WO1994013792A1

WO1994013792A1 - NOVEL ACID- AND HEAT-RESISTANT α-AMYLASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND METHOD OF LIQUEFYING STARCH BY USING THE SAME

Info

Publication number: WO1994013792A1
Application number: PCT/JP1993/001791
Authority: WO
Inventors: Yoshiyuki Takasaki
Original assignee: Yoshiyuki Takasaki
Priority date: 1992-12-09
Filing date: 1993-12-09
Publication date: 1994-06-23
Also published as: EP0644260A4; EP0644260A1; AU5659094A

Description

明細書新規な耐酸 · 耐熱性 α —アミラーゼ、その製造法及び該酵素を用いる澱粉の液化法技術分野

本発明は、耐熱性と耐酸性に優れた新規な α —アミラーゼに関する。詳しくは ΡΗ4. 0〜5. 5 の酸性下、かつ 90〜： 110 て以上の高温でトウモロコシ澱粉を液化できる耐酸性と耐熱性に優れた新規な α—アミラーゼ、その製造法及び該酵素を用いる澱粉の分解法に関するものである。

背景技術

澱粉からブドウ糖などのォリゴ糖の製造において、澱粉は、先ず、バシルス属細菌の生産する液化酵素（σ —アミラーゼ）により液化され、次いで、ァスペルギルス属又はリゾープス属糸状菌の生産するダルコアミラーゼにより糖化することにより製造されている。澱粉の中でも、馬鈴薯澱粉や甘薯澱粉などの地下澱粉は、比較的容易に液化することができるが、現在、主要な原料であるトウモトコシ澱粉は、液化が困難であり、二段液化法（先ず、 135て程度の高温で短時間反応して部分的に液化させるとともに、澱粉を膨潤させ、次いで、 or —アミラーゼを再添加して、約 90てで液化を進行させる方法）と、現在、主流の方になつている Baci l lus s tear o thermoph i 1 us K. Ogasawara, A . I man i sh i , T . I semura , J . B i ochem . , D7 , 65-75 (1970) 、遠藤滋俊，発酵工学雑誌， 37, 353, 356 (1959) 〕， Baci l lus 11 chen l f orm i s 〖 F, J . Morganり、 J . Ap 1 id Bacteriolog .. 50, 107- 114 (1981) , R. L. Antrimら、 Starch, 43, 355 (1991)〕あるいは Baci 1 lus subtilis (特公昭 58-34117)などのバシルス属細菌の生産する耐熱性 α—アミラーゼを用い、ジュット · クッカー（Jet cooker)と呼ばれる装置で、 pH 6 〜6. 5、 103〜110 'Cの温度で噴射してのち（約 5分間滞留）、次いで、 90〜95。C で 1. 5 〜 2時間保持して液化を進行させる方法により行われている。

しかるに、これまで知られている耐熱性 —アミラーゼの殆どは最適 PHが 6 〜 9 にあり、耐酸性に劣るため、澱粉液化時の pHは、これまで、通常、 6 〜 6. 5 で行われてきた。一方、ダルコースの製造において、液化澱粉の糖化に使用されるァスペルギルス ' 二ガーのダルコアミラーゼの最適 pHは 4. 5付近、最適温度は 60'Cにあるため、澱粉を、 PH 6〜6. 5で液化した後、酸を添加して、 PHを 4. 5付近まで低下させ、糖化反応を行うという煩雑な方法が採られている。

また、 PH 6以上の液化では、アルカリ異性化により、生成したデキストリンの還元性末端がフラクトースに異性化され、このため、ダルコアミラーゼで糖化したとき、還元性末端側のグルコース 2残基がマルチュロース（グルコースとフラクト一スが -1, 4- 結合したもの）として残存することになり、ダルコ —ス収量の低下をもたらしていた（J. K.Shetty, W.G.Al len, Cereal Foods World, 33, 929 (1988) _c

