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WO1994026879A1 - CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE L'ENZYME MALOLACTIQUE DE $i(LACTOCOCCUS LACTIS) - Google Patents

CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE L'ENZYME MALOLACTIQUE DE $i(LACTOCOCCUS LACTIS) Download PDF

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WO1994026879A1
WO1994026879A1 PCT/FR1994/000589 FR9400589W WO9426879A1 WO 1994026879 A1 WO1994026879 A1 WO 1994026879A1 FR 9400589 W FR9400589 W FR 9400589W WO 9426879 A1 WO9426879 A1 WO 9426879A1
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malolactic
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leu
gly
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Application number
PCT/FR1994/000589
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Inventor
Pierre Barre
Sylvie Dequin
Virginie Ansanay
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique - I.N.R.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP6525088A priority patent/JPH07509142A/ja
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Priority to EP94917029A priority patent/EP0656056A1/fr
Priority to CA002139665A priority patent/CA2139665A1/fr
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
    • C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
    • C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
    • C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process

Definitions

  • the present invention relates to the cloning of the structural gene of the malolactic enzyme of Lactococcus lactis, to its complete nucleotide sequence and to the deduced protein sequence, as well as to DNA fragments carrying the sequence coding for this gene. It also relates to the expression of this gene in different prokaryotic or eukaryotic hosts, and in particular in Saccharomyces and Schizosaccharomyces.
  • Malolactic fermentation a secondary fermentation which is observed during the vinification process in addition to the alcoholic fermentation carried out by yeasts, consists of the degradation by certain lactic bacteria of malic acid.
  • lactic acid and CO2 The bacterial species naturally present in the fermentation flora and responsible for malolactic fermentation belong to the genera Lactobacillus, Leucono ⁇ toc and Pediococcu ⁇ .
  • WILLIAMS et al. [App. About. Microbiol. 47: 288-293 (1984)], as well as European Application 103300 describe the cloning of a 5 kb DNA fragment carrying the gene for the malolactic enzyme of L. delbrueckii in S. Cerevi ⁇ iae and in E. coli.
  • a malolactic enzyme having an activity of a level comparable to that of the malolactic enzyme of bacteria of the genera
  • Lactococcus lactis It is a protein of around 230 kDa, made up of subunits of around 56 kDa. Its pHi is approximately 4.3, and its Km for malic acid is approximately 10 to 12 mM. Its N-terminal sequence has also been determined [RENAULT, Malolactic fermentation:
  • the inventors identified a DNA fragment of 2684 bp including the entire gene for the malolactic enzyme, and determined the sequence of this fragment, which is represented in the list of sequences in the appendix under the number SEQ.ID.N0. 1.
  • expression of the malolactic gene was obtained in different hosts, prokaryotes and eukaryotes.
  • the present invention relates to a nucleic acid fragment, characterized in that it comprises the sequence of the gene for the malolactic enzyme of Lactococcus lactis.
  • sequence of the gene for the malolactic enzyme of Lactococcus lactis is meant in particular the coding sequence extending from nucleotides 466 to 2085 (inclusive) of the sequence SEQ. ID. NO 1 represented in the annexed list of sequences, as well as any sequence which, taking into account the degeneracy of the genetic code, codes for the same polypeptide; this definition also includes the sequences carrying minor modifications intended to allow better expression of the gene in a given host.
  • the invention also encompasses nucleic acid fragments comprising a sequence homologous to or complementary to the gene sequence for the malolactic enzyme of Lactococcus lactis, as defined above, or of a fragment of at least 10 mothers. , preferably at least 20 mothers, of said sequence, and usable in particular as probes for the localization of said gene and / or as primers for its amplification.
  • the invention also relates to expression cassettes, comprising the sequence of the gene for the malolactic enzyme of Lactococcus lactis, under the control of sequences capable of regulating the expression of said gene.
  • sequences regulating the expression of a gene is meant promoter and terminator type sequences active in the host in which it is desired to obtain the expression of said gene. Promoters and terminators of different genes can be used, combined in different combinations. Among the sequences which can be used to obtain the expression in yeast of the gene for the malolactic enzyme of Lactococcus lactis, mention will be made, by way of nonlimiting example, of the promoters and terminators, known in themselves, of the genes of the alcohol dehydrogenase I (ADHI), phosphoglycerate kinase (PGK), and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).
  • ADHI alcohol dehydrogenase I
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • the expression cassettes according to the invention can be carried by plasmids, or integrated into the chromosomal DNA of the host yeast.
  • the invention also relates to recombinant vectors characterized in that they comprise at least one DNA fragment comprising the sequence of the gene for the malolactic enzyme of Lactococcus lactis, as defined above.
  • said vectors are expression vectors, comprising an expression cassette as defined above.
  • said vectors comprise regulatory sequences active in yeast.
  • the vectors in accordance with the invention are shuttle vectors, also having an origin of bacterial replication and a mark. selection in a bacterium (for example, antibiotic resistance gene).
  • vectors can be selected on the basis of the nature and the strength of the regulatory elements which enter the expression cassette.
  • the promoters and terminators described above can be chosen, or any other sequence making it possible to control and regulate the expression of a gene in yeast.
  • Another criterion for the choice of vectors resides in the number of copies thereof, which is conditioned by the choice of the origin of replication.
  • Replicative vector with a high number of copies, having as origin of replication an ARS chromosomal sequence.
  • Replicative vector with low copy number, having a chromosomal ARS sequence and a centromeric sequence.
  • the vectors in accordance with the invention also include markers for selection in yeast, such as auxotrophy markers: URA3, LEU2, HIS3, TRP ⁇ , ADE, etc ... and / or markers for resistance to antibiotics (G418, hygromycin B, chloramphenicol, phleomycin), to herbicides (sulfo eturon methyl), to copper, etc ...
  • markers for selection in yeast such as auxotrophy markers: URA3, LEU2, HIS3, TRP ⁇ , ADE, etc ... and / or markers for resistance to antibiotics (G418, hygromycin B, chloramphenicol, phleomycin), to herbicides (sulfo eturon methyl), to copper, etc ...
  • Vectors in accordance with the invention carrying the gene coding for the malolactic enzyme of Lactococcus lactis can be introduced into any strain of yeast, by different transformation techniques.
  • transformation techniques that can be used are the protoplast technique, the permeabilization technique with lithium salts and electroporation.
  • the method of this construction comprises the following stages: construction of an expression cassette comprising the gene for the malolactic enzyme and regulating elements of variable force; - introduction of this cassette either in mono ⁇ copy, or in multicopy in yeast.
  • YIp integrative vector
  • the present invention also relates to strains of transformed eukaryotic or prokaryotic cells, characterized in that they contain at least one heterologous DNA fragment carrying at least one copy of a gene coding for the malolactic enzyme of Lactococcus lactis, under the control of sequences regulating the expression of said gene in said cell.
  • said cells are yeast cells.
  • the yeast strains in accordance with the invention find numerous applications in the food industry. be silent and in particular in the field of oenology to accomplish malolactic fermentation.
  • said yeasts belong to the genus Saccharomyces.
  • said yeasts belong to the genus Schizosaccharomyces.
  • Schizosaccharomyces is sometimes used in oenology for its ability to degrade malate.
  • its use is limited, because this degradation which is carried out by the pathway of the malic enzyme does not produce lactate, but ethanol and CO2, which leads to a significant deacidification, which can have negative influences on the characteristics of the wine.
  • Schizosaccharomyces strains can have many uses in oenology; they can be used for example:
  • the malolactic enzyme was purified as described by RENAULT (1990, cited above); cf. also C. ROULLAND, (DEA in oenology-ampelology, September 1988, University of Bordeaux II)
  • Lactococcus lactis (IL 1441) is cultivated in the following medium:
  • the pH is adjusted to 5%.
  • the sterile medium is inoculated with 10% (v / v) of a preculture.
  • the cells were cultured in 3 liters of the above medium to 28 "C for 24 hours, harvested by centrifugation at 1000 g for 10 min at 4 ° C and washed 2 times with 0.9% NaCl.
  • the pellet is taken up in 30 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 6.0).
  • the cells are ground ultrasonicated for 6 min at 0 ° C. After centrifugation
  • the malolactic activity is measured by the decarbo ylation of malic acid followed by a CO 2 electrode (EISCHWEILER).
  • the supernatant from the 70% precipitation has no activity.
  • the pellet taken up in 2 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 6.0, and which contains all the malolactic activity is deposited on a filtration column on ACA 34 gel (ULTROGEL; fractionation range from 20,000 to 350,000 ) 40 cm long and 2.6 cm in diameter, previously balanced by the elution buffer: 0.01 M phosphate buffer, pH 6.0, 0.1 M KC1.
  • the elution is carried out with a flow rate of 18 ml / h.
  • the volume of the fractions collected is 2.4 ml.
  • the most active fractions correspond to fractions 50 to 54. They are combined for further purification by electrofocusing. 1 electrofocusing is carried out on a 110 ml LKB column. The pH gradient is formed by the ampholines used at 2% and stabilized by a glycerol density gradient established during the filling of the column. The most active fraction which focuses at pH 4.3, pHi of the protein, is recovered, then undergoes an additional purification step by chromatography ion exchange (anion exchange column SEPHAROSE Q, PHARMACIA).
  • the elution is carried out by a gradient from 0 to 0.5 M NaCl, in a 50 mM Tris-Hcl buffer, pH 7.6, 0.1 mM EDTA, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol.
  • the antibodies were obtained by injection into two rabbits of part of the purified preparation of malolactic protein according to the following protocol: - Subcutaneous injection of 2 ml of malolactic protein solution (100 ⁇ g in 0.3 M NaCl buffer) added with 2 ml of complete Freund's adjuvant.
  • the blood of two rabbits was collected 12 days after the second injection, left for 24 h at 4 ° C to allow clotting, centrifuged at 10,000 g for 10 min at 4 °, and the recovered serum is aliquoted and stored at -20 " C.
  • the anti-malolactic enzyme antibodies were then tested by ELISA test carried out on the two sera (called 120 and 119) obtained from the rabbit serum according to the protocol described by SAMBROOK et al. ((1989)]. determined that the optimal dilution for the use of antibodies was 1 / 1000th.
  • the specificity of the antibodies was then determined by immunoelectrophoretic transfer (Western blot).
  • polyclonal antibodies obtained are then fixed on the membrane and revealed by anti-rabbit antibodies coupled to alkaline phosphatase.
  • Serum 120 recognizes on the crude extract and on the purified fraction, a majority band of molecular weight approximately 60kD corresponding to the malolactic enzyme, and several contaminating bands of lower molecular weight.
  • serum 119 recognizes on the purified fraction, as on the crude extract, a single band, corresponding to the malolactic enzyme; this very specific serum was therefore used for subsequent experiments.
  • the genomic DNA of Lactococcus lactis IL 1441 was first extracted and purified. For this, 500 ml of a culture in the exponential phase are centrifuged at 5000 g for 10 min. The pellet is taken up in 5 ml of TE (10 mM Tris 1 M EDTA pH 8) containing
  • Ethidium bromide is extracted with isoamyl alcohol. After dilution with 2 volumes of water, the DNA is precipitated with 6 volumes of ethanol. The precipitate is recovered at the baguette and dissolved in 1 ml of TE. The concentration of DNA in solution was determined (1 ⁇ g / ⁇ l) by measuring the OD at 260 nm.
