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WO1994013787A1 - Procede pour favoriser la differenciation de cellules vegetales en culture - Google Patents

Procede pour favoriser la differenciation de cellules vegetales en culture Download PDF

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WO1994013787A1
WO1994013787A1 PCT/FR1993/001239 FR9301239W WO9413787A1 WO 1994013787 A1 WO1994013787 A1 WO 1994013787A1 FR 9301239 W FR9301239 W FR 9301239W WO 9413787 A1 WO9413787 A1 WO 9413787A1
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WO
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ltp
culture
protein
analog
cells
Prior art date
Application number
PCT/FR1993/001239
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English (en)
Inventor
Pierre Marie Louis Coutos-Thevenot
Thierry Georges Jouenne
Olivier Charles Antoine Maes
Alain Jean Deloire
Michel Paul Henri Boulay
Jean René Denis GUERN
Original Assignee
L.V.M.H. Recherche
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Publication date
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Priority to US08/448,481 priority patent/US5914270A/en
Priority to EP94902805A priority patent/EP0673414A1/fr
Priority to AU57022/94A priority patent/AU684484B2/en
Publication of WO1994013787A1 publication Critical patent/WO1994013787A1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting the differentiation of cells in culture, in particular during the processes of tissue differentiation, embryogenesis, or organogenesis; it relates more particularly to a process intended for obtaining embryos from the culture of plant somatic cells using ⁇ lipid transfer proteins which will be referred to below as LTP, as well as these proteins themselves and their applications.
  • LTP ⁇ lipid transfer proteins
  • Somatic embryogenesis essentially comprises two stages: 1- the induction of the embryogenic potential by exogenous auxins, generally in high concentrations, which allow the appearance of proembryogenic aggregates (or masses) (PEM) which correspond to groups of 10 to 50 cells, in particular bas ⁇ stémmatique. 2- the transfer of these cells to media free of auxins which lead to the formation of somatic embryos from these PEMs, following the different stages of evolution of plant embryogenesis, namely: globules, heart and torpedo.
  • PEM proembryogenic aggregates
  • somatic embryos For some plant species, obtaining somatic embryos is very difficult, if not impossible. For example, with certain vine cultivars, the embryogenic capacities of somatic cells can be stopped, most of the time at the stage of proembryogenic aggregates formation, or else, the maturation of the embryos is blocked, in particular at the globular stage.
  • EP 281375 proposed the addition of calmodu ne and calcium to a cell culture to promote the differentiation of roots and embryos.
  • Application EP 55597 describes a method of stimulating the growth and embryogenesis of plants cultivated in vitro, by addition of arabino-galactan proteins. However, it has been shown (de V ⁇ es et al, 1989, Proceedings of the International Symposium of EUotechnology for Major Crops (ADEBIO ed.), Pages 22-23) that an extra-cellular glycoprotein of 52/54 kDa induces a cessation of embryonic development at the heart stage.
  • the present invention is based on the discovery of proteins making it possible to ensure or stimulate cell differentiation, and in particular somatic embryogenesis, even under certain non-permissive conditions, in particular from somatic vine cells, said proteins also being able to have other applications.
  • non-permissive conditions with respect to the realization of a given phenomenon, conditions known from the state of the art which partially or totally prevent the phenomenon from occurring.
  • the present invention relates to a method for promoting the differentiation of cells in culture, in particular with a view to tissue differentiation, embryogenesis, or organogenesis, characterized in that '' is introduced into the culture medium in effective concentration to obtain the cell differentiation at least one lipid transfer protein or "LTP", or an LTP analog.
  • LTP analog is meant any protein substance, such as protein, protein fragment or polypeptide, having at least 30% homology with an LTP or with an LTP fragment.
  • the lipid transfer protein is an LTP obtainable from cells belonging to the same genus or the same species as cells in culture.
  • the present invention relates to a process for obtaining plant somatic embryos from a culture of somatic cells in vitro, characterized in that the culture medium is added in a concentration effective to ensure the embryogenesis, at least one lipid transfer protein or LTP, or an analog of LTP.
  • maturation will be used generally to designate the phenomena of development and germination of the somatic plant embryo, thus passing through the following stages of development: globule, heart, torpedo and seedling.
  • the technology of in vitro cell culture of somatic cells is known and will of course have to be adapted to each of the cells in question, the physicochemical conditions, culture media and environment being adapted so as to allow the multiplication and the formation of aggregates. proembryogens, then embryogenesis.
  • the corresponding media will be called "culture media for embryogenesis”.
  • the LTPs usable according to the invention can be introduced at any time into the culture medium.
  • Kader et al (Methods Enzymol., 1987, 148, 661-666) identified an LTP isolated from young corn plants.
  • Nonspecific lipid transfer proteins could be characterized in the castor bean endosperm, spinach leaves, and barley grass.
  • LTPs are also present in carrots and millets.
  • the LTPs known from the vegetable sector are proteins generally having a molecular weight of approximately 10 kDa; non-specific LTPs and most of the specific LTPs are basic proteins, having an isoelectric point greater than 8.
  • the inventors have been able to highlight the fact that the presence of auxin in the medium, which very often causes the appearance of non-permissive conditions, was not an obstacle to the formation of embryos if LTPs are added. .
  • the LTP or the analog of LTP is added to the medium for the induction and / or multiplication of the aggregates of proembryogenic cells, generally containing an auxin. An increase in the embryogenic power of the strain is then observed and an increase in the number of proembryogenic aggregates formed.
  • the process according to the present invention is also particularly advantageous for obtaining the formation of embryos and their maturation, especially in the case where they are transformed cells.
  • the LTPs can be introduced into the maturation medium of the embryos, which is, according to the prior art, generally free of auxin, or even substantially free of auxin.
  • the LTP or the analog of LTP is added to the maturation medium embryos.
  • This maturation medium can be substantially free of auxin.
  • the maturation medium contains an auxin, in particular in an amount necessary to ensure the viability of cell culture.
  • auxins 2, -d ⁇ chloro phenoxyacetic acid (2.4 D), 1-naphthalene acetic acid (NAA), 2-naphthoxyacetic acid (NOA).
  • 2.4 D 2, -d ⁇ chloro phenoxyacetic acid
  • NAA 1-naphthalene acetic acid
  • NOA 2-naphthoxyacetic acid
  • LTPs in culture media for transformed cells, in particular vine cells, especially in the case where the cell strain has a disturbed somatic embryo genesis.
