WO1994003810A1 - Procede pour la detection d'infections a mycoplasmes - Google Patents
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Definitions
- Mycoplasma fermentans Incognitus strain of Lo (3) and strain No. 8 (Montagnier, ref. 4) and also Mycoplasma pirum (Montagnier, ref. 5).
- a third species was recently isolated from the urine of AIDS patients by Lo and his team. This species is apparently new and has been given the name Mycoplasma penetrans (6).
- M. piru and M. penetrans have in common a differentiated end capable of attaching to the cell and probably of permitting penetration.
- these mycoplasmas are capable of considerably increasing the cytopathogenic power of HIV-1 and HIV-2 on T4 lymphocytes or derived tumor lines (7) (8) (9).
- extracts from M. pirum can restore the multiplication potential of a strain of HIV-1 apparently free of its mycoplasma contamination (1).
- an antibody directed against the adhesion site of M. genitalium (close to M. pirum) can inhibit the replication of certain strains of V H-1 (10) and HIV-2.
- the present invention aims to determine the presence of anti-fermentan antibodies in serum and other biological fluids, but it can be applied to any other similar mycoplasma.
- the invention follows from the observation - new for fermentans, even if a similar observation has been made in the past for certain non-human mycoplasmas - that the life cycle of the mycoplasma passes through an extremely compact form which we call here "mycosphere" .
- These mycospheres whose average diameter is of the order of 160 n, are formed by successive strangulations of the filamentous forms, which are the forms of growth of the mycoplasma.
- mycoplasmas in this form are more easily recognized by sera taken from patients infected with these mycoplasmas.
- the method according to the invention for the in vitro diagnosis in a biological fluid of a previous infection with mycoplasmas is characterized by bringing this biological fluid into contact in an appropriate nutritive medium with mycoplasmas under conditions allowing an interaction between these mycoplasmas and antibodies recognizing these mycoplasmas and possibly present in this biological fluid.
- the in vitro diagnosis is based on the demonstration of a neutralizing action of these antibodies against said mycoplasmas, when these are brought into contact with the biological fluid studied within an appropriate culture medium.
- the visualization of the neutralizing action can be done by any appropriate means.
- a reaction indicator capable of being affected by one of the products released during the development of the mycoplasma, for example a pH change indicator making it possible to detect acid production lactic acid, when the culture medium used contains glucose and this undergoes fermentation by the mycoplasma during its development.
- the methods of in vitro diagnosis of a mycoplasma infection are easier and more sensitive to use when, like M. fermentans, the mycoplasma studied can be isolated and produced in the form of mycospheres. These then give rise to more sensitive agglutination reactions, when they are brought into contact with biological samples, in particular blood sera containing anti-mycoplasma antibodies.
- these mycospheres When these mycospheres can be produced and stored, they constitute a reagent of choice for the diagnosis of a mycoplasma infection.
- the mycospheres of M. fermentans in particular the M. fermentans strain strain 0 8, deposited at the CNCM under the number 1-949, on May 22, 1990, constitute new products, in particular for the production of kits in vitro detection of infections due to mycoplasmas.
- the process for the production of fermentan mycospheres involves the cultivation of such a strain of mycoplasmas in SP4 medium (13).
- the invention also lies in obtaining these forms at will by allowing cultures to age in an SP4 medium.
- the serum of patients infected with mycoplasma contains antibodies which agglutinate the mycospheres. Agglutination can be detected in negative staining with an electron microscope. It can also more practically be detected with the naked eye by agglutination of microbeads on which the mycospheres have been fixed.
- the SP4 medium is prepared, in particular as follows, from a "base medium” itself constituted from the following components, sold by the company DIFCO:
- the basic medium is itself obtained by adding pyrolized water until a volume of 200 ml is obtained, the pH of which is finally adjusted to 7.8.
- the “base medium” thus obtained is sterilized by autoclaving 15 'at 120 "C.
- the complete medium (SP4) is obtained by adding to the 200 ml of the base medium: 2.7 ml of an ampicillin solution dosed at 66 mg / ml
- yeast extract GIBCO a yeast extract "Yeast extract GIBCO"
- GIBCO fetal calf serum
- the complete medium is then filtered through a membrane (0.22 ⁇ m mesh).
- the filtrate can be stored at 4 ° C for 2 weeks.
- mycospheres of mycoplasmas in particular of M. fermentans, lies in their capacity to be fixed via covalent bonds, on immunologically inert supports, hence the possibility of visualizing the reactions between the antigens (in this case the mycospheres coupled to immunologically inert supports) and the antibodies possibly contained in the biological sample under study, thanks to agglutination or hemagglutination reactions.
- the immunologically inert supports consist of micro-supports or microbeads in latex or any other suitable material (plastic, silicate, dextran ball, etc.).
- the invention has been found to open up a new way of screening at a very early stage for possible HIV infection in high-risk subjects.
- the invention therefore also relates to kits for the diagnosis of an infection due to mycoplasmas, the main reagent of these kits then consisting of a mycoplasma, in particular in the form of mycospheres, or a mycoplasma antigen.
- the main reagent consists of a conjugate between this mycoplasma and inert support particles allowing the performance of agglutination reaction, or even of haemagglutination.
