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WO1993016193A1 - Cell adhesion inhibiting antibody and cell adhesion inhibitor containing the same - Google Patents

Cell adhesion inhibiting antibody and cell adhesion inhibitor containing the same Download PDF

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WO1993016193A1
WO1993016193A1 PCT/JP1993/000182 JP9300182W WO9316193A1 WO 1993016193 A1 WO1993016193 A1 WO 1993016193A1 JP 9300182 W JP9300182 W JP 9300182W WO 9316193 A1 WO9316193 A1 WO 9316193A1
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cell adhesion
domain
cea
monoclonal antibody
antibody
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PCT/JP1993/000182
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Jyunko Hashino
Shinzo Oikama
Hiroshi Nakazato
Toshihiro Nakanishi
Original Assignee
Suntory Limited
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody against a peptide that imparts an adhering activity to human cancer cells by being expressed on the cell surface, and to a cell adhesion inhibitor utilizing the same.
  • CEA-related antigen is a general term for a group of antigens that are very similar to CEA both proteinaceously and immunologically.
  • a typical CEA-related antigen is found in the lungs and spleen of normal humans.
  • a non-specific cross-reactive antigen von Kleist, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2492, 1972.
  • NCA NCA-2
  • CEA (Oikawa, S. et al., BBRC, 142,511, 1987. and Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-177774)
  • CA Tawaragi, ⁇ . Et al.
  • B. B. R. C. 150, 89, 1988.
  • BGPI Hexoda, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 6959, 1988.
  • W272 The primary structure of the peptide of CGM6) (Arakawa, F. et al., BBR, 166, 1063, 1990.) has been elucidated.
  • the CEA peptide is composed of 668 amino acids, as shown in Fig. 3 of JP-A-63-177779, for example. It has been.
  • the CEA peptides have Byone mains N (1-108) from the N-terminal to the 108th amino acid, which are very close to each other.
  • Domain I (109-2886) consisting of 178 amino acids each having a repeating structure with high homology to domain II (2 8 7-4 6 4), domain ⁇ (465-6 4 2) and domain M (6 4 3-) consisting mainly of hydrophobic amino acids of 26 C-terminals 6 6)).
  • domains I, II, and III are found in subdomains (sometimes called domains) consisting of 92 and 86 amino acid residues, respectively.
  • the subdomains are sometimes called 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, and 3B.
  • NCA contains amino acid 108 N and amino acid 17
  • domain I There are eight domains I. However, the domain corresponding to domains II and ⁇ of CEA is missing, and domain M consisting of 24 predominantly hydrophobic amino acids follows domain I. .
  • the structure of domain I of NCA is less than 90% homologous to domain I of CEA at the amino acid level, and the positions of the four cysteine residues are exactly the same.
  • BGPI is a CEA-related antigen found in bile (Svenberg, T. et al., Int. J. Cancer, 17, 588, 1976.). After domain I, it has a domain A 'specific for BGPI, a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain.
  • W272 is an isolated CEA-related antigen isolated from human leukocytes (granulocytes), and its domain structure is similar to NCA.
  • CEA and NCA have cell adhesion activity (Oikawa, S. et al., BBR C. , 164, 39, 1989 .; Benchimol, S. et al., Cell, 57, 327, 1989.). In other words, it turned out that cells expressing CEA and NCA on the cell surface, respectively, and that cells expressing CEA and cells expressing NCA strongly adhere to each other. .
  • a monoclonal antibody against the whole CEA molecule contains many antibodies that use peptides other than the domain (domain) responsible for the cell adhesion activity of CEA.
  • a monoclonal antibody that inhibits the cell adhesion activity of CEA it was necessary to identify the region responsible for the cell adhesion activity of CEA and its minimum peptide unit.
  • the present inventors when the site involved in cell adhesion on the CEA molecule is known, synthesize a peptide corresponding to the amino acid sequence in that region, and obtained an antibody that inhibits cell adhesion, It has been discovered that it is possible to produce a large amount of antibodies that inhibit cell adhesion using Escherichia coli and animal cells using known techniques.
  • anti-CEA cell adhesion monoclonal antibody prepared using the above-mentioned peptide may be an active ingredient of a cell adhesion inhibitor such as a cancer metastasis inhibitor. did.
