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WO1994013686A1 - Derives glycosyl phosphotriesters et leur utilisation au niveau du systeme nerveux central - Google Patents

Derives glycosyl phosphotriesters et leur utilisation au niveau du systeme nerveux central Download PDF

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WO1994013686A1
WO1994013686A1 PCT/FR1993/001253 FR9301253W WO9413686A1 WO 1994013686 A1 WO1994013686 A1 WO 1994013686A1 FR 9301253 W FR9301253 W FR 9301253W WO 9413686 A1 WO9413686 A1 WO 9413686A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sugar
compound according
formula
integer
molecule
Prior art date
Application number
PCT/FR1993/001253
Other languages
English (en)
Inventor
Tam Huynh-Dinh
Gilles Fillion
Original Assignee
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9215196A external-priority patent/FR2699178B1/fr
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C07H11/04—Phosphates; Phosphites; Polyphosphates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings

Definitions

  • the subject of the invention is glycosyl phosphotriester derivatives of substances capable of passing the blood-brain barrier (BBB) and having pharmacological activity in the central nervous system (CNS).
  • BBB blood-brain barrier
  • CNS central nervous system
  • An important problem posed in pharmacology is that of the availability of drugs at the level of their therapeutic target, and in this area, the passage of the BBB.
  • substances include psychotropics (antidepressants, neuroleptics or anxiolytics), analgesics, or even various regulators of the reticuloendothelial system or the cardiovascular system.
  • a bad passage of the BBB constitutes a major drawback to the administration of substances which must act on the level of the central nervous system.
  • peripheral route oral, intravenous, intramuscular or intraperitoneal
  • a minimal fraction reaches the cerebral target.
  • the result is most often the induction of significant and disabling side effects.
  • the present invention aims to develop a new approach and new compounds in order to allow the targeting of molecules at the central level, by a means usable as a drug in 1 • man or animal.
  • a pharmacologically active substance which, originally or badly passes the blood-brain barrier at all, is modified by the addition of a phosphate group esterified by a sugar and a lipid chain which allow it to cross this barrier; at the level of the central nervous system (CNS), metabolic reactions make it possible to release the active molecule again in its initial state and this, in the vicinity of its targets.
  • CNS central nervous system
  • the present invention is a new family of compounds exhibiting pharmacological activity central, having the capacity to cross the BBB after administration of said compound by the peripheral route, and having the general formula I: 0
  • - x is an integer from 1 to 12;
  • - y is an integer from 1 to 6;
  • R 2 represents an alkyl group of 6 to 30 carbon atoms, saturated or not, which can carry ramifications or rings;
  • - M represents a molecule capable of acting at the central level. Mention may in particular be made of psychotropics, analgesics, regulators of the immune or cardiovascular systems; it can also represent a precursor of said molecules capable of being transformed in the CNS into the active molecule.
  • Said molecule can be, for example, a peptide or polypeptide or a glycosylated protein or not, a cyclic or heterocyclic molecule chosen for example from the different families of psychotropics. This list is not exhaustive and may include any active substance having a hydroxyl, thiol or amino radical capable of being esterified or amidified on a phosphate function.
  • 5-hydroxy N-acetyltryptamine was chosen as a model.
  • This compound is a derivative of serotonin having only a chemically reactive OH function; it is a metabolite of serotonin which is transformed in the brain by an O-methyl transferase into melatonin (CT15850).
  • Melatonin is a hormone secreted by the pineal gland; its role is quite complex: it can be considered as a mediator involved in photoperiodicity, thermoregulation, reproduction and locomotor activity in a certain number of animals (L.
  • the present invention illustrates the capacity of glycosylphosphotriester derivatives to cross the blood-brain barrier by measuring the functional effect of the brain on locomotion in mice. This effect has been compared to that of melatonin alone after central or peripheral administration. Hydroxy-N-acetyltryptamine (CT15166) has been tested in the same way.
  • glycosylated phosphotriester derivatives of the invention corresponds to formula II below:
  • R OH: the sugar is a mannose and the general formula II above is coded n ° CT16729,
  • R OH: the sugar is a glucose and the general formula II is coded n ° CT16731,
  • CT15165, CT16729 and CT16731 are N-acetyltryptamine.
  • CT15165, CT16729 and CT16731 will be used in the experiments below as glycosylated phosphotriester derivatives of melatonin.
  • any other sweet derivative in which the sugar is a C 5 or C 6 D or L sugar also meets the characteristics of the invention.
  • Another compound of the invention can be represented by formula III.
  • R, R 2 and M have the same meaning as in formula II.
  • the invention also relates to the process for the preparation of compounds of formula I. This process is a three-step process.
  • the first step is to phosphorylate a suitably protected sugar with a phosphite which is in situ coupled with N-acetyl hydroxy-5 tryptamine and oxidized to the corresponding phosphotriester.
  • the second step consists in removing the protective groups from the sugar and the phosphate to phosph ⁇ diester, isolated in the form of tetrabutyl ammonium salt.
  • the third step consists of a nucleophilic substitution of an alkyl halide with the phosphodiester salt to give the phosphotriester.
  • any variant of this reaction scheme is also possible, for example phosphorylation of 5-hydroxy trypta ine and of a long chain aliphatic alcohol and final alkylation with a halogen-sugar derivative.
  • the chemistry described here with a derivative of trivalent phosphorus can be carried out with other phosphoric derivatives of phosphotriester type (cf. oligonucleotide synthesis), phosphonate or phosphorothioate.
  • CT15165, CT16729 and CT16731 a series of hexadecylphosphates glycosyls of hydroxy-5N-acetyltryptamine (CT15165, CT16729 and CT16731) were synthesized. Their effect on locomotor 1'enfin mice was measured and compared with the effects of melatonin alone (CT15850) and the precursor of the hydroxy-5 melatonin N-acetyltryptamine (CT15166).
  • the starting compound (1) is deoxy-2-D-glucose
  • a release of HCl gas is made to arrive in a suspension of 32.26 g of 2a in 12 ml (84.5 mmol) of benzyloxyethanol at room temperature for 2 h 30 min until complete dissolution.
  • the mixture is diluted in dichloromethane, washed twice with saturated NaHCO 3 solution , once with water.
  • the residue is chromatographed on a Merck 9385 silica column eluted with dichloromethane to give 78% 3a (oil).
  • Rf 0.07 (CH 2 C1 2 ).
  • Penta-0-benzoyl-1,2,3,4,6 glucose is transformed into bromo-1 tetra-0-benzoyl-2,3,4,6 glucose according to R.K. Ness et al. (JACS, 1950, 7 ⁇ : 2200-2205).
  • TEAA buffer triethylam onium acetate 10 * 2 M pH 6.5.
  • mice used are Swiss mice weighing 15 to 18 g (Iffa Credo). The mice used are kept in a pet store in a light-dark cycle from 12 pm to 12 pm at 22 ° C., and having food and drink ad libitum.
  • IP intraperitoneal
  • the intraperitoneal (IP) injections are carried out in a volume of 0.5 ml per 20 g of animal, corresponding to 1.10 or 30 mg / kg for melatonin or the equivalent doses for the glycosylated phosphotriester derivatives.
