WO1994005637A1

WO1994005637A1 - Optically active 1,4-dihydropyridine compound and process for producing the same

Info

Publication number: WO1994005637A1
Application number: PCT/JP1993/001222
Authority: WO
Inventors: Kunio Isshiki; Takashi Nakashima; Takeo Yoshioka; Hiroshi Tsunekawa; Takashi Adachi; Tomomi Ota
Original assignee: Mercian Corporation; Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1992-08-31
Filing date: 1993-08-31
Publication date: 1994-03-17
Also published as: EP0657429A1; EP0657429B1; KR950702963A; EP0657429A4; CA2143106A1; AU4981893A; DE69330130D1; KR100244728B1; US5635395A; ATE200484T1; DE69330130T2

Description

明細書光学活性 1 ， 4 — ジヒドロピリジン

化合物およびその製造方法技術分野

本発明は、虚血性心疾患や高血圧などの予防および治療薬として有用な光学活性 1 , 4 — ジヒドロピリジン誘導体の製造中間体およびその製造方法に関する。

背景技術

1 , 4 ージヒドロピリジン系のジヒドロピリジン環の 3 位と 5 位に結合した 2 つのカルボン酸エステルが互いに異なるものは、その 4 位に不斉炭素を有しており、 2 種の光学異性体が存在する。最近、これらの化合物の生物学的性質が検討された結果、それぞれの光学活性体間に薬理活性、体内動態、安全性などに差があることが報告さォ "Lている〔K. Tamazawa et al. ； J. ed. Chem. Vol. 29 , 25 ϋ 4 ( 1 9 8 6 ) 〕。このような不斉炭素を有する化合物を医薬品として使用する場合、生体に対して余計な負荷を与えないという意味から、医薬品として好ましい一方の異性体のみを与えるという考え方が一般的になりつつある。このような観点から光学活性 1 , 4 ージヒドロピリジン化合物を製造するための方法が検討されている。

光学活性 1 ， 4 ージヒド口ピリジン誘導体合成の一般的方法としては、（ 4 R ) — 1 ， 4 — ジヒドロピリジンカルボン酸モノエステルを中間体とし、これに好ましいエステル残基を導入する方法が知られている〔A.

Ashimor i et al. ； Chem. Pharm. Bui 1. Vol. 39 ， 10 8 ( 1 9 9 1 ) 〕。この光学活性中間体の（ 4 R ) — 1 ， 4 — ジヒドロピリジン一 3 , 5 — ジカノレボン酸モノエステルの製造方法としては、柴沼らの化学的方法〔Chem. Pharm. Bull. Vol. 2 8 , 28 0 9 ( 1 9 8 0 ) 〕、並びに阿知波らの酸素法 [Tetrahedron Letters, Vol.3 2, 5 8 0 5 ( 1 9 9 1 ) 〕および Charles J. Sihらの酵素法 C Tetrahedron Letters, Vol, 3 2, 3 4 6 5 ( 1 9 9 1 ) 〕が知られている。しかしながら、微生物的手段によるジエステルの直接の不斉加水分解反応による方法は開示されていない。

上記記載の化学的手段による光学活性（ 4 R ) - 1 ， 4 ージヒドロピリジン一 3 , 5 — ジカルボン酸モノエステルの合成は、ジヒドロピリジン環上のアミノ基に保護基を必要とするばかりでなく、加水分解反応が不斉加水分解でないため、生成したモノカルボン酸がラセミ体であり、ラセミ分割を必要とするなどの欠点があった。

一方、阿知波らの方法は、ジヒドロピリジン環の 3 位および 5 位にピバロイルォキシメチル基などが結合したジヒドロピリジンエステル誘導体を基質として、一方のエステルを酵素的に不斉加水分解して医薬品の合成中間体としての光学活性ジヒドロピリジンモノ力ルボン酸誘導体に導くというものである。しかしこの方法は基質の合成およびビバロイルォキシメチル基などを他の置換基に変換して医薬品として有用な化合物に導くまで多くの工程を必要とするため、最終物までの収率がそれほど良くなレ、という欠点があつた。

S i h らの方法は、阿知波らの方法でビバロイルォキシメチルエステルがァセトキシメチルエステルに代わつているだけであり、本質的には両者変わりはない。

そこで、効率の良い光学活性体（ 4 R ) — 1 ， 4 ージヒドロピリジン 3 ， 5 — ジカルボン酸モノエステルの製造法の開発が望まれていた。

発明の開示

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、微生物を利用することにより、（ 4 R ) _ 1 , 4 — ジヒドロピリジン _ 3 ， 5 — ジカノレボン酸モノエステル誘導体を効率的に製造する方法を見いだし、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、下記式（ I )

_nNHR

( I )

