WO1993018643A1 - Process for reducing seed storage proteins and process for transforming plants - Google Patents

Description

明 細書

種 子 貯蔵 タ ン パ ク 質 の 低滅方法 お よ び植物 の 形 質転換 方 法

産 業 上 の 利 用 分野

本 発 明 は 、 種子 中 に お け る 貯蔵 タ ン パ ク 質 の 量 を 低減 さ せ 、 低 タ ン ノ ク 質種子 を 得 る 方 法 に 関 す る 。 ま た 、 本 発 明 は 、 植物 の 形 質転換方 法 に 関 す る 。 髙 等植物 の 種子 に は 乾燥 重量 当 り 、 豆類 で は 2 0 ~ 3 0 % 穀類 で は 1 0 % 程度 の タ ン ノ S ク 質 が含 ま れ て い る 。 こ れ ら の う ち 、 7 〜 8 割 を 貯蔵 タ ン ノ ク 質 カ 占 めて い る 。 特 に イ ネ 種子 中 に 含 ま れて い る 貯蔵 タ ン ノ ク 質 は 希 酸 や 希 T ル カ リ に の み 可溶 な グ ル テ リ ン と 呼 ば れ る 成分 が約 8 0 % を 占 め 、 主要 な 貯蔵 タ ン パ ク 質 と な っ て い る 。 残 リ は 、 有機溶媒 に 可溶 な プ ロ ラ ミ ン （ 1 0 〜 ： I 5 % ) と 、 塩 で 可 溶 な グ ロ ブ リ ン （ 5 〜 ： L 0 °/₀ ) と で 構成 さ れ て い る 。

種 子貯蔵 タ ン ノ ク 質 は 食糧 と し て 重要 な タ ン パ ク 質 資 源 で あ り 、 栄 養学 的 、 タ ン パ ク 質 化 学 的見 地 か ら 多 く の 研 究 力 な さ れ て き た 。 こ の た め 、 穀物 で は ト ウ モ ロ コ シ 、 コ ム ギ 、 ォ 才 ム ギ 等 の 貯蔵 タ ン ノ ク 質遺伝 子 が ク ロ 一 ニ ン グ さ れ 、 そ の 遺伝 子構造 か ら ア ミ ノ 酸配列 が推定 さ れ た り 、 さ ら に 、 遺伝 子 制御領域 が解析 さ れ た り し て い る 。

イ ネ 種 子貯蔵 タ ン ノ ク 質 の グ ル テ リ ン の c D N A は 既 に ク ロ ー ニ ン グ さ れ 、 そ の塩基配 列 の 解析 か ら こ の タ ン 新た な ffi パ ク 質 の 完 全 一 次 構造 が決 定 さ れ て い る 。 さ ら に 、 こ の c D N A を プ ロ ー ブ と し て 当 該 タ ン パ ク 質 の 遺 伝 子 も 単 離 さ れ て い る （ 特 開 昭 6 3 — 9 1 0 8 5 号 ） 。

こ の 核 由 来 遺 伝 子 断 片 の 5 ' 上 流 域 （ グ ル テ リ ン プ a モ ー タ ー 領 域 ） の 機能 を 明 ら か に す る た め に 、 該 プ ロ モ — タ 一 と レ ポ 一 タ ー 遺 伝 子 と し て ク ロ ラ ム フ エ 二 コ ー ル ァ セ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ （ C A T ) 遺伝 子 と の 融 合 遺 伝 子 が ァ グ ロ ノ ク テ リ ゥ ム を 介 し て タ ノ コ に 導 入 さ れ た 。 そ し て 、 こ れ ら 形 質転 換 タ ノ コ を 用 い て C A T ア ツ セ ィ を 行 っ た 結 果 、 イ ネ グ ル テ リ ン プ ロ モ ー タ 一 は 種 子 胚乳 特異 的 、 か つ 、 登 熟期 特異 的 に 発 現 す る こ と が確 認 さ れ た ( ォ キ タ ら 、 Pl ant Molecular B i o 1 o g o g y , 14， 4 1-50 (1989) )。

と こ ろ で 、 加 工 好 適 米 は タ ン パ ク 質 含 量 の 低 い こ と が 要求 さ れ て い る 。 醸造 用 の 酒米 に お い て は 胚乳 周 辺部 に 多 く 存 在 し て い る タ ン ノ ク 質 を 減 少 さ せ る た め に 精 白 度 を 高 め る こ と に よ っ て そ の 目 的 を 果 た し て レヽ る 。 米 デ ン プ ン の 製造 に お い て は 、 純 度 を 高 め る た め に ア ル カ リ 、 界 面 活性剤 、 さ ら に 、 超 音 波 の 利 用 に よ っ て タ ン パ ク 質 を 除 去 し て い る 。

ま だ 、 米 の タ ン ノ ク 質 含 量 は そ の 食 味 に も 影 響 を 与 え て お り 、 い わ ゆ る お レ、 し レヽ 米 は タ ン ノ ク 質 含 量 力 低 レヽ 。 こ の よ う な 低 タ ン ノ ク 質 米 に 対 し て は 、 従 来 の 交 雑育 種 法、 あ る い は 、 突 然 変 異 の 誘 発 を 利用 し た 方 法 が行 わ れ て き た 。 近 年 、 植 物 組 織 培 養 技 術 の 向 上 と 遺 伝 子 導 入 技 術 の 開 発 に よ り 形 質 転 換 植 物 の 作 出 が 報 告 さ れ て い る 。 イ ネ 科 植 物 に お い て は 、 培 養 細 胞 よ り 単 離 し た プ ロ 卜 プ ラ ス ト を ポ リ ェ チ レ ン グ リ コ ー ル で 処 理 す る こ と に よ り 外 来 遺 伝 子 を 導 入 し た 例 ( 特 開 昭 6 3 - 2 8 7 4 8 5 号 ） や 、 電 気 パ ル ス を 印 加 す る こ と に よ り 外 来 遺 伝 子 を 導 入 し た 例 が 報 告 さ れ て い る （ 特 開 平 1 一 1 8 1 7 9 1 号 ） 。

