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WO1994001581A1 - Procede de determination de la taille en nucleotides de fragments d'adn - Google Patents

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WO1994001581A1
WO1994001581A1 PCT/FR1993/000675 FR9300675W WO9401581A1 WO 1994001581 A1 WO1994001581 A1 WO 1994001581A1 FR 9300675 W FR9300675 W FR 9300675W WO 9401581 A1 WO9401581 A1 WO 9401581A1
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WO
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exp
standards
coefficients
interpolation
Prior art date
Application number
PCT/FR1993/000675
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English (en)
Inventor
Christophe Pannetier
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Institut Pasteur
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm), Institut Pasteur filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Priority to EP93914800A priority patent/EP0672184B1/fr
Priority to JP50302194A priority patent/JP3261426B2/ja
Priority to DE69316028T priority patent/DE69316028T2/de
Publication of WO1994001581A1 publication Critical patent/WO1994001581A1/fr
Priority to US08/801,096 priority patent/US5795455A/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the nucleotide size of DNA fragments.
  • the method according to the present invention exploits a process of separation of DNA fragments, by gel electrophoresis.
  • the known devices for separating DNA fragments by gel electrophoresis generally include:
  • a migration plane support formed by a gel for example made of polyacrylamide or agarose, capable of receiving DNA samples previously labeled
  • a high voltage continuous electrical power source typically from 1000 to 1500V, connected between the ends of the support gel to induce the separation of the DNA fragments, by electrophoresis, - a set of detection of the DNA fragments migrating successively on the support gel, placed at the base of it and
  • DNA samples are prepared according to various techniques well known to those skilled in the art.
  • EP-A-200 362 on the basic technique for the PCR method.
  • Each cycle comprises several stages: a stage of hybridization of specific oligonucleotide primers on the 5 ′ ends of the DNA fragments which are complementary thereto, and
  • thermostable polymerase Taq polymerase
  • Taq polymerase thermostable polymerase
  • the denaturing conditions generally correspond to an increase in the temperature of the reaction medium above 90 ° C.
  • the hybridization generally takes place between 50 and 70 ° C. and the elongation by DNA polymerase can be carried out at relatively high temperatures, of the order of 70 ° C if a heat-stable DNA polymerase is used.
  • the SDA amplification method is based on the use of oligonucleotide primers modified in 5 ′ by the addition of a DNA sequence recognized by a restriction enzyme, for example the enzyme Hinc II.
  • a restriction enzyme for example the enzyme Hinc II.
  • the process requires the formation of a thiolated restriction site by incorporation of sulfur-containing deoxyadenosine triphostate, and the alternating actions of said enzyme Hinc II which partially hydrolyses (on a single strand), said restriction site, and DNA polymerase which synthesizes from the hydrolysis point a new strand, with simultaneous displacement of the previously cut nucleic sequence, without denaturation being necessary.
  • Hybridization of the modified primers on the target requires only a first step of DNA denaturation. The reaction then takes place at 37 ° C.
  • the labeling of the fragments is generally carried out using a few additional amplification cycles in the presence of priming oligonucleotides having radioactive, enzymatic or, preferably, fluorescent labeling, based on fluorophores.
  • the migration support gel generally comprises several parallel tracks, for example 24 tracks.
  • the detection assembly comprises an excitation system (laser or halogen lamp by example) and a sensor sensitive to fluorescent radiation generated by the excited sample.
  • an excitation system laser or halogen lamp by example
  • a sensor sensitive to fluorescent radiation generated by the excited sample In certain devices, a set of mirrors placed on a carriage moved in translation back and forth opposite the base of the gel, successively scans the various tracks, reflects the excitation radiation on the sample and returns the fluorescent radiation on the sensor.
  • the excitation radiation is sent directly into the thickness of the gel, perpendicular to the direction of electrophoresis and parallel to the plane of the gel, while a series of sensors collects the fluorescence signal.
  • the sensor delivers a signal whose amplitude is proportional to the concentration of the fluorescent color detected, provided that this amplitude remains below a certain threshold.
  • the present invention can, for example, find application in the process for describing the repertoires of the immune system, presented in the patent application filed in France on 9.01.1991 under No. 91 00189.
  • an elongation step is carried out for each segment J of the repertoire marked, using as an primer an oligonucleotide specific for this segment J and the amplification product as matrix,
  • the present invention can also find application in the process for determining the quantity of a DNA fragment of interest by a quantitative amplification method, presented in the patent application filed in France on November 15, 1991 under the number 91
  • This process is essentially characterized in that: 1) a standard DNA fragment different from the DNA fragment of interest but amplifiable by the same oligonucleotides is added to the sample to be analyzed containing the DNA fragment of interest primers, the standard DNA fragments of interest differing in sequence and / or in size by no more than about 10%, preferably not more than 5 nucélotides per strand,
  • the DNA fragments of interest and standard DNA are co-amplified with the same priming oligonucleotides, preferably until the amplification of the mixture of these DNA fragments is saturated,
  • step 2) adding to the reaction medium obtained in step 2) one or more labeled oligonucleotide (s) primer (s), specific (s) DNA fragments of interest and standards, and different from said oligonucleotides primers from step 2), and one or more additional amplification cycles are carried out with the labeled primer (s) oligonucleotide (s), so that during a cycle, after denaturation of the DNA, the labeled primer (s) oligonucleotide (s) hybridize (s) with the said fragments at an appropriate site so that an elongation by the DNA polymerase generates DNA fragments marked with different sizes and / or sequences or with different markers depending on whether they come from DNA fragments of interest or standards respectively, then
  • the initial quantity of DNA fragment of interest is determined as being the product of the initial quantity of standard DNA fragment and of the ratio between the quantity of DNA fragment of interest amplified and the quantity of fragment of DNA Amplified standard DNA, a ratio which is identical to that of the quantities of the labeled DNA fragments originating respectively from the DNA fragments of interest and amplified standards obtained in step 3).