(但し、式中 R は、低級アルカノィル基、複素環カルボ二ル基、ハロ置換ァセチル基、アルコキシァセチル基、ァリールォキシァセチル基、置換もしくは非置換フエ二ル低級了ルカノィル基、フエニル置換もしくは非置換低級ァルケフィル基、アルコキシもしくはアルケニルォキシカルボ二ル基、ァラルキルォキシカルボニル基または有機スルホ二ル基を表わし、 n は、 2 〜 4 の整数を表わす。）で示される化合物またはその塩をストレプトミセス属、パェシ口ミセス属、ボトリオディオプ口ディア属アルテナリア属またはへルミントスポリゥム属に属する不斉加水分解能を有する微生物又はその処理物と反応させ、生成する下記式（ I I )

(但し、式中 R及び n は、前記と同意義である）で示される光学活性 1 , 4 — ジヒドロピリジン化合物またはその塩を採取することを特徴とする光学活性（ 4 R ) - 1 4 — ジヒドロ一 2， 6 — ジメチノレ一 4 — (ニトロフエ二ル）ピリジン一 .3， 5 — ジカルボン酸モノエステル誘導体の製造方法を提供するものである。

更に本発明は、下記一般式（ m )

R'NH NHR'

(但し、式中 R ' は、低級アルカノィル基を表わし、 n は、 2〜 4 の整数を表わす。）で表わされる 1 , 4 — ジヒドロピリジン化合物を提供するものである。更に本発明は、下記一般式（ IV )

(但し、式中 R ' は、低級ァルカノィル基を表わし、 n は、 2 〜 4 の整数を表わす。 ) で表わされる光学活性 1 4 ジヒド口ピリジン化合物またはその塩を提供するものである。

発明を実施するための最良の形態

上記一般式（ I ) 及び（ E ) におレ、―て R は、ホルミル基、ァセチル基、プロピオ二ル基、ブチリル基、イソブチリノレ基、ノくレリノレ基、イソバレリル基などの低級ァルカノィル基；ピコリノィル基、ニコチノィル基、イソ二コチノィル基、二ペコチノィル基、キノリノィル基、キノキサノィル基、フエナチノィル基などの複素環カルボニル基；トリフロロァセチル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、ブロモアセチル基、ジブ口モアセチル基などのハ口置換ァセチル基；メトキシァ 'セチル基、ェトキシァセチル基などのァルコキシァセチル基；フエノキシァセチル基、ナフチルォキシァセチル基などのァリールォキシ了セチル基；フエニルァセチル基、メトキシフヱ二ルァセチル基フエニルプロピオニル基などの置換もしくは非置換フエニル低級アルカノィル基；クロトノィル基、シンナモイル基などのフエニル置換もしくは非置換低級アルケノィル基；メトキシカルボニル基、エトキンカルボニル基、 t e r t — ブトキシカルボニル基、ァリルォキシカルボニル基などのアルコキシもしくはアルケニルォキシカルボ二ル基；ベンジルォキシカルボニル基などのァラルキルォキシカルボニル基；メタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、ベンジルスルホニル基、トルエンスルホニル基などの有機スルホニル基等が挙げられる。

また 4 位のフェニル基上の二ト口基の置換位置は限定されず 2 位、 3 位及び 4 位いずれでもよい。

本発明の微生物反応による製造方法に使用される式 ( I ) の出発原料は、塩としても使用できる。このような塩としては、酢酸、酒石酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸付加塩；塩酸、硫酸などの無機酸付加塩などが使用される。

式（ I ) で示される出発原料はそれ自体公知の方法により製造することが出来る。即ち、下記式（ V )

HO - ( CH ₂ ) _n - NHR ( V )

(但し、式中 R は、低級アルカノィル基、複素環カルボニル基、ヽロ置換ァセチル基、アルコキシァセチル基、ァリールォキシァセチル基、置換もしくは非置換フエ二ル低級アルカノィル基、フエニル置換もしくは非置換低級ァルケノィル基、アルコキシもしくはァルケ二ルォキシカルボニル基、ァラルキルォキシ力ルボ二ル基または有機スルホ二ル基を表わし、 _n は、 2 〜 4 の整数を表わす。）で表わされるアミノ基を保護したエタノールアミン誘導体、 3 — ァミノブロノノール誘導体あるいは 4 - アミノブ夕ノール誘導体をジケテンと反応して得られる下記式（ VI )

0

0~(CHゥ）一 NHR

(VI)

(但し、式中 R及び n は、前記と同意義である）で表わされるァセト酢酸エステル体をアンモニアと共にニトロべンズアルデヒドと加熱縮合させることによって製造することができる。あるいは一般式（ VI ) で表わされるァセ卜酢酸エステルと二トロべンズアルデヒドをぁらかじめ縮合させて得られる下記式（ VII )