ま た 、 形 質 転 換 イ ネ で 外 来 遺 伝 子 を 発 現 さ せ る プ ロ モ — タ 一 は そ の 全 て の 例 で 力 V フ ラ ヮ ー モ ザ イ ク ウ ィ ル ス ( C a M V ) の 3 5 S プ ロ モ ー タ 一が 使 わ れ て い る 。 タ ン パ ク 質 の 合 成 の 情 報 と な る m R N A の よ う な あ る 機能 を 持 つ た R N A に 対 し て 相 補 的 塩 基 配 列 を 持 つ R N A そ の R N A の 機 能 を 抑 制 す る 働 き が あ る と が知 ら て' い る .。 こ れ は ア ン チ セ ン ス R N A と 総 称 さ れ る も の で あ り 、 遺 伝 子 組 換 え 技 術 の 導 入 に よ つ て 、 ァ ン チ セ ン ス R N A を 人 工 的 に 作 り 出 す 研 究 も 進 め ら れ て い る 。

例 え ば、 ネ匕 色 色 素 合 成 に 関 与 し て い る チ ャ ル コ ン 合 成 酵 素 の ア ン チ セ ン ス R N A を 産 生 す る 組 換 え べ チ ュ ニ ァ を 作 製 し 、 野 生 型 と は 花 色 の 異 な る ペ チ ュ ニ ア が ら れ て い る （ 欧 州 特 許 公 開 第 3 4 1 8 8 5 号 ） 。 ま た 、 卜 マ ト 果 実 の 軟 質 化 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る ポ リ ガ ラ ク ッ ロ ナ 一 ゼ 伝 子 が 導 入 さ れ た ァ ン チ セ ン ス R N A に よ つ て 発 現 が 抑 制 さ れ 、 野 生 型 よ り も 保 存 の 効 く ト マ ト が 作 り 出 さ れ て い る ( 欧 州 特 許 公 開 第 8 9 1 1 1 5 号 ） 。 し か し 、 こ れ ま で ア ン チ セ ン ス R N A の 技 術 を 種 子 貯 蔵 タ ン ノ ク 質 の 低 減 に 応 用 し た 例 は な い

米 中 の 胚 芽 や 糠 に は タ ン ノ ク 質 、 脂 質 、 灰 分 、 ビ タ ミ ン カ 多 く 、 こ れ ら が麹 菌 や 酵母 の 生 育 を 急 進 さ せ て 酒 質 の 調 和 を 崩 し 、 ま た 、 醸 造 酒 の 着 色 、 雑 味成 分 と な っ て 、 酒 質 を 劣 化 さ せ て い る 。 従 っ て 、 精 米 に よ っ て こ れ ら 有 害 成 分 を 取 り 去 っ て レヽ る 。 そ し て 、 と う 精 す る に つ れ 、 糠 に そ の 含量 の 多 い 脂 質 、 灰 分 及 び グ ロ ブ リ ン は 大 き く 減 少 す る が 、 逆 に 、 米 の 貯 蔵 タ ン パ ク 質 で あ る グ ル テ リ ン や プ ロ ラ ミ ン は 胚 乳 内 部 に も 存 在 す る た め 、 そ の 組 成 比 が増 加 し て し ま う 。

と こ ろ で 、 酒 米 の 育 種 は 現 在 、 早生 、 短稈 化 を 目 標 に 行 わ れ て い る が 、 一般 に 、 早 生 、 短稈 品 種 は タ ン ノ ク 質 含量 が 高 く 、 早生 、 短稈 で か つ 、 画期 的 な 低 蛋 白 性 を 有 す る 品 種 の 育 成 は 従 来 の 技 術 で は 極 め て 困難 で あ る 。 さ ら に 、 突然 変異 の 誘 発 を 利 用 し た 方 法 は 多 大 数 の 植物 体 を 処 理 す る 必 要 カ あ り 、 そ の 中 か ら 低 タ ン パ ク 個 体 を 選 抜 す る に は 非 常 に 多 く の 労 力 と 時 間 を 要 す る 。

ま た 、 種 子貯蔵 タ ン パ ク 質 の 品 質 の 改 善 を 目 指 す 場 合 、 現 存 す る 貯蔵 タ ン パ ク 質 を 特異 的 に 効 率 良 く 低減 さ せ る 必 要 が あ る 。 一

従 来 、 形 質 転換 植物 に お い て 、 外 来遺 伝 子 を 発現 さ せ る た め に は 、 通 常 、 C a M V の 3 5 S プ ロ モ ー タ 一 カ 使 わ れ て い る

