分間ィンキュベー ト した。
P C R生成物 A - E ( 1 8 7 bp) , B - F ( 8 7 bp) , C - G ( 1 5 2 bp) 及び D— H ( 6 5 bp) を 1 . 5 %低融点ァガロースゲ ルを用いて精製し、 第二 P C Rでアッセンプリ した。 第二 P C Rに おいては、 l tz gの各第一 P C Rの生成物、 及び 5 uの Am p l i
T a qを含有する 9 8 〃 1 の P C R混合物を、 9 4てにて 2分間,
5 0でにて 2分間及び 7 2でにて 2分間で 2サイクルインキュベー ト し、 そして次に 1 0 0 pmole の各外部プライマー （A及び H) を 加えた。 P C Rチューブを 5 0 // 1 の鉱油で覆い、 そして前記と同
—の条件で 3 0サイクルの P C Rを行った。
第二 P C Rにより生じた 3 9 9 bpの DNA断片を 1 . 5 %低融点 ァガロースゲルで精製し、 B a mH I及び H i n d III で消化し、 得られた DNA断片を H E F発現ベクター H E F— VL — g kにク ローニングした。 DN A配列決定の後、 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖 V領域のバージョ ン 「 a j の正しいアミ ノ酸配列をコー ドする DN A断片を含むプラスミ ドを H E F— R V L— S K 2 a と命名した。 本プラスミ ド H E F— R V L— S K 2 aに含まれる L鎖 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列を配列番号 ： 5 2に示す。 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖 V領域のバージョ ン 「b」 を、 P CR を用いる変異誘発によって作製した。 変異原プライマー FTY— 1 (配列番号 ： 4 2) 及び FTY - 2 (配列番号 ： 4 3) は、 7 1位 のフヱニルァラニンがチロシンに変異するように設計した。 プラス ミ ド HE F— RV 1 — S K 2 aを铸型 DNAとして用いた。 最終 P CR生成物を精製し、 B amH I及び H i n d lll で消化し、 得ら れた DNA断片を HE F—発現べクター HE F— VL — g kにクロ —ニングしてプラスミ ド H E F— R V L— S K 2 bを得た。 本ブラ スミ ド HE F— RVL— SK 2 bに含まれる L鎖 V領域のアミ ノ酸 配列および塩基配列を配列番号 ： 5 3に示す。
再構成ヒ ト S K 2抗体 H鎖 V領域の作製
再構成ヒ ト SK 2抗体 H鎖 V領域をコー ドする DNAを次の様に して設計した。 ヒ ト抗体 DAWの FRをコー ドする DNA配列を V 領域 （K a b a t . E. A. ら、 US D e p t H e a l t h a n d Hum a n S e r v i c e s, US G o v e r nm e n t P r i n t i n g O f f i c e s, 1 9 9 1 ) の 「 c o d o n u s a g e J に基いて設計し、 そしてマウス SK 2抗体 H鎖 V領域の C DRをコー ドする DNA配列とつなげることにより、 再 構成ヒ ト SK 2抗体 H鎖 V領域のバージョ ン 「 a」 をコー ドする全 長 DN Aを設計した。
次に、 この DN A配列のそれぞれ 5 ' —側及び 3 ' —側に H i n d III 認識部位 ZK 0 ZAKコンセンサス配列及び B amH I認識 部位 Zスプライスドナー配列を付加して、 HE F発現ベクターに揷 入できるようにした。
こう して設計した DN A配列を 6個のオリゴヌ ク レオチ ドに分け そして次に、 これらのオリゴヌク レオチ ドのアセンブリ一を妨害す る可能性のあるォリゴヌ ク レオチ ド中の二次構造についてコンビュ 一夕一解析した。
6個のオリゴヌク レオチ ド配列を配列番号 ： 4 4〜 4 9に示す。 これらのオリゴヌ ク レオチ ドは 9 3〜 9 6塩基の長さを有し、 2 0 〜 2 4 bpのオーバラップ領域を有する。 オリゴヌ ク レオチ ドの内の 3個、 すなわち、 H P 1 (配列番号 ： 4 4 ) 、 H P 3 (配列番号 ： 4 6 ) 及び H P 5 (配列番号 ： 4 8 ) はセンス DNA配列を有し、 そして他の 3個、 すなわち、 H P 2 (配列番号 ： 4 5 ) 、 H P 4 (配列番号 ： 4 7 ) 及び H P 6 (配列番号 ： 4 9 ) はアンチセンス DN A配列を有する。 これら 6個のオリゴヌク レオチ ドの P C R法 によるアセンブリーの方法を図 7に示す。
2 pmole ずつの 6種のオリゴヌク レオチ ド及び 5 uの Am p 1 i T a qを含有する 9 8 1 の P C R混合物を、 9 4 eCにて 2分間 の最初の変性の後、 9 4でにて 1 分間、 5 0でにて 1分間及び 7 2 °Cにて 1分間のから成る 3サイクルのインキュベーショ ンを行い、 次に 7 2てにて 1 0分間インキュベー トした。 5 0 zπloleずっのH P 1 及び H P 6を外部プライマーとして添加した後、 P C Rチュー ブを 5 0 1 の鉱油で覆い、 そして 9 4てにて 1 分間の最初の変性 の後、 9 4 eCにて 1分間、 5 0てにて 1分間及び 7 2てにて 1 分間 の 3 0サイクルを行い、 そして次に 7 2 eCにて 1 0分間イ ンキュべ 一ト した。