  • the animals then remain 15 minutes at rest in their cage before starting the measurement of their motor activity in an activometer, according to a process described below.
  • Intracerebroventricular (ICV) injections are performed by freehand in the third ventricle of the right cerebral hemisphere in a maximum volume of 5 ⁇ l.
  • the injection time is 30 seconds.
  • the doses used vary from 5 to 50 ng / kg of melatonin or their equivalence for glycosylated phosphotriester derivatives.
  • the animals are observed and left to rest for 15 minutes in their cage before starting to measure their motor activity.
  • the locomotor activity of animals is measured in a six-compartment activometer in which the activity of animals is measured by their passage through two light beams arranged at 90 ° and directed towards two photoelectric cells. The only horizontal locomotion is recorded for 15, 30, 45 and 60 minutes.
  • results are expressed as a percentage of locomotion measured relative to control mice having received NaCl in an equivalent volume and measured 15, 30, 45 and 60 min after the injection, which results are obtained at variable doses of compound injected.
  • the injection is carried out under the conditions described above.
  • Figure 2 shows the results obtained for each of these doses with CT15850, CT15165 and CT15166.
  • Each of the three compounds has an effect on locomotion.
  • the ICV administration of the products studied made it possible to observe at the dose of 5 ng / kg an inhibiting effect on locomotion progressing over time for the CT15850, as well as the CT15165.
  • the melatonin precursor did not show significant effects under the same conditions.
  • melatonin itself showed a marked inhibitory effect after 60 minutes, its precursor CT15166 also induced an effect inhibitor progressing over time; it was the same with the ester derivative.
  • Intraperitoneal administration was carried out under the conditions described above.
  • N-acetyltryptamine Melatonin itself and its precursor, N-acetyltryptamine, had no significant effect in increasing or inhibiting animal locomotion during the four time periods analyzed after injection. A slight reduction in activity was observed after 45 and 60 minutes at 10 mg / kg of N-acetyltrypta ine, but this effect was not significant and it was not confirmed at the higher dose of 30 mg / kg.
  • ester derivative CT15165 reduced the activity at the three doses studied, moderately to 1 mg / kg and 10 mg / kg and very markedly, to 30 mg / kg.
  • Figure 3b indicates that 1 • intraperitoneal administration of the two derivatives CT16729 and CT16731 are as effective, injected at a dose of 30 mg of melatonin equivalent per kg of mouse as CT15165.
  • This example relates to the measurement of the intracerebral transport capacity of the derivatives of the invention for a peptide exhibiting an analgesic effect.
  • mice for example the EOPS mouse, the properties of natural enkephalin (TyrGlyGlyPheLeu) and of various derivatives after administration directly into the brain (ICV injection) or after peripheral administration (IP injection).
  • the maximum exposure time (“eut off") is fixed at 7 seconds, considered to be sufficient to indicate a state of analgesia.
  • Oxidation is carried out with a 0.1 M iodine solution in pyridine / water (addition until iodine color persists). After extraction with CH C1 2 , the crude product is chromatographed on a MERCK 7734 silica column (CH 2 Cl 2 / MeOH).
  • Aromatic Y-Aromatic F-Aromatic Benzyl 6.7 to
  • mice receive an ICV injection of 3 ⁇ g of the peptide, of 50 mg / kg by IP injection.
  • the following table indicates that the analgesic activity of the phosphodiester derivative is observed, whether the injection is carried out in ICV, with a maximum effect at 25 ⁇ g per mouse, or in PI at a dose of 30 mg / kg.

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Abstract

L'invention concerne des composés présentant une activité pharmacologique au niveau du SNC, ayant la capacité de traverser la BHE après administration dudit composé par voie périphérique, et présentant la formule générale (I), dans laquelle: A = O, N, ou S; R1 représente (1) soit: [sucre ou désoxy sucre en C5 ou C6, substitué ou non]n en série D ou L: n = 1 à 6, et la jonction entre le sucre et le phosphore étant sur l'un des hydroxyles des sommets 2, 3, 4 ou 6 ou (2) soit: (Ose) X - O - [(CH2)y - O]z - dans lequel Ose représente un sucre en C5 ou C6, D ou L, la substitution de la chaîne 0 - [CH2)y - O]z se faisant sur l'hydroxyle du sommet 1 du sucre, x est un nombre entier de 1 à 12; y est un nombre entier de 1 à 6; z est un nombre entier de 1 à 4; R2 représente un groupe alcoyle de 6 à 30 atomes de carbone, saturé ou non, pouvant porter des ramifications ou des cycles, M représente une molécule susceptible d'agir au niveau du système nerveux central.

Description

DERIVES GLYCOSYL PHOSPHOTRIESTERS ET LEUR UTILISATION AU NIVEAU DU SYSTEME NERVEUX CENTRAL
L'invention a pour objet des dérivés glycosyl phosphotriesters de substances susceptibles de passer la barrière hématoencéphalique (BHE) et possédant une activité pharmacologique au niveau du système nerveux central (SNC) .
Un problème important posé en pharmacologie est celui de la disponibilité des médicaments au niveau de leur cible thérapeutique, et dans ce domaine, le passage de la BHE. Parmi ces. substances, on peut citer les psychotropes (antidépresseurs, neuroleptiques ou anxiolytiques) , les analgésiques, voire divers régulateurs du système réticuloendothélial ou du système cardiovasculaire. Un mauvais passage de la BHE constitue un inconvénient majeur à l'administration de substances devant agir au niveau du système nerveux central.
Ces substances sont généralement administrées par voie périphérique (orale, intraveineuse, intramusculaire ou intrapéritonéale) à des doses massives avec l'objectif qu'une fraction minime atteigne la cible cérébrale. Le résultat en est le plus souvent 1'induction d'effets secondaires importants et handicapants.
Différentes stratégies ont été développées pour permettre le ciblage de substances à effet pharmacologique au niveau du système nerveux central. L'une de celles-ci, développée par N. Bodor et coll. depuis le début des années 1980, est le système redox-dihydropyridine/pyridiniu (cf. notamment les brevets Bodor : US n° 4.479.932, n° 4.540.564, n° 4.617.298, n" 4.727.079, n" 4.824.850, n° 4.829.070, n" 4.863.911, n° 4.880.816, n" 4.880.921, n' 4.900.837, ainsi que les demandes de brevets PCT WO83/03968 et WO86/00897 au nom de University of Florida.
Ce système, s'il a donné des résultats encourageants au laboratoire, se heurte à des inconvénients majeurs lors de la transposition à la conception d'un médicament : les dérivés contenant la dihydropyridine sont instables, et extrêmement sensibles à l'oxydation. En outre, ce type de composé est insoluble dans une solution aqueuse, ce qui rend problématique son administration systémique.
D'autres approches ont été développées, également par Bodor dans la demande de brevet PCT 092/00988. Dans cette approche, des dérivés phosphonates ont été développés. Ces composés ont un résidu composé d'une substance pharmacologique ayant un groupe réactif fonctionnel, lequel groupe est couplé, directement ou par un groupe de pontage, et via un lien -O-, à l'atome de phosphore du composé ; ces composés sont hydrolyses in situ, permettant la libération de la substance pharmacologique et de son site actif.