  • the digested DNA is precipitated with 1/20 vol of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol. After centrifugation, the DNA is taken up in 300 ⁇ l of TE and the fragments separated on a sucrose gradient for 15 hours at 25,000 rpm. 0.5 ml fractions are collected and analyzed on 0.8% agarose gel. The fraction containing 1.5 and 4 Kb fragments is dialyzed against TE for 4 hours. c) Ligation of the digested DNA to the vector ⁇ gtll The vector ⁇ gtll (derived from the bacteriophage ⁇ ) was chosen to produce the expression library.
  • the principle of production of the library consists in inserting DNA fragments into the 3 ′ region of the coding phase of the ⁇ -galactosidase gene, so as to express hybrid proteins under the control of the ⁇ -galactosidase promoter.
  • a cloning kit in ⁇ gtll was used according to the protocol recommended by the supplier.
  • DNA is ligated to dephosphorylated adapters having a blunt end and another EcoRI cohesive end. After removal of the free adapters by purification on an exclusion column, the "adapted" DNA fragments are phosphorylated and ligated to the arms of the vector also digested with EcoRl and dephosphorylated.
  • the in vi tro packaging of the phage particles is then carried out.
  • the library thus obtained was titrated by infection of the bacterial strain E. coli 1090 [hSd (r-km + k) lac U169, ProA + , Ion-, araDl39, StrA, SupF, trpC22: TnlO (pMC9)] aliquot fraction of the phage suspension, and the transformants selected on LB medium (bacterotryptone 10 g / 1, yeast extract 5 g / 1, NaCl 10 g / 1) + ampicillin (50 ⁇ g / ml) at 43 ° C (to induce bacterial lysis). The lysis ranges are obtained after 4 h of incubation.
  • the bank thus obtained represents approximately 3 times the genome of Lactococcus lactis.
  • plaques were obtained by plating the library on LB medium + ampicillin + MgCl2 and incubating 3:30 to 43 ° C (under non-expression).
  • the dishes are covered with nitrocellulose filters (C extra, AMERSHAM), impregnated with 10 mM IPTG and incubated for 4 h at 37 "C, so as to induce expression.
  • the filters are rinsed in TNT (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20), then incubated with light agitation for 30 min at room temperature in the same buffer.
  • a culture of E. coli Y1090 is carried out in
  • the cells are lysed completely by sonication at 0 ° C (six times 20 seconds), then centrifuged at 12,000 g for 10 min at 4 ° C. The lysate was recovered and incubated for 4 h at room temperature in the presence of 1 ml of antibody 119 diluted 1/10 'in TNT buffer
  • the exhausted serum is stored at 4 ° C. in the presence of sodium azide (0.05%).
  • c) Immunological Screening of the Bank The nitrocellulose filters are then incubated in the presence of the exhausted serum 119 as described above, and the revelation of the fixed antibodies is carried out using anti-rabbit antibodies coupled to alkaline phosphatase, as previously described.
  • an agarose core is taken and incubated in 500 ⁇ l of SM buffer (NaCl 6 g / 1, MgS0 7H 2 0 2 g / 1, Tris base 6 g / 1, gelatin 0.01 % pH 7.5) for 2 hours at 4 ° C to allow diffusion of phage particles. This suspension is again used to infect E. coli
  • the phage DNA of the 10 positive clones was extracted and analyzed.
  • a well isolated positive lysis range (subclone) was systematically used as starting material.
  • the DNA is extracted from the confluent lysis plaques on LB + ampicillin dishes. The dishes are covered with 5 ml of SM buffer and shaken at 4 ° C. for 2 hours. The suspension is recovered, treated with a few drops of chloroform, and centrifuged at 4000 g for 10 min at 4 ° C to remove bacterial debris. The DNA is extracted from the phage suspension thus purified.
  • the first analysis consisted in amplifying by PCR the inserts carried by the recombinant phages to determine their size.
  • oligonucleotides [lambda gtll Primer (forward) 24-MER and lambda gtll Primer (reverse) 24-MER, Company BIOLABS] corresponding to ⁇ -galactosidase sequences surrounding the EcoRI cloning site were used as primers for amplification of the inserts.
  • the sizes of the inserts shown are 3 kb, 2.7 kb, 2 kb, and 3 kb. These overlapping inserts, the total size of the cloned region is 4.5 kb.
  • the 6th clone which has an insert with a restriction map without any similarity to that of the other 5 clones, comes from a different genomic DNA fragment.
  • the nucleotide sequence of one of the 5 clones P153A exhibiting a 2.7 kb insert was determined by the dideoxitermination method on a sequencer Applied Biosystem. The total sequence of the insert is shown in the appendix, under the identification number SEQ ID NO 1, as well as the amino acid sequence which is deduced therefrom.
  • the coding region of the malolactic gene is 1620 nucleotides. The first 20 amino acids deduced from the nucleotide sequence obtained are identical to the protein sequence determined from the purified enzyme, with the exception of the 14th amino acid (lysine instead of cysteine determined from the purified enzyme).
  • This open reading phase is capable of coding for a protein of 53 kD, which is entirely compatible with the size of the malolactic enzyme of Lactococcus lactis estimated by gel filtration and by SDS-PAGE electrophoresis (approximately 60 kD).
  • the sequence SEQ ID NO 1 also comprises 465 nucleotides upstream from the translation initiation codon. This sequence includes the entire promoter of the malolactic enzyme gene. Lactococcus lactis promoters are on the order of 150 nucleotides upstream of the initiation codon. In addition, the characteristic signals of initiation of transcription of the genes of Lactococcus lactis are present.
  • malolactic enzyme which uses, like the malic enzyme, malate as a substrate, and requires NAD for the transformation of the substrate into lactate.
  • the medium is buffered to pH 6.5 by addition of citric acid.
  • L-lactate was carried out using a kit (BOEHRINGER), according to the protocol described by the supplier.
  • the level of lactate produced is quite low if it is compared to that produced by the control strain of L. lactis tested under the same conditions and from the same malate concentrations.
  • the production of L-lactate in L. lactis corresponds to the L-lactate produced by fermentation malolactic, and also a significant proportion of L-lactate produced by degradation of sugars, via L-LDH which converts pyruvate into lactate.
  • the coding region was placed under the control of regulatory elements.
  • the expression plasmid pVTlOO-U was used. This plasmid contains the origin of yeast replication 2 ⁇ , the selection marker URA3 and the strong regulatory elements ADH (promoter and terminator of alcohol dehyrogenase I), as well as the bacterial elements (origin of replication and gene for resistance to 'ampicillin).
  • This plasmid has been described by VERNET et al [Gene 52; 225-233, (1987)]
  • the coding region of the malolactic gene was amplified by PCR from the plasmid pl53A, using primers consisting of oligonucleotides derived from the sequence of the malolactic gene.
  • primers consisting of oligonucleotides derived from the sequence of the malolactic gene.
  • the introduction of Xhol restriction sites upstream and Xbal downstream of the coding region was carried out during the amplifications.
  • oligonucleotides used as primers are: - an oligonucleotide making it possible to isolate the coding region at the level of the ATG translation initiation codon (primer 1) and comprising an Xhol site
  • the chosen oligonucleotide (primer 3') is located a few nucleotides downstream from the translation termination codon.
  • Taq buffer 10X 10 ⁇ l Taq polymerase (5 ⁇ / ⁇ l) 0.5 ⁇ l dNTP2 ⁇ M 10 ⁇ l MgCl 2 25mM 6 ⁇ l pl53A 4 ⁇ l (40ng)
  • Amplification conditions 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 40 ° C, 1 min at 72 ° C. for 30 cycles.
  • the size of the amplified fragments was verified by analysis of an aliquot on agarose gel. 100 ng of the amplified fragments were digested with Xhol and Xbal and ligated to 50 ng of vector pVTlOO-U previously digested with Xhol and Xbal and dephosphorylated.
  • the vector pVTlOO-U obtained, called pMl, is represented in FIG. 3.
  • pMl Yeast transformation
  • the yeast strain Saccharomyces cerevisiae SCV5M was transformed with the vector pM1.
  • Microorganisms held by the Institut Pasteur, under the number 1-1222. It is a haploid laboratory strain, ura “ , MATa, derived from an oenological strain.
  • the two media used do not contain uracil, which ensures selection pressure for the plasmids.
  • a transformant of ScV5M by the plasmid pVTlOO-U containing no insert was used as negative control.
  • CULTURE AND DOSAGE CONDITIONS 8 ml of medium are inoculated with the yeast strains (transformants and control). Growth is performed in sterile 10 ml tubes, at 28 ° C, for 60 h, without shaking.
  • the recombinant strains therefore degrade the malate to lactate by malolactic fermentation, and with greater efficiency at acid pH, therefore under conditions close to those of oenology.
  • the expression of the malolactic gene has also been studied in Schizosaccharomyces pombe.
  • the coding region of the malolactic gene was placed under the control of a promoter of S. pombe, in a shuttle vector S. pombe / E. coli. a) Introduction of qèn ? TM lactic acid on the PARTI multicopy plasmid
  • the expression plasmid pART1 was used. This plasmid contains the origin of replication of yeast ARS1, the selection marker LEU2 and the promoter of S. pombe alcohol dehydrogenase, as well as bacterial elements (origin of replication and gene for resistance to ampicillin). This plasmid has been described by McLeod et al., (EMBO J. 6; 729-736, 1987).
  • the coding region of the malolactic gene was amplified by PCR from the plasmid pl53A, using primers consisting of oligonucleotides derived from the sequence of the malolactic gene. In order to facilitate cloning, the introduction of BamHI restriction sites upstream and Sac1 downstream of the coding region was carried out during the amplifications.
  • the oligonucleotides used as primers are:
  • an oligonucleotide allowing the coding region to be isolated at the level of the ATG translation initiation codon (primer 12) and comprising a BamHI site - on the 3 ′ side, the chosen oligonucleotide (primer 12)
  • the size of the amplified fragments was verified by analysis of an aliquot on agarose gel.
  • transformants obtained One of the transformants obtained, called Sp / D42, was tested for its ability to carry out malolactic fermentation (conversion of malate to lactate).
  • the transformant was cultivated under the following conditions:
  • a transformant of the same strain by the plasmid pART1 containing no insert was used as a negative control.
  • the cultures are centrifuged for 5 min at 4000 g and the supernatant tested for the production of L-lactate using a BOEHRINGER kit, as indicated previously.
  • the transformant Sp / D42 is capable of degrading practically all of the L-malate in the medium (at pH 3.5, only 150 mg / 1 of L-malate have not been degraded) and moreover, to convert more than 80% of the malate present into L-lactate (3.05 g / 1).