4 4 8 bpの DN A断片を 1 . 5 %低融点ァガロースゲルを用いて 精製し、 H i n d HI 及び B a mH I により消化し、 そして次に H E F発現べクター H E F— VH - g y l にクローニングした。 DN A配列決定の後、 正しい H鎖 V領域のア ミ ノ酸配列をコ一 ドする D NA断片を含むプラスミ ドを H E F— R VH— S K 2 a と命名した, 本プラスミ ド H E F— R VH— S K 2 aに含まれる H鎖 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列を配列番号 ： 5 4に示す。 バージ ョ ン 「bj を、 P CR法による変異誘発を用いて作製した, 変異原プライマー R S K 2— STNA (配列番号 ： 5 0 ) 及び R S K - S TN B (配列番号 ： 5 1 ) を、 3 0位のセリ ンがァスパラギ ンに変る様に設計した。 プラスミ ド RVH— SK 2 aを铸型 DNA として使用した。 最終 P CR生成物を精製し、 B amH I及び H i n d III により消化し、 そして次に HE F発現べクタ一 HE F— V H - g r 1にクローニングし、 プラスミ ド HE F— RVH— SK 2 bを得た。 本プラスミ ド HE F— RVH— S K 2 bに含まれる H鎖 V領域のア ミ ノ酸配列および塩基配列を配列番号 ： 5 5に示す。 再構成ヒ ト SK 2抗体の各鎖を評価するため、 まず、 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖のための 2種類の発現ベクター HE F— RVL— S K 2 a (バージョ ン 「 a j ：) 及び HE F— RVL— S K 2 b (バー ジョ ン 「b」 ） のいずれかと、 キメラ S K 2抗体 H鎖のための発現 ベクター HE F— SK 2 h— g 7 1 とにより C 0 S細胞を前記のよ うにして同時トランスフエクシヨ ンし、 前記のようにして抗体生成 物を回収した後、 前記のようにして抗原結合測定にかけた。
この結果を図 8に示す。 図 8に示すように、 陽性対照としてのキ メラ抗体 （C h LZC hH) と、 再構成 L鎖パージヨ ン 「 a」 とキ メラ H鎖とから成る抗体 （RVL aZC hH) 、 と再構成 L鎖バー ジョ ン 「b」 とキメラ H鎖とから成る抗体 （RVL bZC hH) と の間には抗原結合性に差がなく、 7 1位におけるチロシン残基のフ ェニルァラニン残基への変化は抗原結合性に影響を与えないことが 示された。
次に、 再構成ヒ ト化 S K 2抗体 L鎖の 2つのバージョ ンと再構成 ヒ ト化 S K 2抗体 H鎖の 2つのバージョ ンとの組合せを評価するた め、 HE F— RVL— SK 2 aと RVH— SK 2 a、 HE F— RV L一 SK 2 aと RVH— SK 2 b、 HE F— RVL— SK 2 bと R VH— S K 2 a、 又は HE F— RVL— S K 2 bと RVH— S K 2 bとにより C 0 S細胞を同時トランスフヱクシヨ ンし、 前記のよう にして得られた抗体について抗原結合測定を行った。 その結果を図 9に示す。 図 9から明らかな通り、 再構成ヒ ト H鎖と再構成ヒ ト V 鎖とのすべての組合せが、 キメラ S K 2抗体に匹敵する良好な抗原 結合性を示した。
なお、 前記プラスミ ド HE F— RVL — S K 2 bを含有する大腸 菌は E s c h e r i c h i a c o l i DH 5 a (HE F -RVL
5 K 2 b ) 、 およびプラスミ ド HE F— RVH — S K 2 aを含有す る大腸菌は E s c h e r i c h i a c o l i D H 5 a (HE F -R V„ S K 2 a ) として工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨 城県つく ば市東 1丁目 1番 3号） に、 平成 5年 4月 2 1 日に、 各々 F ERM B P— 4 2 6 7、 および F E RM B P— 4 2 6 8 とし てブダぺス ト条約に基き国際寄託された。
これに対して、 図 1 0に示すように、 結合阻害 （ I L 6 と I L一
6 Rと結合を阻害する抗体の能力） 測定においては、 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖バージョ ン 「b」 （R v L b) と再構成ヒ ト S K 2抗 体 H鎖バージョ ン 「 a」 （R vH a ) との組合せのみが、 マウスモ ノ クローナル抗体 S K 2及びキメラ S K 2抗体に匹敵する結合阻害 活性を示し、 この組合せがヒ ト抗体における機能的抗原結合部位を 形成することが示唆された。
他方、 再構成ヒ ト S K 2抗体 L鎖バージョ ン 「 a」 （R v L a)と 再構成ヒ ト S K 2抗体 H鎖バージョ ン 「 a」 （R vH a)との組合せ、 及び R v L aと R v Hbとの組合せは低い結合阻害活性を示し、 L 鎖中の 7 1位にフ 二ルァラニンを有する抗体は良好な抗原結合活 性を示すが機能的抗原結合部位を再形成することが示唆された。
これらのこ とからヒ ト抗体 L鎖の CDR 1領域に於けるループ構 造には、 7 1位のチロシンは機能的な抗原結合部位を再構成するの に必須であると言える。
参考例 1. ノヽイブリ ドーマ S K 2の作製