La présente invention a pour but la mise au point d'une approche nouvelle et de nouveaux composés dans le but de permettre le ciblage de molécules au niveau central, par un moyen utilisable en tant que médicament chez 1•homme ou 1'animal.
Une substance pharmacologiquement active qui, originellement passe mal ou pas du tout la barrière hématoencéphalique, est modifiée par l'adjonction d'un groupement phosphate estérifié par un sucre et une chaîne lipidique qui lui permettent de franchir cette barrière ; au niveau du système nerveux central (SNC) , des réactions métaboliques permettent de libérer à nouveau la molécule active dans son état initial et ce, au voisinage de ses cibles.
La présente invention est une nouvelle famille de composés présentant une activité pharmacologique centrale, ayant la capacité de traverser la BHE après administration dudit composé par voie périphérique, et présentant la formule I générale : 0
II
R.,0 - P - AM
I
0R2 dans laquelle : A = O, N ou S
- R-, représente
1) soit : [sucre ou désoxy sucre en C5 à C6, substitué ou non]n, en série D ou L ; n = 1 à 6, et la jonction entre le sucre et le phosphore étant sur 1'un des hydroxyles des sommets 2, 3, 4, 6, ou
2) soit : (Ose) x - 0 - [(CH2)y - 0]z - dans lequel Ose représente un sucre en C5 ou C6, D ou L, la substitution de la chaîne 0 - [(CH2)y - 0]2 se faisant sur le sommet 1 du sucre.
- x est un nombre entier de 1 à 12 ;
- y est un nombre entier de 1 à 6 ;
- z est un nombre entier de 1 à 4 ;
- R2 représente un groupe alcoyle de 6 à 30 atomes de carbone, saturé ou non, pouvant porter des ramifications ou des cycles ;
- M représente une molécule susceptible d'agir au niveau central. On peut citer en particulier les psychotropes, les analgésiques, les régulateurs des systèmes immunitaires ou cardio-vasculaires ; il peut également représenter un précurseur desdites molécules susceptibles d'être transformées dans le SNC en la molécule active.
Ladite molécule peut être, par exemple, un peptide ou polypeptide ou une protéine glycosylée ou non, une molécule cyclique ou hétérocyclique choisie par exemple dans les différentes familles de psychotropes. Cette liste n'est pas limitative et peut inclure tout substance active ayant un radical hydroxyle, thiol ou aminé susceptible d'être estérifie ou amidifié sur une fonction phosphate.
Pour démontrer l'efficacité de cette méthodologie, l'hydroxy-5 N-acétyltryptamine a été choisie comme modèle. Ce composé est un dérivé de la sérotonine ne présentant qu'une fonction OH chimiquement réactive ; c'est un métabolite de la sérotonine qui est transformé dans le cerveau par une O-méthyl transférase en mélatonine (CT15850) . La mélatonine est une hormone sécrétée par la glande pinéale ; son rôle est assez complexe : elle peut être considérée comme un médiateur impliqué dans la photopériodicité, la thermorégulation, la reproduction et l'activité locomotrice chez un certain nombre d'animaux (L. Tamar in, C.J. Baird and O.F.X. Almeida, Science (1985), 227:714-720 ; S.M. Reppert, D.R. Weaver, S.A. Rivkees and E.G. Stopa, Science (1988), 242.78-81 et V.M. Cassone, TINS (1990), 1_3:457-467 ; D.N. Kranse and M.L. Dubocovitch, TINS (1990), 2^3:464-470. Chez l'homme, la mélatonine a été utilisée pour resynchroniser les rythmes circadiens et pour combattre les effets physiologiques et psychologiques du décalage horaire (jet lag) ; d'autre part, des travaux récents semblent indiquer en plus un rôle immunomodulateur et anti-stress (A. Conti and G. Maestroni, Neuroimmunomodulation in pharmacology, 2nd Course of the Fédération of the European Pharmacological Sociétés, 5-7 February 1992, PARIS). Quand elle est administrée par voie intrapéritonéale (IP) la mélatonine à forte concentration (30 mg/kg) n'a pas d'effet sur la locomotion de la souris (Ducobovitch et al., 1990, Eur. J. Pharmacol. 182:313-325) , alors qu'une injection intracérébrale de faible dose (0.1 à 100 ng) directement dans le noyau accumbens diminue l'activité locomotrice (Gaffori et Van Ree, 1985, Neuropharmacology, 24:237-244) . Ces observations suggèrent fortement un très faible passage de la mélatonine à travers la barrière hématoméningée, après administration périphérique.
La présente invention illustre la capacité des dérivés glycosylphosphotriesters de traverser la barrière hématoméningée et ce, par mesure de l'effet fonctionnel cérébral sur la locomotion des souris. Cet effet a été comparé à celui de la mélatonine seule après administration centrale ou périphérique. La hydroxy-N-acétyltryptamine (CT15166) , a été testé de la même façon.
Un groupe de dérivés phosphotriesters glycosylés de l'invention répond à la formule II suivante :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle :
- R2 a la même définition que dans la formule I ci- dessus et/ou
- R a les signification suivantes :
. R = H : le sucre est alors un désoxyglucose et la formule II générale est codée sous le n° CT15165,
. R = OH : le sucre est un mannose et la formule II générale ci-dessus est codée n° CT16729,
. R = OH : le sucre est un glucose et la formule II générale est codée n° CT16731,
- M est la N-acétyltryptamine. Les trois dérivés CT15165, CT16729 et CT16731 seront utilisés dans les expériences ci-dessous comme dérivés phosphotriesters glycosylés de la mélatonine.
Cependant, tout autre dérivé sucré dans lequel le sucre est un sucre en C5 ou en C6 D ou L répond également aux caractéristiques de l'invention. Parmi celles-ci, on peut citer le fructose, le fucose, les amino hexoses pour les hexoses, ou l'arabinose, le xylose, le ribose, le désoxyribose pour les pentoses.
Un autre composé de 1•invention peut être représenté par la formule III.
Figure imgf000008_0001
dans laquelle R, R2 et M ont la même signification que dans la formule II.
L'invention concerne également le procédé de préparation de composés de formule I. Ce procédé est un procédé en trois étapes.
La première étape consiste à phosphoryler un sucre convenablement protégé avec un phosphite qui est in situ couplé avec la N-acétyl hydroxy-5 tryptamine et oxydé en phosphotriester correspondant.
La deuxième étape consiste à enlever les groupements protecteurs du sucre et du phosphate en phosphόdiester, isolé sous forme de sel de tétrabutyl ammonium. La troisième étape consiste en une substitution nucléophile d'un halogénure d'alcoyle avec le sel du phosphodiester pour donner le phosphotriester.
Il est bien entendu que toute variante de ce schéma réactionnel est aussi possible, par exemple phosphorylation de l'hydroxy-5 trypta ine et d'un alcool aliphatique à longue chaîne et alcoylation finale avec un dérivé halogéno-sucre. De même, la chimie décrite ici avec un dérivé du phosphore trivalent (chlorophosphora idite) peut être réalisée avec d'autres dérivés phosphoriques de type phosphotriester (cf. synthèse oligonucléotidique) , phosphonate ou phosphorothioate.
Un exemple particulier de la synthèse des composés CT15165, CT16729 et CT16731 sera donné dans l'exemple I ci-dessous.