  • the present inventors used molecular biology techniques to remove CEA-deleted antigens, chimeric antigens with NCA, and CEA-related antigens such as BGPI and W2. By establishing cell lines expressing 72 and examining the cell adhesion activity of various combinations, intensive research was conducted to identify the adhesion domain.
  • a homologous peptide sequence means that amino acid substitution, deletion, addition, etc. are part of the sequence and are not the same as the original peptide sequence, but most of them are Have the same sequence and yet have almost the same function as the original peptide.
  • FIG. 1 is a drawing showing the adhesion activity of the monoclonal antibody of the present invention to CEA.
  • FIG. 2 is a drawing showing the inhibition rate of the monoclonal antibody of the present invention against CEA.
  • Peptides used as antigens for preparing the cell adhesion activity-inhibiting antibody of the present invention include, for example, a nucleotide sequence encoding the N-domain peptide sequence from CEA expression vector and A nucleotide sequence encoding a part or the whole of a domain is excised, ligated, and then incorporated into an appropriate expression vector and expressed in an appropriate cell. It is good.
  • the CEA expression vector is first digested with appropriate restriction enzymes to remove the DNA fragments encoding the CEA I and II domains, or the CEA expression vector is appropriately restricted. After digestion with enzymes to separate each domain into a coding gene, a DNA fragment coding for the N domain and a DNA fragment coding for part or all of domain ⁇ Is ligated using ligase.
  • the obtained gene is incorporated into a plasmid that can be expressed in a host cell according to a conventional method, and the host cell (Escherichia coli, yeast, animal cells) is transformed, and the host cell may be cultured.
  • the host cell Esscherichia coli, yeast, animal cells
  • the peptide sequences of N domain and domain III of CEA are both known, the synthesis method is used in place of the above method. Then, the peptide of the present invention or a peptide having homology with the peptide of the present invention may be prepared.
  • an antigen-based antibody can be produced in a conventional manner. After immunizing a mammal with the peptide, the spleen is removed to obtain spleen cells, which are fused with passage cells, and the fused cells are screened by an appropriate method to obtain the desired antibody. The expressing fused cells may be isolated and cultured in an appropriate medium.
  • the above screening can be performed, for example, by conducting selective culture in a HAT medium and then confirming the reaction of the culture supernatant with an antigen by EIA or the like. It is performed by combining the steps that react with the deleted antigen.
  • a brassmid capable of expressing CEA in animal cells is prepared according to a conventional method, the brassmid is introduced into CHO (Chinese hamster ovary) cells, and a cell line that expresses CEA antigen on the cell surface is established. . Then, the cell adhesion activity of the CEA-expressing cell line is examined in the presence of the monoclonal antibody, and the result may be compared with the result in the absence of the monoclonal antibody.
  • Cell adhesion activity can be measured by a known and appropriate method.
  • a cell line in a 24-well plate is grown, and the cell line is labeled with a fluorescent substance or radioactivity. After incubating for a certain period of time, wash the cells several times with a buffer to remove non-adherent cells, and then release the adhering cells with, for example, triscin.
  • the present invention obtained by dissolving with a surfactant such as 1% NP-40 and measuring the intensity of fluorescence and radioactivity using an appropriate measuring instrument is obtained as described above.
  • Monoclonal antibodies inhibit the cell adhesion activity of CEA, which is thought to be involved in metastasis of colorectal cancer, and drugs containing this monoclonal antibody are used in conjunction with cell adhesion inhibitors such as cancer metastasis inhibitors.
  • the use of these antibodies will solve the problems of antigenicity due to continuous administration and the problem of half-life in the body.
  • Such mouse-human chimera antibodies and humanized antibodies are naturally included in the present invention.
  • variable regions of the mouse H-chain and L-chain which have cell adhesion-inhibiting activity, are linked to the human constant region, and incorporated into an appropriate expression vector. Well, it can be mass-produced with animal cells.
  • CDR1, 2 and 3 hypervariable regions (CDR1, 2 and 3), which are antigen-binding sites, of the mouse H and L chain variable regions are transplanted into the human antibody. Thereafter, the treatment may be performed in the same manner as in the case of the chimeric antibody, and mass production can be similarly performed.
  • the production of the cell adhesion inhibitor of the present invention can be carried out by formulating an appropriate amount of a monoclonal antibody as required by a conventional method.