抗ー ヒ ト I L一 6モノ ク口一ナル抗体を産生するハイブリ ドーマ はヒ ト I L一 6で免役した B A L BZ cマウスの脾臓細胞とマウス 骨髄腫細胞株 P 3 U 1をポリエチレングリ コールを用いた常法によ り融合して作製した。 I L一 6 と I L一 6 Rの結合を阻害する活性 を指標としたスク リ ーニングを行い、 結合阻害活性を有する 1 7種 のクローンを得た。 これらのクローンをマウスの腹腔内に移植し、 得られた腹水をプロテイ ン Aァガロースカラムにかけ、 精製マウス モノ クローナル抗体を得た。
参考例 2. マウスモノ ク ローナル抗体 S K 2のタイ ピング
ハイプリ ドーマ S K 2から産生されるマウスモノ ク口ーナル抗体 S K 2の L鎖お.よび H鎖のタイプを調べるために、 マウスモノ ク ロ ーナル抗体アイソタイ ピングキッ ト （アマシャムインターナショナ ル P 1 c社製） を用いてタイピングを行った。 その結果、 S K 2抗 体は 型軽鎖および τ 1型重鎖を有することが明らかになった。 特許協力条約に基く規則第 1 3規則の 2の寄託された微生物への 言及
寄託機関の名称及びあて名 ：
工業技術院生命工学工業技術研究所
茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号
受託番号 可 eli日
1. F ERM B P - 4 2 6 7 1 9 9 3年 4月 2 1 日
2. F E R B P - 4 2 6 8 1 9 9 3年 4月 2 1 日
3. F E RM B P - 4 2 6 9 1 9 9 3年 4月 2 1 日 4. F E R M B P— 4 2 7 0 1 9 9 3年 4月 2 1 日 配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 3 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 4 3 配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 4 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41 配列番号 ： 8
配列の長さ ： 4 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41 配列番号 ： 9
配列の長さ ： 3 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35 配列番号 ： 1 0
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37 配列番号 ： 1 1
配列の長さ ： 3 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38 配列番号 ： 1 2
配列の長さ ： 2 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27 配列番号 ： 1 3
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37 配列番号 ： 1 4
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36 配列番号 ： 1 5
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37 配列番号 ： 1 6
配列の長さ ： 3 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35 配列番号 ： 1 7
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A 配列
ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40 配列番号 ： 1 8
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37 配列番号 ： 1 9
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36 配列番号 ： 2 0
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33 配列番号 ： 2 1 配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40 配列番号 ： 2 2
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37 配列番号 ： 2 3
配列の長さ ： 3 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGATTTTG GGCTGATTTT TTTTATTG 38 配列番号 ： 2 4
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖 トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 DNA
配列
ACTAGTCGAC ATGATGGTGT TAAGTCTTCT GTACCTG 37 配列番号 ： 2 5
配列の長さ ： 2 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 DN A
配列
GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28 配列番号 ： 2 6
配列の長さ ： 3 7 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c DN A
起源
生物名 ： マウス
直接の起源 .
