WO1993018062A1 - Peptide which inhibits phospholipase c - Google Patents
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- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the present invention relates to novel peptides that inhibit phospholipase C (hereinafter, referred to as PLC) activity.
- PI-PLC inositol phospholipid PLC
- the structural features of the ⁇ , ⁇ and 5 types are that they include the oncogene src-related region, the SH2 and SH3 (SH2 zoSH3) regions between the I. II regions common to ⁇ , 7, and ⁇ ,
- SH2 and SH3 SH2 zoSH3 regions between the I. II regions common to ⁇ , 7, and ⁇
- the type 2 SH2 region is essential for interaction with receptor tyrosine kinases [D. Anderson et al., Science, 250, 979-982 (1990)].
- the function of the atypical SH3 region is not clear, but is speculated to be important for its interaction with the cytoskeletal system.
- N-Hormi lumethionyl-leucylaff perilalanine is known to induce inflammation via granulocytes and polymorphonuclear leukocytes (PMN). Report that PLC is involved in receptor signaling (Science, 232, 97-100 (1986)), platelet-derived growth factor in atherosclerotic lesions
- the peptides represented by SEQ ID NOS: 1 to 5, 7 and 8 are the bases of the priority application of the present application (Japanese Patent Application No. 521/39394: 19). J. Biol. Chem.). 26 7; 2 844-218 449 9; 1992 It has been announced.
- a peptide having phospholipase C inhibitory activity comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a peptide having a small amount of the peptide At least one amino acid residue has been deleted, at least one amino acid residue has been added to the peptide, and Z or another amino acid residue or a modified amino acid. Mutant peptides substituted with residues can be provided. These peptides are collectively referred to as compound (I).
- Mutant peptides include those consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 8 or the formula WX-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Y-Z (wherein W represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkanoyl group, a substituted or unsubstituted aroyl group or a cumaryl group, X represents a single bond or —L eu—, Y represents a single bond or —P r 0—V a 1— and Z represents a hydroxy group or an amino group, provided that when W is a hydrogen atom, Z is an amino group.)
- a peptide represented by the following formula: Peptides having the amino acid sequence shown can be mentioned.
- the peptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 28 are referred to as compounds (I-11) to (I-28), respectively.
- the substituted or unsubstituted alkanoyl group has 1 to 10 carbon atoms, specifically, formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, and vivaloyl.
- the substituent include a carboxy group, an alicyclic alkyl group, and a phenyl group.
- Examples of the alicyclic alkyl include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and the like having 3 to 8 carbon atoms.
- Examples of the substituted or unsubstituted arylo group include a benzoyl group and a naphthyl group.
- the substituent include hydroxy having 1 to 3 substituents.
- Compound (I) is synthesized by a solid phase synthesis method using an automatic peptide synthesizer.
- the peptide-bound solid support obtained by the solid root method is treated with hydrogen fluoride to release the peptide from the solid support and simultaneously with the amino acid side chain. Remove the protecting group.
- Amidation of C-terminal amino acids is performed using p-methyl-benzyl when using a peptide synthesizer manufactured by Applied Biosystems, Inc., Foster Ctiy, California, USA; Hydrolamine (BHA) — Use resin (ABI).
- the compound (I) obtained according to the present invention exhibits excellent PLC inhibitory activity, cell growth inhibitory activity and antibacterial activity.
- a sample (PLC-a) was prepared according to the method described in Y. Ho Awake a et Biochemical 'Journal [(Biochem. J.) ⁇ 269, 13 (1990)].
- a solution having the composition shown in Table 1 below was prepared in advance on ice, and the reaction was started by heating to 37 ° C. After incubating for 10 minutes, the reaction was stopped by adding 2 ml of a mixed solution of chloroform-methanol (2: 1, V / V). The formed inositol phosphate was extracted with 0.5 ml of IN hydrochloric acid. And two-phase distribution by centrifugation (2000 ⁇ g, 3 minutes), the free Murrell 3 H amounts were scintillation counting in the supernatant 0.7 ml.
- the value of the specific activity obtained is A, and the value of the specific activity when the same amount of water is added in place of the test peptide aqueous solution is B, and the same amount is used in place of the sample and the test peptide aqueous solution.
- the medium was changed again with a serum-free DMEM medium, and the labeling reagents, 5-buta-2'-dexoxydiridine (BrdU) and 5-fluoro-2'-doxydiridine (FdU) [10: l], were diluted 1000 times in the same medium. 0.5 ml of the diluted solution was added to each well and cultured for 2 hours. Then, the medium was removed, and the cells were fixed with an acetic acid-ethanol solution. The fixed cells were stained according to the method of a cell proliferation detection kit manufactured by Amersham and further stained with 1% Giemsa solution (Merck).
- the number of BrdU-incorporated cells and the total number of cells were measured in one visual field (approximately 200 cells) under a microscope, and the percentage (%) of stained cells per visual field was calculated. The same procedure was repeated 10 times, and the average value was taken as the cell growth activity (%).
- the cell growth inhibitory activity was calculated as follows.
- the cell growth inhibition rate (X) was determined from the following equation, where A is the proliferation activity when no peptide is added, and B is the proliferation activity when the test peptide is added.
- Table 3 shows the inhibition rates of the obtained test peptides.
- the minimum inhibitory concentrations (MIC) for various bacteria are shown in Tables 4-1 and 4-2.
- the antibacterial activity was measured by an agar dilution method using a medium (PH7.0) having a composition of 3 g / l of pact tryptone (manufactured by Difco), lg / 1 of meat extract, lg / 1 of glucose, and 16 g of agar agar. The results are shown in Tables 4-1 and 4-2.
- Glx L-gluminic acid or L-gluminic acid
- Fmoc-Tyr (t-Bu) -OH ⁇ -9-Fluorenylmethylquinonecarbonyl 0-t-butyl-L-tyrosine
- Fmoc-Arg (Pmc) -OH ⁇ -9-fluorenylmethylcarbonyl- ⁇ - ⁇ -2,2,5,7,8-pentamethylchroman 16-sulfonyl: L-arginine
- Examples 1 to 11 show examples of synthesis using an ABI peptide synthesizer 430A, ABI company reagents and solvents according to ABI company synthesis programs, and operating the machine to synthesize peptides.
- the amino acid condensation reaction is asparagine, glutamine and arginine for Using zotriazole as the active ester form, and other amino acids as symmetric acid anhydrides were performed under standard conditions.
- Examples 12 to 28 show examples of synthesizing peptides using Shimadzu's peptide synthesizer PSSM8 and operating the synthesizer according to the company's synthesis program using Shimadzu's reagents and solvents.
- the condensation reaction of the amino acid was carried out under standard conditions by the Fmoc method [Basic and Experimental Peptide Synthesis Nobuo Izumiya et al. (Maruzen)].
- protected amino acids and reagents used were products of Domestic Chemistry, Peptide Research Laboratories, and Calbiochemunobbiochem Japan.
- step (6) After performing the above-described deprotection steps (1) to (5) on the obtained carrier resin to which t-Boc-Lys (Cl-Z) -Met is bonded, in the step (6), t- Boc-Arg (Tos) (HOB t) was added to carry out a condensation reaction, and then through the washing step (7), t-Boc-Arg (Tos) -LysCCl-Z) -Met was synthesized on the carrier resin. Thereafter, the steps (1) to (7) were sequentially repeated to obtain 1.92 g of a carrier resin having a protected peptide bonded thereto.
- step (6) t-Boc-Tyr (Br-Z) -0H, t-Boc-Leu-0H, t-Boc-Ala-0H't-Boc-His (DNP) -OH, t_Boc- Lys (Cut Z) -0H, t-Boc-Glu (OBzl) -0H,, t-Boc-Tyr (Br-Z) -OH.t-Boc-Tyr (Br-Z) -0H, t-Boc -Ser (Bzl) -OH was used.
- Acetic anhydride (2.0 mg) was condensed with 725 mg of the carrier resin obtained in Example 9 to obtain 0.91 g of the carrier resin. All of this was treated with hydrogen fluoride in the same manner as in Example 1 to obtain 217.8 mg of a crude product. Of these, 117.8 mg was purified by HPLC to obtain 74.5 mg of the compound (I-10).
- step (4) 300 mo 1 of Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Leu-0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Met-0H,
- Fmoc-Leu-0H and coumaric acid were used.
- the obtained 'carrier resin was thoroughly washed with methanol and butyl ether, and then dried under reduced pressure for 2 hours.
- 1 ml of 10% TFA / methylene chloride was added to the reaction vessel containing the dried carrier resin, and the mixture was stirred and allowed to naturally drop from the lower part of the reaction vessel to collect the liquid.
- the above operation was repeated four times, and similarly, 1 ml of 5% TFAZ methylene chloride was added, and the above operation was repeated twice. Collect the natural liquid
- the solvent was distilled off in a vaporizer, and the peptide was cut out from the resin.
- Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) were used as N-protected amino acids using 60 mg of the carrier resin in the same manner as in Example 12. -0H, Fmoc-Leu-0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Met-OH,
- Fmoc-Lys (t-Boc) -0H
- Fmoc-Arg (Pmc) -0H
- Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H
- Fmoc-Vat 0H, Fmoc-Pro-0H, Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) were used as N-protected amino acids using 60 mg of the carrier resin in the same manner as in Example 12.
- Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) were used as N-protected amino acids using 60 mg of the carrier resin in the same manner as in Example 12. -0H, Fmoc-Leu-0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H.Fmoc-Met-OH,
- Fmoc-Val_0H, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H were used as N-protected amino acids using 60 mg of the carrier resin in the same manner as in Example 12. , Fmoc-Leu-0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Met-OH,
- Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) were used as N-protected amino acids using 60 mg of the carrier resin in the same manner as in Example 12. -0H, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Met-0H,
- Fmoc-Vat 0H, Fmoc-Pro-0H, Fmoc-Tyr (t-Bu) -OH, Fmoc-Arg (Pmc) were used as N-protected amino acids using 60 mg of the carrier resin in the same manner as in Example 12. -0H, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Lys (t-Boc) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Tyr (t- Bu) -OH,
- compound (I) having PLC inhibitory activity can be provided.
- Xaa represents Tyrosine amide.
- Xaa at position 1 represents N-Acetyl-L-Tyrosine.
- Xaa at position 8 represents L-Tyrosine amide.
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N- (2,4-Dihydroxybenzoyl) -L-Leucine.
- E 'Other information Xaa at position 11 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N- (2,5-Dihydroxybenzoyl) -L-Leucine.
- Xaa at position 1 1 represents-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N- (3-Cyclohexylpropionyl) -L-Leucine.
- Characteristic code Modified- site
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N-Cyclopentylacety L-Leucine Symbol for special feature: Modified-site
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N-Propionyl_L-Leucine. Symbol indicating special features: Modif ied-site
- E 'Other information Xaa at position 11 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N-Isobutyry L-Leucine. Symbol indicating special features: Modif ied-site
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N- (2-Ethyl-n-butyryl) -L-Leucine.
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N- (n-Caprylyl) -L-Leucine c Symbol indicating characteristic: Modif ied-site
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 is N- (3-Cyclopentylpropionyl) -L-
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N-Cyclopropylcarbonyl-L-Leucine.
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N-Cyclohexylacetyl-L-Leucine. , Symbol indicating characteristics: Modified-site * Location: 1 1
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 has N-Cyclopentylcarbonyl-L-Leucine
- Xaa at position 1 1 represents [/ "Valine amide.”
- Xaa at position 1 represents N- (n-Hexanoyl) -L-Leucine.
- Characteristic code Modif ied-site
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
- Xaa at position 1 represents N- (n-Nonanoyl) -L-Leucine.
- Characteristic code Modif ied- si te
- Xaa at position 1 1 represents L-Valine amide.
Landscapes
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Description
明 細 書
ホスホリパ一ゼ C阻害べプチド
技術分野
本発明はホスホリパ一ゼ C (以下、 PLCという） 活性を阻害する新 規ペプチド類に関する。
背景技術
細胞内情報伝達の解明を目的に、 各種組織より PL C、 たとえばイノ シト一ルリン脂質 PLC (以下、 P I—PLCという） の分離、 精製が 行われ、 これまでに 、 β、 y、 <5の 4タイプ 9種のアイソザィムの存 在が明らかにされてきた。 ァタイプとして 9^ と 72 の 2種が知られて おり 〔S.G.Rhee et al. ,サイエンス (Science), 244， 546 - 550(1989)； Y. Homma et al.，バイオケミカル · ジャーナル（Biochem. J. ), 269, 13 - 18 (1990)〕 、 両者とも増殖因子の情報伝達に重要な役割を果たすことが明 らかにされている。 β、 < および 5タイプの構造上の特徴は^、 7、 δ に共通の I. I I領域の間に癌遺伝子 src関連領域、 SH2および SH 3 (SH2ゾ SH3) 領域を含むことであるが、 ァタイプの SH2領域 は受容体型チロシンキナーゼとの相互作用に必須である 〔D.Anderson e t al.，サイェンス（Science), 250， 979-982(1990) 〕 。 ァタイプの SH3 領域の機能は明らかではないが、 細胞骨格系との相互作用に重要であろ うと推測されている。 そして、 SH2および SH3 (SH2/SH3) 領域のみを持ち、 キナーゼ領域を持たない癌遺伝子 crkが発見されるに 至り、 γの SH2および SH3 (SH2ZSH3) 領域を介する調節の 乱れ （Ρ I— PLCの活性異常） や細胞増殖の異常が癌化を引き起こす 可能性がクローズアップされてきている。 また、 その他に PLCの昂進 が病態と閬連する報告として、 トロンビンによる血小板活性化系に P L Cが関与しているという報告 〔ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケ
ミストリ一 （J. Biol. C em. )， 261， 16838-16847(1986) 〕 、 ヒスタ ミ ン の遊離に P L C活性が関与しているという報告 〔ジャーナル ·ォブ ·セ ル 'バイオロジー （J. Cell Biol. ), 105, 2745 - 2750(1987)〕 、 顆粒球、 多形核白血球 （PMN) 経由で炎症を惹起するものとして、 N—ホルミ ルーメチォニル一ロイシルーフヱ二ルァラニンが知られており、 このレ セプターのシグナル伝達系に P L Cが関与しているという報告 〔サイェ ンス（Science), 232， 97 - 100(1986)〕 、 動脈硬化巣に血小板由来成長因子
