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WO1994013823A1 - Sequence nucleotidique destinee au traitement du cancer et des infections - Google Patents

Sequence nucleotidique destinee au traitement du cancer et des infections Download PDF

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WO1994013823A1
WO1994013823A1 PCT/BE1993/000080 BE9300080W WO9413823A1 WO 1994013823 A1 WO1994013823 A1 WO 1994013823A1 BE 9300080 W BE9300080 W BE 9300080W WO 9413823 A1 WO9413823 A1 WO 9413823A1
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PCT/BE1993/000080
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Marc Zeicher
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Z. Company S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleotide sequence intended for the treatment of cancer cells or cells subjected to infections.
  • the present invention also relates to the vector comprising the sequence according to the present invention, as well as a pharmaceutical composition comprising said sequence and / or said vector.
  • the invention also extends to the use of the nucleotide sequence and / or of the vector according to the invention for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancer cells or cells subjected to infections. Technological background The effectiveness of conventional cancer and infection treatments is limited by their lack of selectivity. Indeed, the toxicity linked to these treatments is not limited to the target cells (tumor cells, infected cells), it also affects normal cells of vital importance.
  • Proteins which are highly cytotoxic when introduced into mammalian cells are produced by many species of bacteria and plants (fragment A of diphtheria toxin (DT-A),
  • Maxwell Cancer Research, 46, 4660-4664, September 1986 consists in introducing the DNA coding for the fragment A of the diphtheria toxin, in vitro into cells using Constructions comprising specific transcriptional regulatory elements of tissues acting in cis with the aim of only expressing DTA in cells containing the factors acting on these regulatory elements.
  • HSV-TK Herpes simplex type 1 Thymidine kinase
  • Certain guanosine analogues such as iodovinyldeoxyuridine (IVDU), acyclovir, ganciclovir are specific substrates for HSV-TK, which catalyzes their phos ⁇ phorylation into monophosphates more effectively (more thousand times) than thymidine kinases from mammalian cells. Subsequent phosphorylation into triphosphates under the influence of cellular kinases converts these molecules into potent inhibitors of DNA synthesis.
  • IVDU iodovinyldeoxyuridine
  • ganciclovir ganciclovir
  • ganciclovir which do not affect the in vitro survival of HSV-TK negative cells, allow in vitro destruction of HSV-TK positive cells and eradicate lymphomas HSV-TK positive in vivo in transgenic mice expressing HSV-TK in their lymphox cells.
  • guanosine analogs labeled with AUGER electron-emitting radioisotopes such as Iodine 123 (half-life 1:21 p.m.). These isotopes release most of their energy over a course of a few nanometers. The effectiveness of such radioisotopes with regard to cellular cytotoxicity is completely lost when they are not linked or at most at a distance of a few nanometers from DNA. If they are in the vicinity of DNA, about fifty decays are sufficient to kill the HSV TK positive cell.
  • cytotoxicity is obtained when the cells incorporate the analogy of guanosine labeled with iodine 123 into their DNA at doses below 10 ⁇ 10 M, which is much lower than the threshold of toxicity of this analog for cells. not having HSV-TK.
  • Iodine 123 also emits ⁇ radiation which can be detected using a gamma camera in the clinic.
  • This approach compared to the expression of fragment A of the diphtheria toxin, has the advantage of allowing control of the intensity and course of the cytotoxic attack.
  • Administration of the guanosine analogue may to be modified according to clinical evolution (evolution of cancerous tissue and toxicity inflicted on normal tissue).
  • Gene therapy can also use genes generating after transcription of RNAs inhibiting the expression of an oncogene involved in tumor disease.
  • antisense nucleic acid sequences to block the function of the messenger RNA with which they hybridize has developed over the last decade.
  • the inhibitory action of antisense molecules on gene expression depends either on the stability of the antisense RNA-target RNA hybrid or on the capacity of the antisense-target RNA hybrid to induce enzymatic protein destruction of RNA target.
  • RNA itself can have enzymatic activity and that catalytic RNA molecules (Ribozymes) can be modified to create antisense units which by their specific binding to target RNA molecules catalyze their cleavage.
  • Haseloff and Gerlach (Nature, 334 (1988), p.
  • RNAs can be selected from libraries of nucleotide sequences to obtain RNAs with specific enzymatic activity or RNAs used as specific ligands.
  • the use of genes coding for a protein which increases the defense mechanisms of the host has also been described.
  • Activation of the promoter sequence then allows the expression of the sequence coding for cytotoxic products resulting in the death of cells infected with the HIV virus.
  • nucleotide constructs can comprise LTR sequences, other than the TAR sequence.
  • sequences such as the enhancer elements NF-Kappa B (Greene, Annual Rev. Immunol., 1990, 8, p. 453) are transactivable by cellular activators, or such that the element NRE (Negative Regulatory Element) are transactivable by the viral factor NEF (Kieny, Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 3, p. 395 (1990).
  • NRE Negative Regulatory Element
  • NEF Negative Regulatory Element
  • Patent application WO 90/07936 and the document "Aids Research and Human Retroviruses" (vol. 8, no. 1, 1992, Mary Ann Liebert, Inc., Publisher) describe the integration into viral vectors or plasmids of nucleotide constructxons comprising regulatory sequences which can be activated by specific disease factors (such as AIDS) and sequences encoding cytotoxic products specifically affecting cells subject to hyperproliferative disorders or infections.
  • Patent application WO91 / 18088 describes the use of adeno-associated parvoviruses with low transduction efficiency (0.5 to 1.5% for a multiplicity of infection (Mol) from 1 to 10) which also exhibit the disadvantage of not being oncoselective and of integrating into the genome of transduced cells. Also, the technique described in this document requires an in vitro modification of hematopoxetic cells before being reinjected after transduction to the patient.
  • Patent application WO90 / 05538 describes a method for producing empty capsid of autonomous parvoviruses for: - vaccination using empty capsids;
  • the parvovirus described (B19) is a pathogenic autonomous parvovirus expressing selectively in hematopoxetic stem cells.
  • the empty capsid is then used to correct genetic deficiencies in hematopoxetic stem cells.
  • Virology vol. 186, n ⁇ 1, p. 207-218 describes a Densovirus (parvovirus infecting only insects). This virus is not infectious to mammalian cells and can therefore in no case be used for genetic therapy of cancer or infections in humans.
  • adenoviral vectors for the treatment of HIV infections. These adenoviral vectors still contain a large part of the genome of adenoviruses and recently their use as a vector for gene therapy for cystic fibrosis dose caused severe inflammatory reactions.
  • the regulatory and effector sequences used also have the following drawbacks:
  • the LTR sequence used ranges from -640 to +80 and must therefore confer a very significant ba ⁇ ale activity in the absence of tat;
  • the fragment (1084 bp) intended to allow regulation by Rev is particularly short and according to the authors, does not confer regulation by Rev.
  • the HSV thymidine kinase used as an effector sequence confers a "bystander effect" which risks killing the neighboring uninfected cells.
  • Patent application WO-A-8808450 is based on the addition to human stem cells, after their isolation in vitro, of a gene with a therapeutic value and of their reinjection in vivo into the patient.
  • the authors envisage the parvoviral vectors, namely the adeno-associated parvoviral vectors.
  • patent applications WO-A-9007936 are based on the addition to human stem cells, after their isolation in vitro, of a gene with a therapeutic value and of their reinjection in vivo into the patient.
  • WO-A-9012087 and WO-A-9102805 describe viral vectors such as retroviruses, adenoviruses or adeno-associated viruses for gene therapy.
  • the object of the invention is to provide a viral nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence capable of destroying or normalizing cells which are cancerous or subject to infections.
  • Another object of the invention is to provide a viral vector which, without integrating into their genome, is capable of being expressed effectively in the intracellular environment of said cells.
  • Main elements of the invention are to provide a viral vector which, without integrating into their genome, is capable of being expressed effectively in the intracellular environment of said cells.
  • the invention relates to a nucleotide sequence. intended for the treatment of cancer cells or cells subjected to infections, comprising, integrated into the nucleotide sequence of a virus belonging to the group of autonomous parvoviruses, an effector sequence capable of ensuring the destruction or normalization of the cells .
  • treatment is understood to mean a reduction or alleviation of the symptoms of the affection, the elimination or inhibition of the causative agents, the prevention of infection or of the cellular disorder of the subject subjected to the affection.
  • infection refers to infections of cells with viral, bacterial or other infectious intracellular parasites.
  • the invention relates more particularly to viral infectious agents such as HIV-I, HIV-II, HIV-III, HTLV-I, HTLV-II, herpes simplex virus (HSV), cytomegalovirus (CMV ), human papillomaviruses (HPV) and other similar viruses.
  • viral infectious agents such as HIV-I, HIV-II, HIV-III, HTLV-I, HTLV-II, herpes simplex virus (HSV), cytomegalovirus (CMV ), human papillomaviruses (HPV) and other similar viruses.
  • the viruses according to the invention are the viruses belonging to the group of autonomous parvoviruses, preferably oncoselective. These are small, envelope-less viruses whose genome consists of single-stranded linear DNA of approximately 5 KD. Their low genetic complexity makes them totally dependent on exogenous factors for their replication. They only replicate effectively in the intracellular environment of tumor cells in which they are found in episomal form (J. Rommelaere, Handbook of Parvoviruses, 1990, vol. 2, p. 41-57, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida).
  • the viral vector used is the Parvovirus H1, the fibrotropic Parvovirus of the "minute virus of mice” (MVMp) or the Parvovirus Lu III.
  • MVMp fibrotropic Parvovirus of the "minute virus of mice
  • Most human cancer cell lines tested to date have been shown to be permissive for infection by Hl parvoviruses and the fibrotropic variant of the "minute virus of mice (MVMp). These viruses have oncoprotective properties in vivo and can cause regression of human tumors in nude mice even after viral inoculation at a site distant from the tumor.
  • Hl and MVMp are small viruses containing a single stranded DNA of 5 kb bordered by 2 palindromic hairpin loops.
  • two promoters, P4 and P38 respectively control the expression of two non-structural proteins (NSI and NSII) and two capsid proteins (VP1 and VP2).
  • P4 controls NSI and NSII and P38, VP1 and VP2.
  • P38 transactivation factor and is responsible for cytotoxic activity.
  • NSI is further required for viral replication and the restriction or permissiveness for viral infection appears to be related to the level of t ranscription from NSI.
  • the viral vector lacks the genes coding for the capsid proteins (VP1 and VP2) of the parvovirus.
  • the viral vector also lacks the P38 promoter and the genes coding for the non-structural proteins NSI and NSII of the Parvovirus.
  • the autonomous parvovirus pMM 984 described by Merchlinsky et al., Is used. (J. of Virology, 47, p. 227-232 (1983).
  • effector sequence refers to a nucleotide sequence which, when it is expressed, for example when, under the action of specific transactivation factors acting on a regulatory sequence, it codes for an effector polypeptide capable of destroying or normalizing -treated cells.
  • this effector sequence when it is transcribed into an RNA is capable of destroying or normalizing treated cells.
  • a ribozyme can be created which specifically destroys the RNA transcript resulting from the fusion of exon 3 of the bcr gene to exon 2 of the abl gene encountered in chronic myeloid leukemia cells.
  • Szczylik et al. (Science, 253, 562 (1991)) have been able to show that anti-sense anti-bcr-abl RNAs inhibit the proliferation of cells of chronic myeloid leukemia.
  • the DNA encoding this ribozyme can be placed at the Ase I restriction site which is found in the small intron of the MVM p genome. During splicing of the messenger RNAs of MVMp, this ribozyme will be released by the spliceosome in a nuclear compartment rich in target RNA.
  • the stability of such ribozymes can be increased by adding a 3 'sequence such as the transcription terminator sequence of bacteriophage T7. This sequence will protect the ribozyme from digestion with 3 'exonucleases (Sioud et al., J. Mol. Biol. (1992), 223, p. 831-835).
  • the size of the parvoviral DNA can be increased by about 100 nucleotides while still retaining the encapsidation capacity and the infectious power of the parvoviruses formed.