  • the determination of the last step of the above-mentioned process is done by:
  • the nucleotide size of the DNA fragments is evaluated in a fairly rudimentary manner using a visual comparison of the position of the samples detected with respect to the position of marked size standards which are codeposited on the support gel and subjected to the same electrophoresis as the samples to be measured.
  • the aim of the present invention is to improve the existing technique by proposing new means allowing a more precise measurement of the size of the DNA fragments.
  • This object is achieved according to the present invention by a method comprising the steps which consist in: i) measuring the migration time, over a predetermined constant length, of each DNA fragment detected, and ii) establishing a correlation between the size of each DNA fragment detected and the migration time thereof.
  • FIG. 1 represents a general schematic flow diagram of the method according to the present invention
  • FIGS. 2 to 7 represent in the form of flow diagrams of the particular steps of this method
  • FIG. 8 shows a general flowchart grouping all the steps which will be described later.
  • the method according to the present invention designed to determine the size in nucleotides of DNA fragments, exploits a process of separation of the DNA fragments by gel electrophoresis.
  • the present invention exploits a process according to which standards of known size are codeposited on the support gel.
  • standards of known size are thus deposited on three control tracks, namely on the two lateral edges of the support gel and in the center thereof.
  • the number n of size standards thus codeposited on each control gel support track can be chosen by the user. However, preferably, five size standards are deposited on each control track.
  • these five standards of known size can respectively comprise 96, 114, 140, 157 and 176 nucleotides.
  • the method according to the present invention comprises preferably the steps consisting in: a) performing gel electrophoresis of labeled DNA samples and of labeled size standards codeposited on the gel (step 100 in FIG. 1), b) detecting and memorizing the signal coming from the the detection assembly (step 200 in FIG. 1), c) filter the measured data (step 300 in FIG.
  • step 400 in FIG. 1 1), d) determining the size of the DNA fragments detected (step 400 in FIG. 1), and e) visualizing the results obtained (step 500 in FIG. 1).
  • the filtering step 300 can be operated before the storage step 200.
  • the curves from the sensor are stored in a respective specific file at the rate of one file per track. of measurement.
  • the filtering phase 300 preferably comprises, as shown diagrammatically in FIG. 2, the initial step 210 of low-pass filtering modulated by a Lanczos convolution, in order to eliminate the high frequency noise, using a filter preferably having an adjustable cutoff frequency and an adjustable window width.
  • the width of the Lanczos window is also adjustable.
  • the filtering phase 300 comprises the final step 320 of subtracting the baseline obtained at any point, like the minimum value of the filtered curve, on a determined window value.
  • This window must of course be much greater than the width of a peak; preferably, the width of this window is adjustable.
  • step 400 consists in: a) determining the coefficients A, B, C for each control track comprising size standards (step 410 in FIG. 3), including the times of migration ti have been measured, b) interpolate the migration times ti measured in the control tracks, for the measurement tracks (step 420 in FIG. 3), c) from this interpolation, determine, for each track measuring the value of parameters A, B and C (step 430 in FIG. 3) d) determining the size of the DNA fragments on the basis of the above law (step 440 in FIG. 3) established for each of the tracks of the gel.
  • Step 410 is illustrated in the form of a flow diagram in FIG. 4.
  • This step 410 begins with a step 411 for entering the i size standards in the corresponding file.
  • This step 411 detailed in FIG. 5 is carried out as follows.
  • the apparatus automatically searches in a measurement window set by default, but modifiable by the user, for radiation peaks. This search is carried out by comparing (step 4111) the intensity peaks measured with a progressively lowered threshold (step 4112) until the i peaks are obtained (step 4113).
  • the apparatus goes to a second phase 4114 in which the user can either modify the width of the window in step 4115 and restart the phase of the aforementioned automatic search 4110, or operate a manual search (step 4116) by identifying by all known means (for example using a pointer moved on the screen) the peaks sought, on a representation of the measured curve displayed on the screen .
  • step 411 for entering the standards
  • step 412 for measuring the time ti for migration of the standards of known length Li
  • step 413 of calculating the coefficients
  • the migration time ti of the size standards, measured in step 412, corresponds to the time taken by them to reach the sensor of the detection assembly placed at the base of a support gel, from a temporal origin.
  • This time origin can correspond to the initialization of electrophoresis, in which case the time constant to is zero.
  • the time origin can also be after the initialization of the electrophoresis, in which case the time constant to is equal to the offset between the initialization of the electrophoresis and the origin considered time.
  • Step 413 is illustrated in FIG. 6.
  • the method according to the present invention is continued by the interpolation step 420.
  • the purpose of the interpolation step 420 is to define the values of the migration times ti of the non-standard markers for each sample measurement track on the basis of the values measured for the standard tracks.
  • the purpose of this interpolation step 420 is to reduce the measurement errors due to a dispersion of the migration parameters according to the width of the support gel. It can be a linear interpolation. However, in the context of the present invention, a parabolic type interpolation can be carried out, for example the Simpson interpolation. Interpolation of the parabolic type indeed gives a more precise result than the linear interpolation.
  • step 420 the values of the coefficients A, B and C are determined for each measurement track from the values ti resulting from the interpolation, and this using the relationships given above.
  • certain apparatuses require that all the samples are not loaded onto the gel simultaneously. Most often the support gels thus have even tracks having a common time origin and odd tracks also having a common time origin, but offset in time relative to the even tracks.