Tous les composés obtenus ainsi que les composés intermédiaires ont des caractéristiques spectrales (résonance magnétique nucléaire, ultra-violet, SM) en accord avec les formules proposées. La pureté en a été testée par chromatographie en HPLC (tableau I) .
Les exemples suivants sont destinés à montrer les effets particulièrement avantageux des composés de 1'invention ; une série de glycosyles hexadécylphosphates de 1'hydroxy-5N-acétyltryptamine (CT15165, CT16729 et CT16731) ont été synthétisés. Leur effet sur 1'activité locomotrice chez la souris a été mesuré et comparé avec les effets de la mélatonine seule '(CT15850) et le précurseur de la mélatonine hydroxy-5 N-acétyltryptamine (CT15166) .
- EXEMPLE I : Synthèse des dérivés CT15165, CT16729 et CT16731 :
A cette fin, on part d'un sucre (désoxyglucose, mannose ou glucose) qui est couplé à une hydroxy-5-N- acétyl tryptamine par un phosphate. La chaîne hexadécyle est ensuite condensée sur cette structure phosphodiester par l'intermédiaire d'une réaction de substitution nucléophile. , . ,
La chimie du phosphore trivalent (phosphoramidite) a été utilisée afin de permettre des temps de réaction beaucoup plus rapides que ceux du phosphore pentavalent.
Les différentes étapes sont les suivantes et illustrées dans la Figure 1.
Dans ce schéma, a) si R = H :
- le composé de départ (1) est le désoxy-2-D-glucose,
- le composé (6) est le CT15164 (6a) ,
- le composé (7) est le CT15165 (7a) , b) si R = OH, situé à "l'intérieur" du cycle :
- le composé (1) est le mannose,
- le composé (6) est le CT16728 (6b) ,
- le composé (7) est le CT16729 (7b) , c) si R = OH, situé à "l'extérieur" du cycle :
- le composé (1) est le glucose,
- le composé (6) est le CT16730 (6c) ,
- le composé (7) est le CT16731 (7c) .
Première étape : Protection du sucre, et phosphorylation avec un phosphyte couplé avec la N- acétyl hydroxy-5 tryptamine et oxydation en phosphotriester : a) Synthèse de Tétra-O-benzoyl-1,3,4,6 désoxy-2-D- glucose (2a) :
10 g (61 mmoles) de désoxy-2-D-glucose co-évaporés avec la pyridine sont redissous dans 100 ml de pyridine anhydre, on ajoute goutte à goutte 58 ml (70,24 g; 500 mmoles) de chlorure de benzoyle en maintenant la température à 0°C. On laisse une nuit à 4°C, puis on ajoute à 0°C du méthanol jusqu'à dissolution complète du précipité formé. Le solvant est évaporé à sec et le résidu est repris dans du dichlorométhane, lavé 2 fois avec une solution saturée de NaHC03, puis à l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SO[ et évaporée à sec pour donner un résidu (32,46 g, 92%) qui est lavé plusieurs fois avec de 1 'éther de pétrole. Rf = 0,27 (AcOEt-hexane, 1-2) . F = 131°C. b) Synthèse de Tri-O-benzoyl-3,4,6 benzyloxy-2 éthyl désoxy-2-D-glucopyranoside (3a) :
On fait arriver un dégagement de HC1 gazeux dans une suspension de 32,26 g de 2a dans 12 ml (84,5 mmoles) , de benzyloxyéthanol à température ambiante pendant 2 h 30 jusqu'à dissolution complète. Le mélange est dilué dans du dichlorométhane, lavé deux fois avec une solution saturée de NaHC03, une fois à l'eau. Le résidu est chromatographié sur colonne de silice Merck 9385 éluée avec du dichlorométhane pour donner 78% de 3a (huile) . Rf = 0,07 (CH2C12) .
RMN (CDC13, ppm) = 1H: 5,05 (H-,) , 2,0 et 2,60 (H2, H2') , 5,80 (H3), 5,6 (H4), 3,9 (H5) , 4,45 (H6, H6' ) , 3,6-3,75 (CH2) , 4,55 (CH2<>) . c) Synthèse de Tri-O-benzoyl-3,4,6 hydroxy-2 éthyl désoxy-2-D glucopyranoside (4a) :
18,5 g (30 mmoles) de 3a en solution dans 250 ml d'acétate d'éthyle sont hydrogénés catalytiquement en présence de Pd-C (10%) pendant 5 h à 30 psi.
Après filtration sur Celite, le solvant est évaporé à sec et le résidu chromatographié sur colonne de silice éluée avec du dichlorométhane pour donner 19,4 g (86%) de 4a. Rf = 0,49 (MeOH-CH2Cl2, 5-95). F = 42-46°C. SM (IC, NH3) = 538 (M + 18) . RMN (CDCl3, ppm) : 1H: 5,1 (HT) , 2,05 et 2,55 (H2, H2' ) , 5,75 (H3) , 5,6 (H4) , 4,4 (H6, H6') , 3,6 (CH2CH2OH) , 3,8 (CH2CH2OH) . d) Synthèse de 5-cyanoéthyl (tri-O-benzoyl 3,4,6 désoxy-2-D-glucopyranosidyl) éthyl-2 (N-acétγl tryptarainyl) -5 phosphate (5a) :
A une solution de 2,29 g (4,4 mmoles) de 4a dans 20 ml d'acétonitrile anhydre et 3,3 ml (2,44 g, 19 mmoles) de diisopropyl éthylamine on ajoute sous atmosphère d'azote 975 μl (1,034 g, 4,4 mmoles) de β- cyanoéthyl N,N diisopropyl chlorophosphora idite. On laisse pendant 15 mn à température ambiante puis on ajoute une solution de 1,284 g (18,3 mmoles) de tétrazole et 800 g (3,67 mmoles) d'hydrox-5-N- acétyltrypta ine dissous dans 15 ml d'acétonitrile anhydre. Après 1 h à température ambiante, on oxyde avec 30 ml d'une solution d'iode 0,1 M (H20-pyridine- THF, 1-10-40) dilué avec du dichlorométhane et lavé deux fois avec une solution de NaHS03 (5%) et une fois à l'eau. Après évaporation à sec, le résidu est précipité par 1 'éther de pétrole et chromatographié sur colonne de silice Merck 7734 éluée avec du dichlorométhane enrichi en méthanol (0-5%) . Une deuxième chromatographié -sur colonne de Séphadex LH-20 éluée avec un mélange THF-MeOH (95-5) donne 1,78 g 57% de 5a. Rf 0,40 (MeOH-CH2Cl2, 75-92,5).
. Deuxième étape : Synthèse des CT15164, CT16728 et
CT16730 a) Synthèse de (désoxy-2-D-glucopyranosidyl) éthyl-2
(N-acétyl trypta inyl)-5 phosphate (6a) (CT15164) :
On traite 900 mg (1,06 mmoles) de 5a avec 50 ml de méthylate de sodium (1%) pendant 10 mn à température ambiante. Après neutralisation avec une résine Do ex AG-50 X8, le solvant est filtré et évaporé à sec pour donner un résidu qui est purifié sur colonne de silice Lichroprep RP-18 (Merck 9303) éluée avec de l'eau graduellement enrichie en méthanol (0-100%) pour donner 457 mg (89%) de 6a sous forme de sel d'ammonium. F = 139°C. Rf = 0,62 (isopropanol-NH4OH-H20, 7-1-2) .