クローン ： p UC— S K 2 - VL
特徵 ： 1. . 6 0 s i g p e p t i d e
6 1. . 2 7 9 m a t p e p t i d e
配列
ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GGG TTG CTG CTG CTG TGG CTT 45 Met Ser Val Leu Thr Gin Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu -20 -15 -10 ACA GAT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA GCC TCC 90 Thr Asp Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser -5 - 1 1 5 10
CTA TCT GTA TCA GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA 135 Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala
15 20 25
AGT GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG 180 Ser Glu Asn lie Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin
30 35 40
GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG GTC TAT GCC GCA ACA TAC TTA GCA 225 Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ala
45 50 55
GAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGC ACA CAG 270 Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin
60 65 70
TAT TCC CTA AAG ATC AAC AGC CTG CAG TCT GAA GAT TTT GGG AGT 315 Tyr Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Ser Glu Asp Phe Gly Ser
75 80 85
TAT TAC TGT CAA CAT TTT TGG GGT ACT CCT CCG TTC GGC TCG GGG 360 Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Gly Thr Pro Pro Phe Gly Ser Gly
90 95 100
ACA AAG TTG GAA ATA AAA C 379 Thr Lys Leu Glu lie Lys
105
配列番号 ： 2 7
配列の長さ ： 4 5 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c DN A
起源
生物名 ： マウス
直接の起源
クローン ： p UC— S K 2— VH
特徵 ： 1. . 5 7 s i g p e p t i d e 5 8. . 4 5 7 m a t p e p t i d e
配列
ATG GGC AGA CTT ACA TTC TCA TTC CTG CTA CTG ATT GTC CCT GCA 45
Met Gly Arg Leu Thr Phe Ser Phe Leu Leu Leu lie Val Pro Ala
-15 -10 -5
TAT GTC CTG TCC CAG GTT ACT CTG AAA GAG TCT GGC CCT GGG ATA 90
Tyr Val Leu Ser Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie
- 1 1 5 10
TTG CAG CCC TCC CAG ACC CTC AGT CTG ACT TGT TCT TTC TCT GGT 135 Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly
15 20 25
TTT TCA CTG AAC ACT TCT GGT ATG ACC GTA GGC TGG ATT CGT CAG 180 Phe Ser Leu Asn Thr Ser Gly Met Thr Val Gly Trp lie Arg Gin
30 35 40
CCT TCA GGG AAG GGT CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TGG TGG AAT 225 Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asn
45 50 55
GAT GAT AAG TAC TAT AAC CCA GCC CTG AAA GGC CGG CTC ACA ATC 270 Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Arg Leu Thr lie
60 65 70
TCC AAG GAT ACC TCC AAC AAC CAG GTA TTC CTC AAG ATC GCC AGT 315 Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gin Val Phe Leu Lys lie Ala Ser
75 80 85
GTG GTC ACT GCA GAT ACT GCC ACA TAC TAC TGT GCT CGA ATG GAG 360 Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu
90 95 100
GAT TAC GAC GAA GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC 405 Asp Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val
105 110 115
ACC GTC TCC TCA G 418 Thr Val Ser Ser
120
配列番号 ： 2 8
配列の長さ ： 3 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CCTGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAACT TTGTC 35 配列番号 ： 2 9
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GATAAGCTTG CCGCCACCAT GAGTGTGCTC ACTCAG 36 配列番号 ： 3 0
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GATAAGCTTG CCGCCACCAT GGGCAGACTT ACATTC 36 配列番号 ： 3 1