  • size standards are codeposited on the support gel respectively with the same origins as the various measurement tracks. It is therefore necessary to calculate the coefficients A, B, C, for the size standards having different origins corresponding respectively to the even and odd tracks and to carry out respective interpolations for the even and odd measurement tracks respectively.
  • steps 410 and 412 are repeated for each origin of the measurement track.
  • this step 440 is broken down into the following three sub-steps: a) input of the peaks of the measurement signal corresponding to the DNA fragments (step 441 in FIG. 7). This can be done automatically by comparing the amplitude of the measurement signal with a threshold. This threshold can be adjustable as well as the width of the window considered. The capture of useful peaks can also be done manually. The operator then manually searches for the signal peaks corresponding to the DNA fragments, as described above and illustrated in FIG. 5 for entering the standards.
  • step 442 Aexp [-B / (t + to)] + C
  • results can be illustrated in the form of a three-dimensional matrix, two axes of which correspond to the primers V and J, while the third axis corresponds to the size value of the DNA segments detected.
  • the primers V have different yields. Therefore, to allow direct comparison of the values represented in the various sections J / Size preferably proceed to a normalization of the values measured from one section to another, on the basis of quantitative measurements carried out according to the method described in patent application FR 91 14089 relating to the determination of the quantity d 'a DNA fragment of interest, before proceeding to the representation.
  • the present invention makes it possible to significantly improve the accuracy of measuring the size of the DNA fragments. Indeed, while the rough comparison of the DNA fragments migrating by electrophoresis, with known size standards codeposited, according to the state of the art, allows at best to know the length of the DNA fragments with an accuracy of 1 '' order of 1 to 2%, according to the invention on the contrary, the measurement accuracy is of the order of 0.3%.
  • the present invention is not limited to the particular embodiment which has just been described but extends to any variant in accordance with its spirit.
  • the detected fluorescent signal gives an important contribution in the ad hoc color channel, but also, due to the imperfection of the filter located in front of the sensor, contributions, certainly less important, in the other three channels.
  • the recorded data can undergo an operation which consists in multiplying the matrix of p lines (p representing the number of fluorophores used) and of n points (where n is the number of measurements made during the electrophoresis) by a square matrix (pxp) characteristic of the device.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détermination de la taille en nucléotides de fragments d'ADN séparés par électrophorèse sur gels caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes qui consistent à: i) mesurer le temps de migration de chaque fragment d'ADN détecté, et ii) établir une corrélation entre la taille de chaque fragment d'ADN détecté et le temps de migration de celui-ci.

Description

PROCEDE DE DETERMINAT ION DE LA TAILLE EN NUCLEOTIDES DE FRAGMENTS D'ADN.
La présente invention concerne un procédé permettant de déterminer la taille en nucléotides de fragments d 'ADN.
Le procédé conforme à la présente invention exploite un processus de séparation des fragments d 'ADN, par electrophorese sur gel .
La séparation et la détection de fragments d 'ADN marqués , par exemple marqués par des marqueurs f luorescents , par electrophorese sur gel , sont bien connues de l ' homme de l ' art.
On connait sur le marché différents appareillages aptes à réaliser ces fonctions . Parmi ces appareillages connus on peut citer le dispositif automatisé d' electrophorese sur gel à séquençage d ' ADN automatique commercialisé par la Société Applied Biosystem sous la référence 373A. Ce dispositif est décrit dans le document US-A-4 811 218. Les appareillages connus de séparation de fragments d 'ADN par electrophorese sur gel comprennent généralement :
- un support plan de migration formé d' un gel, par exemple en polyacrylamide ou agarose , apte à recevoir des échantillons d'ADN préalablement marqués ,
- une source d ' alimentation électrique continue haute tension, typiquement de 1000 à 1500V, connectée entre les extrémités du gel support pour induire la séparation des fragments d 'ADN, par electrophorese, - un ensemble de détection des fragments d 'ADN migrant successivement sur le gel support , placé à la base de celui-ci et
- un ensemble d 'enregistrement et de traitement des données issues de l 'ensemble de détection. Les échantillons d 'ADN sont préparés selon diverses techniques bien connues de l'homme de l'art.
Ces techniques de préparation connues utilisent généralement une méthode d'amplification enzymatique in vitro de séquences d'acides nucléiques ADN mono-brins ou double brins, notamment par PCR (Polymérase Chain
Reaction) ou par la technique par SDA (Strand Displacement
Amplification).
Les techniques d'amplification in vitro, notamment par PCR ou SDA, ont été décrites dans la littérature. On peut citer en particulier les publications EP-A-201 184 et
EP-A-200 362 sur la technique de base pour la méthode PCR.
La technique d'amplification dite par SDA (Strand
Displacement Amplification) a été décrite lors de la conférence de San Diego sur les Acides Nucléiques les 20- 22 novembre 1991.
Dans ces méthodes d'amplification enzymatique d'ADN, l'amplification de la séquence s'effectue par cycles successifs.
Chaque cycle comporte plusieurs étapes : - une étape d'hybridation d'amorces oligonucléotides spécifiques sur les extrémités 5' des fragments d'ADN qui leur sont complémentaires, et
- une étape d'élongation à partir des extrémités 3' des amorces à l'aide d'une ADN polymérase. Le facteur de multiplication des fragments d'ADN est en théorie de deux à chaque cycle.