  • TABLE III DETERMINATION OF LACTATE IN S. POMBE
  • AAAAGTAGAG TGATTTTACT CTACTTTTTT AGAATACTTT TATATAATAG GAAATATGAA 120
  • AAAAAACTTA AAGAAACGAA AATATCGGGA ATTAGTCTTC CCTTATATGC CTTTTTCGTA 2165

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Abstract

L'invention est relative à l'obtention d'un fragment d'ADN comprenant le gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, et au clonage et à l'expression de ce gène chez E. coli et chez des levures, en particulier des genres Saccharomyces et Schizosaccharomyces.

Description

94/26879
1 CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE L'ENZYME MALOLACTIQUE DE LACTOCOCCUS LACTIS.
La présente Invention est relative au clonage du gène de structure de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, à sa séquence nucleotidique complète et à la séquence protéique déduite, ainsi qu'à des fragments d'ADN portant la séquence codant pour ce gène. Elle est relative également à l'expression de ce gène dans différents hôtes procaryotes ou eucaryotes, et en particulier dans Saccharomyces et Schizosaccharomyces .
La fermentation malolactique, fermentation secondaire qui est observée au cours du processus de vinification en addition de la fermentation alcoolique réalisée par des levures, consiste en la dégradation par certaines bactéries lactiques de l'acide malique .présent dans les vins, en acide lactique et CO2• Les espèces bactériennes naturellement présentes dans la flore fermentaire et responsables de la fermentation malolactique appartiennent aux genres Lactobacillus, Leuconoεtoc et Pediococcuε.
Cette réaction présente deux avantages principaux :
- Elle conduit à une désacidification du vin par transformation d'un diacide (L-malate) en un monoacide (L-lactate) , dont les conséquences sont avantageuses au niveau organoleptique, pour la majorité des vins rouges et certains vins blancs,
- Elle permet la stabilisation microbiologique du vin, et donc une meilleure conservation, par utilisation d'un substrat fermentescible, ce qui empêche des fermentations ultérieures par d'autres souches de microorganismes indésirables. Enfin la fermentation malolactique peut avoir une influence sur la qualité du vin au niveau aromatique. Cette réaction pose toutefois un certain nombre de problèmes, du fait de sa lenteur et de son caractère incontrôlable.
La fermentation malolactique ne se produit spontanément qu'à la fin du processus naturel de vini¬ fication ; en effet, le pH, la teneur en éthanol et la présence de SO2 dans le vin ralentissent considérablement la croissance des bactéries lactiques naturellement présentes dans la masse fer entaire et responsables de la fermentation malolactique. Pour tenter d'accélérer cette fermentation, la technique la plus couramment employée réside en l'adjonction au milieu fermentaire, d'un inoculât de bactéries lactiques.
Toutefois, cette technique ne résout pas toujours les problèmes d'implantation des bactéries lactiques, en raison de leur difficulté à s'adapter au milieu vin. D'autre part, l'introduction de bactéries lactiques revient à introduire, outre l'enzyme malolactique dont l'activité est recherchée, de nombreuses autres enzymes, dont l'action sur les nombreux substrats présents dans le vin, peut aboutir à une évolution très difficilement contrôlable des qualités organoleptiques du produit.
Il serait donc souhaitable d'avoir la possibi- lité de mettre en oeuvre la fermentation malolactique de façon à aboutir rapidement, et en éliminant des variables incontrôlables, à une amélioration du produit obtenu.
Dans le but de mieux contrôler la fermentation malolactique, il a été proposé de cloner les gènes des enzymes malolactiques des bactéries lactiques, de les introduire et exprimer dans un microorganisme normalement impliqué dans la fabrication du vin, tel que S. Cerevisiae.
WILLIAMS et al. [App. Environ. Microbiol. 47 : 288-293 (1984)], ainsi que la Demande Européenne 103300 décrivent le clonage d'un fragment d'ADN de 5 kb portant le gène de l'enzyme malolactique de L. delbrueckii chez S. Cereviεiae et chez E. coli .
Le gène de l'enzyme malolactique de L. oenos a également été clone chez E. Coli [LAUTENACH et al., Microbiol., 39 : 29-39 (1984)].
Toutefois, les souches de microorganismes transformés n'expriment le gène qu'à un taux très faible, insuffisant pour permettre son utilisation dans la fabri¬ cation du vin. En outre dans les 2 cas, une instabilité de l'ADN clone chez E. Coli a été observée, allant même jusqu'à entraîner une perte complète du gène.
D'autre part une enzyme malolactique, présentant une activité d'un niveau comparable à celle de 1'enzyme malolactique des bactéries des genres
Leuconostoc, Pediococcus et Lactobacillus mentionnés plus haut a récemment été purifiée à partir de
Lactococcus lactis. C'est une protéine d'environ 230 kDa, constituée de sous-unités d'environ 56 kDa. Son pHi est d'environ 4,3, et son Km pour l'acide malique est d'environ 10 à 12 mM. Sa séquence N-terminale a également été déterminée [RENAULT, Malolactic fermentation :
Genetics and Genetic Engineering, GIM90, 6th
International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, Strasbourg (1990)].
A partir d'une préparation purifiée de cette enzyme malolactique, les Inventeurs ont obtenu des préparations d'anticorps polyclonaux spécifiquement dirigés contre cette enzyme. Une banque d'ADN de Lactococcus lactis a ensuite été réalisée dans le vecteur λgtll, dans E. coli . Le criblage de cette banque avec les anticorps obtenus a permis de cloner des fragments d'ADN, qui représentent à eux tous 4.5 kb d'une même région d'ADN genomique de Lactococcus lactis, contenant le gène malolactique, et un fragment du gène de la malate perméase, ces gènes étant organisés en opéron. Les Inventeurs ont identifié un fragment d'ADN de 2684 pb incluant la totalité du gène de l'enzyme malolactique, et ont déterminé la séquence de ce fragment, qui est représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ.ID.N0.1. En outre, l'expression du gène malolactique a été obtenue dans différents hôtes, procaryotes et eucaryotes. Ainsi, l'introduction du gène malolactique de Lactococcus lactis dans E. coli, sous contrôle de ses propres éléments de régulation ainsi que 1'expression dudit gène dans la levure sous contrôle d'éléments de régulation de levure font été réalisées.
La présente Invention a pour objet un fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence du gène de 1'enzyme malolactique de Lactococcus lactis.
Par "séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis" on entend en particulier la séquence codante s'étendant des nucléotides 466 à 2085 (inclus) de la séquence SEQ. ID. NO 1 représentée dans la liste des séquences en annexe, ainsi que toute séquence qui, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, code pour le même polypeptide ; cette définition comprend également les séquences portant des modifications mineures destinées à permettre une meilleure expression du gène dans un hôte déterminé.
L'Invention englobe également des fragments d'acide nucléique comprenant une séquence homologue ou complémentaire de la séquence du gène de 1'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, telle que définie ci- dessus, ou d'un fragment d'au moins 10-mères, préférentiellement au moins 20-mères, de ladite séquence, et utilisables en particulier comme sondes pour la localisation dudit gène et/ou comme amorces pour son amplification. L'Invention a également pour objet des cassettes d'expression, comprenant la séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, sous contrôle de séquences propres à réguler 1'expression dudit gène.
Par "séquences régulant l'expression d'un gène" on entend des séquences de type promoteur et termi- nateur actives chez 1'hôte dans lequel on souhaite obtenir l'expression dudit gêne. Les promoteurs et terminateurs de différents gènes peuvent être utilisés, associés dans des combinaisons différentes. Parmi les séquences utilisables pour obtenir l'expression dans la levure du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, on citera, à titre d'exemple non limitatif, les promoteurs et terminateurs, connus en eux-mêmes, des gènes de l'alcool- déshydrogénase I (ADHI) , de la phosphoglycérate kinase (PGK) , et de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) .
Les cassettes d'expression conformes à 1'invention peuvent être portées par des plasmides, ou intégrées dans l'ADN chromosomique de la levure hôte.
L'Invention a également pour objet des vec¬ teurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'ADN comportant la séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs comprennent des séquences de régulation actives dans la levure.
Avantageusement, les vecteurs conformes à l'Invention sont des vecteurs navette, possédant égale- ment une origine de replication bactérienne et un mar- queur de sélection dans une bactérie (par exemple, gène de résistance à un antibiotique) .
Ces vecteurs pourront être sélectionnés sur la base de la nature et de la force des éléments régulateurs qui entrent dans la cassette d'expression. On peut choi¬ sir les promoteurs et terminateurs décrits plus haut, ou toute autre séquence permettant de contrôler et de réguler l'expression d'un gène dans la levure.
Un autre critère du choix des vecteurs réside dans le nombre de copies de ceux-ci, qui est conditionné par le choix de l'origine de replication.
A titre d'exemple, un choix peut être fait entre les vecteurs suivants :
. Vecteur réplicatif (YEp) à haut nombre de copies, possédant comme origine de replication dans la levure une partie du plasmide 2μ endogène.
. Vecteur réplicatif (YRp) à haut nombre de copies, possédant comme origine de replication une sé¬ quence ARS chromosomique. . Vecteur réplicatif (YLp) linéaire à haut nombre de copies possédant des séquences télo ériques comme origine de replication.
. Vecteur réplicatif (YCp) à bas nombre de copies, possédant une séquence ARS chromosomique et une séquence centromérique.
Préférentiellement, les vecteurs conformes à 1'Invention comportent également des marqueurs de sélec¬ tion dans la levure, tels que des marqueurs d'auxotrophie : URA3, LEU2, HIS3, TRP^, ADE, etc ...et/ou des marqueurs de résistance à des antibiotiques (G418, hygromycine B, chloramphénicol, phléomycine) , à des herbicides (sulfo éturon methyl) , au cuivre, etc...
Des vecteurs conformes à l'Invention, portant le gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis peuvent être introduits dans toutes souches de levure, par différentes techniques de transformation. Parmi les techniques de transformation les plus courantes utilisables on citera la technique des protoplastes, la technique de perméabilisation aux sels de lithium et 1'électroporation. Dans tous les cas, le procédé de cette construction comprend les étapes suivantes : construction d'une cassette d'expression comprenant le gène de 1'enzyme malolactique et des éléments régulateurs de force variable ; - introduction de cette cassette soit en mono¬ copie, soit en multicopie dans la levure.
On peut également choisir d'intégrer le gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, muni de ses séquences de contrôle, dans le génome de la levure, auquel cas on choisira par exemple un vecteur intégratif (YIp) ne possédant pas d'origine de replication dans la levure ; il est également possible d'intégrer ce gène en utilisant d'autres techniques, par exemple la co- transformation. II est possible de moduler le taux d'expres¬ sion du gène codant pour 1'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, en jouant notamment sur le nombre de copies du gène introduites dans la levure, et/ou sur la force des éléments de régulation qui y sont associés. La présente Invention a également pour objet des souches de cellules eucaryotes ou procaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'ADN hétérologue portant au moins une copie d'un gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, sous contrôle de séquences régulant l'expression dudit gène dans ladite cellule.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdites cellules sont des cellules de levure. Les souches de levure conformes à l'invention trouvent de nombreuses applications dans 1'agro-alimen- taire et en particulier dans le domaine de 1'oenologie pour accomplir la fermentation malolactique.