以上の理由から、 PH 6以下の酸性下で澱粉を液化する研究が多くの研究者により行われてきた。例えば、後藤京二らは、 35 % トウモロコシ澱粉下、 pH6. 5 で 105てで作用する一ァミラーゼ生産株 Baci】 lus 1 ^1^111 1~^ 51卩012196株をニトロソグァ二ジンで処理することにより、 PH5. 5、 105 てでも作用する耐酸性 —アミラーゼ生産変異株を得たと報告している（日本農芸化学昭和 61年度大会要旨集 653 頁）〕。また、 J.F.Shettyらは、最適 PHは 6.5にある力く、マルチュロースの生成を抑制できる PH5.8 においても、トウモロコシ澱粉を液化できる Bacillus 1 ichenif ormis L- 170の ατ—アミラーゼ（Taka-Therm II) こついて報告している CCereal Foods World, 33, 929 (1988) 〕。また、 R. Antrimらも最適 pH力く 5. 5 〜6. 0 にある Baci llus licheniformisの or—ァミラーゼを用い、 pH5.5での澱粉液化について報告している（Starch, 43, 355 (1991) 〕。 Nielsenらは、 Thermoanaerobacter 0 ¾産する耐熱性サイクロデキストリン合成酵素（サイクロデキストリン · ダルカノトランスフェラ一ゼ）、 PH4. 5、 105 てでトウモロコシ澱粉を液化できると報告している〔Food Technology, January, 102 (1991)〕。また、表 1 に示しているように、ある種のクロストリジゥム属菌も耐酸性の α—ァミ一ゼを生産することが知られている（特開昭 61- 115491、特開昭 61- 185185) が、この酵素は熱安定性に劣つている。

以上のように、これまで酸性下で澱粉を液化するための種々の試みが行われてきている力現在までに発見されている o — ァミラーゼは耐酸性と耐熱性が十分でなく、ジェットクカーを用い、トウモロコシ澱粉が液化できる温度（103〜105 X ) で、かつ PH 5以下の酸性下で、商業的にトウモロコシ澱粉を液化することはできなかった。

発明の開示

本発明者らは、ダルコアミラ一ゼによる液化澱粉の糖化と同じ PH領域で、トウモロコシ澱粉を液化できる耐酸 ' 耐熱性の " —アミラーゼを、広く自然界から検索してきた。その結果、ノシルス属の 1 菌株が最適 PH約 5 ( 1 %の可溶性澱粉の下、 80 'C で 30分反応のとき PH4. 7 〜5. 3 ) 、最適温度 90 'C ( 1 %可溶性澱粉の下で 10分反応。 5mM の塩化カルシュゥムの存在下では、最適温度は約 10(TC )にあり、 30〜35%のトウモロコシ澱粉の下、 _PH4. 0 〜5. 5、好ましくは 4. 5 〜5. 0 の酸性下、かつ 90〜110 て、好ましくは 105〜110 °Cの高温でトウモロコシ澱粉を液化できる耐酸性と耐熱性に優れた新規な —アミラーゼを菌体外に生産することを見出して本発明に到達した。

即ち、本発明の目的は、 ΡΗ4. 0 〜5. 5 の酸性下、かつ 90〜； 110 て以上の高温で、トウモロコシ澱粉を液化できる新規な σ —ァミラ一ゼを提供するものである。

本発明の他の目的は、耐酸 · 耐熱性 or—ァミラーゼ生産能を有するノシルス · リケニフォルミスを培養して、該》—ァミラ —ゼを生産し、これを採取するバシルス属耐酸 ' 耐熱性（ - ァミラーゼの製造方法を提供することにある。

更に、本発明の他の目的は、この酵素を用いて澱粉を液化する方法を提供することにある。

本発明の耐酸 · 耐熱性 o —ァミラ—ゼは、例えばバシルス属に属する菌株を培養することにより得られる。

本発明の耐酸 · 耐熱性 o —アミラーゼの理化学的性質は下記に示す通りである。

a) 作用及び基質特異性：殺粉の or - 1 , 4- ダルコシド結合をェンド型で分解し、デキストリン化する。このため、澱粉の粘度は急激に低下し液化する。反応初期には G ₅ (グルコース 5個からなるマルトペンタオース）と G ₆ (グルコース 6個からなるマルトへキサオース）などを生成する力、'、最終的には、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースマルトペンタォ一ス、マルトへキサオースなど一連の還元性ォリゴ糖を生成する。本酵素はアミロぺクチン又はその派生物の a -1,6- ダルコシド結合を加水分解することはできない。

b) 作用 pH及び最適 pH ：本酵素は pH3. 5 〜10の広い範囲に作用する。表 3 (後記する実施例 2 ) に示すように、 5mM 酢酸緩衝液 1 %可溶性澱粉の下で、 80'Cで 30分間反応したとき、最適作用 pHは 4. 7 〜 5. 3 にあり、 PH5. 5以下の酸性下においてもよく作用する（第 1 図参照、一〇_酢酸緩衝液、一秦ーリン酸緩衝液）。また、後記する実施例 5 から明らかなように、実質的な澱粉液化条件である 30%の澱粉下、かつ 5mM の CaCl₂ の存在下で、一次液化を 105'Cで 5分、二次液化を 95°Cで 0. 5 〜 6 時間行ったときの最適 PHは約 5 に認められる（第 4図参照、一口一 pH5.25、 —■— H5. 0、一〇一 pH4.75、ー秦一 pH4. 5：)。 pH4.5 前後においてもよく作用し、トウモロコシ澱粉を完全に液化できる。