(PDGF) /8鎖が多量に発現しており 〔サイエンス（Science), 248，
1009(1990)) 、 PDGF—依存的血管平滑筋細胞の増殖のシグナル伝達 系に PLC— 72が構成成分として存在し、 平滑筋細胞の増殖系に PL C- r 2が大きく関わっているという報告 〔バイオケミカル ·アンド ' バイオフィジィカル · リサーチ · コミュニケィショ.ンズ （Biochem. Bio hys. Res. Commun. ) ， 156， 846-854(1988)、 バイオケミカル · ジャーナ ル（Biochem. J. ), 290， 649-653(1993)) 、 アルツハイマー病態時に P L C が昂進しているという報告 〔アメリカン . ジャーナル ·ォブ ·パソロジ -(Am. J. Pathol.), 139， 737-742(1991)) などがあげられる。 そこで P L C活性を阻害することにより、 これらの病態を改善できることが期待 され、 PLCの活性を阻害する薬剤の提供が求められている。 PLC活 性を阻害するペプチドとしては、 配列番号 1〜5、 7および 8で示され るべプチドが、 本出願の優先権の基礎となる出願 （特願平 4一 52 3 9 4 ： 1 9 9 2年 3月 1 1 日出願） 後のジャーナル ·ォブ ·バイオロジカ ル ·ケミストリー （ J. Biol. Chem. ) . 26 7巻、 2 1 844〜 2 1 84 9頁、 1 9 9 2年に発表されている。
発明の開示
本発明によれば、 ホスホリパーゼ C阻害活性を有し、 かつ配列番号 1 で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドもしくは該ぺプチドの少なく
とも 1個のァミノ酸残基が欠失されるか、 該ぺプチドに少なく とも 1個 のァミノ酸残基が付加されるかおよび Zまたは他のァミノ酸残基もしく は修飾されたァミノ酸残基で置換された変異べプチドを提供することが できる。 これらのペプチドを総称して化合物 （ I ) と称する。 変異ぺプ チドとしては、 配列番号 2〜8で示されるァミノ酸配列からなるぺプチ ドまたは式 W-X-Tyr-Arg- Lys-Met-Arg- Leu-Arg-Tyr-Y- Z (式中、 Wは 水素原子、 置換もしくは非置換のアルカノィル基、 置換もしくは非置換 のァロイル基またはクマリル基を表し、 Xは単結合または— L e u—を 表し、 Yは単結合または— P r 0— V a 1 —を表し、 Zはヒドロキシ基 またはァミノ基を表す。 但し、 Wが水素原子のとき、 Zはァミノ基であ る。 ） で表されるペプチド、 具体例としては配列番号 9〜2 8で示され るアミノ酸配列からなるペプチドをあげることができる。 なお、 配列番 号 1〜2 8で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを各々化合物 （ I 一 1 ) 〜 （ I一 2 8 ) と称する。
前記式中、 置換もしくは非置換のアルカノィル基は、 炭素数 1〜 1 0 の、 具体的にはホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 プチリル、 イソブ チリル、 バレリル、 イソバレリル、 ビバロイルなどがあげられる。 置換 基としては、 カルボキシ基、 脂環式アルキル基、 フヱニル基などがあげ られる。 脂環式アルキルとしては、 炭素数 3〜8の、 シクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどがあげられる。 置 換もしくは非置換のァロイル基としては、 ベンゾィル基またはナフ トイ ル基などがあげられる。 置換基としては置換数 1〜3のヒドロキシがあ げられる。
化合物 （ I ) はペプチド自動合成機を用いた固相合成法により合成さ れる。 固根法により得られるぺプチドの結合した固相担体はフッ化水素 で処理し、 ぺプチドを固相担体より遊離させると同時にァミノ酸側鎖の
保護基を除去する。 C末アミノ酸のアミ ド化はアプライ ドバイオシステ ムズ （Applied Biosystems, Inc. , Foster Ctiy, California, USA；以 下、 AB Iという） 社製べプチド合成機を用いる場合は p—メチル—ベ ンズヒドリルァミン （BHA) —レジン （AB I社製） を使用する。 島 津製作所製べプチド合成機を用いる場合、 リ ンクアミ ドーレジンあるい はリンクアミ ド一 MBHA (4—メチルーベンズヒドリルァミン） 一レ ジン （カルビオケム一ノバビオケムジャパン社製） を用いる。 また、 N 末アミノ酸の修飾 （ァシル化） については、 N末アミノ酸保護基を脱保 護後ペプチド鎖の延長と同様にカルボン酸成分と縮合試薬 〔例えば、 ベ ンゾトリアゾールー 1—ィル一ォキシートリス一ピロリジノーフォスフ ォニゥムへキサフルオロフォスフェート （PyBOP) ZN—ヒ ドロキ シベンゾトリアゾ一ル （HOBT) ZN—メチルモルホリン （NMM) 〕 を用いて縮合するか、 あるいはカルボン酸成分の酸無水物、 酸クロラ イド等のカルボン酸活性化物を用いて、 縮合を行う。 尚、 上記反応は合 成樹脂上で反応を行い、 反応終了後に目的とするぺプチド誘導体を樹脂 から切り出して得る。 このようにして得られるペプチドの粗生成物を、 逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー （以下、 HPLCという ) で精製して純品を得る。
本発明により得られる化合物 （I) は優れた PLC阻害活性、 細胞増 殖阻害活性および抗菌作用を示す。
次に化合物 （I) の PLC阻害活性、 細胞増殖阻害活性および抗菌作 用を実験例 1〜 3で説明する。
実験例 1 PLC阻害活性
ゥシ胸腺より Y. Ho醒 a et バイオケミカル ' ジャーナル 〔 （Bioche m. J.) ^269, 13(1990) 〕 に記載の方法に従って試料 （ P L C—ァ ) を 製造した。
あらかじめ氷上で下記第 1表に記載の組成を有する溶液を調製し、 37 °Cに加温することによって反応を開始した。 10分間ィンキュペートした のち、 2ml のクロ口ホルム—メタノール （2:1, V/V) 混合溶液を加えて 反応を停止した。 生成したイノシトールリン酸を 0.5ml の IN塩酸で抽出 した。 遠心 （2000xg， 3 分間） により二相分配し、 その上清 0.7ml に含 まれる3 H量をシンチレーション測定した。
第 1 表 '
溶 液 液量（ a 1 )
試料 （0.2 の精製 PI- PLC-y i 標品） 10
反応液 30
DIM MES(e) NaOH緩衝液（pH 6.0) 2.5
2) lmM CaCh 5
3) 20mg/ml ゥシ血清アルブミ ン 2.5
4)試験べプチド水溶液（b) 20
基質（e) 10
( a) モルホリノ） エタンスルホン酸
(b) 2-(N- (c) 試験に供したぺプチドおよび水溶液の濃度は第 2表に記す。
500 ng ホスファチジルイノシトール 4， 5-ビスリン酸 （PIP2) - 150 ホスファチジルエタノールァミン、 37kBq[3H]PIP2 を あらか！；め少量のクロ口ホルムで混合する。 窒素 ¾流下で脂質 を乾固させたのち、 0.1M KC1を lml 加え超音波処理する。
得られた比放射能の値を Aとし、 試験べプチド水溶液のかわりに同量 の水を加えた場合の比放射能の値を Bとし、 試料および試験べプチド水 溶液のかわりに同量の水を加えた場合の比放射能を Cとして、 次式より 阻害率 （X) を求めた。
X (%) = (A-C) / (B-C) x 1 0 0 得られた試験べプチドの阻害率を第 2表に示す。
第 2 表
化合物 濃度 M ) 阻害率 （ ）
実験例 2 細胞増殖阻害活性
アマシャム （Amersham) 社製の細胞増殖検出キッ トを用いて、 以下の よつに行つた。
まず、 細胞 〔KMS— 4 ； M. Nanba et al.， International Journal of Cancer, 32， 697(1983)〕 を 1 0 %牛胎児血清含有 DME M培地 （日 水製薬製） に加え、 1〜2 X 1 04 個 Zmlの濃度に調整後、 24穴プレ
—ト （コ一ニング社製） の 1穴当たり上記細胞懸濁液 1 m 1加え、 C02 インキュベーター （ 3 7 °C、 5 %C02 ) で 2日間培養した。 ついで、 1 0 %牛胎児血清含有 DMEM培地で培地交 後、 被検ペプチドを添加 し、 1 7時間培養した。 再び、 無血清 DMEM培地で培地交換し、 標識 試薬 5-ブ口モ -2' -デォキシゥリジン（BrdU)および 5-フルォロ -2' -デォキ シゥリジン（FdU)[10:l] を同培地で 1000倍希釈した液 0.5ml を各穴に加 え、 2時間培養した。 ついで、 培地を除去し、 酢酸—エタノール液で細 胞を固定した。 固定された細胞についてアマシャム社製細胞増殖検出キ ッ トの方法に従って、 染色し、 さらに 1 %ギムザ液 （メルク社製） で追 染色した。 ついで、 顕微鏡 1視野 （細胞数約 2 0 0個） 内で BrdUを取り 込んだ細胞数ならびに全細胞数を測定し、 1視野当たりの染色細胞数割 合 （％) を算出した。 さらに、 同操作を 1 0回行い、 その平均値をもつ て細胞増殖活性 （％) とした。
細胞増殖阻害活性は次のようにして算出した。 ぺプチド無添加の場合 の増殖活性を Aとし、 被検ぺプチド添加の場合の増殖活性を Bとして、 次式より、 細胞増殖阻害率 （X) を求めた。
X (%) = ( 1 - B/A) X 1 0 0
得られた試験べプチドの阻害率を第 3表に示す。
第 3 表 化合物 濃度 （ ^Μ ) 阻害率 （％)
実験例 3 抗菌作用
各種細菌に対する最小生育阻止濃度 （MI C) を第 4— 1表および第 4一 2表に示す。 抗菌活性はパク ト トリプトン （ディフコ社製） 3g/l、 肉エキス lg/1 、 グルコース lg/1 、 寒天 16g八の組成からなる培地 (PH7.0)を用いて寒天希釈法で測定した。 結果を第 4 - 1表および第 4 一 2表に示す。
第 4 一 1 表
一 ：活性なし
第 4 一 2
一 ：活性なし
本発明を実施するための最良の形態
以下の実施例で示される理化学的性質は次の機器類によって測定した。
•質量分析：実施例 1〜 1 1 ； 日立 M- 80B