(VII) (但し、式中 R及び η は、前記と同意義である）で表わされるひ一ベンジリデン一 / S — ケトエステル体を更に一般式（ VI ) で表わされるァセト酢酸エステルとァンモニァの存在下に縮合することによって製造することもできる。あるいはまた、一般式（ VI ) で表されるァセト酢酸エステルとァンモニァと反応して得られる下記式 (珊）

NH

2 O

'0~"(CHゥト NH R

(但し、式中 R及び n は前記と同意義である）

で表わされる /3 —ァミノクロトン酸エステルを二トロべンズアルデヒドと共に更に一般式（ VI ) で表わされるァセト酢酸エステルと縮合することによつても製造することが出来る。

また、本発明は、上記微生物反応による製造方法の原料化合物として好適に使用できる、一般式（ I ) において Rが低級アルカノィル基である化合物、即ち下記式 ( H ) HR'

R'N

(但し、式中 R ' は低級アルカノィル基を表わし、 n は 2 〜 4 の整数を表わす）で示される新規 1 , 4 一ジヒド口ピリジン化合物を提供するものである。また、本発明は上記式（ ΠΙ ) の化合物またはその塩を上記微生物反応による製造方法に付すことにより、生成される下記式

( 17 )

(但し、式中 R ' 及び n は前記と同意義である）で示される新規光学活性 1 , 4 ージヒドロピリジン化合物またはその塩を提供するものである。上記微生物反応に用いられる微生物としては、ストレブトミセス属、パェシ口ミセス属、ボ卜リオディオプ口ディア属、アルテナリア属またはヘルミントスポリゥ厶属に属する不斉加水分解能を有する微生物が利用できる。このような微生物としては例えば F I — 4 株、 F I — 7 4 1 株、 F I — 1 0 0 7 株及び A — 9 1 4 株が挙げられる。これらの菌の形態的特徴を以下に示す。

F I — 4 株

ポテトデキストロース寒天培地上で、薄灰白色の綿状の菌糸層を形成し、培養が進むと基部は黒灰色となる。分生糸は分生糸柄の頂端の小孔から生じるポロ型分生糸で、隔壁により分断されレンガを積んだ形状を示す。分生糸の底部はまるく、頂部はとがつており色は褐色である。

F I - 7 4 1 株

ポテトデキストロース寒天培地上で、良く発達した白色綿状の菌糸層を形成し、培養が進むと基部は褐色となる。分生子は、頂端が開口した分生子殻と呼ばれる球形の器官内に形成される。分生子は、やや長く、平滑で粘性を示さない。成熟すると褐色となり、細胞壁が厚くなる。

F^_I — 1 0 0 7 株

ポテトデキストロース寒天培地上で、灰白色の菌糸層を形成し、培養が進むと基部はややピンクかかった褐色となる。分生子は、分生子柄上の最先端部の枝（フィァライド）から出現するフィァ口型である。分生子柄はほとんど分技しないがフィアライドは、よく分技し、細長い構造を取る。

以上の形態的特徴をもとに The Genera of Fungi Sporulat ing in Pure Culture (J. A. vonARX 著 1 9 7 0 ) で検索した結果、 F I 一 4 は、アルテナリアエスピ一（ Alternaria s p. ) 、 F I — 7 4 1 は、ボトリオディォプロディアエスピー ( Botryodi oplodia sp.

F I — 1 0 0 7 は、パェシ口ミセスエスピー

( Paec i 1 omyces sp. ) と同定された。

A - 9 1 4 株

I S P - 2寒天培地上で淡褐色の堅固なコロニーを形成する。培養が進むとコロニーの表面はやや灰色を帯びた緑色となる。メラニン色素やその他の拡散性の色素を作らない。基中菌糸は、分断されないで良く発達し、気菌糸が存在する。気菌糸上にらせん状に連鎖した分生子を多量に着生する。分生子の表面は、平滑でめ <D ο

細胞壁成分に L ージアミノピメリン酸が含まれる。 L — ヒドロキシプロリンを利用できない。 1 0 0 〃 g / m 1のォレアンドマイシンに感受性である。

、上の特徴をもとに Bergey ' s a n n u a 1 of

SystematicBacteology Volume 4 で検索した結果、 A - 9 1 4 は、ストレプトミセスピリドスポルス ( Streptomyces v i r i dosporus) と同定された。 F I — 4 株は 1 9 9 3 年 3 月 1 8 日に工業技術院生命ェ学工業技術研究所に寄託され受託番号として F E R M P — 1 3 5 3 5 が付与された。その後、 1 9 9 3 年 6 月 1 4 日にブダぺスト条約に基づく寄託に移管され受託番号として F E R M B P — 4 3 3 5 が付されている。

F I - 7 4 1 株、 F I — 1 0 0 7 株及び A — 9 1 4 株は、それぞれ 1 9 9 2 年 7 月 2 9 日に工業技術院生命工学ェ業技術研究所に寄託され、受託番号として F E R M