Analyse C20H32O10N3P, H20 (C, H, N) : Cale. 45,89, 6,50, 8,03 ; ïr. 45,66, 6,53, 7,92. HPLC : Rt 11,07 mn.
SM (FAB+) : 527,3 (M + Na+) , 506,2 (M + H)+. UV (MeOH) : 222 (27000), 277 (6000) . RMN (tableau) . b) Synthèse de (D-Mannopyranosidyl) éthyl-2 (N-acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (6b) (CT16728) :
La même séquence de réactions est effectuée à partir de 900 mg (1,406 mmoles) l'hydroxy-2 éthyl-D-α- mannopyranoside 4b (Rf = 0.62, CH2Cl2-MeOH, 95-5) (Y. Hénin et al., J. Med. Chem. 1191, 3_4: 1830-1837 ; C. Gouyette et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30:6019-6022) pour donner 40% de 5b. (Rf = 0.57, CH2Cl2-MeOH, 90-10) qui est déprotégé par le méthylate en 6b (95%) . Ce phosphate est échangé sous forme N(Bu)4+ pour la suite des réactions. (Rf = 0.78, isopropranol-NH40H-H20, 7-1-2) SM (FAB+) : 987,4 (M + N (Bu)4)+. UV (MeOH) : 223 (31000) , 276 (6800) .
Analyse 03^40^3?, 1/2 H20. (C, H, N, P) : Cale. 57,29, 8,62, 5,57, 4,11 ; Tr. 57,27, 8,67, 5,35, 4,28. HPLC: Rt 11,07 mn. RMN (tableau I) . c) Synthèse de (D-glucopyranosidyl)éthyl-2 (N-acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (6c) (CT16730) :
Le penta-0-benzoyl-l,2, 3,4 , 6 glucose est transformé en bromo-1 tétra-0-benzoyl-2 , 3 ,4 , 6 glucose suivant R.K. Ness et al. (JACS, 1950, 7^:2200-2205) .
On laisse tourner à température ambiante pendant 1 h 30 une suspension de 4,6 g de bro o-glucose (7 mmoles) avec 2,14 g de Hg(CN)2, 3,05 g de Hg(Br)2, 670 mg de tamis moléculaire 4Â et 1 ml de benzyloxyéthanol dans 40 ml d'un mélange toluène-nitrométhane (1/1) . Après filtration, la solution est diluée avec du dichlorométhane, lavée 3 fois avec H20, NaHC03, H20. Après chromatographié sur colonne de silice Merck 9385 avec du dichlorométhane, on obtient 60% de 3c. (Rf = 0.35, AcEt-Hexane, 1-2) (huile) qui est hydrogéné sur Pd/C pour donner 85% de 4c. (Rf = 0.76, CH2Cl2-Me0H, 95-5) .
La suite de réactions analogues que pour les séries précédentes donne 5c (9%) Rf = 0.42 (CHC12 - MeOH, 10-90) qui est déprotégée en 6c (78%) . (Rf = 0.40, isopropranol-NH4 OH-H20, 7-1-2)
Analyse C36H64011N3P, 1/2 H20 (C, H, N) : Cale. 57,29, 8,62, 5,57; Tr. 57,20, 8,78, 5,60. HPLC: Rt: 7,05 mn. SM (FAB+) : 987,5 (M + N(Bu)4)+. RMN (tableau) .
Troisième étape : substitution nucléophile d'un halogène d'alcoyle ; synthèse des CT15165, CT16729, et CT16731. a) Hexadécyl (désoxy-2-D-glucopyranosidyl)éthyl-2 (N- acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (7a) (CT15165) :
On passe le phosphodiester 6a sur une colonne de Dowex AG-50 X8, N(Butyl)+ pour obtenir le sel de tétrabutylammonium. 260 mg (0,537 mmoles) du phosphodiester dans 17 ml de CH3CN anhydre et'^1,7 ml (1,9 g, 5,4 mmoles) d'iodo-16 hexadécane sont chauffés à 80°C pendant une nuit. Après évaporâtion du solvant, le résidu est précipité avec l'éther de pétrole et chromatographié sur colonne de silice Merck 9385 éluée au dichlorométhane enrichi progressivement au méthanol pour donner 86% de 7a. (Rf = 0.44, CH2Cl2-Me0H, 80-20).
Analyse C36H61O10N2P, 1/2 H20 ; (C, H, N, F) : Cale. 59,92, 8,60, 3,88, 4,30 ; Tr. 60,06, 8,66, 3,89, 3,97. HPLC: Rt 15,35 mn. SM (FAB+) : 735,7 (M + Na+) . RMN (tableau) . b) Synthèse de hexadécyl (α-D-mannopyranosidyl)éthyl-2 (N-acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (7b) (CT16729) :
Le même protocole que pour 7a sur 250 mg de 6b (0,336 mmoles) donne 74% de 7b. (Rf = 0,32, CH2C12- MeOH, 80-20) .
Analyse Cj^^O^^P, H20 (C, H, N, P) . Cale: 57,91, 8,44, 3,75, 4,16 ; Tr. 58,51, 8,45, 3,82, 4,59. UV (MeOH) : 224 (34000) , 286 (5700) .
HPLC: Rt 13,19 mn. SM (FAB+) : 751,6 (M + Na+) , 728 (M+) . RMN (tableau 1) . c) Synthèse de hexadécyl (D-glucopyranosidyl-éthyl-2 (N-acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (7c) (CT16731) :
La réaction avec 1 ' iodohexadécane sur 6c donne 69% de 7c. (Rf = 0.35, CH2C12- MeOH, 80-20) .
Analyse C^H^N^E, H20 (C, H, N, PJ .Calc: 57,91, 8,44, 3,75, 4,16; Tr.: 58,45, 8,5, 3,83, 4,12. HPLC: Rt: 13,11 mn. SM (FAB+) : 751,8 (M + Na+) , 729,7 (MH+) , 728 (M+) . RMN (tableau 1) . Conditions chromatographiques HPLC :
Tampon TEAA : acétate de triéthylam onium 10*2 M pH 6,5.
Acétonitrile Merck (ACN) .
Durée du gradient : 20 minutes.
Figure imgf000015_0001
Colonne Nucléosil 5-C18 (Macherey-Nagel) (15 cm x 0, 46 cm) .
Débit 1 ml/min.
- EXEMPLE II : Mesure de l'activité pharmacologique des cinq produits CT15165, CT16729, CT16731, CT15850 et CT15166 sur l'activité locomotrice des souris :
Les animaux utilisés sont des souris Swiss de 15 à 18 g (Iffa Credo) . Les souris utilisées sont conservées en animalerie dans un cycle lumière-obscurité 12 h-12 h à 22 °C, et disposant de nourriture et de boisson ad libitum.