実施例 1 2〜28 ； 日本電子 JMS- HX110A ' •ァミノ酸分析： Waters pico tag , 使用したァミノ酸及びその保護基に関する略号は、 生化学命名に関す る IUPAC-IUB委員会 (IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatu の勧告 〔バイオケミストリ一 （Biochemistry), 11， 1726(1972) 〕 に従つ た。
以下の略号は対応する下記のァミノ酸及び保護基を表す。
Gly:グリシン
Ala: Lーァラニン
Val:L—バリン
Leu： L—口イシン
Ile:L—ィソロイシン
Ser:L—セリ ン
Thr:L—ス'レオニン
Asp:L—ァスパラギン酸
Asn:L—ァスパラギン
Glu: L—グルタミ ン酸
Gin: L—グルタミ ン
Lys:L—リジン
Met:L—メチォニン
His:L—ヒスチジン
Arg:L-—アルギニン s Phe:L-フエ二ルァラニン
Tyr:L—チロシン
Cys:L一システィン
Pro: L—プロリ ン
Asx:L—ァスパラギン酸または L—ァスパラギン
Glx:L -グル夕 ミ ン酸または L一グル夕 ミ ン
t-Boc: t一ブチルォキシカルボニル
Bzl:ベンジル
Tos:p— トルエンスルフォニル
DNP: 2, 4 -ジニトロフェニル
B0M:ベンジルォキシメチル
C1-Z： 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
Br-Z： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
Fmoc： 9 -フルォレニルメチルォキシカルボニル
以下の略号は対応する下記の側鎖保護ァミノ酸を表す。
Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH ： Να - 9—フルォレニルメチルォキンカルボ二 ル一 0— t—プチルー Lーチロシン
Fmoc-Lys(t-Boc)-OH： N 一 9一フルォレニルメチルカルボ二ルー N ε一 t—プチルォキシカルボ二ルー L一リジン
Fmoc-Arg(Pmc)-OH： Να- 9一フルォレニルメチルカルボニル— Ν— δ - 2 , 2, 5, 7， 8—ペンタメチルクロマン 一 6一スルホ二ルー : L—アルギニン
以下の略号は対応する下記の反応溶媒及び反応試薬を表す。
P y Β 0 Ρ ： ベンゾトリアゾール一 1—ィル—ォキシー トリス一ピロ リジノーフォスフォニゥムへキサフルオロフォスフェー
HO B t ： N—ヒ ドロキシベンゾトリアゾール
N M： N—メチルモルホリ ン
D M F ： N, N—ジメチルホルムアミ ド
T F A： トリフルォ口酢酸
N末端修飾に使用したカルボン酸の製造会社は以下のとおりである
無水酢酸：国産化学
無水一 n—酪酸： ナカライテスク
イソ酪酸：第一化学薬品
n—力ブロン酸：和光純薬
無水コハク酸： A 1 d r i c h
3—シクロペンチルプロピオン酸： A 1 d r i c h
クマリン酸 、
2 , 3—ジヒドロキシ安息香酸
2， 4ージヒドロキシ安息香酸
2 , 5—ジヒドロキシ安息香酸
3―シクロへキサンプロピオン酸
シクロペンチル酢酸 ！·東京化成
プロピオン酸
2—ェチルー n -酪酸
n—力プリル酸
シク口プロパンカルボン酸
シク口へキシル酢酸
シクロペンタンカルボン酸
ペラフレコン酸
以下の実施例 1 〜 1 1は A B I社のペプチド合成機 430A型機を用い、 A B I社の試薬及び溶媒を用いて A B I社の合成プログラムにより合成 ， 機を運転してペプチドを合成した例を示す。 アミノ酸の縮合反応は、 ァス パラギン、 グルタミンおよびアルギニンについては 1一ヒドロキシベン
ゾトリアゾ一ルを用いて活性エステル体として、 他のァミノ酸類は対称 酸無水物として標準の条件で行った。
実施例 1 2〜2 8は島津製作所のペプチド合成機 PS SM 8を用い、 島津製作所の試薬及び溶媒を用いて同社の合成プログラムにより合成機 を運転してぺプチドを合成した例を示す。 ァミノ酸の縮合反応は F mo c法 〔ペプチド合成の基礎と実験 泉屋信夫ら （丸善） 〕 により、 標準 の条件で行った。
なお、 必要に応じて、 アミノ酸保護体、 試薬は国産化学、 ペプチド研 究所、 カルビオケムーノバビオケムジャパン社の製品も用いた。
実施例 1 化合物 （ I一 2 ：配列番号 2) の合成
H-Ser-Tyr-Tyr-Glu-Lys-His-Ala-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-OH
t-Boc-Met 0.5瞧 ol が結合した担体樹脂 0.73g を自動合成機の反応容 器に入れ、 ABI 社の合成プログラムに従い、 次の処理、 洗浄を行った。
(1) 3 3 %TF Aを含む塩化メチレン溶液処理 （8 0秒）
(2) 5 0%TFAを含む塩化メチレン溶液処理 （18.5分）
(3)塩化メチレン洗浄 （3回）
(4) 1 0 %ジイソプロピルェチルアミンを含む塩化メチレン溶液処理
( 1分 X 2回）
(5) DMF洗浄 （5回）
(6) (1)〜 )の工程で得られた Metの結合した担体樹脂に、 t-Boc-Lys(Cl-Z の対称酸無水物 l.Onimol を含む DMF溶液 4ml を加え、 反応容器を
18分間攪拌した。
(7)塩化メチレン洗浄 （5回）
こうして、 t-Boc-Lys(Cl-Z)-Met が担体樹脂上に合成された。
次に、 得られた t-Boc-Lys(Cl-Z)-Met が結合した担体樹脂に上記の (1)〜(5)の脱保護工程を行った後、 （6)の工程で t-Boc- Arg(Tos)の活性エステ
ル （HOB t) を加えて縮合反応を行い、 次いで (7)の洗浄工程を絰て t-Boc- Arg(Tos)- LysCCl- Z)- Metを担体樹脂上に合成した。 以下、 工程 (1) 〜(7)を順次繰り返して保護べプチドの結合した担体樹脂 1.92g を得た。
尚、 工程 (6)では順次 t- Boc- Tyr(Br- Z)- 0H、 t- Boc-Leu-0H、 t- Boc-Ala- 0H' t-Boc-His(DNP)-OH、 t_Boc- Lys(C卜 Z)- 0H、 t- Boc-Glu(OBzl)- 0H、 ， t-Boc-Tyr(Br-Z)-OH. t- Boc- Tyr(Br-Z)- 0H、 t- Boc-Ser(Bzl)- OH を用い た。 合成反応終了後、 得られた担体樹脂のうち 0.96g を用い DMF 4.8 ml、 チォフエノール 0.51ml を加え室温で 1 時間攪拌した。 次いで濾過 して得られた担体樹脂を DMF20ml、 水 20ml、 エタノール 20ml 、 塩化 メチレン 20ml で洗浄後、 担体樹脂 0.90g を自動合成機の反応器に入れ 、 脱 Boc プログラムに従い上記（1) 〜（5) の脱保護工程を行った。 得ら れた担体樹脂 0.87g を用い、 これにァニソール 1.1mlを加え 15時間放置 した後フッ化水素 15mlを加えて 1.2 時間氷冷下攪拌した。 次いでフッ化 水素を減圧除去し、 担体樹脂に酢酸ェチル 100mlを加え 0.5 時間攪拌し た。 濾過して得られた担体樹脂に 2M酢酸 100ml を加えて 1時間攪拌した 。 担体樹脂を濾過で除き濾液を凍結乾燥して 306mg の粗成品を得た。 こ のうち 150mg を逆相カラム （CAPCELL PAK C18 SG120 30x250mm ) を用 いた HPLCで精製した。 0.1 %TF Aとァセトニトリルを用いた直線濃度 勾配法で溶出し、 220nmで検出し化合物 （ I一 2) を含む画分を得た。 この画分を凍結乾燥して化合物 （ 1— 2) 82.5mgを得た。
質量分析 （SIMS; 以下同様） ： 1588 (M+l) +
アミノ酸分析 ： Glx 1.0(1)， Ser 1.0(1)， His 1.1(1)， Arg 1.2(1)， Ala 1.0(1), Tyr 3.0(3)， Met 0.8(1)， Leu 1.0(1)， Lys 2.0(2). 実施例 2- 化合物 （ I一 3 ：配列番号 3) の合成 έ H-Glu-Lys-His-Ala-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-OH
t - Boc- Met が結合した担体樹脂及び保護ァミノ酸として順次
t - Boc- LysCCl- Z)-0Hゝ t- Boc- Arg(Tos)- OH 、 t-Boc- Tyr(Br- Z)-0H、 t- Boc-Leu- 0H、 t- Boc- Ala- 0H、 t- Boc- His(DNP)- OH、 t- Boc- LysCCl- Z)- t-Boc-Glu(0Bzl)-0Hを用い、 実施例 1 と同様にして保護ペプチドの結合 した担体樹脂 1.3gを得た。 このうち 0.67g を実施例 1 と同様に処理して 粗成品 140mg を得た。 このうち 67mgを HPLCで精製して化合物 （ 1— 3) 24mgを得た。 ·
質量分析 ： 1175 (M+l) +
アミノ酸分析 ： Gl 1.0(1)， His 1.0(1)， Arg 1.1(1)， Ala 1.0(1)， Tyr 1.0(1), Met 0.9(1), Leu 1.0(1)， Lys 2.1(2). 実施例 3 化合物 （ I一 4 ：配列番号 4 ) の合成
H-Glu-Lys-His-Ala-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-OH t-Boc-Val が結合した担体樹脂及び保護アミノ酸として順次 t-Boc- P 0H、 t- Boc- Tyr(Br-Z)-0H、 t-Boc_Arg(Tos)-0H、 t-Boc-Leu-OH、 t- Bo Arg(Tos)-0H、 t-Boc-Met-0H. t-Boc-Lys(Cl-Z)-0H. t」Boc- Arg(Tos)- t-Boc-Tyr(Br-Z)-0H、 t-Boc-Leu- 0H、 t- Boc-Ala-OH、 t-Boc-His(DNP) t-Boc-Lys(Cl-Z)-0H、 t- Boc-Glu(OBzl)- OHを用い、 実施例 1 と同様にし て保護ペプチドの結合した担体樹脂 2.5gを得た。 このうち 1.24g を実施 例 1 と同様に処理して粗成品 322mg を得た。 このうち 161mg を HPLCで精 製して化合物 （ 1— 4) 96mgを得た。
質量分析： 1959 (M+l) +
アミノ酸分析： Glx 0.9(1), His 1.1(1), Arg 3.1(3)， Ala 0.9(1), Pro 1.4(1), Tyr 2.0(2), Val 0.8(1)， Met 0.9(1)， Leu 2.0(2), Lys 1.-9C2).
