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WO1994023747A1 - Arzneimittel, das antikörper enthält, zur behandlung von t-zell spezifischen immunreaktionen und t-zell-leukämien - Google Patents

Arzneimittel, das antikörper enthält, zur behandlung von t-zell spezifischen immunreaktionen und t-zell-leukämien Download PDF

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WO1994023747A1
WO1994023747A1 PCT/EP1994/001129 EP9401129W WO9423747A1 WO 1994023747 A1 WO1994023747 A1 WO 1994023747A1 EP 9401129 W EP9401129 W EP 9401129W WO 9423747 A1 WO9423747 A1 WO 9423747A1
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WO
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cells
medicament according
antibodies
treatment
cell
Prior art date
Application number
PCT/EP1994/001129
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English (en)
French (fr)
Inventor
Rolf Schuh
Stefan Thierfelder
Original Assignee
Fresenius Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fresenius Ag filed Critical Fresenius Ag
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Publication of WO1994023747A1 publication Critical patent/WO1994023747A1/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A61K51/1039—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants against T-cell receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for the treatment of T-cell-specific immune reactions and T-cell leukemias, which contains, as active ingredient, a combination of at least four monoclonal antibodies of different specificity, two of the antibodies against different, non-over - Lapping epitopes of the human lymphocyte marker CD5 and the other two are directed against different, non-overlapping epitopes of the human lymphocyte marker CD7.
  • the medicament has proven to be extremely effective for the treatment of leukemia, autoimmune diseases and for the suppression of immune reactions in organ or bone marrow transplants without producing the side effects observed in connection with antibody preparations known to date in the prior art.
  • the "lymphocyte marker” CD5 is an antigenically active molecule which is expressed on practically all normal peripheral T cells and on a subpopulation of normal peripheral B cells, the so-called polyreactive IgM antibodies to produce.
  • the "lymphocyte marker” CD7 is an antigenic active molecule which is expressed within the lymphocyte population on most normal peripheral T and NK cells (N.atural Killer Cells).
  • the medicament according to the invention thus covers a broad but precisely defined spectrum of target cells, as a result of which an extremely effective suppression of immune reactions in organ or bone marrow transplants is achieved.
  • T-lymphocytes develop a cellular immune response after contact with foreign antigens.
  • the host's T cells recognize the donor organ cells as foreign; the patient develops host versus donor disease.
  • the T cells transferred with the donor bone marrow or ripening therefrom recognize the host as foreign; the patient develops a graft-versus-host-disease (GvHD).
  • GvHD graft-versus-host-disease
  • the patient's T cells recognize the body's own tissue as foreign due to an incorrect regulation.
  • the antigens recognized as foreign cause a proliferation of the T lymphocytes and the induction of helper and cytotoxic T cells represents the first stage of the T cell-specific immune reactions.
  • T cells can be chemotactic effective, ie among other things attracting macrophages, as well as mitogenic substances and ⁇ -interferon are released.
  • cytotoxic substances are released, which kill the cells containing the foreign antigen.
  • this cell destruction has a macroscopic effect on rejection of the transplant.
  • NK-Zel.len can also be considered as another effector cell population for mediating rejection symptoms - at least with GvHD.
  • CD5 + B cells could be involved in inducing a humoral immune response.
  • One way to influence rejection symptoms prophylactically or therapeutically is to destroy or inactivate the effector cells. This is possible by using specific polyclonal or monoclonal antibodies. By binding antibodies to their target cells, cell-eliminating mechanisms, such as the complement system, can be started in vivo and in vitro.
  • the complement system In addition to the lytic function, the complement system also contributes to the initiation of cellular effects and mechanisms.
  • complement receptors on macrophages are known, by means of which these effector cells recognize the target cells on which complement activation has taken place (Tenner and Cooper, J. Immunol. 1981, 126, 1174). Stimulation of macrophage-mediated, antibody-dependent cytotoxicity has also been described (Leu et al., J. Immunol. 1989, 143, 3250).
  • Clq The first component of the classic component cascade is Cl, a pentameric molecule whose largest subunit, Clq, mediates the bond between Cl and the Fc parts of immunoglobulins (Cooper, Advances in Immunol. (Editor: Dixon) Academic Press, New York, 1985 , 151).
  • Clq consists of six movable collagen arms, each with a globular binding head.
  • the isotope conveys the affinity of Clq to the Fc part of the antibodies.
  • mouse IgG2b and mouse IgG2a mouse IgG2b and human IgGl and human IgG3 have a high Clq affinity (Füst et al., Immunol. Lett. 1980 , i, 249; Schumaker et al., Biochemistry 1976, 5, 5175).
  • the expression density of the antigens determines the possible Clq binding sites. Therefore, the antigen density on the target cell must theoretically exceed a certain threshold so that the average distance between two adjacent immunoglobulins is within the range of a Clq molecule (Hughes-Jones et al., Eur. J. Immunol. 1985, 15, 976 ).
  • a Clq molecule can also bind to two different antibodies which are directed against two non-overlapping epitopes on the same antigen (so-called ⁇ ynergistic pair of antibodies).
  • ⁇ ynergistic pair of antibodies According to Hughes-Jones et al. (Eur. J. Immunol. 1984, 14, 974), regardless of the expression density, each antigen represents a potential Clq binding site if suitable antibody pairs are present which bind two epitopes of this antigen within the range of Clq.
  • a certain correlation between the in vitro measurable binding of Clq to a given antibody preparation and its cell-depleting potency in vivo was established by Kummer et al. (J. Immunol. 1987, 138, 4069). So far, however, no reliable evidence for a direct causal relationship has been provided.
  • either the bone marrow to be transplanted is treated in vitro before an autologous bone marrow transplantation, or in vivo treatments can be used to achieve remission.
  • the number of immune-competent cells can be reduced by in vivo treatment of the transplant recipient in order to prevent or suppress rejections.
  • Autoimmune diseases can be treated with comparable therapy.
  • the antibody preparations used in the clinic can either lead to an elimination of the target cells by activating the body's own effector mechanisms or change the readiness of the target cells to function, for example by blocking or activating functionally relevant receptors, for example IL2 receptors.
  • functionally relevant receptors for example IL2 receptors.
  • toxin or radionuclide conjugated antibodies is also practiced. While antibodies themselves activate natural effector mechanisms (elimination of the target cells or change in their functional state), in the case of the antibody-toxin conjugates, a toxic component can be transported directly to the target cells (in vitro and in vivo).
  • Antibodies that are genetically or chemically modified, for example by exchanging constant regions, by coupling antibodies of different or the same specificities, by adding or removing functional components, such as by adding enzymes or removing the Fc part, are also suitable the immunoglobulins and others
  • Suitable immunosuppressive antibody preparations are, for example, monoclonal antibodies against the human CD3 T cell antigen (OKT3) and polyclonal antiserum against human T cells (ATG).
  • ATG Acute thrombocytopenias and granulocytopenias also occur, which in some cases make it necessary to stop immunosuppressive antibody therapy with ATG.
  • the massive cell elimination releases a large number of cell constituents and immune mediators, which in addition to incompatibility reactions, in particular at the beginning of the treatment, leads to a drop in blood pressure, chest pain, fever reactions, diarrhea and itching (ATG-Fresenius, information brochure).
  • monoclonal antibodies have a high specific titer, so that undesired reactions, which may be initiated by the special antigen / antibody interaction, can take place massively and unchecked.
  • the antibody preparation 0KT3 shows clear side effects in vivo, which are based on the initial stimulation of the CD3 + T cells and the associated massive release of immune mediators. These extremely diverse side effects, such as fever (73%), chills (57%), shortness of breath (21%), pectanginous symptoms (14%), spasticity (11%), nausea (11%), vomiting (13%) and diarrhea (20%) can be life-threatening (Todd and Brogden, Drugs 1989, 2 871).
  • OKT3 induces the modulation of the CD3 antigen and thus causes a non-functional, so-called anergic state.
  • CD5-specific antibodies are known in the prior art which are cost-stimulating in vitro (Ledbetter et al., Mol. Immunol. 1989, 2nd r 137; Vandenberghe and Ceuppens, Eur. J. Immunol. 1991, 2nd r 251) or a stimulating (Spertini et al., J. Immunol. 1991, 146, 47) effect on T cells.
  • a stimulating Spertini et al., J. Immunol. 1991, 146, 47
  • the stimulation potency also with CD5-specific antibodies depends on the respective Fc receptor type on the accessory cells. There does not seem to be a correlation between the epitope specificity of the antibodies used.
  • the medicament according to claim 1 which has at least four monoclonal antibodies of different specificity as active substance. contains, two of which are directed against non-overlapping epitopes of the CD5 lymphocyte marker and two against non-overlapping CD7 lymphocyte marker epitopes.
  • the medicinal product according to the invention surprisingly shows not only in number and extent drastically reduced side effects, but it has an unexpected, in contrast to monoclonal antibody preparations known from the prior art, significantly increased effectiveness in the treatment of T-cell-specific immune reactions. Due to the effective elimination or inactivation of the T cells, the medicament according to the invention is suitable for the effective treatment or delaying of clinically manifest rejection reactions in organ and / or bone marrow transplants Treatment of autoimmune diseases and CD5 and / or CD7 positive leukemias.
  • the medicament according to the invention not only covers practically all T cells, but advantageously also the NK cells which carry the CD7 antigen and which are jointly responsible for rejection reactions.
  • T cells around 10% of the B cells (polyreactive, IgM-producing B cells) also have the CD5 antigen and thus also represent a target cell population for the medicament according to the invention Reaction to foreign antigens suppressed extremely effectively.
  • the use of the medicament according to the invention initially leads to a clear elimination of the CD5 and / or CD7 positive target cells from the peripheral blood.
  • some target cells lose their target antigens through modulation.
  • these modulated and therefore CD5 and / or CD7 negative target cells are surprisingly further reduced significantly after about 5 to 10 days when the medicament according to the invention is used further.
  • a prerequisite for this is a dosage which ensures that the serum level for the individual components of the medicament according to the invention does not drop to zero.
  • Antibodies to CD3 or CD5 neither individually nor in any combination for a significant stimulation of T- Cells in vitro. An Fc receptor heterogeneity caused by the blood cell donor could be excluded.
  • the medicament according to the invention thus allows an effective treatment of T-cell-specific immune reactions, with which clinically manifest rejection reactions can be effectively delayed or suppressed without causing the side effects which occur in the case of previously used antibody preparations and which are sometimes life-threatening.
  • the medicament according to the invention preferably contains antibodies of the rat IgG2b subclass.
  • monoclonal antibodies of the mouse IgG2a, mouse IgG2b, human IgGl and human IgG3 sub-class have proven to be particularly advantageous for use in the medicament according to the invention.
  • IgG subclasses of other animals that have a high affinity for Clq are also suitable for the medicament according to the invention.
  • the medicament can additionally contain two monoclonal antibodies against non-overlapping epitopes of another (third) lymphocyte marker.
  • a toxic component in the medicament according to the invention can be ricin, saporin, cis-platinum, or radionuclides, which are bound to the corresponding antibody in the form of a chemical bond.
  • one or more of the antibodies contained in the drug can be genetically modified. Examples of possible modifications are: 1. Exchange of constant regions for homologous sequences of antibodies from another subclass of the same or a different species, preferably of humans (chimerization, humanization); 2. Coupling of antibodies with one another for the purpose of efficient induction of effector mechanisms, preferably the binding of Clq (dimerization); 3. Elimination of parts of the antibody, preferably the Fc part or a Fab part (monovalent antibodies, antibody fragments).
  • a further modification relates to the direct and indirect coupling of at least one antibody to components or agents which allow physical separation or removal of the target cells or which generally enable enrichment or depletion.
  • Agents that can be coupled to the antibodies are those that allow coupling to membranes or magnetic particles.
  • the medicament according to the present invention is able to reduce the number of leukemia cells, and it is used in particular for the in vitro treatment of autologous bone marrow to be transplanted, the bone marrow preferably with the medicament and a lytic complement source is incubated. Furthermore, the use of the drug to achieve remission in vivo is advantageous if the drug is administered to the leukemia patient iv in the form of daily doses.