c) 作用温度及び最適温度：本酵素は約 120'Cまで作用する。表 4 (後記する実施例 3 ) に見られるように、 1 %可溶性澱粉を基質とし、 10mM酢酸緩衝液（PH5.5) で 10分間反応させたときの最適温度は約 90°Cに認められる力（第 2図参照、一〇一）、 5mM の CaCl₂ の存在下では約 100 'Cに認められた（第 2図参照. 一一）。実用的な澱粉液化条件である 30%の澱粉下、かつ力ルシゥムイオンの存在下では、 pH 4 〜5.5、好ましくは 4 .3〜 5 . 温度 90〜： 120 て、好ましくは 90〜： 105 てで澱粉を液化することができる（表 6 ) (図 5参照、一画一 105。C、一ロー 100。C、 ——•——95て、 ——〇—— ΙΟΟΐ ) 。

d) PH安定性： 50て、 1 時間の処理で、 PH約 5 〜10において安定である。 PH約 4. 5 〜11で 80%以上の活性が保持される。

e) 熱安定性： 5mM 酢酸緩衝液（pH5.5) の下、 60〜： 100 の温度で 10分間加熱したとき、 90'Cまで失活が認められない（第 3 図参照、一〇一）。加熱した後の残存活性を表 5(実施例 4 ) に示したように、 100 てで、 10分間の加熱で約 50%の失活が認められる力、'、基質及び CaCl₂ の存在下で安定化される。例えば、 5mM の CaCl₂ の存在下では 100てで 10分加熱しても失活が認められず（第 3図参照、一き一）、また 30分加熱後も殆ど失活が認められない。澱粉の液化条件である 30〜35%の鏺粉下、かつ CaCl_z の存在下では、 100 てで 2時間反応させても、活性の低下は殆ど認められない（第 5図参照）。

f) 分子量：セフアデックス G- 75を用いたゲル濾過法により測定した分子量は約 9, 000 である。本酵素はアミコン社製造の分子量 1 万以上を阻止する限外濾過膜（YM- 10) を通過し、分子量は 3千以下を阻止する限外濾過膜（YM-3)で阻止される。

g) 安定化： Ca^{z +}、 Sr²% Ba^{2 +}、 Na⁺ などの存在下で熱失活から保護される。 h) 胆害剤： Zn^{z +}、 Hg^{z +}、 Ag^zヽ Cu^{2 +} , Fe^

Al ^{3 +} などにより阻害される。 i) 精製法：培養液上澄から.. 80%硫安沈殿、 DEAE—セファロ一スカラムクロマトグラフィ一とセフアデックス G- 75カラムクロマトグラフィーなどにより電気泳動的に均一まで精製することができる _u

本発明の o —ァミラーゼの酵素活性は次のようにして測定した。 (a) ヨウ素法（糊精化力）： 0.1M酢酸緩衝液に溶解した 1 %可溶性澱粉液（PH5.0)0. に該酵素溶液の適量を加え、蒸溜水で全量 1.0 とし、 90'Cで反応させる。 15分間反応後、ヨウ素溶液〔ヨウ素液（0.2 g I_z十 2g KI ) 2.5 と 0.1M HCllO を 100 としたもの〕 5 を加えて反応を停止させると共に、ヨウ素呈色し、 15分放置後、 660nm で比色する。この条件で、 1 分間に 1 %の青色を褪色する酵素量を 1 単位とする。

(b) 粘度法（糊精化力）： JIS-7001- 1990 に準じて行った。すなわち、ポテト澱粉 lgを含む 0.1M酢酸緩衝液（pH5.0) 10 に、酵素液を 1 加え、 65°Cで反応する。粘度比較液として、シリコーン油（ジメチルポリシロキサン）を用い、 15分間で同じ粘度とする酵素量を 1 単位とする。

(c) 還元糖定量法（糖化力）： 0.1M酢酸緩衝液に溶解した 1 % 可溶性澱粉液（PH5.0) 0.5 に該酵素水溶液の適量を加え、蒸溜水で全量 1.0/ ^とし、 90てで反応させ、生成した還元糖をソモギー ' ネルソン法により定量する。この条件で 1 分間に 1 マイクロモルのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を 1 単位とする。

以上の本発明の α—アミラーゼの酵素的性質について、公知の —アミラーゼのと比較したものを表 1 及び表 2 に示す。

1

各種耐熱性 o- アミラーゼの比較（その 1)