  • these cells have been transformed by biolistics (by particle gun) or by appropriate cloning vectors, such as vectors derived from Agrobacté ⁇ um or other viral type systems.
  • the multiplication step does not necessarily have to be, and maturation can take place directly.
  • the LTP or the analog of LTP is present in the culture medium at a concentration of between 1 and 10 ⁇ g / ml of medium, preferably between 1 and 50 ⁇ g / ml.
  • the abovementioned cell culture is a culture of vine cells.
  • LTP or the analog of LTP comprises at least one amino acid sequence having at least 80% homology with one of the sequences shown in Figure 2.
  • LTP or the analog of LTP comprises at least one amino acid sequence having practically 100% homology with one of the sequences represented in FIG. 2.
  • LTP, or the analog of LTP has a molecular weight of about 9 kDa.
  • the lipid transfer protein is an LTP obtainable from cells belonging to the same genus or the same species as cells in culture.
  • LTP obtainable from cells belonging to the same genus or the same species as cells in culture.
  • the invention also relates to a plant obtained by any of the aforementioned methods of the invention.
  • PI, P2, P3 and P as well as the proteins or fragments of said proteins or polypeptides having at least 80% homology with at least one of these proteins, or the corresponding fragments of said proteins, in particular partially deleted proteins but which , preferably kept the lipid transfer capacities.
  • the N-terminal sequence of these four proteins is indicated in the attached FIG. 1, the purity of these proteins was confirmed by the presence of a single type of N-terminal end for each sample.
  • the corresponding proteins are proteins which are not N-glycosylated.
  • the present invention relates to a protein substance consisting in particular of a protein, a protein fragment or a polypeptide, characterized in that said protein substance comprises an amino acid sequence, located preferably to its N-terminal extrunrun, having at least 80% homology with one of the sequences shown in Figure 1, and preferably having a transfer activity of lipids, in particular phospholipids.
  • said protein substance comprises an amino acid sequence having practically 100% homology with one of the sequences represented in FIG. 1.
  • Proteins P I and P2 have the same sequence on the first 40 amino acids from the N-terminus, while the amino acid compositions of proteins P3 and P4 are different. It appears from this observation that the proteins P I and P2 having the same
  • the four proteins in question have a lipid transfer activity, as has been demonstrated by tests of in vitro transfer of phosphatidyl-choline t ⁇ tiée, between liposomes (donor membrane system) made of this phospholipid and mitochond ⁇ es constituting the membrane system recipient, according to the method described by Douady D. et ai. in the journal Biochim. Biophys. Acta (1982) vol. 710 p. 143-153.
  • the present invention also relates to a DNA sequence coding for a tell protein as defined in the previous aspect.
  • the present invention also relates to the different uses of protein substances as defined above when describing the fourth aspect of the invention, in particular in compositions comprising them alone or in combination with other active principles, in particular lipid compounds. These compositions can be used, for example as additive for cell cultures, but can also be used for other applications in the biological field in which their lipid transfer activity and / or on tissue differentiation can prove to be valuable.
  • the present invention also relates to a probe consisting of at least one oligonucleotide, characterized in that the base sequence of said oligonucleotide is deduced from a part of the amino acid sequence of a protein substance such as previously defined, in particular of one of the proteins PI to P4.
  • oligonucleotide is deduced from an amino acid sequence which comprises at least 6 or 7 amino acids, preferably from position 3 of the N-terminal end of the protein substance , especially protein.
  • the probe can also consist of a mixture of oligonucleotides as defined above.
  • Figure 1 Sequences of PI, P2, P3 and P4 proteins
  • Figure 2 Compared sequences of LTPs from different species
  • Figure 3 Effect of the addition of the FI fraction (PI, P2 and P3 proteins) on the maturation of the embryos present of different concentrations of auxin and at two different cell densities, compared to a control culture.
  • Figure 4 Effect of the addition of the FI fraction on differentiation at the preglobular stage, in the presence of different concentrations of auxin and at two different cell densities
  • FIG. 5 Effect of the addition at different concentrations of the F2 fraction (P4 protein) on the maturation of embryos.
  • a suspension of vine cells derived from the 41 B line (Vitis vinifera cv. Chasselas x Vitis berlandie ⁇ ) is used. The undifferentiated growth of these cells is maintained by weekly subcultures in the presence of auxin, 2-naphthoxy acetic acid (NOA) at the concentration of 5 ⁇ M, as described previously by Coutos-Thevenot, et al. . in Plant Cell Tissue Organ Culture 29, 125-133 (1992).
  • auxin 2-naphthoxy acetic acid
  • the filtered cells are washed in a medium free of auxins and inoculated at a rate of 1 ⁇ l in a GMo culture medium according to the protocol described in the same document.
  • the medium is harvested by first separating the PEMs or the embryos with a particulate glass filter No. 2 and No. 4 respectively (Pyrex France).
  • the conditioned medium is clarified by passing it under vacuum through a fiberglass membrane (GF / C hatman) and concentrated 100 to 200 times using an AMICON ultrafiltration system with an AMICON YM3 membrane (cutoff threshold 3 kDa).
  • the protein content is determined by the Lowry method.
  • the proteins are purified using an HPLC system (Waters Massachussets USA) using a UV detector M 440 under the following conditions: 1) the medium harvested after 1 5 days of incubation and concentrated 100 times, is loaded onto a cation exchange column (model SP5PW from Waters Massachussets USA) previously equilibrated with a 25mM buffer of sodium phosphate pH 6.5 ( speed 0.8 ml / minute). About 4mg of protein is placed on the column. The basic proteins are removed in 30 minutes by a linear gradient of aqueous sodium chloride solutions 0 to 0.3 M. The fractions corresponding to the different peaks observed on the elution profile are collected and analyzed by SDS-PAGE electrophoresis. Two fractions having a molecular weight of approximately 10 kDa are obtained, which are then subjected to a second purification step. The IF fraction represents 15.3% by weight of the initial basic proteins, and the F2 fraction represents 10.2%
  • the elution profile obtained for the first major peak (fraction F1) of step 1 provides 3 secondary peaks corresponding to the proteins PI, P2, and P3.
  • the P4 protein is recovered in the elution of the second major peak (fraction F2) of step 1.
  • For 100 ⁇ g of the fraction F1, 42.5 ⁇ g of PI, 6.54 ⁇ g of P2 and 0.33 ⁇ g of P3 are collected after this chromatographic treatment. From 100 ⁇ g of fraction F2, 46 ⁇ g of P4 is collected.