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, lesdites levures appartiennent au genre Saccharomyces .
Selon une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, lesdites levures appartiennent au genre Schizosaccharomyces .
Schizosaccharomyces est parfois utilisée en oenologie pour sa capacité à dégrader le malate. Cependant, son utilisation est limitée, car cette dégradation qui est effectuée par la voie de l'enzyme malique ne produit pas de lactate, mais de l'éthanol et du CO2, ce qui entraîne une désacidification importante, pouvant avoir des influences négatives sur les caractéristiques du vin.
Des souches de Schizosaccharomyces obtenues conformément à 1'Invention et exprimant le gène de l'enzyme malolactique, réalisent la fermentation malolactique avec dégradation du L-malate en L-lactate, et présentent ainsi l'avantage de permettre une désacidification beaucoup moins importante que celle qui résulte de la conversion malate/éthanol.
Ces souches de Schizosaccharomyces peuvent avoir de nombreuses utilisations en oenologie ; elles peuvent être par exemple utilisées :
- en co-culture avec une souche oenologique de Saccharomyces cereviεiae , -
- en cellules fixées. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant le clonage du gène de 1'enzyme malolactique de Lactococcus lactis et son expression dans des bactéries et des levures. - Méthodes générales
L'enzyme malolactique a été purifiée comme décrit par RENAULT (1990, communication précitée) ; cf. aussi C. ROULLAND, (DEA d'oenologie-ampélologie, Septembre 1988, Université de Bordeaux II)
Les techniques générales de manipulation des acides nucléiques et de clonage moléculaire auquelles il est fait référence dans les exemples qui suivent sont celles décrites par SAMBROOK et al. [ Molécular Cloning : A Laboratory Manual (second édition) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989)] EXEMPLE 1 - PURIFICATION DE L'ENZYME MALOLACTIQUE Le protocole d'extraction est brièvement rappelé ci- après : Souche - conditions de culture
Lactococcus lactis (IL 1441) est cultivé dans le milieu suivant :
Extrait de levure 6 g
Tryptone 2 g
Glucose 15 g
Acide DL Malique 15 g
K2HP04 0,5 g
KH2P04 0,5 g
MgS04 0,4 g
NaCl 0,02 g
FeS04 0,004 g
MnS04 0,02 g
H20 qsp 1 1
Le pH est ajusté à 5%. Le milieu stérile est inoculé avec 10% (v/v) d'une préculture.
- Préparation d'un extrait brut et dosages
Les cellules sont cultivées dans 3 litres du milieu ci-dessus à 28"C, pendant 24 heures, récoltées par centrifugation à 1000 g pendant 10 mn à 4*C, et lavées 2 fois avec NaCl 0,9%. Le culot est repris dans 30 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 6,0). Les cellules sont broyées aux ultrasons pendant 6 mn à 0*C. Après centrifugation
(30 000g, 15 mn, à 4'C) le surnageant constitue l'extrait brut.
Les protéines sont dosées par le BCA Protein Assay Reagent (PIERCE) .
L'activité malolactique est mesurée par la décarbo ylation de 1'acide malique suivie avec une électrode à C02 (EISCHWEILER) .
- Purification de l'enzyme
Après traitement par la DNAse I (1 mg/ml et 15 mn d'incubation à température ambiante), l'extrait brut est soumis à une précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium (35% de saturation, puis 70%).
Le surnageant de la précipitation à 70% n'a pas d'activité. Le culot, repris dans 2 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 6,0, et qui contient toute l'activité malolactique est déposé sur une colonne de filtration sur gel ACA 34 (ULTROGEL ; domaine de fractionnement de 20 000 à 350 000) de 40 cm de longueur et 2,6 cm de diamètre, préalablement équilibrée par le tampon d'élution : tampon phosphate 0,01 M, pH 6,0, KC1 0,1 M. L'élution est effectuée avec un débit de 18 ml/h. Le volume des fractions collectées est de 2,4 ml.
Dans ces conditions les fractions les plus actives correspondent aux fractions 50 à 54. Elles sont rassemblées en vue d'une purification complémentaire par électrofocalisation. L1électrofocalisation est réalisée sur colonne LKB de 110 ml. Le gradient de pH est formé grâce aux ampholines utilisées à 2% et stabilisé par un gradient de densité de glycerol établi lors du remplissage de la colonne. La fraction la plus active qui focalise au pH de 4,3, pHi de la protéine, est récupérée, puis subit une étape supplémentaire de purification par chromatographie d'échange d'ions (colonne échangeuse d'anions SEPHAROSE Q, PHARMACIA) .
L'élution est effectuée par un gradient de 0 à 0,5 M NaCl, dans un tampon Tris-Hcl 50 mM, pH 7,6, EDTA 0,1 mM, β-mercaptoéthanol 1 mM .
La fraction renfermant l'activité malolactique est éluée à une concentration en NaCl de 0,33 M. C'est cette fraction qui est utilisée pour l'obtention d'anticorps. EXEMPLE 2 : OBTENTION D'ANTICORPS POLYCLONAUX DIRIGES CONTRE L'ENZYME MAI-OI-ACTIOϋE DE LACTOCOCCUS LACTIS :
Les anticorps ont été obtenus par injection à deux lapins d'une partie de la préparation purifiée de protéine malolactique selon le protocole suivant : - Injection sous-cutanée de 2 ml de solution de protéine malolactique (100 μg dans tampon NaCl 0,3 M) additionnés de 2 ml d'adjuvant de Freund complet.
- Deuxième injection 40 jours après, avec la même quantité de protéine malolactique et 2 ml d'adjuvant de Freund incomplet.
Le sang des deux lapins est récupéré 12 jours après la 2ème injection, laissé 24 h à 4*C pour permettre la coagulation, centrifugé à 10 000 g pendant 10 mn à 4*, et le sérum récupéré est aliquoté et stocké à -20"C. Les anticorps anti-enzyme malolactique ont ensuite été testés par test ELISA réalisé sur les deux sérums (appelés 120 et 119) obtenus à partir du sérum des lapins selon le protocole décrit par SAMBROOK et al. [(1989)]. Cette analyse a permis de déterminer que la dilution optimale pour l'utilisation des anticorps était de l/1000ème.
La spécificité des anticorps a alors été déterminée par transfert immunoelectrophoretique (Western blot) . Les protéines d'un extrait brut de Lactococcus lactis (préparé comme décrit à l'Exemple 1) d'une part, et de la préparation purifiée d'enzyme malolactique d'autre part, ont été séparées par électrophorèse SDS- PAGE et transférées sur membrane de nitrocellulose.
Les anticorps polyclonaux obtenus sont alors fixés sur la membrane et révélés par des anticorps anti¬ lapin couplés à la phosphatase alcaline.
Le sérum 120 reconnaît sur l'extrait brut et sur la fraction purifiée, une bande majoritaire de poids moléculaire environ 60kD correspondant à l'enzyme malolactique, et plusieurs bandes contaminantes de poids moléculaire inférieur.
En revanche, le sérum 119 reconnaît sur la fraction purifiée, comme sur l'extrait brut, une seule bande, correspondant à l'enzyme malolactique ; ce sérum très spécifique a donc été utilisé pour les expériences ultérieures.
EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION D'UNE BANQUE D'EXPRESSION D'ADN GENOMIODE DE LACTOCOCCUS LACTIS DANS E. COLI a) Extraction de l'ADN de Lactococcus lactis La banque d'ADN genomique de Lactococcus lactis a été réalisée dans le vecteur λgtll.
L'ADN genomique de Lactococcus lactis IL 1441 a, dans un premier temps, été extrait et purifié. Pour cela, 500 ml d'une culture en phase exponentielle sont centrifugés à 5000g pendant 10 mn. Le culot est repris dans 5 ml de TE (Tris 10 mM EDTA 1 M pH 8) contenant
150 mM de NaCl et 1 mg/ml de lysozyme, et incubé 10 min à
37*C. 1 ml de SDS, 25% dans de l'EDTA, 0,1 M pH 8 sont ajoutés et le mélange est incubé 15 min à 60*C. L'ADN est purifié par deux extractions au phénol-chloroforme, suivies de deux autres au chloroforme-alcool isoamylique
(24:1). Une purification finale est réalisée sur gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium.
Le bromure d'éthidium est extrait à l'alcool isoamylique. Après dilution par 2 volumes d'eau, l'ADN est précipité par 6 volumes d'éthanol. Le précipité est récupéré à la baguette et dissous dans 1 ml de TE. La concentration de l'ADN en solution a été déterminée (1 μg/μl) par mesure de la DO à 260 nm. b) Digestion de l'ADN de Lactococcus lactis 125 μg d'ADN de Lactococcus lactis sont digérés partiellement par deux unités d'enzyme AluI et deux unités de HaelII pendant 35 min. à 37*C de manière à générer des extrémités à bouts francs. La digestion est arrêtée par addition d'EDTA à 0,1 M final. L'ADN digéré est précipité par 1/20 vol d'acétate de sodium 3 M et 2 volumes d'éthanol. Après centrifugation, l'ADN est repris dans 300 μl de TE et les fragments séparés sur gradient de sucrose pendant 15 heures à 25000 rpm. Des fractions de 0,5 ml sont récoltées et analysées sur gel d'agarose 0,8%. La fraction contenant des fragments de 1,5 et 4 Kb est dialysée contre du TE pendant 4 heures. c) Ligation de l'ADN digéré au vecteur λgtll Le vecteur λgtll (dérivé du bactériophage λ) a été choisi pour réaliser la banque d'expression. Le principe de réalisation de la banque consiste à insérer des fragments d'ADN dans la région 3' de la phase codante du gène de la β-galactosidase, de façon à exprimer des protéines hybrides sous contrôle du promoteur de la β- galactosidase.
Un kit de clonage dans λgtll (AMERSHAM) , a été utilisé selon le protocole préconisé par le fournisseur.
1 μg d'ADN digéré (à bouts francs) et dialyse comme décrit ci-dessus a été inséré dans le vecteur λgtll selon le principe suivant :
L'ADN est ligué à des adaptateurs déphosphorylés possédant une extrémité à bout franc et une autre extrémité cohésive EcoRI. Après élimination des adaptateurs libres par purification sur colonne d'exclusion, les fragments d'ADN "adaptés" sont phosphorylés et ligués aux bras du vecteur également digérés par EcoRl et déphosphorylés.
L'empaquetage in vi tro des particules phagiques est ensuite réalisé. La banque ainsi obtenue a été titrée par infection de la souche bactérienne E. coli 1090 [hSd (r-km+k) lac U169, ProA+, Ion-, araDl39, StrA, SupF, trpC22 : TnlO(pMC9)] par une fraction aliquote de la suspension phagique, et les transformants sélectionnés sur milieu LB (bactotryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 10 g/1) + ampicilline (50 μg/ml) à 43'C (pour induire la lyse bactérienne) . Les plages de lyse sont obtenues après 4h d'incubation.
