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WO1994001535A1 - Process for co-cultivating a type of cells with liver cells - Google Patents

Process for co-cultivating a type of cells with liver cells Download PDF

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WO1994001535A1
WO1994001535A1 PCT/EP1993/001756 EP9301756W WO9401535A1 WO 1994001535 A1 WO1994001535 A1 WO 1994001535A1 EP 9301756 W EP9301756 W EP 9301756W WO 9401535 A1 WO9401535 A1 WO 9401535A1
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cells
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culture
cell
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Augustinus Bader
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Augustinus Bader
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Definitions

  • the invention relates to a method for the in vitro production of hepatocellular products and to the possibility of the action of these products on a second cell type in a stable cellular test system.
  • test system that could run under in vivo conditions would e.g. a special meaning for:
  • pro-cytostatic agents which are metabolized, i.e. an enzymatic conversion in the liver to substances that are more easily excreted and converted into their toxic form for a tumor.
  • Such a precursor form administered to a patient has few side effects for the entire organism. This means that such substances represent the ideal case of anti-cancer drugs.
  • the cells were mixed in a two-dimensional layer, as a result of which it was no longer possible to selectively separate them in a simple manner. This means the test system is not reusable.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a method for cultivating a cell type in the co-culture method, in which conditions for examining this cell type can be achieved at least approximately in vivo over a longer period of time.
  • this object is achieved by cultivating liver cells on a support using the sandwich method, between or over which a second cell type to be examined is applied.
  • the above-mentioned problem is solved in a three-dimensional culture system by growing the second cell type to be examined within or preferably above this structure.
  • One of the advantages of the inventive / 3s form of the co-culture method is as / 3 is maintained in this way a polari ⁇ catalyzed anchoring of the hepatocytes.
  • the process according to the invention thus consists of three techniques, some of which are known, namely membrane oxygenation by a support, a sandwich process for the cultivation of liver cells, and a co-culture process which is new in this form.
  • This procedure eliminates oxygenation problems, maintains a stable liver cell culture and, at the same time, allows a cell type to be cultured through which effects can be investigated. which are generated, for example, by the liver cells and their metabolizing capacity.
  • liver cells and the second cell type to be examined are stacked, their separation e.g. can be done by a matrix layer, if necessary, both cell types can be selectively separated from each other. This can e.g. by adding an enzyme to the cultivated cell type above. For example, Trypsin was found to be a suitable enzyme for detaching the cells.
  • the longer-term functional stability of the liver cells and the detachability of a cell type while maintaining the liver cells immobilized in the sandwich system also enables the test system to be reused.
  • another cell type to be tested can be grown again after washing the system. This is particularly important because human cells, e.g. human liver cells are not available indefinitely.
  • FIG. 1 shows a method for cultivating a cell type in the co-culture method with cell types arranged one above the other;
  • FIG. 2 shows a method for growing a cell type in a coculture method with cell types arranged one inside the other or next to one another.
  • an at least gas-permeable membrane 1 is first coated with a matrix 2 as a carrier.
  • a support can be used which consists of a material with correspondingly large pores or has holes through which oxygen is passed or diffuses.
  • sintered metal disks are suitable, into which an oxygen source from oxygen leads into channels or bores in the interior of the disk, from where the oxygen is passed on to the surface of the membrane 1 via corresponding bores or pores.
  • Porous plastics or cellulose are also suitable as membrane 1.
  • matrix 2 e.g. a proteinaceous layer may be used, e.g. Collagen. If necessary, further components such as e.g. Glycosaminoglycans or glycoprotein can be added if necessary. Such components perform inductive functions on hepatocytes. Hepatocytes, i.e. Liver cells 3 are embedded polarized in or over the matrix 2.
  • V 79 cells or lymphocytes can be used as a cell type for co-culture with the hepatocytes. These cells are particularly advantageous for mutagenicity tests.
  • the matrix 2 also serves to improve the adhesion of the liver cells 3. If necessary, the liver cells 3 could also be placed directly on the membrane 1, without the matrix 2 in between, if this membrane enables the liver cells 3 to adhere, e.g. Polyurethane films, polypropylene or organic membranes, such as e.g. human or animal connective tissue.
  • the liver cells 3 can be isolated in a known manner by collagenase digestion of the connective tissue structure of a liver and then washed. After the liver cells 3 have been applied to the first matrix layer 2, it is possible to start applying a second matrix layer 4 over the liver cells 3 after about 30 minutes to 1 hour using collagen as the basal adhesive structure.
  • the second matrix layer 4 serves to anchor the liver cells 3 with their cell membranes lying on top of this structure. In the same way as for the first matrix layer 2, further substances can optionally be added to the second matrix layer 4.
  • any second or even several cell types 5 can be applied above it.
  • culture or nutrient medium 6 is applied in one layer over the upper cell layer 5 to be examined.
  • an additional attachment of a third matrix layer can be provided over the cell type 5 to be examined. This is indicated in FIG. 1 by the dashed line 7.
  • the layer of culture or nutrient medium 6 represents the upper closure / 3 above the third matrix layer 7.