P — 1 3 0 9 7， F E R M P - 1 3 0 9 6 , 及び F E R M P — 1 3 0 9 8 が付与された。その後、 1 9 9 3 年 6 月 1 4 日にそれぞれブタぺスト条約に基づく寄託に移管され、受託番号としてそれぞれ F E R M B P — 4

3 3 3 , F E R M B P — 4 3 3 2 , F E R M B P —

4 3 3 4 が付与されている。

さらに本発明に利用できる微生物として、ストレプトミセスエスピー A T C C 1 1 8 6 2 およびヘルミントスポリゥムゾナタム I F 0 6 6 7 8 が挙げられる。これらの微生物は、それぞれァメリカンタイプカルチヤ一コレクションおよび（財）発酵研究所に保存されており、容易に入手できる。

上記微生物を培養する培地は、特に限定されず、通常の微生物の培養に用い得るものであればよい。例えば、炭素源としては、上記微生物の利用可能なものであればいづれでも使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類；グリセロール、ソルビトールなどの糖アルコーノレ；フマル酸、クェン酸などの有機酸を使用できる。これらの炭素源の培地への添加量は、通常 0. 1 乃至 1 0 %程度とすることが好ましい。窒素源としては、例えば、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥ厶、燐酸アンモニゥ厶などの無機酸アンモニゥ厶塩；フマル酸アンモニゥ厶、クェン酸アンモニゥムなどの有機酸アンモニゥム塩；肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源などを使用することができる。このうち有機窒素源は、多くの場合、炭素源としても兼用できる。窒素源の添加量は、通常、 0. 1 乃至 1 0 %が適当である。無機塩類としては、例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどのリン酸アル力リ金属塩；塩化力リウ厶、塩化ナトリウムなどの塩化アルカリ金属塩；硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄などの硫酸金属塩等を使用できる。その使用量は、 0. 0 0 1 乃至 1 %の範囲が適当である。

微生物の培養は、上記の培地で 2 0 乃至 4 0 °C、好ましくは 2 8 乃至 3 7 °C、 p Hは 5 乃至 9 、好ましくは、 6 乃至 8 で好気的条件下で実施すればよい。

微生物反応は、微生物またはその処理物と反応させることによって行なわれる。微生物との反応は通常微生物の培養物との反応であり、微生物の培養物としては、培養された該微生物菌体、培養濾液および培養液が挙げられる。微生物の処理物とは、培養された該微生物菌体の処理物、培養濾液および培養液などの処理物であり、該微生物菌体の処理物としては、乾燥菌体、例えば、凍結乾燥菌体、噴霧乾燥菌体、または有機溶媒、例えばァセトン、トルエン、メタノール、ブ夕ノール等で処理した菌体、菌体抽出物、固定化処理物を挙げることができる。また、培養濾液および培養液の処理物としては、該培養液の濃縮物、乾燥粉末、噴霧乾燥粉末が挙げられる。更に、該培養菌体および培養濾液より、酵素を分離、精製し、該化合物の処理物として用いることもできる。

本発明を実施するには、培地に微生物を接種した後、例えば、 2 0 乃至 4 0 °Cで、 1 2 乃至 1 2 0 時間培養することにより、微生物を l m l中に 1 0 ⁶ 乃至 1 0 ¹。個を含む菌株培養液を得る。その培養液に原料化合物である式（ I ) の化合物を、通常、最終濃度が 0. 5 mgZ m l乃至 5 mgZ m lになるよう水または溶解補助剤に溶解して加え、通常 2 8 °Cで 1 8 時間乃至 7 2 時間反応させる。次いで pHを 5 に調整後、ク π 口ホルム、酢酸ェチル、酢酸プチル、ブタノール等の有機溶媒等で抽出し、結晶化するかまたは転溶、沈殿化等の手段により目的の光学活性体である式（ E ) の化合物を得ることができる。

ここで用いられる溶解補助剤としては、種々の有機溶媒を使用することができる。このような有機溶媒としては、アセトン、 'メチルェチルケトン、ジメチルスルホキシド、ジォキサン、 N， N— ジメチルホルムアミド、ァセトニトリル等が挙げられ、これらは単独、または 2 種類以上用いてもよい。その添加量は培地に対して 3 乃至 5 %の範囲が好適である。