La banque ainsi obtenue représente environ 3 fois le génome de Lactococcus lactis. EXEMPLE 4 ; CRIBLAGE DE LA BANQUE D'ADN GENOMIQUE a) Etalement de la banque et préparation des fjltreg
75000 plages de lyse ont été obtenues par étalement de la banque sur milieu LB+ ampicilline + MgCl2 et incubation 3h30 à 43*C (conditions de non-expression). Les boîtes sont recouvertes de filtres de nitrocellulose (C extra, AMERSHAM) , imprégnés d'IPTG 10 mM et incubées pendant 4 h à 37"C, de manière à induire 1'expression.
Les filtres sont rincés dans du TNT (Tris-HCl 10 mM pH 8, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05%), puis incubés avec légère agitation 30 min à température ambiante dans le même tampon.
Afin de limiter la détection de clones "faux positifs" pouvant hybrider de manière non spécifique lors du criblage de la banque, une deuxième série de filtres, constituant des doubles de la première série, ont été déposés sur les boîtes, incubés et traités de la même façon.
Figure imgf000016_0001
Le criblage immunologique de la banque est réalisé à 1'aide du sérum 119 préalablement épuisé contre les protéines de E. coli . L'épuisement du sérum est effectué comme suit :
Une culture de E. coli Y1090 est réalisée dans
100 ml de LB + ampicilline pendant 24h à 37"C. La culture est centrifugée à 5000 g pendant 10 min à 4*C. Le culot est repris dans 3 ml de tampon (Tris 50 mM EDTA 10 mM pH
8), et la suspension congelée à -20*C et décongelée
(plusieurs fois) . Les cellules sont lysées complètement par sonication à 0*C (six fois 20 secondes), puis centrifugées à 12000 g pendant 10 min à 4*C. Le lysat est récupéré et incubé 4h à température ambiante en présence de 1 ml d'anticorps 119 dilué au 1/10' dans du tampon TNT
+ 1% gélatine + 3% BSA + 5% lait écrémé en poudre.
Le sérum épuisé est stocké à 4'C en présence d'azide de sodium (0,05%). c) Criblage immunoloσiαue de la banque Les filtres de nitrocellulose sont alors incubés en présence du sérum 119 épuisé comme décrit ci- dessus, et la révélation des anticorps fixés est réalisée à l'aide d'anticorps anti-lapin couplés à la phosphatase alcaline, comme décrit précédemment.
Seuls les clones montrant un signal positif sur les deux filtres ont été pris en considération. 24 clones positifs ont ainsi été sélectionnés. Afin de vérifier la spécificité du signal obtenu, les clones positifs ont été sous-clonés et une deuxième détection à l'aide des anticorps a été réalisée.
Autour de chaque plage de lyse positive, une carotte d'agarose est prélevée et incubée dans 500 μl de tampon SM (NaCl 6 g/1, MgS0 7H20 2 g/1, Tris base 6 g/1, gélatine 0,01 % pH 7,5), pendant 2 heures à 4*C afin de permettre la diffusion des particules phagiques. Cette suspension est de nouveau utilisée pour infecter E. coli
1090 et le mélange étalé sur boîte LB + ampicilline + MgCl comme précédemment, de façon à obtenir des plages de lyses très isolées. Un deuxième criblage par le sérum 119 réalisé comme précédemment a permis d'éliminer 14 clones sur les 24 testés, qui ne présentaient plus de signaux significatifs. Les 10 autres clones, très nettement positifs ont été sélectionnés. d) Caractérisation des clones recombinants
L'ADN phagique des 10 clones positifs a été extrait et analysé. Une plage de lyse positive bien isolée (sous-clone) a été systématiquement utilisée comme matériel de départ. L'ADN est extrait à partir des plages de lyse confluantes sur boîtes LB + ampicilline. Les boîtes sont recouvertes de 5 ml de tampon SM et agitées à 4'C pendant 2 heures. La suspension est récupérée, additionnée de quelques gouttes de chloroforme, et centrifugée à 4000 g pendant 10 min à 4*C pour éliminer les débris bactériens. L'ADN est extrait à partir de la suspension phagique ainsi purifiée.
La première analyse a consisté à amplifier par PCR les inserts portés par les phages recombinants pour en déterminer la taille.
Deux oligonucléotides [lambda gtll Primer (forward) 24-MER et lambda gtll Primer (reverse) 24-MER, Société BIOLABS] correspondant à des séquences de la β-galactosidase entourant le site de clonage EcoRI ont été utilisés comme amorces d'amplification des inserts.
L'analyse des produits d'amplification sur gel d'agarose (1,6%) a permis de déterminer que les 10 clones λgtll sélectionnés avaient des inserts de taille comprise entre 2 et 3,5 kb. Afin d'établir la carte de restriction des fragments d'ADN clones, les inserts des vecteurs λgtll ont été sous-clonés dans le plasmide pUC18 [YANISH-PERRON et al. Gène n* 33, p. 103-119, (1985)]. Le sous-clonage de 6 inserts a ainsi pu être obtenu. La carte de restriction des 6 inserts a été réalisée ; 5 des 6 inserts présentent une région commune, suggérant que ces 5 inserts proviennent d'un même fragment genomique. Ceci a été vérifié par hybridation de Southern de fragments de restriction d'ADN genomique de Lactococcus lactis séparés sur gel d'agarose et transférés sur membrane de Nylon, avec les inserts marqués radioactivement au 32p#
Les cartes de restriction de 4 de ces 5 inserts sont représentées à la figure 1.
Les tailles des inserts représentés sont de 3 kb, 2,7 kb, 2 kb, et 3 kb. Ces inserts se chevauchant, la taille totale de la région clonée est de 4,5 kb.
Le 6ème clone, qui présente un insert ayant une carte de restriction sans aucune similitude avec celle des 5 autres clones, provient d'un fragment d'ADN genomique différent.
Afin de déterminer si l'un des deux types de fragments d'ADN clones contenait la région 5' du gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, une hybridation de Southern des inserts séparés sur gel d'agarose et transférés sur membrane de nylon, avec une sonde d' oligonucléotides dérivés de la séquence protéique de l'extrémité NH terminale de l'enzyme malolactique (P. RENAULT, communication précitée) a été réalisée. La sonde choisie est un mélange d'oligonucléotides déduits de la séquence incluant les 6 premiers acides aminés : ATG(A,C)G(G,A,T,C)GC(G,A,T,C)CA(T,C)GA(G,A)AT
Les 5 inserts provenant d'un même fragment d'ADN hybrident avec la sonde ; ce qui prouve que 1 'extrémité 5 ' du gène codant pour 1'enzyme malolactique de Lactococcus lactis est contenue dans les 5 inserts clones. Par contre, aucune hybridation n'a été détectée sur le 6ème clone. e) Séquence du clone P153A
La séquence nucleotidique d'un des 5 clones P153A présentant un insert de 2,7 kb a été déterminée par la méthode de didéoxiterminaison sur un séquenceur Applied Biosystem. La séquence totale de 1'insert est représentée en annexe, sous le numéro d'identification SEQ ID NO 1, ainsi que la séquence en acides aminés qui en est déduite. La région codante du gène malolactique est de 1620 nucleotides. Les 20 premiers acides aminés déduits de la séquence nucleotidique obtenue sont identiques à la séquence protéique déterminée à partir de l'enzyme purifiée, à l'exception du 14ème acide aminé (lysine au lieu de cystéine déterminée à partir de l'enzyme purifiée). Cette phase ouverte de lecture est susceptible de coder pour une protéine de 53 kD, ce qui est tout à fait compatible avec la taille de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis estimée par gel filtration et par électrophorèse SDS-PAGE (environ 60kD) . La séquence SEQ ID NO 1 comprend en outre 465 nucleotides en amont du codon d'initiation de la traduction. Cette séquence comprend l'intégralité du promoteur du gène de l'enzyme malolactique. Les promoteurs de Lactococcus lactis ont une taille de l'ordre de 150 nucleotides en amont du codon d'initiation. De plus, les signaux caractéristiques d'initiation de transcription des gènes de Lactococcus lactis sont présents.
En aval de la phase ouverte de lecture, 596 nucleotides ont été séquences, et une autre phase ouverte de lecture de 581 nucleotides a été mise en évidence en 3' du gène malolactique dans un autre cadre de lecture.
La recherche d'homologies avec les gènes ou protéines connues a été réalisée par comparaison de la séquence nucleotidique SEQ ID NO 1, et des séquences protéiques déduites avec des bases de données.
- En ce qui concerne la phase ouverte de lecture de 1620 nucleotides, des conservations très importantes en acides aminés et en nucleotides ont été mises en évidence avec différentes enzymes maliques, responsables de la décarboxylation du malate en pyruvate. D'autre part, une séquence consensus de liaison du NAD a été retrouvée.
Ces homologies sont parfaitement en accord avec la fonction de l'enzyme malolactique, qui utilise, comme l'enzyme malique, le malate comme substrat, et exige du NAD pour la transformation du substrat en lactate.
- En ce qui concerne le début de phase de lecture identifiée en aval du gène malolactique, des homologies en acides aminés, également importantes (de l'ordre de 40%) ont été identifiées avec des citrate perméases. Il paraît extrêmement probable que cette phase ouverte de lecture puisse correspondre à la région 5' d'une malate perméase. II apparaît donc que sont présents sur le fragment d'ADN séquence le gène de structure codant pour l'enzyme malolactique, et une partie du gène de la malate perméase, et que ces gènes sont organisés en opéron. EXEMPLE 5 ; EXPRESSION DU GENE MALOLACTIQUE CHEZ E. COLI L'expression du gène malolactique a été étudiée chez E. coli , chez différents tranfor ants de la souche bactérienne DH5α: pl53A (clone séquence) , p5A, pl91A (voir cartes de restriction, Figure 1) .
Les transformants ainsi que la souche témoin DH5α transformée par pUC18, ont été ensemencés dans une gamme de milieux de culture à concentration croissante en malate : 3 ml de milieu M9 (Na2HP04,7H20 6g/l, KH2P04 3g/1, NaCl 0,5g/l, NH4C1 lg/1, glucose 4g/1) , additionné de thiamine lmg/1, acide aspartique 20mg/l et d'ampicilline 20mg/l, et contenant 0 ; 0,3 ; 0,5 ou 1% de malate (p/v) . Le milieu est tamponné à pH 6,5 par addition d'acide citrique.
Les cultures ont été incubées à 37*C, avec agitation, pendant 48h. A titre de témoin, Lactococcus lactis a été cultivé dans 8 ml de milieu M9 contenant 5g/1 de "YEAST EXTRACT" et la même gamme de malate. Les cultures ont été incubées à 28*C, pendant 48 h, en anaérobiose.
Les cultures ont alors été centrifugées 10 min à 4000g. Les surnageants ont été récupérés et testés pour la présence de L-lactate. Le dosage du L-lactate a été réalisé à l'aide d'un kit (BOEHRINGER) , selon le protocole décrit par le fournisseur.