  • a third matrix layer 7 will generally be provided if, for example, the upper cells 5 to be examined are also liver cells.
  • a co-culture of liver cells 3 with any second cell type 5 is possible with the method shown, while maintaining a long-term stable hepatocellular phenotype. Since the oxygen supply to the liver cells 3 is ensured by membrane oxygenation, any other cell type can be grown in a conventional manner on the basis of the second upper collagen layer 4.
  • the cell type 5 to be examined is supplied from above via the culture or nutrient medium 6.
  • Fig. 1 e.g. Toxicity tests of pharmaceuticals possible because cells from target organs of potential toxicity can be combined directly with a human metabolism system. This therefore offers the possibility of a screening process, i.e. a screening of several substances.
  • the method according to FIG. 1 can also be included in a dynamic culture medium cycle.
  • this second cell type 5 can also be applied to a separate carrier (not shown). be applied. This carrier is then placed together with those Rinsed cells with the metabolite-rich medium from the liver cell system. Approaching the second carrier with the second cell type 5 in such a way that there is a gap with culture medium between the two systems is then possible.
  • FIG. 2 shows a procedure in which cell type 5, e.g. Nerve cells are added directly to the liver cells 3 within the sandwich system, a second matrix layer 4 is formed over the combined cell layer in the same way as in the method according to FIG. 1, and again a layer of a culture or nutrient medium 6 arranged.
  • the oxygen supply takes place in the same way from below through the membrane 1.
  • a simple, non-gas-permeable plate can also be used as the carrier.
  • the cells would then have to be examined in a special incubator in which the oxygen partial pressure can be increased to such an extent that the liver cells are adequately supplied with oxygen.
  • a gas-permeable membrane will generally be used for reasons of simplicity and easier feasibility.

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Abstract

A process is disclosed for co-cultivating a type of cells. Liver cells (3) are cultivated on a support (1) according to a sandwich process, and the second type of cells to be analysed (5) is applied thereupon or therebetween.

Description

Verfahren zum Züchten einer Zellart im Kokulturverfahren mit Leberzellen Process for growing a cell type in a co-culture process with liver cells
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Her¬ stellung hepatozellulärer Produkte und eine Ermögli¬ chung der Einwirkung dieser Produkte auf eine zweite Zellart in einem stabilen zellulären Testsystem.The invention relates to a method for the in vitro production of hepatocellular products and to the possibility of the action of these products on a second cell type in a stable cellular test system.
Bisher ist kein funktionell in vitro stabiles Testsy¬ stem für eukaryonte Zellen bekannt, in dem der Einflu3 von Medikamenten oder chemischen Substanzen und zu¬ gleich auch deren Metaboliten auf eine beliebige Zell¬ art hinsichtlich der Gesamtheit ihrer Wirkung unter¬ sucht werden konnte.So far, no functionally stable in vitro test system for eukaryotic cells is known in which the influence of drugs or chemical substances and, at the same time, also their metabolites on any cell type could be examined with regard to the entirety of their action.
Ein Testsystem, das unter in vivo Bedingungen ablaufen könnte, hätte jedoch z.B. eine besondere Bedeutung für:However, a test system that could run under in vivo conditions would e.g. a special meaning for:
1. Die Entwicklung von Vorläufermedikamenten. Als Bei¬ spiel hierfür sind Prozytostatika zu nennen, die durch eine Metabolisierung, d.h. eine enzymatische Umwandlung in der Leber zu besser ausscheidbaren Substanzen, in ihre, für einen Tumor toxische Form übergeführt werden. Eine derartige, einem Patienten verabreichte Vorläuferform ist für den Gesamtorga¬ nismus nebenwirkungsarm. Dies bedeutet, derartige Substanzen stellen den Idealfall krebshemmender Me¬ dikamente dar.1. The development of precursor drugs. As an example, pro-cytostatic agents are to be mentioned, which are metabolized, i.e. an enzymatic conversion in the liver to substances that are more easily excreted and converted into their toxic form for a tumor. Such a precursor form administered to a patient has few side effects for the entire organism. This means that such substances represent the ideal case of anti-cancer drugs.
2. Eine Identifizierung von Mutationen verursachenden Substanzen, oder Karzinogenen. Bekanntlich sind be- stimmte in der Umwelt vorkommende Substanzen primär nicht krebserregend, werden aber nach Aufnahme in den menschlichen Organismus und nach erfolgter Metabolisierung aktiviert und damit krebserregend.2. Identification of mutation-causing substances or carcinogens. As is well known, certain substances found in the environment are primarily not carcinogenic, but are activated after being absorbed into the human organism and after metabolism and thus carcinogenic.
3. Zu Toxizitätsuntersuchungen. Bekanntlich müssen neuentwickelte Medikamente oder chemische Substan¬ zen hinsichtlich einer potentiellen toxischen Wir¬ kung untersucht werden. Eine Vielzahl von Medika¬ menten wirkt jedoch vor allem durch ihre Metaboli¬ sierung und eine speziesabhängig unterschiedlich ausgeprägte Entgiftungsfähigkeit toxisch.3. Toxicity studies. As is known, newly developed drugs or chemical substances have to be investigated with regard to a potential toxic effect. However, a large number of medications have a toxic effect, above all due to their metabolism and a detoxification capacity which differs depending on the species.