  • Such a recombinant virus containing a ribozyme has the ability to reproduce in tumor tissue while destroying it and can re-infect, develop and kill other tumor cells.
  • the effector sequence is made up of several coding or non-coding nucleotide sequences, arranged in polycistronic subunits, under the control of a single promoter unit.
  • the effector sequence also includes sequences coding for molecules inhibiting tumor neoangiogenesis (Billington DC, Drug design and discovery, vol. 8, p. 3-35 (1991)) such as Interferon ⁇ , Interferon ⁇ or the Platelet Factor 4 (Maione et al., Cancer Research, 51, p. 2077-2083 (1991)).
  • effector genes of the same effector sequence can be inserted into the same vector by arranging them in polycistronic units where the different genes are linked by nucleotide sequences allowing their expression following the activation of a single promoter located upstream of the first effector gene.
  • parvoviral vectors preferably oncoselective, makes it possible to directly synthesize in vivo by the tumor cells of the patient's cancerous tissues, the various molecules promoting the rejection of the cancerous tissues. This represents enormous progress compared to the method described by Pardoll where one has to excise a piece of the patient's tumor, make a cell suspension of it, transfect it, irradiate it and reinject it into the patient.
  • the effective nucleotide sequence or a part of it encodes at least one fusion polypeptide, comprising in particular a ligand (secretable), such as the specific hypervariable end of an antibody (single chain antibody) , a cytokine or a growth factor, which specifically binds to at least one molecule expressed on the surface of cancer cells or cells subjected to infections.
  • a ligand secretable
  • an antibody single chain antibody
  • cytokine a growth factor
  • the fraction of the target cells having been infected by the recombinant autonomous parvoviruses will synthesize and secrete in large quantities the fusion polypeptides (immunotoxins, immunocytokines, immunoenzymes, etc.). These fusion polypeptides will mainly bind to uninfected cancer cells and this process will increase the "bystander" effect and the remote effect of gene therapy.
  • fusion polypeptides immunotoxins, immunocytokines, immunoenzymes, etc.
  • the effector sequence or part of the effector sequence, code :
  • a molecule such as an enzyme, giving a cell sensitivity to a toxic agent
  • said molecule preferably being the thymidine kinase of Herpes simplex virus type 1 (HSV-TK) and the toxic agent an analog guanosine gue labeled with radioisotopes emitting Auger electrons, such as Iodine 123;
  • HSV-TK Herpes simplex virus type 1
  • DT-A cytotoxic proteins available
  • RicinA RicinA
  • Gelonin Pseudomonas aeruginosa toxin
  • DT-A cytotoxic proteins available
  • any possible release of DT-A by the dead cells will be destroyed by the immune system.
  • DT-A lacks a binding site to a cell receptor, it will not be able to enter other cells.
  • the production of DT-A in mammalian cells results in the inhibition of any subsequent protein synthesis (by ADP ribozylation of the elongation factor -2) and therefore leads to cell death.
  • DTA acts catalytically and not stoichiometrically, a few molecules of DTA are sufficient to kill a cell.
  • the fragment A released in cells infected with HIV not only causes cell death, but also blocks any protein synthesis including the synthesis of viral proteins and therefore blocks the reinfection of neighboring cells.
  • the effector sequence can be modified for example by site-directed mutagenesis in order to attenuate the cytotoxicity of the protein produced.
  • the nucleotide sequence also comprises at least one regulatory sequence transactivable by transactivation factors specific for the condition treated or the affected cellular tissue, and capable of cisactivating the effector sequence.
  • the expression "ensuring the destruction or normalization of cells” means that during an infection or during cancer, the expression of the effective sequence in the host cell makes it possible either to kill that - either to make it sensitive to a toxic exogenous agent or to make it capable of inhibiting the action of cancer or the infectious agent.
  • effector sequence refers to a nucleotide sequence which, * when expressed (by the action of specific transactivation factors on the regulatory sequence), makes it possible to destroy or normalize the cells treated .
  • the effector sequence codes for either a cytotoxic protein, preferably fragment A of the diphtheria toxin (DTA); or for an enzyme which confers on the transfected cell a sensitivity to a toxic agent, the enzyme will preferably be the thymidine kinase of Herpes simplex virus type 1 (HSV-TK).
  • DTA diphtheria toxin
  • HSV-TK Herpes simplex virus type 1
  • DT-A cytotoxic proteins available (DT-A, RicinA, Gelonin, Pseudomonas aeruginosa toxin) the choice of DT-A seems appropriate. Indeed, as the majority of the population has been vaccinated against diphtheria toxin, any possible release of DT-A by dead cells will be destroyed by the immune system. In addition, since DT-A lacks a cell receptor binding site, it will not be able to enter other cells.
  • DT-A in mammalian cells results in the inhibition of any subsequent protein synthesis (by ADP ribozylation of the elongation factor -2) and therefore leads to cell death.
  • DTA acts catalytically and not stoichiometrically, a few molecules of DTA are enough to kill a cell.
  • the fragment A released in cells infected with HIV not only causes cell death, but also blocks any protein synthesis including the synthesis of viral proteins and therefore blocks the reinfection of neighboring cells.
  • the effector sequence can be modified for example by site-directed mutagenesis in order to attenuate the cytotoxicity of the protein produced.
  • the nucleotide sequence also comprises at least one regulatory sequence transactivable by transactivation factors specific for the condition treated or the affected cellular tissue, and capable of cisactivating the effector sequence.
  • transactivatable regulatory sequence refers to a nucleotide sequence which is capable of responding to a specific transactivation factor and of activating in response the transcription of sequences located in cis.
  • the regulatory sequence comprises all or part of the LTR (Long terminal Repeat) regulatory sequence of HIV or HTLV viruses comprising the TAR (TAT responsive element) sequence.
  • the LTR sequence is devoid of the Kappa B enhancer sequence transactivable by cellular factors and / or of the NRE sequence transactivable by the viral factor NEF.
  • deletion of these sequences within the LTR sequence surprisingly reduces the expression of the nucleotide sequence of the invention in cells not expressing the TAT protein without decreasing the expression of the nucleotide sequence of the invention in cells expressing the TAT protein.
  • the nucleotide sequence also includes a regulatory sequence consisting of all or part of the RRE (Rev-Responsive Element) sequence and of the adjacent CRS sequence of the HIV and HTLV viruses (Rosen, PNAS, vol. 85, p. 2071-2075 (1988)) and adjacent splicing sites.
  • RRE Rev-Responsive Element
  • the TAR sequences located in the LTR of HIV and HTLV viruses and transactivable by the viral proteins TAT of HIV and TAX of HTLV
  • RRE located in the sequence of ENV of HIV and HTLV viruses and responding to the proteins REV of HIV and REX of HTLV
  • adjacent splicing sites are for example sequences which can be used for the treatment of infections by these retroviruses (Rosen G., Editorial Review, Aids 1990, 4, 499-509).
  • the effector sequence is also placed under the control of the HIV Rev protein, because in the absence of Rev, any RNA which contains the RRE sequence is blocked in the nuclear spliceosome and cannot be exported in the cytoplasm to the ribosomes. .
  • the regulatory sequence consists of at least one "enhancer" promoter sequence, preferably specific for the cytomegalovirus and the effector sequence is transcribed into a ribozyme specifically cleaving I 'Messenger RNA coding for the cytomegalovirus ⁇ protein (Griffiths P., Biochem J., 241, p. 313-324 (1987)).
  • the regulatory sequence consists of at least one promoter and / or at least one transactivable enhancer in certain specific tissues, preferably chosen from the group consisting of: - the nucleotide sequence controlling the expression of the gene coding for the foetoprotein (AFP), this region being transactivated only in the cells of hepatomas, chorio-carcinoma and in rare hepatic cells (Sakai M., The Journal of Biological Chemistry, vol. 260, n ° 8, p. 5055-5060 and Nakabayashi H., vol. 264, n ° 1, p. 266-271);
  • AFP foetoprotein
  • PP11 placental protein 11
  • H23 breast-cancer-associated antigen
  • the present invention also relates to a recombinant vector (viral or plasmid) comprising the sequence or part of the sequence according to the invention.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition for the treatment of cancer cells or cells subjected to infections comprising at least one sequence and / or the vector according to the invention and an adequate pharmaceutical vehicle.
  • this pharmaceutical composition also comprises one or more wild viral agents belonging to the group of autonomous parvoviruses.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the pharmaceutical composition, of the sequence and / or of the vector according to the invention for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancers and / or infections .
  • FIG. 1 represents a schematic view of the nucleotide sequence of the invention.
  • FIG. 2 represents the growth curves (number of cells x 10 * 4 ) of normal human fibroblasts (NHF) and of transformed fibroblasts (KMST-6) as a function of time (day after infection).
  • FIG. 3 represents the expression of CAT (Pg CAT / 10 ⁇ g of cell extract) in these two cell lines as a function of time (day after infection).
  • FIG. 4 represents the expression of the CAT protein after two days of infection of different normal (white rectangle) or transformed (striped rectangle) cell lines
  • fibroblasts epithemial cells
  • c T lymphocytes, B lymphocytes, e ⁇ Macrophages
  • FIG. 1 represents a nucleotide sequence (1) according to the invention and the polypeptxdxque sequence (7) encoded by said nucleotide sequence (1).
  • This nucleotide sequence (1) comprises, integrated into an autonomous parvoviral vector (2), under the control of at least one regulatory sequence (4), at least one effector sequence (3).
  • Said effector sequence (3) preferably consists of several polycistronic coding subunits (5,6).
  • Said effector sequence (3) preferably codes for a fusion polypeptide (7) comprising at least one ligand (8) and an effector polypeptide sequence proper (9) such as a cytotoxic polypeptide.
  • Example 1 Treatment of H.I.V. Infection
  • the viral sequences used are on the one hand the 5 ′ LTR sequence of HIV modified so as to be controlled by the TAT protein of HIV and to escape control of cell transactivation factors, and on the other hand, the RRE sequence placed under control of the HIV Rev protein and linked to the adjacent CRS sequence.
  • the effector sequence placed between these two sequences consists of the gene coding for the fragment A of the diphtheria toxin.
  • the TAR sequence (controlled by TAT) and the RRE sequence (REV Responsive Element) of HIV-1 respond to the TAT and REV proteins of HIV-1 and HIV-2 as well as the TAX and REX proteins of HTL-V-1.
  • the high degree of conservation of these sequences makes it possible to treat the cells infected with the different strains of HIV using the same construction.
  • the advantage of parvovirus over other transfection vectors is that there is no integration into the genome of the cell of its genetic material, which remains in episomal form and does not risk inactivating an oncosuppressive gene or activate a protooncogene.
  • the safety and efficacy of such a treatment should also allow its administration to HIV-positive patients in the asymptomatic latent infection phase.
  • the fragment A released in cells infected with HIV not only causes cell death, but also blocks any protein synthesis including the synthesis of viral proteins and therefore blocks the reinfection of neighboring cells.
  • HIV LTR sequence is thus devoid of the NF-KB sites but retains 3 SP1 sites, the TATA Box and the TAR (TAT Responsive Element).
  • BamH I fragment (Bluescript 719) "BamH I (HIV 8474) having the correct orientation (2865 bp) and another poorly oriented fragment (1277 bp).
  • Bgl II polylinker insert BamH I fragment - LTR - DTA - CRS - RRE - BamH I and select the clones with the correct orientation.
  • Clones with the correct orientation are selected and the plasmids isolated.
  • PMM 984 tends when propagated in E. Coli to lose 40 or 97 base pairs in the right palindrome, which is not the case in Epicurian Coli sour (Stratagene ® ).
  • helper plasmid (either pMM 984 or a pMM 984 having a deletion in the right palindrome) is cotransfected with the recombinant plasmid selected in tumor cells.
  • the Hind III site of the plasmid PBR 322 in pMM 984 is destroyed by removing the Cla I - Nhe I fragment from PBR 322 and by blurring the protruding 5 ′ ends in the presence of the Klenow fragment of E DNA polymerase. Coli.