実施例 4 化合物 （ I— 5 ：配列番号 5 ) の合成
H-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-OH
t-Boc-Val が結合した担体樹脂及び保護アミノ酸として順次 t-Boc - Pro- 0H、 t-Boc-Tyr(Br-Z)-OH. t- Boc-Arg(Tos)- OH、 t- Boc- Leu- 0H、 t-Boc-Arg(Tos)-OH、 t-Boc-Met- 0H、 t - Boc- Lys(Cl- Z)- OH、 t- Boc - Arg(Tos)-0H、 t - Boc-Tyr(Br-Z)- 0H、 t-Boc-Leu-OHを用い、 実施例 1 と 同様にして保護べプチドの結合した担体樹脂 1. 6gを得た。 このうち 0. 78 g を実施例 1 と同様に処理して粗成品 253mg を得た。 このうち 135mg を HPLCで精製して化合物 （ I一 5 ) 57mgを得た。
質量分析： 1494 ( +l) +
アミノ酸分析： Arg 3. 4(3), Pro 1. 1(1)， Tyr 1. 9(2), Val 1. 1(1)， Met 0. 4(1)， Leu 2. 2(2)， Lys 1. 0(1). 実施例 5 化合物 （ I— 6 ：配列番号 6 ) の合成
H-Ser-Leu-Val-Glu-Leu-Val-Ser-Tyr-Tyr-Glu-Lys-His-Ala-OH
t-Boc-Ala が結合した担体樹脂及び保護ァミノ酸として順次
t-Boc-His(B0M)-0H、 t-Boc-Lys(C卜 Z)-0H、 t-Boc-Glu(0Bzl)-0H.
t-Boc-Tyr(Br-Z)- 0H、 t-Boc_Tyr(Br-Z)-0H、 t-Boc-Ser(Bzl)-0H、 t-Boc-Val-OH. t-Boc-Leu-0H t- Boc- Glu(OBzl)- 0H、 t-Boc- Val-0H、 t-Boc-Leu-OH. t_Boc- Ser(Bzl)_0Hを用い、 実施例 1 と同様にして保護 ペプチドの結合した担体樹脂 1. 7gを得た。 このうち 0. 91g を実施例 1 と 同様に処理して粗成品 342mg を得た。 このうち 70mgを HPLCで精製して化 合物 （ I一 6 ) 40mgを得た。
質量分析 ： 1537 (M+l) +
ァミノ、酸分析 ： Glx 2. 0(2)， Ser 2. 1(2)， His 0. 9(1)， Ala 1. 0(1), Tyr 2. 0(2)， Val 2. 0(2), Leu 2. 1 (2)， Lys 1. 0(1).
実施例 6 化合物 （ I一 7 ：配列番号 7 ) の合成
H-Tyr-Arg-Lys- et-Arg-Leu-Arg-Tyr-OH
t-Boc-Tyr(Br-Z) が結合した担体樹脂及び保護ァミノ酸として順次 t-Boc-Arg(Tos)-OH、 t- Boc-Leu- 0H、 t-Boc- Arg(Tos)- OH、 t- Boc-Met- 0 t - Boc- Lys(C卜 Z)-0H、 t-Boc-Arg(Tos)-OH、 t- Boc- Tyr(Br- Z)- OHを用い、 実施例 1 と同様にして保護ペプチドの結合した担体樹脂 1.7gを得た。 こ のうち 0.80g を実施例 1 と同様に処理して粗成品 194mg を得た。 このう 67mgを HPLCで精製して化合物 （ 1 - 7) 38mgを得た。
質量分析 ： 1185 (M+l) +
アミノ酸分析 ： Arg 3.2(3)， Tyr 1.9(2), Met 0.9(1), Leu 1.0(1)， Lys 1.0(1). 実施例 7 化合物 （ I一 8 ：配列番号 8 ) の合成
H - Arg - Lys - Met - Arg - Leu - Arg - 0H
t-Boc-Arg(Tos)が結合した担体樹脂及び保護ァミノ酸として順次 t-Boc-Leu- 0H、 t-Boc- Arg(Tos)-0H、 t-Boc-Met- 0H、 t - Boc- Lys(C卜 Z)-0 t-Boc-Arg(Tos)-0H を用い、 実施例 1 と同様にして保護ペプチドの結合 した担体樹脂 1.5gを得た。 このうち 0.80g を実施例 1 と同様に処理して 粗成品 130mg を得た。 このうち 40mgを HPLCで精製して化合物 （ 1— 8) 30mgを得た。
質量分析 ： 859 (M†l) +
アミノ酸分析 ： Arg 3.0(3)， Met 0.9(1)， Leu 1.0(1)， Lys 1.0(1). 実施例 8· 化合物 （ I一 1 ：配列番号 1 ) の合成
H-Ser-Leu-Val-Glu- Leu- Val-Ser- Tyr- Tyr- Glu-Lys- His- Ala- Leu- Tyr-Arg
Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-OH
t-Boc-Val が結合した担体樹脂及び保護アミノ酸として順次 t-Boc - Pro- 0H、 t-Boc- Tyr(Br-Z)-0H、 t- Boc- Arg(Tos)- OH、 t- Boc- Leu-0H、 t-Boc- Arg(Tos)- OH 、 t-Boc- Met- 0H、 t-Boc- Lys(Cl- Z)-0H、 t-Boc- Arg(Tos)- OH、 t-Boc- Tyr(Br-Z)-0H、 t- Boc- Leu- 0H、 t- Boc- Ala-OH 、 t-Boc- His(DNP)- OH、 t-Boc- Lys(Cl_Z)-0H、 t- Boc- Glu(0Bzl)-0H、 t-Boc-Tyr(Br-Z)-OH. t- Boc- Tyr(Br-Z)- 0H、 t- Boc- Ser(Bzl)- OH 、 t-Boc-Val-OH. t-Boc-Leu-OH 、 t-Boc-Glu(0Bzl)-0H 、 t- Boc- Val-0H、 t-Boc-Leu-OH. t- Boc- Ser(Bzl)- OHを用い、 実施例 1 と同様にして保護 ペプチドの結合した担体樹脂 2. 8gを得た。 このうち 1. 3gを実施例 1 と同 様に処理して粗成品 380mg を得た。 このうち 210mg を HPLCで精製して化 合物 （ I一 1 ) 65nig を得た。
アミノ酸分析 ： Glx 2. 2(2)， Ser 1. 8(2)， His 1. 0(1)， Arg 2. 6(3)，
Ala 0. 9(1), Pro 1. 1 (1)， Tyr 4. 0(4)， Val 3. 0(3), Met 1. 4(1)，
Leu 3. 9(4)， Lys 2. 0(2). 実; 例 9 化合物 （ I— 9 ：配列番号 9 ) の合成
H-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-NHz
P-メチル -BHAが結合した担体樹脂 7 2 5 m gを用い、 保護アミノ酸と して順次 t - Boc-Tyr(Br-Z)-0H、 t-Boc - Arg(Tos)- 0H、 t-Boc- Leu-0H、 t-Boc-Arg(Tos)-0H、 t- Boc- Met-0Hゝ t- Boc-Lys(Ci-Z)-0H、 t-Boc- Arg(Tos) - OH、 t-Boc-Tyr(Br-Z)-0Hを用い、 実施例 1 と同様の方法によ り保護ペプチドの結合した担体樹脂 1. 8 g を得た。 このうち 0. 9gを実施 例 1と同様にフッ化水素処理を行って 239. 9mg の粗製品を得た。 このう ち 140mg を HPLC精製して、 化合物 （ I一 9 ) 84. 8mgを得た。
質量分析： 1184 (M+l) +
アミノ酸分析： Tyr 2.0(2), Arg 3.2(3), Lys 1.1(1)， Met 0.9(1), Leu 0.9(1). 実施例 1 0 化合物 （ I一 1 0 ：配列番号 1 0 ) の合成
CH3CO-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-NH2
実施例 9で得た担体樹脂 725mg に無水酢酸 2.0隱 olを縮合させ 0.91g の担体樹脂を得た。 このすベてを実施例 1 と同様にフッ化水素処理を行 つて 217.8mg の粗製品を得た。 このうち 117 .8mgを HPLC精製して、 化合 物 （ I— 1 0 ) 74.5mgを得た。
質量分析： 1226 (M+l) +
アミノ酸分析： Tyr 2.0(2)， Arg 3.2(3), Lys 1.0(1), Met 0.9(1)， Leu 0.9(1). 実施例 1 1 化合物 （ I一 1 1 ：配列番号 1 1 ) の合成'
n-C3H7C0-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2
p—メチルー BHA が結合した担体樹脂 725mg を用い、 護アミノ酸と して順次 t-Boc-Va卜 0H、 t-Boc - Pro-0H、 t-Boc-Tyr(Br-Z)-0H、 t-Boc- Arg(Tos)-0H、 t - Boc-Leu-0H、 t-Boc- Arg(Tos) - OH、 t-Boc- Met-0H、 t-Boc-Lys(Cl-Z)-0H、 t-Boc-Arg(Tos) - OH、 t- Boc-Tyr(Br-Z)-0H、 t-Boc-Leu-0H. 無水 n -酪酸を用い、 実施例 1 と同様の方法により保護 ペプチドの結合した担体樹脂 2. lgを得た。 このうち 0.8gを実施例 1 と同 様にフッ化水素処理を行って 207mg の粗製品を得た。 このうち 103mg を HPLC精製して化合物 （ 1— 1 1 ) 63mgを得た。
質量分析： 1563 (M+l) +
アミノ酸分析： Tyr 2.0(2), Arg 3.0(3), Lys 1.1(1)， Met 1.0(1)， Leu 2.0(2)， Pro 1.0(1)， Val 1.0(1).