以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明は実施例のみによって限定されるものではない。

実施例 1 . ( 4 R ) — 1 ， 4 — ジヒドロー 2 , 6 — ジメチルー 3 ( 2 —ニコチノイノレアミノエチル

) ォキシカルボニル ( 3 —二トロフ X ニル）ピリジン一 5 — カルボン酸の製造

1 - 1 ) ストレプトミセスピリドスポルス A — 9 1 4 による製造

ストレプトミセスピリドスポルス A — 9 1 4 を 3 0 mlの C培地（ポテトスターチ 2 %、エスサンミート 2 % , 酵母エキス 0. 5 % . NaCl 0.25 % CaC0₃ 0. 3 2 % , FeS0₄ 7 H₂0 0.00 0 5 % , MnS0₄ 4 H₂0 0.00 0 5 % , ZnS0₄ 7 H₂0 0.00 0 5 % , pH7. 4 ) を含む 2 5 0 m 1フラスコに植菌し、 2 8 °Cで 3 日間培養した。得られた培養液に 1 , 4 ージヒドロー 2 , 6 — ジメチル— 4 一 ( 3 —二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5 — ジカルボン酸ビス（ 2 —ニコチノィルアミノエチル）エステル ' 2 塩酸塩 6 0 mgを蒸留水 0. 7 5 mlに溶解して加え、更に 2 日間、 2 8 °Cで振盪を続けた。この反応混合物に 1 N 塩酸を加え、 PH5. 0 とした後、酢酸ェチル 3 0 mlにて抽出した。有機層を 0. 1 N水酸化ナトリウ厶水溶液（ 2 0 mi x 3 ) で分液逆抽出した。この水層に 1 N塩酸を加え、 pH5. 0 としたのち酢酸ェチル 3 0 mlで分液抽出した。この有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層は、減圧濃縮後、その濃縮液を分取用 T L C プレートに吸着させ、クロ口ホルム：メタノ一ル：酢酸（ 5 0 ： 5 ： 1 ) にて展開し、 R f 値 0. 2 2 に U V吸収を示す溶出区分を濃縮乾固すると目的の表題化合物が 1 8. 0 mg得られた。

この物質の光学純度は、ダイセル工業社製光学分割用カラム、キラル A G P ( 4 mmx 1 0 0 mm) を用レ、た H P L C 〔移動相； 0. 6 %イソプロノ、'ノール一 0. 0 1 M リン酸緩衝液（ pH7. 1 ) , 流速； 0. 7 mlZmin 〕により分析した。その結果、光学純度は 1 0 0 %であり、保持時間は 4. 7 分を示した。

N M R ( CDC1₃) (5 ；

2. 3 7 ( 3 H , s ) ， 2. 3 9 ( 3 H , s ) ， 3. 6 — 3. 8 ( 2 H， m ) ， 4. 2 - 4. 4 ( 2 Η , ΙΏ ) ， 5. 1 8 ( 1 Η , s ) ， 6. 7 4 ( 1 Η , br) , 7. 3 0 ( 1 Η， t ， J = 8. 0 Hz) , 7. 4 3 ( 1 Η , dd， J = 5. 0 & 8· 0 Hz) , 7. 6 2 ( 1 Η， d , J = 8. 0 Ηζ) , 7. 9 4 ( 1 Η , dd, J = 2. 0 &8. 0 Ηζ) , 8. 1 0 ( 1 Η , t J = 2. 0 Hz) , 8. 1 7 ( 1 Η , dt, J = 8. 0 & 1. 5

Hz) , 8. 6 8 ( 1 H , dd, J = 1. 5 & 5. 0 Hz) ， 8. 9 1 ( 1 H， d， J = 1. 5 Hz)

F A B - M S ( m / z ) ； 4 6 7 ( M + H ) +

1-2) ストレプトミセスエスピー A T C C 1 1 8 6 2 による製造ストレプトミセスエスピー A T C C 1 1 8 6 2 を用い実施例 1-1) と同様に反応処理し 4 mgの原料より目的の光学活性モノカルボン酸 0. 7 mgを得た。

1-3) ボトリオディオプ口ディアエスピー F 1 — 7 4

1 による製造

ボトリオディオプ口ディアエスピー F I — 7 4 1 を 3 0 mlの F I 培地（ポテトスターチ 2 %、エスサンミート 2 %、 KH₂P0₄ 0. 1 % , gS0₄ 7 H₂0 0.05 % , グルコース 1 %、アデ力ノール L G 1 0 9 0. 0 5 % ) を含む 2 5 0 mlの三角フラスコに植菌し、 2 8 °Cで 3 日間培養した。得られた培養液に 1 ， 4 ージヒドロ — 2 ， 6 - ジメチルー 4 一（ 3 —二トロフエニル）ピリジン一 3 ， 5 — ジカルボン酸ビス（ 2 —ニコチノィルアミノエチル）エステル， 2 塩酸塩 6 0 mgを蒸留水 0. 7 5 mlに溶解して加え、更に 2 日間、 2 8 °Cで振盪を続けた。以下実施例 1-1) と同様に処理すると光学純度 1 0 0 %の表題化合物が 8 mg得られた。