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TGTTGGATCC ACTCACCTGA AGAGACAGTG ACTGAGGTTC 40
5 o 配列番号 ： 3 2
配列の長さ ： 2 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CAGAAGTGGA CAGTGAAAAA CCAGA 25 配列番号 ： 3 3
配列の長さ ： 2 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TTTTTCACTG TCCACTTCTG GTATGAC 27 配列番号 ： 3 4
配列の長さ ： 1 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
AACAGCTATG ACCATGA 17 配列番号 ： 3 5
配列の長さ ： 2 6
配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GAATTCGGAT CCACTCACGT TTGATT 26 配列番号 ： 3 6
配列の長さ ： 3 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GAATATTTAC AGTAATTTAG CATGGTACCA GCAGAAGCC 39 配列番号 ： 3 7
配列の長さ ： 4 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TGCTGATCTA CGCCGCAACA TACTTAGCAG ATGGTGTGCC AAGCA 45 配列番号 ： 3 8
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A 配列
TTGGGGTACT CCTCCGTTCT GGCCAAGGGA CCAAGGT 37 配列番号 ： 3 9
配列の長さ ： 4 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖伏
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TTACTGTAAA TATTCTCACT TGCTCTACAG GTGATGGTCA C 41 配列番号 ： 4 0
配列の長さ ： 4 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACCATCTGCT AAGTATGTTG CGTCGTAGAT CAGCAGCTTT GGAGC 45 配列番号 ： 4 1
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CGGAGGAGTA CCCCAAAAAT GTTGGCAGTA GTAGGT 36 配列番号 ： 4 2 配列の長さ ： 3 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GGTACCGACT ACACCTTCAC CATCAGCAGC C 31 配列番号 ： 4 3
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GGTGAAGGTG TAGTCGGTAC CGCTACCGCT A 31 配列番号 ： 4 4
配列の長さ ： 9 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GATAAGCTTG CCACCATGGA CTGGACCTGG AGGGTCTTCT TCTTGCTGGC 50 TGTAGCTCCA CGTGCTCACT CCCAAGTGAC TCTGAGGGAG TCTGG 95 配列番号 ： 4 5
配列の長さ ： 9 3
配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
AGTACTTAAT GAGAAGCCAG AGAAGGTGCA GGTGAGTGTC AGAGTCTGTG 50 TAGGTCTCAC AAGGGCAGGT CCAGACTCCC TCAGAGTCAC TTG 93 配列番号 ： 4 6
配列の長さ ： 9 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TTCTCTGGCT TCTCATTAAG TACTTCTGGT ATGACCGTAG GCTGGATTCG 50 CCAACCTCCT GGAGAGGCAC TGGAGTGGCT GGCACACATT TGGTG 95 配列番号 ： 4 7
配列の長さ ： 9 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CTGGTTCTTG GATGTGTCTT TGGAGACGGC CAGTCGGCCT TTCAGGGCaG 50 GGTTATAGTA CTTATCATCA TTCCACCAAA TGTGTGCCAG CCACTC 96 配列番号 ： 4 8
配列の長さ ： 9 8
配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TCCAAAGACA CATCCAAGAA CCAGGTTGTC CTGTCCATGA ACACCGTGGG 50 TCCCGGGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC AAGAATGGAG GATTACGA 98 配列番号 ： 4 9
配列の長さ ： 9 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACGGTGA CCAGAATCCC TTGGCCCCAG 50 TAGTCCATAG CTTCGTCGTA ATCCTCCATT CTTGCACAGT AATA 94 配列番号 ： 5 0
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TTCTCATTAA ATACTTCTGG TATGACCGTA 31 配列番号 ： 5 1
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖 トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 DN A
配列
ACCAGAAGTA TTTAATGAGA AGCCAGAGAA G 31 配列番号 ： 5 2
配列の長さ ： 3 7 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成
起源
生物名 ： マウス及びヒ ト
直接の起源
クローン ： H E F— R V L— S K 2 a
特徴 ： ヒ ト I L一 6に対する再構成ヒ ト S K 2抗体の L鎖 V領域バ 一ジ ョ ン （ a ) 及びそれをコー ドする遺伝子
ァミ ノ酸 1 9 一 1 1 e a d e r
ァミ ノ酸 1 2 3 F R 1
ァ ミ ノ酸 2 4 3 4 C D R 1