Les résultats, présentés dans le tableau I ci- dessous (exprimés en g/1) , montrent une production très nette de lactate dans le surnageant de culture des transformants pl53A et pl9lA, alors qu'aucune trace de lactate n'est détectée dans le surnageant de la souche témoin { E. coli DH5 transformée par pUC18) . Un autre transformant, p5A, qui a été testé dans les mêmes conditions, ne produit par contre pas de lactate. Ceci s'explique par le fait que le gène malolactique porté par le vecteur recombinant p5A présente une extrémité 3 ' tronquée de 200 nucleotides. Cette région semble donc essentielle à l'activité malolactique. En absence de malate, il n'y a pas de production significative de lactate dans le surnageant de culture des transformants pl53A et pl91A, ni de la souche témoin transformée par pUC18. Ceci s'explique par le fait que E. coli ne produit pas de L-lactate dans ces conditions de culture.
En présence de malate, aucune production de lactate n'est observée pour la souche témoin. Par contre, en ce qui concerne les transformants pl53A et pl9lA, une production significative de lactate est observée, en présence de 0,1, 0,3, et 1% de malate.
Le taux de lactate produit est assez faible si on le compare à celui produit par la souche témoin de L. lactis testée dans les mêmes conditions et à partir des mêmes concentrations en malate. Cependant, il convient de noter que la production de L-lactate dans L. lactis correspond au L-lactate produit par fermentation malolactique, et également à une proportion importante de L-lactate produit par dégradation des sucres, via la L-LDH qui convertit le pyruvate en lactate.
D'autre part, il est difficile de déterminer la part de malate qui est réellement disponible pour la fermentation malolactique. En effet, dans les conditions de culture utilisées pour E. coli , une partie non négligeable du malate peut être utilisé via le cycle tricarboxylique.
TABLEAU I
Souche bactérienne % malate dans le milieu de culture
0 0,3 0,5 1
E. coli DH5α(pUC18) 0,001 0,017 0,008 0,015
E. coli (pl53A) 0,015 0,12 0,23 0,31
E. coli (pl91A) 0,017 0,17 0,15 0,2
Lactococcus lactis 2,6 5,09 8,5 -
EXEMPLE 6 ; EXPRESSION DU GENE MALOLACTIQUE DANS LA LEVURE
Afin de réaliser l'expression du gène malolactique clone dans la levure, la région codante a été placée sous contrôle d'éléments régulateurs
(promoteurs et terminateurs) de levure, dans des vecteurs navette levure/E. coli. a) Introduction du gène malolactique sur le plasmide multicopie pVT100-ϋ
Le plasmide d'expression pVTlOO-U a été utilisé. Ce plasmide contient l'origine de replication de levure 2μ, le marqueur de sélection URA3 et les éléments régulateurs forts ADH (promoteur et terminateur de l'alcool déshyrogénase I), ainsi que les éléments bactériens (origine de replication et gène de résistance à l'ampicilline) .
Ce plasmide a été décrit par VERNET et al [Gène 52 ; 225-233, (1987)] La région codante du gène malolactique a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pl53A, à l'aide d'amorces constituées d'oligonucléotides dérivés de la séquence du gène malolactique. Afin de faciliter le clonage, l'introduction de sites de restriction Xhol en amont et Xbal en aval de la région codante a été réalisée au cours des amplifications.
Les oligonucléotides utilisés comme amorces sont : - un oligonucléotide permettant d'isoler la région codante au niveau du codon d'initiation de la traduction ATG (amorce 1) et comportant un site Xhol
- Du côté 3', 1'oligonucléotide choisi (amorce 3 ' ) est localisé à quelques nucleotides en aval du codon de terminaison de la traduction.
Les séquences ainsi que les positions exactes des amorces utilisées sont indiquées sur la figure 2.
L'amplification a été réalisée de la manière suivante : amorce 1 4 μl (30pmoles) amorce 3 4 μl(30pmoles)
Taq buffer 10X 10 μl Taq polymérase (5μ/μl) 0,5 μl dNTP2μM 10 μl MgCl2 25mM 6 μl pl53A 4μl (40ng)
H20 62 μl
Conditions d'amplification : 30 secondes à 94*C, 30 secondes à 40*C, 1 min à 72'C pendant 30 cycles. La taille des fragments amplifiés a été vérifiée par analyse d'un aliquot sur gel d'agarose. lOOng des fragments amplifiés ont été digérés par Xhol et Xbal et ligués à 50ng de vecteur pVTlOO-U préalablement digéré par Xhol et Xbal et déphosphorylé. Le vecteur pVTlOO-U obtenu, dénommé pMl, est représenté à la figure 3. b) Transformation de la levure
La souche de levure Saccharomyces cerevisiae SCV5M a été transformée par le vecteur pMl.
La souche SCV5M a été déposée le 18 juin 1992 auprès de la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, sous le numéro 1-1222. Il s'agit d'une souche de laboratoire haploïde, ura", MATa, dérivée d'une souche oenologique.
La méthode de transformation utilisée est celle de l'acétate de lithium décrite par ITO et al. [J. Bacteriol. n* 153, pp. 163-168, (1983)] . c) Obtention de la fermentation malolactique dans la levure
Deux des transformants obtenus, dénommés ScV5M/pMIa et ScV5M/pMIb ont été testés pour leur capacité à réaliser la fermentation malolactique
(conversion du malate en lactate) ; ces transformants ont été cultivés dans les conditions suivantes :
- d'une part, sur milieu synthétique minimum YNB (6,7 g/1 "Yeast nitrogen base without aminoacid"
(DIFCO) , 20 g/1 glucose) contenant 0, 0,6 ou 1% de malate, tamponné soit à pH 3, soit à pH 6 avec de l'acide citrique (6,3 g/1).
- d'autre part, sur milieu synthétique mimant la composition d'un moût de raisin, [SABLAYROLLES et
BARRE, Sciences des Aliments, n* 6, p. 373-383 (1986)], tamponné à pH 3,3.
Les deux milieux utilisés ne contiennent pas d'uracile, ce qui assure une pression de sélection pour les plasmides.
Un transformant de ScV5M par le plasmide pVTlOO-U ne contenant pas d' insert a été utilisé comme témoin négatif.
CONDITIONS DE CULTURE ET DE DOSAGE 8 ml de milieu sont ensemencés par les souches de levures (transformants et témoin) . La croissance est réalisée dans des tubes stériles de 10 ml, à 28'C, pendant 60 h, sans agitation.
Les cultures sont centrifugées 5 min à 4000 g et le surnageant testé pour la production de L-lactate en utilisant un kit Boehringer, comme indiqué à l'Exemple 5. RESULTATS
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau II.
Sur milieu synthétique minimum YNB (Tableau II), en absence comme en présence de malate (0,3 et 1%), aucune trace de L-lactate n'est détectée avec la levure témoin (ScV5M/pVTU) . Ceci est tout à fait en accord avec le fait que S. cerevisiae est incapable de réaliser la transformation du malate en lactate, et que, d'autre part, en anaerobiose, elle ne produit que des traces de lactate à partir du glucose, principalement sous forme de D-lactate.
Les souches transformées pMla et pMlb, en l'absence de malate, produisent des traces de L-lactate, de l'ordre d'une cinquantaine à une centaine de milligrammes. Il est probable que cette légère production provient de la conversion par l'enzyme malolactique d'une partie du malate endogène de la levure, étabolisé à partir du glucose. En présence de malate dans le milieu de culture (0,6 et 1% de malate), et dans les milieux YNB tamponnés à pH 3, ou sur moût synthétique (pH 3,3, 3g/l de malate) , une production très significative de L- lactate (de 0,5 à 0,7 g/1 pour le clone pMla dans ces conditions expérimentales) est observée. La production la plus importante est observée sur moût synthétique dont la composition est très proche de celle des moûts de raisin (0,7 g/1 de L-lactate soit 7,7 μmoles/ml) .
Dans les mêmes conditions de culture (YNB) mais à pH 6, la production de L-lactate est très faible, du même ordre de grandeur qu'en 1'absence de malate. La 25 différence de production de L-lactate selon le pH du milieu de culture pourrait s'expliquer par un problème de perméation du malate chez S. cerevisiae à pH 6. A pH 3 ou 3,3, une grande partie du malate (pK 3,5) se trouvant sous forme non-dissociée peut entrer à 1'intérieur de la cellule par simple diffusion. Par contre à pH 6 le malate, principalement sous forme dissociée entrerait moins facilement à l'intérieur de la cellule.
Les souches recombinantes dégradent donc le malate en lactate par fermentation malolactique, et avec une efficacité plus grande à pH acide, donc en conditions proches de celles de l'oenologie.
Figure imgf000027_0001
TABLEAU II DOSAGE DU LACTATE CHEZ S. CEREVISIAE
Souches de levure L-lactate produit L-lactate produit
(g/1) (μmole/ml)
ScVRM/pVTlOO-ϋ
- dans (pH = 3) :
0% malate 2,4.10-3 0,02
0,6% malate 7.10-3 0,07
1% malate 9.10"3 0,1
- dans (pH = 6) :
0% malate 3.10-3 0,03
0,6% malate 6.10-3 0,06
1% malate 10.10-3 0,11
- Moût synthétique
(pH = 3,3) 9.10-3 0,1
ScV5M/pMla
- dans (pH = 3) :
0% malate 0,15 1,66
0,6% malate 0,4 4,4
1% malate 0,52 5,7
- dans (pH = 6) :
0% malate 0,1 1,1
0,6% malate 0,07 0,77
1% malate 0,05 0,55
- Moût synthétique
(pH = 3,3) 0,7 7,7
Figure imgf000028_0001
TABLEAU II (suite)
Souches de levure L-lactate produit L-lactate produit
(g/D (μmole/ml)
ScV5M/pMlb
- dans (pH = 3) :
0% malate 0,15 1,66
0,6% malate 0,40 4,4
1% malate 0,48 5,3
- dans (pH = 6) :
0% malate 0,11 1,22
0,6% malate 0,08 0,88
1% malate 0,056 0,62
- Moût synthétique
(pH = 3,3) 0,51 5,66
La même expérimentation a été effectuée sur moût synthétique, et la production de lactate mesurée au bout de 10 jours de culture ; l,5g/l (soit 17 μmoles/ml) de lactate ont été produits dans ces conditions. EXEMPLE 7 i EXPRESSION DU GENE MALOLACTIQUE CHEZ SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE
L'expression du gène malolactique a été également étudiée chez Schizosaccharomyces pombe. Dans ce but, la région codante du gène malolactique a été placée sous contrôle d'un promoteur de S. pombe, dans un vecteur navette S. pombe/E. coli . a) Introduction du qèn? ™pi?lactique sur le plasmide multicopie PARTI
Le plasmide d'expression pARTl a été utilisé. Ce plasmide contient l'origine de replication de levure ARSl, le marqueur de sélection LEU2 et le promoteur de 1'alcool déshydrogénase de S. pombe, ainsi que des éléments bactériens (origine de replication et gène de résistance à 1'ampicilline) . Ce plasmide a été décrit par McLeod et al., (EMBO J. 6; 729-736, 1987).