し か し 、 形 質転 換 イ ネ に お い て は 、 C a M V 3 5 S プ 口 モ ー タ — の 転 写 活 性 は 弱 く 、 特 に 、 グ ル テ リ ン 遺 伝 子 が 発 現 し て い る 胚 乳 中 で は 、 そ の 転 写 活 性 は さ ら に 弱 い ( シ マ モ 卜 ら 、 Mo l . Gen . Genet . 220： 389 - 392 ( 1990 ) ) 。 こ の た め 、 グ ノレ テ リ ン ア ン チ セ ン ス R N A を 作 ら せ る プ ロ モ — タ ー と し て 、 C a M V 3 5 S プ ロ モ ー タ 一 を 用 い て は 効 率 良 い グ ル テ リ ン タ ン ノ S ク 質 の 低 減 は 期 待 で き な い 。

発 明 の 開 示

本 発 明 の 目 的 は 、 従 来 の 交 雑 育 種 法 や 突 然 変 異 誘 発 法 よ り も 容 易 、 確 実 に 種 子 中 の 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の 量 を 低 減 さ 'せ る こ と が で き る 方 法 を 提 供 す る こ と で あ る 。

さ ら に 、 本 発 明 の 目 的 は 、 胚 乳 中 等 、 従 来 技 術 に お い て 用 い ら れ て い る プ ロ モ ー タ ー の 活 性 が 低 く な る 組 織 中 で あ 'つ て ¾ A い fe写 活 性 を 発 揮 す る よ う に 植 物 を 形 質 転 換 す る 方 法 を 提 供 す る 。

本 願 発 明 者 ら は 、 鋭 意 研.究 の 結 果 、 植 物 に 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 に 対 す る ア ン チ セ ン ス R N A の 鍚 型 と な る 遺 伝 子 を 導 入 し 、 こ れ を 種 子 中 で 転 写 さ せ る こ と に よ り 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の 量 を 低 減 さ せ る こ と に 成 功 し 、 本 発 明 を 完 成 し た 。

す. な わ ち 、 本 発 明 は 、 種 子 貯 蔵 タ ン ノ ク 質 の m R N A に 対 し て 相 補 的 な 塩 基 配 列 を 有 す る m R N A の 铸 型 と な る 退 伝 子 を 植 物 に 導 入 し 、 該 遺 伝 子 を 種 子 中 に お い て 転 写 さ せ る こ と に よ り 、 前記 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の m R N A の.翻 訳 を 阻 害 し て 種 子 中 に お け る 前 記 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 を 低減 さ せ る 方 法 を 提 供 す る 。 さ ら に 、 本 発 明 は 、 上 記 本 発 明 の 方 法 に よ リ 種 子 貯蔵 タ ン パ ク 質 の 量 が低 減 さ れ た 種 子 を 提供 す る 。 さ ら に 、 本発 明 は 、 グ ル テ リ ン プ ロ モ ー タ 一 及 び 外来遺 伝 子 を 含 む べ ク タ ー で 植物 を 形 質 転 換 す る こ と を 含 む 植物 の 形 質 転換 方 法 を 提 供 す る 。 本 発 明 に よ り 、 遺 伝 子 工 学 的 手 法 に よ り 、 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の 量 を 低 減 す る 方 法及 び 貯蔵 タ ン パ ク 質量 が 低 減 さ れ た 種 子 が提 供 さ れ た 。 本発 明 の 方 法 は 、 従 来 の 交 雑育 種 や 突 然 変 異 誘 発 を 利 用 す る 方 法 に 比 べ て 容 易 に 、 か つ 、 確実 に 行 う こ と カ で き る 。

ま た 、 本 発 明 に よ り 、 従 来 技 術 で 用 い ら れ て い る プ ロ モ ー タ 一 で は 転 写 活性 が低 か っ た 胚乳等 の 組織 中 で も 高 い 転 写活性 が 発 揮 さ れ 、 外 来遺 伝 子 が効 率 良 く 発現 さ れ る 植 物 の 形 質 転換 方 法 が 提 供 さ れ た 。

図 面 の 簡 単 な 説 明

図 1 は グ ル テ リ ン の プ ロ モ ー タ ー の 塩 基配列 を 示 す 図 図 2 は 本 発 明 の 実 施 例 に お い て ク ロ ー ニ ン グ さ れ た 、 グ ル テ リ ン プ ロ モ ー タ ー 及 び グ ル テ リ ン 遺 伝 子 を 含 む D N A 断片 の 塩基配 列 を 示 す 図 、

図 3 は 本 発 明 の 実施例 に お い て 、 形 質 転換 に 用 い る 組 換 え プ ラ ス ミ ド ベ ク タ 一 を 作製 す る た め に 中 間 体 と し て 作 製 し た 組 換 え プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー の 遺 伝 子 地 図 、

図 4 及 び 図 5 は 本発 明 の 実 施 例 に お い て 、 形 質 転 換 に 用 い た 組 換 え プ ラ ス ミ ド ベ ク タ 一 の 遺 伝 子 地 図 、 図 6 及 び 図 8 は 対 照 の 米 粒 2 0 粒 の グ ル テ リ ン 量 （ 対 グ 口 ブ リ ン 比 ） を 示 す ヒ ス ト グ ラ ム 、

図 7 及 び 図 9 は 本 発 明 の 方 法 を 適 用 し た 米 粒 2 0 粒 の グ ル テ リ ン 量 （ 対 グ ロ ブ リ ン 比 ） を 示 す ヒ ス ト グ ラ ム で あ る