  • PMM 984 (Hind III PBR 322-) is then recircularized. - Digestion with Hind III and Xba I and insertion of the fragment H23 - ATG - DTA TAG at the Hind III (2650) and Xba I (4339) sites of the plasmid (devoid of the Hind III site of PBR 322) pMM 984 in place of the coding sequences for the VP1 and VP2 proteins of MVMp. The following sequence of the modified MVMp is therefore obtained: Palindrome, P4 promoter, NSI, NSII, P38 promoter H23 enhancer promoter region - ATG - DTA - TAG - MVM polydenylation sites, Palindrome.
  • Example 4 Vectorial construction to be used for the treatment of hepatoma or choriocarcinoma
  • the viral infection is combated by cytotoxic T lymphocytes which recognize peptides originating from viral proteins which have been degraded after endogenous synthesis by the infected cells. These peptides are recognized in association with the molecules of MHC class I (Major Histocompatibility Complex).
  • MHC class I Major Histocompatibility Complex
  • the destruction of infected cells prevents the viruses from spreading to other cells by inhibiting their replication.
  • the body's defenses also include the intracellular production of interferon and the production of specific antibodies.
  • cytomegalovirus infection is asymptomatic in individuals with an immune system normal, it becomes a major cause of death and morbidity in patients with immunity either immature (fetus, newborn) or compromised (allograft recipients, patients with AIDS). Intrauterine CMV infections are the second cause of mental retardation after down syndrome. (Griffiths and al., Biochem. J. (1987), 241, p. 313-324)
  • CMV pneumonia is the main cause of death after bone marrow transplantation and the discrete CMV infection is the major cause of morbidity and mortality in kidney transplant recipients or in AIDS patients.
  • RNA and proteins After infection of the susceptible cell by CMV, the temporal expression of the virus genome is tightly controlled in the form of a cascade synthesis of messenger RNA and proteins.
  • the products of the ⁇ genes are required by the virus to take control of the syntheses of the host cell, the ⁇ products control the production of virions while the ⁇ products form the structural components of the virion.
  • the ⁇ proteins allow the synthesis of messa ⁇ ger ⁇ RNA and the ⁇ proteins allow the replication of DNA which is followed by the synthesis of ⁇ messenger RNA.
  • the o and ⁇ genes are transcribed by cellular RNA polymerase II. Their expression is controlled by sequences proximal to the promoter which are activated in trans by a structural protein of the virion.
  • these sequences are inserted following the P4 promoter of the parvovirus and are followed by a sequence coding for a ribozymial RNA specifically cleaving the messenger RNA coding for the most important ⁇ protein (Spaete and Mocarski, 1985, J. virol., 56, 135-143; Sternberg et al, 1984, J. virol., 49, 190-199).
  • Cells transfected with the modified parvovirus in this way are protected from CMV infection. Indeed, during infection, removal of the viral envelope gives rise to the structural protein which will transactivate the sequence included in the parvovirus and will initiate the production of anti RNA ribozymes of the ⁇ protein.
  • EXAMPLE 6 Vector Construction Comprising Polycistronic Units Autonomous Parvoviral Vector Containing the GMCSF Gene (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) and the PF4 Gene (Platelet Factor 4) in the Form of a Bicistronic Unit Connected by the IRES (Internai Ribosome Entry Site) of the hepatitis C virus.
  • GMCSF Gene Gramulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
  • PF4 Gene Platinum-Platelet Factor 4 Gene
  • the autonomous parvoviral vector according to the invention comprises both sequences coding for GMCSF and for PF 4 (which is a powerful inhibitor of tumor neovascularization).
  • the gene coding for GMCSF is isolated by adding to it a Hind III site in 5 'and an NCO I site in 3' (plasmid GMCSF ® from the British Technology Group), the pGEM 7 ® (Promega) is modified by introducing to the Smal site, an NCO I site and to the EcoR I site, a BglII site. The Hind III-GMCSF-NcoI fragment is inserted into the modified pGEM 7 plasmid.
  • a fragment including the sequence between nucleotides 101 and 332 of the 5 'untranslated region of the hepatitis C virus is isolated by PCR (Tsukiyama-Kohara, Journal of Virology, 1992, 1476-1483). This fragment comprises a 5 'NCO I site and a 3' BglII site including the IRES (101-332).
  • the modified pGEM 7 containing GMCSF is inserted at the NCO I and BglII sites.
  • the fragment is isolated by PCR containing the gene coding for human PF4 (Barone, J. Biol. Chem., 2.63 / . 8710-8715 (1988)).
  • This fragment comprises a 5 'BglII site and a 3' Xba I site encompassing the PF4 gene. This fragment is inserted between the BglII sites and
  • Hind III-GMCSF-NCOI-IRES-BglII-PF4-Xba I fragment is isolated from pGEM 7 and inserted into pMM 984 (deleted from the Hind III site (9169) between the Hind III (2650) and Xba I sites ( 4342)
  • pMM 984 denoted from the Hind III site (9169) between the Hind III (2650) and Xba I sites ( 4342)
  • a plasmid containing the GMCSF and PF4 genes placed under the control of the P38 promoter of the parvovirus MVMp is thus constructed.
  • Example 7 Construction of an Autonomous Parvoviral Vector Containing the Murine B7 Gene
  • the reinjection of irradiated tumor cells transfected with the murine gene coding for the B7 protein allows the eradication of pre-existing tumors.
  • the murine B7 gene is inserted into the parvovirus MVMp in place of the genes coding for the capsid proteins VP1 and VP2.
  • the plasmid containing the murine gene B7 is obtained from the center A.Z. Jette (Vrije Universiteit te Brussel).
  • This gene is there in the form of a Hind III-XhOI fragment of 944 base pairs.
  • B7 fragment HindIII-XhoI was introduced into the HindIII and XhoI sites of the plasmid pGEM 7 ® (Promega), which contains an Xba I site adjacent to the XhoI site.
  • the plasmid pMM 984 containing the MVMp is deleted from the Hind III site (9169) present in the pBR322 part of pMM 984. (After partial digestion, the site 9169 is made blunt by the Klenow fragment of DNA polymerase).
  • the B7 gene included in a Hind III-Xba I fragment is isolated from the modified pGEM and inserted at the Hind III (2650) and Xba I (4342) sites of the MVMp in the plasmid pMM 984 deleted from the Hind III site (9169).
  • the plasmid pM984 containing the B7 gene is co- transfected with a plasmid pMM 984 containing an MVMp deleted from the right palindrome in COS cells.
  • a plasmid pMM 984 containing an MVMp deleted from the right palindrome in COS cells Three days after transfection, the cells are frozen and thawed three times and the virions are harvested and isolated on cesium chloride gra ⁇ host.
  • the isolated virions are resuspended after dialysis in PBS pH 7.2 and used to infect different cell lines.
  • Normal human fibroblasts obtained from primoculture and a line of transformed human fibroblasts are infected at a multiplicity of infection (MOI) of approximately 10 "2 .
  • the expression of the B7 protein on the surface of infected cells is measured by mmofluorescence using a Fluorescent Activated Cell Sorter (Becton Dickinson).
  • NBK 67 cells have an average intensity in FACS units greater than 100; the average is 490 and the median is 340.
  • Example 8 Construction of an autonomous parvoviral vector containing an anti bcr-abl ribozyme inserted at the Asel site (2350) of the MVMp
  • the Asel site (8316) present in the pBR322 part of pMM 984 is deleted. After partial digestion, the Asel site 8316 is made blunt by the Klenow fragment of DNA polymerase I.
  • the anti bcr-abl ribozyme consists of the sequence described on p. 601 in the article by Snyder et al .: Blood, vol. 82, n ° 2, 1993, p. 600 to 605, surrounded by 2 Asel sites.
  • Double stranded DNA containing the sequence coding for the anti bcr-abl ribozyme between two Asel sites is inserted at the Asel site (2350) of pMM 984.
  • Virions are produced by transfection of COS cells or NBK cells.
  • the sequence coding for the anti-bcr-abl ribozyme coding sequence for the transcription termination signal of bacteriophage T7 is added in 3 ′ (Sioud et al., J. Mol. Biol. (1993), 223, p. 831-835).
  • the assembly is also inserted at the Asel site (2350) of pMM 984.
  • EXAMPLE 9 Construction of an Autonomous Parvoviral Vector Containing the CAT Gene (Chloramphenicol Acetyl Transferase) in Place of the Genes Encoding Capsid Proteins
  • the fragment containing the CAT Gene is Inserted Between a Hind III Site 5 'Contiguous to ATG and an Xba I site 3 'to the Hind III site (2650) and Xba I (4342) of the plasmid pMM 984 deleted from the Hind III site (9169).
  • the production of virions is done by cotransfection of COS cells using the plasmid obtained (P38.CAT) and pMM 984 deleted from the right palindrome of MVMp.
  • the cells are frozen and thawed three times and the virions are harvested and isolated on a cesium chloride gradient.
  • the isolated virions are resuspended after dialysis to infect different cell lines.
  • FIG. 2 shows the growth curves of normal human fibroblasts (NHF) and of transformed human fibroblasts 1, 2 and 3 days after infection with P38 CAT virions (MOI ⁇ 10 "2 ).
  • FIG. 3 shows the production of the CAT protein (measured by CAT-ELISA of Boehringer) from these same cells. Despite the fact that they multiply at a good rate, normal fibroblasts produce quantities of CAT protein only at the detection limit, while transformed cells produce abundantly.
  • Figure 4 shows the CAT expression measured 2 days after infection of different normal human cell lines (in white) and transformed cells (in striped).

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Abstract

Séquence nucléotidique destinée au traitement de cellules cancéreuses ou soumises à des infections comprenant, intégré dans la séquence nucléotidique d'un virus appartenant au groupe des parvovirus autonomes, au moins une séquence effectrice susceptible d'assurer la destruction ou la normalisation desdites cellules.

Description

SÉQUENCE NUCLÉOTIDIQUE DESTINÉE AU TRAITEMENT DU CANCER
ET DES INFECTIONS Objet de l'invention
La présente invention concerne une séquence nucléo¬ tidique destinée au traitement de cellules cancéreuses ou soumises à des infections.
La présente invention concerne également le vecteur comprenant la séquence selon la présente invention, ainsi qu'une composition pharmaceutique comprenant ladite séquence et/ou ledit vecteur. L'invention s'étend également à l'utilisation de la séquence nucléotidique et/ou du vecteur selon 1'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cellules cancéreuses ou soumises à des infections. Arrière-plan technologique L'efficacité des traitements conventionnels du cancer et des infections est limitée par leur manque de sélectivité. En effet, la toxicité liée à ces traitements ne se limite pas aux cellules cibles (cellules tumorales, cellu¬ les infectées), elle affecte aussi des cellules normales d'importance vitale.
En conséquence, on a développé des systèmes de ciblage d'agents thérapeutiques qui permettent de diminuer la dose toxique administrée aux tissus normaux tout en per¬ mettant à une dose toxique efficace d'être administrée aux tissus pathologiques.
Le brevet US-4 675 382 décrit des protéines hybri¬ des clivables et constituées de fragments cytotoxiques et de ligands cytospécifiques, ainsi que leur application thérapeutique ciblée dans le traitement de désordres médicaux. •-
Des protéines qui sont hautement cytotoxiques lorsqu'elles sont introduites dans les cellules de mammifères sont produites par beaucoup d'espèces de bactéries et de plantes (fragment A de la toxine diphtérique (DT-A) , de
Pseudomonas aeruginosa, du Ricin...).
Des tentatives ont été faites pour remplacer la portion de ces protéines responsable de l'entrée cellulaire par des ligands spécifiques de tumeurs (anticorps monoclo- naux, peptides...) (Martinez et al, Cancer Surveys, 1, 374 (1982)).
Une autre stratégie employée par Maxwell (Cancer Research, 46, 4660-4664, september 1986), consiste à intro- duire l'ADN codant pour le fragment A de la toxine diphtéri¬ que, in vitro dans des cellules à l'aide de constructions comportant des éléments de régulation transcriptionnelles spécifiques de tissus agissant en cis dans le but de n'expri¬ mer la DTA que dans les cellules contenant les facteurs agissant sur ces éléments de régulation.