  • the molecular weights of the proteins PI, P2, P3 and P4 were determined in a conventional manner by mass spectrometry. The results are shown in Table I.
  • the N-terminal sequence on 40 amino acids was analyzed using a 470A sequencer in the liquid gas phase (ABI, Foster City, California).
  • the amino acids phenylhydantoin are analyzed on a 120A analyzer.
  • the PI to P4 sequences were compared to the LTP protein sequences of carrot (c) spinach (millet (Mi) and corn (M)).
  • the four protein fractions and a purified corn LTP used as a control are tested for their lipid transfer activity, by the technique described by Douady, D., Grosbois, M., Guerbette, F. and Kader, 3.C. (1982) Biochim. Biophys. Acta 710, 143-153. Proteins are incubated for 30 minutes at 30 ° C with purified mitochond ⁇ es from corn and with a preparation of radioactive liposomes. The labeling is carried out on the one hand with t ⁇ tiated phosphatidylcholine and on the other hand with a liquid non-transferable by these LTPs: cholesteryl (1 - 14C) oleate.
  • the mitochondria are resuspended in 1% of Triton X 100 and the activity ratio (in cpm) between 3H and 14C is measured to determine the transfer activity which is expressed as a percentage of t ⁇ tiated phosphatidyichohne transferred after correction of contaminating radioactivity due to cholesteryl oleate not exchanged.
  • Proteins can be classified into two groups based on their ability to transfer phospholipids (see Table II). The PI and P2 proteins exhibit high specific activities, while
  • the culture medium used for the development of somatic embryos is a modified liquid culture medium MS, 0 comprising in particular 18 g / 1 of maitose and 4.6 g / 1 of glycerol replacing sucrose and 1 g / 1 of hydrolyzate casein.
  • This medium is used at a pH of 5.8 adjusted by the addition of 0.1 N sodium hydroxide; either such that, or NOA (naphthoxyacetic acid) is added at concentrations of 0.5 ⁇ M or 5 ⁇ M.
  • the culture medium is autoclaved for 20 min at 120 ° C.
  • the undifferentiated cell cultures, originating from the cell culture maintained according to the protocol of Example 1, are successively filtered through nylon filters having pores with a size of 500 ⁇ m, then of 200 ⁇ m, so as to not preserve for culture inoculation only ⁇ cell aggregates of size between these two values.
  • the undifferentiated cell aggregates retained on the second filter are then washed 3 times with modified MS medium, then suspended in 30 ml of this medium.
  • the cell density expressed in ⁇ l of cell volume per ml of medium is determined after sedimentation (1 ⁇ g) of the cells in a graduated conical tube.
  • modified culture medium MS then containing 0, 0.5 or 5 ⁇ M NOA
  • 80 ml of modified culture medium MS are then inoculated with a suspension of cellular aggregates at a density of 0, 1 or 1 ⁇ l / ml, in a 250 ml Erlenmeyer flask.
  • the volumes of culture medium can be reduced to approximately 1 ml, in 24-well microtiter dishes (Falcon) but the cell density must be respected.
  • the culture mediums are then supplemented to To of the experiment by increasing doses of the protein fraction F I isolated according to Example 1 and containing essentially the LTP P I, P2 and P3.
  • the respective doses are 2 and 10 ⁇ g / ml; a control without LTP is also cultivated.
  • the development curves of the proembryogenic structures are established using arbitrary units: 0 for undifferentiated PEM, 4 for embryos at the globular stage, the values 1, 2 and 3 corresponding to intermediate stages of proglobular embryos in the cell mass.
  • the first globules appear only after 21 days. This time for the appearance of the first globules is shortened to 1 day when the middle place is supplemented with 2 ⁇ g / ml of LTP, and to 6 days when the medium is supplemented with 10 ⁇ g / ml of LTP. The same effect is observed for a density of 1 ⁇ i / ml, with a slight delay.
  • auxin With an initial cell density of 1 ⁇ l / ml, auxin is rapidly metabolized and there is a beginning of differentiation even in the absence of LTP. The differentiation is accelerated by the complementation in fraction FI.
  • Figure 3 shows the progression of embryogenesis by counting the proportions of embryos at different stages of their development in a medium containing no auxin, compared to the total number of embryos.
  • A are represented the results for an initial cell density of 0.1 ⁇ l / ml; e in B for an initial density of 1 ⁇ l / ml. (A) at 0.1 ⁇ l PCV / ml.
  • FIG. 5 shows the results obtained after 21 days of culture, in the presence of NOA at the concentration of 5 ⁇ M for an initial cell density of 0.1 ⁇ l / ml, and in the presence of different concentrations of the fraction F2: 0.1 , 2 and 3 ⁇ g / ml.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour favoriser la différenciation de cellules en culture, notamment en vue de la différenciation tissulaire, de l'embryogénèse, et/ou de l'organogénèse, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture en concentration efficace pour obtenir la différenciation des cellules, au moins une protéine de transfert de lipide ou 'LTP' ou un analogue de LTP. Elle concerne également une plante obtenue par un tel procédé, des substances protéiques et protéines possédant une activité de transfert de lipides et une composition comportant au moins une telle substance. Elle concerne enfin une séquence d'ADN codant pour une LTP et une sonde dont la séquence est déduite de la séquence de ladite protéine.

Description

PROCEDE POUR FAVORISER LA DIFFERENCIATION DE CELLULES VEGETALES EN CULTURE.
La présente invention concerne un procédé destiné à favoriser la différenciation de cellules en culture, notamment au cours des processus de différenciation tissulaire, d'embryogenèse, ou d'organogénèse ; elle concerne plus particulièrement un procédé destiné à l'obtention d'embryons à partir de culture de cellules somatiques végétales en utilisant des ~ protéines de transfert de lipides qui seront dénommées ci-après LTP, ainsi que ces protéines elles-mêmes et leurs applications.
Le principe de l'obtention d'embryons à partir de culture de cellules somatiques in vitro est bien connu, en théorie. On peut se reporter en particulier à la publication de D.J. Gray <k J.A. Mortensen dans la revue 10 Plant Cell, Tissue and Organ Culture ( 1987) vol. 9 p. 73-80. En ce qui concerne en particulier les embryons somatiques de vigne, on pourra se reporter au document US 532 733. Si l'embryogenèse somatique est praticable pour certaines espèces de plantes, pour d'autres par contre ce procédé est très difficile, voire impossible à mettre en oeuvre. 15 Pour comprendre les problèmes posés il faut rappeler brièvement les principes de culture de cellules somatiques destinées à la formation d'embryons.