測定法： a)ゲル濾過法， b)沈降法， c)SDS アクリルアミド電気泳動法表 2

各種耐熱性 or—アミラーゼの比較（その 2)

測定法： c)SDS アクリルアミド電気泳動法、 d)分子篩法表 1 及び表 2 から明らかなように、本発明の酵素の特徴の 1 つは、公知の一アミラーゼよりも耐酸性と耐熱性に優れていることである。本発明の酵素は実用的な殺粉濃度である 30 35 %の殺粉濃度の下、かつカルシウムイオンの存在下では、 PH約 5 の酸性下で最適温度は 95 100 てにあり、また、 Ca^{2 +}の存在下では、 100 てで 10分加熱しても活性の低下が殆ど認められない（表 5 ) (第 3図）。 pH4. 5 5.25の酸性下で、 90 95又は 100 てで 2時間反応後も活性の低下が殆ど認められない（表 7 ) (第 5図）。従って、本発明の酵素を使用すれば、トウモロコシ澱粉の液化に必要な、 100 〜110 'Cの高温下の液化を、 PH 4 〜 5 の酸性下で行うことができる。これに対し、これまでに知られている or—アミラーゼの殆どは、 PH 6 〜 7 では比較的安定であるが、 PH 6以下の酸性側で不安定であり、 103〜110 ての温度では、 PH5.5以下でトウモロコシ澱粉を液化することは実質上できなかった。

本発明の酵素のもう 1 つ 1J の大きな特徴はこれまで知られている or—アミラーゼに比べ、分 o 子量が極めて小さいことである。すなわち、表 1 及び表 2から明らかなように、これまでに報告されている or—アミラーゼの分子量は 2 万〜 7 万にあるのに対し、本発明の酵素は、分子量 3000以下を通過させる限外濾過膜 (Amicon 社製造、 YM-3) で胆止されたが、分子量 1 万以下を通過させる限外濾過膜（Amicon 社製造、 YM- 10)を通過した。セァデックス（Sephadex)G-75を用い、また、標準タンパク質としてリボヌクレアーゼ（分子量 13, 700)、キモトリブシン（分子量 35, 000)、オボアルブミン（分子量 45, 000)、血清アルブミン (分子量 67, 000) を用い、ゲル濾過法により推定した本酵素の分子量は約 9000ダルトンであった。すなわち、本発明の酵素はこれまでに知られていない極めて小さい分子量の酵素であるといえる。このように分子量が極めて小さいこと力、本発明の酵素の耐酸性と耐熱性に寄与しているものと考えられる。

更に、本発明の酵素を用いることにより、トウモロコシ澱粉を PH5 以下で液化することができ、トウモロコシ澱粉に舍まれるタンパク質などの不純物がデキストリンときれいに分離できるようになり、極めて濾過性が優れた澱粉液化物（デキストリン）を得ることができることにある。また、得られたデキストリンは極めて老化しにくいものである。このような優れたデキストリンは、本発明の耐酸性かつ耐熱性の酵素を用いることにより初めて得られたものである。本発明の一アミラーゼの酵素作用様式が、従来の o —アミラーゼとは微妙に異なっているいることによるものと考えられる。

耐酸 · 耐熱性 α —ァミラーゼ生産菌 Β. 1 ichemiformis は、宮崎県宫崎郡清武町の畑地、深さ約 5 cmの土壌より分離した。すなわち、該土壌の少量を殺菌水に懸濁し、上澄を、可溶性澱粉 2%、ポリペプトン 1%、 K₂HP0₄ 0.3%. MgS0₄ · 7H ₂0 0.1 %、寒天 2.5%からなる組成の plate培地に塗布し、 30てで生育してきた約 8000株の細菌の中から本菌を選択した。

その菌学的的性質は下記の通りである。なお本菌は工業技術院生命工学工業技術研究所に微ェ研菌寄第 13286号（FERM P- 13286)として寄託され、後にブタペスト条約による、同所国際受託番号 FERM BP- 4480として寄託がなされている。