4. Zur Untersuchung von Interaktionen. Darunter sind Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellarten zu verstehen.4. To study interactions. This means interactions between different cell types.
Bei den unter 1 bis 3 genannten Fällen handelt es sich insbesondere um Substanzen, die erst nach einer Meta¬ bolisierung in ihre aktive "Wirkform" übergeführt wer¬ den. Bekannt ist nun zu dessen Prüfung, die zu testen¬ den Substanzen entweder Tieren zu verabreichen, oder nach einer Metabolisierung in einem Enzymgemisch auf bestimmte Zellarten zu applizieren oder auch in einem herkömmlichen Monolayerkokultursystem zwischen Leber¬ zellen und einer weiteren Zellart zu untersuchen.The cases mentioned under 1 to 3 are in particular substances which are only converted into their active “mode of action” after metabolism. To test it, it is now known to either administer the substances to be tested to animals, or to apply them to certain cell types after metabolism in an enzyme mixture or to investigate them in a conventional monolayer culture system between liver cells and another cell type.
Nachteilig bei diesen bekannten Verfahren ist jedoch unter anderem, da3 gravierende Unterschiede im Muster der Metabolitenentstehung nicht nur zwischen verschie¬ denen Tierarten sondern insbesondere auch zwischen Mensch und Tier vorhanden sind. Dies bedeutet, alle Substanzen, deren aktive oder toxische Form erst nach einer Metabolisierung in einem menschlichen Stoffwech- selsystem entstehen können, sind in Tierversuchen nicht brauchbar zu ermitteln.However, a disadvantage of these known methods is, among other things, that there are serious differences in the pattern of metabolite formation not only between different animal species but in particular also between humans and animals. This means that all substances whose active or toxic form is only metabolized in a human metabolism animal system can not be determined in animal experiments.
Aus diesem Grunde wurde bereits versucht, in Kokultur- verfahren mit Leberzellen verschiedene Zellarten zu untersuchen. Bei allen diesen bekannten Kokulturver- fahren besteht jedoch das Problem, da3 unmittelbar nach dem Ansetzen ein Funktionsverlust der Hepatozy- ten, d.h. der Leberzellen, in der Kultur einsetzt, da grundlegende hepatozytenspezifische und zellbiologi¬ sche Anforderungen nicht berücksichtigt wurden und in der dabei verwandten Vorgehensweise nicht berücksich¬ tigt werden konnten. Längerfristige Untersuchungen sind deswegen mit derartigen Systemen nicht sinnvoll. Diese wären jedoch sehr wichtig, denn bekanntlich zeigt sich die Eigenschaft von krebserregenden Stoffen erst nach einer längeren Zeit.For this reason, attempts have already been made to investigate various cell types in coculture processes using liver cells. However, with all of these known coculture methods there is the problem that a loss of function of the hepatocytes, i.e. the liver cells used in the culture, since basic hepatocyte-specific and cell-biological requirements were not taken into account and the related procedure could not be taken into account. Longer-term studies are therefore not sensible with such systems. However, these would be very important because, as is well known, the properties of carcinogenic substances only show up after a long time.
Bei den bekannten Kokulturverfahren wurden die Zellen in einer zweidimensionalen Schicht gemischt, wodurch sie nicht mehr auf einfache Weise selektiv getrennt werden konnten. Dies bedeutet, das Testsystem ist nicht wiederverwendbar.In the known coculture methods, the cells were mixed in a two-dimensional layer, as a result of which it was no longer possible to selectively separate them in a simple manner. This means the test system is not reusable.
Insbesondere wegen der auftretenden instabilen Funk¬ tion und deren nicht in vivo-artigen Reaktionsweisen der bekannten Testsysteme wurde auch bereits vorge¬ schlagen, Substanzen nach einer vorherigen Metaboli¬ sierung in einem Enzymgemisch auf die jeweiligen Zell¬ arten zur Untersuchung eines Einflusses aufzutragen.In particular because of the unstable function that occurs and the way in which the known test systems react in a manner that is not in vivo, it has also already been proposed to apply substances to the respective cell types after a previous metabolism in an enzyme mixture to investigate an influence.
Nachteilig bei diesem Testsystem ist jedoch, da/3 wie¬ der nur ein Teil der in vivo vorkommenden Metaboliten erfa/3t werden kann, da eine komplette Metabolisierung an ein intaktes zelluläres System gebunden ist. Mögli¬ che therapeutisch wirksame oder toxische Substanzen bleiben auf diese Weise unentdeckt, da sie überhaupt nicht entstehen können. Besonders nachteilig dabei ist jedoch, da/3 potentielle Karzinogene oder Zytostatika auf diese Weise nicht ermittelt werden können.The disadvantage of this test system, however, since / 3 wie¬ only a portion can be erfa in vivo occurring metabolites / 3t of as a complete metabolism is bound to an intact cellular system. Possible therapeutically active or toxic substances remain undetected in this way since they cannot arise at all. However, it is particularly disadvantageous that potential carcinogens or cytostatics cannot be determined in this way.