L'embryogenèse somatique comporte essentiellement deux étapes : 20 1- l'induction du potentiel embryogène par des auxines exogènes, généralement en fortes concentrations, qui permettent l'apparition d'agrégats (ou masses) proembryogènes (PEM) qui correspondent à des groupes de 10 à 50 cellules, notamment méπstèmatiques. 2- le transfert de ces cellules sur des milieux exempts d'auxines qui 25 conduisent à la formation d'embryons somatiques à partir de ces PEM, en suivant les différents stades d'évolution de l'embryogenèse végétale, à savoir : globules, coeur et torpille.
Pour certaines espèces végétales, l'obtention d'embryons somatiques s'avère très difficile, voire impossible. Par exemple, avec 30 certains cultivars de vigne, les capacités embryogenes des cellules somatiques peuvent être stoppées, la plupart du temps au stade de la formation des agrégats proembryogènes, ou bien, la maturation des embryons est bloquée, notamment au stade globulaire.
35 Ceci est d'autant plus gênant qu'il existe, en particulier pour la vigne, un très grand besoin d'obtention à grande échelle d'embryons somatiques, in vitro. En effet, les méthodes in vivo de production d'embryons sont souvent insuffisantes et non souhaitables, car elles conduisent en règle générale à des recombinaisons génétiques, ce qui entraîne la perte des caractères génétiques originaux du cépage ou du porte-greffe que l'on souhaite multiplier.
La demande EP 281375, a proposé l'addition de calmodu ne et de calcium à une culture cellulaire pour favoriser la différenciation des racines et des embryons.
La demande EP 55597 décrit une méthode de stimulation de la croissance et l'embryogenèse des plantes cultivées in vitro, par addition d'arabino-galactane protéines. Il a cependant été démontré (de Vπes et al, 1989, Proceedings of the International Symposium of EUotechnology for Major Crops (A.D.E.B.I.O. éd.), pages 22-23) qu'une glycoprotéine extra- cellulaire de 52/54 kDa induit un arrêt du développement embryonnaire au stade coeur.
La présente invention repose sur la mise en évidence de protéines permettant d'assurer ou de stimuler la différenciation cellulaire, et notamment l'embryogenèse somatique, même dans certaines conditions non permissives, notamment à partir de cellules somatiques de vigne, lesdites protéines pouvant également avoir d'autres applications.
Au sens du paragraphe précédent, on entend par "conditions non permissives" par rapport à la réalisation d'un phénomène donné, des conditions connues de l'état de la technique qui empêchent partiellement ou totalement le phénomène de se réaliser.
C'est pourquoi, suivant un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour favoriser la différenciation de cellules en culture, notamment en vue de la différenciation tissulaire, de l'embryogenèse, ou de l'organogénèse, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture en concentration efficace pour obtenir la différenciation des cellules au moins une protéine de transfert de lipide ou "LTP", ou un analogue de LTP. Par analogue de LTP, on entend toute substance protéique, telle que protéine, fragment de protéine ou poiypeptide, présentant au moins 30% d'homologie avec une LTP ou avec un fragment de LTP.
De préférence, la protéine de transfert de lipides est une LTP pouvant être obtenue à partir de cellules appartenant au même genre ou à la même espèce que les cellules en culture.
Suivant un deuxième aspect, la présente invention concerne un procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux à partir d'une culture de cellules somatiques in vitro, caractérisée en ce qu'on ajoute au mi lieu de culture, en concentration efficace pour assurer l'embryogenèse, au moins une protéine de transfert de lipides ou LTP, ou un analogue de LTP.
Les raisons pour lesquelles l'embryogenèse somatique de la vigne est bloquée sont multiples. De façon générale on utilisera pour les conditions dans lesquelles la formation d'embryons n'est pas possible ou au mieux très difficile ou faible, la terminologie "conditions non permissives", comme définie plus haut.
De même, dans ce qui suit, on utilisera de façon générale le terme maturation pour désigner les phénomènes de développement et de germination de l'embryon végétal somatique, passant ainsi par les stades de développement suivants : globule, coeur, torpille et plantule.
La technologie de culture cellulaire in vitro de cellules somatiques est connue et devra bien entendu être adaptée à chacune des cellules en cause, les conditions physico-chimiques, milieux de culture et environnement étant adaptés de façon à permettre la multiplication et la formation d'agrégats proembryogènes, puis ensuite l'embryogenèse. Les milieux correspondants seront appelés "milieux de culture pour embryo¬ genèse". Les LTP utilisables selon l'invention peuvent être introduites à tout moment dans le milieu de culture. Ainsi on a pu mettre en évidence que dans le cas où les cellules somatiques étaient placées dans des conditions non permissives d'embryogenèse, il était possible néanmoin d'observer la formation d'embryons dans la mesure où l'on rajoutait a milieu de culture des protéines de transfert de lipides.
Kader et al (Methods Enzymol., 1987, 148, 661-666) on identifié une LTP isolée de jeunes plants de maïs. Des protéines d transfert de lipides non spécifiques ont pu être caractérisées dans l'endosperme de graine de ricin, les feuilles d'épinard, et dans l'aleuron d'orge. Des LTP sont présentes également chez la carotte et le millet. Les LTP connues du domaine végétai sont des protéines ayant généralement un poids moléculaire d'environ 10 kDa ; les LTP non spécifiques et la plupar des LTP spécifiques sont des protéines basiques, présentant un poin isoélectrique supérieur à 8.
Les inventeurs ont pu mettre en évidence le fait que l présence d'auxine dans le milieu, qui très souvent entraîne l'apparition d conditions non permissives, n'était pas un obstacle à la formation d'embryons si l'on rajoute des LTP.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé, la LTP ou l'analogue de LTP est ajoutée dans le milieu d'induction et/ou de multiplication des agrégats de cellules proembryogènes, contenant généralement une auxine. On observe alors une augmentation du pouvoir embryogene de la souche et une augmentation du nombre d'agrégats proembryogènes formés.
Le procédé selon la présente invention est également particulièrement intéressant pour obtenir la formation d'embryons et leur maturation, surtout dans le cas où il s'agit de cellules transformées. Ainsi selon l'invention, les LTP peuvent être introduites dans le milieu de maturation des embryons, qui est, selon l'art antérieur, généralement exempt d'auxine, voire sensiblement exempt d'auxine. Cependant, c'est un avantage de l'invention que, même en présence d'auxine, et malgré cette présence, l'addition de LTP favorise ou permet la maturation des embryons. Ainsi, suivant un mode de réalisation particulier de l'inven¬ tion, la LTP ou l'analogue de LTP est ajoutée dans le milieu de maturation des embryons. Ce milieu de maturation peut être sensiblement exemp d'auxine. Mais selon une autre variante du procédé d'obtention d'embryon somatiques végétaux, le milieu de maturation contient une auxine notamment en quantité nécessaire pour assurer la viabilité de la cultur cellulaire.