La région codante du gène malolactique a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pl53A, à l'aide d'amorces constituées d'oligonucléotides dérivés de la séquence du gène malolactique. Afin de faciliter le clonage, l'introduction de sites de restriction BamHI en amont et Sacl en aval de la région codante a été réalisée au cours des amplifications. Les oligonucléotides utilisés comme armorces sont :
- un oligonucléotide permettant d'isoler la région codante au niveau du codon d'initiation de la traduction ATG (amorce 12) et comportant un site BamHI - du côté 3', 1'oligonucléotide choisi (amorce
13) est localisé à quelques nucleotides en aval du codon de terminaison de la traduction et comporte un site Sacl.
Les séquences ainsi que les positions exactes des amorces utilisées sont indiquées sur la figure 2. L'amplification a été réalisée de la manière suivante :
. amorce 12 4μl (20pmoles)
. amorce 13 4μl (20pmoles)
. Taq buffer 10X lOμl . Taq polymérase (5U/μl) 0,5μl
. dNTP 2μM lOμl
. mgC12 25mM 6μl
. pl53A lOμl (lOOng)
. H20 65,5μl Conditions d'amplication : 30 secondes à 94*C,
30 secondes à 37"C, 1 minute à 72 *C pendant 30 cycles.
La taille des fragments amplifiés a été vérifiée par analyse d'un aliquot sur gel d'agarose.
100 ng de fragments amplifiés ont été digérés par BamHI et Sacl et ligués à 50 ng de vecteur pAARTl préalablement digéré par BamHI et Sacl et déphosphorylé. Le vecteur obtenu, dénommé pD4, est représenté à la figure 4. b) Transformation de S. Ooxabe
Une souche S. pombe auxotrope pour la leucine a été transformée par le vecteur pD4 et par le vecteur pARTl. Il s'agit de la souche de laboratoire leul-32 h-t-, qui a été fournie par J. KOHLI, Institute of General Microbiology, Raltzerstrasse 4, CH-3012, Bern, Switzerland. La méthode de transformation utilisée est celle de transformation à l'acétate de lithium adaptée de ITO et al. [Journal of Bacteriology 153, 163-168, (1983)] . c) Obtention de la fermentation malolactique
Figure imgf000031_0001
Un des transformants obtenus, dénommé Sp/D42 a été testé pour sa capacité à réaliser la fermentation malolactique (conversion du malate en lactate) . Le transformant a été cultivé dans les conditions suivantes :
- sur milieu synthétique minimum YNB contenant
50 g/1 de glucose et 5,5 g/1 de L-malate, tamponné soit à à pH 3,5, soit à pH 6. Ce milieu ne contient pas de leucine, ce qui assure une pression de sélection pour les plasmides introduits.
Un transformant de la même souche par le plasmide pARTl ne contenant pas d'insert a été utilisé comme témoin négatif.
8ml de milieu sont ensemencés par les souches de levure (transformant et témoin) . La croissance est réalisée dans des tubes stériles de 10 ml, à 40"C, pendant une semaine, sans agitation.
Les cultures sont centrifugées 5min à 4000g et le surnageant testé pour la production de L-lactate en utilisant un kit BOEHRINGER, comme indiqué précédemment.
La dégradation du L-malate a été étudiée par dosage du L- malate résiduel dans le milieu de culture à l'aide d'un kit BOEHRINGER.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau III ci-dessous. Dans les différentes conditions de culture testées, la levure témoin Sp/pARTl ne produit que des traces de L-lactate (de l'ordre de 20 à 40 mg/1) . En effet, de même que S. cerevisiae, S. pombe est incapable de transformer du malate en lactate, et, d'autre part ne produit que des traces de lactate en anaerobiose à partir du glucose.
La souche transformée par le gène malolactique (Sp/D42), en l'absence de malate, produit des quantités très faibles de L-lactate (de l'ordre de 170 à 300 mg/1). Cette légère production provient très problablement de la conversion par l'enzyme malolactique d'une partie du malate endogène de la levure, métabolisé à partir du glucose. Ceci a également été observé avec les transformants de S. cerivisiae (tableau II) . En présence de 5,5 g/1 de L-malate dans le milieu de culture, une production très importante de L-lactate est observée pour le transformant Sp/D42, de 2,4 à 3 g/1 selon le pH du milieu de culture. La production la plus forte est observée à pH acide, donc en condition de pH proches de celles de l'oenologie. La production obtenue à pH6 est aussi très forte, comparativement à celle obtenue pour les transformants de S. cerevisiae au même pH.
D'autre part, en présence de 5,5 g/1 de L- malate et à pH acide, le transformant Sp/D42 est capable de dégrader pratiquement tout le L-malate du milieu (à pH 3,5, seulement 150 mg/1 de L-malate n'ont pas été dégradés) et de plus, de convertir plus de 80% du malate présent en L-lactate (3,05 g/1). TABLEAU III : DOSAGE DU LACTATE CHEZ S. POMBE
Souches de levure L-Lactate L-Malate produit (g/1) résiduel (g/1)
Sp/ AR l
- dans (pH = 3,5)
0% malate non détecté
0,55% malate 0,04 1,4
- dans (pH = 6)
0% malate 0,02
0,55% malate 0,03 4,6
Sp/D42
- dans (pH = 3,5)
0% malate 0,17
0,55% malate 3,05 0,15
- dans (pH = 6)
0% malate 0,3
0, 55% malate 2,4 1,5
Figure imgf000033_0001
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT (A) NOM INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - I.N.R.A.
(B RUE: 147, RUE DE L'UNIVERSITE (C VILLE: PARIS
(E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 75341 CEDEX 07
(A NOM: BARRE Pierre (B RUE: 90, RUE DES LAVANDES (C VILLE: SAINT GELY DU FESC (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 34980
(A NOM: DEQUIN Sylvie (B RUE: 7, RUE DU GENERAL RENE (C VILLE: MONTPELLIER
(E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 34000
(A NOM: ANSANAY Virginie (B RUE: 60, COURS GAMBETTA (C VILLE: MONTPELLIER (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 34000
(ii) TITRE DE L' INVENTION: CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE L' ENZYME MALOLACTIQUE DE LACTOCOCCUS LACTIS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE DEPOT: FR 93 06003
(B) DATE DE DEPOT: 18-MAY-1993
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2684 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Lactococcus lactis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 466..2085
(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "ENZYME MALOLACTIQUE"
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: -35_signal
(B) EMPLACEMENT: 392..397
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: -10_signal
(B) EMPLACEMENT: 416..421
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TTTTGTTGAA AAAATTTCTA ATCAAATTAT TAACCTAAAA GATACATAAA TTTAAAAAAT 60
AAAAGTAGAG TGATTTTACT CTACTTTTTT AGAATACTTT TATATAATAG GAAATATGAA 120
TAAAGCAAAG CGCACAATTT TGGTTTTATT TAAAAAAATG GATACCTTAG ATACACAACC 180
ACCATTGACA AAAAATCTTA ATCCTAAATT GGTTGAAACC CTGATAAATT AGGGATAGTA 240
ATAGGAGGAG GACAGTTTAT CATTTAATAG TTATAAGCTA ATTTTTACTA CCATTTCTTT 300
GATTAATATC ATCTATTTTT ATATAGAGAC TTTTAAATAA ACATTGACAT TATTTATGCG 360
TTATAAATTA AATTTATCAA CACTAAGGAA TTTGACTATA ACGATAAAAG AAGTTTATAG 420
TAATAAAGTA ATAACATTAA TTATAATTTT AATGGAGGTT GTACG ATG CGT GCA 474
Met Arg Ala
1
CAT GAA ATT TTA AAC AAT CCT TTT TTA AAT AAA GGA ACA GCT TTT ACT 522 His Glu Ile Leu Asn Asn Pro Phe Leu Asn Lys Gly Thr Ala Phe Thr 5 10 15
ATG AAA GAC CGT CAA GAA TTG GGG TTG ATT GGT CTT CTT CCA CCA ACT 570 Met Lys Asp Arg Gin Glu Leu Gly Leu Ile Gly Leu Leu Pro Pro Thr 20 25 30 35
GTT CAA ACA ATT GAG GAA CAA GCT GAA CAA ACT TAC GAA CAA TAT TTG 618 Val Gin Thr Ile Glu Glu Gin Ala Glu Gin Thr Tyr Glu Gin Tyr Leu 40 45 50
ACA AAA CCA TCT GAT TTA GAA AAA CGT CAT TTC TTG ATG GAA ATT TTT 666 Thr Lys Pro Ser Asp Leu Glu Lys Arg His Phe Leu Met Glu Ile Phe 55 60 65
AAT ACA AAC CGT ACT TTG TTT TAC TAC TTA TTC AAC AAA CAT ATT GTA 714 Asn Thr Asn Arg Thr Leu Phe Tyr Tyr Leu Phe Asn Lys His Ile Val 70 75 80
GAA TTT AAT CCA GTT GTT TAT GAT CCA ACA ATT GCT GAT ACA ATT GAA 762 Glu Phe Asn Pro Val Val Tyr Asp Pro Thr Ile Ala Asp Thr Ile Glu 85 90 95
AAC TAC AGT CAT TTG TTC GTA GAT CCA CAA TAT GCT GCT TAT CTT GAT 810 Asn Tyr Ser His Leu Phe Val Asp Pro Gin Tyr Ala Ala Tyr Leu Asp 100 105 110 115 ATT AAC CAC CCT GAA AAC ATT ACT GAA ACA TTG AAA AGT GCA GCA GGT 858 Ile Asn His Pro Glu Asn Ile Thr Glu Thr Leu Lys Ser Ala Ala Gly 120 125 130
GAC AGA GAA ATT CGT CCT ATT GTT GTA ACT GAT GCT GAA GGA ACC CTT 906 Asp Arg Glu Ile Arg Pro Ile Val Val Thr Asp Ala Glu Gly Thr Leu 135 140 145
GGT ATT GGA GAC TGG GGA ACT CAA GGT GTT GAT ATC TCA GTT GGT AAA 954 Gly Ile Gly Asp Trp Gly Thr Gin Gly Val Asp Ile Ser Val Gly Lys 150 155 160
TTA ATG ATT TAT ACA GCC GCA GCA GGT ATT GAT CCA GCG TCT GTA CTT 1002 Leu Met Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Gly Ile Asp Pro Ala Ser Val Leu 165 170 175