1-4) パェシ口ミセスエスピー F I — 1 0 0 7 による製造

ノ、。ェシロミセスエスピー F I — 1 0 0 7 を 3 0 mlの F I 培地（ポテトスターチ 2 %、エスサンミート 2 %、 KH₂P0₄ 0. 1 % , MgSO-, 7 H 2 O 0.05 % , グルコース 1 % アデ力ノール L G 1 0 9 0. 0 5 % ) を含む 2 5 0 mlの三角フラスコに植菌し、 2 8 。Cで 3 日間培養した。得られた培養液に 1 ， 4 — ジヒドロ — 2 ， 6 — ジメチル一 4 — ( 3 — ニトロフエ二ノレ）ピリジン一 3 , 5 — ジカルボン酸ビス（ 2 — ニコチノイノレアミノェチル）エステル · 2 塩酸塩 6 0 mgを蒸留水 0. 7 5 mlに溶解して加え、更に 2 日間、 2 8 °Cで振盪を続けた。以下実施例 1 - 1 ) と同様に処理すると光学純度 1 0 0 %の表題化合物が 1 0 mg得られた。

1-5) その他の菌による製造

アルテナリアエスピー F I — 4 およびへルミントスポリゥムゾナタム I F 〇 6 6 7 8 株を用い実施例 1-3) と同様に反応処理して T L C により分析し、目的のモノカルボン酸を確認した。

実施例 2 . 1 ， 4 — ジヒドロ — 2， 6 — ジメチルー 4 一

( 3 — 二トロフエニル）ピリジン一 3， 5 - ジカルボン酸ビス（ 2 — ァセタミドエチル）エステルの製造

N— ァセチルエタノールアミン 2 5 g のジォキサン 1 0 0 ml溶液にトリエチルァミン 0, 3 4 mlを加え、ジケテン 1 8. 7 mlをゆつくり滴下した。発熱反応が終わった後、濃アンモニア水 8. 1 ml及び m—二トロべンズアルデヒド 1 8. 3 g を加え 8 0 での油溶中で 1 7 時間、加熱攪拌し減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣を 7 0 0 g のシリカゲルを充塡したカラムに展開系としてトルエンーァセトン混合溶媒（混合比 2 ： 1 ) を用い精製し、目的物 2 4 g を得た。 N M R ( CDC1₃) (5 ；

1. 9 8 ( 6 H , s ) ， 2. 3 6 ( 6 H , s ) ， 3. 4 8

( 2 H , m ) ， 3. 6 0 ( 2 H , m ) , 3. 9 5 ( 2 H , m ) ， 4. 2 0 ( 2 H m ) , ο. 1 1 ( 1 H， s ) , 6.

6 7 ( 1 H， s ) ， 6. 8 5 ( 2 H , t ， J = 6 Ηζ) ,

7. 4 0 ( 1 H , T

t ， J 一 o Π Z y , 7. 7 0 ( 1 H , td,

1. 2 & 8 Hz) , 8. 0 π U 丄 Jrl， td， J = 1. 2 & 8 Hz),

8. 2 3 ( 1 H， t ， T

J 、

F A B - M S ( m / z ) 、 ; 4 8 9 ( M + H ) ⁺

実施例 3 . ( 4 R ) 3 一（ 2 -ァセタミドエチル）ォキシカルボルー 1 ， 4 ージヒド a一 2 , 6 ージメチル 4 - ( 3 一二トロフェニル）ピリジン一 5 カルボン酸の製造

3-1 ) ノェシ口ミセスエスピー F I 1 0 0 7 による製造

ノ、⁰ェシロミセスエスピー F I — 1 0 0 7 を 3 0 mlの F I 培地（ポテトスターチ 2 %、エスサンミート 2 %、 KH₂P0₄ 0. 1 %， MgS0₄ 7 H₂0 0.05 %，グルコース 1 %、アデ力ノール L G 1 0 9 0. 0 5 % ) を含む 2 5 0 mlの三角フラスコに植菌し、 2 8 でで 3 日間培養した。得られた培養液に 1 ， 4 ージヒドロー 2 , 6 — ジメチル — 4 — ( 3 —二トロフエニル）ピリジンー 3 , 5 — ジカルボン酸ビス（ 2 — ァセタミドエチル）エステル 6 0 mgをジメチルスルホキシド 0. 7 5 mlに溶解して加え、更に 2 8 °Cで 2 日間振盪を続けた。この反応混合物に I N 塩酸を加え、 PH3. 0 に調整後、酢酸ェチル 3 O mlにて抽出した。

この有機相を 0. 1 M水酸化ナトリウム 2 0 mlで逆抽出した。その抽出液の pHを 3. 0 に調整後、酢酸ェチル 2 0 mlにて抽出、飽和食塩水洗浄、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。有機相を濃縮後、調製用 T L C プレートに吸着させ、クロ口ホルム：メタノール（ 7 ： 1 ) にて展開し、 R f 値 0. 2 2 に U V吸収を示す溶出区分を減圧乾固すると目的の表題化合物が 1 0 mg得られた。