  • the preparation of monoclonal antibodies against CD5 and CD7 according to the invention enables the number of immunocompetent cells to be reduced and / or treated for graft-versus-host disease (GvHD) even after allogeneic bone marrow transplantation. It is advantageous if the drug is used for the in vitro treatment of the donor bone marrow before the transplant, but it leads to at least the same effect if the drug is used for the prophylactic and therapeutic in vivo treatment of the bone marrow recipient becomes.
  • the medicament according to the invention also enables the number of immunocompetent cells to be reduced to prevent and / or treat rejections after organ transplants, the medicament being administered to the recipient of the organ transplant.
  • the monoclonal antibodies used according to the invention are in purified form, preferably dissolved in phosphate-buffered saline (PBS), optionally mixed with a surface-active agent such as, for example, Tween 80, in an amount of, for example, 0.02%, based on the total solution.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the solution can contain the antibody mixture in amounts of 0.5 to 5, preferably 1 to 3 and particularly preferably 1 mg / ml, the different types of antibodies preferably being present in approximately equal proportions.
  • Such a solution can be provided for intravenous administration, the daily dose being 10 to 30 mg of antibody preparation.
  • the production of the monoclonal antibody pairs against the human lymphocyte markers CD5 and CD7 takes place in principle by targeted immunization of rats or mice by ip, iv or sc application of the antigen, preferably in the form of whole human T cells (lymphocytes, T cell line) or of corresponding cell lysates or (cleaned) surface molecules.
  • B-lymphocytes After the immunization has taken place, a large number of B-lymphocytes are stimulated for proliferation and antibody production, depending on the complexity of the antigen, its antigenic action, the type and number of immunization steps and the physiological readiness of the animal.
  • the so-called B-blasts are obtained from the animal, preferably by removing the spleen and immortalized in vitro.
  • Immortalization is carried out by polyethylene glycol-induced cell hybridization or by electrofusion with an in vitro viable and dividable myeloma cell line.
  • Suitable myeloma lines preferably have an anzaguranin resistance which enables selection of the immortalized B cell / myeloma hybrids (hybridomas).
  • the cells are diluted with HAT selection medium and transferred to appropriate culture vessels (e.g. 96-well plates) so that individual clones can be created and manipulated separately.
  • appropriate culture vessels e.g. 96-well plates
  • Each individual clone typically secretes identical antibodies that are not always directed against the desired antigen.
  • the antibodies are examined for desired properties (eg isotype and / or specificity) using suitable test systems.
  • a sub-class-specific ELISA can be used to determine the isotype, and an immunoassay (eg EIA) to determine the specificity against human T cells, which detects the binding behavior of the antibodies to T and non-T cells (eg B- Cells).
  • EIA immunoassay
  • Clones which produce suitable antibodies are expanded in liquid medium and repeatedly reclined at the individual cell level until a stable cell line with almost constant properties is generated.
  • the exact antigen specificity of the antibodies can be examined in FACS double-labeling experiments on human blood lymphocytes with reference antibodies of the desired specificity (anti-CD5, anti-CD?), The distribution and location of the double and single positive cells being used for the assessment. The antigen specificity is confirmed after immunoprecipitates from the solubilizate of human T cells in comparison with the molecular weights precipitated by reference antibodies. The relative epitope specificity of the generated antibodies can be determined by cross-inhibition in the EIA.
  • the antibodies are secreted by the hybrid cells into the culture medium; the technical implementation of this process is called fermentation.
  • the cells are removed from the fermentation supernatant by centrifugation or filtration and the antibodies are obtained by purification.
  • Specific immunological and / or physico-chemical parameters of the antibodies are used in order to selectively enrich them, preferably using chromatographic methods.
  • the purified antibodies can be lyophilized or stored in solution in suitable buffers, either deep-frozen or preferably at 4 ° C.
  • RhCD5p RhCD5 ⁇ , RhCD7p and RhCD7q:
  • the fusion partner was the azaguanine-resistant, non-producing mouse myeloma line P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580), which had previously been expanded in a standard medium (RPMI 1640, 10% fetal calf serum, glutamine, non-essential amino acids, Na pyruvate).
  • RPMI 1640 10% fetal calf serum, glutamine, non-essential amino acids, Na pyruvate
  • the fusion was carried out according to standard procedures (Galfre et al., Nature 1977, 266, 550) with polyethylene glycol 1500. 100 ⁇ 10 6 rat spleen cells and 50 ⁇ 10 6 mouse myeloma cells were used per batch.
  • the cells were transferred to 96-well culture plates. For this purpose, they were diluted so that an average of one clone per hole was to be expected.
  • the HAT supplement which enables the selection of fused cells, was added to the standard medium. Approximately 24 hours before the fusion, these culture plates were coated with a cell lawn from mouse peretoneal macrophages, which favor the growth of hybridoma cells in the sensitive phase after the fusion. Table 1: Immunization scheme
  • Antibody immunogen 1 2. 3. Fusion
  • RhCD5p stim PBL + Day 0: Day 44: Day 83: Day 86
  • RhCD5q stim PBL Day 0: Day 84: Day 112: Day 115
  • RhCD7q stim PBL Day 0: Day 49: Day 112: Day 115
  • the target line and antigen specificity was determined in a double-marking experiment with reference antibodies against suitable CD antigens (see Example 2, Test III).
  • the hybridoma cell lines that secreted the CD5- or CD7-specific antibodies were thawed again and cloned in 96-well culture plates until a monoclonality or a stable production rate was reached at the individual cell level.
  • a subclass-specific ELISA see Example 2, Test I
  • a cell binding test see Example 2, Test II
  • RhCD5p and RhCD5q are directed against the human CD5 antigen, which is expressed on practically all peripheral T. cells and approximately 10% of the B cells in peripheral blood; RhCD7p and RhCD7q are directed against the human CD7 antigen, which is expressed on most human T and NK cells in peripheral blood and on myeloid progenitor cells in the bone marrow.
  • the relative epitope specificity of the antibodies was investigated by binding inhibition experiments (see Example 2, Test IV). As a result, neither RhCD5p and RhCD5q nor RhCD7p and RhCD7q were significantly inhibited. They therefore bind to two different epitopes on the CD5 and CD7 antigen.
  • a cell line was cryopreserved as a master cell bank (MCB).
  • MCB master cell bank
  • WB working cell bank
  • Rat IgG 2i antibodies (ATCC 174).
  • a detection antibody a polyclonal, peroxidase-conjugated mouse anti-rat IgG antibody (Dianova) was used. "The test was developed by adding o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD) and evaluated in an ELISA reader.
  • OPD o-phenylenediamine dihydrochloride
  • This test was performed as a cell immunoassay in a 96-hole round bottom. plates carried out.
  • a T cell line e.g. Molt-3; ATCC, CRL 1552
  • a non-T cell line e.g. HL-60; ATCC, CCL 240
  • the cells were incubated with the culture supernatant to be tested and then washed.
  • the binding of the antibody to the target cell was demonstrated by incubation with a polyclonal, peroxidase-conjugated mouse anti-rat IgG antibody (Dianova).
  • the test was developed by adding OPD and evaluated in an ELISA reader.
  • the cell parameters were measured in the cytofluorometer and the data saved. In the analysis, only the cells were taken into account by setting a corresponding window in the forward versus sidescatter representation, which fell into the lymphocyte population due to their size and granulation.
  • test antibody is not T cell specific.
  • the antibody to be tested formed a flat distribution with one or more reference antibodies: in addition, a significant number of only single-positive cells can also occur: the test antibody showed a similar distribution pattern to the reference antibody and recognizes T cells.
  • the single-positive cells can be single-labeled B- or
  • NK cells act, which gives a further indication of the antigen specificity of the test antibody.
  • reference and test antibodies bind to two different, but coupled, expressed epitopes, which are probably on the antigen defined by the reference antibody.
  • Suitable target cells eg lymphocytes from human tonsils stimulated with phytohemagglutinin for 3 days
  • the rat antibodies RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p and RhCD7q were used as detection antibodies, which had previously been purified via Protein-G-Sephadex (Pharmacia) and labeled with a 100-fold molar excess of NHS-LC-Biotin (Pierce).
  • the biotin-labeled rat antibodies were detected by peroxidase-conjugated avidin (Dianova).
  • the test was developed with OPD and evaluated with an ELISA reader.
  • the maximum binding of the detection antibody was determined in control batches without a competent test antibody. The extent of the inhibition was achieved using the following formula:
  • a human T cell-containing cell population e.g. lymphocytes from tonsils stimulated with phytohemagglutinin for 3 days
  • NHS-LC-Biotin Pierce
  • NP-40 lysed with NP-40
  • the antibodies to be tested were purified or via a Capture antibodies attached to the solid phase in a 96-well ELISA plate and incubated with the biotin-labeled cell solubilisate. Excess material was removed by intensive washing.
  • the specifically bound antigen was eluted with a pH 2.7 citric acid buffer in the presence of 1% SDS and subjected to gel electrophoresis.
  • a colored protein mixture (LMW Biorad) served as the molecular weight standard.
  • the protein from the gel was then transferred to nitrocellulose paper and visualized with real dye via streptovidin-coupled phosphatase (Dianova).
  • Leu 1 (CD5) and Leu 9 (CD7; both Becton Dickinson) served as reference antibodies.
  • the antigen specificity could be demonstrated by comparing the band patterns between reference and test antibodies.
  • the cell lines characterized according to Examples 1 and 2 and established as MCB or WCB were thawed individually in serum-containing medium (RPMI 1640, 10% fetal calf serum, glutamine, non-essential amino acids, Na pyruvate) and in plastic culture bottles at 37 ° C and 5% C0 2 grown. The cells were then switched to serum-free LP medium (Gibco), expanded and transferred to a corresponding number of 10-well stack (NUNC).
  • serum-containing medium RPMI 1640, 10% fetal calf serum, glutamine, non-essential amino acids, Na pyruvate
  • the fermentation took place over a period of approx. 2 months in a volume of approx. 2 l per stack of trays.
  • the tub stacks were harvested semi-continuously three times a week, with twice 1.5 1 and once 1 1 cell-containing culture supernatant was harvested and replaced by fresh medium.
  • the daily harvests of the parallel tub stack of a cell line were filtered together to remove the cells from the culture supernatant using a glass fiber pre-filter and a sterile filter (0.22 ⁇ m).
  • the filtered culture supernatants of the total fermentation of a cell line were concentrated after the completion of the fermentation via a hollow fiber module with an exclusion limit of 30 kD to an antibody content of approximately 0.5 g / l.
  • the antibody concentration was measured in a subclass-specific ELISA (see Example 2, Test I), with the samples being titrated out in a serial dilution.
  • the antibody content was determined by calculation by comparing the dilution series of the sample to be examined with the dilution series of a standard antibody of the same subclass and known concentration.
  • the cleaning was carried out using an FPLC system and was divided into two sub-steps:
  • Sub-step 2 ( Figure 2) related to a further treatment of the entire mixture. This consisted of a chromatographic Method and a further virus inactivation step and ended in the production of the sterile end product.
  • the sterile end product (mATG) was stored at 4 ° C in plastic bottles. If necessary, the corresponding volumes were transferred to siliconized, sterile 30 ml glass bottles with rubber stoppers and stored in an upright position at 4 ° C.
  • a 32-year-old female patient (A) was transplanted from her HLA-DR different mother in the beginning recurrence of a secondary AML.
  • the AML first appeared 6 months earlier and had to be regarded as a secondary AML in connection with chemotherapy and radiotherapy performed 6 years earlier due to a M. Hodgkin. Due to the rapid relapse of the AML, the search for an optimally matched donor was dispensed with and, despite the increased GvHD risk, the HLA-DR haploidentic mother was chosen as the bone marrow donor.
  • the patient developed GvHD grade II of the skin and the liver with accompanying cytomegalovirus-associated interstitial pneumonia.
  • the GvHD was initially treated with high-dose steroids and a monoclonal antibody against TNF ⁇ .
  • the skin symptoms turned out to be primarily refractory and required a further 7-day treatment with 0KT3 on day 20, and after only a short response, a 10-day treatment with polyclonal ATG on day 29.