ァミ ノ酸 3 5 4 9 F R 2
ァミ ノ酸 5 0 5 6 C D R 2
ァ ミ ノ酸 5 7 8 8 F R 3
ァミ ノ酸 8 9 9 6 C D R 3
ァミ ノ酸 9 7 1 0 6 ： F R 4
配列
ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr
- 15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu
- 1 1 5 10
AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AGA GCA AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser
15 20 25
GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Glu Asn He Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly
30 35 40
AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC GCC GCA ACA TAC TTA GCA GAT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Asp
45 50 55
GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
60 65 70
ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC 315 Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr
75 80 85
TAC TGC CAA CAT TTT TGG GGT ACT CCT CCG TTC GGC CAA GGG ACC 360 Tyr Cys Gin His Phe Trp Gly Thr Pro Pro Phe Gly Gin Gly Thr
90 95 100
AAG GTG GAA ATC AAA C 376 Lys Val Glu lie Lys
105
配列番号 ： 5 3
配列の長さ ： 3 7 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成
起源
生物名 ： マウス及びヒ ト
直接の起源
クローン ： HE F— RVL— S K 2 b
特徵 ： ヒ ト I L一 6に対する再構成ヒ ト化 S K 2抗体の L鎖 V領域 バージョ ン （ b ) 及びそれをコー ドする遺伝子
ア ミ ノ酸 一 1 9 1 ： l e a d e r
ア ミ ノ酸 1 一 2 3 F R 1
ア ミ ノ酸 2 4一 3 4 C D R 1
ア ミ ノ酸 3 5一 4 9 F R 2
ア ミ ノ酸 5 0一 5 6 C D R 2
ア ミ ノ酸 5 8 8 F R 3
ア ミ ノ酸 8 9一 9 6 C D R 3
ア ミ ノ酸 9 - 1 0 ： F R 4
配列
ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45
Met Gly Trp Ser Cys He lie Leu Phe し en Val Ala Thr Ala Thr
-15 -10 -5
GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu
-1 1 5 10
AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AGA GCA AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser
15 20 25
GAG AAT ATT TAC ACT AAT TTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Glu Asn lie Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly
30 35 40
AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC GCC GCA ACA TAC TTA GCA GAT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Asp
45 50 55
GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TAC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
60 65 70
ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC 315 Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr
75 80 85
TAC TGC CAA CAT TTT TGG GGT ACT CCT CCG TTC GGC CAA GGG ACC 360 Tyr Cys Gin His Phe Trp Gly Thr Pro Pro Phe Gly Gin Gly Thr
90 95 100 AAG GTG GAA ATC AAA C 376 Lys Val Glu lie Lys
105
配列番号 ： 5 4
配列の長さ ： 4 1 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成
起源
生物名 ： マウス及びヒ ト
直接の起源
クローン ： HE F— RVH— S K 2 a
特徵 ： ヒ ト I L一 6に対する再構成ヒ ト化 S K 2抗体の H鎖 V領域 バージョ ン （ a ) 及びそれをコー ドする遗伝子。
T ノ酸 一 1 9 一 1 1 e a d e r
了 ノ酸 1 3 0 F R 1
了 ノ酸 3 1 3 7 C D R 1
了 ノ酸 3 8 5 1 F R 2
了 ノ酸 5 2 6 7 C D R 2
了 ノ酸 6 8 9 9 F R 3
了 ノ酸 1 0 0 1 0 9 ： C D R 3
了 ノ酸 1 1 0 - 1 2 0 : F R 4
配列
ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA 45 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro
-15 -10 -5
CGT GCT CAC TCC CAA GTG ACT CTG AGG GAG TCT GGA CCT GCC CTT 90 Arg Ala His Ser Gin Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu
- 1 1 5 10 GTG AGA CCT ACA CAG ACT CTG ACA CTC ACC TGC ACC TTC TCT GGC 135 Val Arg Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly
15 20 25
TTC TCA TTA AGT ACT TCT GGT ATG ACC GTA GGC TGG ATT CGC CAA 180 Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Thr Val Gly Trp lie Arg Gin
30 35 40
CCT CCT GGA GAG GCA CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TGG TGG AAT 225 Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp Leu Ala His He Trp Trp Asn
45 50 55
GAT GAT AAG TAC TAT AAC CCT GCC CTG AAA GGC CGA CTG GCC GTC 270 Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Arg Leu Ala Val
60 65 70
TCC AAA GAC ACA TCC AAG AAC CAG GTT GTC CTG TCC ATG AAC ACC 315 Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val Val Leu Ser Met Asn Thr
75 80 85
GTG GGT CCC GGG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA AGA ATG GAG 360 Val Gly Pro Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu
90 95 100
GAT TAC GAC GAA GCT ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ATT CTG GTC 405 Asp Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly lie Leu Val
105 110 115
ACC GTC TCC TCA G 418 Thr Val Ser Ser
120
配列番号 ： 5 5
配列の長さ ： 4 1 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成
起源
生物名 ： マウス及びヒ ト
直接の起源
クローン ： HE F— RVH— SK 2 b
特徴 ： ヒ ト I L一 6に対する再構成ヒ ト化 S K 2抗体の H鎖 V領域 バージョ ン （ b ) 及びそれをコー ドする遺伝子 <
ア ミ ノ酸 一 1 9 一 1 1 e a d e r
ア ミ ノ酸 1 3 0 F R 1
ア ミ ノ酸 3 1 3 7 C D R 1
ア ミ ノ酸 3 8 5 1 F R 2
ア ミ ノ酸 5 2 6 7 C D R 2
ア ミ ノ酸 6 8 9 9 F R 3
ア ミ ノ酸 1 0 0 - 1 0 9 : CDR 3
ア ミ ノ酸 1 1 0 - 1 2 0 : F R 4
配列
ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA 45 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro
-15 -10 - 5
CGT GCT CAC TCC CAA GTG ACT CTG AGG GAG TCT GGA CCT GCC CTT 90 Arg Ala His Ser Gin Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu
-1 1 5 10
GTG AGA CCT ACA CAG ACT CTG ACA CTC ACC TGC ACC TTC TCT GGC 135 Val Arg Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly
15 20 25
TTC TCA TTA AAT ACT TCT GGT ATG ACC GTA GGC TGG ATT CGC CAA 180 Phe Ser Leu Asn Thr Ser Gly Met Thr Val Gly Trp lie Arg Gin
30 35 40
CCT CCT GGA GAG GCA CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TGG TGG AAT 225 Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asn
45 50 55
GAT GAT AAG TAC TAT AAC CCT GCC CTG AAA GGC CGA CTG GCC GTC 270 Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Arg Leu Ala Val
60 65 70
TCC AAA GAC ACA TCC AAG AAC CAG GTT GTC CTG TCC ATG AAC ACC 315 Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val Val Leu Ser Met Asn Thr
75 80 85
GTG GGT CCC GGG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA AGA ATG GAG 360 Val Gly Pro Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu
90 95 100 co
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Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記に定義されるアミ ノ酸配列 ：
CDR1： Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Asn Leu Ala
CDR2： Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Asp
CDR3： Gin His Phe Trp Gly Thr Pro Pro
またはその一部から成る 3個の相補性決定領域 （CDR) およびフ レームワーク領域 （FR) を含む L鎖可変領域 （V領域） 、 並びに ヒ ト L鎖定常領域 （C領域） から構成されるヒ トインターロイキン 一 6 ( I L - 6 ) に対する抗体の L鎖。
2. 前記 L鎖 V領域の F Rがマウス抗体由来であることを特徴と する請求項 1 に記載の L鎖。
3. 前記 L鎖 V領域が配列番号 ： 2 6に示されるァミ ノ酸配列を 有することを特徵とする請求項 1 に記載の L鎖。
4. 前記 L鎖 V領域の FRがヒ ト抗体由来であることを特徵とす る請求項 1 に記載の L鎖。