D'autres techniques utilisent des gènes codant pour un enzyme conférant à la cellule transfectée une sensibilité à un agent toxique ont été décrites par Moolten F. (Human Gène Therapy 1: 125-134 (1990) et Venkatesh (P.N.A.S., vol. 87, p. 8746-8750, novembre 1990).
Le gène codant pour la Thymidine kinase de l'Herpès simplex type 1 (HSV-TK) est approprié à ce type de thérapie. Certains analogues de la guanosine tels que l'iodovinyldéoxy- uridine (IVDU), l'acyclovir, le ganciclovir sont des sub- strats spécifiques pour l'HSV-TK, qui catalyse leur phos¬ phorylation en monophosphates de façon plus efficace (plus de mille fois) que les thymidine kinases des cellules de mammifères. Une phosphorylation ultérieure en triphosphates sous l'influence de kinases cellulaires convertit ces molécu- les en de puissants inhibiteurs de la synthèse d'ADN. Des doses de ganciclovir, n'affectant pas la survie in vitro de cellules HSV-TK négatives, permettent de détruire in vitro des cellules HSV-TK positives et d'éradiquer les lymphomes HSV-TK positifs in vivo chez des souris transgéniques expri¬ mant l'HSV-TK dans leurs cellules lymphoxdes.
Toutefois, pour certaines lignées cellulaires exprimant l'HSV-TK la dose d'analogues de guanosine permet- tant une cytotoxicité in vitro proche de 100% de mort cellu¬ laire induit une cytotoxicité appréciable dans des lignées cellulaires n'exprimant pas l'HSV-TK (doses entre 10 et 100 μM).
Une approche permettant d'éviter ce problème est d'utiliser des analogues de la guanosine marqués à l'aide de radio-isotopes émetteurs d'électrons AUGER tels que l'Iode 123 (demi-vie 13h21). Ces isotopes relâchent la majeure partie de leur énergie sur un parcours de quelques nanomètres. L'efficacité de tels radio-isotopes en ce qui concerne la cytotoxicité cellulaire est complètement perdue lorsqu'ils ne sont pas liés ou tout au plus à une distance de quelques nanomètres de l'ADN. S'ils sont dans le voisinage de l'ADN, une cinquantaine de désintégrations sont suffisan¬ tes pour tuer la cellule HSV TK positive. Une cytotoxicité maximale est obtenue lorsque les cellules incorporent l'ana¬ logue de la guanosine marqué à l'Iode 123 dans leur ADN à des doses inférieures à 10~10 M ce qui est largement inférieur au seuil de toxicité de cet analogue pour les cellules ne possé¬ dant pas de HSV-TK. En outre, l'Iode 123 est également émetteur d'un rayonnement γ qui peut être détecté à 1'aide d'une gamma- caméra en clinique.
Après concentration in vivo de 1*analogue marqué dans les tissus exprimant l'HSV-TK et l'élimination de l'ana- logue de la guanosine du flux sanguin et des autres tissus, il y a possibilité de détecter à l'aide d'une gammacaméra les tissus exprimant l'HSV-TK (application à la détection de métastases) .
Cette approche, comparée à l'expression du fragment A de la toxine diphtérique, a l'avantage de permettre un contrôle de l'intensité et du déroulement de l'attaque cytotoxique.
L'administration de l'analogue de la guanosine peut être moαuxee en fonction de l'évolution clinique (évolution des tissus cancéreux et toxicité infligée aux tissus nor¬ maux) .
La thérapie génique peut également utiliser des gènes générant après transcription des ARN inhibant l'expres¬ sion d'un oncogène impliqué dans l'affection tumorale.
Le concept d'utiliser des séquences antisens d'aci¬ des nucléiques pour bloquer la fonction de 1'ARN messager avec lequel elles s'hybrident s'est développé au cours de la dernière décade. L'action inhibitrice des molécules antisens sur l'expression génique dépend soit de la stabilité de l'hybride ARN antisens-ARN cible soit de la capacité de l'hybride ADN antisens-ARN cible d'induire une destruction protéique enzymatique de 1'ARN cible. De même, il a été démontré que l'ARN lui-même pouvait avoir une activité enzymatique et que des molécules d'ARN catalytiques (Ribozymes) pouvaient être modifiées pour créer des unités antisens qui par leur liaison spécifiques aux molécules d'ARN cible catalysaient leur clivage. Ainsi, Haseloff et Gerlach (Nature, 334 (1988), p.
585-591) ont fusionné la région catalytique de ribozymes "hammerhead" à 2 ARN anti-sens reconnaissant la séquence cible d'un ARN à cliver.
Plus récemment, Herschlag (Nature, vol. 344, p. 405, 1990) ont décrit certains ribozymes qui peuvent égale¬ ment cliver de façon spécifique des ADN cibles et qu'il y avait moyen de sélectionner in vitro les ribozymes mutants clivant l'ADN de façon plus efficace que l'enzyme sauvage. In vitro, l'inhibition par de l'ARN antisens des gènes E6 et E7 (codant pour les oncogènes E6 et E7 dans les cellules de cancers du col utérin associés à une infection par les papillomavirus humains HPV16, 18, 31 et 33) induit une réversion du phénotype cancéreux vers le phénotype normal dans des lignées de cancer du col utérin (Schlegel... ) . En outre, il est démontré que des ARN peuvent être sélectionnés parmi des librairies de séquences nucléotidiques pour obtenir des ARN à activité enzymatique spécifique ou des ARN utilisés comme ligands spécifiques. L'utilisation de gènes codant pour une protéine augmentant les mécanismes de défense de 1'hôte a été égale¬ ment décrite.
Dans la demande de brevet WO 90/11359, Baltimore et al. décrivent des constructions nucléotidiques recombinan¬ tes comportant des séquences régulatrices du virus HIV et des séquences codant pour des produits cytotoxiques affectant spécifiquement les cellules infectées par les virus HIV ou HTLV. La séquence virale conservée est constituée de tout ou partie de la séquence régulatrice LTR (Long Terminal Repeat) du virus. Cette séquence peut être transactivée au niveau d'une séquence promotrice TAR par les facteurs de transactivation viraux spécifiques TAT des virus HIV et TAX des virus HTLV, exprimés dans les cellules infectées par ces virus (Sodroski J. et al., Science (1985) 227, 171-173).
L'activation de la séquence promotrice permet ensuite l'expression de la séquence codant pour des produits cytotoxiques entraînant la mort des cellules infectées par le virus HIV.
Cependant de telles constructions nucléotidiques peuvent comporter des séquences de LTR, autres que la sé¬ quence TAR.
Ces séquences, telles que les éléments enhancer NF-Kappa B (Greene, Annual Rev. Immunol., 1990, 8, p. 453) sont transactivables par des activateurs cellulaires, ou telles que l'élément NRE (Négative Regulatory Elément) sont transactivables par le facteur viral NEF (Kieny, Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 3, p. 395 (1990). De tels facteurs peuvent donc activer les gènes cytotoxiques dans des cellules saines ou les désactiver dans des cellules infectées par le virus.
La demande de brevet WO 90/07936 et le document "Aids Research and Human Retroviruses" (vol. 8, n° 1, 1992, Mary Ann Liebert, Inc., Publisher) décrivent l'intégration dans des vecteurs viraux ou des plasmides des constructxons nucléotidiques comportant des séquences régulatrices trans¬ activables par des facteurs spécifiques d'une affection (telle que le SIDA) et des séquences codant pour des produits cytotoxiques affectant spécifiquement les cellules soumises à des désordres hyper-prolifératifs ou à des infections.
La demande de brevet WO91/18088 décrit l'utilisa- tion de parvovirus adénoassociés à faible efficacité de transduction (0,5 à 1,5% pour une multiplicité d'infection (Mol) de 1 à 10) qui présentent en outre l'inconvénient de ne pas être oncosélectifs et de s'intégrer dans le génome des cellules transductées. Aussi, la technique décrite dans ce document néces¬ site une modification in vitro des cellules hématopoxétiques avant d'être réinjectées après transduction au patient.
La demande de brevet WO90/05538 décrit une méthode de production de capsides vides de parvovirus autonomes pour: - la vaccination à l'aide de capsides vides;
- le diagnostic pour détecter des anticorps anti-capsides;
- 1'encapsidation de matériel génétique dans des capsides vides et l'introduction de ce matériel dans des cellules cibles. Les auteurs ici envisagent 1*encapsidation de matériel génétique hétérologue (non dérivé de parvovirus autonomes), l'exemple cité étant les vecteurs adénoassociés parvovirus. Le parvovirus décrit (B19) est un parvovirus autonome pathogène s'exprimant sélectivement dans les cellules souches hématopoxétiques. La capside vide est ensuite utilisée pour corriger des déficiences génétiques dans des cellules souches hématopoxétiques.
Le document Virology (vol. 186, nβ 1, p. 207-218) décrit un Densovirus (parvovirus n'infectant que les insectes). Ce virus n'est pas infectieux pour les cellules de mammifères et ne peut donc en aucun cas être utilisé pour la thérapie génétique du cancer ou des infections chez 1'homme.
Le document (Proc. Natl. Acad. of Science, USA (1990, vol. 87, p. 8746-8750) préconise l'utilisation de vecteurs adénoviraux pour le traitement des infections à HIV. Ces vecteurs adénoviraux contiennent encore une importante partie du génome des adénovirus et récemment, leur utilisa¬ tion en tant que vecteur de thérapie génique de la mucovisci- dose a provoqué de graves réactions inflammatoires. Les séquences régulatrices et effectrices utilisées présentent de plus les inconvénients suivants:
- la séquence LTR utilisées va de -640 à +80 et doit donc conférer une activité baεale très importante en 1'absence de tat;
- le fragment (1084 bp) devant permettre la régulation par Rev, est particulièrement court et selon les auteurs, ne confère pas de régulation par Rev. En outre, la thymidine kinase de l'HSV utilisée comme séquence effectrice confère un "bystander effect" qui risque de tuer les cellules non infectées avoisinantes.
La demande de brevet WO-A-8808450 est basée sur l'adjonction à des cellules souches humaines, après leur isolation in vitro, d'un gène à vertu thérapeutique et de leur réinjection in vivo dans le patient. Parmi les différen¬ tes méthodes d'introduction de gène hétérologue dans les cellules souches, les auteurs envisagent les vecteurs parvo- viraux, à savoir les vecteurs parvoviraux adénoassociés. De même, les demandes de brevet WO-A-9007936,
WO-A-9012087 et WO-A-9102805 décrivent des vecteurs viraux tels que des rétrovirus, des adénovirus ou les virus adéno¬ associés pour la thérapie génique.
Cependant, ces vecteurs viraux ou plasmidiques présentent un danger potentiel en s'intégrant dans les cellu¬ les hôtes d'activer des protooncogènes ou d'annihiler des gènes suppresseurs de tumeurs (anti-oncogènes) . Buts de l'invention
L'invention a pour but de fournir une séquence nucléotidique virale comportant une séquence nucléotidique susceptible de détruire ou de normaliser des cellules cancé¬ reuses ou soumises à des infections.
Un autre but de 1'invention consiste à fournir un vecteur viral qui, sans s'intégrer dans leur génome, est susceptible de s'exprimer efficacement dans 1'environnement intracellulaire desdites cellules. Eléments principaux de 1'invention
L'invention concerne une séquence nucléotidique destiné au traitement de cellules cancéreuses ou soumises à des infections, comprenant, intégré dans la séquence nucléo¬ tidique d'un virus appartenant au groupe des parvovirus auto¬ nomes, une séquence effectrice susceptible d'assurer la des- truction ou la normalisation des cellules.
On entend par le terme "traitement" une réduction ou un allégement des symptômes de l'affection, l'élimination ou l'inhibition des agents causaux, la prévention de l'infec¬ tion ou du désordre cellulaire du sujet soumis à l'affection. Le terme "infection" se rapporte à des infections de cellules par des agents viraux, bactériens ou d'autres parasites infectieux intracellulaires.
L'invention concerne tout particulièrement des agents infectieux viraux tels que le HIV-I, le HIV-II, le HIV-III, le HTLV-I, le HTLV-II, l'herpès simplex virus (HSV) , le cytomégalovirus (CMV), les papillomavirus humains (HPV) et d'autres virus similaires.