Parmi les auxines, on peut citer l'acide 2, -dιchloro phénoxyacétique (2,4 D), l'acide 1-naphtalèneacétιque (NAA), l'acid 2-naphtoxyacétιque (NOA).
En particulier il peut être intéressant d'utiliser des LTP dan des milieux de culture de cellules transformées, notamment de cellules d vigne, surtout dans le cas où la souche cellulaire présente une embryo genèse somatique perturbée. Par exemple, ces cellules ont été transformée par biolistique (par canon à particules) ou par des vecteurs de clonag appropriés, tels que des vecteurs dérivés d'Agrobactéπum ou d'autre systèmes de type viraux. Dans ce cas, l'étape de multiplication n'a pa forcément lieu d'être, et la maturation peut avoir heu directement.
Suivant un mode particulier de réalisation du procédé selo l'un ou l'autre des deux aspects précités, la LTP ou l'analogue de LTP es présente dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 1 e l OOμg/ml de milieu, de préférence entre 1 et 50μg/ml.
Suivant un autre mode particulier selon l'un ou l'autre de ces deux aspects, la culture de cellules précitée est une culture de cellules de vigne.
Suivant différents autres modes de mise en oeuvre du procédé selon l'un ou l'autre des deux aspects précités, la LTP ou l'analogue de LTP, comporte au moins une séquence d'acides aminés présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 2.
En particulier la LTP ou l'analogue de LTP précitée comporte au moins une séquence d'acides aminés présentant pratiquement 100% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 2. Egalement, la LTP ou l'analogue de LTP, possède un poids moléculaire d'environ 9 kDa.
De préférence, la protéine de transfert de lipides est une LTP pouvant être obtenue à partir de cellules appartenant au même genre ou à la même espèce que les cellules en culture. Par exemple, dans le cas de l'embryogenèse de la vigne, il est intéressant d'uti liser comme cela sera décrit plus en détail ci-après, des protéines P I , P2, P3 ou P4 de la vigne, de même que leurs dérivés, les polypeptides et leurs fragments ayant de préférence des propriétés de transfert de lipides. En particulier, on peut utiliser une LTP de vigne, de carotte, d'épinard, de millet, de maïs, d'orge ou de colza.
Suivant un troisième aspect, l'invention concerne également une plante obtenue par l'un quelconque des procédés de l'invention précités.
Parmi les LTP utilisables, notamment dans le cas des embryons de vignes, il faut citer plus particulièrement quatre protéines qui ont été mises en évidence dans le cadre de la présente invention, à savoir
P I , P2, P3 et P , ainsi que les protéines ou fragments desdites protéines ou polypeptides présentant au moins 80% d'homologie avec au moins l'une de ces protéines, ou les fragments correspondant desdites protéines, notamment les protéines partiellement délétées mais qui, de préférence ont gardé les capacités de transfert des lipides.
La séquence N-terminale de ces quatre protéines est indiquée dans la figure 1 ci-annexée, la pureté de ces protéines a été confirmée par la présence d'un seul type d'extrémité N-terminale pour chaque échantillon. Les protéines correspondantes sont des protéines qui sont non N-giyco- sylées.
Ainsi, suivant un quatrième aspect, la présente invention concerne une substance protéique constituée en particulier d'une protéine, d'un fragment de protéine ou d'un polypeptide, caractérisée en ce que ladite substance protéique comporte une séquence d'acides aminés, située de préférence à son extrénruné N-terminale, présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 1 , et possédant de préférence une activité de tranfert de lipides, notamment de phospholipides. En particulier, ladite substance protéique comporte une séquence d'acides aminés présentant pratiquement 1 00% d'homologie avec l 'une des séquences représentées à la figure 1.
Les protéines P I , P2, P3 et P4 qui seront décrites plus en détails ci-après, correspondent à la définition précédente.
Les protéines P I et P2 présentent la même séquence sur les 40 premiers amino-acides à compter de l'extrémité N-terminale, alors que les compositions en amino-acides des protéines P3 et P4 sont différentes. Il ressort de cette observation que les protéines P I et P2 ayant la même
10 séquence, pourraient représenter une même protéine, ayant subi des modifications post-traductionnelies, alors que P3 et P4 représentent deux autres isoformes. Les séquences de ces protéines présentent également de grandes similarités avec d'autres séquences de protéines établies pour d'autres espèces végétales. - ~^ L'analyse des homologies entre les séquences des 40 premiers acides aminés à compter de l'extrémité N-terminale, appartenant à des LTP de différentes origines, a été effectuée par le progiciel de l'University of Wisconsin Genetic Computer Group (Nucleic Acid Research. _1_2, 387-395, 1984). Elle est représentée sur la figure 2. 0 La numérotation des acides aminés est donnée en fonction du système utilisé pour la détermination des homologies entre les différentes LTP telle qu'elle est montrée à la figure 2. Cette numérotation tient compte du décalage nécessaire à l'apparition des alignements de l'homoiogie maximum. On constate que, pour ces protéines, certains acides aminés conservent les positions suivantes :
2 cystéine, respectivement en position 4 et 14,
1 ou 2 cystéine, respectivement en position 30 et 31 ,
1 valine, en position 7, 0 1 'tyrosine, en position 17,
1 leucine, en position 37, et avec une très forte probabilité
5 3 glycine, respectivement en position 5, 22 et 33
1 proline en position 25
1 l ysine en position 35
1 aianine en position 40
Les masses moléculaires des protéines de vigne P I , P2, P3 et P4 sont rassemblées dans le tableau I :
TABLEAU I
Protéines Calcul de la masse moyenne (Da)
P I 9 102.5 ± 3.0
P2 9270.5 +_ 0.4 P3 9273.0 +_ 3.1
P4 9090.2 + 7.0
Les quatre protéines en cause possèdent une activité de transfert de lipides, comme cela a été démontré par des essais de transfert in vitro de phosphatidyl-choline tπtiée, entre des liposomes (système membranaire donneur) constitués de ce phospholipide et des mitochondπes constituant le système membranaire receveur, suivant la méthode décrite par Douady D. et ai. dans la revue Biochim. Biophys. Acta ( 1982) vol. 710 p. 143-153.