この物質の光学純度は、ダイセル工業社製光学分割用力ラム、キラル A G P ( 4 mm X I O O mra) を用いた H P L C 〔移動相； 0. 3 5 %イソプロノくノール一 0. 0 1 M リン酸緩衝液（ PH4. 4 ) ，流速； 0. 8 ml Z mi η 〕により分析した。その結果、光学純度は 1 0 0 %であり、保持時間は 1 4. 3 分を示した。

N M R ( CDC") δ ；

1. 9 1 ( 3 Η， s ) , 2. 3 4 ( 6 Η , s ) , 3. 4 0 ( 2 H， t ， J = 5. 5 Hz) , 4. 0 — 4. 2 ( 2 H , m ) ，

5. 1 0 ( 1 H， s ) , 7. 4 4 ( 1 H , t , J = 8. 0 Hz) ， 7. 6 6 ( 1 H， td， J = 1. 0 ， 2. 0 & 8. 0 Hz) ， 7. 9 9 ( 1 H , td, J = 1. 0 , 2. 0 & 8. 0 Hz) ， 8. 1 1 ( 1 H , t , J = 2. 0 Hz)

F A B — M S ( m / z ) ; 4 0 4 ( M + H ) ⁺

また、この物質をジァゾメタンで処理して得られるメチルエステル体は以下の N M Rスぺクトルを示した。 N M R ( CD3OD) δ ；

1. 9 0 ( 3 H , s ) ， 2. 3 0 ( 3 H , s ) , 2. 3 3 ( 3 H， s ) ， 3. 4 0 ( 2 H , t , J = 5. 9 Hz) , 3. 6 3 ( 3 H , s ) ，

4. 0 4 ( 1 H , dd， J = 1 1. 4 & 5. 9 Hz) , 4. 1 3 ( 1 H , dd, J = 1 1. 4 & 5. 9 Hz) ， 5. 0 8 ( 1 H , s ) ，

7. 4 5 ( 1 H , t , J = 8 Hz) , 7. 6 5 ( 1 H , d， J = 8 Hz) , 8. 0 0 ( 1 H , d , J = 8 Hz) , 8. 0 9 ( 1 H， s )

表題化合物の（ R ) —体標品を以下のようにして製造しすこ。即ち、柴沼らの報文〔Chem. Pharm. Bull. , Vol. 2 8 ( 9 ) , 2 8 0 9 — 2 8 1 2 ( 1 9 8 0 ) 〕記載の方法により調製した（ S ) — （ + ) — 1 , 4 — ジヒド π — 2， 6 — ジメチルー 5 — メトキシカルボ二ルー 4 一（ 3 — ニトロフエニル）一 3 — ピリジン力ノレボン酸 5 mgをテトラヒドロフラン 0 . 5ml に溶解後、クロロギ酸イソブチル 2 〃 1 を加え、 1 0 分間攪拌した後トリェチルアミン 6 〃 1 および N— ァセチルェ夕ノールアミン 3 0 p. 1 を加え、更に 2 時間攪拌した。反応混合物に酢酸ェチル 5 mlを加え、水洗して得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣を分取用シリ力ゲル T L C (展開系トルエン一アセトン； 1 ： 1 ) で精製して 3 mgの（ R ) —体標品を得た。この（ R ) —体標品と上記の如くして得た表題化合物とは、上記光学分割用カラムで同じ保持時間（ 1 4. 0 分；移動相 2. 5 % ィソプロノくノール Z 0. 0 1 M リン酸緩衝液（ pH7. 1 ) , 流速； 0. 8 mlZmin ) を示した。尚、（ S ) —体では同条件で 8. 4 分の保持時間を示した。

さらに、本物質 1 0 . O mgを 1 Nナトリウムメトキジドのメタノール溶液 1 m 1に溶解し、 4 0 °Cの油浴中、 5 時間加熱した。反応混合物に冷却下、 1 N塩酸を加え pH 2 とした後蒸留水 5 mlおよび酢酸ェチル 5 mlを加え分液した。この有機相を水洗後芒硝にて脱水乾燥し、溶媒は減圧留去した。残留物を分取用 T C L にて精製して得たメチルエステル体 8 . 0 mgの理化学的性状は下記に示す様に、上記柴沼らの方法によって得られた（ R ) — ( 一）一 1 ， 4 — ジヒドロ 2 ， 6 — ジメチルー 5 — メトキシカルボニル一 4 一（ 3 — 二トロフエニル） — 3 — ピリジンカルボン酸と一致した。

¹ H - N R ( C D ₃ 0 D ) ： δ 8.09(1H, t, J = 2.2 Hz), 7.99(1H, td, J= 8.1, 2.2 & 1.1 Hz), 7.64(1H, d, J = l.1Hz), 7.44(1H, t, J = 8.1Hz), 5.09(1H, s), 8.62(3H, s)， 2.34(3H, s)， 2.88(8H, s) ;