Les virus selon l'invention sont les virus apparte¬ nant au groupe des parvovirus autonomes de préférence onco- sélectifs. Ce sont de petits virus sans enveloppe dont le génome est constitué d'un ADN simple brin linéaire d'environ 5 KD. Leur faible complexité génétique les rend totalement dépendant de facteurs exogènes pour leur réplication. Ils ne se répliquent efficacement que dans l'environnement intra- cellulaire des cellules tumorales dans lesquelles ils se trouvent sous forme épisomique (J. Rommelaere, Handbook of Parvoviruses, 1990, vol. 2, p. 41-57, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida) .
Ils ne s'intègrent pas dans le génome des cellules comme les rétrovirus et ne présentent donc pas le danger potentiel d'activer des protooncogènes ou d'annihiler les gènes suppresseurs de tumeurs. Leur oncotropisme et leur caractère épisomique en font des vecteurs de choix pour la thérapie génique ciblée de tumeurs et d'infections intracel- lulaires.
Préférentiellement, le vecteur viral utilisé est le Parvovirus Hl, le Parvovirus fibrotropique du "minute virus of mice" (MVMp) ou le Parvovirus Lu III. La plupart des lignées de cellules cancéreuses humaines testées à ce jour se sont révélées permissives pour l'infection pair les parvovirus Hl et le variant fibrotropique du "minute virus of mice (MVMp). Ces virus ont des propriétés oncoprotectrices in vivo et peuvent causer la régression de tumeurs humaines en souris nues même après inoculation virale à un site distant de la tumeur. L'Hl et le MVMp sont de petits virus contenant un ADN simple brin de 5 kb bordé de 2 boucles palindromiques en épingle à cheveu. Chez ces parvovirus, deux promoteurs, P4 et P38, contrôlent respectivement l'expression de deux protéines non structurelles (NSI et NSII) et de deux protéines de capsides (VP1 et VP2). P4 contrôle NSI et NSII et P38, VP1 et VP2. NSI est un facteur de transactivation de P38 et est responsable de l'activité cytotoxique. NSI est en outre nécessaire pour la réplication virale et la restriction ou permissivité pour l'infection virale semble liée au niveau de transcription de NSI.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le vecteur viral est dépourvu des gènes codant pour les protéines de capsides (VP1 et VP2) du parvovirus. Préférentiellement, le vecteur viral est également dépourvu du promoteur P38 et des gènes codant pour les protéines non structurelles NSI et NSII du Parvovirus. De préférence, on utilise le parvovirus autonome pMM 984, décrit par Merchlinsky et al. (J. of Virology, 47, p. 227-232 (1983).
L'expression "assurant la destruction ou la norma¬ lisation des cellules" signifie que lors d'une infection ou à l'occasion d'un cancer, l'expression de la séquence effec¬ trice dans la cellule hôte permet soit de tuer celle-ci, soit de la rendre sensible à un agent exogène toxique ou soit de la rendre capable d'inhiber 1"action du cancer ou de 1'agent infectieux. Le terme "séquence effectrice" se rapporte à une séquence nucléotidique qui, lorsqu'elle s'exprime, par exem¬ ple lorsque, sous l'action de facteurs de transactivation spécifiques agissant sur une séquence régulatrice, elle code pour un polypeptide effecteur susceptible de détruire ou de normaliser -des cellules traitées.
De même, cette séquence effectrice lorsqu'elle est transcrite en un ARN, par exemple un ARN anti-sens ou un ribozyme, est susceptible de détruire ou de normaliser des cellules traitées.
Par exemple, l'on peut créer un ribozyme qui dé¬ truise spécifique le transcript ARN résultant de la fusion de l'exon 3 du gène bcr à l'exon 2 du gène abl, rencontrée dans des cellules de leucémie myéloxde chronique. Szczylik et al. (Science, 253, 562 (1991)) ont pu montrer que des ARN anti-sens anti bcr-abl inhibaient la prolifération des cellu¬ les de leucémies myéloxdes chroniques.
L'ADN codant pour ce ribozyme peut être placé au site de restriction Ase I qui se trouve dans le petit intron du génome MVMp. Lors de l'épissage des ARN messagers du MVMp, ce ribozyme sera libéré par le spliceosome dans un comparti¬ ment nucléaire riche en ARN cible.
La stabilité de tels ribozymes peut être augmentée par l'adjonction en 3' d'une séquence telle que la séquence terminatrice de transcription du bactériophage T7. Cette séquence protégera le ribozyme de la digestion par des exo- nucléaβe 3' (Sioud et al., J. Mol. Biol. (1992), 223, p. 831- 835). L'on peut augmenter la taille de l'ADN parvoviral d'environ 100 nucléotides tout en conservant encore la capa¬ cité d'encapsidation et le pouvoir infectieux des parvovirus formés. Un tel virus recombinant contenant un ribozyme a la faculté de se reproduire dans le tissu tumoral tout en le détruisant et peut réinfecter d'autres cellules tumorales, s'y développer et les tuer.
De préférence, la séquence effectrice est consti¬ tuée de plusieurs séquences nucléotidiques codantes ou non, agencées en sous-unités polycistroniques, sous le contrôle d'une seule unité promotrice.
La transfection de cellules tumorales par des séquences nucléotidiques codant pour différentes molécules biologiquement actives (cytokines, protéines membranaires intervenant dans la reconnaissance immunitaire,...) et la réinjection, de ces cellules irradiées dans des animaux por¬ teurs de tumeurs a pu dans certaines conditions expérimenta¬ les entraîner le rejet spécifique de tumeurs identiques aux cellules transfectées (Pardoll et al., Immunology Today, vol. 14, nβ 6, p. 310-316 (1993)).
Toutefois, la plupart de ces molécules, outre leur propriété d'augmenter 1'immunogénicité des tumeurs, stimulent la néovascularisation tumorale. Aussi, la séquence effectrice comprend également des séquences codant pour des molécules inhibitrices de la néoangiogénèse tumorale (Billington D.C., Drug design and discovery, vol. 8, p. 3-35 (1991)) telles que l'Interferon α, l'Interferon β ou le Platelet Factor 4 (Maione et al., Cancer Research, 51, p. 2077-2083 (1991)). Plusieurs gènes effecteurs d'une même séquence effectrice peuvent être insérés dans le même vecteur en les agençant en unités polycistroniques où les différents gènes sont reliés par des séquences nucléotidiques permettant leur expression suite à l'activation d'un seul promoteur situé en amont du premier gène effecteur. Parmi les séquences nucléo¬ tidiques possédant cette propriété, il y a notamment les I.R.E.S. (Internai Ribosome Entry Sites) (Tsukiyama-Kohara, J. of Virology, p. 1476-1488 (1992)).
L'utilisation de vecteurs parvoviraux autonomes, de préférence oncosélectifs, permet de faire synthétiser directement in vivo par les cellules tumorales des tissus cancéreux du patient, les différentes molécules favorisant le rejet des tissus cancéreux. Ceci représente un progrès énorme par rapport à la méthode décrite par Pardoll où l'on doit exciser un morceau de tumeur du patient, en faire une suspension cellulaire, la transfecter, l'irradier et la réinjecter au patient.
Avantageusement, la séquence nucléotidique effec¬ trice ou une partie de celle-ci code pour au moins un poly- peptide de fusion, comportant notamment un ligand (secrétable) , tel que l'extrémité hypervariable spécifique d'un anticorps (single chain antibody) , une cytokine ou un facteur de croissance, se liant de manière spécifique à au moins une molécule exprimée à la surface de cellules cancé¬ reuses ou soumises à des infections.
De la sorte, la fraction des cellules cibles ayant été infectées par les parvovirus autonomes recombinants, synthétiseront et sécréteront en grande quantité les polypep- tides de fusion (immunotoxines, immunocytokines, immunoenzymes, ... ) . Ces polypeptides de fusion iront se fixer principalement sur les cellules cancéreuses non infectées et ce procédé permettra d'augmenter l'effet "bystander" et l'effet à distance de la thérapie génique.
Selon une forme d'exécution préférée de l'inven¬ tion, la séquence effectrice ou une partie de la séquence effectrice, code:
- pour au moins un polypeptide ou fragment(s) de ce polypep- tide cytotoxique, préférentiellement pour le fragment A de la toxine diphtérique (DTA) ;
- pour une molécule, telle qu'une enzyme, conférant à une cellule une sensibilité à un agent toxique, ladite molécule étant préférentiellement la thymidine kinase de l'Herpès simplex virus type 1 (HSV-TK) et l'agent toxique un analo¬ gue de guanosine marqué à l'aide de radio-isotopes émet¬ teurs d'électrons Auger, tels que l'Iode 123;
- pour au moins un polypeptide ou fragment(s) de ce polypep¬ tide, augmentant la réponse immunitaire du patient; - pour au moins un polypeptide ou fragment(s) de ce polypep¬ tide, inhibant la néoangiogénèse tumorale.
Parmi les différentes protéines cytotoxiques dispo¬ nibles (DT-A, RicinA, Gelonine, Toxine de Pseudomonas aeruginosa) le choix de la DT-A est préféré. En effet, comme la majorité de la population a été vaccinée contre la toxine diphtérique, tout éventuel relargage de DT-A par les cellules mortes sera annihilé par le système immunitaire. En outre, comme la DT-A est dépourvue de site de liaison à un récepteur cellulaxre, elle ne pourra pas entrer dans d'autres cellules. La production de DT-A dans les cellules de mammifè¬ res résulte en l'inhibition de toute synthèse protéique ultérieure (par ADP ribozylation du facteur d'élongation -2) et par conséquent mène à la mort cellulaire. Comme la DTA agit de façon catalytique et non stoechiométrique, quelques molécules de DTA sont suffisantes pour tuer une cellule.
Le fragment A libéré dans les cellules infectées par HIV non seulement entraîne la mort cellulaire, mais bloque également toute synthèse protéique y compris la syn¬ thèse des protéines virales et de ce fait bloque la réinfec¬ tion des cellules voisines.
Avantageusement, la séquence effectrice peut être modifié par exemple par une mutagénèse dirigée afin d'atté- nuer la cytotoxicité de la protéine produite.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, la séquence nucléotidique comprend également au moins une séquence régulatrice transactivable par des fac¬ teurs de transactivation spécifique de l'affection traitée ou du tissu cellulaire affecté, et apte à cisactiver la séquence effectrice.
L'expression "assurant la destruction ou la norma¬ lisation des cellules" signifie que lors d'une infection ou à l'occasion d'un cancer, l'expression de la séquence effec- trice dans la cellule hôte permet soit de tuer celle-ci, soit de la rendre sensible à un agent exogène toxique ou soit de la rendre capable d'inhiber l'action du cancer ou de l'agent infectieux.
Le terme "séquence effectrice" se rapporte à une séquence nucléotidique qui,* lorsqu'elle s'exprime (par l'ac¬ tion de facteurs de transactivation spécifique sur la sé¬ quence régulatrice) , permet de détruire ou de normaliser les cellules traitées.
Selon une forme d'exécution préférée de 1'inven- tion, la séquence effectrice code soit pour une protéine cytotoxique, préférentiellement le fragment A de la toxine diphtérique (DTA); soit pour une enzyme conférant à la cel¬ lule transfectée une sensibilité à un agent toxique, 1'enzyme sera préférentiellement la thymidine kinase de l'Herpès simplex virus type 1 (HSV-TK).
Parmi les différentes protéines cytotoxiques dispo¬ nibles (DT-A, RicinA, Gelonine, Toxine de Pseudomonas aeruginosa) le choix de la DT-A semble approprié. En effet, comme la majorité de la population a été vaccinée contre la toxine diphtérique, tout éventuel relargage de DT-A par les cellules mortes sera annihilé par le système immunitaire. En outre, comme la DT-A est dépourvue de site de liaison à un récepteur cellulaire, elle ne pourra pas entrer dans d'autres cellules.
La production de DT-A dans les cellules de mammifè¬ res résulte en l'inhibition de toute synthèse protéique ultérieure (par ADP ribozylation du facteur d'élongation -2) et par conséquent mène à la mort cellulaire. Comme la DTA agit de façon catalytique et non stoechiométrique, quelques molécules de DTA sont suffisantes pour tuer une cellule.