Eine Untersuchung von Interaktionen zwischen verschie¬ denen Zellarten, insbesondere zwischen Hepatozyten und einer weiteren Zellart in Kokultur, entsprechend Fall 4, wäre nur dann sinnvoll, wenn die Hepatozyten in der Lage wären, eine stabile Funktion in der Kultur zu be¬ halten. Dies ist jedoch bei den bekannten Verfahren nicht der Fall.An investigation of interactions between different cell types, in particular between hepatocytes and another cell type in coculture, according to case 4, would only make sense if the hepatocytes were able to maintain a stable function in the culture. However, this is not the case with the known methods.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu¬ grunde, ein Verfahren zum Züchten einer Zellart im Ko- kulturverfahren zu schaffen, bei der über einen länge¬ ren Zeitraum wenigstens annähernd in vivo Bedingungen zur Untersuchung dieser Zellart erreicht werden kön¬ nen.The present invention is therefore based on the object of providing a method for cultivating a cell type in the co-culture method, in which conditions for examining this cell type can be achieved at least approximately in vivo over a longer period of time.
Erfindungsgemä3 wird diese Aufgabe gelöst durch eine Kultivierung von Leberzellen auf einem Träger im Sand¬ wichverfahren, zwischen denen oder über denen eine zweite zu untersuchende Zellenart aufgebracht wird.According to the invention, this object is achieved by cultivating liver cells on a support using the sandwich method, between or over which a second cell type to be examined is applied.
Erfindungsgemä/3 wird zusätzlich zu einer Sandwichkul¬ turtechnik für Hepatozyten mit einem Anzüchten der zu untersuchenden zweiten Zellart innerhalb oder vorzugs¬ weise oberhalb dieser Struktur in einem dreidimensio¬ nalen Kultursystem die vorstehend genannte Problematik gelöst. Eines der Vorteile der erfindungsgemä/3en Form des Ko- kulturverfahrens ist, da/3 auf diese Weise eine polari¬ sierte Verankerung der Hepatozyten beibehalten wird.According to the invention, in addition to a sandwich culture technique for hepatocytes, the above-mentioned problem is solved in a three-dimensional culture system by growing the second cell type to be examined within or preferably above this structure. One of the advantages of the inventive / 3s form of the co-culture method is as / 3 is maintained in this way a polari¬ catalyzed anchoring of the hepatocytes.
Da normalerweise eine derartige Zellstapelung oder Zelldichte sehr schnell zu einem Sauerstoffmangel der unterhalb gelegenen Leberzellen führen würde, wird in einer sehr vorteilhaften und nicht naheliegenden Wei¬ terbildung der Erfindung vorgeschlagen, da/3 über den Träger Sauerstoff in Form einer Membranoxygenierung zu den Leberzellen gebracht wird.Since normally such a cell-stacking or cell density would quickly lead to a lack of oxygen to the below located liver cells, in a highly advantageous and unobvious Wei¬ the invention terbildung proposed da / 3 is brought over the carrier oxygen in the form of a membrane oxygenation of the liver cells .
Auf diese Weise wird eine sogenannte Membranoxygena- tion erreicht, wenn der Träger entsprechend ausgebil¬ det ist und die Leberzellen werden ausreichend mit Sauerstoff versorgt.In this way, a so-called membrane oxygenation is achieved if the carrier is appropriately trained and the liver cells are adequately supplied with oxygen.
Praktisch liegt eine Kombination dreier Techniken vor, die es ermöglicht, die funktionellen Vorteile einer Sandwichleberzellkulturtechnik zur Herstellung hepato- zellulärer Produkte und deren unmittelbare Einwirkung auf eine beliebig oberhalb davon kokultivierte Zellart auszunutzen und umgekehrt.In practice, there is a combination of three techniques that make it possible to exploit the functional advantages of a sandwich liver cell culture technique for the production of hepatocellular products and their direct effect on any cell type that is co-cultivated above and vice versa.
Das erfindungsgemä3e Verfahren besteht somit aus drei zum Teil bekannten Techniken, nämlich einer Membran¬ oxygenierung durch einen Träger, einem Sandwichverfah¬ ren für die Kultivierung von Leberzellen, und einem in dieser Form neuen Kokulturverfahren.The process according to the invention thus consists of three techniques, some of which are known, namely membrane oxygenation by a support, a sandwich process for the cultivation of liver cells, and a co-culture process which is new in this form.
Durch dieses Verfahren schaltet man Oxygenationspro- bleme aus, erhält eine stabile Leberzellenkultur und kann gleichzeitig eine Kokultivierung einer Zellart durchführen, durch die man Effekte untersuchen kann, die z.B. durch die Leberzellen und deren Metabolisie- rungskapazität erzeugt werden.This procedure eliminates oxygenation problems, maintains a stable liver cell culture and, at the same time, allows a cell type to be cultured through which effects can be investigated. which are generated, for example, by the liver cells and their metabolizing capacity.