Dans les techniques d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR, les échantillons sont dénaturés par la chaleur au début de chaque cycle. L'emploi d'une polymérase thermostable, la Taq polymérase, a permis de développer des cycleurs automatiques ( dénaturation thermique / hybridation / polymérisation enzymatique ) dont les différentes étapes ne se distinguent que par leur température opératoire. Les conditions de dénaturation correspondent généralement à une élévation de la température du milieu réactionnel au-dessus de 90°C, l'hybridation a lieu généralement entre 50 et 70°C et l'élongation par l'ADN polymérase peut s'effectuer à des températures relativement élevées, de l'ordre de 70°C si l'on utilise une ADN polymérase stable à la chaleur.
En revanche, dans d'autres techniques d'amplification enzymatique d'ADN, telles que la technique par SDA, les produits obtenus à la fin de chaque cycle ne sont pas dénaturés par la chaleur. Il s'agit de méthodes isothermes.
La méthode d'amplification par SDA repose sur l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques modifiées en 5' par l'addition d'une séquence d'ADN reconnue par une enzyme de restriction, par exemple l'enzyme Hinc II. Le processus requiert la formation d'un site de restriction thiolé par incorporation de déoxyadénosine triphostate soufré, et les actions alternées de ladite enzyme Hinc II qui hydrolyse partiellement (sur un seul brin), ledit site de restriction, et de l'ADN polymérase qui synthétise à partir du point d'hydrolyse un nouveau brin, avec déplacement simultané de la séquence nucléique précédemment coupée, sans que la dénaturation soit nécessaire. L'hybridation des amorces modifiées sur la cible nécessite seulement une première étape de dénaturation de l'ADN. La réaction se fait ensuite à 37°C.
Le marquage des fragments est opéré généralement à l'aide de quelques cycles d'amplification additionnels en présence d'oligonucléotides amorces présentant un marquage radioactif, enzymatique ou, de préférence, fluorescent, à base de fluorophores.
Le gel support de migration comprend généralement plusieurs pistes parallèles, par exemple 24 pistes.
Dans le cas préférentiel d'un marquage fluorescent à base de fluorophores, l'ensemble de détection comprend un système d'excitation (laser ou lampe halogène par exemple) et un capteur sensible au rayonnement fluorescent généré par l ' échantillon excité . Dans certains dispositifs , un jeu de miroirs placés sur un chariot déplacé en translation en va et vient en regard de la base du gel , balaye successivement les diverses pistes , réfléchit le rayonnement d 'excitation sur l 'échantillon et renvoie le rayonnement fluorescent sur le capteur.
Dans d ' autres dispositif s , le rayonnement d ' excitation est directement envoyé dans l ' épaisseur du gel , perpendiculairement à la direction d ' electrophorese et parallèlement au plan du gel , tandis qu ' une série de capteurs recueille le signal de fluorescence.
Le capteur délivre un signal dont l ' amplitude est proportionnelle à la concentration de la couleur fluorescente détectée , pourvu que cette amplitude reste inférieure à un certain seuil.
Par ailleurs , pour certains dispositifs , on sait utiliser simultanément quatre f luorophores de "couleurs" différentes , ce qui permet de placer quatre échantillons de marquages différents sur chaque piste.
Pour cela, il est simplement nécessaire de prévoir un ensemble de filtres motorisé par exemple une roue à quatre filtres déplacée séquentiellement , en amont du capteur , pour déceler successivement chacun des rayonnements et détecter par conséquent chacun des échantillons .
La présente invention peut par exemple trouver application dans le procédé de description des répertoires du système immunitaire, présenté dans la demande de brevet déposée en France le 9.01.1991 sous le N°91 00189.
Ce procédé se caractérise essentiellement en ce que
- à partir d ' un prélèvement biologique , on ef fectue la transcription réverse des ARNm qu ' il contient, - on effectue ensuite, sur le produit de transcription ( ou directement sur l'ADN extrait de l'échantillon), des amplifications séparées pour chaque couple d'amorce V, C, V correspondant à un segment variable du répertoire en cause et C s'hybridant au segment constant du répertoire étudié,
- sur chacun de ces produits d'amplification on effectue, pour chaque segment J du répertoire, marqué, une étape d'élongation utilisant comme amorce une oligonucléotide spécifique de ce segment J et le produit d'amplification comme matrice,
- pour chaque produit d'élongation correspondant à un triplet V,C,J ainsi obtenu on fait apparaitre la taille et la quantité des différents produits d'élongation,
- la description du répertoire est réalisée pour chaque élément du répertoire correspondant à un triplet V,C,J et à la taille de l'élément par la mesure de la quantité de cet élément dans ledit répertoire.
On se reportera utilement à la description de cette demande de brevet FR 91 00189 pour la bonne compréhension de ce processus de description des répertoires du système immunitaire.
La présente invention peut également trouver application dans le procédé de détermination de la quantité d'un fragment d'ADN d'intérêt par une méthode d'amplification quantitative, présenté dans la demande de brevet déposée en France le 15 Novembre 1991 sous le n° 91
14089.