(1) 形態：桿菌

(2) グラム染色性：十

(3) 運動性：十

(4) 芽胞：

胞子囊非膨出

形：楕円形

位置中！/_〜亜 11；

- I一

(5) カタラーゼ：

(6) 嫌気下での生育

(7) V- P反応： ÷ (8) V-Pブロスの pH: 5.3

(9) グルコースからの酸の産生： +

(10)グルコースよりガスの生成：一

(11)ゼラチンの液化：十

(12)殺粉の分解： +

(13)クェン酸の利用： +

(14)プロピオン酸塩の利用： +

(15)卵黄反応：一

(16)硝酸塩の還元：十 - Ε

2

(17) PH6. 8 での生育（二ュトリエントブロス）

(18) PH5. 7 での生育：十

(19) 5 %NaCl存在下での生育：十

(20) 7 %NaCl存在下での生育： +

(21) 10 °Cでの生育： ―

(22) 30 'Cでの生育：十

(23) 55 °Cでの生育： +

(24) 65 °Cでの生育： ―

+は "する " または陽性を示し、は "しない " または陰性を示す。

以上の菌学的性質ふこつヽて、 Bergey ' s Mannual of Determin ative Bactgeriology,第 7版及び第 8版を参照し、本菌をバシルス · リケニフォルミス (Baci l lus 1 icheni f ormis)に近縁の微生物と同定し、本菌をバシルス · リケニフォルミス a Baci 1 lus 1 icheni f ormis a ) と命名した。

ノシルス · リケニフォルミスは、表 1に示すように、最適温度が 70てにある、比較的熱に安定な —アミラーゼと最適温度が 90てにある熱に安定な —アミラーゼを生産することが知られているが、最適温度が 90てにあるァミラ一ゼの最適 pHはマ〜 9 にあって、本発明の α—ァミラーゼと異なっている。

本菌を培養して本発明のーァミラーゼを生産するには、窒素源として、大豆粕、大豆タンパク、コーン ' スティープ ' リカー、肉エキス、ペプトン、ミノレクカゼイン、酵母エキスなどの有機窒素源が使用される。中でも、ポリペプトン、ポリぺプトン S酵母エキス、大豆タンパク、コーン ' スティ一フ。 ' リカ一などは良好な窒素源である。 3 この他、必要に応じ、硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、尿素、硝酸アンモニゥムなどの無機窒素源が使用される。炭素源としては、通常、澱粉又は液化澱粉、可溶性澱粉、デキストリンなどの澱粉派生物が使用される。

以上の窒素源と炭素源の他に、リン酸塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などが補足原料として使用される。特に、リン酸塩、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどの添加は効果があり、リン酸塩として、例えば、 K₂HP0₄は 0.05〜 0.3%. マグネシウム塩として、例えば、 MgS0₄'7H₂0 は 0.01〜 0. 3 %、カルシュゥム塩として、例えば、 CaCl₂ は 0.01〜 0.1 %程度添加される。

本発明の or アミラーゼは菌体外に生産される。培養後、濾過又は遠心分離により、除菌し、酵素を回収する。

本発明の —ァミラ一ゼは耐酸性と耐熱性に優れているため、現在、工業的に使用されているノシルス · スブチルス (Baci 1 lus subti 1 is)やノシルス . リケニオルミス (Baci 1 lus I i chen i f ormi s) などのバシルス属菌の生産する耐熱性 α ァミラーゼと同様に 100〜 110 ての高温でトウモロコシ毂粉を液化するのに使用することができる。しかし、本発明の o _アミラーゼが従来の o —アミラーゼと異なるところは、本発明の酵素が PH4. 5前後の酸性下で使用できることにある。このため、澱粉乳の PHを、無調整又は PH4. 0〜5. 0 に調整して液化後、 PHを再調整することなく、そのまま、ァスペルギルス属菌の生産するグルコアミラーゼにより糖化することができる。具体的には、 30〜35%のトゥモロコシ澱粉乳に本発明の酵素の適当量を加え、ジュットクカーを用いて、 103〜105 'Cで 5分程度処理し、次いで、 90〜 95てで 0. 5 〜数時間程度処理することにより、糖化に使用できる DE10前後の液化澱粉を製造することができる。

鎩粉液化において、カルシュゥム塩として、例えば塩化カルシユウムを 1 〜： lOmM程度添加される。 100 °C以上の温度で、かつ pH 5以下での殺粉液化においてはカルシユウム塩の陰イオン成分は酵素の安定性に著しく影響する。カルシウム塩としては. 炭酸カルシウム、生石灰などがカルシュゥム源として使用される。

図面の簡単な説明

第 1 図は、本発明の o —アミラーゼの最適 pHを示す図である < 一〇一は酢酸緩衝液を使用した場合を示し、一壽一はリン酸緩衝液（KH₂P0₄-NaHP0₄) を使用した場合を示す。

第 2図は、本発明の or —アミラーゼの最適温度を示す図である。

一〇一は、 CaCl ₂ 無添加の場合を示し、一拿一は 5mM CaCl _z が存在した場合を示す。

第 3図は、本発明の α —アミラーゼの熱安定性を示す図である。 11約5. 5 で、 90て、 95。C、 100 てで 10分間加熱した後の残存活性を示す。一〇一は、 CaCl₂ 無添加の場合を示し、ー秦ーは 5mM CaCl_z の存在下で加熱した場合を示す。