Im Gegensatz zu bekannten Testsystemen, insbesondere von bekannten Kokulturverfahren, liegt nunmehr erfin- dungsgemä3 ein funktionell stabiles Testsystem vor, in dem Metaboliten über einen Zeitraum von mehreren Wo¬ chen hin produziert und in ihrer Wirkung untersucht werden können. Gleiches gilt auch für zelluläre Inter¬ aktionen. Auf diese Weise sind erstmals mittel- bis langfristige Toxizitätsuntersuchungen möglich.In contrast to known test systems, in particular known coculture methods, according to the invention there is now a functionally stable test system in which metabolites can be produced over a period of several weeks and their effects can be examined. The same also applies to cellular interactions. In this way, medium to long-term toxicity studies are possible for the first time.
Da bei einer übereinanderanordnung von Leberzellen und der zur untersuchenden zweiten Zellart, deren Trennung z.B. durch eine Matrixschicht erfolgen kann, lassen sich bei Bedarf auch beide Zellarten wieder selektiv voneinander trennen. Dies kann z.B. durch Zugabe eines Enzymes zu der oberhalb liegenden kultivierten Zellart erfolgen. Dabei hat sich z.B. als geeignetes Enzym zur .Ablösung der Zellen Trypsin herausgestellt.Since liver cells and the second cell type to be examined are stacked, their separation e.g. can be done by a matrix layer, if necessary, both cell types can be selectively separated from each other. This can e.g. by adding an enzyme to the cultivated cell type above. For example, Trypsin was found to be a suitable enzyme for detaching the cells.
Die längerfristige funktionelle Stabilität der Leber¬ zellen und die Ablösbarkeit einer Zellart unter Erhalt der im Sandwichsystem immobilisierten Leberzellen er¬ möglicht auch eine Wiederverwendbarkeit des Testsyste- mes.The longer-term functional stability of the liver cells and the detachability of a cell type while maintaining the liver cells immobilized in the sandwich system also enables the test system to be reused.
So kann z.B. eine andere, zu testende Zellart nach Wa¬ schen des Syste es erneut angezüchtet werden. Dies ist insbesondere deshalb von Bedeutung, weil humane Zel¬ len, wie z.B. humane Leberzellen, nicht unbegrenzt er¬ hältlich sind.For example, another cell type to be tested can be grown again after washing the system. This is particularly important because human cells, e.g. human liver cells are not available indefinitely.
Ein weiterer sehr bedeutender Vorteil des erfindungs- gemä/3en Verfahrens liegt auch in der Verwendbarkeit menschlicher Hepatozyten, die damit eine sehr hohe Re¬ levanz bezüglich ihrer Ergebnisse beim Menschen errei¬ chen, was ja gerade das Ziel aller humanpharmazeuti¬ schen und humantoxikologischen Untersuchungen ist.Another very significant advantage of the invention According to the method, there is also the usability of human hepatocytes, which thus achieve a very high relevance with regard to their results in humans, which is precisely the goal of all human pharmaceutical and human toxicological studies.
Eine höhere Relevanz liegt auch gegenüber Verfahren unter Verwendung von Enzymgemischen vor, da ja ein in¬ taktes Zellsystem erfindungsgemä/3 vorliegt, und somit die Gesamtheit aller Metaboliten getestet werden kann. Bekannte Kokulturverfahren haben hier nur eine sehr geringe Relevanz für mittel- und längerfristige Unter¬ suchungen, da ja die Leberzellen in derartigen bekann¬ ten Systemen sehr rasch metabolische Enzyme verlieren.There is also greater relevance compared to methods using enzyme mixtures, since there is an intact cell system according to the invention and the totality of all metabolites can thus be tested. Known coculture methods are of very little relevance here for medium and long-term studies, since the liver cells in such known systems very quickly lose metabolic enzymes.
Nachfolgend sind zwei Ausführungsbeispiele des erfin- dungsgemäßen Verfahrens prinzipmä/3ig näher erläutert.Two exemplary embodiments of the method according to the invention are explained in principle below.
Es zeigt:It shows:
Fig. 1 ein Verfahren zum Züchten einer Zellart im Kokulturverfahren mit übereinander angeordne¬ ten Zellarten;1 shows a method for cultivating a cell type in the co-culture method with cell types arranged one above the other;
Fig. 2 ein Verfahren zum Züchten einer Zellart im Kokulturverfahren mit ineinander bzw. neben¬ einander angeordneten Zellarten.2 shows a method for growing a cell type in a coculture method with cell types arranged one inside the other or next to one another.