Ce procédé se caractérise essentiellement en ce que : 1 ) on ajoute à l ' échantillon à analyser contenant le fragment d 'ADN d ' intérêt , un fragment d 'ADN standard différent du fragment d'ADN d'intérêt mais amplifiable par les mêmes oligonucléotides amorces , les fragments d 'ADN standards et d' intérêt ne différant en séquences et /ou en taille de pas plus de 10% environ, de préférence de pas plus de 5 nucélotides par brin,
2) on co-amplifie les fragments d'ADN d'intérêt et standard avec les mêmes oligonucléotides amorces, de préférence jusqu'à saturation de l'amplification du mélange de ces fragments d'ADN,
3) on ajoute dans le milieu réactionnel obtenu à l'étape 2) un ou plusieurs oligonucléotide(s) amorce(s) marqué(s), spécifique(s) des fragments d'ADN d'intérêt et standards, et différents desdits oligonucléotides amorces de l'étape 2), et on effectue un ou quelques cycle(s) d'amplification supplémentaire(s) avec le ou lesdits oligonucléotide(s) amorce(s) marqué(s), de sorte que, au cours d'un cycle, après dénaturation de l'ADN, le ou lesdits oligonucléotide(s) amorce(s) marqué(s) s'hybride(nt) avec lesdits fragments en un site approprié pour qu'une élongation par l'ADN polyméase génère des fragments d'ADN marqués de taille et/ou de séquences différentes ou avec des marqueurs différents selon qu'ils proviennent des fragments d'ADN d'intérêt ou standards respectivement, puis
4 ) on détermine la quantité initiale de fragment d 'ADN d ' intérêt comme étant le produit de la quantité initiale de fragment d'ADN standard et du rapport entre la quantité de fragment d 'ADN d ' intérêt amplifié et la quantité de fragment d 'ADN standard amplifié , rapport qui est identique à celui des quantités des fragments d 'ADN marqués provenant respectivement des fragments d 'ADN d ' intérêt et standards amplifiés obtenus à 1 ' étape 3 ) .
Selon une mise en oeuvre particulière , la détermination de la dernière étape du procédé précité se fait en :
- séparant selon leur taille par electrophorese sur gel les fragments d'ADN marqués provenant des fragments d 'ADN d'intérêt et standards amplifiés, puis en - détectant les intensités des signaux correspondant au marqueur d 'une amorce respective pour les fragments d 'ADN marqués provenant des fragments d 'ADN d ' intérêt et standards respectivement.
On se reportera utilement à la description de cette demande de brevet FR 91 14089 pour la bonne compréhension de ce processus de détermination de la quantité d ' un fragment d 'ADN d ' intérêt.
Dans les appareillages connus , la taille en nucléotides des fragments d'ADN est évaluée de façon assez rudimentaire à l ' aide d ' une comparaison visuelle de la position des échantillons détectés par rapport à la position de standards de taille marqués qui sont codéposés sur le gel support et soumis à la même electrophorese que les échantillons à mesurer. La présente invention a pour but de perfectionner la technique existante en proposant de nouveaux moyens permettant une mesure plus précise de la taille des fragments d 'ADN.
Ce but est atteint selon la présente invention grâce à un procédé comprenant les étapes qui consistent à : i ) mesurer le temps de migration , sur une longueur constante prédéterminée, de chaque fragment d 'ADN détecté, et ii ) établir une corrélation entre la taille de chaque fragment d 'ADN détecté et le temps de migration de celui- ci.
Selon une caractéristique avantageuse de la présente invention, la corrélation entre la taille de chaque fragment d 'ADN détecté et le temps de migration de celui-ci, est établi sur la base de la loi : L(t)=A exp[ -B/ (t+to) ]+C dans laquelle A, B et C sont des constantes , t représente le temps de migration, to représente une constante de temps et L ( t ) représente la longueur en nucléotides de l'ADN détecté.
D'autres caractéristiques, buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui va suivre, et en regard des dessins annexés donnés à titre d'exemple non limitatif et sur lesquels :
- la figure 1 représente un organigramme schématique général du procédé conforme à la présente invention, les figures 2 à 7 représentent sous forme d'organigrammes des étapes particulières de ce procédé, et
- la figure 8 représente un organigramme général regroupant l'ensemble des étapes qui vont être décrites par la suite.
Comme indiqué précédemment, le procédé conforme à la présente invention, conçu pour déterminer la taille en nucléotides de fragments d'ADN, exploite un processus de séparation des fragments d'ADN par electrophorese sur gel.
Ce processus de séparation connu en lui-même et rappelé ci-dessus dans ses caractéristiques essentielles ne sera pas décrit plus en détail par la suite.,
Plus précisément, la présente invention exploite un processus selon lequel des standards de taille connue sont codéposés sur le gel support. De préférence, il est ainsi déposé des standards de taille connue sur trois pistes témoins, à savoir sur les deux bords latéraux du gel support et au centre de celui-ci.
Le nombre n de standards de taille ainsi codéposés sur chaque piste témoin du gel support peut être choisi quelconque par l'utilisateur. Toutefois, de préférence, on dépose cinq standards de taille sur chaque piste témoin.
A titre d'exemple non limitatif, ces cinq standards de taille connue peuvent comprendre respectivement 96, 114, 140, 157 et 176 nucléotides.
Comme cela est schématisé sur la figure 1 annexée, le procédé conforme à la présente invention comprend de préférence les étapes consistant à : a) opérer une electrophorese sur gel d'échantillons d'ADN marqués et de standards de taille marqués codéposés sur le gel (étape 100 sur la figure 1), b) détecter et mémoriser le signal issu du capteur de l'ensemble de détection (étape 200 sur la figure 1), c) filtrer les données mesurées (étape 300 sur la figure
1), d) déterminer la taille des fragments d'ADN détectés (étape 400 sur la figure 1), et e) visualiser les résultats obtenus (étape 500 sur la figure 1) .
Le cas échéant, l'étape de filtrage 300 peut être opérée avant l'étape de mémorisation 200. De préférence, à l'étape 200, les courbes issues du capteur sont stockées dans un fichier spécifique respectif à raison d'un fichier par piste de mesure.
La phase de filtrage 300 comprend de préférence, comme cela est schématisé sur la figure 2, l'étape initiale 210 de filtrage passe-bas modulé par une convolution de Lanczos, afin d'éliminer le bruit haute fréquence, à l'aide d'un filtre présentant de préférence une fréquence de coupure réglable et une largeur de fenêtre réglable. La largeur de la fenêtre de Lanczos est également réglable.