Les activités spécifiques de ces protéines sont toutefois assez différentes, comme indiqué dans le tableau II. TABLEAU II
Protéines Activité spécifique
(nmoi.m in .mg~ prot)
P I 15 P2 17,8
P3 *,3
P4 5,3 LTP de maïs purifié 5,7
On constate que les protéines P I et P2 présentent une trè haute activité spécifique tandis que l'activité des protéines P3 et P4 es trois fois plus faible.
Dans les exemples on donnera un procédé permettant d'isole ces protéines par des méthodes physicochimiques, mais il est bien entend que connaissant l'enchaînement des quarante premiers aminoacides, il es possible d'en déduire une séquence d'ADN codant pour les protéines et don de faire synthétiser ces protéines par le moyen de cellules recombinantes
Ainsi, suivant un cinquième aspect, la présente invention également pour objet une séquence d'ADN codant pour une protéine tell que définie dans l'aspect précédent.
Suivant un sixième aspect, la présente invention concern également les différentes utilisations de substances protéiques telles qu définies précédemment lors de la description du quatrième aspect d l'invention, notamment dans des compositions les comportant seules ou e association avec d'autres principes actifs, notamment des composé lipidiques. Ces compositions peuvent être utilisées, par exemple comme additif pour des cultures cellulaires, mais peuvent être également utilisées pour d'autres applications dans le domaine biologique dans lequel leur activité de transfert de lipide et/ou sur la différenciation tissulaire peut se révéler précieux. Suivant enfin un dernier aspect, la présente invention a également pour objet une sonde constituée par au moins un oligonucléotide, caractérisée en ce que la séquence en bases dudit oligonucléotide est déduite d'une partie de la séquence en acides aminés d'une substance protéique telle que précédemment définie, en particulier de l'une des protéines P I à P4. Ces sondes, marquées par des méthodes connues de l'homme de métier (Molecular cloning, A. Laboratory Manual, T. Maniatis, E.F. FRITSCH, 3. SAMBROOK, Coid Spπng Harbour Laboratory 1982) seront utilisées pour détecter les LTP endogènes et objectiver les processus de différenciation cellulaire. Plus particulièrement, la séquence précitée de l'oligo- nucléotide est déduite d'une séquence en acides aminés qui comporte au moins 6 ou 7 acides aminés, de préférence à compter de la position 3 de l'extrémité N-terminale de la substance protéique, notamment de la protéine. La sonde peut également être constituée d'un mélange d'oligonucléotides tels que définis précédemment.
Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes :
Figure 1 : Séquences des protéines P I, P2, P3 et P4 Figure 2 : Séquences comparées des LTP de différentes espèces Figure 3 : Effet de l'addition de la fraction FI (protéines P I , P2 et P3) sur la maturation des embryons en présence de différentes concentrations d'auxine et à deux densités cellulaires différentes, comparé à une culture témoin. Figure 4 : Effet de l 'addition de la fraction F I sur la différenciation au stade préglobulaire, en présence de différentes concentrations d'auxine et à deux densités cellulaires différentes
Figure 5 : Effet de l'addition à différentes concentrations de la fraction F2 (protéine P4) sur la maturation des embryons.
EXEMPLE 1 : Préparation des protéines PI, P2, P3 et P4
On utilise une suspension de cellules de vigne dérivée de la lignée 41 B (Vitis vinifera cv. Chasselas x Vitis berlandieπ). La croissance indifférenciée de ces cellules est maintenue par des sous-cultures hebdomadaires en présence d'auxine, l'acide 2-naphtoxy acétique (NOA) à la concentration de 5 μM, comme cela a été décrit précédemment par Coutos-Thevenot, et al. dans le document Plant Cell Tissue Organ Culture 29, 125- 133 ( 1992).
Afin d'initier la différenciation embryogene, les cellules f iltrées sont lavées dans un milieu exempt d'auxines et inoculées à raison de 1 μl dans un milieu de culture GMo selon le protocole décrit dans le même document.
Après 15 jours d'incubation, le milieu est récolté en séparant tout d'abord les PEMs ou les embryons avec un f iltre particulaire en verre n°2 et n°4 respectivement (Pyrex France). Le milieu conditionné est clarifié en le passant sous vide à travers une membrane en fibre de verre (GF/C hatman) et concentré 100 à 200 fois en utilisant un système d'ultra- filtration AMICON avec une membrane AMICON YM3 (seuil de coupure 3 kDa). Le contenu en protéines est déterminé par la méthode de Lowry.
Les protéines sont purifiées à l'aide d'un système HPLC (Waters Massachussets USA) utilisant un détecteur UV M 440 dans les conditions suivantes : 1 ) le milieu récolté après 1 5 jours d'incubation et concentré 100 fois, est chargé sur une colonne d'échange de cations (modèle SP5PW de Waters Massachussets USA) préalablement équilibré avec un tampon 25mM de phosphate de sodium pH 6,5 (vitesse 0,8 ml/minute). Environ 4mg de protéines sont disposés sur la colonne. Les protéines basiques sont éiuées en 30 minutes par un gradient linéaire de solutions aqueuses de chlorure de sodium 0 à 0,3 M. Les fractions correspondant aux différents pics observés sur le prof il d'élution sont collectées et analysées par électrophorèse SDS-PAGE. On obtient deux fractions présentant un poids moléculaire d'environ 10 kDa, qui sont ensuite soumises à une seconde étape de purification. La fraction F I représente 15,3% en poids des protéines basiques initiales, et la fraction F2 représente 10,2%
2) Les échantillons ( lv/v) dilués avec un tampon (3,6 M de sulfate d'ammonium, l OOmM de phosphate de sodium pH 7) sont chargés sur une colonne hydrophobe (HIC PH214 de Shodex Tokyo Japon), dont la phase mobile est une solution tampon à pH 7 contenant 1 ,8 mole de sulfate d'ammonium et l OOmM de phosphate de sodium. La vitesse de passage est de de l ml/mn. Les protéines fixées sont éiuées par un gradient linéaire décroissant de 1 ,8M à 0M de sulfate d'ammonium en 30 mn. Les fractions correspondant aux différents pics sont assemblées et désalées sur Sephadex G25M (PD-10 de Pharmacia). Après détermination de la concentration en protéines selon la méthode de Lowry, les fractions sont concentrées en utilisant un concentrateur
Speedvac (modèle SPD2DVAC modèle SVC 100H de Savant Instrument Inc. New- York, USA).