発 明 を 実 施 す る た め の 最 良 の 形 態 本 発 明 の 方 法 で は 、 種 子 貯 蔵 タ ン ノ ク 質 の ！ n R N A に 対 す る ア ン チ セ ン ス R N A を 種 子 内 に お い て 生 産 さ せ 、 種 子 貯 蔵 タ ン ノ ク 質 の ！ n R N A が 翻 訳 さ れ る こ と を 阻 止 す る

本 発 明 の 方 法 が 適 用 さ れ る 植 物 の 例 と し て は イ ネ 、 卜 ゥ 乇 口 コ シ 、 コ ム ギ 、 ォ ォ ム ギ 、 ダ イ ズ 等 、 貯 蔵 タ ン パ ク 質 を 含 む 種 子 を 実 ら せ る 植 物 を 挙 げ る こ と カ で き る 。 ま た 、 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の 例 と し て グ ル テ リ ン を 挙 げ る こ と が で き る 。 グ ル テ リ ン 遺 伝 子 は 既 に ク ロ 一 ニ ン グ さ れ て お り 、 そ の 塩 基 配 列 も 公 知 で あ る の で 、 イ ネ の ゲ ノ ^ ッ ク D N A ラ イ ブ ラ リ 一 力、 ら 該 遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ す る 操 作 は 、 グ ル テ リ ン の c D N A を プ ロ ー ブ と し て 用 い る こ と に よ り 常 法 に 基 づ き 行 う こ と が で き る 。

グ ル テ リ ン c D N A を 、 植 物 内 で 複 製 可 能 な ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ド に 組 み 込 み 、 こ れ で 植 物 を 形 質 転 換 す る こ と に よ リ 、 植 物 内 で グ ル テ リ ン m R N A に 対 す る ア ン チ セ ン ス R N A を 生 産 す る こ と カ で き る 。 植 物 内 で 複 製 可 能 な ベ ク タ 一 プ ラ ス ミ ド は こ の 分 野 に お い て よ く 知 ら れ て お り 、 例 え ば 後 述 の 実 施 例 で は 市 販 の P U C 1 9 ( メ シ ン グ ら 、 Gene, 33 : 103 - 119 (1985)、 フ ア ル マ シ ア 社 よ り 市 販 ） を 用 い て い る 。 後述 の 実施 例 で 示 す よ う に 、 ア ン チ セ ン ス R N A の 生 産量 を 高 め る た め に 、 1 つ の .ベ ク タ 一プ ラ ス ミ ド 中 に 、 2 つ 又 は そ れ 以 上 の グ ル テ リ ン c D N A を ア ン チ セ ン ス 方 向 に 揷入 す る こ と も で き る 。 ま た 、 植 物 細胞 の 形 質 転換 方 法 自 体 も こ の 分 野 に お い て 周 知 で あ り 、 例 え ば 、 プ ロ ト プ ラ ス ト に 電圧 を 印 加 し て 外 来 D N A を 取 り 込 ま せ る エ レ ク ト ロ ボ レ 一 シ ヨ ン 法 、 又 は プ ロ ト プ ラ ス ト に ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル を 作 用 さ せ る 方 法 に よ り 行 う こ と カ' で き る 。

従 来技術 の 項 で 述 べ だ が 、 従 来 、 植 物 の 形 質 転換 に お い て は 、 植物 内 で 発 現 さ せ る 外 来 性 遺伝 子 の プ ロ モ ー タ 一 と し て 、 C a M V の 3 5 S プ ロ モ ー タ 一 が用 レヽ ら れ て き た 。 し か し な 力 ら 、 C a M V の 3 5 S プ ロ モ ー タ 一 は 、 種 子 内 で の 活 性 が低 く 、 従 っ て 、 種 子 内 の 貯蔵 タ ン パ ク 質 の 低減 に は 不 向 き で あ る 。 本 願発 明 者 ら は 、 グ ル テ リ ン の プ ロ モ ー タ ー が種 子 内 に お い て 高 い 活 性 を 有 す る こ と を 見 出 し 、 該 プ ロ モ ー タ ー を 用 い て 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の 低 減 に 成 功 し た 。 該 プ ロ モ ー タ ー の 塩基 配 列 は 図 1 に 示 す 通 り で あ り 、 グ ル テ リ ン の 構造 遺伝 子 の 上 流 に 存在 す る 。

植 物 細 胞 の 形 質 転換 を 行 う 際、 ア ン チ セ ン ス 方 向 に 揷 入 さ れ た グ ル テ リ ン じ D N A 及 び グ ル テ リ ン プ ロ モ ー タ 一 を 有 す る 組 換 え ベ ク タ ー の 他 に 、 マ ー カ ー と し て 例 え ば 薬 剤 耐 性 （ 後 述 の 実施 例 で は ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン 耐性 を 利 用 ） を 発 現 す る 遺 伝 子 を 別 途 導 入 し て お く と 便 利 で あ る 。 こ の よ う な マ ー カ ー 遺 伝 子 は 形 質 転 換 細 胞 の 選 択 に の み 必 要 で あ り 、 選 択 が 終 わ れ ば 不 要 と な る の で 、 グ ル テ リ ン c D N A を 有 す る 前 記 組 換 え べ ク タ ー と は 別 の 組 換 え ベ ク タ ー に 挿 入 し て 形 質 転 換 す る こ と が 好 ま し レヽ 。 こ の よ う な マ ー カ 一 と な る ベ ク タ ー の プ ロ モ ー タ 一 は グ ル テ リ ン プ ロ モ ー タ ー で あ る 必 要 は な く 、 従 来 か ら 広 く 用 い ら れ て い る C a M V の 3 5 S プ ロ モ ー タ ー で よ い „ 得 ら れ た 形 質 転 換 プ ロ ト プ ラ ス ト を 再 生 し 、 こ れ を 常 法 に よ り 培 養 し て 植 物 体 を 再 生 さ せ 、 そ の D N A を サ ザ ン 八 イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ヨ ン 法 で 調 べ て グ ル テ リ ン の ア ン チ セ ン.ス 遺 伝 子 を 有 し て.い る も の を 選 択 す る こ と に よ り 、 種 子 貯 蔵 タ ン ノ ク 質 量 が低 減 さ れ た 種 子 及 び こ の よ う な 種 子 を 実 ら せ る 植 物 を 得 る こ と 力 で き る 。