- the kits of the genus in question contain as princeps constituents:
- kits comprising, in addition to the main reagents mentioned above, synthetic or natural antigens capable of being recognized by antibodies characteristic of HIV, as soon as the biological sample or sample contains them.
- the invention also relates to anti-mycoplasma vaccine compositions essentially characterized by attenuated or killed forms of mycospheres of mycoplasmas, in particular of M. fermentans, or proteins or peptides derived from these mycospheres as well as their fragments; these can be obtained by enzymatic hydrolysis, for example with the V8 protein, or by chemical synthesis or also by expression of nucleotide sequences corresponding to the peptide sequences of the above fragments by genetic engineering techniques.
- the fragments of proteins or peptides derived from the above-mentioned mycospheres are naturally characterized by their ability to be recognized by the same antibodies as the mycospheres themselves.
- the invention therefore provides a complementary vaccine making it possible to delay, if not to halt, the development of AIDS in subjects who are seropositive or at high risk of developing it.
- This vaccination takes on its full value as soon as it is recognized that annihilation in the subject of mycoplasmas can also lead to a slowing down of the viral activity of HIV in the seropositive or potentially seropositive subject.
- the strain No. 8 (deposited in the National Collection of Microorganisms), isolated from an asymptomatic patient infected with HIV, is cultured in an SP4 medium (13), each passage receiving 1/50 of inoculu from a previous passage. (about 100 doses changing the color). The color change linked to glycolysis generally appears around day 5.
- Mesch 200 copper grids are used, covered with a collodion film and a carbon film.
- the grids are placed on the sera diluted for 10 minutes at laboratory temperature and absorbed on filter paper in order to remove the excess serum. They are deposited on a suspension of mycospheres for 30 minutes then are absorbed on filter paper and stained with 6% amomium molybdate in distilled water for 2 minutes.
- the serum has no agglutinating antibodies, it is observed that the mycospheres remain dispersed, or exist in small packages a few units. If the serum is agglutinating, large aggregates of several tens of mycospheres are observed. III. Antibody detection by agglutination of microbeads
- a simpler and easier method to use in routine laboratory is to link the mycospheres by covalent bond (for example by the technique of Brandt et al, Biochemica Biophysica Acta 1975, 386, p 196-202 or the technique of Avraméas et al described in US patent n ° 4,925,921 issued on 5/15/90 or the technique described in PCT patent application n ° 82 / 00203 deposited on, 8/07/81) to microbeads of latex or any other suitable material (plastic, silicates, dextran beads, etc.).
- microbeads remain dispersed.
- the sera of certain patients also contain antibodies capable of neutralizing the growth of M. fermentans in SP4 medium.
- This growth results in an inhibition of the change in color from red to yellow of the SP4 medium.
- this medium contains phenol red capable of turning yellow at an acid pH.
- the lactic acid produced by the fermentation of glucose by the mycoplasma will cause this acidification.
- the mixture is filtered successively on a 0.22 m Millipore filter, then 0.1 / . ; - narrow glass tubes (6 m / m in diameter) are used so as to observe the change of environment.
- Each tube receives 50 ⁇ l of a suspension of M. fermentans N8 (a previous passage from a culture having turned yellow in SP4 medium, containing approximately 100 doses of turning yellow).
- Control tubes are also used, one negative containing SP4 medium and 15% fetal calf serum, the other positive, like the previous one, but also receiving the suspension of M. fermentans.
- Dilutions of test sera can also be used to determine the titer of neutralizing antibodies.
- infection with M. fermentans may have been acquired through the bloodstream at the same time (or independently for hemophiliacs) as infection with HIV.
- HIV-negative risk groups Particularly interesting are the so-called HIV-negative risk groups.
- hemophiliacs who remained seronegative, but who had continuously received before 1985 concentrates of factor VIII potentially contaminated with HIV, and often presenting slight immune deficiencies, a significant proportion (43%) possessed neutralizing anti-fermentant antibodies, markedly more than the group of HIV-positive hemophiliacs (1/18). This difference would suggest that the presence of these antibodies would confer some protective power against HIV infection, at least in this type of population.
- M. fermentans infection may be a co-factor of HIV infection and AIDS.
- this co-factor role can be exclusive or non-exclusive: non-exclusive, if we admit that the serological data obtained by the new tests described reflect a real picture of the situation: some people infected with M. fermentans at the same time or not as with HIV, others not. In this case, other species of mycoplasma (M. penetrans, M. pirum) could play a role similar to M. fermentans.
- M. penetrans, M. pirum could play a role similar to M. fermentans.
- the serological data are not in favor of a particular role for M. pirum, which is also found in low-risk HIV negative people.
- results obtained in the seronegative risk groups encourage the use of M. fermentans in an inactive form, or proteins derived from the mycoplasma, to protect against this mycoplasma from seronegative subjects exposed to HIV.
- a vaccine complementary to that of HIV could thus be obtained from this mycoplasma or from fragments of vaccinating proteins or polypeptides, as defined above.