実施例 1 2 化合物 （ 1— 1 2 :配列番号 1 2 ) の合成 C5H302C0-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2
4 -（2， 4 - Dimethoxyphenyl - Fmoc - !101116 1)-卩|1611(^の担体榭脂6011^ を自動合成機の反応器に入れ島津製作所の合成プログラムに従い次の処 理、 洗浄を行った。
(1) DMFによる洗浄 （3分） '
(2) 3 0 %ピペリジンを含む DMF溶液処理 （4分 X 2回）
(3) DMF洗浄 （ 1分 X 5回)
(4) (1)〜 )の工程で得られた Va 1の結合した担体樹脂に、 Fmoc-Pro - 0H 300^ mo 1 、 PyBOP 300/^ mo 1 および HOB t 300 1 を加え、
3 0分間撹拌した。
(5) DMF洗浄 （ 1分 5回）
こうして、 Fmoc-Pro- Valが担体上に合成された。 次に、 上記 (1)〜 )の洗 浄、 脱保護工程を行った後、 （4)の工程で Fmoc- Tyr(t-Bu)-0H を用いて縮 合反応を行い、 次いで (5)の洗浄工程を得て Fmoc-Tyr(t-Bu)-Pro- Valを担 体樹脂上に合成した。 以下、 工程 (1)〜(2)を順次繰り返して保護ペプチド の結合した担体樹脂を得た。 尚、 工程 (4)には順次 300 mo 1の Fmoc - Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Leu-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H. Fmoc-Met-0H、
Fmoc- Lys(t- Boc)- 0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、
Fmoc - Leu-0H、 クマリン酸を用いた。 得られた'担体樹脂をメタノール、 ブチルエーテルでよく洗浄した後、 減圧下 2時間乾燥した。 乾燥した担 体樹脂の入っている反応容器に 1 0 %TF A/塩化メチレンを 1 m 1入 れて撹拌し、 そのまま反応容器の下部より自然滴下させてその液を回収 した。 上記操作を 4回繰り返し、 同様に 5 %TFAZ塩化メチレンを 1 m l加えて、 上記操作を 2回繰り返した。 その自然適下した回収液をェ
バポレー夕にて溶媒を留去し、 樹脂よりペプチドを切り出した。 さらに
8 2. 5%TFA、 5. 5 %チオアニソール、 2. 5 %エタンジチォ一 ル、 3 %ェチルメチルサルファイ ド、 2 %チォフエノールの混合液 1 m
1を加え室温で 8時間放置し、 脱保護を行った。 得られた溶液におよそ
2m 1のエーテルを加えて、 生じる沈澱を粗ペプチドとして 5. 7mg 回収した。 この粗製品全てを逆相カラム （NUCLEOSIL 5C18 20x250睡
：) を用いた HPLCにて精製した。 0. 1 %TF Aとァセトニトリルを 用いた直線濃度勾配法で溶出し 2 2 0 nmにて検出し標記化合物を含む 画分を得た。 この画分を凍結乾燥して標記化合物 （ I一 1 2) 0.52mg得 十- 質量分析： M + H = 1617
アミノ酸分析： Arg 2.9(3), Pro 1.1(1), Tyr 2.0(2)， Val 1.1(1), Met 0.9(1), Leu 2.0(2)， Lys 1.1(1). 実施例 1 3 化合物 （ 1— 1 3 :配列番号 1 3 ) の合成
(H0)2C6H3C0-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2
実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc- Pro- OH、 Fmoc- Tyr(t- Bu)-0H、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Leu-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Met- OH、
Fmoc- Lys(t-Boc)-0H、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、
Fmoc- Leu- OH、 2， 3-ジヒドロキシ安息香酸を用いて、 縮合を行った。 さ らに実施例 1 2と同様にして樹脂からペプチドの切り出し、 脱保護を行 い粗製品 4.4mg を得た。 この全てを HPLCで精製し標記化合物 （ 1— 1 3 ) 0.49mgを得た。
質量分祈： M + H = 1631
アミノ酸分析： Arg 2.9(3)， Pro 1.1(1)， Tyr 2.0(2), Val 1.1(1)，
Met 0.9(1)， Leu 2.0(2)， Lys 1.1(1). 実施例 1 4 化合物 （ 1— 1 4 ：配列番号 1 4 ) の合成
(H0)2C6H3C0- Leu- Tyr- Arg-Lys- Met- Arg- Leu- Arg-Tyr- Pro- Val- NH2 実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc- Tyr(t-Bu) - OH、 Fmoc- Arg(Pmc)- OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Met-OH、
Fmoc-Lys(t-Boc)-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H. Fmoc- Tyr(t- Bu)- OH、
Fmoc-Leu-OH、 2， 4-ジヒドロキシ安息香酸を用いて、 縮合を行った。 さ らに実施例 1 2と同様にして樹脂からペプチドの切り出し、 脱保護を行 い粗製品 5.0mg を得た。 この全てを H PLC精製し標記化合物 （ 1— 1 4) 1.05mgを得た。
質量分析： M + H = 1631
アミノ酸分析： Arg 3.1(3), Pro 1.0(1), Tyr 2.0(2), Val 1.0(1), Met 0.8(1), Leu 2.0(2), Lys 1.0(1). 実施例 1 5 化合物 （ I一 1 5 ：配列番号 1 5 ) の合成
(H0)2C6H3C0-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2 実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Val-0H、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc- Tyr(t- Bu)-0H、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc- Arg (Pmc)-0H、 Fmoc-Met-0H、
Fmoc- Lys (t-Boc)-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H. Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、
Fmoc-Leu-OH . 2， 5-ジヒドロキシ安息香酸を用いて、 縮合を行った。 さ らに実施例 1 2と同様にして樹脂からペプチドの切り出し、 脱保護を行 い粗製品 6.0mg を得た。 この全てを HPLC精製し標記化合物 （ 1— 1 5) 1.27mgを得た。
質量分析： Μ + Η = 1631 ·
アミノ酸分析： Arg 3.0(3), Pro 1.0(1)， Tyr 2.0(2), Val 1.0(1)， Met 0.9(1), Leu 2.0(2)， Lys 1.0(1). 実施例 1 6 化合物 （ I一 1 6 ：配列番号 1 6 ) の合成
C6HiiCH2CH2CO-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2 実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Va卜 OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H 、 Fmoc-Leu-0H 、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H. Fmoc- Met-0H、 Fmoc-Lys(t- Boc)- 0H、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、
Fmoc-Leu-0H、 3-シクロへキサンプロピオン酸を用い、 縮合を行った。 実施例 1 2と同様にして樹脂からペプチドの切り出し、 脱保護を行い粗 製品 3.4mg を得た。 この全てを HPLC精製し標記化合物 （ 1— 1 6) 1.25 mgを得た。 '
質量分析： M + H = 1633
アミノ酸分析： Arg 3.0(3)， Pro 1.0(1), Tyr 2.0(2), Val 1.0(1)， Met 0.9(1)， Leu 2.0(2), Lys 1.1(1). 実施例 1 7 化合物 （ I一 1 7 ：配列番号 1 Ί ) の合成
C5H9CH2C0-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2
実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc- Va卜 0H、 Fmoc- Pro- 0H 、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、 Fmoc- Arg(Pmc) - OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Met-OH 、 Fmoc- Lys(t-Boc)- 0H、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu) - OH 、
Fmoc-Leu-OH , シクロペンチル酢酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2と同様にして樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 3.7m
g を得た。 この全てを HPLC精製し標記化合物 （ 1— 1 7 ) l. Omg を得た c 質量分析： M + H = 1605
アミノ酸分析： Arg 3. 0(3), Pro 1. 0(1)， Tyr 2. 1 (2), Val 1. 0(1), Met 0. 9(1)， Leu 2. 0(2), Lys 1. 0(1). 実施例 1 8 化合物 （ I一 1 8 ：配列番号 1 8 ) の合成
CHs CHaCO-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NHz
実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Val-OH 、 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 、 Fmoc - Arg(Pmc)-0H 、 Fmoc-Leu-0H 、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H. Fmoc-Met-OH 、
Fmoc-Lys (t- Boc)-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 、
Fmoc-Leu-0H 、 プロピオン酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2と同 様にして樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 24. 5mgを得 た。 このうち 14. 8mgを HPLC精製し標記化合物 （ 1— 1 8 ) 6. Omg を得た c 質量分析： M + H = 1551
アミノ酸分析： Arg 3. 0(3), Pro 0. 9(1), Tyr 2. 0(2), Val 1. 0(1), Met 0. 9(1)， Leu 2. 0(2), Lys 1. 0(1). 実施例 1 9 化合物 （ I一 1 9 ：配列番号 1 9 ) の合成
(CH3)2CHCO-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2
実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Val_0H 、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 、 Fmoc - Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Leu-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Met-OH、
Fmoc-Lys(t-Boc)-0H. Fmoc- Arg (Pmc)-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 、
Fmoc-Leu-0H、 イソ酪酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2と同様に して樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 24. 9mgを得た。