Für eine Kokultivierung wird zuerst als Träger eine zumindest gaspermeable Membrane 1 mit einer Matrix 2 beschichtet. Als gaspermeable Membrane 1 kann z.B. ein Träger verwendet werden, der aus einem Material mit entsprechend gro/3en Poren besteht oder Bohrungen ver¬ sehen ist, durch die Sauerstoff geleitet wird bzw. diffundiert. Hierfür eignen sich z.B. Sintermetall¬ scheiben, in die von einer Sauerstoffquelle aus Sauer¬ stoff in Kanäle oder Bohrungen im Inneren der Scheibe eingeleitet wird, von wo aus der Sauerstoff über ent¬ sprechende Bohrungen oder Poren zur Oberfläche der Membrane 1 weitergeleitet wird. Ebenso sind poröse Kunststoffe oder Zellstoff als Membrane 1 geeignet.For cocultivation, an at least gas-permeable membrane 1 is first coated with a matrix 2 as a carrier. As the gas-permeable membrane 1, for example, a support can be used which consists of a material with correspondingly large pores or has holes through which oxygen is passed or diffuses. For this purpose, for example, sintered metal disks are suitable, into which an oxygen source from oxygen leads into channels or bores in the interior of the disk, from where the oxygen is passed on to the surface of the membrane 1 via corresponding bores or pores. Porous plastics or cellulose are also suitable as membrane 1.
Als Matrix 2 kann z.B. eine proteinhaltige Schicht verwendet werden, wie z.B. Kollagen. Dabei können ge¬ gebenenfalls weitere Komponenten wie z.B. Glycosamino- glykane oder Glykoprotein bei Bedarf hinzugemischt werden. Derartige Komponenten üben induktive Funktio¬ nen auf Hepatozyten aus. Hepatozyten, d.h. Leberzellen 3 werden polarisiert in bzw. über die Matrix 2 einge¬ bettet.As matrix 2 e.g. a proteinaceous layer may be used, e.g. Collagen. If necessary, further components such as e.g. Glycosaminoglycans or glycoprotein can be added if necessary. Such components perform inductive functions on hepatocytes. Hepatocytes, i.e. Liver cells 3 are embedded polarized in or over the matrix 2.
Als Zellart zu Kokultur mit den Hepatozyten können z.B. V 79-Zellen oder Lymphozyten verwendet werden. Diese Zellen sind insbesondere für Mutagenitätsteste von Vorteil.As a cell type for co-culture with the hepatocytes, e.g. V 79 cells or lymphocytes can be used. These cells are particularly advantageous for mutagenicity tests.
Die Matrix 2 dient auch der Adhäsionsverbesserung der Leberzellen 3. Gegebenenfalls könnten die Leberzellen 3 auch direkt auf die Membrane l aufgelegt werden, oh¬ ne die dazwischen liegende Matrix 2, wenn dieses Mem¬ bran ein Anhaften der Leberzellen 3 ermöglicht, wie z.B. Polyurethanfolien, Polypropylen oder organische Membrane, wie z.B. menschliche oder tierische Binde¬ gewebe.The matrix 2 also serves to improve the adhesion of the liver cells 3. If necessary, the liver cells 3 could also be placed directly on the membrane 1, without the matrix 2 in between, if this membrane enables the liver cells 3 to adhere, e.g. Polyurethane films, polypropylene or organic membranes, such as e.g. human or animal connective tissue.
Die Leberzellen 3 können in bekannter Weise mittels einer Kollagenaseverdauung des bindegewebigen Gerüstes einer Leber isoliert und dann gewaschen werden. Nach einem Aufbringen der Leberzellen 3 auf die erste Matrixschicht 2 kann nach ca. 30 Minuten bis 1 Stunde bei Verwendung von Kollagen als basale Adhäsionsstruk- tur mit dem Auftragen einer zweiten Matrixschicht 4 über den Leberzellen 3 begonnen werden. Die zweite Ma¬ trixschicht 4 dient der Verankerung der Leberzellen 3 mit ihren oben liegenden Zellmembranen an diese Struk¬ tur. Ebenso wie für die erste Matrixschicht 2 können gegebenenfalls weitere Substanzen der zweiten Matrix¬ schicht 4 zugemischt werden.The liver cells 3 can be isolated in a known manner by collagenase digestion of the connective tissue structure of a liver and then washed. After the liver cells 3 have been applied to the first matrix layer 2, it is possible to start applying a second matrix layer 4 over the liver cells 3 after about 30 minutes to 1 hour using collagen as the basal adhesive structure. The second matrix layer 4 serves to anchor the liver cells 3 with their cell membranes lying on top of this structure. In the same way as for the first matrix layer 2, further substances can optionally be added to the second matrix layer 4.
Nach einer erfolgten Verfestigung der zweiten, oberen Matrixschicht 4 kann eine beliebige zweite, oder auch mehrere Zellarten 5, darüber aufgegeben werden.After the second, upper matrix layer 4 has solidified, any second or even several cell types 5 can be applied above it.