CCA GTT GTT ATT GAT GCA GGG ACA AAT AGG AAA GGA CTT TTA GAA GAT 1050 Pro Val Val Ile Asp Ala Gly Thr Asn Arg Lys Gly Leu Leu Glu Asp 180 185 190 195
CAT TTG TAT CTT GGA AAT CAT CAA GAA CGT ATT TAC GGT GAT CAA TAC 1098 His Leu Tyr Leu Gly Asn His Gin Glu Arg Ile Tyr Gly Asp Gin Tyr 200 205 210
TAC AGT TTC GTC GAT CAA TTT GTA GAA ACT GCA GAA TCA ATT TTC CCT 1146 Tyr Ser Phe Val Asp Gin Phe Val Glu Thr Ala Glu Ser Ile Phe Pro 215 220 225
AAA TTG TAC CTT CAC TGG GAA GAT TTC GGA CGT TCA AAT GCT GCA ACA 1194 Lys Leu Tyr Leu His Trp Glu Asp Phe Gly Arg Ser Asn Ala Ala Thr 230 235 240
ATT TTA AAT AAC TAC AAA ACA AAA ATC CCA ACA TTT AAT GAT GAC ATT 1242 Ile Leu Asn Asn Tyr Lys Thr Lys Ile Pro Thr Phe Asn Asp Asp Ile 245 250 255
CAA GGA ACT GGT ATT GTT GTT TTA GGT GGT ATT TTC GGA TCA CTT GAC 1290 Gin Gly Thr Gly Ile Val Val Leu Gly Gly Ile Phe Gly Ser Leu Asp 260 265 270 275
ATT ACA GGT GAA AAA TTA ACT GAT CAA GTA TAT CTT TGC TAT GGT GGT 1338 Ile Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asp Gin Val Tyr Leu Cys Tyr Gly Gly 280 285 290
GGT TCA GCC GGT GCA GGG ATT GCT GGT CGT GTT CAT GCT GAA ATG GTT 1386 Gly Ser Ala Gly Ala Gly Ile Ala Gly Arg Val His Ala Glu Met Val 295 300 305
AGT GAA GGT CTT TCT GAA GAA GAA GCT TAC AAA CAT TTC TTC ATG ATT 1434 Ser Glu Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Tyr Lys His Phe Phe Met Ile 310 315 320
GAT CAA CAA GGT TTA CTT TTT GAT GAT ATG GAA GAC CTT ACA CCA GCT 1482 Asp Gin Gin Gly Leu Leu Phe Asp Asp Met Glu Asp Leu Thr Pro Ala 325 330 335
CAA AAA CCA TTT GCT AAA AAA CGT GCT GAT TAT AAA GAT GCT GGA GAT 1530 Gin Lys Pro Phe Ala Lys Lys Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Ala Gly Asp 340 345 350 355
ATG ACT GAC CTT CTT AAC GTT GTT AAG ACA GTA AAA CCA ACT ATT TTA 1578 Met Thr Asp Leu Leu Asn Val Val Lys Thr Val Lys Pro Thr Ile Leu 360 365 370 GTA GGA ACT TCA ACT AAT CCA GGT GCC TTT ACA AAA GAA GTT GTT GAA 162.6 Val Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ala Phe Thr Lys Glu Val Val Glu 375 380 385
GCA ATG TGT GCT AAT ACA GAA CGC CCA GTA ATC TTC CCT ATC TCA AAT 1674 Ala Met Cys Ala Asn Thr Glu Arg Pro Val Ile Phe Pro Ile Ser Asn 390 395 400
CCA ACT AAA AAA ATG GAA ACT ACA GCT GAA CAA GTT ATT GAG TGG TCT 1722 Pro Thr Lys Lys Met Glu Thr Thr Ala Glu Gin Val Ile Glu Trp Ser 405 410 415
GAT GGA AAA GCT TTT GTC GCT ACT GGT GTT CCT TCA GGA ACA ATC AGC 1770 Asp Gly Lys Ala Phe Val Ala Thr Gly Val Pro Ser Gly Thr Ile Ser 420 425 430 435
TAC AAA GGT GTT GAT TAT CAA ATT GGT CAA GCA AAT AAC TCA CTT ATC 1818 Tyr Lys Gly Val Asp Tyr Gin Ile Gly Gin Ala Asn Asn Ser Leu Ile 440 445 450
CAC CCA GGT TTG GGC TTA GGA ATG TTG GCA TCT GAA GCA AAA CTT TTG 1866 His Pro Gly Leu Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Glu Ala Lys Leu Leu 455 460 465
ACA GAT GAA ATG ATC GGT GCA GCT GCA CAT TCA TTG AGC GGT TTA GTA 1 14 Thr Asp Glu Met Ile Gly Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Gly Leu Val 470 475 480
GAT CCA GGT AAA CCA GGT GCT CCT GTT CTT CCT CCA TTT GAA TTT GTT 1962 Asp Pro Gly Lys Pro Gly Ala Pro Val Leu Pro Pro Phe Glu Phe Val 485 490 495
GCT GAT GTA TCA ATT AAA GTT GCA GAA GCA GTT GCT AAG AAA GCT CAA 2010 Ala Asp Val Ser Ile Lys Val Ala Glu Ala Val Ala Lys Lys Ala Gin 500 505 510 515
GAA CAA GGT CTT ACT GAA TCT AAA GAA ACT GAT ATG GCT AAA GCA GTT 2058 Glu Gin Gly Leu Thr Glu Ser Lys Glu Thr Asp Met Ala Lys Ala Val 520 525 530
CGT GAT CTT AAA TGG TAT CCA GAG TAC TAAGGGGAAT ATCTTAAATG 2105
Arg Asp Leu Lys Trp Tyr Pro Glu Tyr 535 540
AAAAAACTTA AAGAAACGAA AATATCGGGA ATTAGTCTTC CCTTATATGC CTTTTTCGTA 2165
GCTGTCATCA TAGTTGTAAC ACTATTAGGA AAACTTCCAC TTGATATGGT AGGGTTAACT 2225
CTCCTACTTG TAACATTAGG CCACCTATTA TACTTCATAG GAGAAAAATT CCCTATTATG 2285
AATTCATACT TAGGTGGGGG ATCTGTTTTC ACTTTAATTG GTGCTACTCT ATTATCTTTC 2345
TTCCACATTG TTCCTTCAAA TGTTATTGGA GCAGTTTCCA ATTTTATGGG TGGAAAATTT 2405
GGATTTCTTG ATTTTTATAT AGCTGCACTT ATCTGTGGAT CTATTTTAGG AATGAACAGA 2465
AATCTTTTGG TTAAAGCTTC CAAGAAATTT ATTCCGATTG CTTTAATCAC TATGGTTATT 2525
GGTTTCTTCT CAGTAGGTCT TGTAGGAATG CTTATTGGTA ATGGATTTGC TGATTCTGTA 2585
ATGTATGTTT CTATGCCAAT GATGTCAGGT GGTATGGGAG CCGGAATTAC TCACTCTCTC 2645
AAATCTATGC AGCCGGATTG GCTCATGGAA ACCAAGCAG 2684 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 540 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Arg Ala His Glu Ile Leu Asn Asn Pro Phe Leu Asn Lys Gly Thr
1 5 10 15
Ala Phe Thr Met Lys Asp Arg Gin Glu Leu Gly Leu Ile Gly Leu Leu 20 25 30
Pro Pro Thr Val Gin Thr Ile Glu Glu Gin Ala Glu Gin Thr Tyr Glu 35 40 45
Gin Tyr Leu Thr Lys Pro Ser Asp Leu Glu Lys Arg His Phe Leu Met 50 55 60
Glu Ile Phe Asn Thr Asn Arg Thr Leu Phe Tyr Tyr Leu Phe Asn Lys 65 70 75 80
His Ile Val Glu Phe Asn Pro Val Val Tyr Asp Pro Thr Ile Ala Asp 85 90 95
Thr Ile Glu Asn Tyr Ser His Leu Phe Val Asp Pro Gin Tyr Ala Ala 100 105 110
Tyr Leu Asp Ile Asn His Pro Glu Asn Ile Thr Glu Thr Leu Lys Ser 115 120 125
Ala Ala Gly Asp Arg Glu Ile Arg Pro Ile Val Val Thr Asp Ala Glu 130 135 140
Gly Thr Leu Gly Ile Gly Asp Trp Gly Thr Gin Gly Val Asp Ile Ser 145 150 155 160
Val Gly Lys Leu Met Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Gly Ile Asp Pro Ala 165 170 175
Ser Val Leu Pro Val Val Ile Asp Ala Gly Thr Asn Arg Lys Gly Leu 180 185 190
Leu Glu Asp His Leu Tyr Leu Gly Asn His Gin Glu Arg Ile Tyr Gly 195 200 205
Asp Gin Tyr Tyr Ser Phe Val Asp Gin Phe Val Glu Thr Ala Glu Ser 210 215 220
Ile Phe Pro Lys Leu Tyr Leu His Trp Glu Asp Phe Gly Arg Ser Asn 225 230 235 240
Ala Ala Thr Ile Leu Asn Asn Tyr Lys Thr Lys Ile Pro Thr Phe Asn 245 250 255
Asp Asp Ile Gin Gly Thr Gly Ile Val Val Leu Gly Gly Ile Phe Gly 260 265 270
Ser Leu Asp Ile Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asp Gin Val Tyr Leu Cys 275 280 285 Tyr Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Gly Ile Ala Gly Arg Val His Ala 290 295 300
Glu Met Val Ser Glu Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Tyr Lys His Phe 305 310 315 320
Phe Met Ile Asp Gin Gin Gly Leu Leu Phe Asp Asp Met Glu Asp Leu 325 330 335
Thr Pro Ala Gin Lys Pro Phe Ala Lys Lys Arg Ala Asp Tyr Lys Asp 340 345 350
Ala Gly Asp Met Thr Asp Leu Leu Asn Val Val Lys Thr Val Lys Pro 355 360 365
Thr Ile Leu Val Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ala Phe Thr Lys Glu 370 375 380
Val Val Glu Ala Met Cys Ala Asn Thr Glu Arg Pro Val Ile Phe Pro 385 390 395 400
Ile Ser Asn Pro Thr Lys Lys Met Glu Thr Thr Ala Glu Gin Val Ile 405 410 415
Glu Trp Ser Asp Gly Lys Ala Phe Val Ala Thr Gly Val Pro Ser Gly 420 425 430
Thr Ile Ser Tyr Lys Gly Val Asp Tyr Gin Ile Gly Gin Ala Asn Asn 435 440 445
Ser Leu Ile His Pro Gly Leu Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Glu Ala 450 455 460
Lys Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Gly Ala Ala Ala His Ser Leu Ser 465 470 475 480
Gly Leu Val Asp Pro Gly Lys Pro Gly Ala Pro Val Leu Pro Pro Phe 485 490 495
Glu Phe Val Ala Asp Val Ser Ile Lys Val Ala Glu Ala Val Ala Lys 500 505 510
Lys Ala Gin Glu Gin Gly Leu Thr Glu Ser Lys Glu Thr Asp Met Ala 515 520 525
Lys Ala Val Arg Asp Leu Lys Trp Tyr Pro Glu Tyr 530 535 540

Claims

REVENDICATIONS
1) Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de 1620 pb codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis. 2) Fragment d'acide nucléique, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour le polypeptide SEQ. ID. NO 2.
3) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend les nucleotides 466 à 2085 de la séquence SEQ. ID. NO 1.
4) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, placé sous contrôle de séquences de régulation de l'expression d'un gène. 5) Cassette d'expression selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdites séquences de régulation sont actives chez la levure.
6) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
7) Vecteur recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce qu' il comprend une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5. 8) Cellule eucaryote ou procaryote transformée, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5.
9) Cellule transformée selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de levure.
10) Cellule de levure selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite levure appartient au genre Saccharomyces. 11) Cellule de levure selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite levure appartient au genre Schizosaccharomyces .
12) Utilisation d'au moins une cellule de levure selon 1'une quelconque des revendications 9 à 11 pour accomplir la fermentation malolactique.
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