Le profil d'élution obtenu pour le premier pic majeur (fraction F I ) de l'étape 1 fournit 3 pics secondaires correspondant aux protéines P I , P2, et P3. La protéine P4 est récupérée dans l'elution du second pic majeur (fraction F2) de l'étape 1. Pour 100 μg de la fraction F I , on recueille après ce traitement chromatographique 42,5 μg de P I, 6,54 μg de P2 et 0, 33 μg de P3. A partir de 100 μg de la fraction F2, on recueille 46 μg de P4.
EXEMPLE 2 : Analyse des protéines PI, P2, P3 et P4
a) détermination des masses moléculaires
Les masses moléculaires des protéines PI, P2, P3 et P4 ont été déterminées de manière conventionnelle par spectrometrie de masse. Les résultats figurent au tableau I.
b) détermination des séquences d'aminoacides
La séquence N-terminale sur 40 acides aminés a été analysée au moyen d'un séquenceur 470A en phase gaz liquide (ABI, Foster City, Californie). Les acides aminés phenylhydantoïne sont analysés sur analyseur on Une 120A.
Les résultats de cette analyse sont représentés en figure 1 ci-annexée.
Les séquences PI à P4 ont été comparées aux séquences de protéines LTP de carotte (c) épinard (s) de millet (Mi) et de maïs (M).
Les pourcentages d'homologie entre ces protéines sur les 40 premiers aminoacides figurent au tableau III.
Figure imgf000015_0001
1^
TABLEAU III
LTP PI P2 P3 P4 Mi M
PI 100 100 32 53 35 63 45 37
P2 100
P3
P4
C
S i
M
Figure imgf000016_0001
On remarque une homoiogie totale pour les protéines P I et P2, tandis que les protéines P3 et P4 présentent une plus faible homoiogie entre elles.
c) Détermination de l'activité sur les transferts de lipides
Les quatre fractions protéiques et une LTP purifiée de maïs utilisée comme témoin sont testées pour leur activité de transfert de lipides, par la technique décrite par Douady, D., Grosbois, M., Guerbette, F. and Kader, 3.C. ( 1982) Biochim. Biophys. Acta 710, 143- 153. Les protéines sont incubées pendant 30 minutes à 30°C avec des mitochondπes purifiées de maïs et avec une préparation de liposomes radioactifs. Le marquage est effectué d'une part avec de la phosphatidylcholine tπtiée et d'autre part avec un li pide non transférable par ces LTP : le cholestéry le ( 1 - 14C) oléate. Après centπfugation, les mitochondries sont remises en suspension dans 1 % de Triton X 100 et l'on mesure le rapport des activités (en cpm) entre 3H et 14C pour déterminer l'activité de transfert qui est exprimée en pourcentage de phosphatidyichohne tπtiée transférée après correction de la radioactivité contaminante due au cholestéryle oléate non échangé. Les protéines peuvent être classées en deux groupes en fonction de leur capacité à transférer les phospholipides (cf. Tableau II). Les protéines P I et P2 présentent de hautes activités spécifiques, alors que
10 les activités des protéines P3 et P4 sont trois fois plus basses et proches de celles trouvées pour la LTP de maïs.
EXEMPLE 3 Effet des protéines P I, P2 et P3 sur l'initiation et maturation des embryons 5
1) Matériel et méthodes
Le milieu de culture employé pour le développement d'embryons somatiques est un milieu de culture liquide MS modifié, 0 comprenant notamment 18 g/1 de maitose et 4,6 g/1 de glycérol remplaçant le sucrose et 1 g/1 d'hydrolysat de caséine.
Ce milieu est employé à un pH de 5,8 ajusté par l'addition de soude 0, 1 N ; soit tel que, soit additionné de NOA (acide naphtoxyacétique) à des concentrations de 0,5 μM ou 5 μM. Le milieu de culture est autoclave 20 min à 120°C. Les cultures cellulaires indifférenciées, provenant de la culture cellulaire entretenue selon le protocole de l'exemple 1 , sont filtrées successivement au travers de filtres de nylon ayant des pores d'une taille de 500 μm, puis de 200 μm, de manière à ne conserver pour l'inoculation de la culture que ^ des agrégats cellulaires de taille comprise entre ces deux valeurs.
Les agrégats cellulaires indifférenciés retenus sur le second filtre sont alors lavés 3 fois avec du milieu MS modifié, puis mis en suspension dans 30 ml de ce milieu.
5 La densité cellulaire exprimée en μl de volume cellulaire par ml de milieu est déterm inée après sédimentation ( l xg) des cellules dans un tube gradué conique.
On inocule alors 80 ml de milieu de culture MS modifié, (contenant selon les cas NOA à 0, 0,5 ou 5 μM) avec une suspension d'agrégats cellulaires à une densité de 0, 1 ou 1 μl/ml, dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml.
Pour des applications expérimentales, les volumes de milieu de culture peuvent être réduits à environ 1 ml, en boîtes de microtitration 24 puits (Falcon) mais la densité cellulaire doit être respectée.
Les mi lieux de culture sont alors complémentés à To de l'expérience par des doses croissantes de la fraction protéique F I isolée selon l'exemple 1 et contenant essentiellement les LTP P I, P2 et P3. Les doses respectives sont de 2 et 10 μg/ml ; un témoin sans LTP est également cultivé.
2) Effets sur l'initiation
La figure 4 représente le développement des agrégats proembryogènes vers le premier stade globulaire de l'embryon, en présence d'auxine à des concentrations respectives de 0,5 et 5 μM pour des densités d'agrégats cellulaires de 0, 1 et 1 μl/ml exprimés en unité de volume cellulaire sédimenté (PCV = packed cell volume) par unité de volume du milieu. Les courbes de développement des structures proembryogènes sont établies en utilisant des unités arbitraires : 0 pour des PEM indifférenciés, 4 pour des embryons au stade globulaire, les valeurs 1 , 2 et 3 correspondant à des stades intermédiaires d'embryons proglobulaires dans la masse cellulaire.
Pour 0,5 μM NOA et une densité d'agrégats de 0, 1 μl/ml sans addition de LTP, les premiers globules n'apparaissent qu'après 21 jours. Ce délai d'apparition des premiers globules est raccourci à 1 jours quand le mi lieu est complémenté par 2 μg/ml de LTP, et à 6 jou quand le milieu est complémenté par 10 μg/ml de LTP. On observe le mê effet pour une densité de 1 μi/ml, avec un léger retard.