  • the concomitant therapy with corticosteroids and ciclosporin was continued in maintenance doses, in addition, methotrexate was administered in a low dose once a week.
  • the patient had slight dyspnea 1 hour after the end of the infusion, which stopped after a further 30 minutes without additional measures.
  • the following applications of the antibody preparation were tolerated without acute reactions.
  • the skin rash faded, the improvement became apparent from the 4th day of treatment.
  • Serum alkaline phosphatase (AP) initially expressed as liver GvHD, decreased from 469 U / ml to 339 U / ml at the end of the cycle.
  • the leukocytes remained stable under the administration of antibodies, the pre-existing thrombopenia and the plasma coagulation were not adversely affected.
  • a 31-year-old male patient (B) was transplanted with bone marrow from an HLA-identical donor in the specified phase of chronic myeloid leukemia.
  • myelofibrosis with secondary hapato and spenomegaly and signs of liver damage were complicating.
  • this patient developed a GvHD grade II-III of skin and liver, which was initially treated with anti-TNF antibody and high-dose steroid administration while continuing the cyclosporin prophylaxis. If there was a progressive increase in bilirubin and transaminases under this treatment, a 7-day cycle with ATG was added on day 20.
  • thalidomide was additionally used on the 83rd day after KMT, this treatment had to however, due to transient neurological symptoms in the sense of paraesthesia in the trigeminal region, they are stopped again after a few days.
  • the indication for the administration of the preparation according to the invention (cocktail) was therefore seen after the conventional therapeutic measures had been exhausted and discussed in detail with the patient. Therefore, from the 91st to the 98th day after KMT, 2 x 7.5 mg of the cocktail were applied, here too, short-term dyspnea due to spasticity and urticaria, which responded quickly to Fenistil, occurred under the first antibody administration. With good tolerance, the skin rash gradually regressed.
  • the 20-year-old patient D was referred for allogeneic KMT in the second remission of a T-ALL.
  • he When admitted, he already showed a recurrence of the underlying disease with multiple to five-mark-sized skin infiltrates in the trunk area and an increase in the number of blasts in the peripheral blood to 4%. Since the patient had suffered severe complications in the sense of pneumonia with ARDS during previous chemotherapy, chemotherapy again seemed too risky before the KMT was carried out. On the other hand, an unfavorable starting situation for the KMT was to be feared at the beginning of the conditioning without previous tumor reduction.
  • the cocktail was administered in one dose for three days of 2 x 7.5 mg / day.
  • prednisolone was administered in a dose of 100 mg from the 1st application: Immediately after the end of the 1st cocktail infusion, the patient complained of itching, which followed within a few minutes from the formation of patchy urticaria, partly in the area of the leukemia focus, partly in the healthy skin area.
  • the patient indicated that breathing was difficult, which necessitated the administration of oxygen.
  • antihistamines and 2 x 100 mg prednisolone urticaria improved within 10 minutes and dyspnea after about an hour. No further reactions such as an increase in fever or cardiac arrhythmia were observed, and the further administration of antibodies was well tolerated without any reaction.
  • the larger skin infiltrates showed a significant decrease in both the extent and the thickness, which continued in the further course.
  • the day of the first whole body exposure to the KMT they were practically no longer detectable. bar.
  • the peripheral blood count on the second day of administration of the monoclonal antibody preparation according to the invention showed a disappearance of the circulating blasts, and the bone marrow on the fourth day of treatment showed complete remission.
  • the application of the cocktail led to the intended tumor reduction in the absence of severe reactions in the sense of a tumor lysis syndrome.
  • the further course of the transplantation was low in complications. A short time later, the patient could be discharged to the outpatient clinic with normal haematological reconstitution and a full remission picture.
  • the monoclonal antibody preparation according to the invention achieved the desired effect of full remission with sufficient acute tolerability and that no further toxicities with regard to haematopoiesis or important organ functions occurred beyond the changes described.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung von T-Zell-spezifischer Immunreaktionen und von T-Zell-Leukämien, welches mindestens vier monoklonale Antikörper unterschiedlicher Spezifität gegen die humanen Lymphozytenmarker CD5 und CD7 enthält, wobei zwei der monoklonalen Antikörper gegen zwei nicht überlappende Epitope des Lymphozytenmarkers CD5 und die beiden anderen gegen zwei nicht überlappende Epitope des Lymphozytenmarkers CD7 gerichtet sind. Das erfindungsgemäße Arzneimittel erlaubt eine wirksame Suppression von Immunreaktionen bei Organ- oder Knochenmarkstransplantationen ohne die Nebenwirkungen hervorzurufen, die mit bisher bekannten Antikörper-Präparaten beobachtet worden sind.

Description

ARZNEIMITTEL, DAS ANTIKÖRPER ENTHÄLT, ZUR BEHANDLUNG VON T-ZELL SPEZIFISCHEN IMMUNREAKTIONEN UND T-ZELL-LEUKAMIEN.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behand¬ lung T-Zell-spezifischer Immunreaktionen und von T-Zeil-Leukä¬ mien, welches als Wirkstoff eine Kombination aus mindestens vier monoklonalen Antikörpern unterschiedlicher Spezifität enthält, wobei zwei der Antikörper gegen unterschiedliche, nicht-über- lappende Epitope des humanen Lymphozytenmarkers CD5 und die beiden anderen gegen unterschiedliche, nicht-überlappende Epitope des humanen Lymphozytenmarkers CD7 gerichtet sind.
Das Arzneimittel hat sich als äußerst wirksam für die Behandlung von Leukämie, Autoimmunerkrankungen und für die Suppression von Immunreaktionen bei Organ- oder Knochenmarkstransplantationen erwiesen, ohne die im Zusammenhang mit bisher im Stand der Technik bekannten Antikörperpräparaten beobachteten Neben¬ wirkungen zu erzeugen.
Der "Lymphozytenmarker" CD5 ist ein antigen wirksames Molekül, welches auf praktisch allen normalen peripheren T-Zellen sowie auf einer Subpopulation der normalen peripheren B-Zellen exprimiert wird, die sogenannte polyreaktive IgM-Antikörper produzieren. Der "Lymphozytenmarker" CD7 ist ein antigen wirksames Molekül, welches innerhalb der Lymphozytenpopulation auf den meisten normalen peripheren T- und NK-Zellen (N.atural Killer Cells) exprimiert wird.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel erfaßt somit ein breites, aber genau definiertes Spektrum von Zielzellen, wodurch eine äußerst wirksame Suppression von Immunreaktionen bei Organ- oder Knochenmarkstransplantationen erreicht wird.
T-Lymphozyten (T-Zellen) entwickeln nach Kontakt mit fremden Antigenen eine zelluläre Immunantwort. Im Falle einer allogenen Organtrans-plantation erkennen die T-Zellen des Wirts die Zellen des Spenderorgaris als fremd; der Patient entwickelt eine Wirt- gegen-Spender-Erkrankung. Im Falle einer allogenen Knochenmark¬ transplantation erkennen die mit dem Spenderknochenmark über¬ tragenen oder daraus nachreifenden T-Zellen den Wirt als fremd; der Patient entwickelt eine Spender-gegen-Wirt-Erkrankung (graft- versus-host-desease; GvHD). Im Falle einer Autoimmunerkrankung erkennen die T-Zellen des Patienten aufgrund einer Fehlregulation körpereigenes Gewebe als fremd.
Im ersten Schritt wird durch die als fremd erkannten Antigene eine Proliferation der T-Lymphozyten ausgelöst und die Induktion von Helfer- und zytotoxischen T-Zellen stellt die erste Stufe der T-Zell-spezifischen Immunreaktionen dar. Von T-Zellen können im weiteren Verlauf chemotaktisch wirksame, d.h. unter anderem Makrophagen anlockende, sowie mitogene Substanzen und γ-Inter¬ feron freigesetzt werden. Als Folge der T-Zell-Antigen-Reaktion kommt es zur Ausschüttung zytotoxischer Substanzen, die das Fremdantigen enthaltende Zellen abtöten. Im Fall einer Organ¬ transplantation wirkt sich diese Zellzerstörung makroskopisch in einer Abstoßung des Transplantats aus. Im Falle einer Knochen¬ marktransplantation kommt es makroskopisch zu Abstoßungserschei- nungen hauptsächlich am Darm, Leber und Haut. Als eine weitere Effektorzellpopulation für die Vermittlung von Abstoßungserscheinungen - zumindest bei der GvHD - kommen nach neuestem Kenntnisstand auch NK-Zel.len in Frage. Zudem könnten CD5+ B-Zellen an der Induktion einen humoralen Immunantwort beteiligt sein.
Eine Möglichkeit, Abstoßungserscheinungen prophylaktisch oder therapeutisch zu beeinflussen, besteht in der Zerstörung bzw. Inaktivierung der Effektorzellen. Möglich ist dies durch Verwendung spezifischer polyklonaler oder monoklonaler Antikör¬ per. Durch die Bindung von Antikörpern an ihre Zielzellen können in vivo und in vitro zelleliminierende Mechanismen, wie zum Beispiel das KomplementSystem, angeworfen werden.
Eine der möglichen Konsequenzen der Komplementaktivierung ist die sequentielle Zusammenfügung der sogenannten späten Komplementkom¬ ponenten (C5, C6, C7, C8 und C9) zu einem großen Proteinkomplex, der dann die Zell-Lyse vermittelt (Müller-Eberhard, Springer Semin. Immunopathol. , 7., 93 (1984)).
Neben der lytischen Funktion trägt das KomplementSystem auch zur Initiierung zellulärer Effekte und Mechanismen bei. Bekannt sind zum Beispiel Komplement-Rezeptoren auf Makrophagen, durch die diese Effektorzellen die Zielzellen erkennen, auf denen die Komplementaktivierung stattgefunden hat (Tenner und Cooper, J. Immunol. 1981, 126, 1174). Es wurde auch eine Stimulation der Makrophagen-vermittelten, Antikörper-abhängigen Zytotoxizität beschrieben (Leu et al., J. Immunol. 1989, 143. 3250).
Die erste Komponente der klassischen Komponentenkaskade ist Cl, ein pentameres Molekül, dessen größte Untereinheit, Clq, die Bindung zwischen Cl und den Fc-Teilen von Immunglobulinen vermittelt (Cooper, Advances in Immunol. (Editor: Dixon) Academic Press, New York, 1985, 151). Clq besteht aus sechs beweglichen kollagenen Armen mit je einem globulären Bindungskopf. Die Affinitätskonstante einer monovalenten Bindung zwischen einer Clq-Bindungseinheit und einem IgG-Molekül ist jedoch so schwach, daß eine stabile Bindung von Clq an IgG-besetzte Zellen oder Iπrmunkomplexe nur dann zustande kommt, wenn Clq mit mindestens zwei Bindungseinheiten an nebeneinander fixierten Antikörpern binden kann (Hughes-Jones, Im unology, 1978, .32., 191).
Im Stand der Technik sind folgende Parameter bekannt, die eine Clq-Bindung an IgG-besetzte Zielzellen bedingen und die Cl- Aktivierung bedingen: (1) der Isotop des verwendeten Antikörpers und (2) die Expensionsdichte des Zielantigens.
Der Isotop vermittelt die Affinität von Clq an den Fc-Teil der Antikörper. Von den gut untersuchten Maus-, Ratten- und Mensch- Isotypen weisen Maus-IgG2b und Maus-IgG2a, Ratte-IgG2b und Mensch-IgGl und Mensch-IgG3 eine hohe Clq-Affinität auf (Füst et al., Immunol. Lett. 1980, i, 249; Schumaker et al. , Biochemistry 1976, 5, 5175).
Die Expressionsdichte der Antigene determiniert die möglichen Clq-Bindungsstellen. Daher muß die Antigendichte auf der Zielzelle theoretisch einen gewissen Schwellenwert überschreiten, so daß der durchschnittliche Abstand zwischen zwei benachbart gebundenen Immunglobulinen innerhalb der Spannweite eines Clq- Moleküls liegt (Hughes-Jones et al., Eur. J. Immunol. 1985, 15, 976).