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Abstract
L'invention concerne un procédé pour le diagnostic in vitro d'une infection antérieure d'un sujet par des mycoplasmes caractérisé par la mise en contact d'un fluide biologique prélevé chez ce sujet avec des mycoplasmes au sein d'un milieu nutritif autorisant leur développement dans des conditions permettant une interaction entre ces mycoplasmes, notamment Mycoplasma fermentans sous forme de mycoplasmes, et des anticorps contre ces mycoplasmes, éventuellement présents dans ce fluide biologique. Une réponse positive peut éventuellement être corrélée à un pronostic de séropositivité, voire de SIDA.
Description
PROCEDE POUR LA DETECTION D'INFECTIONS A MYCOPLASMES
L'importance des infections à mycoplasmes en médecine animale est reconnue. Ceci est moins le cas chez l'homme, du fait que peu d'espèces ont été reconnues comme pathogènes.
Cependant, le rôle possible de certains mycoplasmes comme co-facteurs du SIDA a été récemment envisagé par notre équipe (1) , à la suite des travaux de Lo et al. (2) et de nos propres travaux.
Plusieurs espèces de mycoplasmes ont été isolées de patients asympto atiques, infectés par le VIH et aussi atteints de SIDA.
Il s'agit de Mycoplasma fermentans, souche incognitus de Lo (3) et souche n°8 (Montagnier, réf.4) et aussi de Mycoplasma pirum (Montagnier, réf.5). Une troisième espèce a récemment été isolée de l'urine de patients atteints de SIDA par Lo et son équipe. Cette espèce est apparemment nouvelle et a reçu le nom de Mycoplasma penetrans (6) .
Dans une étude portant sur 43 échantillons d'urine provenant de 40 sujets infectés par le VIH, 10(23%) étaient positifs pour Mycoplasma fermentans par la réaction d'amplification en chaine réaction ou PCR (11) , et chez aucun séronégatif.
Dans une autre étude, les séquences d'ADN de Mycoplasma fermentans ont été trouvées dans le sang de 6/55 (11%) patients VIH séropositifs, et chez aucun individu à faible risque d'infection par le VIH (12).
Les trois espèces de mycoplasmes mentionnées ci-dessus ont en commun les propriétés d'hydrolyser l'arginine et de fermenter le glucose, et de pouvoir pénétrer facilement à l'intérieur du cytoplasme de cellules infectées.
M. piru et M. penetrans ont en commun une extrémité différenciée capable de se fixer à la cellule et probablement de permettre la pénétration.
In vitro, ces mycoplasmes sont capables d'augmenter considérablement le pouvoir cytopathogène du VIH-1 et du VIH-2 sur des lymphocytes T4 ou des lignées tumorales dérivées (7) (8) (9).
En outre, des extraits de M. pirum peuvent restaurer le potentiel de multiplication d'une souche de VIH-1 apparemment débarrassée de sa contamination mycoplasme (1) .
Enfin, un anticorps dirigé contre le site d'adhésion de M. genitalium (proche de M. pirum) peut inhiber la réplication de certaines souches du V H-1 (10) et du VIH-2.
La faiblesse de l'immunité humorale dirigée contre les mycoplasmes dans d'autres types d'affections dans lesquels ils ont déjà pu se trouver impliqués (pour une documentation générale relative aux mycoplasmes, on peut se reporter au chapitre 10 intitulé "The Mycoplasmas" de l'ouvrage intitulé Bergey Manual, ou encore au chapitre intitulé "The molliculites Mycoplasmas and ureaplasmas" de J.G. Tully and S. Razin, dans l'ouvrage intitulé "Practical handboo of Microbiology" édité par William M. O'Leary, 1989, édité par CRC Press, Inc., Boca Raton, Floride, USA) ne représentait pas jusqu'à ce jour une voie d'accès
réellement explorable pour le diagnostic in vitro d'infections par des mycoplasmes ou d'affections distinctes susceptibles d'être mise en corrélation avec une infection par des mycoplasmes.
La présente invention vise à déterminer la présence d'anticorps anti-fermentans dans le sérum et les autres fluides biologiques, mais elle peut être appliquée à tout autre mycoplasme analogue.
L'invention découle de l'observation -nouvelle pour fermentans, même si une observation semblable a pu être faite dans le passé pour certains mycoplasmes non humains- que le cycle vital du mycoplasme passe par une forme extrêmement compacte que nous appelons ici "mycosphère".
Ces mycosphères, dont le diamètre moyen est de l'ordre de 160 n , se forment par des étranglements successifs des formes filamenteuses, qui sont les formes de croissance du mycoplasme.
Il a été constaté que ces mycosphères, du moins celles de M. Fermentans, présentent un certain degré de stabilité même en milieu acide, contrairement à ce qui a pu être observé pour d'autres mycoplasmes ayant déjà donné lieu à l'observation de "mycosphères".
En outre les mycoplasmes se présentant sous cette forme sont plus aisément reconnus par des sérums prélevés chez des patients infectés par ces mycoplasmes.