第 4図は、本発明の α—アミラーゼを用いて約 35% トウモロコシ澱粉、 8mM 酢酸緩衝液、 5mM CaCl_z の下、一次液化を 105 てで 5分行ったのち、 90°Cで 2次液化を行った結果を示す図である。

一拿一は pH4. 5、一〇一 11 は pH4. 7 、一口一は pH5. 0、一画一は PH5. 5 の酢酸緩衝液による一次液化を示す。

第 5図は、本発明の —アミラーゼを用いて約 30%のポテト澱粉、 8mM 酢酸緩衝液（pH5.5)、 5mM CaCl₂ の下で、液化を行つた図を示す。

一〇一は液化温度 90°C、ー參一は 95て、一口一は 100 て、一画一は 105 °Cをそれぞれ示す。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明の内容を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 1

大豆粕 2%、可溶性澱粉 2%、 MgS0₄-7H_z0 0.05%, K₂HP0₄ 0.2%, CaCl₂ - 2H_Z0 0.05 %からなる培地（pH5.5) 200 を 1 リットル容三角フラスコに入れ、 121°Cで 15分殺菌後、バシルス - リケニフォルミス or (FERM BP-4480)を接種し、 30て、 225 回転/分で 5 日間培養した。その結果、培地 1 当たり、 1. 5単位生産された。

培養液を遠心分離して、上澄液を得、硫酸アンモニゥムを 80 %飽和になるよう加え、生成した沈殿を回収後、透析し、アミコン社製、 YM- 3で限外濾過により濃縮し、 31.8単位（粘度法）/ の酵素液を得た。

実施例 2

実施例 1 で得られた本発明の α アミラーゼを、 1 %可溶性澱粉、 0.1M緩衝液下で 30分間反応させて、本発明の α ァミラ —ゼの活性の ΡΗ依存性を調べた。なお、緩衝液としては、酢酸緩衝液およびリン酸緩衝液（KH₂P0₄-Na₂HP0₄) を用いた。結果を表 3及び第 1 図に示した。

- 1

表 6 3

この表 3から明かなように、本発明のアミラーゼは、 pH 4 〜 8. 5 において活性を有し、特に PH4. 5 〜 5. 5 において活性は極めて高い。

実施例 3

実施例 1 で得られた本発明のアミラーゼを、 1 %可溶性澱粉、 10mM緩衝液（pH 5.5) 下で 10分間反応させて、本発明の α アミラーゼの活性の温度依存性を、 CaCl₂ 無添加の場合と. 5mM CaCl₂ が存在する場合について調べた。結果を表 4及び第 2図に示した。表 4 温度による相対活性

この表 4 から明かなように、本発明の o —アミラーゼは、 90 てで高い活性を有する。また、カルシウムイオンを存在させるときは 90〜： 104 'Cで高い活性を有し、高温で反応させることができる。

実施例 4

実施例 1 で得られた本発明の or—アミラーゼを、 5mM 酢酸緩衝液（PH5.5)中で 60〜： 100 てで 10分間加熱した後の残存活性を調べた。結果を表 5及び第 3図に示した。

90'Cまでの加熱では失活は認められない。 100 て、の加熱では 50 %の失活が認められたが、カルシウムイオンを存在させたときは失活は認められず、 30分間加熱しても殆ど失活は認められなかった。

表 5 熱安定性試験

Relative Activity (%)

加熱温度（て )

CaCl ₂ 無添加 CaCl ₂ 5mM 添加

60 100 100

70 100 100

80 100 100

90 100 100

100 52 100 実施例 5

実施例 1 で得られた本発明の _アミラーゼを、約 35% トゥモロコシ澱粉、 8mM 酢酸緩衝液、 5mM CaCl₂ の下、一次液化を 105 'Cで 5分行った後、 90てで二次液化を行った。結果を表 6 及び第 4図に示した。

表 6

< 1.

δ

実施例 6

実施例 1 で得られた本発明の α—アミラーゼを用い、澱粉の液化条件を検討した。

ポテト澱粉 0.4 g、 0.4M酢酸緩衝液（PH5.5) 0.2 、 0.1M CaCl 0.05«ώ、実施例 1 で調製した一アミラーゼ 1. 6単位（粘度法）を加え、全量 1. 0 とし、 90て、 95。C、 100'C及び 105°Cで反応を行った。

経時的に、 1定量採取し、生成した還元糖をソモギー · ネルソン法により、グルコースとして定量した。得られた結果を表 7及び第 5図に示す。表 Ί 澱粉の液化における温度の影響