5. 前記 L鎖 V領域の F Rがヒ ト抗体 R E I由来であることを特 徵とする請求項 1又は 4に記載の L鎖。
6. 前記 L鎖 V領域が下記アミ ノ酸配列 ：
( a) FR 1 ： Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys FR 2 ： Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly し ys Ala Pro Lys Leu
Leu lie Tyr
FR 3 ： Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys
FR4 ： Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys ( b ) FR 1 ： Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys
FR 2 ： Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
Leu lie Tyr
FR 3 ： Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
Thr Asp Tyr Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys
FR4 ： Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
またはその一部から成る 4個の F Rのいずれか 1 組を含むことを特 徵とする請求項 1 に記載の L鎖。
7. 前記ヒ ト L鎖 C領域が / c C領域であることを特徴とする請求 項 1 に記載の L鎖。
8. 下記に定義されるアミ ノ酸配列 ：
CDR1 ： Thr Ser Gly Met Thr Val Gly
CDR2： His lie Trp Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
Leu Lys Gly
CDR3： Met Glu Asp Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr
またはその一部から成る 3個の C D Rおよび F Rを含む H鎖 V領域、 並びにヒ ト L鎖 C領域から構成されるヒ ト I R— 6に対する抗体の H鎖。
9. 前記 H鎖 V領域の F Rがマウス抗体由来であることを特徴と する請求項 8に記載の H鎖。
10. 前記 H鎖 V領域が配列番号 ： 2 7に示されるア ミ ノ酸配列を 有することを特徴とする請求項 8に記載の H鎖。
11. 前記 H鎖 V領域の F Rがヒ ト抗体由来であることを特徵とす る請求項 8 に記載の H鎖。
12. 前記 H鎖 V領域の F Rがヒ ト抗体 DAW由来であることを特 徵とする請求項 8に記載の H鎖。
13. 前記 H鎖 V領域が下記のア ミ ノ酸配列 ：
( a ) FR 1 ： Gin Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val
Arg Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
FR 2 ： Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp
Leu Ala
FR 3 ： Arg Leu Ala Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin
Val Val Leu Ser Met Asn Thr Val Gly Pro Gly Asp
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
FR4 ： Trp Gly Gin Gly lie Leu Val Thr Val Ser Ser ( b ) FR 1 ： Gin Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val
Arg Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe
Ser Gly Phe Ser Leu Asn
FR 2 ： Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp
Leu Ala
FR 3 ： Arg Leu Ala Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin
Val Val Leu Ser Met Asn Thr Val Gly Pro Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
FR 4 ： Trp Gly Gin Gly lie Leu Val Thr Val Ser Ser またはその一部から成る 4個の F Rのいずれか 1組を含むことを特 徵とする請求項 8に記載の H鎖。
14. 前記ヒ ト C領域が 7— 1 C領域または 7— 4 C領域であるこ とを特徴とする請求項 8に記載の H鎖。
15. 請求項 1 に記載の L鎖および請求項 8に記載の H鎖からなる ヒ トイ ンタ一ロイキン一 6 に対する抗体。
16. 前記 V領域の F Rがマウス抗体由来であることを特徴とする 請求項 1 5に記載の抗体。
17. 前記 V領域の F Rがヒ ト抗体由来であることを特徴とする請 求項 1 5 に記載の抗体。
18. 請求項 1 に記載のァ ミ ノ酸配列またはその一部からなる 3個 の C D Rおよび F Rを含む L鎖 V領域ならびにヒ ト L鎖 C領域から なるヒ トイ ンターロイキン一 6 に対する抗体の L鎖をコー ドする D N A。
19. 前記 L鎖 V領域が配列番号 5 2 または 5 3で示されるヌ ク レ ォチ ド配列であることを特徴とする特許請求の範囲第 1 8項記載の D N A。
20. 請求項 8 に記載のァミ ノ酸配列またはその一部からなる 3個 の C D Rおよび F Rを含む H鎖 V領域ならびにヒ ト H鎖 C領域から なるヒ トインターロイキン一 6に対する抗体の H鎖をコー ドする D N A。
21. 前記 H鎖 V領域が配列番号 5 4 または 5 5で示されるヌク レ ォチ ド配列であることを特徴とする請求項 2 0に記載の D N A。
22. 請求項 1 8 または 1 9に記載の D N Aまたはその一部を含む 組換えべクタ一。
23. 請求項 2 0 または 2 1 に記載の D N Aまたはその一部を含む 組換えべクタ一。
24. 請求項 2 2に記載の組換えベクターおよび請求項 2 3に記載 の組換えベクターにより同時形質転換された形質転換体。
25. 請求項 2 4に記載の形質転換体を培養し、 次いで、 産生され た目的とする抗体を分離することを特徴とする遣伝子組換え技術を 使用した、 ヒ トインターロイキン一 6に対する抗体の製造方法。
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