La possibilité offerte par l'invention de permettre la détection d'anticorps anti fermentans dans un fluide biologique, notamment un sérum, a également ouvert la voie, notamment à deux formes de détection in vitro d'infections par ce type de mycoplasmes. Il s'est en effet avéré que les
anticorps contenus dans les sérums de patients infectés et capables de reconnaître M. anti- fermentans sous forme de mycosphères, avaient des propriétés séroneutralisantes qui pouvaient être mises à profit pour inhiber le développement d'un inoculum de mycoplasmes correspondant amené à son contact au sein d'un milieu de culture approprié, la constatation d'une inhibition éventuelle "signant" alors la présence des anticorps du genre en question dans le fluide biologique testé.
Dans sa forme la plus générale, le procédé selon l'invention pour le diagnostic in vitro dans un fluide biologique d'une infection antérieure par des mycoplasmes est caractérisé par la mise en contact de ce fluide biologique au sein d'un milieu nutritif approprié avec des mycoplasmes dans des conditions permettant une interaction entre ces mycoplasmes et des anticorps reconnaissant ces mycoplasmes et éventuellement présents dans ce fluide biologique.
Dans l'une des formes de mise en oeuvre de ce procédé, le diagnostic in vitro repose sur la mise en évidence d'une action neutralisante de ces anticorps contre lesdits mycoplasmes, lorsque ceux- ci sont amenés au contact du fluide biologique étudié au sein d'un milieu de culture approprié. La visualisation de l'action neutralisante peut être faite par tout moyen approprié.
Avantageusement, on peut avoir recours à l'utilisation des manifestations d'un indicateur de réaction susceptible d'être affecté par l'un des produits libérés à l'occasion du développement du mycoplasme, par exemple un indicateur de changement de pH permettant de détecter la production d'acide
lactique, lorsque le milieu de culture utilisé contient du glucose et que celui-ci subit une fermentation par le mycoplasme au cours de son développement.
Ainsi la présence, d'anticorps anti-mycoplasmes dans l'échantillon étudié se manifestera-t'elle par l'inhibition du développement du micro-organisme. Au contraire, on observera un développement des mycoplasmes, par conséquent une acidification du milieu, en l'absence des anticorps dans l'échantillon.
Les méthodes de diagnostic in vitro d'une infection par des mycoplasmes sont plus faciles et plus sensibles à mettre en oeuvre lorsque, comme M. fermentans, le mycoplasme étudié peut être isolé et produit à l'état de mycosphères. Celles-ci donnent alors lieu à des réactions d'agglutination plus sensibles, lorsqu'elles sont amenées au contact de prélèvements biologiques, notamment sérums sanguins contenant des anticorps anti-mycoplasmes.
Il faut noter que dans le sérum des patients le titre d'anticorps neutralisants est extrêmement faible et ne dépasse pas le 1/20, ce qui explique la difficulté à détecter lesdits anticorps par les méthodes classiques.
Lorsque ces mycosphères peuvent être produites et conservées, elles constituent un réactif de choix pour le diagnostic d'une infection à mycoplasmes.
A ce titre, les mycosphères de M. fermentans, en particulier la souche M. fermentans souche n08, déposée à la CNCM sous le numéro 1-949, le 22 mai 1990, constituent des produits nouveaux, notamment pour la réalisation de kits de détection in vitro d'infections dues à des mycoplasmes.
Le procédé de production de mycosphères de fermentans (illustré par un exemple présenté plus loin) comporte la culture d'une telle souche de mycoplasmes dans le milieu SP4 (13) .
L'invention réside aussi dans l'obtention à volonté de ces formes en laissant vieillir les cultures en milieu SP4.
Le sérum de patients infectés par le mycoplasme contient des anticorps qui agglutinent les mycosphères. L'agglutination peut être détectée en coloration négative au microscope électronique. Elle peut aussi plus pratiquement être détectée à l'oeil nu par agglutination de microbilles sur lesquelles ont été fixées les mycosphères.
En outre, un certain nombre de ces sérums ont le pouvoir de neutraliser la croissance du mycoplasme, particulièrement à partir des mycosphères. Cependant, le titre des anticorps est faible, 1/6 à 1/10, de sorte qu'il n'avait pu être détecté par les autres méthodes.
Le milieu SP4 est préparé, notamment comme suit à partir d'un "milieu de base" lui-même constitué à partir des composants suivants, commercialisés par la société DIFCO :
- DIFCO "PPL Broth" : 1 g
- DIFCO peptone : 1,6 g
- DIFCO tryptone : 3 g
Le milieu de base est lui-même obtenu par addition d'eau pyrolisée jusqu'à obtenir un volume de 200 ml dont le pH est finalement ajusté à 7,8.
Le "milieu de base" ainsi obtenu est stérilisé par autoclavage 15' à 120"C.
Le milieu complet (SP4) est obtenu en ajoutant aux 200 ml du milieu de base :
2,7 ml d'une solution d'ampicilline dosée à 66 mg/ml
- 30 ml d'un extrait de levure "Yeast extract GIBCO"
- 15 ml d'un milieu lui-même obtenu à partir de CMRL 1066 (GIBCO) complété avec de la glutamine à raison de 3 mg/1 de fluide et sans bicarbonate
- 3 ml d'une solution de glucose à 50%
- 0,6 ml d'une solution de rouge de phénol (1%)
- 50 ml de sérum de veau foetal (GIBCO) .