Il y a donc une accélération très importante du développeme des embryons lorsque le milieu contient une LTP.
En présence de 5 μM NOA, il n'y a pas de formation d globules dans les cultures s'il n'y a pas eu complémentation par des LTP
Pour une densité cellulaire initiale de 0, 1 μl/ml, on obtie des globules parfaitement différenciés à 21 jours dans le milieu compl menté par 10 μg/ml de fraction FI.
Avec une densité cellulaire initiale de 1 μl/ml, l'auxine e rapidement métabolisée et il y a un début de différenciation même e l'absence de LTP. La différenciation est accélérée par la complémentatio en fraction FI.
3) Résultats sur la maturation des embryons
En l'absence d'auxine, la durée totale du développement d embryons, passant par les différents stades de développement globulair coeur puis torpille, est d'environ 15 jours en présence de 10 μg/ml de LT
La figure 3 montre la progression de l'embryogenèse p comptage des proportions des embryons aux différents stades de leu développement dans un milieu ne contenant pas d'auxine, par rapport a nombre total d'embryons. La complémentation du milieu de culture e effectuée au début de la culture avec la fraction FI à une concentration e protéines de 10 μg/ml( 10)ou un volume équivalent de tampon (0). En A son représentés les résultats pour une densité cellulaire initiale de 0,1 μl/ml; e en B pour une densité initiale de 1 μl/ml. (A) à 0,1 μl PCV/ml.
A cette densité cellulaire, les embryons ne sont pas bloqués e conditions classiques de culture et peuvent atteindre le stade plantule En présence de LTP, à 1 7 jours il y a déjà présence de plantules alors que dans le contrôle, les embryons sont encore au stade torpille.
Il y a donc accélération du développement des embryons. (B) à 1 μl de PCV/ml.
Dans ces conditions de densité les embryons sont en général bloqués au stade coeur.
Sans LTP, à 17 jours, la majorité des embryons sont au stade coeur et y restent bloqués. Avec LTP la majorité des embryons sont au stade torpiile : il y a donc une accélération du développement des embryons, sans que ne se produise de blocage à un stade déterminé.
Par ailleurs, il a été montré qu'en présence d'auxine, et en l'absence de LTP, le développement des embryons est bloqué au stade globule. Par contre, grâce à l'ajout de LTP au milieu de culture, il n'est observé aucun blocage. Par exemple, l'addition de 10 μg/ml de la fraction F I au temps To dans le milieu de culture contenant l'auxine NOA à la concentration de 0,5 μM, permet d'obtenir au bout de 21 jours de culture, pour 100 embryons comptés : 59 au stade globule, 20 au stade coeur, 1 1 au stade torpille et 9 au stade plantule.
EXEMPLE 4 : Effet de la protéine P4 sur la maturation des embryons
La complémentation du milieu est réalisée selon un protocole similaire à celui décrit dans l'exemple 3, en utilisant la fraction F2, qui contient essentiellement la LTP P4.
La figure 5 montre les résultats obtenus après 21 jours de culture, en présence de NOA à la concentration de 5 μM pour une densité cellulaire initiale de 0,1 μl/ml, et en présence de différentes concentrations de la fraction F2 : 0, 1 , 2 et 3 μg/ml.
En l'absence de LTP, il n'y a pas de différenciation. Celle-ci est induite par la complémentation du milieu en fraction F2. L'effet de la fraction F2 est plus lent à apparaître. A 21 jour de culture, une faible proportion d'embryons seulement a atte int le stad coeur.
Figure imgf000021_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour favoriser la différenciation de cellules en culture, notamment en vue de la différenciation tissulaire, de Pembryo- genèse, et/ou de l'organogénèse, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture en concentration efficace pour obtenir la différenciation des cellules, au moins une protéine de transfert de lipide ou "LTP" ou un analogue de LTP.
2. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux à partir d'une culture de cellules somatiques in vitro, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de culture, en concentration efficace pour assurer l'embryogenèse, au moins une protéine de transfert de lipide ou "LTP", ou un analogue de LTP.
3. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux selon la revendication 2, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP est ajoutée dans le milieu d'induction et/ou de multiplication des agrégats de cellules proembryogènes, contenant généralement une auxine.
4. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP est ajoutée au milieu de maturation des embryons.
5. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu de maturation est sensiblement exempt d'auxine.
6. Procédé d'obtention d'embryons somatiques végétaux selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu de maturation contient une auxine, notamment en concentration nécessaire pour assurer la viabilité de la culture.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP est présente dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 1 et 100 μg/ml de milieu , de préférence ente 1 et 50 μg/ml.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la culture cellulaire est une culture de cellules de vigne.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP comporte au moins une séquence d'acides aminés présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 2.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la
LTP ou l'analogue de LTP précitée comporte au moins une séquence d'acides aminés présentant pratiquement 100% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 2.
1 1. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la LTP ou l'analogue de LTP a un poids moléculaire d'environ 9 kDa.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1, caractérisé en ce que la protéine de transfert de lipide est une LTP pouvant être obtenue à partir de cellules appartenant au même genre que les cellules en culture.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la LTP est une LTP de vigne, de carotte, d'épinard, de millet, de maïs, d'orge ou de colza.
14. Plante obtenue par le procédé selon l'une des revendi- cations 1 à 13.
15. Substance protéique constituée en particulier d'une protéine, d'un fragment de protéine ou d'un polypeptide, caractérisée en ce que ladite substance protéique comporte une séquence d'acides aminés, située de préférence à son extrémité N-terminale, présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 1 , et possédant de préférence une activité de transfert de lipides, notamment de phospholipides.
16. Substance protéique selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence d'acides aminés présentant prati- quement 100 % d'homologie avec l'une des séquences représentées à la figure 1.
17. Séquence d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 1 5 ou 16.
18. Composition comportant au moins une substance protéique selon la revendication 15 ou 16.
19. Sonde constituée par au moins un oligonucléotide, caractérisée en ce que la séquence en bases dudit oligonucléotide est déduite d'une partie de la séquence en acides aminés de la substance protéique selon la revendication 15 ou 16.
20. Sonde selon la revendication 19, caractérisée en ce que la séquence en acides aminés précitée comporte au moins 6 ou 7 acides aminés, de préférence à compter de la position 3 de l'extrémité N-terminale de la substance protéique.
21. Sonde constituée d'un mélange d'ohgonucléotides tels que définis à la revendication 19 ou 20.
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