Enfin, la phase de filtrage 300 comprend l'étape ultime 320 de soustraction de la ligne de base obtenue en tout point, comme la valeur minimale de la courbe filtrée, sur une valeur de fenêtre déterminée.
La largeur de cette fenêtre doit bien sûr être bien supérieure à la largeur d'un pic ; de préférence, la largeur de cette fenêtre est réglable.
On va maintenant décrire l'étape 400 de détermination de la taille des fragments d'ADN détectés. Comme cela a été évoqué précédemment, selon l'invention, l'étape principale de détermination de la taille des fragments d'ADN consiste, après avoir mesuré le temps de migration de chaque fragment d'ADN détecté, à établir une corrélation entre la taille L de chaque fragment d'ADN détecté et le temps de migration de celui- ci à l'aide de la relation : L(t)= A exp[-B/(t+to)]+C dans laquelle A, B et C sont des constantes, t représente le temps de migration et to représente une constante de temps.
On notera que to=0 lorsque l'origine temporelle de la mesure coïncide avec le début de l'electrophorese.
Plus précisément, comme cela est schématisé sur la figure 3, l'étape 400 consiste à : a) déterminer les coefficients A, B, C pour chaque piste témoin comportant des standards de taille (étape 410 sur la figure 3), dont les temps de migration ti ont été mesurés, b) opérer une interpolation des temps de migration ti mesurés dans les pistes témoin, pour les pistes de mesure (étape 420 sur la figure 3), c) à partir de cette interpolation, déterminer, pour chaque piste de mesure la valeur des paramètres A, B et C (étape 430 sur la figure 3) d) déterminer la taille des fragments d'ADN sur la base de la loi précitée (étape 440 sur la figure 3) établie pour chacune des pistes du gel.
L'étape 410 est illustrée sous forme d'organigramme sur la figure 4.
Cette étape 410 débute par une étape 411 de saisie des i standards de taille dans le fichier correspondant.
Cette étape 411 détaillée sur la figure 5 est opérée comme suit. Dans une première phase 4110, l'appareillage recherche automatiquement dans une fenêtre de mesure fixée par défaut, mais modifiable par l'utilisateur, les i pics de rayonnement. Cette recherche est opérée en comparant (étape 4111) les pics d'intensité mesurés avec un seuil progressivement abaissé (étape 4112) jusqu'à obtention des i pics (étape 4113).
Si la première phase 4110 ci-dessus ne permet pas d'obtenir les i pics recherchés, l'appareillage passe à une seconde phase 4114 dans laquelle l'utilisateur peut soit modifier la largeur de la fenêtre à l'étape 4115 et relancer la phase de recherche automatique précitée 4110, soit opérer une recherche manuelle (étape 4116) en identifiant par tous moyens connus (par exemple à l'aide d'un pointeur déplacé sur écran) les pics recherchés, sur une représentation de la courbe mesurée visualisée sur écran .
Comme cela est représenté sur la figure 4 annexée, une fois les standards de taille identifiée de façon automatique ou manuelle à l'étape 411 de saisie des standards, cette étape est suivie d'une étape 412 de mesure du temps ti de migration des standards de longueur connue Li puis d'une étape 413 de calcul des coefficients
A, B et C pour ces standards sur la base de cette mesure.
Le temps de migration ti des standards de taille, mesuré à l'étape 412, correspond au temps mis par ceux-ci pour atteindre le capteur de l'ensemble de détection placé à la base d'un gel support, à partir d'une origine temporelle .
Cette origine temporelle peut correspondre à l'initialisation de 1 'electrophorese, auquel cas la constante de temps to est nulle.
L'origine temporelle peut aussi être postérieure à l'initialisation de 1 'electrophorese, auquel cas la constante de temps to est égale au décalage entre l'initialisation de 1 'électrophorèe et l'origine temporelle considérée. L'utilisateur introduit alors la valeur de ce paramètre une fois pour toute. Dans la suite, on prend t0 = 0 pour simplifier l'écriture.
L'étape 413 est illustrée sur la figure 6. A l'étape 413, les coefficients A, B, C sont tout d'abord estimés (étape 4130) à l'aide de la fonction d'erreur suivante au moindres carrés : n f(A,B,C,) = ∑ [Li-(A exp(-B/ti)+C)]2 i=l dans laquelle n est le nombre d'ADN standards, en recherchant la valeur de ces coefficients A, B et C pour lesquels les fonctions dérivées partielles en A, B, C, de cette fonction f(A, B, C) sont nulles. On obtient ainsi un système de trois équations dont l'une en fonction seulement de B : n [ ∑ (Li-L)exp(-B/ti)] x i=l n t Σ (exp(-B/ti)-exp(-B/t))exp(-B/ti)l/ti] = i=l n [ ∑ (Li-L)exp(-B/ti)l/ti] x i≈l n
[ ∑ (exp(-B/ti)-exp(-B/t))exp(-B/tι)] i≈l n A=[ ∑(Li-L)exp(-B/ti)] / i≈l n
[ ∑(exp(-B/ti)-exp(-B/t))exp(-B/ti)] i≈l n C=(l/n) ∑ [Li-A exp(-B/tι)] i≈l avec comme notation que : n
X(t) = (1/n) Σ X(tι) est la moyenne des X(l), ..., X(n). i≈l La première équation ci-dessus permet donc de déterminer la valeur de la constante B. Et une fois la constante B obtenue, on obtient les constantes A et C sur la base des deux dernières équations ci-dessus.