Le milieu complet est alors filtré sur membrane (mailles de 0,22 μm) . Le filtrat peut être stocké à 4°C pendant 2 semaines.
L'un des avantages particuliers des mycosphères de mycoplasmes, notamment de M. fermentans, réside dans leur capacité à être fixées par l'intermédiaire de liaisons covalentes, sur des supports immunologiquement inertes, d'où la possibilité de visualiser les réactions entre les antigènes (en 1'occurence les mycosphères couplées à des supports immunologiquement inertes) et les anticorps éventuellement contenus dans le prélèvement biologique à l'étude, grâce à des réactions d'agglutination ou d'hémagglutination.
Avantageusement les supports immunologiquement inertes sont constitués par des micro-supports ou microbilles en latex ou toute autre matière adéquate (plastique, silicate, bille de dextran, etc) .
Le couplage par liaison covalente de ces mycosphères pour micro-supports ou microbilles peut être réalisé de toute façon en soi connue. A titre d'exemple, on pourra mettre en oeuvre les techniques décrites par Brandt et al ou par Avraméas et al, qui on fait l'objet de publications dans des articles
dont les références bibliographiques sont fournies plus loin.
La détection rendue possible grâce à l'invention de la présence d'anticorps anti- mycoplasmes dans des prélèvements biologiques, notamment sérums, de sujets infectés par des mycoplasmes, a également confirmé la corrélation qui avait déjà été faite chez un grand nombre de patients, de la coexistence d'infections à la fois par des mycoplasmes et par un VIH. L'invention s'est avérée ouvrir une nouvelle voie de dépistage à un stade très précoce d'une éventuelle infection par le VIH chez des sujets à haut risque.
En particulier, il est constaté dans de nombreux cas, que la détection d'une infection par des mycoplasmes, notamment du type M. fermentans, dans les conditions évoquées ci-dessus, précède la détection d'une séropositivité par les tests classiques mettant en oeuvre la réalisation d'un contact immunologique entre le prélèvement biologique à l'étude et un antigène ou une composition d'antigènes caractéristique du VIH.
L'invention concerne donc également des kits pour le diagnostic d'un infection due à des mycoplasmes, le réactif principal de ces kits consistant alors dans un mycoplasme, notamment sous forme de mycosphères, ou un antigène de mycoplasmes.
Dans une forme préférée de kit, du moins lorsque le mycoplasme étudié peut être produit et isolé sous forme de mycosphères, le réactif principal consiste en un conjugué entre ce mycoplasme et des particules supports inertes permettant la réalisation de réaction d'agglutination, ou même d'hémagglutination.
Pour la mise en évidence d'une infection par mycoplasmes mettant en jeu les propriétés séroneutralisantes des anticorps éventuellement présents dans les échantillons ou prélèvements biologiques à étudier, -les kits du genre en question contiennent à titre de constituants princeps :
- des mycoplasmes sous forme lyophilisée ou congelée susceptibles d'être remis en culture ; les milieux de culture appropriés propres à recevoir à la fois les mycoplasmes et échantillons ou prélèvements biologiques à étudier ;
- l'indicateur ou les indicateurs de l'éventuelle croissance de la culture de mycoplasmes.
L'invention concerne encore des kits comportant, outre les réactifs principaux rappelés ci-dessus, des antigènes synthétiques ou naturels susceptibles d'être reconnus par des anticorps caractéristiques du VIH, dès lors que l'échantillon ou prélèvement biologique en contient.
L'invention concerne également des compositions de vaccins anti-mycoplasmes essentiellement caractérisées par des formes atténuées ou tuées de mycosphères de mycoplasmes, en particulier de M. fermentans, ou des protéines ou des peptides dérivés de ces mycosphères ainsi que de leurs fragments ; ceux-ci peuvent être obtenus par hydrolyse enzymatique, par exemple avec la protéine V8, ou par synthèse chimique ou encore par expression de séquences nucléotidiques correspondant aux séquences peptidiques des susdits fragments par des techniques de génie génétique. Les fragments de protéines ou de peptides dérivés des susdites mycosphères sont naturellement caractérisés par leur capacité à être
reconnus par les mêmes anticorps que les mycosphères elles-mêmes.
L'invention apporte à ce titre un vaccin complémentaire permettant de retarder, sinon d'enrayer, le développement du SIDA chez des sujets séropositifs ou à haut risque de le développer. Cette vaccination prend toute sa valeur dès que l'on admet que l'annihilation chez le sujet des mycoplasmes peut également entraîner un ralentissement de l'activité virale du VIH chez le sujet séropositif ou potentiellement séropositif.
Des formes de réalisation préférée de l'invention et les résultats qui ont déjà été obtenus par la mise en oeuvre de l'invention sont indiquées ci-après, à titre d'exemples non limitatifs.
I. Préparation des mycosphères
La souche n°8 (déposée à la Collection Nationale des Microorganismes) , isolée d'un patient asymptomatique infecté par le VIH, est cultivée dans un milieu SP4 (13) , chaque passage recevant 1/50 d'inoculu d'un passage précédent (environ 100 doses changeant la couleur) . Le changement de couleur lié à la glycolyse apparaît en général vers le jour 5.