Alternativ kann ein Clq-Molekül auch an zwei unterschiedliche Antikörper binden, die gegen zwei sich nicht überlappende Epitope auf demselben Antigen gerichtet sind (sogenanntes εynergistischeε Antikörperpaar). Nach Hughes-Jones et al. (Eur. J. Immunol. 1984, 14, 974) stellt jedes Antigen unabhängig von der Expressions¬ dichte eine potentielle Clq-Bindungsstelle dar, wenn geeignete Antikörperpaare vorliegen, die innerhalb der Spannweite von Clq zwei Epitope dieses Antigens binden. Eine gewisse Korrelation zwischen der in vitro meßbaren Bindung von Clq gegenüber einer gegebenen Antikörperpräparation und deren zelldepletorischen Potenz in vivo wurde von Kummer et al. (J. Immunol. 1987, 138, 4069) beschrieben. Es wurde bislang jedoch noch kein gesicherter Nachweis für einen direkten kausalen Zusammenhang geliefert.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Antikörperpräparaten gegen T-Zellen und andere Leukozyten zur Immunsuppression, zur Leukämietherapie und zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen bekannt.
Zur Reduktion von Leukämiezellen wird entweder das zu trans- plantierende Knochenmark vor einer autoloσen Knochenmarktrans- plantation in vitro behandelt, oder es können in vivo-Behandlun- gen zum Erreichen einer Remission erfolgen.
Bei der Reduktion immunkompetenter Zellen zur Verhinderung bzw. Behandlung einer Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD) nach alloqener Knochenmarktransplantation erfolgt entweder eine in vitro-Be- handlung des Spender-Knochenmarks, oder der Empfänger wird vor oder nach der erfolgten Transplantation mit entsprechenden Antikörpern in vivo behandelt.
Bei Organtransplantationen läßt sich durch eine in vivo-Behand- lung des Transplantat-Empfängers die Zahl immunkompetenter Zellen reduzieren, um Abstoßungen zu verhindern bzw. zu unterdrücken. Autoimmunerkrankungen können mit einer vergleichbaren Therapie behandelt werden.
Die in der Klinik eingesetzten Antikörperpräparate können entweder zu einer Elimination der Zielzellen durch Aktivierung körpereigener Effektormechanismen führen oder die Funktions¬ bereitschaft der Zielzellen verändern, wie z.B. durch Blockade oder Aktivierung von funktionsrelevanten Rezeptoren, z.B. IL2- Rezeptor. Neben der Applikation von unmodifizierten Antikörpern wird auch die Verwendung Toxin- oder Radionuklid-konjugierten Antikörpern praktiziert. Während Antikörper selbst zu einer Aktivierung natürlicher Effektormechanismen führen (Elimination der Zielzel- len oder Veränderung ihres Funktionszustandes) , kann im Fall der Antikörper-Toxin-Konjugate eine toxische Komponente direkt an die Zielzellen transportiert werden (in vitro und in vivo) . Darüber hinaus kommen auch Antikörper in Frage, die gentechnologisch oder chemisch verändert werden, z.B. durch den Austausch konstanter Regionen, durch Kopplung von Antikörpern unterschiedlicher oder gleicher Spezifitäten, durch Anfügen oder Entfernen funktioneller Komponenten, wie z.B. durch Anfügen von Enzymen oder Enfernen des Fc-Teils der Immunglobuline u.a.
Bekannte immunsuppressiveAntikörperpräparate sindbeispielsweise monoklonale Antikörper gegen das humane CD3-T-Zellantigen (OKT3) und polyklonales Antiserum gegen humane T-Zellen (ATG) .
Die typischen Nebenwirkungen von ATG beruhen auf dem polyklonalen Charakter des Präparates, das mit seiner breitgefächerten Spezifität neben T-Zellen auch noch eine Vielzahl anderer Zellen erkennt. So kommt es neben ausgeprägten Lymphozytopenien auch zu Thrombo- und Granulozytopenien, die in einigen Fällen den Abbruch der immunsuppressiven Antikörper-Therapie mit ATG erforderlich machen. Durch die massive Zelleliminierung wird eine große Zahl von Zeilinhaltsstoffen und Immunmediatoren freigesetzt, was neben Unverträglichkeitsreaktionen insbesondere zu Beginn der Behand¬ lung zu Blutdruckabfall, Thoraxschmerzen, Fieberreaktione , Durchfällen und Juckreiz führt (ATG-Fresenius, Informations- broschüre) .
Die für polyklonale Antikörperpräparate typischen pleotropen Nebenwirkungen können durch Verwendung monoklonaler Antikörper stark eingeschränkt werden, da diese aufgrund ihrer Antigen- spezifität ihre Zielzellpopulation selektiv erkennen können. Jedoch kommt es wegen der im Vergleich zu polyklönalem Antikör- perpräparat geringen Bindungsdichte auf diesen Zellen zu einer nur milde verlaufenden Zellelimination.
Andererseits weisen monoklonale Antikörper einen hohen spezifi- sehen Titer auf, so daß unerwünschte Reaktionen, die gegebenen¬ falls durch die spezielle Antigen/Antikörper-Interaktion iniziiert werden, massiv und ungebremst ablaufen können.
So zeigt das Antikörperpäparat 0KT3 in vivo deutliche Neben- Wirkungen, die auf der initialen Stimulation der CD3+-T-Zellen sowie der damit verbundenen massiven Freisetzung an Immunmediato¬ ren basieren. Diese äußerst vielfältigen Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Fieber (73 %), Schüttelfrost (57 %), Atemnot (21 %), pektanginöse Beschwerden (14 %), Spastik (11 %), Übelkeit (11 %), Erbrechen (13 %) und Durchfall (20 %), können lebensbedrohlich sein (Todd und Brogden, Drugs 1989, 2 871).
Neben einer initialen Stimulation der T-Zelle induziert OKT3 die Modulation des CD3-Antigens und bewirkt somit einen funktions- losen, sogenannten anergischen Zustand.
Die meisten onoklonalen Antikörper gegen das humane CD3-Antigen weisen - abhängig vom Isotyp und dem Vorhandensein entsprechender Fc-Rezeptoren auf sogenannten akzessorischen Zellen wie Monozyten und Granulozyten - ähnliche stimulatorische Eigenschaften in vitro und klinische Nebenwirkungen in vivo auf wie OKT3 (Rao et al. Human Immunol. 1992, 32/ 275).
Daneben sind eine Reihe CD5-spezifischer Antikörper im Stand der Technik bekannt, die in vitro eine costimulierende (Ledbetter et al., Mol. Immunol. 1989, 2 .r 137; Vandenberghe und Ceuppens, Eur. J. Immunol. 1991, 2 r 251) beziehungsweise eine stimulierende (Spertini et al., J. Immunol. 1991, 146, 47) Wirkung auf T-Zellen ausüben können. Nach Lydyard und MacKenzie (Leucocyte Typing IV (Editor: Knapp et al. ), Oxford University Press 1989, 338) konnte keine Korrelation mit dem Iεotyp des Antikörpers festgestellt werden, jedoch ist die Stimulationspotenz auch bei CD5-spezifi- schen Antikörpern vom jeweiligen Fc-Rezeptortyp auf den akzesso- rischen Zellen abhängig. Eine Korrelation der Epitopspezifität der verwendeten Antikörper scheint nicht zu bestehen.
Von Bertram et al. (Blood 1986, .68., 752) wurden im Zusammenhang mit der Verwendung eines CD5-spezifischen Antikörpers bei T- Lymphom-Patienten zahlreiche Nebenwirkungen wie Juckreiz, Hautrötung, Kurzatmigkeit, Fieber, Durchfall, Erbrechen, HerzrhythmusStörungen und Blutdruckschwankungen beschrieben. Das Erscheinungsbild ist, wenngleich auch etwas abgeschwächt, ähnlich wie nach OKT3-Behandlung.
Neben monoklonalen Antikörpern gegen das CD5-Antigen sind auch entsprechende Antikörper gegen CD7 im Stand der Technik bekannt und wurden therapeutisch eingesetzt (Raftery et al. , Transplant. Proceedings 1985, 1 , 2737). Im Gegensatz zu CD3- bzw. CD5- spezifischen Antikörpern ist für Antikörper gegen das CD7-Antigen keine (co)stimulatorische Wirkung auf periphere T-Zellen beobachtet worden (Ledbetter et al., Mol. Immunol. 1989, .26., 137; Vandenberghe und Ceuppens, Eur. J. Immunol. 1991, 22., 251).
Außer der Verwendung von Antikörpern gegen ein T-Zell-Antigen zum Zweck der Immunsuppression durch Elimination von T-Zellen wurden im Stand der Technik auch Mischungen monoklonaler Antikörper gegen unterschiedliche T-Zell-Antigene verwendet. So beschrieben Uckun et al. (Blood 1990, 2£ 1723) die in vitro-Anwendung einer Kombination aus je einem Toxin-konjugierten Antikörper gegen CD5 und CD7 zur Leukämiezellreduktion. Auch die Verwendung einer Mischung aus je einem Antikörper gegen CD2, CD5 und CD7 zusammen mit einer Komplementquelle in vitro ist im Stand der Technik bekannt (Autran et al. Exp. He atol. 1987, JL5, 1121).
Die in vivo-Wirkung synergistischer, d.h. gegen nicht-über- läppende Epitope eines Antigens gerichteter, Clq-bindender
Antikörper wurde unter anderem von Qin et al. (Eur. J. Immunol. 1987, 2 1159) beschrieben. Der in Tierexperimenten nach¬ gewiesene Synergismus wurde mit Hilfe von einem Antikörperpaar gegen das humane Leukozytenantigen CD45 zur Elimination immunre- gulatorischer Leukozyten aus der Spenderniere ex vivo in der Humanmedizin ausgenutzt (Brewer et al., Lancet, 1989, 934).
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, das monoklonale Antikörper enthält, die vorrangig mit humanen T- (und NK-)Zellen reagieren, und welches geeignet ist, durch Eliminierung oder Inaktivierung dieser Zielzellen klinisch manifeste Abstoßungsreaktionen wirksam zu unterdrücken bzw. zu verzögern, ohne die bei Verwendung der bisher bekannten Antikörperpräparate auftretenden Nachteile bzw. drastischen Nebenwirkungen hervorzurufen.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird das Arzneimittel nach Anspruch 1 vorgeschlagen, welches als Wirkstoff mindestens vier monoklonale Antikörper unterschiedlicher Spezifität. enthält, von denen zwei gegen nicht-überlappende Epitope des Lymphozytenmarkers CD5 und zwei gegen nicht-überlappende Epitope des Lymphozytenmarkers CD7 gerichtet sind.
Während beim Übergang von polyklonalen zu monoklonalen Antikör¬ perpräparaten wegen der Erhöhung der Antigen-Spezifität nicht nur mit einer Reduktion der beobachteten pleotropen Nebenwirkungen sondern gleichzeitig auch mit einer verminderten Wirksamkeit zu rechnen ist, weist das erfindungsgemäße Arzneimittel über¬ raschenderweise nicht nur in Zahl und Ausmaß drastisch reduzierte Nebenwirkungen auf, sondern es besitzt eine unerwartete, im Gegensatz zu aus dem Stand der Technik bekannten monoklonalen Antikörperpräparaten signifikant erhöhte Wirksamkeit bei der Behandlung T-Zell-spezifischer Immunreaktionen. Das erfin¬ dungsgemäße Arzneimittel eignet sich aufgrund der effektiven Eliminierung bzw. Inaktivierung der T-Zellen zur wirksamen Behandlung bzw. Verzögerung klinisch manifester Abεtoßungs- reaktionen bei Organ- und/oder Knochenmarktransplantationen, zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen sowie von CD5- und/oder CD7- positiven Leukämien.