このうち 14.8mgを HPLC精製し標記化合物 （ 1— 1 9) 6.2mg を得た。 質量分析： M + H = 1565
ァミノ酸分析： Arg 3.1(3), Pro 1.0(1)， Tyr 2.0(2), Val 1.0(1), Met 0.9(1)， Leu 2.0(2), Lys 1.0(1). 実施例 2 0 化合物 （ 1— 2 0 ：配列番号 2 0 ) の合成
(CH3CH2)2CHCO-Leu-Tyr- Arg- Lys-Met- Arg-Leu- Arg- Tyr-Pro- Val-NH2 実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護ァミノ酸とし て、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Pro-0H、 Fmoc- Tyr(t- Bu)-0H、 Fmoc- Arg(Pmc) - OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Met-OH、
Fmoc- Lys(t- Boc)- 0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H, Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、
Fmoc-Leu-OH、 2-ェチル -n- 酪酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2 と同様にして樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 30.6mg を得た。 このうち 16.8mgを HPLC精製し標記化合物 （ I一 2 0 ) 7. lmg を 得た。
質量分析： M + H = 1593
アミノ酸分析： Arg 3.0(3)， Pro 1.0(1)， Tyr 2.1(2)， Val 1.1(1)， Met 0.9(1), Leu 2.0(2), Lys 1.0(1) 実施例 2 1 化合物 （ 1— 2 1 ：配列番号 2 1 ) の合成
CH3(CH2)6CO-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2 実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護ァミノ酸とし て、 Fmoc-Val-0H 、 Fmoc-Pro-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Met-OH、
Fmoc- Lys(t-Boc)- 0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H. Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、
Fmoc-Leu-OH . n—力プリル酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2と
同様にして樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 23.9mgを 得た。 このうち 14.2mgを HPLC精製し標記化合物 （ I— 2 1 ) 4.7mg を得 質量分析： M + H = 1621
アミノ酸分析： Arg 3.1(3)， Pro 1.0(1), Tyr 2.1(2), Val 1.0(1), Met 0.9(1)， Leu 2.0(2)， Lys 1.0(1) 実施例 2 2 化合物 （ I一 2 2 ：配列番号 2 2 ) の合成
H00(CH2)2C0-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2
実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc- Pro- OH、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Met-0H、
Fmoc-Lys(t-Boc)-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、
Fmoc-Leu-0H、 無水コハク酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2と同 様にして樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 29.6mgを得 た。 このうち 17.4mgを HPLC樟製し標記化合物 （ I一 2 2) 7. Omgを得た。 質量分析： M + H = 1595
アミノ酸分析： Arg 3.1(3)， Pro 1.0(1), Tyr 2.1(2)， Val 1.0(1), Met 0.9(1), Leu 2.0(2)， Lys 1.0(1). 実施例 2 3 化合物 （ 1— 2 3 ：配列番号 2 8 )
C5HaCH2CH2C0-Leu-Tyr- Arg-Lys-Met-Arg- Leu- Arg- Tyr-Pro-Val-NH2 実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Val-0H、 Fmoc-Pro-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、 Fmoc - Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Leu-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H. Fmoc- Met- OH、
Fmoc- Lys (t-Boc)-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-TyrCt-Bu)-0H、
Fmoc- Leu- OH 、 3—シクロペンチルプロピオン酸を用いて、 縮合を行つ た。 実施例 1 2と同様にして樹脂からペプチドを切り出し、 脱保護を行 い粗製品 3.7mg を得た。 この全てを HPLC精製し標記化合物 （ I一 2 3) 0.29mgを得た。
質量分析： M + H = 1619
アミノ酸分析： Arg 3.2(3)， Pro 1.0(1)， Tyr 2.0(2), Val 1.1(1)， Met 0.9(1), Leu 1.9(2), Lys 1.0(1). 実施例 2 4 化合物 （ I一 2 4 ：配列番号 2 4)
C3H5C0- Leu- Tyr-Arg- Lys-Met-Arg- Leu-Arg- Tyr-Pro- Val-NH2
実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護ァミノ酸とし て、 Fmoc-Val-0H、 Fmoc-Pro-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、 Fmoc- Arg(Pmc)- OH、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Met- OH 、 Fmoc- Lys(t- Boc)-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H、
Fmoc-Leu-0H 、 シクロプロパンカルボン酸を用いて、 縮合を行った。 実 施例 1 と同様にして樹脂からペプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製 品 5.6mg を得た。 このうち 3.0mg を HPLC精製し標記化合物 （ 1— 2 4) 0.88mgを得た。
質量分析： M + H = 1563
アミノ酸分析： Arg 3.1(3)， Pro 1.0(1)， Tyr 2.0(2), Val 1.0(1)， Met 0.9(1)， Leu 1.9(2), Lys 1.0(1). 実施例 2 5 化合物 （ I一 2 5 ：配列番号 2 5 )
CeHnCHzCO-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NHa
実施例、 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護ァミノ酸とし て、 Fmoc-Val-0H、 Fmoc-Pro-0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 、 Fmoc-
Arg(Pmc) - OH、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Met- OH 、 Fmoc- Lys(t- Boc)- OHゝ Fmoc- Arg(Pmc) - 0H、 Fmoc- Tyr(t- Bu)-OH 、
Fmoc-Leu-OH . シクロへキシル酢酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2と同様にして樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 11.4 mgを得た。 このうち 5.9mg を HPLC精製し標記化合物 （ 1— 2 5) 3.91mg を得た。
質量分析： M + H-1619
アミノ酸分析： Arg 3.1(3), Pro 1.0(1), Tyr 2.0(2), Val 1.0(1), Met 1.0(1), Leu 1.9(2), Lys 1.0(1). 実施例 2 6 化合物 （ I一 2 6 ：配列番号 2 6 )
CsHgCO-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NHz
実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc- Va卜 0H、 Fmoc- Pro-0H、 Fmoc- Tyr(t-Bu)- OH 、 Fmoc - Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Met- OH、 Fmoc-Lys(t-Boc)-0H、 Fmoc- Arg (Pmc)-0H、 Fmoc- Tyr (t-Bu)-OH、
Fmoc-Leu-OH , シクロペンタンカルボン酸を用いて、 縮合を行った。 実 施例 1 2と同様にして樹脂からペプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製 品 13.0mgを得た。 このうち 6.5mg を HPLC精製し標記化合物 （ I一 2 6 ) 3.75mgを得た。
質量分析： M + H = 1591
アミノ酸分析： Arg 3.0(3), Pro 1.0(1), Tyr 2.0(2), Val 1.0(1)， Met 1.0(1)， Leu 2.0(2), Lys 1.0(1). 実施例 2、7 化合物 （ I一 2 7 ：配列番号 2 7 )
CH3(CH2)4C0-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2
実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc- Val-OH 、 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc- Tyr(t- Bu)- OH 、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Met-OH 、 Fmoc- Lys(t-Boc)-0Hゝ Fmoc- Arg(Pmc)- OHゝ Fmoc- Tyr(t-Bu) - OH 、
Fmoc-Leu-OH , n—カブロン酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2と 同様にして樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 12.7mgを 得た。 このうち 6.5mg を HPLC精製し標記化合物 （ 1 - 2 7 ) 3.63mgを得 質量分析： M + H = 1593
アミノ酸分析： Arg 3.0(3), Pro 1.0(1), Tyr 2.0(2)， Val 1.0(1)， Met 1.1(1)， Leu 2.0(2), Lys 1.0(1). 実施例 2 8 化合物 （】一 2 8 ：配列番号 2 8 )
CH3(CH2)7C0-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-NH2 実施例 1 2と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸とし て、 Fmoc-Val-0H 、 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Met-OH 、 Fmoc-Lys(t-Boc)-0H、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Tyr(t-Bu) - OH 、
Fmoc-Leu-OH 、 ペラルゴン酸を用いて、 縮合を行った。 実施例 1 2と同 様にして樹脂からぺプチドを切り出し、 脱保護を行い粗製品 10.6mgを得 た。 このうち 5.4mg を HPLC精製し標記化合物 （ I一 2 8 ) 2.45mgを得た
0
質量分析： M + H = 1635
アミノ酸分析： Arg 2.9(3)， Pro 1.1(1)， Tyr 2.0(2)， Val 1.0(1)， Met 1.0(1), Leu 2.0(2), Lys 1.0(1).