な お 、 上 記 説 明 は 、 主 た る 種 子 貯 蔵 タ ン ノ ク 質 で あ る グ ル テ リ ン に つ い て 説 明 し た が 、 上 記 し た 方 法 は 他 の 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 に も 適 用 可 能 で あ り 、 他 の 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の 低 減 に も グ ル テ リ ン プ ロ モ ー タ 一 を 利 用 す る こ と 力 s で き る 。

ま た 、 グ ル テ リ ン プ ロ モ ー タ 一 は 、 従 来 、 植 物 の 形 質 転 換 に 用 い ら れ た 例 力 な い 。 従 っ て 、 本 発 明 は ま た 、 グ ル テ リ ン プ 口 モ ー タ ー 及 び 外 来 遺 伝 子 を 含 む べ ク タ ー で 植 物 を 形 質 転 換 す る こ と を 含 む 植 物 の 形 質 転 換 方 法 を 初 め て 提 供 し た 。 こ の 本 発 明 の 形 質 転換 方 法 は 、 種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 の 低減 方 法 に 限 ら ず 、 他 の 所 望 の 外 来遺 伝 子 を 種 子 中 又 は そ の 他 の 組 織 中 で 発 現 さ せ る た め に 用 い る こ と が で き る も の で あ る 。

以 下 、 本 発 明 を 実 施 例 に 基 づ き さ ら に 具 体 的 に 説 明 す る 。 も っ と も 、 本 発 明 は 下 記 実施 例 に 限 定 さ れ る も の で は な い 。

[ 実 施例 ]

以 下 の 実 施 例 に お い て 、 特 に 断 リ カ ^s な い 限 り 、 テ ィ · マ ニ ア テ イ ス ( Mo lecular Cloning, Co l d Spring H a r b o r ( 1982) ) 記 載 の 方 法 に よ り 行 っ た 。

(1) イ ネ グ ル テ リ ン の 核 D N A の ク ロ ー ニ ン グ 及 び グ ル テ リ ン の プ ロ モ ー タ ー 領域 を 含 む 断片 の 単離 （ 図 3 ) ィ ネ 栽 培 品 種 サ サ ニ シ キ の 緑 葉 か ら 常 法 に 従 い 核 D N A を 抽 出 し た （ 植 物 遺 伝 子 工 学 マ ニ ュ ア ル ： 講談 社 ） 。 そ の 核 D N A を Bam HI処 理 し た 断 片 群 に E M B L 3 フ ァ — ジ （ ス ト ラ タ 'ジ ー ン 社製 ） の Bam HI部 位 に 組 み 込 み 、 さ ら に 、 イ ン ビ 卜 ロ ノ ッ ケ ー ジ ン グ 法 に よ り 遺 伝 子 ラ イ ブ ラ リ ー を 作 製 し た 。

こ の 遺伝 子 ラ イ ブ ラ リ ー の 中 か ら グ ル テ リ ン の c D N A を プ ロ ー ブ に し て グ ル テ リ ン に 対応 す る 遺 伝 子 を 含 む 組換 体 フ ァ ー ジ を 選抜 し た 。 こ の 組換 体 フ ァ ー ジ ょ リ グ ル テ リ ン に 対応 す る 遺 伝 子 を 含 む 断 片 を 単 離精 製 し た 後 、 そ の 遺伝 子 の 塩 基 配 列 を サ ン ガ ー ら の 方 法 （ Proc. Na t 1. Acad. Sci . USA, 7 : 5463 (1979) )に 従 い 決 定 し た 。 決 定 し た 塩 基 配 列 を 図 2 に 示 す 。

塩 基 配 列 の 解 析 結 果 よ り 、 グ ル テ リ ン の プ ロ モ ー タ ー 領 域 を 含 む 断 片 を 制 限 酵 素 B a m H I及 び S p e I で 切 り 出 し 、 3 ' 末 端 を ェ ク ソ ヌ ク レ ア ー ゼ ΙΠ ( タ カ ラ 社 製 ） で 削 つ て い き 、 グ ル テ リ ン の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の み を 含 む 断 片 に し た 。 そ の 3 ' 末 端 に Bam H I リ ン カ 一 を 付 加 し た 後 、 プ ラ ス ミ ド p U C 1 9 ( 上 述 ） の Bam HI部 位 へ サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し 、 プ ラ ス ミ ド p U C G P を 得 た （ 図 3 ) 。

(2) グ ル テ リ ン ア ン チ セ ン ス R N A を 転 写 し 得 る ベ ク タ — の 構 築 （ 図 4 、 図 5 )