Mit der Auswahl synergistischer Antikörperpaare gegen das CD5- und das CD7-Antigen wird zum einen eine starke Clq-Antikörper- Bindung erreicht, zum anderen kann in besonders vorteilhafter Weise ein breites, aber genau definiertes Spektrum von Zielzellen erfaßt werden, wodurch eine äußerst wirksame Suppression von Immunreaktionen bei Organ- oder Knochenmarktransplantationen erreicht wird. So erfaßt das erfindungsgemäße Arzneimittel nicht nur praktisch alle T-Zellen, sondern vorteilhafterweise auch die das CD7-Antigen tragenden NK-Zellen, die in besonderer Weise für Abstoßungsreaktionen mitverantwortlich sind. Neben T-Zellen weisen auch etwa 10% der B-Zellen (polyreaktive, IgM-produzieren- de B-Zellen) das CD5-Antigen auf und stellen somit für das erfindungsgemäße Arzneimittel ebenfalls eine Zielzellpopulation dar. Daher wird mit dem Antikörperpräparat die erste humorale Reaktion auf Fremdantigene äußerst wirsam unterdrückt.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels führt initial zu einer deutlichen Elimination der CD5- und/oder CD7-positiven Zielzellen aus dem peripheren Blut. Parallel und in Konkurrenz zu diesem Wirkmechanismus kommt es auf einigen Zielzellen zum Verlust der Zielantigene durch Modulation. Diese modulierten und daher CD5- und/oder CD7-negativen Zielzellen werden jedoch überraschenderweise bei der weiteren Anwendung des erfindungs¬ gemäßen Arzneimittels nach ca. 5 bis 10 Tagen weiter deutlich reduziert. Voraussetzung hierfür ist eine Dosierung, die gewähr¬ leistet, daß der Serumspiegel für die Einzelkomponenten des er indungsgemäßen Arzneimittels nicht auf Null absinkt.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gegen CD5 und CD7 führen im Gegensatz zu vielen, im Stand der Technik bekannten
Antikörpern gegen CD3 oder CD5 weder einzeln noch in einer beliebigen Kombination zu einer signifikanten Stimulation der T- Zellen in vitro. Eine vom Blutzellspender bedingte Fc-Rezeptor- Heterogenität konnte ausgeschlossen werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung werden im Gegensatz zu den im Stand der Technik bekannten Antikörperpräparaten keine mit ATG vergleichbaren, d.h. pleotropen, oder mit 0KT3 vergleichbaren, stimulations-assoziierten Nebenwirkungen beobachtet.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel gestattet somit eine effektive Behandlung T-Zell-spezifischer Immunreaktionen, mit der sich klinisch manifeste Abstoßungsreaktionen wirkungsvoll verzögern bzw. unterdrücken lassen, ohne die bei bisher verwendeten Antikörperpräparaten auftretenden und zum Teil lebensbedrohlichen Nebenwirkungen hervorzurufen.
Obwohl eine Vielzahl verschiedener Isotypen zur erfolgreichen Immunsuppression eingesetzt werden kann, enthält das erfindungs¬ gemäße Arzneimittel vorzugsweise Antikörper der Subklasse Ratte- IgG2b.
Weiterhin haben sich monoklonale Antikörper der Subklasse Maus- IgG2a, Maus-IgG2b, Mensch-IgGl und Mensch-IgG3 als besonders vorteilhaft zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel erwiesen.
Prinzipiell kommen für das erfindungsgemäße Arzneimittel aber auch IgG-Subklassen anderer Tiere in Frage, die eine hohe Affinität zu Clq aufweisen.
Neben der erfindungsgemäßen Verwendung monoklonaler Antikörper gegen die humanen Lymphozytenmarker CD5 und CD7 kann das Arzneimittel zusätzlich zwei monoklonale Antikörper gegen nicht- überlappende Epitope eines weiteren (dritten) Lymphozytenmarkers enthalten. Darüber hinaus ist es von Vorteil, wenn in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel wenigstens ein Antikörper mit einer toxischen Komponente konjugiert ist. Zum Beispiel können diese Toxine Ricin, Saporin, cis-Platin, oder Radionuklide sein, die in Form einer chemischen Bindung an den entsprechenden Antikörper gebunden sind.
Zudem können ein oder mehrere der in dem Arzneimittel enthaltenen Antikörper gentechnologisch modifiziert sein. Beispiele für in Betracht kommende Modifikationen sind: 1. Austausch konstanter Regionen gegen homologe Sequenzen von Antikörpern einer anderen Subklasse der gleichen oder einer anderen Spezies, vorzugsweise des Menschen, (Chimärisierung, Humanisierung); 2. Kopplung von Antikörpern untereinander zum Zwecke der effizienten Induktion von Effektormechanismen, vorzugsweise der Bindung von Clq (Dimerisierung) ; 3. Eliminierung von Teilen des Antikörpers, vorzugsweise des Fc-Teils oder eines Fab-Teils (monovalente Antikörper, Antikörperfragmente) .
Eine weitere Modifikation betrifft die direkte und indirekte Kopplung mindestens eines Antikörpers an Komponenten bzw. Agentien, die eine physikalische Trennung bzw. Entfernung der Zielzellen erlauben oder allgemein eine Anreicherung oder Abreicherung ermöglichen. Als an die Antikörper gekoppelte Agentien kommen hierbei solche in Frage, die eine Kopplung auf Membranen gestatten oder magnetische Partikel.
Das Arzneimittel entsprechend der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, die Zahl der Leukämiezellen zu reduzieren, und es wird insbesondere zur in vitro-Behandlung von autologem, zu trans- plantierendem Knochenmark verwendet, wobei das Knochenmark vorzugsweise mit dem Arzneimittel und einer lytischen Kom¬ plementquelle inkubiert wird. Desweiteren ist die Verwendung des Arzneimittels zum Erreichen einer Remission in vivo von Vorteil, wenn man dem Leukämiepatienten das Arzneimittel i.v. in Form täglicher Dosen appliziert. Das erfindungsgemäße Präparat aus monoklonalen Antikörpern gegen CD5 und CD7 ermöglicht auch nach allogener Knochenmarktrans¬ plantation die Reduktion der Zahl immunkompetenter Zellen zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Graft-versus-Host- Erkrankung (GvHD) . Dabei ist es von Vorteil, wenn das Arznei¬ mittel vor der Transplantation zur in vitro-Behandlung des Spender-Knochenmarks verwendet wird, es führt aber wenigstens zum gleichen Effekt, wenn das Arzneimittel zur prophylaktischen und therapeutischen in vivo-Behandlung des Knochenmark-Empfängers eingesetzt wird.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel ermöglicht darüber hinaus die Reduktion der Zahl immunkompetenter Zellen zur Verhinderung und/oder Behandlung von Abstoßungen nach Organtransplantationen, wobei das Arzneimittel dem Empfänger des Organtransplantats verabreicht wird.
Ebenso ist eine Therapie von Autoimmunerkrankungen möglich, wobei der Patient in vivo mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel behandelt wird.
Die erfindungsgemäß verwendeten monoklonalen Antikörper liegen in gereinigter Form vor, vorzugsweise gelöst in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), gegebenenfalls versetzt mit einem oberflächenaktiven Mittel wie beispielsweise Tween 80, in einer Menge von beispielsweise 0,02 %, bezogen die Gesamtlösung. Die Lösung kann die Antikörpermischung in Mengen von 0,5 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 und in besonders bevorzugter Weise 1 mg/ml enthalten, wobei die verschiedenen Antikörpertypen vorzugsweise in etwa gleichen Mengenanteilen vorliegen.
Eine derartige Lösung kann für die intravenöse Applikation vorgesehen sein, wobei die Tagesdosis 10 bis 30 mg Antikörper¬ präparat betragen kann. Vorzugsweise werden 2 x täglich je 6 bis 10 mg Antikörper gelöst in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung über einen Zeitraum von einer halben Stunde infundiert. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper-Paare gegen die humanen Lymphozytenmarker CD5 und CD7 erfolgt im Prinzip durch eine gezielte Immunisierung von Ratten oder Mäusen durch i.p., i.v. oder s.c. Applikation des Antigens vorzugsweise in Form ganzer humaner T-Zellen (Lymphozyten, T-Zellinie) oder von entsprechenden Zell-Lysaten oder (an-)gereinigten Oberflächenmo¬ lekülen.
Nach erfolgter Immunisierung werden je nach Komplexität des Antigens, seiner antigenen Wirkung, Art und Anzahl der Immunisie¬ rungsschritte und der physiologischen Bereitschaft des Tieres, eine Vielzahl von B-Lymphozyten zur Proliferation und Antikör¬ perproduktion angeregt. Die sogenannten B-Blasten werden aus dem Tier gewonnen, vorzugsweise durch Entnahme der Milz und in vitro immortalisiert.
Die Immortalisierung erfolgt durch Polyethylenglykol-induzierte Zellhybridisierung, oder durch Elektrofusion mit einer in vitro lebens- und teilungsfähigen Myelomzellinie. Geeignete Myelomli- nien weisen vorzugsweise eine Anzaguranin-Resistenz auf, die eine Selektion der immortalisierten B-Zell/Myelom-Hybride (Hybridome) ermöglicht.
Nach der Fusion werden die Zellen mit HAT-Selektionsmedium verdünnt und in entsprechende Kulturgefäße (z.B. 96-Lochplatten) überführt, so daß Einzelklone entstehen und getrennt manipuliert werden können. Jeder Einzelklon sezerniert typischerweise identische Antikörper, die nicht immer gegen das gewünschte Antigen gerichtet sind.
Die Antikörper werden mittels geeigneter Testsysteme auf gewünschte Eigenschaften (z.B. Isotyp und/oder Spezifität) untersucht. Zur Bestimmung des Isotyps bietet sich ein sub¬ klassenspezifischer ELISA an, zur Bestimmung der Spezifität gegen humane T-Zellen ein Immunassay (z.B. EIA), der das Bindungs¬ verhalten der Antikörper auf T- und nicht-T-Zellen (z.B. B- Zellen) untersucht. Klone, die geeignete Antikörper produzieren, werden in Flüssigmedium expandiert und wiederholt auf Einzelzell¬ niveau rekliniert, bis eine stabile Zellinie mit nahezu kon¬ stanten Eigenschaften generiert ist.
Die genaue Antigen-Spezifität der Antikörper kann in FACS- Doppelmarkierungsexperimenten auf humanen Blutlymphozyten mit Referenzantikörpern der gewünschten Spezifität (anti-CD5, anti- CD?) untersucht werden, wobei die Verteilung und Lage der doppelt- und einzelpositiven Zellen zur Beurteilung herangezogen werden. Die Antigenspezifität wird nach Immunpräzipitaten aus dem Solubilisat von humanen T-Zellen im Vergleich mit den durch Referenzantikörper präzipitierten Molekulargewichte bestätigt. Die relative Epitopspezifität der generierten Antikörper kann durch Kreuzinhibition im EIA ermittelt werden.
Die Antikörper werden von den Hybrido zellen in das Kulturmedium sezerniert; die technische Umsetzung dieses Vorgangs wird Fermentation genannt. Aus dem Fermentationsüberstand werden die Zellen durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und die Antikörper durch Reinigung gewonnen. Dabei werden spezifische immunologische und/oder physiko-chemische Parameter der Antikör¬ per ausgenützt, um diese vorzugsweise durch chromatographische Verfahren selektiv anzureichern.
Die gereinigten Antikörper können lyophilisiert oder in ge¬ eigneten Puffern gelöst aufbewahrt werden, entweder tiefgefroren oder vorzugsweise bei 4°C.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert. Beispiel 1
Immunisierung, Fusion sowie Etablierung der Hvbridomzellinien RhCD5p, RhCD5σ, RhCD7p und RhCD7q:
Lou/C-Ratten wurden mit der humanen T-Zellinie Molt-3 ( merican Type Culture Cpllection (ATCC), CRL 1552) bzw. humanen peripheren Lymphozyten aus dem Blut immunisiert, wobei die Zellen 3 Tage lang mit Phytohämagglutinin (PHA) stimuliert worden waren. Das genaue Immunisierungsschema, das zur Etablierung der vier beschriebenen Zellinien führte, ist in Tabelle 1 angegeben.
Drei Tage nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet, die Milzen entnommen und daraus eine Einzelzellsuspension gewonnen. Als Fusionspartner diente die Azaguanin-resistente, nicht produzierende Maus-Myelomlinie P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580), die zuvor in einem Standardmedium (RPMI 1640, 10 % fötales Kälberserum, Glutamin, nicht-essentielleAminosäuren, Na-Pyruvat) expandiert wurde. Die Fusion erfolgte nach Standardprozeduren (Galfre et al. , Nature 1977, 266, 550) mit Polyethylenglykol 1500. Pro Ansatz wurden 100 x 106 Ratten-Milzzellen und 50 x 106 Maus-Myelomzellen verwendet.