産業上の利用可能性
本発明によれば、 PLC阻害活性を有している化合物 （ I) を提供す ることができる。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 24
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Leu Val Glu Leu Val Ser Tyr Tyr Glu Lys His Ala Leu Tyr Arg 1 5 10 15
Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Val
20
配列番号： 2
配列の長さ ： 12
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状 '
配列の種類：ぺプチド
配列 '
Ser Tyr Tyr Glu Lys His Ala Leu Tyr Arg Lys Met
1 5 10
配列番号： 3
配列の長さ ： 9
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Glu Lys His Ala Leu Tyr Arg Lys Met
1 5
配列番号： 4
配列の長さ ： 15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Glu Lys His Ala Leu Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Val 1 5 10 15 配列番号： 5
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Leu Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Val
1 5 10
配列番号： 6
配列の長さ ： 13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Leu Val Glu Leu Val Ser Tyr Tyr Glu Lys His Ala
1 5 10
配列番号： 7
配列の長さ ： 8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Tyr Arg Lvs Met Arg Leu Arg Tyr
1 5
配列番号： 8
配列の長さ ： 6
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Arg Lys Met Arg Leu Arg
1 5
配列番号： 9
配列の長さ ： 8
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modi f i ed-s i te
存在位置： 8
特徴を決定した方法： E
他の情報： Xaa は Tyrosine amideを表す。 配列
Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Xaa
1 5
配列番号： 1 0
配列の長さ ： 8
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modif ied- si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-Acetyl-L- Tyrosine を表す。
特徵を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 8
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 8の Xaa は L- Tyrosine amideを表す。
配列
Xaa Arg Lys Met Arg Leu Arg Xaa
I 5
配列番号： 1 1
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徵：
特徴を表す記号： Modif ied- site
存在位置： 1
特徵を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は Butyryl)-L-Leucine を表す。 特徵を表す記号： Modif ied-site
存在位置： 1 1
特徵を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L- Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 1 2
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徵：
特徴を表す記号： odified-site
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-Coumalyl- L-Leucineを表す < 特徴を表す記号： Modified-site
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Valine amideを表す。 配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 1 3
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modif ied- si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N- (2，3- Dihydroxybenzoyl)- L-Leucineを5 表す。
特徴を表す記号： Modif ied- si te
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 1 4
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状 一
配列の種類：ぺプチド
配列の特徵：
特徵を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-(2， 4- Dihydroxybenzoyl)-L-Leucineを 表す。
特徴を表す記号： Modif ied- site . 存在位置： 1 1
特徵を決定した方法： E ' 他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L- Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 1 5
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modified-site
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N- (2，5-Dihydroxybenzoyl)-L- Leucine 表す。
特徴を表す記号： odified-site
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa はし- Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 1 6
配列の長さ ： 11
配列の型： アミノ酸
トポロジー 直鎖状
配列の種類 ぺプチド
配列の特徴
特徵を表す記号： Modified-site
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-(3-Cyclohexylpropionyl)-L- Leucine を表す。 -、 特徴を表す記号： Modified- site
存在位置： 1 1 '
特徵を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L- Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 1 Ί
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徵：
特徵を表す記号： Modified-site
存在位置： 1
特徵を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-Cyclopentylacety卜 L- Leucine を表す 特徵を表す記号： Modified- site
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 1 8
配列の長さ ： 11
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modi f ied - si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-Propionyl_L- Leucine を表す。 特徵を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E ' 他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L- Val ine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 1 9
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徵を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-Isobutyry卜 L-Leucineを表す。 特徵を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Val ine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 2 0
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徵を表す記号： Modif ied-si te
存在位置 -. 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-(2-Ethyl-n-butyryl)-L- Leucine を 表す。
特徴を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1 1
特徵を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Val ine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 2 1
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modif ied- si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-(n- Caprylyl)- L- Leucineを表す c 特徴を表す記号： Modif ied- si te
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa はい Val ine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 2 2
配列の長さ ： 11
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N- Succinyl-L- Leucineを表す。 特徴を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Val ine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 - 5 10
配列番号： 2 3
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modif ied-site
存在位置： 1
特徵を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-(3- Cyclopentylpropionyl)-L-
Leucine を表 "5 0
特徵を表す記号： Modif ied-site
存在位置： 1 1
特徵を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Val ine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 24
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状 .
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modified-site
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N- Cyclopropylcarbonyl- L-Leucine を表す。 ,
特徴を表す記号： Modified-site
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 2 5
配列の長さ ： 11
配列の型： アミノ酸
トポロジ一 直鎖状
配列の種類 ぺプチド
配列の特徴
特徴を表す記号： Modified- site
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N- Cyclohexylacetyl- L- Leucineを表す。 、 特徴を表す記号： Modified- site * 存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L- Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 26
配列の長さ ： 11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modified-site
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-Cyclopentylcarbonyl-L-Leucine を
表す。
特徵を表す記号： Modified-site "
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は [/"Valine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 2 7
配列の長さ ： 11
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N-(n-Hexanoyl)-L- Leucineを表す。 特徴を表す記号： Modif ied-si te
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L-Val ine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
配列番号： 2 8
配列の長さ ： 11
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modif ied- si te
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N- (n- Nonanoyl)- L-Leucineを表す。 特徴を表す記号： Modif ied- si te
存在位置： 1 1
特徴を決定した方法： E
'他の情報：存在位置 1 1の Xaa は L- Val ine amideを表す。
配列
Xaa Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Xaa
1 5 10
Claims
(1) ホスホリパ一ゼ C阻害活性を有し、 かつ配列番号 1で示されるァ ミノ酸配列からなるぺプチドもしくは該ぺプチドの少なく とも 1個のァ ミノ酸残基が欠失されるか、 該ペプチドに少なく とも 1個のァミノ酸残 基が付加されるかおよび zまたは他のァミノ酸残基もしくは修飾された ァミノ酸残基で置換された変異べプチド。
(2) 変異ペプチドが、 配列番号 2〜 8で示されるアミノ酸配列からな るべプチドから選ばれる請求項 1記載の変異べプチド。
(3) 変異べプチドが、 式 W-X-Tyr-Arg-Lys- Met- Arg- Leu_Arg-Tyr - Y- Z (式中、 Wは水素原子、 置換もしくは非置換のアルカノィル基、 置換 もしくは非置換のァロイル基またはクマリル基を表し、 Xは単結合また は— L e u—を表し、 Yは単結合または一 P r 0 - V a 1一を表し、 Z はヒド πキシ基またはアミノ基を表す。 但し、 Wが水素原子のとき、 Z はァミノ基である。 ） で表されるペプチドである請求項 1'記載の変異べ プチド。
(4) 変異ペプチドが、 配列番号 9〜2 8で示されるアミン酸配列から なるぺプチドから選ばれる請求項 3記載の変異べプチド。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/146,152 US5580956A (en) | 1992-03-11 | 1993-03-11 | Phospholipase C-inhibiting peptides |
| DE69314120T DE69314120T2 (de) | 1992-03-11 | 1993-03-11 | Phospholipase c hemmendes peptid |
| EP93905633A EP0584374B1 (en) | 1992-03-11 | 1993-03-11 | Peptide which inhibits phospholipase c |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4/52394 | 1992-03-11 | ||
| JP5239492 | 1992-03-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Country Status (6)
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO1995007293A1 (fr) * | 1993-09-10 | 1995-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Peptide inhibant la phospholipase c |
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Families Citing this family (3)
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| US7713949B2 (en) | 2000-10-10 | 2010-05-11 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Compositions and methods for enhancing paracellular permeability across epithelial and endothelial barriers |
-
1993
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FEBS Lett., Vol. 242, No. 1 (1988), YASUO KAGAWA et al., "Complete cDNA encoding a putative phospholipase C from transformed human lymphocytes", pp. 31-35. * |
| J. Biol. Chem., Vol. 264, No. 36 (1989), TADAOMI TAKENAWA et al., "A second type of rat phosphoinositide-specific phospholipase C containing a src-related sequence not essential for phosphoinositide-hydrolyzing activity", pp. 21885-21890. * |
| See also references of EP0584374A4 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995007293A1 (fr) * | 1993-09-10 | 1995-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Peptide inhibant la phospholipase c |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0584374B1 (en) | 1997-09-24 |
| EP0584374A4 (en) | 1994-07-13 |
| CA2102609A1 (en) | 1993-09-12 |
| US5580956A (en) | 1996-12-03 |
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| DE69314120D1 (de) | 1997-10-30 |
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