上 記 プ ラ ス ミ ド p U C G P に お い て 、 グ ル テ リ ン プ ロ モ 一 タ ー 領 域 を 含 む 配列 の 下 流 の Sma I 及 び Sac I 部 位 に グ ル テ リ ン の 完 全 長 c D N A を ア ン チ セ ン ス の 方 向 に 挿 入 し た 。 さ ら に 、 ア ン チ セ ン ス グ ル テ リ ン c D N A 配 列 の 下 流 の Sac 1 及 び Eco RI部 位 に 、 N o s タ ー ミ ネ 一 タ ー グ ッ . ド マ ン ら 、 Journal of Mo l ecu l ar and A p p 1 i ed Geneti cs : 561-573 ( 1982) )を 挿 入 し て グ ル テ リ ン の ア ン チ セ ン ス 遺 伝 子 を 保 持 し た プ ラ ス ミ ド P A N G 2 を 作 製 し た （ 図 4 ) 。

さ ら に 、 グ リ テ リ ン プ ロ モ ー タ 一 、 ア ン チ セ ン ス グ ル テ リ ン c D N A 及 び N o s タ ー ミ ネ ー タ 一 を 含 ん だ 断 片 を Eco RI及 び Hi nd I I I処 理 に よ り 切 り 出 し 、 そ の 断 片 の Eco R I末 端 を ク レ ノ ゥ 酵 素 処 理 に よ リ 平 滑 ィヒ し た 後 、 プ ラ ス ミ ド P A N G 2 の Hi nd I I I及 び Hi nc I I 部 位 へ 挿 入 し 、 環状化 さ せ た 。 こ の よ う に し て 、 グ ル テ リ ン ア ン チ セ ン ス 遺 伝 子 を 2 個 直 列 に 配 置 さ せ た プ ラ ス ミ ド p A N G 3 を 作製 し た （ 図 5 ) 。

( 3 ) イ ネ へ の 形 質 転 換 ―

イ ネ 栽 培 品 種 、 日 本 晴 及 び ア キ ヒ カ リ を 温 室 で 生 育 さ せ た 植物 体 よ リ 葯 を 採取 し 、 無水 エ タ ノ ー ル 及 び 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ゥ ム 水 溶 液 で 滅 菌 処 理 を 行 っ た 後 、 A A 培 地 、 ミ ュ ラ 一 ら 、 M 0 1. Gen . Gene t . 161 : 67-76 ( 1978 ) , 2 , - D 1 ppm、 力 イ ネ チ ン 0. 2 ριη 、 ジ ベ レ リ ン 0. 1 p p m ) で 振 盪 培 養 を 2 5 °C 、 暗 黒 、 1 2 0 r p m の 条件 下 で 行 い 培 養細 胞 を 得 た 。

植 え 継 ぎ 4 日 目 の 培 養細 胞 を 1 % セ ル ラ 一 ゼ R S 、 1 % マ セ ロ ザ ィ ム R — 1 0 、 0 . 1 % ぺ ク ト リ ア ー ゼ Y —

2 3 、 0 · 5 % ド リ セ ラ 一 ゼ 、 0 . 4 M マ ニ ト 一 ル 、 p H 5 . 8 を 含 む 酵 素 液 で 3 0 °C 、 2 時 間 処 理 し て プ ロ ト プ ラ ス ト を 調 製 し た

得 ら れ た プ ロ ト プ ラ ス ト を 0 . 1 % M E S 、 7 0 m M K C 1 、 5 m M M g C 1 2 0 . 4 M マ 二 ト ー ル

、 H 5 . 8 を 含 む バ ッ フ ァ 一 に 懸 濁 し た 。

こ の 懸 濁 液 に プ ロ モ ー タ 一 と し て G a M V 3 5 S 、 外 来 遺 伝 子 と し て ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン フ ォ ス フ ォ ト ラ ン ス フ エ ラ 一 ゼ 遺 伝 子 及 び C a M V 由 来 の タ ー ミ ネ 一 タ ー を 有 す る プ ラ ス ミ ド 5 0 β g / I . 並 び に グ ル テ リ ン の ァ ン チ セ ン ス 遺 伝 子 を 有 す る プ ラ ス ミ ド P A N G 2 又 は p

A N G 3 5 0 μ g Z m l を 添 加 し 、 水 上 で 5 分 間 冷 却 し た 後 、 滅 菌 し た プ ラ ス チ ッ ク セ ル に 移 し 、 直 流 パ ル ス を 2 5 0 μ F の コ ン デ ン サ 一 、 6 2 5 V Z c m の 電 圧 、 4 0 0 オ ー ム の 抵 抗 を 用 い て 印 力 tl し た 。

パ ル ス 印 加 後 、 氷 上 で 2 0 分 間 冷 却 し た 後 、 R · 2 プ ロ ト プ ラ ス ト 液 体 培 地 （ ォ ォ ヒ ラ ら 、 P l ant Ce l l Phys i o l . 14 : 1113 - 1121 ( 1973 ) )で 培 養 を 2 5 。C 、 照 明 下 で 行 つ た 。

R 2 液 体 培地 で 1 ~ 2 力 月 培 養 後 、 2 0 _g m l ハ ィ グ ロ マ イ シ ン B を 含 む N 6 ( チ ュ ら 、 Scient i a Sc ini ca 18 : 659 - 663 ( 1975 ) ) を 基 本 と し た 増 殖 固 体 培 地 に 置 床 し 、 ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン に 耐 性 を 示 す コ ロ ニ ー を 選 抜 し た 。