Le fragment A libéré dans les cellules infectées par HIV non seulement entraîne la mort cellulaire, mais bloque également toute synthèse protéique y compris la syn¬ thèse des protéines virales et de ce fait bloque la réinfec¬ tion des cellules voisines.
Avantageusement, la séquence effectrice peut être modifié par exemple par une mutagénèse dirigée afin d'atté- nuer la cytotoxicité de la protéine produite.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, la séquence nucléotidique comprend également au moins une séquence régulatrice transactivable par des fac¬ teurs de transactivation spécifique de l'affection traitée ou du tissu cellulaire affecté, et apte à cisactiver la séquence effectrice.
Le terme "séquence régulatrice transactivable" se rapporte à une séquence nucléotidique qui est capable de répondre à un facteur de transactivation spécifique et d'ac- tiver en réponse la transcription de séquences situées en cis.
Selon une autre forme d'exécution de l'invention, la séquence régulatrice comporte tout ou partie de la sé¬ quence régulatrice LTR (Long terminal Repeat) des virus HIV ou HTLV comprenant la séquence TAR (TAT responsive élément). Préférentiellement, la séquence LTR est dépourvue de la séquence enhancer Kappa B transactivable par des fac¬ teurs cellulaires et/ou de la séquence NRE transactivable par le facteur viral NEF.
La suppression de ces séquences au sein de la séquence LTR réduisent de manière surprenante l'expression de la séquence nucléotidique de l'invention dans les cellules n'exprimant pas la protéine TAT sans diminuer l'expression de la séquence nucléotidique de l'invention dans les cellules exprimant la protéine TAT.
Avantageusement, la séquence nucléotidique comporte également une séquence régulatrice constituée de tout ou partie de la séquence RRE (Rev-Responsive Elément) et de la séquence adjacente CRS des virus HIV et HTLV (Rosen, P.N.A.S., vol. 85, p. 2071-2075 (1988)) et de sites adjacents d'épissages.
Les séquences TAR (situées dans le LTR des virus HIV et HTLV et transactivables par les protéines virales TAT du HIV et TAX du HTLV) et RRE (situées dans la séquence ENV des virus HIV et HTLV et répondant aux protéines REV du HIV et REX du HTLV) et de sites adjacents d'épissages sont par exemple des séquences utilisables pour le traitement des infections par ces rétrovirus (Rosen G., Editorial Review, Aids 1990, 4, 499-509).
Le grand degré de conservation de ces séquences permet de traiter les cellules infectées par les différentes souches de HIV à l'aide de la même construction nucléotidi- que.
On place également la séquence effectrice sous le contrôle de la protéine Rev de HIV, car en l'absence de Rev, tout RNA qui contient la séquence RRE est bloqué dans le spliceosome nucléaire et ne peut être exporté dans le cyto- plasme vers les ribosomes.
Selon une autre forme d'exécution préférée de l'invention, la séquence régulatrice est constituée d'au moins une séquence promoteur "enhancer", de préférence spéci¬ fique du cytomégalovirus et la séquence effectrice est trans- crite en un ribozyme clivant spécifiquement I'JARN messager codant pour la protéine α du cytomégalovirus (Griffiths P., Biochem J., 241, p. 313-324 (1987)).
Selon une autre forme d'exécution préférée de l'invention, la séquence régulatrice est constituée d'au moins un promoteur et/ou d'au moins un enhancer transactiva¬ ble dans certains tissus spécifiques, de préférence choisis parmi le groupe constitué par: - la séquence nucléotidique contrôlant l'expression du gène codant pour l'a foetoprotéine (AFP), cette région n'étant transactivée que dans les cellules d'hépatomes, de chorio- carcinome et dans de rares cellules hépatiques (Sakai M., The Journal of Biological Chemistry, vol. 260, n° 8, p. 5055-5060 et Nakabayashi H., vol. 264, n° 1, p. 266-271);
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de la protéine placentaire humaine 11 (PP11). La PP11 n'est exprimée que dans le placenta (syncytiotrophoblaste) et on ne la trouve dans aucun tissu adulte normal, mais par immunohistochimie on la détecte dans 47% des cancers du sein, dans 67% des carcinomes ovariens, et dans 38% des cancers testiculaires et gastriques étudiés (Grundmann U., DNA and Cell Biology, vol. nβ 9, n° 4, 1990, p. 243-250);
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de l'an- tigène CO - 029 qui est détectée dans des carcinomes de l'estomac, du côlon, du rectum et du pancréas mais n'est pas détecté dans les tissus normaux (Szala S., PNAS, vol. 87, p. 6833-6837 (1990));
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de l'an- tigène H23 (breast-cancer-aεsociated antigen) détecté chez l'humain dans 90% des cancers du sein (Tsarfaty I., Gène, 93, (1990) p. 313 à 318);
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression prostati¬ que de la protéine sécrétoire prostatique PSP94; dans les cancers de la prostate à un stade avancé, après prostatec- tomie, le seul tissu de l'organisme synthétisant la PSP94 est le tissu tumoral prostatique (Linard. C, Gène, 73 (1988), p. 479-487);
- la séquence nucléotidique contrôlant 1'expression de la protéine pHGRll associée au mélanome, au cancer ovarien, à 1'adénocarcinome du côlon et de la prostate; les seules cellules normales où pHGRll est exprimé, sont les cellules de la granulosa de l'ovaire (Rapp G., DNA and cell Biology, vol. 9, nβ 7, p. 479-485);
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de la protéine pHGR74, exprimée dans les testicules, la prostate, la vésicule séminale et la granulosa de l'ovaire; - ainsi que les séquences contrôlant l'expression de protéi¬ nes spécifiques de l'épithélium mammaire, de 1'épithéliu utérin;
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de la tyrosinase, exprimée dans les mélanocytes et le mélanome malin (Kwon B., PNAS, vol. 84, p. 7473-7477);
- les séquences contrôlant l'expression de l'élastase, expri¬ mée uniquement dans le pancréas exocrine (Cell, vol. 9, 435-443 (1987);
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression hypo- physaire de la prolactine (Peers B., Molecular and Cellular
Biology, sept. 1990, p. 4690-4700).
La présente invention concerne aussi un vecteur recombinant (viral ou plasmidique) comprenant la séquence ou une partie de la séquence selon l'invention. L'invention concerne également une composition pharmaceutique pour le traitement de cellules cancéreuses ou soumises à des infections comprenant au moins une séquence et/ou le vecteur selon l'invention et un véhicule pharmaceu¬ tique adéquat. Selon une forme d'exécution préférée de l'inven¬ tion, cette composition pharmaceutique comprend également un ou plusieurs agents viraux sauvages appartenant au groupe des parvovirus autonomes.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisa- tion de la composition pharmaceutique, de la séquence et/ou du vecteur selon l'invention pour la préparation d'un médica¬ ment destiné au traitement de cancers et/ou d'infections. Brève description des figures
La figure 1 représente une vue schématique de la séquence nucléotidique de l'invention.
La figure 2 représente les courbes de croissance (nombre de cellules x 10*"4) de fibroblastes humains normaux (NHF) et de fibroblastes transformés (KMST-6) en fonction du temps (jour après infection) .
La figure 3 représente l'expression de CAT (Pg CAT/10 μg d'extrait cellulaire) dans ces deux lignées cellulaires en fonction du temps (jour après infection) .
La figure 4 représente l'expression de la protéine CAT après deux jours d'infection de différentes lignées cellulaires normales (rectangle blanc) ou transformées (rectangle rayé)
(a≈fibroblastes, b≈cellules épithémiale, c=lym- phocytes T, d≈lymphocytes B, e≈Macrophages)
Description d'une forme d'exécution préférée de l'invention
La figure 1 représente une séquence nucléotidique (1) selon l'invention et la séquence polypeptxdxque (7) codée par ladite séquence nucléotidique (1).
Cette séquence nucléotidique (1) comprend intégré dans un vecteur parvoviral autonome (2) , sous le contrôle d'au moins une séquence régulatrice (4), au moins une sé- quence effectrice (3). Ladite séquence effectrice (3) est de préférence constituée de plusieurs sous-unités polycistroni- ques codantes (5,6).
Ladite séquence effectrice (3) code de préférence pour un polypeptide de fusion (7) comprenant au moins un ligand (8) et une séquence polypeptxdxque effectrice propre¬ ment dite (9) telle qu'un polypeptide cytotoxique.
Les exemples ci-après sont donnés à titre purement indicatif et permettent d'illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Exemple 1: Traitement de l'infection à H.I.V.
Les séquences virales utilisées sont d'une part la séquence LTR 5' du HIV modifié de façon à être contrôlé par la protéine TAT du HIV et à échapper au contrôle de facteurs de transactivation cellulaire, et d'autre part, la séquence RRE placée sous le contrôle de la protéine Rev du HIV et liée à la séquence CRS adjacente. La séquence effectrice placé entre ces deux séquences est constituée par le gène codant pour le fragment A de la toxine diphtérique. Ces deux séquences imposent une double sécurité à l'expression du fragment qui ne pourra se faire que dans les cellules infectées par le HIV qui produisent (même à bas bruit comme dans les infections latentes) à la fois les protéines TAT et REV. La séquence TAR (contrôlée par TAT) et la séquence RRE (REV Responsive Elément) de HIV-1 répondent aux protéines TAT et REV de HIV-1 et HIV-2 ainsi qu'aux protéines TAX et REX de HTL-V-1. Le grand degré de conservation de ces séquences permet de traiter les cellules infectées par les différentes souches de HIV à l'aide de la même construction. L'avantage du parvovirus sur les autres vecteurs de transfection est qu'il n'y a pas intégration dans le génome de la cellule de son matériel génétique, qui reste sous forme épisomiale et ne risque pas d'inactiver un gène oncosuppresseur ou d'acti- ver un protooncogène.
L'innocuité et l'efficacité d'un tel traitement devraient permettre son administration également aux patients séropositifs en phase d'infection latente asymptomatique. Le fragment A libéré dans les cellules infectées par HIV, non seulement entraîne la mort cellulaire, mais bloque également toute synthèse protéique y compris la synthèse des protéines virales et de ce fait bloque la réinfection des cellules voisines.
Procédé d'obtention de la construction vectorielle: 1. Isolation de la séquence régulatrice transactivable
- Amplification par PCR du fragment (-85, +78) du LTR de HIV-I et insertion aux sites Smal (715 Blunt) et Hind III (689) (compatible avec +78 = site Hind III) du plasmide p Bluescript SK +/-®. La séquence LTR de HIV est ainsi dépourvu des sites NF- KB mais conserve 3 sites SP1, la TATA Box et le TAR (TAT Responsive Elément). 2. Isolation et intégration de la séquence effectrice cis- activable - Amplification par PCR du fragment DTA placé entre les nucléotides (79) et (653) formation des oligomères Hind III - ATG - (79) - DTA et DTA - (653) - TAG - KPnl - Insertion du Hind III ATG - (79) - DTA - (653) TAG - KPnl-aux sites Hind III (689) et KPnl (657) du plasmide p Bluescript SK +/- LTR HIV.
- Isolation du fragment (2668 bp): KPnl (6346) - CRS - RRE - Kpnl (9014) du HIV-I.
- Insertion au site KPnl (657) du plasmide p Bluescript SK +/- LTR - DTA (insertion dans les deux orientations) .
Isolation du fragment BamH I (Bluescript 719) « BamH I (HIV 8474) ayant la bonne orientation (2865 pb) et un autre fragment mal orienté (1277 pb).
3. Intégration de la séquence effectrice et de la séquence régulatrice dans le vecteur parvoviral Digestion du vecteur pMM 984 (vecteur MVM) par NCO I (259) et Xba I (4335)
ajouter polylinker Bgl II insérer fragment BamH I - LTR - DTA - CRS - RRE - BamH I et sélectionner les clones ayant la bonne orientation.
4. Clonage du vecteur dans E. coli
Les clones ayant la bonne orientation sont sélectionnés et les plasmides isolés.