  • parenteral administration using injections, infusion additives, suppositories, etc. is preferred, but in some cases, tablets, powders, granules, capsules, syrups
  • Oral administration using a drug or the like can also be employed, and a known liquid or solid diluent or carrier can be used in the preparation of each preparation.
  • the antibody of the present invention is dissolved in physiological saline for injection, and further, conventional salts and excipients such as sodium chloride so as to be isotonic with physiological osmotic pressure. , Mannitol, aminoacetic acid and the like may be added and prepared.
  • an injection preparation prepared by dissolving 20 mg of the antibody of the present invention in 1 ml of distilled water for injection and isotonic with the salt or the like is mentioned.
  • the amount of the monoclonal antibody of the present invention used in the cell adhesion inhibitor is particularly The antibody is not so limited, but its toxicity is low and its safety is high. For parenteral administration, it is generally sufficient to use about 1 to 100 mg.
  • the CEA deletion antigen N-III expression vector was prepared as follows.
  • CEA has 1 to 108 amino acid sequences of CEA as the N domain, and 465 to 642 amino acid sequence of CEA as the III domain. Had.
  • CHO cells transfected with pdKCR-dhfr-CEAN-III were treated with PI-PLC in the same manner as described below to obtain CEAN-III as an antigen.
  • the 1 .7 5 x 1 0 e number of CHON- III cells were treated with 0.1 25% Bok Li busi down and 0 .0 1% EDTA-containing PBS, and flotation. These cells are suspended in 5 ml of PBS, and the final concentration is 0.2 units / ml of PI.
  • PLC Frakoshi Co., Ltd., Tokyo
  • CHOZN-II cells transfected with CEAN-II expression vector or a soluble N-III fraction prepared from the cells are suspended in complete Freund's adjuvant.
  • Mice BALB / c
  • mice are injected intraperitoneally three times every 7 to 10 days to immunize the mice.
  • the spleen of the mouse was removed, and the cells (splenocytes) were fused with mouse mouse spleen cells using polyethylene glycol, and HAT medium (10% serum) was used in a conventional manner.
  • Selective culture of fused cells hyperridoma) using RPMI 1640 supplemented with hypoxanthine, aminobuterin and thymidine). Thereafter, primary screening was performed on the culture supernatant from the reaction on the purified CEA by the ELISA method.
  • Antibodies produced by monocloned hybridomas that have been subjected to subcloning by the limiting dilution method and that have been determined to be positive in the first screening are further subjected to subcloning.
  • the subclass of (MoAb) was identified using a commercially available mouse globulin identification kit, and as described above, seven hybridoma macrones C249 that produce antibodies having cell adhesion inhibitory activity as described above. , E55, F287, F361G125, G213 and G292. In the present specification, the same symbols are used to indicate the hybridomas and the monoclonal antibodies produced by the hybridomas.
  • hybridoma G125 producing a representative antibody was submitted to the Institute of Microbial Industry and Technology by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on February 14, 1992. No. 3750
  • Example 1 The hybridoma obtained in Example 1 was inoculated intraperitoneally into BALB / c mice, and ascites was collected. After centrifuging and clarifying the obtained 20 ml of ascites fluid, 35 ml of protein A—Sepharose CL 4
  • Groups are divided by the type of antibody that they recognize. That is, group 1 groups domain N (CEA-specific) and group Group 2 recognizes domain N (common to NCA), and group 3 recognizes domain ⁇ as an individual.
  • Example 2 Each monoclonal antibody obtained in Example 2 was incubated with papine-conjugated beads (commercially available) for 8 hours at 22 ° C. for extinction. After collecting the supernatant, the supernatant was passed through a protein A-Sepharose C ⁇ 4B column, and the passed fraction was obtained as a Fab fraction.
  • the measurement of the cell adhesion inhibitory activity was carried out according to a known technique, the cell adhesion assay (Oikawa, S. et al., BBR, 164, 39, 1989.). That is, CH 0 cell line (CH 0 no CEA) expressing 1 ⁇ 107 CEAs is fluorescently labeled with PKH 2 (manufactured by Zina Natisis), and then suspended in a 3 ml medium. Its Cormorant Chino O. Lml 2 4 In addition to unlabeled CH 0 Bruno CEA cell line a single layer (monolayer) growth to play Bok hole, 5% C 0 2 in Lee Nkyubeta, 3 7 3 0 min Lee The document was uploaded.