Les injections intrapéritonéales (IP) sont effectuées sous un volume de 0,5 ml pour 20 g d'animal, correspondant à 1,10 ou 30 mg/kg pour le mélatonine ou les doses équivalentes pour les dérivés phosphotriesters glycosylés. Les animaux restent ensuite 15 mn au repos dans leur cage avant de commencer la mesure de leur activité motrice dans un activomètre, selon un procédé décrit ci-dessous.
Les injections intracérébroventriculaires (ICV) sont réalisées à main levée dans le troisième ventricule de l'hémisphère cérébrale droit sous un volume maximum de 5 μl . Le temps de l'injection est de 30 secondes. Les doses utilisées varient de 5 à 50 ng/kg de mélatonine ou de leur équivalence pour les dérivés phosphotriesters glycosylés.
Les animaux sont observés et laissés au repos pendant 15 mn dans leur cage avant de commencer la mesure de leur activité motrice.
L'activité locomotrice des animaux est mesurée dans un activomètre à six compartiments dans lequel l'activité des animaux est mesurée par leur passage dans deux faisceaux lumineux disposés à 90° et dirigés vers deux cellules photoélectriques. La seule locomotion horizontale est enregistrée et ce, pendant 15, 30, 45 et 60 mn.
Les résultats sont exprimés en pourcentage de locomotion mesurée par rapport à des souris témoins ayant reçu du NaCl sous un volume équivalent et mesuré 15, 30, 45 et 60 mn après l'injection, lesquels résultats sont obtenus à des doses variables de composé injecté.
EXEMPLE III : Comparaison des effets de la mélatonine, de la N-acétyltryptamine et du dérivé glycosyl phosphotriester de la N-acétyltryptamine de formules suivantes :
. dérivés phosphotriesters : CT15165 a) R = H desoxyglucose CT16729 b) R = OH annose CT16731 c) R = OH glucose
Figure imgf000017_0001
CT15850 mélatonine :
Figure imgf000017_0002
CT15166 hydroxy-5N-acétyltryptamine
Figure imgf000017_0003
3.1. Injection intracérébroventriculaire (ICV) :
L'injection est réalisée dans les conditions décrites ci-dessus.
Deux doses ont été utilisées 5 ou 50 ng/kg de poids d'animal, en équivalent mélatonine.
La Figure 2 indique les résultats obtenus pour chacune de ces doses avec CT15850, CT15165 et CT15166.
Chacun des trois composés a un effet sur la locomotion.
L'administration ICV des produits étudiés a permis d'observer à la dose de 5 ng/kg un effet inhibiteur de la locomotion progressant avec le temps pour le CT15850, ainsi que le CT15165. Le précurseur de la mélatonine n'a pas montré dans les mêmes conditions d'effet significatif.
A 50 ng/kg, le mélatonine elle-même a montré un effet inhibiteur marqué après 60 minutes, son précurseur CT15166 a également induit un effet inhibiteur progressant avec le temps ; il en a été de même avec le dérivé ester.
3.2. Administration en périphérie :
Une administration intrapéritonéale a été réalisée dans les conditions décrites plus haut.
Quatre doses ont été utilisées : 0.01, 1, 10 et 30 mg/kg.
Les résultats des tests de locomotion obtenus sont représentés dans la Figure 3a.
La mélatonine elle-même et son précurseur la N- acétyltryptamine, n'ont eu aucun effet significatif pour augmenter ou inhiber la locomotion des animaux et ce, aux quatre périodes de temps analysées après injection. Une faible réduction de l'activité a été observée après 45 et 60 minutes à 10 mg/kg de N- acétyltrypta ine, mais cet effet n'était pas significatif et il n'a pas été confirmé à la dose supérieure de 30 mg/kg.
Au contraire, le dérivé ester CT15165 a réduit l'activité aux trois doses étudiées, de façon modérée à 1 mg/kg et 10 mg/kg et de façon très marquée, à 30 mg/kg.
La Figure 3b indique que 1•administration intrapéritonéale des deux dérivés CT16729 et CT16731 sont aussi efficaces, injectés à la dose de 30 mg d'équivalent mélatonine par kg de souris que le CT15165.
Les résultats obtenus dans cette série expérimentale ont montré que par voie intrapéritonéale, le seul dérivé ester était capable d'inhiber l'activité locomotrice chez la souris aux 3 doses étudiées (1, 10, 30 mg/kg) , alors que dans les mêmes conditions, aucun effet significatif n'était observé pour la mélatonine elle-même ou son précurseur N-acétyltryptamine. Ces résultats suggèrent fortement que le seul dérivé ester a été capable de franchir la barrière hématoencéphalique pour induire les effets locomoteurs. Cette hypothèse est confortée par le fait que les trois substances étudiées réduisent 1'activité locomotrice lorsqu'elles sont administrées directement au niveau central.
Cette dernière observation indique aussi que les effets locomoteurs observés sont bien d'origine centrale puisque la mélatonine et son précurseur n'ont pas eu d'effet après leur administration au niveau périphérique.
La grande différence que 1'on peut observer entre les doses actives du dérivé ester lorsqu'il est administré ICV (5 à 50 ng/kg) et IP (1 à 30 mg/kg) provient vraisemblablement du fait que ce produit lipophile est séquestré de façon extrêmement importante dans un grand nombre de compartiments périphériques ; en dépit de cette inactivation par sa séquestration ou un métabolisme rapide qui le dénature sous sa forme de mélatonine native, un pourcentage faible mais fonctionnellement très significatif est capable d'atteindre des cibles cérébrales. Dans les mêmes conditions, la mélatonine elle-même ne montre aucune activité à ces mêmes doses.
Ces résultats indiquent donc qu'une molécule active au niveau central mais dont les propriétés physicochimiques préviennent le passage de la BHE peut recevoir un groupement chimique lui conférant la propriété de passer cet obstacle.
Sur la base de ces résultats, il n'a pas été recherché si l'ester pouvait agir en tant que tel ou en tant que mélatonine générée par la dégradation de cette molécule. Cependant, il y a tout lieu de penser que la molécule est métabolisée puisque le cerveau contient vraisemblablement en grand nombre les enzymes nécessaires à cette opération. Cet exemple n'est pas limitatif de l'importance de 1•invention en terme de moyen nouveau pour cibler une molécule effectrice au niveau de récepteurs spécifiques du SNC.
- EXEMPLE IV : Comparaison des effets d'un peptide analgésique et de ses dérivés glycosylphosphoesters sur les manifestations de la douleur :
Cet exemple est relatif à la mesure de la capacité de transport intracérébral des dérivés de 1'invention pour un peptide présentant un effet analgésique.
Les essais entrepris ont consisté à rechercher chez la souris, par exemple la souris EOPS les propriétés de 1'enképhaline naturelle (TyrGlyGlyPheLeu) et de divers dérivés après administration directement dans le cerveau (injection ICV) ou après administration périphérique (injection IP) .
La mesure de l'activité analgésique de ces substances est mesurée par le test de tail-flick. Brièvement, les animaux sont placés dans une cage individuelle où ils ne peuvent se déplacer. Leur queue est alors exposée pendant une courte durée (maximum 7 secondes) sous un faisceau lumineux dont l'intensité est contrôlée (1=8OmA) et correspond à un apport significatif de chaleur. Le temps mis par la souris pour retirer la queue en dehors du faisceau par un mouvement bref (tail-flick) est mesuré (deux ou trois secondes chez un animal normal) .