Nach der Fusion wurden die Zellen auf 96-Loch Kulturplatten überführt. Dazu wurden sie so verdünnt, daß durchschnittlich ein Klon pro Loch zu erwarten war. Dem Standard-Medium wurde dabei das HAT-Supplement zugesetzt, das eine Selektion von fusionierten Zellen ermöglicht. Ca. 24 Stunden vor der Fusion wurden diese Kulturplatten mit einem Zellrasen aus Maus-Peretonealmakrophagen beschichtet, die das Anwachsen von Hybridomzellen in der sensiblen Phase nach der Fusion begünstigen. Tabelle 1: Immunisierungsschema
Immunisienmgen
Antikörper Immunogen 1. 2. 3. Fusion
RhCD5p stim. PBL+ 0. Tag: 44. Tag: 83. Tag: 86. Tag
20xl0β*ipJ 30x10 ip. 20xl06 ip.
20xl0β sc.§ 20xl06 iv.
RhCD5q stim. PBL 0. Tag: 84. Tag: 112 Tag: 115. Tag
20xl06 ip. 25xlOβ ip. llxlO6 ip.
20xl06 sc. llxlO6 iv.
RhCD7p Molt-3* 0. Tag: 32. Tag: 175. Tag 178. Tag
25xl0s ip. 40xl06 ip. 7xl06 ip.
25xl0β sc. 7xl06iv.
RhCD7q stim. PBL 0. Tag: 49. Tag: 112. Tag: 115. Tag
10xlOβ ip. 21xl0β ip. 12xlOβ ip.
10xl0β sc. 12xlOβ iv.
PHA-stumulierte PBL
T-Zellinie Molt-3 kultiviert im Normalmedium
Anzahl der Zellen intraperetoneal subkutan intravenös Sobald die wachsenden Klone ca. 10 % der Kulturfläche überdeckten (nach ca. 7 Tagen), wurden die Kulturüberstände der einzelnen Löcher in einem Subklassen-spezifischen ELISA-Test auf das Vorhandensein von Ratten-IgG2b Antikörpern untersucht (siehe Bei- spiel 2, Test I). Einen Tag später wurden die Kulturüberstände, die Ratten-IgG2b Antikörper enthielten, hinsichtlich ihrer Zielzellspezifität in einem Zeilbindungstest untersucht (siehe Beispiel 2, Test II). Die Zellen aus den Löchern, die T-zell- spezifische Antikörper der Subklasse Ratten IgG2b enthielten, wurden einzeln auf 24-Loch-Kulturplatten überführt, expandiert und kryokonserviert.
Die Zielzeil- und Antigenspezifität wurde in einem Doppelmarkie¬ rungsexperiment mit Referenzantikörpern gegen geeignete CD- Antigene ermittelt (siehe Beispiel 2, Test III).
Die Hybridomzellinien, die die CD5- bzw. CD7-spezifischen Antikörper sezernierten, wurden wieder aufgetaut und bis zum Erreichen einer Monoklonalität bzw. einer stabilen Produktions- rate auf Einzelzellniveau in 96-Loch Kulturplatten rekloniert. Zum Austesten der Überstände aus den Reklonierungen wurde ein subklassenspezifischer ELISA- (siehe Beispiel 2, Test I) oder ein Zellbindungstest (siehe Beispiel 2, Test II) durchgeführt.
Parallel mit den Reklonierungsschritten wurden die Antikörper hinsichtlich Antigenspezifität durch Immunpräzipitation (siehe Beispiel 2, Test V) exakt charakterisiert.
Dabei zeigte sich, das RhCD5p und RhCD5q gegen das humane CD5- Antigen gerichtet ist, das auf praktisch allen peripheren T.¬ Zellen und ca. 10 % der B-Zellen im peripheren Blut expri iert ist; RhCD7p und RhCD7q sind gegen das humane CD7-Antigen gerichtet, das auf den meisten humanen T- und NK-Zellen im peripheren Blut sowie auf myeloischen Verläuferzellen im Knochenmark exprimiert ist. Durch Bindungsinhibitionsexperimente (siehe Beispiel 2, Test IV) wurde die relative Epitopspezifität der Antikörper untersucht. Daraus ergab sich, daß sich weder RhCD5p und RhCD5q noch RhCD7p und RhCD7q deutlich inhibieren. Sie binden daher an jeweils zwei unterschiedliche Epitope auf dem CD5- bzw. CD7-Antigen.
Nach der vollständigen Charakterisierung und entsprechenden Reklonierungsschritten wurde eine Zellinie als Master Cell Bank (MCB) kryokonserviert. Aus jeder MCB wurde durch entsprechende Expandierungsschritte in Zellkulturflaschen eine Working Cell Bank (WCB) etabliert, die ihrerseits als Ausgangsmaterial für die Fermentation (siehe Beispiel 3) diente.
Die Zellinien wurden am 3.2.1993 bei "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) Abt. Menschliche und Tierische Zellinien" (Marscheroder Weg lb, 3300 Braunschweig, Germany) unter folgenden Nummern hinterlegt:
Antikörper Zellinie Hinterleσunσsnummer RhCD5p 21/61 DSM ACC 2113
RhCD5q 26/111/17 DSM ACC 2112
RhCD7p 23/5 DSM ACC 2115
RhCD7q 25/II/3 DSM ACC 2114
Beispiel 2
Testsysteme zum Nachweis der Subklasse bzw. der Bindunqsspezifi- tat der Antikörper RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p und RhCD7q
I. Subklassennachweis:
Dafür wurde ein spezifischer ELISA-Test in 96-Loch-Flachbo- denplatten durchgeführt. Als Fängerantikörper diente ein monoklonaler Mausantikörper, der spezifisch reagiert mit
Ratten-IgG2i-Antikörpern (ATCC 174). Als Nachweisantikörper diente ein polyklonaler, Peroxidase-konjugierter Maus-anti¬ Ratten-IgG-Antikörper (Dianova) ."Der Test wurde durch Zugabe von o-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD) entwickelt und in einem ELISA-Reader ausgewertet.
II. Zeilbindungstest:
Dieser Test wurde als Zell-Immunoassay in 96-Loch-Rundboden- . platten durchgeführt. Eine T-Zellinie (z.B. Molt-3; ATCC, CRL 1552) diente als positive Zielzelle, eine nicht-T- Zellinie (z.B. HL-60; ATCC, CCL 240) diente als negative Zielzelle. Die Zellen wurden mit dem zu testenden Kultur¬ überstand inkubiert und anschließend gewaschen. Der Nachweis der Bindung des Antikörpers an die Zielzelle erfolgte durch Inkubation mit einem polyklonalen, Peroxidase-konjugiertem Maus-anti-Ratten-IgG-Antikörper (Dianova). Der Test wurde durch Zugabe von OPD entwickelt und in einem ELISA-Reader ausgewertet.
III. Fluoreszenzdoppelmarkierung:
Dieser Test wurde in einem Durchflußzytometer (FACScan, Becton Dickinson) unter Verwendung des FSCScan Programms durchgeführt. Eine natürliche Zellpopulation (z.B. Ficoll- getrennte humane Blutlymphozyten) wurden mit dem zu te¬ stenden Kulturüberstand und gleichzeitig mit Biotin-markier- ten Maus-Referenzantikörpern (CD2: OKT11, ATCC, CRL 8027; CD5: Leu 1; CD7: Leu 9, beide Becton Dickinson) inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und mit Phycoerythin- markiertem Avidin (Dianova) sowie FITC-konjugiertem, polyklonalem Ratte-anti-Maus-IgG-Antikörper (Dianova) inkubiert. Die Zellparameter (Fluoreszenz 1, Fluoreszenz 2, Forwardscatter, Sidescatter) wurden im Zytofluorometer gemessen und die Daten abgespeichert. Bei der Analyse wurden nur die Zellen durch Setzen eines entsprechenden Fensters in der Forward-versus-Sidescatter-Darstellung berücksichtigt, die aufgrund ihrer Größe und Granulation in die Lymphozyten- population fielen.
Aus der Lage und dem Verhältnis der doppelt-, einfach- und unmarkierten Zellen konnte man auf die Zeil- und Antigen¬ spezifität schließen. Dabei konnten folgende Konstellationen unterschieden werden:
1) Der zu testende Antikörper bildete mit keinem der Referenzantikörper eine signifikante doppeltpositive
Population: Der Testantikörper ist nicht T-zellspezi- fisch.
2) Der zu testende Antikörper bildete mit einem oder mehreren Referenzantikörpern eine flächige Verteilung: zudem kann auch eine signifikante Anzahl an nur ein¬ fachpositiven Zellen auftreten: Der Testantikörper zeigte ein ähnliches Verteilungsmuster wie der Refe¬ renzantikörper und erkennt T-Zellen. Bei den einfachpo- sitiven Zellen kann es sich um einfachmarkierte B- oder
NK-Zellen handeln, was einen weiteren Hinweis auf die Antigenspezifität des Testantikörpers gibt.
3) Die doppeltmarkierte Zellpopulation liegt annähernd auf einer Diagonalen, zudem gibt es keine signifikante
Population an einzelpositiven Zellen: Referenz- und Testantikörper binden an zwei unterschiedliche, aber gekoppelte exprimierte Epitope, die wahrscheinlich auf dem durch den Referenzantikörper definiertem Antigen liegen.
4) Die doppeltpositive Zellpopulation verschwindet zugun¬ sten einer einfachpositiven Zellpopulation: Referenz- und Testantikörper inhibieren sich gegenseitig, d.h. sie sind gegen eng benachbarte bzw. sich überschneiden¬ de Epitope auf dem gleichen Antigen gerichtet. IV. Bindungsinhibitionstest:
Zur relativen Epitopcharakterisierung wurde ein Zell- Immunoassay durchgeführt. Geeignete Zielzellen (z.B. 3 Tage mit Phytohämagglutinin stimulierte Lymphozyten aus humanen Tonsillen) wurden sequentiell zunächst mit dem zu testenden Antikörper RhCD5p, RhCD5q und RhCD7p und RhCD7q bzw. mit Maus-Referenzantikörpern (CD5: Leu 1; CD7: Leu 9, beide Becton Dickinson) und anschließend mit dem Nachweisantikör- per in 96-Loch-Rundbodenplatten inkubiert und gewaschen. Als Nachweisantikörper wurden die Rattenantikörper RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p und RhCD7q verwendet, die zuvor über Protein- G-Sephadex (Pharmacia) gereinigt und mit einem 100-fachen molaren Überschuß an NHS-LC-Biotin (Pierce) markiert wurden. Der Nachweis der Biotin-markierten Rattenantikörper erfolgte durch Peroxidase-konjugiertes Avidin (Dianova). Der Test wurde mit OPD entwickelt und mit einem ELISA-Reader ausge¬ wertet. Die maximale Bindung des Nachweisantikörpers wurde in Kontrollansätzen ohne kompetierenden Testantikörper bestimmt. Das Ausmaß der Inhibition wurde erreichnet nach folgender Formel:
OD-Test — ODHil.t.ergrund
% Inhibition = [1- ] x 100 %
Figure imgf000024_0001
Dabei wurde eine vollständige Inhibition (>>50 %) als eine gegenseitige sterische Behinderung der beiden Antikörper aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur.
V. Immunpräzipitation und Westernblot:
Dazu wurde eine humane T-Zell-haltige Zellpopulation (z.B. 3 Tage mit Phytohämagglutinin stimulierte Lymphozyten aus Tonsillen) mit NHS-LC-Biotin (Pierce) markiert und mit NP-40 lysiert (Schuh et al., J. Immunol. Meth. 1992, 152. 59). Die zu testenden Antikörper wurden gereinigt oder über einen Fängerantikörper an die Festphase in 96-Loch-ELISA-Platte geheftet und mit dem Biotin-markierten Zellsolubilisat inkubiert. Überschüssiges Material wurde durch intensives Waschen entfernt. Das spezifisch gebundene Antigen wurde mit einem Zitronensäurepuffer pH 2,7 in Anwesenheit von 1 % SDS eluiert und einer Gelelektrophorese unterzogen. Als Moleku¬ largewichststandard diente ein gefärbtes Proteingemisch (LMW Biorad) .