(Le pMM 984 a tendance lorsqu'il est propagé dans E. Coli de perdre 40 ou 97 paires de base dans le palindrome droit, ce qui n'est pas le cas dans Epicurian Coli sure (Stratagène®) .
5. Production de virions
Pour encapsider le génome parvoviral recombinant, un plasmide helper (soit le pMM 984 soit un pMM 984 présen¬ tant une délétion dans le palindrome droit) est cotrans- fecté avec le plasmide recombinant sélectionné dans des cellules tumorales.
Après 2 jours de culture, les surnageants (2 jours par transfection) sont récoltés. Les cellules sont congelées et décongelées et les virions récoltés et isolés sur gradient de chlorure de césium. De même, on peut aussi utiliser dans le procédé susmentionné des cellules "emballeuses" produisant de façon constitutive ou inducible VP1 et VP2. Exemple 2: Traitement du cancer du sein Procédé d'obtention de la construction vectorielle 1. Isolation de la séguence régulatrice transactivable Amplification par PCR du fragment
GAG Hind III - H23 Ag (280) ~ H23 Ag (784) - EcoR I - GAG de 584 paires de bases de la 5' flanking séquence de H23 Ag (ATG en 785) à partir de l'ADN génomique de la lignée (T47D) du cancer mammaire humain.
- Digestion par Hind III et EcoR I et insertion aux sites Hind III (689) et EcoR I (701) du plasmide p Bluescript SK +/-.
2. Isolation et intégration de la séquence effectrice cis- activable
- Amplification par PCR du fragment
GAG EcoR I - ATG Diphteria Toxin DTA (79-653) TAG -
Xba I - GAC fragment codant pour la portion toxique de la toxine diphtérique dépourvue de la séquence "hydrophobic leader signal séquence" par l'amorce GAG EcoR I ATG - DTA (79-100) et par l'amorce DTA (631 - 653) - TAG - Xba I - GAG
Digestion par EcoR I et Xba I et insertion du fragment DTA aux sites EcoR I" (701) et Xba I (731) du plasmide p Bluescript SK +/- contenant le fragment H23 Ag.
3. Intégration de la séquence effectrice et de sa séquence régulatrice dans le vecteur parvoviral:
Le site Hind III du plasmide PBR 322 dans pMM 984 est détruit en enlevant le fragment Cla I - Nhe I du PBR 322 et en rendant "blunt" les extrémités 5' protrudentes en présence du fragment de Klenow de la DNA polymérase d'E. Coli.
Le pMM 984 (Hind III PBR 322-) est alors recircularisé. - Digestion par Hind III et Xba I et insertion du frag¬ ment H23 - ATG - DTA TAG aux sites Hind III (2650) et Xba I (4339) du plasmide (dépourvu du site Hind III du PBR 322) pMM 984 en remplacement des séquences codant pour les protéines VP1 et VP2 du MVMp. On obtient donc la séquence suivante du MVMp modifié: Palindrome, Promoteur P4, NSI, NSII, promoteur P38 région promoteur enhancer H23 - ATG - DTA - TAG - sites de polydénylation du MVM, Palindrome.
4. Cotransfection avec du DNA plasmidique de parvovirus sauvage (ou virus avec palindrome 5" non-fonctionnel) pour fournir les capsides virales (VP1 et VP2) dans les cellu¬ les productrices de virions. Exemple 3: Construction vectorielle à utiliser pour le trai¬ tement et le diagnostic de cancer (cancer du sein)
1. Isolation de la séquence régulatrice transactivable L'amplification par PCR du fragment GAG Hind III - H23 Ag (280) « H23 Ag (784) - EcoR I - GAG et son insertion aux sites Hind III (689) et EcoR I (701) du plasmide p Bluescript SK +/- se fait comme précédemment.
2. Isolation et intégration de la séquence effectrice cis- activable
- Amplification par PCR du fragment GAG EcoR I - ATG - HSV-1 Thymidine kinase (59 à 1189) TGA Xba I - GAG
Insertion aux sites EcoR I (701) et Xba I (731) du plasmide p Bluescript SK +/- contenant le fragment H23 Ag. 3. Intégration de la séquence effectrice et de sa séquence régulatrice dans le vecteur parvoviral
Insertion du fragment H23 - Tk aux sites Hind III (2650) et Xba I (4339) du plasmide pMM 984.
Synthèse d'iodovinyldéoxyuridine marquée à l'iode 123 pour le traitement et la détection par gammacaméra de cellules cancéreuses exprimant l'HSV-I Tk après infection par le vecteur décrit ci-dessus (Samuel J. et al, Int. J. Appl.
Radiât. Isot., vol. 35., n° 11, p. 1049-1052 (1984)).
Exemple 4: Construction vectorielle à utiliser pour le trai- tement de l'hépatome ou du choriocarcinome
1. Isolation de la séquence régulatrice transactivable Amplification par PCR du fragment GAG Hind III - AFP enhancer (-736, +44) - EcoR I - GAG par l'amorce GAG Hind III - AFP enhancer (-736, -716) et l'amorce AFP enhancer (+24, +44) EcoR I GAG et insertion aux sites Hind III (689) et EcoR I (701) du plasmide p Bluescript SK +/-. 2. Isolation et intégration de la séquence effectrice cis- activable
Amplification par PCR du fragment GAG EcoR I - ATG - DTA (79-653) TAG - Xba I - GAG et insertion aux sites EcoR I (701) et Xba I (731) du plasmide p Bluescript SK +/- contenant l'AFP enhancer.
3. Insertion de la séquence effectrice et de sa séquence régulatrice dans le vecteur parvoviral insertion du fragment AFP enhancer ATG DTA TAG aux sites Hind III (2650) et Xba I (4339) du plasmide pMM 984 Exemple 5: Traitement de l'infection à cytomégalovirus surve¬ nant chez l« mmunodéprimés
Chez les sujets à immunité normale, l'infection virale est combattue par des lymphocytes T cytotoxiques qui reconnaissent des peptides provenant de protéines virales ayant été dégradées après synthèse endogène par les cellules infectées. Ces peptides sont reconnus en association avec les molécules du MHC classe I (Major Histocompatibility Complex). La destruction des cellules infectées empêche la propagation des virus aux autres cellules en inhibant leur réplication. Les défenses de l'organisme comprennent aussi la production intracellulaire d'interféron et la production d'anticorps spécifiques. En l'absence de médicaments antiviraux spécifi¬ ques et tenant compte de l'efficacité limitée de l'immunothé¬ rapie passive, l'on propose dans l'invention de traiter les immunodéprimés atteint d'affection virale à l'aide de parvo¬ virus modifiés en remplaçant les séquences codant pour NS-1, NS-2, P38, VP-1 et VP-2 par une séquence promoteur "enhancer" contrôlée par des facteurs de transactivation spécifiques du virus infectant. Cette séquence contrôle l'expression d'une séquence effectrice permettant aux cellules transfectées soit de résister à l'infection soit d'être éliminées.
Bien que 1'infection à cytomégalovirus soit asymp- tomatique chez les individus ayant un système immunitaire normal, elle devient une cause majeure de décès et de morbi¬ dité chez les patients à immunité soit immature (foetus, nouveau-né) soit compromise (receveurs d'allogreffes, pa¬ tients atteints du SIDA) . Les infections intra-utérines à CMV sont la seconde cause d'arriération mentale après le syndrome de down. (Griffiths and al., Biochem. J. (1987), 241, p. 313-324)
La pneumonie à CMV est la principale cause de mort après transplantation de moelle osseuse et l'infection dis- criminée à CMV est la cause majeure de morbidité et de morta¬ lité chez les greffés rénaux ou chez les patients atteints de SIDA.
Après l'infection de la cellule susceptible par le CMV, l'expression temporelle du génome du virus est étroite- ment contrôlée sous forme d'une synthèse en cascade d'ARN messager et de protéines. L'on distingue les gènes α (ou précoces immédiats), β (ou précoces retardés) et γ (ou tardifs). Les produits des gènes α sont requis par le virus pour prendre le contrôle des synthèses de la cellule hôte, les produits β contrôlent la production de virions tandis que les produits γ forment les composants de structure du virion. Les protéines α permettent la synthèse d'ARN messa¬ ger β et les protéines β permettent la réplication de l'ADN qui est suivie par la synthèse de l'ARN messager γ. Les gènes o et β sont transcrits par l'ARN polymé- rase II cellulaire. Leur expression est contrôlée par des séquences proximales par rapport au promoteur qui sont acti¬ vées en trans par une protéine structurale du virion.
Selon l'invention, ces séquences sont insérées à la suite du promoteur P4 du parvovirus et sont suivies d'une séquence codant pour un ARN ribozymial clivant spécifiquement l'ARN messager codant pour la protéine α la plus importante (Spaete and Mocarski, 1985, J. virol., 56, 135-143; Sternberg et al, 1984, J. virol., 49, 190-199). Les cellules transfec- tées par le parvovirus modifié de la sorte sont protégées de l'infection par le CMV. En effet, lors de l'infection, l'en¬ lèvement de 1'enveloppe virale donne naissance à la protéine structurale qui transactivera la séquence inclue dans le parvovirus et initiera la production de ribozymes anti RNA de la protéine α.
Exemple 6: Construction vectorielle comprenant des unités polycistroniques Vecteur parvoviral autonome contenant le gène GMCSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) et le gène PF4 (Platelet Factor 4) sous forme d'une unité bicistronique reliés par l'IRES (Internai Ribosome Entry Site) du virus de 1'hépatite C. Dans différents systèmes murins expérimentaux, la réinjection de cellules tumorales irradiées transfectées par un gène codant pour une cytokine (notamment codant pour GMCSF) permet 1'éradication de tumeurs préexistantes (Pardoll, Immunology Today, p. 310-316, vol. 14, n° 6 (1993). Cependant, certaines de ces cytokines (notamment le GMCSF) sont de puissants activateurs de la néovascularisation tumorale. Cette propriété a probablement peu d'importance lorsque les cellules irradiées sont injectées loin des sites tumoraux. Mais, lors de l'utilisation de vecteurs capables de faire exprimer spécifiquement la cytokine par le tissu tumoral, cet effet sur la néovascularisation peut être dommageable. Aussi, le vecteur parvoviral autonome selon 1'invention comporte à la fois des séquences codant pour le GMCSF et pour PF 4 (qui est un puissant inhibiteur de la néovascularisation tumorale).
Par PCR, on isole le gène codant pour le GMCSF en lui adjoignant en 5' un site Hind III et en 3' un site NCO I (plasmide GMCSF® du British Technology Group), on modifie le pGEM 7® (Promega) en introduisant au site Smal, un site NCO I et au site EcoR I, un site BglII. On insère le fragment Hind III-GMCSF-NcoI dans le plasmide pGEM 7 modifié.
On isole par PCR un fragment englobant la séquence comprise entre les nucléotides 101 et 332 de la région non traduite 5' du virus de l'hépatite C. (Tsukiyama-Kohara, Journal of Virology, 1992, 1476-1483). Ce fragment comprend un site NCO I en 5' et un site BglII en 3' englobant l'IRES (101-332). On insère aux sites NCO I et BglII du pGEM 7 modifié contenant le GMCSF. On isole par PCR le fragment contenant le gène codant pour le PF4 humain (Barone, J. Biol. Chem., 2.63/. 8710-8715 (1988)).
Ce fragment comprend un site BglII en 5' et un site Xba I en 3' englobant le gène PF4. On insère ce fragment entre les sites BglII et
Xba I du pGEM 7 modifié contenant le GMCSF et l'IRES.
On isole du pGEM 7 le fragment Hind III-GMCSF-NCOI- IRES-BglII-PF4-Xba I et on insère dans le pMM 984 (délété du site Hind III (9169) entre les sites Hind III (2650) et Xba I (4342). On construit ainsi un plasmide contenant les gènes GMCSF et PF4 placé sous le contrôle du promoteur P38 du parvovirus MVMp.
Exemple 7: Construction d'un vecteur parvoviral autonome contenant le gène murin B7 Dans différents systèmes murins expérimentaux, la réinjection de cellules tumorales irradiées transfectées par le gène murin codant pour la protéine B7 permet 1'éradication de tumeurs pré-existantes. On insère le gène murin B7 dans le parvovirus MVMp à la place des gènes codant pour les protéines de capsides VP1 et VP2.