  • CH 0 cell line CH 0 no CEA
  • PKH 2 manufactured by Zina Natisis
  • Adhesion inhibition rate (%) 0 0
  • Fig. 2 One example of this result is shown in Fig. 2.
  • the antibody recognizing domain N showed relatively stronger inhibitory activity than the antibody recognizing domain ⁇ .
  • G125 group 2 had a strong activity of 100%.
  • C249, E55 and F287 group 1 showed moderate inhibition of 51.8 to 82.1%.
  • Antibody 4 dose Number of metastases formed [percentage] Number of carotid nodules
  • the monoclonal antibody of the present invention when administered, the antibody inhibits the adhesion of cancer cells, As a result, cancer cells can be prevented from metastasizing to other organs, and thus are effective as cell adhesion inhibitors such as cancer metastasis inhibitors.

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Description

明 細 書 細胞接着阻害抗体およびこれを利用する細胞接着阻害剤 技 術 分 野
本発明は、 細胞表面に発現されるこ と によ り 、 ヒ 卜 の癌細胞に接 着活性を付与するぺプチ ド に対するモ ノ クロ一ナル抗体およびこれ を利用する細胞接着阻害剤に関する。
¾ f¾ 術
癌胎児性抗原 ( carcinoembryonicantigen;WT 「 C E A j と略す は 1 9 6 5年、 ゴール ド （ Gold) とフ リ ー ドマン （ Freedman) によ り 、 ヒ ト結腸癌と 2〜 6ヶ月齢胎児消化器に共通に存在する抗原と して発見された分子量 1 8〜 2 0万の糖蛋白質（Gold,P&Freedman, S.O. J. Exp. Med. , 121, 439, 1965. ) で、 現在では、 癌の臨床にお けるその有用性が広 く 認め られ、 最も よ く 用 い られて いる腫瘍マー 力一である。
—方、 その後の研究によ り 、 ヒ ト正常組織にも C E Aと よ く 似た 物質、 すなわち C E A関連抗原が存在する こ とが明らかになった。 この C E A関連抗原 と は蛋白化学的にも免疫学的にも C E Aに極 めて類似 した抗原群の総称であ り 、 代表的な C E A関連抗原 と して は、 正常人の肺や脾臓中に見出された分子量約 9万の糖蛋白質であ る非特異的交差抗原（ von Kleist, S.ら、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 69， 2492 , 1972.) ( nonspecific cross-reactive antigen ； 以下、 「 N C A」 と略称する ） や、 胎児の便中に見出された N C A - 2 (Burtin, P.ら 、 J. Immunol. , 111 , 1926 , 1973·)、 正常成人 の便中に発見さ れた N F A ( normal fecal antigen) ( Kuroki.M. ら 、 Cancer Res . 41， 713 , 1981. ) な どが知 られてい る。
しか しながら 、 これ らの詳細な分子構造やその違いなどは、 現在 の所不明な点が多い。 近年、 日本人の食生活の変化に伴な い、 大腸癌患者が増加 して い るが、 大腸癌はその約 8 0 %が肝臓に転移 し、 ま た肺等の他の臓器 にも転移する と言われて いる。 更に最近、 大腸癌の肝転移に C E Aの細胞接着活性が関与する可能性が報告されて いる （ Jessup，J. M.ら ， Cancer and Metastasis Reviews , 8 , 263,1989 ) 0