Anschließend wurde das Protein aus dem Gel auf Nitrocellulo- se-Papier transferiert und über Streptovidin-gekoppelte Phosphatase (Dianova) mit Echtf rbstoff sichtbar gemacht. Als Referenzantikörper diente Leu 1 (CD5) und Leu 9 (CD7; beide Becton Dickinson). Aus dem Vergleich der Bandenmuster zwischen Referenz- und Testantikörper konnte die Antigen¬ spezifität nachgewiesen werden.
Beispiel 3
Produktion und Reiniσunσ der monoklonalen Antikörper RhCD5p, RhCD5g, RhCD7p und RhCD7σ sowie Herstellung des monoklonalen ATG- Cocktails
Die nach Beispiel 1 und 2 charakterisierten und als MCB bzw. WCB etablierten Zellinien wurden einzeln in serumhaltigen Medium (RPMI 1640, 10 % fötales Kälberserum, Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren, Na-Pyruvat) aufgetaut und in Kunststoffkultur- flaschen bei 37°C und 5 % C02 angezüchtet. Danach wurden die Zellen auf serumfreie LP-Medium (Gibco) umgestellt, expandiert und in eine entsprechende Anzahl von 10er Wannenstapel (NUNC) überführt.
Die Fermentation erfolgte über einen Zeitraum von ca. 2 Monaten in einem Volumen von ca. 2 1 pro Wannenstapel. Die Wannenstapel wurden dreimal wöchentlich semikontinuierlich geerntet, wobei zweimal 1,5 1 und einmal 1 1 zellhaltiger Kulturüberstand geerntet und durch frisches Medium ersetzt wurde. Die täglichen Ernten der parallel angesetzten Wannenstapel einer Zellinie wurden gemeinsam zur Entfernung der Zellen aus dem Kulturüber- stand über ein Glasfaservorfilter und ein Sterilfilter (0,22 μm) filtriert. Die filtrierten Kulturüberstände der Gesamtfermenta- tion einer Zellinie wurden nach Abschluß der Fermentation über ein Hohlfasermodul mit einer Ausschlußgrenze von 30kD bis zu einem Antiköpergehalt von ca. 0,5 g/1 eingeengt. Die Messung der Antikörperkonzentrationerfolgte ineinemSubklassen-spezifischen ELISA (siehe Beispiel 2, Test I), wobei die Proben in einer seriellen Verdünnung austitriert wurden. Der Antikörpergehalt wurde rechnerisch ermittelt durch Vergleich der Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Probe mit der Verdünnungsreihe eines Standardantikörpers der gleichen Subklasse und bekannter Konzentration.
Die Reinigung erfolgte mittels FPLC-Anlage und gliederte sich in zwei Teilschritte:
Teilschritt 1 (Figur 1) beinhaltete eine komplexe Abfolge von fünf chromatographischen Schritten sowie einem Virus-Inaktivie- rungsschritt, wobei die Antikörper in Portionen von ca. 200 mg aus dem Kulturüberstand gereinigt wurden. Für die weitere Verarbeitung wurden nur solche Einzelreinigungenweiterverwendet, die einen Endotoxingehalt < 0,03 EE/ml aufwiesen. Die Einzel¬ reinigungen wurden getrennt für jeden der vier Antikörper zu Rohchargen vereinigt. Entsprechend ihrem Proteingehalt (photome¬ trische Bestimmung: c = (E235-E28o)/2,51; Whitaker et al. , Anual. Biochem. 1980, 104, 156) wurde aus diesen Rohchargen eine äquimolare Mischung der gereinigten Antikörper RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p und RhCD7q hergestellt und auf eine Proteinkonzentration von 3 mg/ml eingestellt.
Teilschritt 2 (Figur 2) bezog sich auf eine weitere Behandlung der Gesamtmischung. Diese bestand aus einem chromatographischen Verfahren sowie einem weiteren Virusinaktivierungsschritt und endete in der Herstellung des sterilen Endprodukts.
Das sterile Endprodukt (mATG) wurde bei 4°C in Kunststofflaschen aufbewahrt. Bei Bedarf wurden die entsprechenden Volumina in silikonisierte, sterile 30ml-Glasflaschen mit Gummistopfen umgefüllt und bei 4°C in aufrechter Stellung aufbewahrt.
Beispiel 4
AnwendungdesAnti-CD5/Anti-CD7monoklonalenAntikörperpräparates bei 2 Patientenmit refraktärer akuter Graft-versus-Host-Reaktion (G HD^ nach alloqener Knochenmarktransplantation fK T^ :
1. Eine 32 Jahre alte weibliche Patientin (A) wurde im begin¬ nenden Rezidiv einer sekundären AML von ihrer HLA-DR differenten Mutter transplantiert. Die AML trat 6 Monate zuvor erstmals auf und mußte im Zusammenhang mit einer 6 Jahre zuvor durchgeführten Chemo- und Radiotherapie wegen eines M. Hodgkin als sekundäre AML betrachtet werden. Aufgrund des raschen Rezidivs der AML wurde auf die Suche nach einem optimal passenden Spender verzichtet und trotz des erhöhten GvHD-Risikos die HLA-DR haploidentische Mutter als Knochenmarkspenderin gewählt.
Die Patientin entwickelte am 14. Tag nach KMT eine GvHD Grad II der Haut und der Leber bei begleitender Cytomegalie- Virus-assoziierter interstitieller Pneumonie. Die GvHD wurde zunächst mit hochdosierten Steroiden und einem monoklonalen Antikörper gegen TNFα behandelt. Die Hautsymptomatik erwies sich als primär refraktär und erforderte am Tag 20 eine 7- tägige weitere Behandlung mit 0KT3, nach nur kurzem An¬ sprechen hierauf am Tag 29 eine 10-tägige Behandlung mit polyklonalem ATG. Die Begleittherapie mit Corticosteroiden und Ciclosporin wurde in Erhaltungsdosen fortgeführt, zusätzlich wurde einmal pro Woche Methotrexat in einer niedrigen Dosis appliziert. Nach erneutem vorübergehenden Ansprechen auf ATG verschlechterte sich die Hautsymptomatik ab Tag 48 nach KMT erneut, weshalb ein zweiter Zyklus mit 0KT3 für 10 Tage und eine Erhaltungstherapie mit Thalidomid angesetzt wurde. Infolge der OKT3-Therapie trat eine generalisierte Mikroangiopathie mit Hämolyse, Thrombopenie und Blutungsneigung auf, die die Gabe von Frischplasma erforderte.
Bei persistierendem Hautexanthem und ansteigenden Cholesta- se-Parametern wurde von Tag 69 bis 75 ein Behandlungsversuch mit einem monoklonalen Antikörper gegen den Interleukin-2- Rezeptor (IL2-Rezeptor) durchgeführt, der keine Wirkung zeigte. Daraufhin wurden von Tag 76 bis Tag 85 jeweils täglich 20 mg des erfindungsgemäßen monoklonalen anti- CD5/anti-CD7-Antikörperpräparates (in 500 ml isotonischer Kochsalzlösung) appliziert. Diese Behandlung erschien trotz der vorbestehenden radiologischen Zeichen pulmonaler Infiltrate wegen des refraktären Verhaltens der GvHD indiziert, sie wurde unter breitem antibiotischen und antimykotischen Schutz durchgeführt. Am 1. Tag der Behand¬ lung mit dem erfindungsgemäßen Antikörperpräparat kam es 1 Stunde nach Infusionsende zu einer geringgradigen Dyspnoe der Patientin, die ohne zusätzliche Maßnahmen nach weiteren 30 Minuten sistierte. Die folgenden Applikationen des Antikörperpräparates wurden ohne akute Reaktionen vertragen. Im Verlauf der Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Antikör¬ perpräparat blaßte das Hautexanthem ab, die Besserung zeigte sich ab dem 4. Behandlungstag. Die initial als Ausdruck einer Leber-GvHD erhöhte alkalische Phosphatase (AP) im Serum fiel von 469 U/ml auf 339 U/ml am Ende des Zyklus ab. Die Leukozyten blieben unter der Antikörper-Gabe stabil, die vorbestehende Thrombopenie sowie die plasmatische Gerinnung wurde nicht nachteilig beeinflußt. Im Verlauf entwickelte die Patientin am Tag 89 eine zunehmende Dyspnoe, die auf die bereits vor Therapie bestehenden pulmonalen Infiltrate zurückzuführen war. Dadurch wurde die Patientin beatmungs- pflichtig. Während der intensivmedizinischen Behandlung kam es erst ab dem Tag 100 nach KMT wieder zu einer Progression der Hautsymptomatik der GvHD, die wegen der zunehmenden pulmonalen Verschlechterung, der die Patientin schließlich erlag, nicht mehr behandelt wurde.
2. Ein 31 Jahre alter männlicher Patient (B) wurde in akze- lierter Phase einer chronisch-myeloischen Leukämie von einem HLA-identen Fremdspender knochenmarktransplantiert. Kom¬ plizierend lag als Folge des 9-jährigen Verlaufs der Erkrankung eine Myelofibrose mit sekundärer Hapato- und Spenomegalie und Zeichen der Leberschädigung vor. Dieser Patient entwickelte am Tag 16 nach KMT eine GvHD Grad II-III von Haut und Leber, die unter Fortführung der Ciclosporin- Prophylaxe zunächst mit anti-TNF-Antikörper und hochdosier¬ ter Steroide-Gabe behandelt wurde. Bei progredientem Bilirubin- und Transaminasen-Anstieg unter dieser Behandlung wurde am Tag 20 ein 7-tägiger Zyklus mit ATG zugesetzt. Während das Bilirubin im Verlauf zunächst rückläufig war, flammte das Hautexanthem am Tag 32 nach KMT erneut im Sinne eines Grad III der akuten GvHD auf, so daß eine Behandlung mit OKT3 unter Pentoxifyllin-Schutz erforderlich wurde. Auch diese Behandlung zeigte nur einen vorübergehenden Effekt, ab dem Tag 52 traten Zeichen der Haut-, Darm- und Leber-GvHD (jeweils Grad III, damit Gesamtgrad der GvHD IV) auf, so daß die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Antikörperpräparat (20 mg/Tag) am Tag 55 begonnen wurde. Am 1. Tag der Antikör- per-Verabreichung kam es 1 Stunde nach Infusions-Ende zu Symptomen der pulmonalen Spastik sowie einer Sinustachykar- die, die selbstlimitiert waren und nach etwa 30 Minuten sistierten. Bereits am 3. Tag der Gabe des erfindungsgemäß verwendeten Antikörperpräparates war die Haut-GvHD des Patienten deutlich rückläufig (Grad I-II), und die Diarrhöen sprachen- mit einem Rückgang von über 1400 ml auf weniger als 500 ml an. Wegen eines zunehmenden Anstiegs der bereits vor Therapiebeginn mit einer Gluta at-Pyruvat-Transaminase (GPT) von über 150 U/ml erhöhten Transaminasen auf maximal 1000 U/ml wurde die Therapie am 4. Tag unterbrochen, da zu diesem Zeitpunkt eine zusätzlich zur GvHD bestehende Virushepatitis nicht ausgeschlossen werden konnte. Wiederum konnten bei Verabreichung des erfindungsgemäßen Antikörper¬ präparates keine negativen Effekte auf das Blutbild be¬ obachtet werden. 3 Tage nach Unterbrechung der Applikation des Antikörperpräparates war die Hautsymptomatik im Sinne des Lyell-Syndroms erneut progredient, die Werte stiegen auf über 8 mg/dl an, so daß erneut hochdosiert Steroide sowie ATG eingesetzt wurden. Das Lyell-Syndrom sprach auf die ATG- Gabe nicht an, so daß von Tag 72 bis 76 nochmals das erfindungsgemäße Antikörperpräparat kombiniert mit anti-TNF appliziert wurde. Während hierunter das Lyell-Syndrom zum Stillstand kam, stand jetzt ein zunehmendes hepatorenales Syndrom im Vordergrund, der Patient verstarb am Tag 77 mit den Zeichen der Leber- und Niereninsuffizienz.