A partir de ce jour, des échantillons sont quotidiennement examinés au microscope électronique pour estimer le degré de transformation en mycosphères.
Lorsque ce changement atteint 90%, la culture est arrêtée, la suspension est répartie en aliquots de 1ml qui sont congelés à -135°C. La transformation en mycosphères est liée à l'épuisement du milieu et à la baisse du pH.
II. Agglutination par des anticorps spécifiques
Les sérums sont préparés à partir de sang prélevé chez les patients sur des tubes secs. Ils sont conservés à +4°C jusqu'à leur usage.
Pour 1'immuno-agglutination observée en microscopie électronique, ils sont dilués au 1/5 dans du PBS et filtrés sur filtres Millipore de 0,22 microns.
On utilise des grilles Mesch 200 en cuivre, recouvertes d'un film de collodion et d'un film de carbone.
Les grilles sont disposées sur les sérums dilués pendant 10 minutes à la température du laboratoire et absorbées sur papier filtre afin d'éliminer le surplus de sérum. Elles sont déposées sur une suspension de mycosphères pendant 30 minutes puis sont absorbées sur papier-filtre et colorées au molybdate d'amomium à 6% dans l'eau distillée pendant 2 minutes.
Ces grilles sont examinées au microscope électronique (par exemple "Jeol" JEM 1200 EXII) à une tension d'accélération de 80 Kv et à un grandissement direct de 50.000. Les photos sont prises sur des plans films Kodak 6,5 X 9, réf. 4489.
Si le sérum n'a pas d'anticorps agglutinants, on observe que les mycosphères demeurent dispersées, ou existent en petits paquets quelques unités. Si le sérum est agglutinant, on observe de larges agrégats de plusieurs dizaines de mycosphères. III. Détection des anticorps par agglutination de microbilles
Une méthode plus simple et plus facile à utiliser en laboratoire de routine consiste à lier les mycosphères par liaison covalente (par exemple par la technique de Brandt et al, Biochemica
Biophysica Acta 1975, 386, p 196-202 ou la technique d'Avraméas et al décrite dans le brevet US n°4.925.921 délivré le 15/05/90 ou encore la technique décrite dans la demande de brevet PCT n°82/00203 déposée le ,8/07/81) à des microbilles de latex ou de toute autre matière adéquate (plastique, silicates, billes de dextran, etc) .
Ces billes sont ensuite incubées avec différentes dilutions de sérum et on observe, soit à l'oeil nu, soit au microscope optique à faible agrandissement, la présence d'un culot compact, si l'agglutination est positive.
Dans le cas contraire, les microbilles restent dispersées.
On peut, à partir de la plus grande dilution de sérum causant l'agglutination, calculer le titre des anticorps. IV. Recherche des anticorps neutralisants
Les sérums de certains patients renferment également des anticorps capables de neutraliser la croissance de M. fermentans en milieu SP4.
Cette croissance se traduit par une inhibition du changement de coloration du rouge au jaune du milieu SP4. En effet, ce milieu contient du rouge de phénol capable de virer au jaune en pH acide. L'acide lactique produit par la fermentation du glucose par le mycoplasme va entraîner cette acidification.
Pour effectuer ce test, on procède de la façon suivante :
- o,2 ml du sérum à tester sont ajoutés à 1,1 ml de milieu SP4 (soit 15,4 %) ;
- le mélange est filtré successivement sur filtre Millipore 0,22 m, puis 0,1/. ;
- on utilise des tubes de verre étroit (6 m/m de diamètre) de façon à bien observer le changement de milieu.
Chaque tube reçoit 50 μl d'une suspension de M. fermentans N8 (un passage précédent d'une culture ayant bien viré au jaune en milieu SP4, contenant approximativement 100 doses de virage au jaune) .
On utilise également des tubes témoins, l'un négatif contenant le milieu SP4 et 15 % de sérum de veau foetal, l'autre positif, comme le précédent, mais recevant également la suspension de M. fermentans.
Trois jours après, on regarde les changements de couleur des tubes, par rapport au témoin positif qui a viré au jaune.
On peut également utiliser des dilutions de sérums à tester pour déterminer le titre d'anticorps neutralisants.
On trouvera ci-après un tableau donnant des résultats obtenus sur 141 sérums avec cette méthode. On notera que la présence de ces anticorps signifie :
1/ que la personne a été infectée par M. fermentans, probablement jusqu'à une infection systémique puisque la présence d'anticorps sériques est rarement trouvée dans des infections urogénitales locales à mycoplasme ;
2/ que la présence d'anticorps neutralisants, même à un taux faible, signifie que la personne a une certaine protection contre le mycoplasme. Le titre observé cependant ne dépasse pas en général 1/10 à 1/20 ;
La compilation des résultats montrent une réponse significative différente suivant les groupes.
Dans un échantillon correspondant à une population faiblement exposée au VIH, on n'a trouvé aucun sérum neutralisant M. fermentans, alors que dans les mêmes conditions, on observe assez fréquemment des anticorps neutralisants contre M. pneumoniae et M. pirum.