Une fois les coefficients A, B et C obtenus à l'étape 4130 pour les diverses pistes standards, les valeurs A, B, C sont réportées à l'étape 4131 dans la fonction f(A,B,C) ou L(t)=A exp(-B/t)+C afin de vérifier pour chaque valeur de consigne connue Li d'un standard que l'écart entre la taille théorique ainsi mesurée et la valeur de consigne connue Li, est inférieur à un seuil donné égal à un nombre prédéterminé de bases (étape 4132).
Dans l'affirmative, le procédé conforme à la présente invention est poursuivi par l'étape d'interpolation 420.
Dans la négative, le calcul des coefficients A, B et C est repris, en vue d'une optimisation, après modification du seuil défini par un nombre prédéterminé de bases, par l'utilisateur à l'étape 4133.
L'étape d'interpolation 420 a pour but de définir les valeurs des temps de migration ti des marqueurs non standards pour chaque piste de mesure d'échantillons sur la base des valeurs mesurées pour les pistes standards. Cette étape d'interpolation 420 a pour but de réduire les erreurs de mesure dues à une dispersion des paramètres de migration selon la largeur du gel support. II peut s'agir d'une interpolation linéaire. Toutefois, dans le cadre de la présente invention, on peut procéder à une interpolation de type parabolique, par exemple l'interpolation de Simpson. L'interpolation de type parabolique donne en effet un résultat plus précis que l'interpolation linéaire.
Enfin dans l'étape 420, on détermine pour chaque piste de mesure, les valeurs des coefficients A, B et C à partir des valeurs ti résultant de l'interpolation, et ce à l'aide des relations données précédemment. En pratique, certains appareillages nécessitent que tous les échantillons ne soient pas chargés sur le gel simultanément. Le plus souvent les gels supports possèdent ainsi des pistes paires ayant une origine temporelle commune et des pistes impaires ayant également une origine temporelle commune, mais décalée dans le temps par rapport aux pistes paires.
Dans ce cas, des standards de taille sont codéposés sur le gel support respectivement avec les mêmes origines que les diverses pistes de mesure. II est donc nécessaire de calculer les coefficients A, B, C, pour les standards de taille présentant des origines différentes correspondant respectivement aux pistes paires et impaires et de procéder à des interpolations respectives pour les pistes de mesure paires et impaires respectivement.
En d'autres termes, les étapes 410 et 412 sont réitérées pour chaque origine de piste de mesure.
Une fois les coefficients A, B et C connus, et de préférence mémorisés pour chaque piste de mesure, on procède à l'étape 440.
Comme cela est illustré sur la figure 7, cette étape 440 se décompose en trois sous-étapes suivantes : a) saisie des pics du signal de mesure correspondant aux fragments d'ADN (étape 441 sur la figure 7). Cette saisie peut être opérée automatiquement en comparant l'amplitude du signal de mesure avec un seuil. Ce seuil peut être réglable ainsi que la largeur de la fenêtre considérée. La saisie des pics utiles peut aussi être opérée manuellement. L'opérateur recherche alors manuellement les pics du signal correspondant aux fragments d'ADN, comme décrit précédemment et illustré sur la figure 5 pour la saisie des standards. b) mesure à l'étape 442 du temps de migration des fragments d'ADN, comme décrit précédemment à l'étape 412 pour les standards, et enfin c) calcul à l'étape 443 de la taille des différents fragments d'ADN sur la base de la relation : L(t)=Aexp[-B/(t+to)]+C
Une fois les résultats entièrement calculés, la représentation de ceux-ci peut être visualisée sous toute forme appropriée à l'étape 500.
Par exemple, dans le cadre d'un procédé de description des répertoires du système immunitaire présenté dans la demande FR 91 00189, on peut illustrer les résultats sous forme d'une matrice tridimensionnelle dont deux axes correspondent aux amorces V et J, tandis que le troisième axe correspond à la valeur de taille des segments d'ADN détectés.
Les différents échantillons analysés qui correspondent à des lignes différentes d'une section
J/Taille de la matrice correspondent à des amorces J respectives et différentes d'une ligne à l'autre. Or ces diverses amorces J présentent des rendements différents.
Pour permettre de comparer les valeurs représentées d'une ligne à l'autre, il faut donc normaliser les valeurs mesurées, en fonction de rendement des amorces J, avant d'opérer la visualisation.
De même, les amorces V possèdent des rendements différents. Par conséquent, pour permettre de comparer directement les valeurs représentées dans les diverses sections J/Taille on procède de préférence à une normalisation des valeurs mesurées d'une section à l'autre, sur la base de mesures quantitatives réalisées selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR 91 14089 relative à la détermination de la quantité d'un fragment d'ADN d'intérêt, avant de procéder à la représentation .
La présente invention permet d'améliorer nettement la précision de mesure de taille des fragments d'ADN. En effet, alors que la comparaison grossière des fragments d'ADN migrant par electrophorese, avec des standards de taille connue codéposés, selon l'état de la techique, permet au mieux de connaître la longueur des fragments d'ADN avec une précision de l'ordre de 1 à 2%, selon l'invention au contraire, la précision de la mesure est de l'ordre de 0,3%.