最近、 分子生物学的な手法を用 いて 、 C E A ( Oikawa, S.ら 、 B. B.R.C. , 142,511, 1987.および特開昭 6 3 — 1 7 7 7 9 4号）、 Ν C A (Tawaragi , Υ.ら、 B · B . R . C .， 150， 89 , 1988. )、 B G P I (Hinoda, Y.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA.，85， 6959 , 1988. )、 W 2 7 2 (CGM6) ( Arakawa, F.ら 、 B.B.R. ， 166, 1063 , 1990.)のべプチ ドの一次構造が明 らか にされた。
c D N Aか らの解析結果では、 C E Aペプチ ドは、 例えば、 特開 昭 6 3 — 1 7 7 7 9 4号の図 3 に示すよ う に 6 6 8個のア ミ ノ酸に よ り構成されて いる。
そ して 、 この図から明 らかなよ う に 、 C E Aペプチ ドは、 N端か ら 1 0 8番目のア ミ ノ 酸までの卞メ イ ン N ( 1 - 1 0 8 ) 、 お互い に非常に相同性の高い 、 繰 り返 し構造をも ったそれぞれ 1 7 8個の ア ミ ノ酸よ り なる ド メ イ ン I ( 1 0 9 — 2 8 6 ) 、 ド メ イ ン II ( 2 8 7 - 4 6 4 ) 、 ドメ イ ン ΠΙ ( 4 6 5 - 6 4 2 ) と C端 2 6個の主 と して疎水性ア ミ ノ酸よ り なる ドメ イ ン M ( 6 4 3 - 6 6 8 ) の 5 つの ド メ イ ンに分けら れる。 さ ら に ド メ イ ン I 、 II 、 IIIは、 それ ぞれ 9 2個と 8 6個のア ミ ノ酸残基よ り なるサブ ドメ イ ン （ ド メ イ ン という こ と も ある ） に分けられるこ とがあ り 、 それぞれのサブ ド メ イ ンを 1 A、 1 B、 2 A、 2 B、 3 A、 3 B と いう こ と も ある。 これ ら各 ドメ イ ンお よびこれから構成される C E Aペプチ ド は、 模式的に特願平 3 — 2 2 2 3 7 9号の図 1の 1番目 に示されて いる ドメ イ ン Mは当初、 細胞膜にアンカ一 して いる と考え られたが、 現在では翻訳後、 プロ セシ ングされ、 代わ り に P I — G ( phospha- tidylinositol glycan) が付加 して、 細胞膜にアンカ一 して いる こ とが判明 して いる（Hefta，S.A.ら、 Proc.Natl. Acad. Sci . USA. , 85， 4648 , 1988.； Takami , N.ら、 J. Biol . Cheni. , 263 , 12716， 1988. )
1 2個存在するシス ティ ン残基は ド メ イ ン I 、 Π、 IIIに各 4個ず つ存在 し、 各 ド メ イ ン内でのその位置は完全に同一部位にあ り 、 1 番目 と 2番目の システィ ンの間に 4 7個、 3番目 と 4番目のシステ イ ンの間に 3 9個のア ミ ノ酸よ り なる 2つのループが形成され、 C E A全体では 6つのループを保持した形になって いる ものと思われ る。
—方、 N C Aにはア ミ ノ酸 1 0 8個の ドメ イ ン Nと アミ ノ酸 1 7
8個の ド メ イ ン I が存在する。 しか し、 C E Aの ド メ イ ン II と ΠΙ に相当する部分が欠如 し、 ドメ イ ン I に続き 2 4個の主と して疎水 性アミ ノ 酸よ り なる ド メ イ ン Mが存在する。 N C Aの ド メ イ ン I の構造は C E Aの ドメ イ ン I とア ミ ノ 酸レベルで 9 0 %弱の相同性 を示し、 4個含まれる システィ ン残基の位置も全 く 同 じである。 B G P I は胆汁中に見出された C E A関連抗原（ Svenberg,T.ら、 Int. J. Cancer , 17, 588, 1976. )で、 c D N Aの解析よ り 、 ドメ イ ン ^^、 ド メ イ ン I の後に B G P I に特異的な ドメ イ ン A'、 細胞膜 貫通 ド メ イ ン 、 細胞質 ド メ イ ンを有する。
W 2 7 2は、 ヒ ト 白血球 （顆粒球） よ り 、 単離された C E A関連 抗原でその ド メ イ ン構造は N C Aと類似して いる。