Ceci correspond aux données déjà publiées dans la littérature qui montrent que l'infection par M. fermentans est rare dans la population générale.
Par contre, chez un groupe de séropositifs, près d'un tiers ont des anticorps anti-fermentans. Ces anticorps existent à tous les stades de l'infection, même précoces, bien qu'ils tendent à disparaître à la phase terminale de la maladie, comme on l'a observé chez un patient dont on disposait des sérums pendant 3 ans.
On n'a pas observé par contre d'augmentation significative de la proportion de sérums ayant des anticorps anti-M. pneumoniae ou anti-M. pirum.
Il est à remarquer d'autre part que plusieurs sérums ayant des anticorps neutralisants vis-à-vis de M. fermentans provenaient de patients, soit ayant été infectés par le VIH par transfusion sanguine (un cas) , soit par des produits antihémophiles (un cas) , soit d'africains (deux cas) .
Ceci suggère que l'infection par M. fermentans a pu être acquise par vois sanguine en même temps (ou indépendamment pour l'hémophile) que l'infection à VIH.
Particulièrement intéressants sont les groupes dits à risque séronégatifs.
Dans le groupe des hémophiles, restés séronégatifs, mais ayant reçu continuellement avant 1985 des concentrés de facteur VIII potentiellement contaminés par le VIH, et souvent présentant de légers déficits immunitaires, une proportion importante (43 %) possède des anticorps neutralisants anti-fermentans, nettement plus que le groupe d'hémophiles VIH-séropositifs (1/18) . Cette différence suggérerait que la présence de ces anticorps conférerait un certain pouvoir protecteur contre l'infection à VIH, au moins dans ce type de population.
Chez les individus exposés au VIH par transmission sexuelle (notamment des partenaires restés VIH séronégatifs de personnes VIH séropositives) , là aussi une forte proportion (38 %) possède des anticorps neutralisants anti-fermentans.
En conclusion, ces résultats suggèrent que l'infection à M. fermentans peut constituer un co- facteur de l'infection à VIH et du SIDA. Dans l'état actuel de nos données, ce rôle de co-facteur peut être exclusif ou non exclusif : non exclusif, si on admet que les données sérologiques obtenues par les nouveaux tests décrits reflètent un tableau réel de la situation : certaines personnes infectées par M. fermentans en même temps ou non que par VIH, d'autres non. Dans ce cas, d'autres espèces de mycoplasmes (M. penetrans, M. pirum) pourraient jouer un rôle analogue à M. fermentans. Cependant, les données sérologiques ne sont pas en faveur d'un rôle particulier de M. pirum, que l'on trouve aussi bien chez des séronégatifs à faible risque.
exclusif, si l'on admet que la présence d'anticorps -et surtout neutralisants- n'est pas constante chez les sujets infectés par M. fermentans. Cependant, d'autres méthodes, en principe plus sensibles,, telles la recherche du DNA du mycoplasme par PCR ne donnent pas des résultats sensiblement différents de ceux donnés par la sérologie.
Quoiqu'il en soit, la détection sérologique de l'infection à M. fermentans peut apporter un paramètre nouveau à l'étude de l'évolution des séropositifs. Il est possible qu'il constitue un élément, défavorable, du pronostic du SIDA.
En outre, les résultats obtenus chez les groupes à risque séronégatifs, incitent à utiliser M. fermentans sous forme inactive, ou des protéines dérivées du mycoplasme, pour protéger vis-à-vis de ce mycoplasme des sujets séronégatifs exposés au VIH.
Un vaccin complémentaire de celui du VIH pourrait ainsi être obtenu à partir de ce mycoplasme ou des fragments de protéines ou polypeptides vaccinants, tels qu'ils ont été définis plus haut.
RESULTAT DU TEST D'INHIBITION METABOLIQUE DE LA
CROISSANCE DE M. FERMENTANS (N8) EN MILIEU
SP4 PAR DES SERUMS HUMAINS DILUES AU 1/6
I. VIH séronégatifs, faible risque 0/34 (<2.9%
II. VIH séronégatifs, haut risque
(par transmission sexuelle) 5/13 (38%)
III. Hémophiles, VIH séronégatifs, haut risque
(par concentrés jusqu'en 1985) 6/14 (43%)
IV. Hémophiles, VIH séropositifs 1/18 (5,5%)
V. VIH séropositifs
(par transmission sexuelle) 20/62 (32%)
FEUILLE DE REMPLACEMENT
BIBLIOGRAPHIE
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5. Dépôt CNCM
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Newly discovered mycoplasma isolated from patients infected with HIV. Lancet, 388, 1415-1418, 1991.
7. Lemaître M., Guétard D. , Hénin Y., Montagnier
L. and Zérial A. Protective activity of tetracycline analogs against the cytopathic effect of the human immunodeficiency viruses in CEM cells. Res. Virol., 141/ 5-16, 1990.
8. Lo S.-C, Tsai S., Benish J.R. , Shih J.W.-K., Wear D.J. and Wong D.M.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Enhancement of HIV-l cytocidal effects in CD4+ lymphocytes by the AIDS-associated mycoplasma. Sciences, 251, 1074-1076, 1991.