- i

9

実施例 7

本実施例においては、澱粉液化の PHの影響について試験した, 実施例 1 で調製した酵素 3. 2単位に、ポテト澱粉 0.4 g 0.4m!1 酢酸緩衝液（PH4. 5 — 5.25)0.2 0.1M CaC ， 0.05 を加え. 全量 1. 0 とし、初発 PH4. 5 4.75 5. 0、および 5.25で、 90 てで、 30分、 60分、 90分及び 120分間反応を行った。生成した還元糖をソモギー ' ネルソン法により定量した。得られた結果を表 8 に示す。表 8 ポテト澱粉液化における PHの影響（反応温度 9CTC ) 反応時間還元糖生成量（グルコースとして） mg/ ml

表 8 から明らかなように、高濃度の澱粉下、 90ての反応において、 60分までの反応において最適 PHは 5付近に認められた。

o

しかし、還元糖生成量から明らかなようにいずれの PHにおいても、 120分反応後も活性の大きな低下は認めれれなかった。

実施例 8

本実施例においては、トウモロコシ澱粉の液化について試験した結果を示す。ネジ付き試験管に、実施例 1 で調製した酵素 3. 2単位（いずれも粘度法）に、トウモロコシ澱粉 0.4g、 0.4 酢酸緩衝液（PH4. 5、 4.75、 5.0および 5.25) 0.2 、 0.1MCaCl₂ 0. 1 を加え、全量 1. 0 とし、 105 てで 5分間油槽で加熱液化（一次液化）し、次いで、 95'C と 90'Cで 6時間液化を継続した。 0.5 、 1.0 、 1.5 、 2.0 とおよび 6時間目に一定量を採取し、生成した還元糖をソモギー · ネルソン法により定量し、 DE を求めた。得られた結果を表 8 に示す。ここで、 DE(Dextrose Equivalentの略、ブドウ糖当量）は固形分中の還元糖量をグルコースとして表した百分率である。表 9 トウモロコシ澱粉の液化（1)

表 9及び表 1 0 から明らかなように、本発明の酵素は、 PH約 4. 5〜 5 の酸性下でも、従来の α _アミラーゼと同様の液化条件（一次液化： 105て， 5分、二次液化； 90〜95'C ) で殺粉を効果的に液化することができた。

実施例 8

本実施例においては、酵素量を変えてトウモロコシ澱粉を液化した結果について記す。

トウモロコシ澱粉 0.4 g、 0.4M酢酸緩衝液（pH4.5又は4.75) 0. 2 、 0.1M CaCl ₂ に、実施例 1で調製した酵素を、澱粉 g 当たり表 11記載の量加え、全量とし、一次液化を 105 'Cで 5分行ったのち、 90'Cで 6時間反応を継続した。経時的に一定量を採り、生成糖をソモギー ' ネルソン法により測定し、 DEを求めた。

得られて結果を表 1 1 に示す.

表 1 1 トウモロコシ澱粉の液化 (3)

2

表 1 1 から明らかなように、酵素量を増加することにより、 DEは増加し、 pH4. 5又は PH4.75の酸性下でも、ダルコアミラ一ゼの糖化に必要な DE 10 前後の液化殺粉を得ることができた。また、得られた液化物は、トウモロコシ澱粉中に舍まれているタンパク質等の不純物が浮遊物として分離し、極めて濾過性が優れている。得られたデキストリンは老化しにくいものであつた。

実施例 9

実施例 8 に従い、 p H 4. 5 で液化したトウモロコシ澱粉の液化液（DE 18) を原料としてァスペルギルス · 二ガーのグルコアミラ一ゼ（デンマークノボ社製造）で糖化を行った。

液化澱粉約 30%、 8mM 酢酸緩衝液（PH4.5) 、グルコアミラーゼ（6.1単位基質）、プルラナ一ゼ（0.5単位/ g基質）の存在下- 又は非存在下で、 60てで 25時間反応した。糖化液の糖組成は高速液体クロマトグラフィ一によつた。得られた結果を表 12に示す。表 1 2 pH4.5で液化したトウモロコシ澱粉の糖化液の糖組成

ダルコアミラーゼ単独で糖化した場合、約 95.3%の高い収量でグルコースが得られた。また、プルラナーゼの存在下でグルコアミラ一ゼで糖化した場合、 97.5 %の高い収量でグルコースが得られた。すなわち、本発明の α—アミラーゼを使用し、 ρΗ 5 以下の低い ΡΗで液化した液化澱粉を使用した場合、二糖類 ( G ₂)成分の少ない糖化液が得られる傾向が認められた。