L'animal qui reçoit un analgésique réagit en un temps plus long : on fixe le temps maximum d'exposition ("eut off") à 7 secondes, considéré comme suffisant pour indiquer un état d'analgésie.
Dans cette étude, l'effet d'injections IP ou ICV de la [D-Ala2-D-Leu5] enképhaline amide YAGFL-NH2 et du dérivé désoxy-2 glycoside phosphodiester ont été comparés. Le peptide YAGFL-NH2 est proche de 1'enképhaline naturelle TyrGlyGlyPheLeu (YGGFL) .
Méthode d'obtention des dérivés diesters et triesters de YAGFL-NH2 :
Elle se fait par les différentes étapes décrites ci-dessous.
Première étape :
H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-NH2 > Z-Tyr-D-Ala-Gly-
Phe-D-Leu-NH2 (1)
95 mg de (D-Ala-D-Leu5) enképhaline amide (0,31015 mmole) sont mis en solution dans 5,5 ml d'eau et 43 μl de triéthylamine (1 éq) . La réaction est suivie en HPLC : CH3CN/CH3COO"NH4 +0.05 M ; λ = 230 nm : colonne C18. On injecte 1 μl du mélange reactionnel dans un gradient I520n>100% tr=9,55 mn) .
On additionne 78 mg (0,31015 mmole) de N-(benzyloxycarbonyoxy) succinimide dans 5,5 ml de méthanol. Agitation pendant 1 h 30. Injection 1 μl du mélange reactionnel tr=l,88 mn (hydroxysuccinimide libérée) tr=12,4 mn Z(D-Ala2-D-Leu5) enképhaline amide. Le mélange reactionnel est évaporé à sec et purifié sur colonne de Sephadex LH 20 (THF 80/MeOH 20) . On obtient 198 mg de (1) (84%) . ccm: 1O% MeOH/CH2Cl2 ; Rf : 0,25, RMN H-, (DMSO-d6) :<5(ppm), CH3 L : 0,5 et 0,7 (doublet), CH3A : 1 (doublet), CH7L : 1,1, CH2/?L : 1,2, CH2;5Y : 2,5 et 2,7, CH2 F : 2,8, CH2G : 3,5, CHffL : 3,9, CH.-A : 4,1, CHβY : 4,2, CHαF : 4,3, CH2 Benzyl : 4,8, Aromatiques Y : 6,4 et 6,9, Aromatiques F : 7 à 7,2, Aromatiques Benzyl, NH Y : 7,3, NH F-NH G-NH L : 7,9 à 8,1, NH A-OH Y : 9
Deuxième étape : Z-Tyr-vD-Ala-Gly-Phe-D-Leu-NH2
AGF -NH.
Figure imgf000022_0001
OBz (2)
272 mg de (hydroxy-2 éthyl) -désoxy-2-D-glucopyrannoside perbenzoylé (0,523 mmole) sont dissous dans 2,3 ml d'acétonitrile anhydre et 387 μl de diisopropyléthylamine. On ajoute 120 μl (0,541 mmole) de 2 cyanoéthyl N,N diisopropylchlorophosphoramidite à l'aide , d'une seringue et agite à la température ambiante 30 mn (CCM : MeOH 05/CH2Cl2 95 Rf : 0,8) .
Après addition de 180 mg de tétrazole (2,535 mmole), de 198 mg de (1) (0,2816 mmole) et 3,4 ml d'acétonitrile anhydre, on remet le milieu sous azote et laisse agiter pendant 1 h 30 (CCM : MeOH 05/CH2Cl2 95 Rf : 0,2) .
On oxyde avec une solution d'iode 0,1 M dans pyridine/eau (addition jusqu'à persistance de la coloration d'iode). Après extraction avec CH C12, le produit brut est chromatographié sur colonne de silice MERCK 7734 (CH2Cl2/MeOH) .
(CCM : MeOH 10/CH2C12 90 Rf : 0,3) . On obtient 227 mg de (2) (60%) .
Les caractéristiques en sont les suivantes : SM (FAB+) : 1337, RMN H. (DMS0-d6) : δ (ppm) , CH3L : 0,7 et 0,8, CH3A : 1,15, CHyL> : 1,2, CH/3L : 1,4, H'2H"2 : 2,1 et 2,45, CH23Y : 2,7 et 2,9, CH23F : 2,9, CH2G : 3,7, [C2] chaîne : 3,7 ; 3,9 et 4,4, CHαL : 4,1, CHαA-CHαY : 4,3, CHαF : 4,5, H'3 : 5,2, H'-, : 5,6, Cyanoéthyl : 4,4 et 5,5, CH2 Benzyl : 4,9, Aromatiques Y : 6,4 et 6,9, Aromatiques F-Aromatiques Benzyl-Aromatiques Benzoyle : 6,9 à 8, NH Y : 7,3, NH F : 7,6, NH G : 8,1, NH L : 8,15, NH A : 8,25.
Troisième étape :
Figure imgf000023_0001
227 mg (0,1698 mmole) de (2) sont solubilisés dans 9,2 ml de méthanol et 1,65 ml d'une solution de methylate de sodium 1% (0,3054 mmole). On agite pendant 2 h (CCM: Isopropanol 70/ammoniaque 10/eau 20 Rf : 0,7) puis neutralise avec une résine H+ AG50 -X8. La purification sur Sephadex G10, puis HPLC (CH3CN/CH3COO"NH4 + 0,05 M, C18 : λ=230 nm; gradient 0 20 E2>60% tr=13,5 mn) donne 112 mg (67%) de (3). Quatrième étape :
Figure imgf000023_0002
70 mg de ( 3 ) ( 0 , 07078 mmole) sont solubilisés dans 8 ml de méthanol et hydrogénés sur palladium-C pendant 1 h (CCM : Isopropanol 70/ammoniaque 10/eau 20 Rf : 0,6) .
Après filtration et évaporation du solvant, on obtient
56 mg de produit (92%) de (4) , dont les caractéristiques sont les suivantes :
SM (FAB+) : 838, RMN E^ (DMSO-d6) : δ (ppm) , CH3L : 0,7 et 0,8, CH3A : 1,15, CH7L : 1,25, CH2/3L : 1,4, H'2H"2 :
1,4 et 1,9, CH /3Y-CH2/3F 2,8 à 3, H'4 : 3, H'3 : 3,6, CH2G : 3,6, CHαL 4,1, CHjA : 4,3, CHaY : 4, CHαF : 4,5, H', : 4,8, OHc,4 4,9, Aromatiques Y-Aromatiques F : 6,9 à 7,4, NH F 8,1, NH G : 8,35, NH L : 8,2, NH A : 8,75, NH2Y : 7,9 à 8,3 Cinquième étape :
Figure imgf000024_0001
112 mg de (3) (0,1132 mmole) sont échangés sur résine Dowex (tétrabutylammonium) . Après lyophilisation, on obtient 137 mg de sel qui est solubilisé dans 3,5 ml CH3CN anhydre. On ajoute 355 μl d' iodohéxadécane (1,13 mmole) et agite à 80°C la nuit. (CCM : 15 MeOH/85 CH C12 Rf : 0,5) . Après évaporation et trituration à l'éther de pétrole, on purifie sur Sephadex LH 20 (THF 80/MeOH 20) et obtient 62 mg de produit (45%) , dont les caractéristiques sont les suivantes :
SM (FAB+) : 1197, RMN H-, (DMSO-d6) : δ (ppm) , CH3L : 0,5 et 0,6 (doublet) , CH3[C16] : 0,65 (triplet) , CH3A : 0,95 (doublet) , CH2[C16] : 1 à 1,15 ; 1,4 ; 3,9, CH23L : 1,2, H'2H"2 : 1,3 et 1,7, CH2/3Y : 2,55 à 2,75, CH2/JF : 3,3 et
3,45, CH2G : 3,5, CHaL : 3,9, CHαY et A : 4,1, CHαF :
4,3, H1, : 4,65, OH : 4,6, OH : 4,75, CH2 benzyl : 4,8,
Aromatiques Y-Aromatiques F-Aromatiques Benzyl : 6,7 à
7,2, NH Y : 7,35, NH F : 7,9, NH G : 8, NH L : 7,95, NH
A : 8,1.