1 力 月 後 、 こ の ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 コ ロ ニ 一 を N 6 を 基 本 と し た 再分 ィヒ 固 体 培 地 に 置 床 し 、 明 所 で 1 ~ 2 力 月 間 培 養 を 続 け る と 、 芽 及 び根 が 現 わ れ 、 や が て 幼 植 物 体 に ま で 生 育 し た 。

さ ら に 、 幼 植 物 体 を ポ ッ ト へ 移 し て 生 育 さ せ た と こ ろ 、 成 熟 し た 完 全 な イ ネ 植 物 体 が 、 日 本 晴 2 3 個 体 、 ア キ ヒ カ リ 1 0 個 体 得 ら れ た 。

(4) 形 質 転 換 の 確 認

上 記 （ 3 ) で 得 ら れ た 植 物 体 の 緑 葉 よ リ 常 法 に 基 づ い て D N A を 抽 出 し 、 サ ザ ン ハ イ プ リ ダ イ ゼ イ シ ヨ ン 法 を 行 い 導 入 し た 遺 伝 子 の 存 在 を 確 認 し た 。

そ の 結 果 、 日 本 晴 2 3 個 体 中 、 ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン フ ォ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 を 保持 し て い る 植 物 体 は 2 0 個 体 あ り 、 そ の う ち 、 グ ル テ リ ン ア ン チ セ ン ス 遺 伝 子 を も 保 持 し て い る 植物 体 は 5 個 体 あ っ た 。

ま た 、 ア キ ヒ カ リ 1 0 個 体 中 、 ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン フ ォ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ 遺伝 子 を 保持 し て い る 植物 体 は 4 個 体 で 、 そ の う ち 、 グ ル テ リ ン ア ン チ セ ン ス 遺 伝 子 を も 保持 し て い る 植物 体 は 2 個 体 あ っ た 。

( 5 ) 形 質 転 換 イ ネ 植物 体 の 種子 の 分 析

上 記 （4 ) で グ ル テ リ ン ア ン チ セ ン ス 遺 伝 子 の 保 持 が 確 認 さ れ た 植 物 体 を 稔 実 す る ま で.生 育 さ せ た 後 、 完 熟種 子 を 採取 し た 。

そ の 種子 を 1 粒 ず つ 乳 鉢 で 粉 砕 し た 後 、 4 % S D S 、 6 M 尿 素 を 含 む ノ ッ フ ァ ー に 懸 濁 し た 。 そ の 懸 濁 液 を 遠 心分 離 し た 上 清 を 1 6 % ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル電気 泳 動 で 分離 し 、 さ ら に 、 ゲ ル を ク マ シ 一 ブ ル 一 で 染色 し た 。 染 色 後 の ゲル は デ ン シ 卜 メ ー タ ー に か け 、 ク マ シ ー ブ ル ー の 染色 度 合 い を 数 値 化 し 、 1 粒 ご と に お け る グ ル テ リ ン の 含 有 量 を 算 出 し た 。

対 照 と し て 、 形 質転 換 し て い な い 日 本 晴 及 び ア キ ヒ カ リ に つ い て の グ ル テ リ ン 含 有 量 も 同 様 に し て 算 出 し た 。 結 果 を 図 6 な い し 図 9 に 示 す 。 図 6 は 日 本 晴 の 対 照 に つ い て の 結 果 、 図 7 は 本 発 明 の 方 法 に よ り 形 質 転 換 さ れ た 日 本 晴 に つ い て の 結果 、 図 8 は ア キ ヒ カ リ の 対 照 に つ い て の 結果 、 図 9 は 本 発 明 の 方 法 に よ り 形 質 転 換 さ れ た ア キ ヒ カ リ に つ い て の 結 果 を 示 し 、 こ れ ら は ラ ン ダ ム に 選 ん だ 2 0 粒 の 分 析 結 果 を ヒ ス ト グ ラ ム で 示 し た も の で あ る 。 な お 、 グ ル テ リ ン の 含 有 量 は 1 粒 中 に お け る 2 6 キ ロ ダ ル ト ン グ ロ ブ リ ン 含 有 量 を 1 と し た と き の グ ル テ リ ン の 含 有 量 で 示 し た 。

日 本 晴 の 対 照 の グ ル テ リ ン 含 有 量 の 分 布 に お い て 9 5 % 信 頼 区 間 （ 6 . 5 ~ 8 . 4 2 ) よ り も 低 い 値 を 示 す 米 粒 力 日 本 晴 形 質 転 換 体 に は 2 0 粒 中 1 0 粒 あ っ た 。 こ れ ら は 環 境 変 異 で は 起 こ り 得 な い グ ル テ リ ン 含 有 量 の 低 減 を 示 す も の で あ る こ と 力 ら 、 グ ル テ リ ン ア ン チ セ ン ス 遺 伝 子 に よ る グ ル テ リ ン 含 有 量 の 低 減 効 果 カ 明 ら か で あ る グ ル テ リ ン ア ン チ セ ン ス 遺 伝 子 を 導 入 し た 当 代 の 植 物 体 よ り 得 ら れ た 種 子 は 、 形 質 転 換 体 の ヒ ス ト グ ラ ム で も 明 ら' か な よ う に グ ル テ リ ン 含 有 量 に ば ら つ き が 生 じ る.。 こ れ は メ ン デ ル 遺 伝 に よ っ て 種 子 力 F ₂ 分 離 を 起 こ し た た め で あ る 。