Bien entendu la présente invention n'est pas limitée au mode de réalisation particulier qui vient d'être décrit mais s'étend à toute variante conforme à son esprit. En particulier dans le cas de l'utilisation simultanée de plusieurs fluorophores émettant à des longueurs d'ondes différentes, comme indiqué précédemment, il est préférable de compléter le procédé qui vient d'être décrit, par un processus initial d'élimination du recouvrement des couleurs. On sait en effet que dans le cas de multiples fluorophores, le signal fluorescent détecté, donne une contribution imporatante dans le canal de la couleur ad hoc, mais également, dû à l'imperfection du filtre situé devant le capteur, des contributions, certes moins importantes, dans les trois autres canaux. Afin d'éliminer ces signaux parasites, les données enregistrées peuvent subir une opération qui consiste à multiplier la matrice de p lignes (p représentant le nombre de fluorophores utilisés) et de n points (où n est le nombre de mesures réalisées pendant l' electrophorese) par une matrice carrée (pxp) caractéristique de l'appareil. Une fois cette transformation linéaire réalisée, les contributions parasites au signal d'une couleur sont éliminées presque totalement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination de la taille en nucléotides de fragments d'ADN séparés par electrophorese sur gel caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes qui consistent à : i) mesurer le temps de migration, sur une longueur constante prédéterminée, de chaque fragment d'ADN détecté, et ii) établir une corrélation entre la taille de chaque fragment d'ADN détecté et le temps de migration de celui- ci.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la corrélation entre la taille (L) de chaque fragment d'ADN détecté et le temps de migration de celui-ci est établie sur la base de la loi : L(t)≈Aexp[-B/(t+to)]+C dans laquelle A, B, C sont des constantes, t représente le temps de migration et to représente une constante de temps.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que la corrélation entre la taille (L) de chaque fragment d'ADN détecté et le temps de migration de celui-ci est établi sur la base de la loi : L(t)=Aexp[-B/t]+C dans laquelle A, B, C sont des constantes et t représente le temps de migration.
4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, dans lequel des standards de taille connue sont codéposés sur le gel, caractérisé par le fait que la valeur des coefficients A, B et C est recherchée, pour les standards de taille connue, lorsque les fonctions dérivées partielles en A, B et C de la fonction suivante sont nulles : n f(A,B,C,) = ∑ [Li-(Aexp(-B/ti)+C)]2 i≈l dans laquelle Li représente les longueurs connues des standards de taille déposés, ti représente le temps de migration de chacun de ces standards connus.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que les standards de taille connue sont saisis automatiquement par comparaison de la courbe de mesure détectée dans une fenêtre de mesure réglable, avec un seuil progressivement abaissé jusqu'à obtention des i pics recherchés.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que les standards de taille connue sont saisis manuellement.
7. Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé par le fait que les coefficients A, B et C sont déterminés sur la base des relations suivantes : n [ ∑ (Li-L)exp(-B/ti)] x i≈l n
[ Σ (exp(-B/ti)-exp(-B/t))exp(-B/ti)l/ti] = i≈l n -
[ ∑ (Li-L)exp(-B/ti)l/ti] x i≈l n
[ Σ (exρ(-B/ti)-exp(-B/t))exp(-B/ti)] i≈l n A=[ ∑(Li-L)exp(-B/ti)] / i≈l n
[ ∑ ( exp( -B/ti)-exp( -B/t ) )exp( -B/ti) ] i≈l n C=l /n ∑ [Li-Aexp( -B/ti) ] i≈l avec la notation que X ( t ) désigne la moyenne de la fonction X sur les valeurs ti : n X( t ) = ( 1/n) Σ X( ti) i≈l
8. Procédé selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé par le fait que les coefficients A, B et C sont ensuite reportés, pour chaque standard de taille considérée dans la relation : L(t)=Aexp[-B/(t+to)]+C, les valeurs de taille ainsi obtenues étant comparées aux valeurs de taille connue afin de reprendre le processus de calcul des coefficients A, B et C en vue d'une optimisation si l'erreur entre la taille mesurée et la taille connue des standards dépasse un seuil prédéterminé.
9. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre l'étape consistant à déterminer les coefficients A, B et C pour chaque piste de mesure à l'aide d'une interpolation des positions tA mesurées pour les standards de taille connue, suivie d'un calcul des coefficients A, B et C à partir des valeurs ti résultant de l'interpolation.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'interpolation est une interpolation linéaire.
11. Procédé selon la revendication 9 , caractérisé par le fait que l 'interpolation est de type parabolique.
12 . Procédé selon la revendication 11 , caractérisé par le fait que l'interpolation est une interpolation de Simpson.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que le gel support utilisé pour l'electrophorese présente des séries de pistes de mesure présentant des origines temporelles respectivement décalées et que le procédé comprend les étapes consistant à calculer les coefficients A, B et C pour les standards de taille et à opérer ultérieurement une interpolation des positions ti obtenues à l'aide des standards de taille, suivie d'un calcul des coefficients A, B et C correspondants, sur les pistes de mesure, pour chaque origine temporelle de migration.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que les courbes issues du capteur sont mémorisées, de préférence à raison d'un fichier par piste de mesure.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que les courbes issues du capteur font l'objet d'un filtrage.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que l'étape de filtrage comprend un filtrage passe-bas.
17. Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé par le fait que l'étape de filtrage comprend un filtrage de Lanczos.
18. Procédé selon l'une des revendications 15 à
17, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre l'étape de soustraction de la ligne de base de la courbe mesurée.
19. Procédé selon l'une des revendications 1 à
18, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre dans le cadre d'un procédé de description des répertoires du système immunitaire et qu'il comprend la visualisation du répertoire sous forme d'une matrice tridimensionnelle dont deux axes correspondent aux amorces V et J tandis que le troisième axe correspond à la valeur de taille des segments d'ADN détectés, et qu'il comprend en outre l'étape de normalisation des valeurs mesurées, en fonction du rendement des amorces J, avant d'opérer la visualisation sur chaque section J/Taille de la matrice.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre l'étape de normalisation des valeurs mesurées, d'une section J/Taille à l'autre, avant de procéder à la représentation de la matrice .
21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par le fait que les pics du signal correspondant aux fragments d'ADN sont saisis manuellement.
22. Procédé selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par le fait que les pics du signal correspondant aux fragments d'ADN sont saisis automatiquement .
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