3. Bei einem 22 Jahre alten männlichen Patienten C wurde eine allogene KMT von einem HLA-identen Fremdspender wegen einer chronisch myeloischen Leukämie durchgeführt. Der Patient entwickelte bereits ab dem 10. Transplantationstag eine akute GvHD der Haut, die zunächst mit Corticosteroiden und anti-TNF-Antikörper unter Fortführung der Ciclosporinprophy- laxe behandelt wurde. Nach primärem Ansprechen der Haut auf diese Behandlung zeigte sich unter Corticoidreduktion ab dem 34. Tag nach KMT eine erneute Zunahme, die die Behandlung mit polyklonalem ATG erforderlich machte. Auch diese Behandlung führte nur zu einer vorübergehenden Stabilisie¬ rung der Haut-GvHD, bei mäßiger Aktivität wurde zunächst eine Erhaltungstherapie mit Corticosteroiden, CsA und wöchentlichen Gaben von MTX versucht. Bei eindeutiger Progression der Symptomatik wurde am 83. Tag nach KMT zusätzlich Thalidomid eingesetzt, diese Behandlung mußte allerdings wegen einer transienten neurologischen Symp¬ tomatik im Sinne von Parästhesien im Trigeminusbereich nach wenigen Tagen wieder abgebrochen werden. Bei progredientem Hautexanthem wurde deshalb die Indikation zur Gabe des erfindungsgemäßen Präparates (Cocktail) nach Ausschöpfung der konventionellen Therapiemaßnahmen gesehen und mit dem Patienten eingehend besprochen. Vom 91. bis 98. Tag nach KMT wurden deshalb jeweils 2 x 7,5 mg des Cocktails appliziert, auch hier kam es unter den ersten Antikörpergaben jeweils zu kurzfristiger Dyspnoe durch Spastik sowie zur Urtikaria, die rasch auf Fenistil ansprach. Bei im weiteren Verlauf guter Verträglichkeit bildete sich das Hautexanthem allmählich zurück. Am 99. Tag nach KMT traten akute Wortfindungs- störungen sowie Kopfschmerzen auf, ein daraufhin durch- geführtes CCT zeigte hypodense Areale, die mit einer cerebralen Toxoplasmose vereinbar schienen. Die Therapie mit dem Cocktail wurde aufgrund dieser Entwicklung nicht fortgeführt, wobei ein kausaler Zusammenhang mit der Applikation des Cocktails unwahrscheinlich erscheint, da bereits vor Therapiebeginn neurologische Symptome aufgetre¬ ten waren. Die cerebrale Toxoplasmose konnte im weiteren Verlauf bestätigt werden, der Patient entwickelte vier Monate nach KMT auf dem Boden dieser Herde eine cerebrale Blutung, an der er schließlich am 124. Tag nach KMT ver- starb. Im ganzen Verlauf war dabei die Haut-GvHD des Patienten trotz allmählicher Reduktion der Steroidmedikation nicht mehr aufgeflammt, so daß von einer dauerhaften Wirkung des Cocktails ausgegangen werden muß.
Zusammenfassend kann zur Wirksamkeit des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörperpräparates (anti-CD5/anti-CD7) bei den Patienten A und B festgestellt werden:
a) Bei den Patienten trat trotz einer massiven Vorbehandlung mit verschiedenen anti-T-Zell-Antikörpern bei Gabe von
20 mg/Tag (Patient A und B) bzw. von 2 x 7,5 mg/Tag (Pa- tient C) des erfindungsgemäßen Antikörperpräparates eine Besserung der GvHD-Symptomatik auf, die bei dem Patienten B an Haut und Darm rasch und extrem eindrucksvoll war und bei Patient C an der Haut über 25 Tage nach Absetzen der Therapie anhielt.
b) Die Akut-Verträglichkeit des erfindungsgemäß verwendeten Antikörperpräparates war im Vergleich zur Gabe von 0KT3, die nur unter zusätzlichem Schutz mit anti-TNF-Antikörpern, hochdosierten Steroiden und/oder Pentoxifyllin durchgeführt werden kann, deutlich besser. Insbesondere kam es nicht zu der bei OKT3 regelmäßig auftretenden Hyperpyrexie oder Zeichen der respiratorischen Insuffizienz, zudem waren die beobachteten, als Ausdruck einer First-Dosis-Reaktion interpretierten Symptome in beiden Fällen transient und nicht behandlungsbedürftig.
c) Hämatologische Nebenwirkungen wie unter der Gabe von ATG und 0KT3 beschrieben konnten nicht beobachtet werden.
d) Die Verläufe mußten bei den Patienten als schicksalshaft betrachtet werden. Die pulmonalen Infiltrate bei der Patientin A sowie die Leberschädigung bei dem Patienten B sowie die cerebrale Toxoplasmose beim Patienten C waren vor- bestehend Interstitielle Pneumonie sowie Leberinsuffizienz sind häufige Todesursachen bei Patienten mit refraktärer GvHD und einerseits direkt mit der GvHD assoziiert, anderer¬ seits als Folge einer über Monate dauernden immunsuppressi- ven Behandlung zu werten.
e) Aufgrund der Anwendungsbeobachtungen kann ausgesagt werden, daß das erfindungsgemäße Antikörperpräparat bei ausreichen¬ der Akut-Verträglichkeit die erwünschte Wirkung erzielte und über die geschilderten Veränderungen hinaus keine weiteren Toxizitäten hinsichtlich der Hämatopoese oder wichtiger Organfunktionen auftreten. Beispiel 5
Der 20 Jahre alte Patient D wurde zur allogenen KMT in 2. Remission einer T-ALL überwiesen. Bei Aufnahme zeigte er bereits wieder ein Rezidiv der Grunderkrankung mit multiplen bis fünfmarkstückgroßen Hautinfiltraten im Stammbereich und einer Vermehrung der Blastenzahl im peripheren Blut auf 4 %. Da der Patient während vorangehender Chemotherapien schwere Komplikatio¬ nen im Sinne einer Pneumonie mit ARDS erlitten hatte, erschien eine erneute Chemotherapie vor Durchführung der KMT zu riskant, andererseits war bei Beginn der Konditionierung ohne vorausgehen¬ de Tumorreduktion eine ungünstige Ausgangssituation für die KMT zu befürchten. Da die leukämischen Zellen des Patienten beim Rezidiv die T-Zell-Marker CD5 und CD7 getragen hatten, entschloß man sich in dieser Situation nach eingehender Aufklärung des Patienten zur Durchführung einer Behandlung mit dem Cocktail zur Tumorreduktion: Der Cocktail wurde über drei Tage in einer Dosis von 2 x 7,5 mg/Tag appliziert. Zur Vermeidung von First Dose Reaktionen, die aufgrund der gewünschten Zerstörung der großen Tumormasse zu erwarten war, wurde von der 1. Applikation Prednisolon in einer Dosis von 100 mg appliziert: Unmittelbar nach Ende der 1. Cocktail-Infusion klagte der Patient über Juckreiz, der innerhalb weniger Minuten von der Ausbildung einer fleckigen Urtikaria zum Teil im Gebiet der Leukämieherde, zum Teil im gesunden Hautbereich gefolgt wurde. Gleichzeitig gab der Patient eine erschwerte Atmung an, die die Gabe von Sauerstoff erforderlich machte. Nach Gabe von Antihistaminika und 2 x 100 mg Prednisolon besserte sich die Urtikaria innerhalb von 10 Minuten, die Dyspnoe nach etwa einer Stunde. Weitere Reaktionen wie Fieberanstieg oder HerzrhythmusStörungenwurden nicht beobachtet, die weiteren Antikörpergaben wurden ohne jegliche Reaktion gut vertragen. Bereits am 2. Tag der erfindungsgemäßen Behandlung zeigten die größeren Hautinfiltrate einen deutlichen Rückgang sowohl der Ausdehnung als auch der Dicke, der sich im weiteren Verlauf fortsetzte. Am vierten Tag, dem Tag der ersten Ganzkör¬ perbestrahlung zur KMT, waren sie praktisch nicht mehr nachweis- bar. Parallel dazu zeigte das periphere Blutbild am zweiten Tag der Verabreichung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper¬ präparates ein Verschwinden der zirkulierenden Blasten, das Knochenmark am vierten Tag der Behandlung eine Vollremission. Insgesamt muß davon ausgegangen werden, daß die Applikation des Cocktails zu der beabsichtigten Tumorreduktion bei Ausbleiben schwerer Reaktionen im Sinne eines Tumorlysesyndroms führte. Der weitere Transplantationsverlauf war bis auf eine ab dem vierten bis zum sechsten Tag bestehende Kollapsneigung, die am ehesten einem postfunktionellen Syndrom nach Liquorpunktion zuzuordnen war, komplikationsarm. Der Patient konnte kurze Zeit später mit normaler hämatologischer Rekonstitution und dem Bild einer Vollremission in die ambulante Betreuung entlassen werden.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das erfindungs¬ gemäße monoklonale Antikörperpräparat bei ausreichender Akut- Verträglichkeit die erwünschte Wirkung einer Vollremission erzielte und über die geschilderten Veränderungen hinaus keine weiteren Toxizitäten hinsichtlich der Hämatopoese oder wichtiger Organfunktionen auftraten.

Claims

Patentansprüche
1. Arzneimittel zur Behandlung von T-Zell spezifischen Immunre- aktionen und T-Zell-Leukämien, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff vier monoklonale Antikörper unterschiedli¬ cher Spezifität enthält, von denen zwei gegen im wesentli¬ chen nicht-überlappende Epitope des Lymphozytenmarkers CD5 und zwei gegen im wesentlichen nicht-überlappende Epitope des Lymphozytenmarkers CD7 gerichtet sind.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichne , daß die monoklonalen Antikörper der Subklasse Ratte-IgG2b, Maus- IgG2a, Maus-IgG2b, Mensch-IgGl oder Mensch-IgG3 angehören.
Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Antikörper von Zellinien entsprechend DSM ACC 2113, DSM ACC 2112, DSM ACC 2115 und DSM ACC 2114 gebildet werden.
4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin zwei monoklonale Antikörper unterschiedlicher Spezifität enthält, die gegen nicht- überlappende Epitope eines weiteren Lymphozytenmarkers gerichtet sind.
5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Antikörper mit einer toxischen Komponente konjugiert ist.
6. Arzneimittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die toxische Komponente Ricin oder ein Radionuklid ist.
7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper gentechnologisch durch Chimärisieren, Dimerisieren und/oder Fragmentieren modifi¬ ziert sind.
8. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper an Agentien gekoppelt sind, die eine physikalische Trennung und/oder eine Anrei¬ cherung und/oder eine Abreicherung der Zielzellen ermögli¬ chen.
9. Arzneimittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Agentien die Kopplung auf Membranen ermöglichen.
10. Arzneimittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Agentien magnetische Partikel sind.
11. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer zur intravenösen Applikation geeigneten Form vorliegt.
12. Verwendung des Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Senkung der Zahl von Leukämiezellen in vivo.
13. Verwendung des Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur in vitro-Behandlung von autologem, zu transplantie- rendem Knochenmark zur Reduktion von Leukämiezellen.
14. Verwendung des Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Reduktion immunkompetenter Zellen zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Graft-versus-Host-Reaktion nach allogener Knochenmarktransplantation.
15. Verwendung nach Anspruch 14 zur in vitro-Behandlung des allogenen Spender-Knochenmarks vor der Transplantation.
16. Verwendung des Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Reduktion immunkompetenter Zellen zur Verhinderung und/oder Behandlung von Abstoßungen nach Organtransplanta¬ tionen.
17. Verwendung des Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen.
18. Hybridom-Zellen entsprechend DSM ACC 2113, DSM ACC 2112, DSM ACC 2115 und DSM ACC 2114.
PCT/EP1994/001129 1993-04-14 1994-04-11 Arzneimittel, das antikörper enthält, zur behandlung von t-zell spezifischen immunreaktionen und t-zell-leukämien WO1994023747A1 (de)

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