ここで、ダルコアミラーゼ 1 単位とは、 1 %可溶性澱粉の下 (5mM 酢酸緩衝液含む）、 pH5. 0、 40てで反応し、 1 分間に 1 マイク口モルのグルコースを生成する酵素量である。

また、プルラナ一ゼ 1 単位とは、 1 %プルランの下（ 5mM 酢酸緩衝液を舍む）、 PH5. 0 、 50 °Cで反応し、 1 分間に 1 マイクロモルのグルコースに相当する還元力を生成す酵素量である。本発明のバシルス属の菌株より得られる _α—ァミラーゼは耐酸性と耐熱性に優れており、 ΡΗ 5以下の酸性下で、 105 てと 90 〜 95てでトウモロコシ澱粉を液化し、 ΡΗを調整することなく、ダルコアミラーゼによる糖化原料として使用することができるまた、本発明の α—アミラーゼを用いることにより、老化しにくい優れたデキストリンを生成させることができる。

産業上の利用可能性

本発明のバシルス属の菌株より得られる o —ァミラーゼは耐酸性と耐熱性に優れており、 PH 5以下の酸性下で一次液化 105 'C と二次液化 90~95'Cでトウモロコシ澱粉を液化し、 PHを調整することなく、ダルコアミラーゼによる糖化原料として使用することができる。

微生物への言及

Bach i 11 us 1 icheni f ormis

寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所住所：日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番 3号受託番号： FERM BP- 4480

(平成 4年 11月 16日に寄託された微ェ研菌寄第 P- 13286号より移管）

2

5

Claims

請求の範囲

1. バシルス属に属する菌株が産生する、最適 PHが 5. 5以下であり、かつ最適温度が 90'C以上である、耐酸性及び耐熱性を有する or—アミラーゼ。

2. ノぺシルス属に属する菌株が Bacillus 1 i chen i f orm i sに属する菌株である請求の範囲 1 の o —アミラーゼ。

3. ノヾシノレス属に属する萌株が Baci 11 us 1 i chen i f orm i s a

(FERM BP- 4480)である請求の範囲 1 の or—アミラーゼ。

4. 次の理化学的性質をもつ請求の範囲 1 の o —アミラーゼ。

1) 作用及び基質特異性：

澱粉の or— 1, 4—ダルコシド結合をエンド型で分解して澱粉をデキストリリン化する。

アミロぺクチンあるいはその派生物の or— 1, 6—ダルコシド結合を加水分解できない。

2) 作用 PH及び最適 pH :

作用 3.5〜10 ( 1 %可溶性殺粉及び 5 mM酢酸緩衝液下で 80てで測定）

最適 PH 5 ( 1 %可溶性殺粉及び 5 mil酢酸緩衝液下で 80

'Cで測定）

3) 作用温度及び最適温度：

作用温度の上限 120'C

最適温度 90'C ( 1 %可溶性澱粉及び 5 mM酢酸緩衝液（PH5.5)下で測定） lOOt (5mM カルシウムイオンの存在下、 1 %可溶性澱粉及び 5 mM 酢酸緩衝液（PH5.5)下で測定） 4) PH安定性：

PH5〜10で安定（0.1M酢酸緩衝液あるいは 0.1Mリン酸緩衝液中で 50てで 1 時間処理した場合）

5) 熱安定性：

90。Cまで安定で、 100 てでは 50%が失活（pH5. 5 の 5mM 酢酸緩衝液で加熱した場合）

5mM カルシウムイオンの存在下で 100°Cで 10分間加熱しても失活しない。 2

マ

6) 分子量：約 9000ダルトン（ゲル濾過法による）

7) 安定化： Ca^{2 +} , Sr² Ba^{2 +}又は Na⁺ の存在下で熱失活から保護される。

8) 阻害剤： Zn^{2 +} , Hg^{z +} , Ag+ , Cu^{2 +} , Fe ² +又は A 1³ +の存在により活性が阻害される。

5. Bacillus属に属する、請求の範囲 1 記載の耐酸 · 耐熱性 α— ァミラーゼを産生することのできる微生物。

6. 請求の範囲 5 に記載される微生物が Bacillus 1 i chen i f or m i s に属する菌株である微生物。

7. Bacillus 1 i chen i f orm i s or (FERM BP-4480)

8. Bacillus属に属し、請求の範囲 1 記載の一アミラーゼを産生する微生物を培養し、培養液から請求の範囲 1 記載の α—アミラーゼを採取することを特徴とする耐酸性及び耐熱性を有するーァミラーゼの製造法。

9. 澱粉に請求の範囲 1 記載の σ—アミラーゼを温度 90て以上、 ΡΗ5. 5以下で作用させ澱粉を加水分解することを特徴とするデキストリンの製造法。