Sixième étape :
Figure imgf000025_0001
62 mg de (5) (0,0518 mmole) sont dissous dans 4 ml de méthanol et hydrogénés sur palladium-C pendant 1 heure. (CCM : 15 MeOH/85 CH2C12 Rf : 0,15) . La purification sur Sephadex LH 20 (THF 80/MeOH 20) donne 38 mg de (6) (70%) , dont les caractéristiques sont les suivantes :
SM (FAB+) : 1064, RMN H, (DMSO-d6) : δ (ppm) , CH3L : 0,6 et 0,7r CH3[C16] : 0,75, CH3A : 1,05, CH2[C16] : 1 à 1,15 ; 1,5 ; 4, CH7L : 1,15, CH2/?L : 1,3, H'2H"2 : 1,3 et 1,7, H'3 : 3,5, H1, : 3,5, OH : 4,80, H'4 : 2,95 CH2/?Y : 3,45 à 3,65, CH2/JF : 3,5, CH2G : 3,55, CHaL : 4,1, CHαA : 4,1, CHaY : 4,1, CHaF : 4,35, Aromatiques Y-Aromatiques F : 6,6 à 7,2, NH F : 8, NH G : 8,15, NH L : 8,02, NH A : 8,1. 24
Traitement des animaux : a) avec le peptide YAGFL-NH2 :
Les souris reçoivent en injection ICV 3 μg du peptide, de 50 mg/kg en injection IP. b) avec le dérivé (4) :
Le tableau suivant indique que l'activité analgésique du dérivé phosphodiester est observée, que l'injection soit réalisée en ICV, avec un effet maximum à 25 μg par souris, ou en IP à la dose de 30 mg/kg.
EFFET ANALGESIQUE DE L»ENKEPHALINE OU DU DIESTER
Figure imgf000026_0001
c) avec le dérivé 6 :
Les premiers résultats obtenus avec le dérivé phosphotriester (6) confirment l'effet analgésique d'une injection icv.
Ces résultats suggèrent très fortement que l'effet analgésique observé après administration des dérivés phosphoesters de 1 'enképhaline est dû au passage à travers le BBB du complexe estérifie et de la libération du peptide dans le cerveau à partir de ces "prodrogues" .
Figure imgf000027_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Composés présentant une activité pharmacologique au niveau du SNC, ayant la capacité de traverser la BHE après administration dudit composé par voie périphérique, et présentant la formule générale : O
R.,0 - P - AM
OR2 dans laquelle : A = 0, N, ou S
- R-, représente
1) soit : [sucre ou désoxy sucre en C5 ou C , substitué ou non]n en série D ou L : n = 1 à 6, et la jonction entre le sucre et le phosphore étant sur l'un des hydroxyles des sommets 2, 3, 4 ou 6 ou
2) soit : (Ose) x - 0 - [(CH2)y - 0]z - dans lequel Ose représente un sucre en C5 ou C6, D ou L, la substitution de la chaîne 0 - [(CH2)y - 0]z se faisant sur le sommet 1 du sucre,
- x est un nombre entier de 1 à 12 ;
- y est un nombre entier de 1 à 6 ;
- z est un nombre entier de 1 à 4 ;
- R2 représente un groupe alcoyle de 6 à 30 atomes de carbone, saturé ou non, pouvant porter des ramifications ou des cycles,
M représente une molécule susceptible d'agir au niveau central, on peut citer en particulier les psychotropes, les analgésiques, les régulateurs cérébraux des systèmes immunitaires ou cardio-vasculaires ; il peut également représenter un précurseur desdites molécules susceptibles d'être transformées dans le SNC en la molécule active, ladite molécule pouvant être, par exemple, un peptide ou polypeptide ou une protéine glycosylée ou non, une molécule cyclique ou hétérocyclique choisie par exemple dans les différentes familles de psychotropes, cette liste n'étant pas limitative et pouvant inclure tout substance active ayant un radical hydroxyle, thiol ou aminé susceptible d'être estérifie ou amidifié sur une fonction phosphate.
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le motif ose est choisi parmi le mannose, le désoxyglucose, le glucose, le galactose, le fructose et le fucose.
3. Composé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que x est égal à 1, y est égal à 2 et z est égal à 1.
4. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit de phosphotriesters glycosylés de formule II :
Figure imgf000029_0001
dans laquelle :
- R2 a la même définition que dans la formule I ci- dessus et peut être par exemple un radical cholestryl, phytyl et/ou
- R a les signification suivantes :
. R = H : le sucre est alors un désoxyglucose et la formule II générale est codée sous le n° CT15165,
. R = OH : le sucre est alors un mannose et la formule II générale ci-dessus est codée n° CT16729, . R = OH : le sucre est alors un glucose et la formule II générale est codée n° CT16731, - M est la N-acétyltryptamine.
5. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit de phosphotriesters glycosylés de formule III :
Figure imgf000030_0001
dans laquelle R, R2 et M ont la m me s gn f cat on que dans la formule II.
6. Composé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le groupe R2 représente une chaîne alcoyle renfermant de 2 à 30 atomes de carbone, le cas échéant, substitué par un groupe NH2, -NHR1 ou -NR'R" dans lesquels R1 et R" représentent un groupe alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone.
7. Procédé de préparation d'un composé selon les revendications 1 à 6 caractérisé par les étapes suivantes : a) phosphorylation d'un sucre convenablement protégé avec un phosphite qui est in situ couplé avec la N- acétyl hydroxy-5 tryptamine et oxydé en phosphotriester correspondant ; b) enlèvement des groupements protecteurs du sucre et du phosphate en phosphodiester, isolé sous forme de sel de tétrabutyl ammonium ; c) substitution nucléophile d'un halogénure d'alcoyle avec le sel du phosphodiester pour donner le phosphqtriester ; étant bien entendu que les différentes variantes permettant l'obtention des dérivés de formule I, II ou III en utilisant la chimie classique du phosphore trivalent, font également partie de l'invention.
8. Composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de désordres ayant leur origine dans le système nerveux central, comprenant comme principe actif un composé selon l'une des revendications 1 à 5 en association avec un support pharmaceutiquement acceptable.
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