〔ひ〕 ²⁷D ：一 32.0° ( c0.30, メタノール）；

〔ひ〕 ²⁷ D ：一 22.3。（ c0.30，アセトン）；

M S ： F A B (neg. )331(M― H )

3-2) その他の菌による製造

ストレプトミセスエスピー A— 9 1 4 およびストレブトミセスエスピー A T C C 1 1 8 6 2 をそれぞれ C 培地（ポテトスターチ 2 %、エスサンミート 2 %、酵母エキス 0. 5 %、 NaCl 0.25 % , CaC0₃ 0. 3 2 % , FeS0₄ 7 H₂0 0.00 0 5 % , nS0₄ 4 H₂0 0.00 0 5 % , ZnS0₄ 7 H₂0 0.00 0 % , pH7. 4 ) を含む 2 5 0 mlフラスコに植菌し、 2 8 °Cで 3 日間培養した。得られた培養液各 2 mlに 1 ， 4 ージヒドロー 2 ， 6 — ジメチルー 4 一（ 3 —二トロフエニル）ピリジン一 3 , 5 — ジカノレポン酸ビス（ 2 — ァセタミドエチル）エステル 4 mgのジメチルスルホキシド溶液 50〃 1 を加え、更に 2 8 °Cで 2 日間振盪を続けた。反応混合物に 1 N塩酸を加え、 pH 3. 0 に調整後、酢酸ェチルで抽出した。得られた有機層より目的の光学活性モノカルボン酸をそれぞれ 0. 5 mgを得た。

ヘルミントスポリゥムゾナタム ί F〇 6 6 7 8 およびボトリオディオプ口ディアエスピー F 1 — 7 4 1 をそれぞれ F I 培地（ポテトスターチ 2 %、エスサンミート 2 %、 KH₂P0₄ 0. 1 %， MgS0₄ 7 H ₂0 0.05 % , グルコース 1 %、アデカノーノレ L G 1 0 9 0. 0 5 % ) に植菌し、 2 8 °Cで 3 日間培養した。得られた培養液に 1 ， 4 — ジヒドロ一 2 ， 6 — ジメチノレ一 4 一（ 3 — ニトロフェニル）ピリジン一 3 ， 5 — ジカルボン酸ビス（ 2 — ァセタミドエチル）エステルのジメチルスルホキシド溶液を加え、更に' 2 8 °Cで 2 日間振盪を続けた。実施例 3-1)と同様に処理して T L C により分析し、目的のモノカルボン酸を確認した。産業上の利用可能性

本発明の微細物反応による製造方法により、簡便で高光学純度の一般式（ I ) で示される化合物またはその塩が提供される。これにより、虚血性疾患や高血圧などの疾患に有効な光学活性 1 , 4 ージヒドロピリジン誘導体例えば（ 4 R ) - ( 2 — ニコチノィルァミノ）ェチル ( 3 —二トロォキシ）プロピル 1 , 4 ージヒドロー 2 6 — ジメチル一 4 — ( 3 —ニトロフエニル）ピリジン一 3 ， 5 — ジカノレボキシレート〔 " 高橋ら、 J p n . J. Pharmacol. , vol 5 8 , Suppl. I， p 3 9 9 ( 1 9 9 2 ) " 〕等の製造の効率化が達成される。

Claims

1. 下記一般式（ I )

一 0一一青

RNH(CH₂) _n の

( I )

固

(但し、式中 R は、低級アル力ノィル基、複素環カルボニル基、ハロ置換ァセチル基、アルコキシァセチル基、ァリールォキシァセチル基、置換もしくは非置換フエ二ル低級アルカノィル基、フエ二ル置換もしくは非置換低級ァルケノィル基、アルコキシもしくはアルケニルォキシカルボニル基、ァラルキルォキシカルボニル基または有機スルホ二ル基を表わし、 _n は、 2 〜 4 の整数を表わす。）で示される化合物またはその塩をストレプトミセス属、パェシ口ミセス属、ボトリオディオプ口ディア属アルテナリア属またはへルミントスポリゥ厶属に属する不斉加水分解を有する微生物又はその処理物と反応させ生成する下記式（ I I )

(I)

(但し、式中 R及び n は、前記と同意義である。）で示される光学活性 1 ， 4 ージヒドロピリジン化合物またはその塩を採取することを特徴とする光学活性（ 4 R ) — 1 , 4 — ジヒドロー 2 , 6 — ジメチルー 4 — (ニトロフェニル）ピリジン一 3， 5 — ジカルボン酸モノエステル誘導体の製造方法。

2. 下記一般式（ )

'N

(但し、式中 R ' は、低級アルカノィル基を表わし、 n は、 2〜 4 の整数を表わす。）で表わされる 1 ， 4 ージヒドロピリジン化合物。