9. Lemaître M., Hénin Y., Destouesse F., Ferrieux C. , Montagnier L. and Blanchard A.
Rôle of mycoplasma infection in the cytopathic effect induced by hu an immunodeficiency virus type 1 in infected cell lines. Infect. Immun. , 0,742-748, 1992.
10. Montagnier L. , Berneman D. , Guétard D. , Blanchard A., Chamaret S., Rame V., Van Rietschoten J. , Mabrouk K. and Bahraoui E. Inhibition de l'infectiosité de souches prototypes de VIH par des anticorps dirigés contre une séquence peptidique de mycoplasme. CR. Acad. Sci. Paris, 311, Série III, 425-430,
1990.
11. Dawson M.S., Wang R. , Hayes M. et al. Détection and isolation of Mycoplasma fermentans from urine of patients with AIDS (abstract G-4) .
In : Program and abstracts gênerai meeting of the American Society for Microbiology (Dallas) . Washington DC. American Society for Microbiology, 1991.
12. Hawkins R.E., Rickman L.S., Vermund S.H. and Mitchell C.
Association of Mycoplasma and human immunodeficiency virus infection : détection of amplified Mycoplasma fermentans DNA in blood. J. of Infect. Diseases, 165, 581-585, 1992.
13. Whitcomb R.F.
Culture média for spiroplasmas. •Methods Mycoplasmol. , 1 , 147-158, 1983.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Claims
1. Procédé de détection in vitro d'anticorps résultant d'une infection antérieure d'un sujet par des mycoplasmes caractérisé par la mise en contact d'un fluide biologique prélevé chez ce sujet avec des mycosphères obtenues au sein d'un milieu nutritif autorisant le développement des mycoplasmes en mycosphères dans des conditions permettant une interaction entre ces mycosphères et des anticorps contre des mycosplas es, éventuellement présents dans ce fluide biologique.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par la mise en évidence d'une action neutralisante de ces anticorps contre lesdits mycoplasmes.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la susdite mise en évidence repose sur la détection d'une éventuelle interaction entre un produit libéré dans le milieu de culture par le mycoplasme à l'occasion de son développement en mycosphère et un indicateur capable de détecter ce produit.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par la mise en évidence d'une agglutination, notamment hémagglutination, lorsque le milieu biologique est un sérum sanguin, de ces mycosphères par lesdits anticorps.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les mycosphères sont fixées de façon covalente à des microsupports immunologiquement inertes.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 6, caractérisé en ce que les mycosphères sont issues de mycoplasmes appartenant à l'espèce Mycoplasma fermentans.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 appliqué à l'établissement d'une corrélation éventuelle avec un pronostic du SIDA, en particulier chez des sujets à haut risque, non encore séropositifs.
8. Procédé de détection d'anticorps neutralisants dans un liquide biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact ledit fluide biologique avec les mycoplasmes, au sein d'un milieu nutritif autorisant le développement de ces mycoplasmes en mycosphères, et en ce que l'on mesure la capacité dudit fluide biologique à inhiber ce développement en mycosphères.
9. Kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par un mycoplasme dans un échantillon ou prélèvement biologique, notamment sérum, caractérisé par la coexistence dans ce kit du réactif principal que constitue un mycoplasme à l'état congelé ou lyophilisé, propre à être mis en culture, et des éléments constitutifs d'un milieu de culture de ces mycoplasmes.
10. Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce que le mycoplasme, notamment M. fermentans, est à l'état de mycosphères susceptibles d'être préservées dans cet état, à l'état congelé, notamment dans un milieu SP4.
11. Kit selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il contient un réactif principal distinct consistant en un antigène ou composition d'antigènes susceptible d'être reconnu immunologiquement par les anticorps anti-VIH contenus dans le sérum d'un sujet séropositif.
12. Mycosphères de M. fermentans.
13. Composition vaccinante contre des mycoplasmes caractérisée en ce que le principe actif est constitué par des mycosphères de Mycoplasma fermentans ou par des fragments de protéines ou de polypeptides de M. fermentans reconnus par les anticorps qui reconnaissent également M. fermentans.
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| FR929209626A FR2694402B1 (fr) | 1992-08-03 | 1992-08-03 | Nouveau procédé pour la détection d'infections à mycoplasmes et son application au traitement et à la prévention du sida. |
| FR92/09626 | 1992-08-03 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2008135977A1 (fr) | 2007-05-03 | 2008-11-13 | Mor Research Applications Ltd. | Procédé de détection d'une infection urogénitale à mycoplasmes chez l'être humain et trousse de diagnostic de ladite infection |
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| EP0278340A2 (fr) * | 1987-02-05 | 1988-08-17 | Yehudith Naot | Antigènes membranaires du mycoplasma et leur utilisation |
| EP0457685A1 (fr) * | 1990-05-18 | 1991-11-21 | Institut Pasteur | Nouveaux mycoplasmes - moyens pour détecter et caractériser des mycoplasmes in vitro |
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Patent Citations (2)
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| DATABASE WPIL Week 9226, Derwent Publications Ltd., London, GB; AN 92-213907 * |
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Also Published As
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| FR2694402A1 (fr) | 1994-02-04 |
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