Abschließend wird Kultur- bzw. Nährmedium 6 in einer Schicht über die obere zu untersuchende Zellschicht 5 aufgebracht. Bei bestimmten beidseitig Verankerungs¬ pflichtigen Zellarten 5 kann eine zusätzliche Anbrin¬ gung einer dritten Matrixschicht über der zu untersu¬ chenden Zellart 5 vorgesehen werden. Dies ist in der Fig. 1 durch die gestrichelte Linie 7 angedeutet. Auch in diesem Falle stellt die Schicht aus Kultur- bzw. Nährmedium 6 den oberen Abschlu/3 über der dritten Ma¬ trixschicht 7 dar. Eine dritte Matrixschicht 7 wird im allgemeinen vorgesehen werden, wenn z.B. die oberen zu untersuchenden Zellen 5 ebenfalls Leberzellen sind.Finally, culture or nutrient medium 6 is applied in one layer over the upper cell layer 5 to be examined. In the case of certain cell types 5 which are anchored on both sides, an additional attachment of a third matrix layer can be provided over the cell type 5 to be examined. This is indicated in FIG. 1 by the dashed line 7. In this case too, the layer of culture or nutrient medium 6 represents the upper closure / 3 above the third matrix layer 7. A third matrix layer 7 will generally be provided if, for example, the upper cells 5 to be examined are also liver cells.
Mit dem dargestellten Verfahren ist eine Kokultur von Leberzellen 3 mit einer beliebigen zweiten Zellart 5 möglich, und zwar unter Erhaltung eines langerfristig stabilen hepatozellulären Phänotypus. Da die Sauerstoffversorgung der Leberzellen 3 mittels der Membranoxygenierung gewährleistet ist, kann jede beliebige andere Zellart in herkömmlicher Weise auf der Grundlage der zweiten oberen Kollagenschicht 4 an¬ gezüchtet werden. Die Versorgung der zu untersuchenden Zellart 5 erfolgt dabei von oben her über das Kultur¬ bzw. Nährmedium 6.A co-culture of liver cells 3 with any second cell type 5 is possible with the method shown, while maintaining a long-term stable hepatocellular phenotype. Since the oxygen supply to the liver cells 3 is ensured by membrane oxygenation, any other cell type can be grown in a conventional manner on the basis of the second upper collagen layer 4. The cell type 5 to be examined is supplied from above via the culture or nutrient medium 6.
Mit dem Verfahren nach der Fig. 1 sind z.B. Toxizi- tätstestungen von Pharmaka möglich, da Zellen von Zielorganen potentieller Toxizität mit einem humanen StoffWechselsystem direkt kombiniert werden können. Dies bietet damit die Möglichkeit eines Screeningver- fahrens, d.h. eine Reihenuntersuchung von mehreren Substanzen.With the method according to Fig. 1 e.g. Toxicity tests of pharmaceuticals possible because cells from target organs of potential toxicity can be combined directly with a human metabolism system. This therefore offers the possibility of a screening process, i.e. a screening of several substances.
Ebenso können humanspezifische StoffWechselprodukte, die im Tierversuch nicht erfa/3t werden können, wie auch die verschiedensten anderen Zellsysteme mit die¬ sem Verfahren untersucht werden. Darüber hinaus be¬ steht damit die Möglichkeit, eine genaue Lokaliεation toxischer Wirkungen nach Zellsystemen.Likewise, human-specific metabolic products that cannot be detected in animal experiments, as well as a wide variety of other cell systems, can be examined using this method. In addition, there is the possibility of an exact localization of toxic effects according to cell systems.
Im Bedarfsfalle kann das Verfahren nach der Fig. 1 auch in einen dynamischen Kulturmediumkreislauf einge¬ schlossen werden.If necessary, the method according to FIG. 1 can also be included in a dynamic culture medium cycle.
Statt dem Auftragen der zweiten Zellart 5, d.h. die in ihrer durch die Metaboliten in ihrer Beeinflussung zu untersuchenden Zellart, auf die dem Kulturmedium zuge¬ wandte Matrixschicht 4 oberhalb der Leberzellen 3, kann diese zweite Zellart 5 auch auf einen separaten Träger (nicht dargestellt) aufgebracht werden. Dieser Träger wird dann zusammen mit den darauf angeordneten Zellen mit dem metabolitenreichen Medium aus dem Le¬ berzellsystem bespült. Eine Annährung des zweiten Trä¬ gers mit der zweiten Zellart 5 in der Weise, da/3 sich ein Spalt mit Kulturmedium zwischen beiden Systemen befindet, ist dann möglich.Instead of applying the second cell type 5, ie the cell type to be examined by the metabolites in terms of their influence, to the matrix layer 4 facing the culture medium above the liver cells 3, this second cell type 5 can also be applied to a separate carrier (not shown). be applied. This carrier is then placed together with those Rinsed cells with the metabolite-rich medium from the liver cell system. Approaching the second carrier with the second cell type 5 in such a way that there is a gap with culture medium between the two systems is then possible.