Le plasmide contenant le gène murin B7 est obtenu du centre A.Z. Jette (Vrije Universiteit te Brussel).
Ce gène s'y trouve sous la forme d'un fragment Hind III-XhOI de 944 paires de bases. Le fragment B7 (Hind III-XhOI) est introduit dans les sites Hind III et XhOI du plasmide pGEM 7® (Promega) , qui contient un site Xba I adjacent au site XhOI.
Par ailleurs, le plasmide pMM 984 contenant le MVMp est délété du site Hind III (9169) présent dans la partie pBR322 du pMM 984. (Après digestion partielle, le site 9169 est rendu blunt par le fragment de Klenow de la DNA polymerase) .
Le gène B7 compris dans un fragment Hind III-Xba I est isolé du pGEM modifié et inséré aux sites Hind III (2650) et Xba I (4342) du MVMp dans le plasmide pMM 984 délété du site Hind III (9169).
Pour produire les virions recombinants contenant le gène B7, le plasmide pM984 contenant le gène B7 est co- transfeσté avec un plasmide pMM 984 contenant un MVMp délété du palindrome droit dans des cellules COS. Trois jours après la transfection, les cellules sont congelées et décongelées trois fois et les virions sont récoltés et isolés sur gra¬ dient de chlorure de césium.
Les virions isolés sont resuspendus après dialyse dans du PBS pH 7,2 et utilisés pour infecter différentes lignées cellulaires.
Des fibroblastes humains normaux (NHF) obtenus de primoculture et une lignée de fibroblastes humains transfor¬ més sont infectés à une multiplicité d'infection (M.O.I.) d'environ 10"2.
L'expression de la protéine B7 à la surface des cellules infectées est mesurée par mmunofluorescence à l'aide d'un Fluorescent Activated Cell Sorter (Becton Dickinson) .
Les résultats obtenus sur 10.000 cellules mesurées sont les suivants :
Figure imgf000029_0001
Le tableau I ci-dessus montre que dans les cellules
NBK 67 cellules possèdent une intensité moyenne en unités FACS supérieure à 100; la moyenne est de 490 et la médiane de 340.
Dans les cellules NHF, toutes les cellules possè- dent une intensité moyenne en unités FACS inférieure à 10. Exemple 8: Construction d'un vecteur parvoviral autonome contenant un ribozyme anti bcr-abl inséré au site Asel (2350) du MVMp
- On délète le site Asel (8316) présent dans la partie pBR322 du pMM 984. Après digestion partielle, le site Asel 8316 est rendu blunt par le fragment de Klenow de la DNA polymé- rase I.
- On synthétise (DNA Synthétiser Applied Biosystems) de l'ADN double brin correspondant à un ribozyme anti bcr-abl. Cet ADN synthétique double brin présente, de part et d'autre, des extrémités protubérantes correspondant au site de restriction Asel.
Le ribozyme anti bcr-abl est constitué de la séquence décrite p. 601 dans l'article de Snyder et al.: Blood, vol. 82, n° 2, 1993, p. 600 à 605, entourée de 2 sites Asel.
L'ADN double brin contenant la séquence codant pour le ribozyme anti bcr-abl entre deux sites Asel est insérée au site Asel (2350) du pMM 984.
Après transformation par électroporation des bacté- ries Epicurian Coli Sure® (Stratagène), les clones positifs (isolés par hybridation avec une sonde radioactive spécifique de la séquence du ribozyme) sont séquences et les clones possédant un ribozyme dans la bonne orientation sont isolés. La production de virions se fait par transfection de cellules COS ou de cellules NBK.
Afin de stabiliser le ribozyme in vivo, l'on ajoute en 3' à la séquence codant pour le ribozyme anti bcr-abl, la séquence codant pour le signal de terminaison de transcrip¬ tion du bactériophage T7 (Sioud et al., J. Mol. Biol. (1993), 223, p. 831-835). L'ensemble est également inséré au site Asel (2350) du pMM 984.
Exemple 9: Construction d'un vecteur parvoviral autonome contenant le gène CAT (chloramphénicol acétyl transférase) en place des gènes codant pour les protéines de capsides On insère le fragment contenant le gène CAT entre un site Hind III en 5' contigu à l'ATG et un site Xba I en 3' au site Hind III (2650) et Xba I (4342) du plasmide pMM 984 délété du site Hind III (9169). La production de virions se fait par cotransfection des cellules COS à l'aide du plasmide obtenu (P38.CAT) et du pMM 984 délété du palindrome droit du MVMp.
Trois jours après la transfection, les cellules sont congelées et décongelées trois fois et les virions sont récoltés et isolés sur gradient de chlorure de césium. Les virions isolés sont resuspendus après dialyse pour infecter différentes lignées cellulaires.
La figure 2 montre les courbes de croissance de fibroblastes humains normaux (NHF) et de fibroblastes humains transformés 1, 2 et 3 jours après infection par des virions P38 CAT (MOI < 10"2).
La figure 3 montre la production de la protéine CAT (mesurée par CAT-ELISA de Boehringer) de ces mêmes cellules. Malgré le fait qu'ils se multiplient à un bon rythme, les fibroblastes normaux ne produisent des quantités de protéine CAT qu'à la limite de détection, tandis que les cellules transformées en produisent abondamment.
La figure 4 montre l'expression CAT mesurée 2 jours après infection de différentes lignées de cellules humaines normales (en blanc) et de cellules transformées (en rayé).
Il en ressort qu'aucune cellule normale ne dépasse le 10 pg/10 microgramme de protéine d'extrait cellulaire.
A part les lymphomes B, toutes les cellules trans- formées testées expriment à des degrés divers des quantités importantes de protéine CAT

Claims

REVENDICATIONS. 1-. Séquence nucléotidique (1) destinée au traite¬ ment de cellules cancéreuses ou soumises à des infections, caractérisée en ce qu'elle comprend, intégré dans la séquence nucléotidique d'un virus (2) appartenant au groupe des parvo¬ virus autonomes, au moins une séquence nucléotidique effec¬ trice (3) susceptible d'assurer la destruction ou la normali¬ sation desdites cellules.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 caractérisée en ce que le virus appartient au groupe des parvovirus autonomes oncosélectifs.
3. Séquence nucléotidique selon la revendication 2 caractérisée en ce que le virus est choisi parmi le groupe constitué par le parvovirus Hl, le parvovirus variant fibro- tropique du "Minute virus of Mxce" (MVMp) et le parvovirus Lu III.
4. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la séquence nucléotidique du virus est dépourvue des séquences nucléoti- diques codant pour les protéines de capsides VPl et VP2 du parvovirus.
5. Séquence nucléotidique selon la revendication 4, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique du virus est également dépourvue de la séquence nucléotidique du promoteur P38 et des séquences nucléotidiques codant pour les protéines non structurelles NSI et NSII du parvovirus.
6. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la séquence effectrice (3) comprend plusieurs séquences nucléo- tidiques codantes (5,6) et/ou non codantes, agencées en sous- unités polycistroniques sous le contrôle d'une seule unité promotrice.
7. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 caractérisée en ce que la séquence effectrice (3) comprend entre les séquences nucléotidiques codantes (5,6) au moins une séquence nucléotidique IRES.
8. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la séquence nucléotidique codante effectrice (3) code pour au moins un polypeptide de fusion (7) comportant au moins un ligand (8), de préférence choisi parmi le groupe constitué par l'extrémité hypervariable spécifique d'un anticorps, une cytokine ou un facteur de croissance, ledit ligand (8) étant susceptible de se lier de manière spécifique à au moins une molécule exprimée à la surface des cellules cancéreuses ou soumises à des infections.
9. Séquence nucléotidique selon 1'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la séquence nucléotidique effectrice (3) comprend au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par les séquences nucléotidiques:
- codant pour un polypeptide cytotoxique ou au moins un fragment de ce polypeptide, de préférence le fragment A de la toxine diphtérique (DTA) ,
- codant pour une molécule conférant à la cellule transfeσtée une sensibilité à un agent toxique, de préférence la molé¬ cule étant la thymidine kinaεe de l'Herpès simplex virus type 1 (HSV-TK) et l'agent toxique étant un analogue de guanosine marqué à l'aide des radioisotopes émetteurs d'électrons Auger tels l'Iode 123,
- codant pour au moins un polypeptide ou un fragment de ce polypeptide, augmentant la réponse immunitaire du patient, - codant pour au moins un polypeptide ou un fragment de ce polypeptide, inhibant la néoangiogénèse tumorale, de pré¬ férence le polypeptide est choisi parmi le groupe constitué par l'interféron α, l'interféron β et/ou le platelet factor 4.
10. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que la séquence nucléotidique effectrice (3) comprend au moins une séquence nucléotidique pouvant être transcrite en un RNA, de préfé¬ rence un RNA anti-sens ou un ribozyme susceptible de détruire ou de normaliser des cellules traitées.
11. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend également au moins une séquence nucléotidique régulatrice (4) transactivable par des facteurs de trans¬ activation spécifiques de l'affection traitée ou du tissu cellulaire affecté et apte à cisactiver la séquence effec¬ trice (3)
12. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la séquence nucléotidique régulatrice (4) comporte tout ou une partie de la séquence nucléotidique régulatrice LTR des virus HIV comprenant la séquence TAR.
13. Séquence nucléotidique selon la revendication
12 caractérisée en ce que la séquence nucléotidique LTR est dépourvue de la séquence nucléotidique enhancer NF-Kappa B transactivable par des facteurs cellulaires et/ou de la séquence nucléotidique NRE transactivable par le facteur viral NEF.
14. Séquence nucléotidique selon les revendications 12 ou 13 caractérisée en ce que la séquence nucléotidique comporte en outre une seconde séquence nucléotidique régula¬ trice constituée de tout ou partie de la séquence nucléotidi- que RRE et de la séquence nucléotidique CRS des virus HIV et des sites adjacents d'épissages.
15. Séquence nucléotidique selon la revendication 11, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique régula¬ trice est constituée d'une séquence nucléotidique promoteur "enhancer" spécifique du cytomégalovirus et que la séquence effectrice est transcrite en un ribozyme clivant spécifique¬ ment I'JARN messager codant pour la protéine α du cytomégalo¬ virus.
16. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 caractérisée en ce que la séquence nucléotidique régula¬ trice comporte au moins un promoteurs et/ou au moins un enhancer transactivable dans certains tissus spécifiques et choisi(s) parmi le groupe constitué par:
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression du gène codant pour l'a foetoprotéine (AFP),
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de la protéine placentaire humaine 11 (PP11),
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de l'antigène CO - 029,
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de l'an¬ tigène H23,
- la séquence nucléotidique contrôlant 1'expression prostati- que de la protéine sécrétoire prostatique PSP94,
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de la protéine pHGRll associée au mélanome, au cancer ovarien, à 1'adénocarcinome du côlon et de la prostate,
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de la protéine pHGR74, exprimée dans les testicules, la prostate, la vésicule séminale et la granulosa de l'ovaire,
- les séquences contrôlant l'expression de protéines spécifi¬ ques de l'épithélium mammaire, de l'épithélium utérin,
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression de la tyrosinase, exprimée dans les mélanocytes et le mélanome malin,
- les séquences contrôlant l'expression de l'élastase, expri¬ mée uniquement dans le pancréas exocrine,
- la séquence nucléotidique contrôlant l'expression hypo- physaire de la prolactine et/ou un mélange d'entre elles.
17. Vecteur recombinant comprenant la séquence ou une partie de la séquence selon 1'une quelconque des revendi¬ cations précédentes 1 à 16.
18. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 et/ou le vecteur selon la revendication 17 et un véhicule pharmaceuti¬ que adéquat.
19. Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 12 caractérisée en ce qu'elle comprend également un ou plusieurs agents viraux sauvages appartenant au groupe des parvovirus autonomes
20. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cancers ou d'infections.
21. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 et/ou d'un vecteur selon la revendication 17 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cancers ou d'infections.
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