そ こ で 、 形 質 転 換 日 本 晴 に お い て 、 グ ル テ リ ン 量 の 低 減 の 顕 著 な 米 粒 と 変 化 の 見 ら れ な い 米 粒 、 そ れ ぞ れ 5 粒 ず つ を 選 び 精 度 を 高 め た 条件 で グ ル テ リ ン 量 及 び グ ロ ブ リ ン 量 の 分 析 を 行 っ た 。 結 果 を 下 記 表 1 及 び 表 2 に 示 す 1 グ ル テ リ ン の 低 減 の 顕著 な 米 粒 （ 形 質 転 換 体 ）

グ ル テ リ ン Z グ ロ ブ リ ン

表 2 グ ル テ リ ン の 低 減 の 見 ら れ な い 米 粒

( 形 質 転 換 体 ）

氺 ： グ ル テ リ ン グ ロ ブ リ ン

ま た 、 ア キ ヒ カ リ 対 照 の グ ル テ リ ン 含 有 量 の 分 布 に お い て も 9 5 % 信 頼 区 間 （ 9 . 1 4 ~ 1 3 . 0 2 ) よ り も 低 い 値 を 示 す 米 粒 力 s ア キ ヒ カ リ 形 質 転 換 体 に は 2 4 粒 中 1 0 粒 あ つ た 。 同 様 に 、 ア キ ヒ カ リ に お レヽ て も グ ル テ リ ン ア ン チ セ ン ス 遺 伝 子 に よ る グ ル テ リ ン 含 有 量 の 低 減 効 果 が 明 ら か で あ る 。

さ ら に 、 形 質 転 換 ア キ ヒ カ リ に お い て 、 日 本 晴 の 場 合 と 同 様 、 グ ル テ リ ン の 低 減 の 顕 著 な 米 粒 と 変 ィヒ の 見 ら れ な い 米 粒 、 そ れ ぞ れ 5 粒 ず つ を 選 び 精 度 を 高 め た 条 件 で 分 析 を 行 っ た 。 結 果 を 表 3 及 び 表 4 に 示 す 。 グ ル テ リ ン の 低減 の 顕著 な 米 粒 （ 形 質 転 換体 ） グ 口 フ リ ン グ ル テ リ ン

米 粒番 号 含 量 ( % ) 含 量 （ % ) G 1 u /G 10* ァ キ ヒ カ リ 1 11 . 6 59. 9 5 . 16 ァ キ ヒ カ υ 2 11 . 7 60. 7 5 . 19 ァ キ ヒ カ υ 3 10 .2 56. 1 5 .50 ァ キ ヒ カ υ 4 11 . 6 58. 7 5 . 06 ァ キ ヒ カ リ 5 10 . 9 62. 8 5 . 76 平均 11 . 2 59. 6 5 .33 グ ル テ リ ン / グ ロ ブ リ ン

表 4 グ ル テ リ ン の 低 減 の 見 ら れ な い 米 粒 ( 形 質 転 換 体 ）

グ グ 口 ブ リ ン グ ル テ リ ン 米 粒 番 号 ン 含 量 ( % ) 含 量 （ % ) G 1 u /G 10* グ

ァ キ ヒ カ V 6 8 . 9 69. 3 7 . 79 ァ キ ヒ カ リ 7 8 . 7 71. 9 8 • 26

7 キ ヒ カ リ 8 8 . 0 ン 70. 8 8 . 85 ァ キ ヒ カ リ 9 8 . 0 63. 1 7 . 89 ァ キ ヒ カ U 10 8 . 3 67. 0 8 . 07

平 均 8 . 68. 4 8 . 17

木

Claims

請求 の 範 囲

1 . 種子 貯 蔵 タ ン ノ ク 質 の m R N A に 対 し て 相 捕 的 な 塩 基配 列 を 有 す る m R N A の 鐃型 と な る 遺 伝 子 を 植物 に 導 入 し 、 該遺 伝 子 を 種 子 中 に お い て 転 写 さ せ る こ と に よ り 、 前 記 種 子 貯蔵 タ ン パ ク 質 の ni R N A の 翻 訳 を 阻 害 し て 種子 中 に お け る 前 記 種 子貯 蔵 タ ン パ ク 質 を 低減 さ せ る 方 法 。

2 . 前記植 物 が イ ネ で あ る 請 求 の 範 囲 第 1 項記 載 の 方 法

3 . 前記種 子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 が グ ル テ リ ン で あ る 請 求 の 範 囲 第 2 項記載 の 方 法。

4 . 前 記 遺 伝 子 の 転 写 は 、 グ ル テ リ ン の プ ロ モ ー タ 一 を 利用 し て 行 な わ れ る 請 求 の 範 囲 第 1 項 な い し 第 3 項 の い ず れ か 1 項 に 記載 の 方法 。

5 . p A N G 2 又 は p A N G 3 で 植 物 を 形 質 転 換 す る こ と に よ リ 行 わ れ る 請 求 の 範 囲 第 4 項記 載 の 方 法 。

6 . 請 求 の 範 囲 第 1 項 な い し 第 5 項 の い ず れ カゝ 1 項 に 記 載 さ れ た 方 法 に よ り 種子 貯 蔵 タ ン パ ク 質 が低 減 さ れ た 種 子 。

7 . グル テ リ ン プ ロ モ ー タ ー 及 び 外来 遺 伝子 を 含 む べ ク タ ー で植物 を 形 質 転 換 す る こ と を 含 む 植 物 の 形 質 転換 方 法。