In der Fig. 2 ist eine Verfahrensweise dargestellt, bei der der Zellart 5, z.B. Nervenzellen, direkt zu den Leberzellen 3 innerhalb des Sandwichsystemes hin¬ zugegeben werden, über die kombinierte Zellschicht wird in gleicher Weise wie bei dem Verfahren nach der Fig. 1 eine zweite Matrixschicht 4 und darüber wieder¬ um eine Schicht aus einem Kultur- bzw. Nährmedium 6 angeordnet. Die SauerstoffVersorgung erfolgt in glei¬ cher Weise von unten her durch die Membrane 1.2 shows a procedure in which cell type 5, e.g. Nerve cells are added directly to the liver cells 3 within the sandwich system, a second matrix layer 4 is formed over the combined cell layer in the same way as in the method according to FIG. 1, and again a layer of a culture or nutrient medium 6 arranged. The oxygen supply takes place in the same way from below through the membrane 1.
Nachteilig bei dieser Vorgehensweise ist jedoch die fehlende Wiederverwendbarkeit des Syste es. Weiterhin müssen zu den Leberzellen 3 andere Zellarten 5 hinzu¬ gegeben werden, mit denen sie in vivo normalerweise nicht in Kontakt kommen.However, the disadvantage of this procedure is the lack of reusability of the system. Furthermore, other cell types 5 with which they normally do not come into contact in vivo must be added to the liver cells 3.
Anstelle einer gaspermeablen Membrane 1 kann als Trä¬ ger auch eine einfache nicht gaspermeable Platte ver¬ wendet werden. Zur ausreichenden SauerstoffVersorgung mü/3te dann allerdings die Untersuchung der Zellen in einem speziellen Inkubator vorgenommen werden, in dem der Sauerstoffpartialdruck entsprechend der darüber- liegenden Zelldichte so weit erhöht werden kann, daß die Leberzellen ausreichend mit Sauerstoff versorgt werden. In der Praxis wird man jedoch im allgemeinen aus Gründen der Einfachheit und der leichteren Durch¬ führbarkeit eine gaspermeable Membrane verwenden. Instead of a gas-permeable membrane 1, a simple, non-gas-permeable plate can also be used as the carrier. To ensure sufficient oxygen supply, however, the cells would then have to be examined in a special incubator in which the oxygen partial pressure can be increased to such an extent that the liver cells are adequately supplied with oxygen. In practice, however, a gas-permeable membrane will generally be used for reasons of simplicity and easier feasibility.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Patent claims
1. Verfahren zum Züchten einer Zellart im Kokulturver¬ fahren mit Leberzellen, g e k e n n z e i c h n e t durch eine Kultivierung von Leberzellen (3) auf einem Träger (1) im Sandwichverfahren, zwischen denen oder über denen eine zweite zu untersuchende Zel¬ lenart (5) aufgebracht wird.1. Method for growing a cell type in a co-culture process with liver cells, e c e n e e c e n e t by cultivating liver cells (3) on a support (1) in a sandwich process, between or over which a second cell type (5) to be examined is applied.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da/3 über den Träger (1) Sauerstoff in Form einer Mem¬ branoxygenierung zu den Leberzellen (3) gebracht wird.2. The method as claimed in claim 1, because the oxygen (oxygen) in the form of membrane oxygenation is brought to the liver cells (3) via the carrier (1).
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da3 zwischen den Leberzellen (3) und dem Träger (1) ei¬ ne erste Matrixschicht (2) zur Verankerung der Leberzellen (3) angeordnet wird.3. The method according to claim 1 or 2, that a first matrix layer (2) for anchoring the liver cells (3) is arranged between the liver cells (3) and the carrier (1).
4. Verfahren nach Anspruch 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da/S über den Leberzellen (3) eine zweite Matrixschicht (4) angeordnet wird.4. The method as claimed in claim 3, since a second matrix layer (4) is arranged above the liver cells (3).
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da/3 über den zweiten Zellen (5) , die über den Leberzel¬ len (3) angeordnet werden, ein Kultur- oder Nährme¬ dium (6) angeordnet wird. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that a culture or nutrient medium (6) is arranged above the second cells (5) which are arranged above the liver cells (3).
6. Verfahren nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da/3 für die zweite Zellart (5) eine dritte Matrix¬ schicht (7) angeordnet wird, über die das Kultur¬ bzw. Nährmedium (6) gelegt wird.6. The method as claimed in claim 5, since a third matrix layer (7) is arranged for the second cell type (5), over which the culture or nutrient medium (6) is placed, for the second cell type (5).
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da/3 die zweite Zellart (5) auf einem eigenen zweiten Träger angeordnet wird, wobei ein Spalt mit Kultur¬ bzw. Nährmedium (6) zwischen den beiden Zellarten (3,5) eingestellt wird.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that / 3 the second cell type (5) is arranged on its own second carrier, wherein a gap with culture or nutrient medium (6) between the two cell types (3.5 ) is set.
8. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da/3 es in einem Inkubator mit erhöhtem Sauerstoffpar- tialdruck durchgeführt wird.8. The method according to claim 1, which also means that it is carried out in an incubator with an elevated partial pressure of oxygen.
9. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8 zur Toxizitätsprüfung von zu untersuchenden Sub¬ stanzen. 9. Use of a method according to claim 1 to 8 for the toxicity test of substances to be examined.
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