C E Aフ ア ミ リ ーの生物学的活性は依然と して不明であつたが、 最近、 C E A、 N C Aが細胞接着活性を有する こ とが明らかにされ た（ 0ikawa,S.ら 、 B.B.R. C . , 164， 39 , 1989.； Benchimol , S.ら、 Cell, 57 , 327, 1989· )。 つま り 、 C E A、 N C Aをそれぞれ細胞 表面に発現 して いる細胞同志、 及び C E Aを発現して いる細胞と N C Aを発現 して いる細胞は強 く 接着するよ う になるこ とが判明 した のである。
しか しながら 、 細胞接着活性が C E A、 N C Aのどの領域に存在 するのかは解明されてお らず、 C E Aの細胞接着活性を阻害するモ ノ ク ロ一ナル抗 C E A抗体を効率よ く 調製 しょ う とす る場合の隘路 となって いた。
すなわち、 C E A分子全体に対する モ ノ ク ローナル抗体では、 C E Aの細胞接着活性を担う領域 （ ドメ イ ン） 以外のペプチ ド をェ ピ 卜 一プと する抗体が多 く 含ま れて しま うので、 C E Aの細胞接着活 性を阻害するモ ノ ク ロ ーナル抗体を効率的に製造するためには C E Aの細胞接着活性を担う領域及びその最小ペプチ ド単位を同定する こ とが必要であった。
発 明 の 開 示
本発明者らは、 C E A分子上の細胞接着に関与する部位が判明す れば、 その領域のア ミ ノ酸配列に相当するペプチ ドを合成 し、 細胞 接着を阻害する抗体を得た り 、 公知の技術を用い、 大腸菌や、 動物 細胞を用 いて細胞接着を阻害する抗体を大量に生産す るこ と も可能 である との知見に達した。
また、 上記ぺプチ ド を用いて調製さ れる抗 C E A細胞接着モ ノ ク 口 一ナル抗体は、 例えば、 癌転移阻害剤等の細胞接着阻害剤の有効 成分とな し う る との知見に達した。
本発明者 らは、 これ らの知見に基づ き、 分子生物学的手法を用 い て、 C E Aの欠失抗原、 N C Aとのキ メ ラ抗原、 及び C E A関連抗 原である B G P I 、 W 2 7 2 を発現する細胞株を樹立 し、 種々の組 み合せの細胞接着活性を調べる こ と に よ り 、 接着 ド メ イ ンを同定 し よ う と鋭意研究を行っ た。
そ してその結果、 少な く と も ヒ 卜の癌胎児性抗原糖蛋白質におけ る N ド メ イ ンのペプチ ド配列お よび ド メ イ ン ΠΙの一部または全部の ぺプチ ド配列も し く はこれと相同性を有する配列を有するぺプチ ド が細胞接着活性に関与するものであ り 、 当該ぺブチ ド を抗原 と して 用いれば細胞接着活性阻害抗体が得ら れる こ と を見出 し、 本発明を 完成 した。 本明細書中において 、 相同性を有するペプチ ド配列 とは、 配列の 一部にア ミ ノ酸の置換、 欠失、 付加等があ り 、 元のペプチ ド配列と 同一ではないが、 大部分の配列は同 じであ り 、 しかも元のペプチ ド と ほと ん ど同一の機能を有する ものを いう 。
図 面 の 簡 単 な 説 明
第 1 図は、 本発明のモ ノ ク ロ ーナル抗体の C E Aに対する接着活 性を示す図面である。
第.2図は、 本発明のモ ノ ク ロ 一ナル抗体の C E Aに対する接着阻 害率を示す図面である 。
発明を実施するための最良の態様
本発明の細胞接着活性阻害抗体を調製するために、 抗原と して用 いるペプチ ドは、 例えば、 C E A発現べク夕一から N ドメ イ ンのぺ プチ ド配列をコ一 ドする塩基配列および ドメ ィ ン ΙΠの一部ま たは全 部のぺプチ ド を コ一 ド する塩基配列を切出 し、 これを結合 した後、 更に適当な発現ベクタ ーに組み込み、 適当な細胞中で発現させれば 良い。
具体的には、 まず C E A発現べクタ一を適当な制限酵素で消化し、 C E Aの I および II ド メ イ ンをコー ド する D N A断片を除去するか、 C E A発現べク 夕一を適当な制限酵素で消化 して各 ド メ イ ンをコ一 ドする遺伝子に分離した後、 N ド メ イ ンをコー ドする D N A断片と ドメ イ ン ΠΙの一部または全部をコ一 ド する D N A断片 とを リ ガーゼ を用いて結合する。
次いで、 得られた遺伝子を常法に従い、 宿主細胞で発現する こ と のできるプラス ミ ド に組み込み、 宿主細胞 （大腸菌、 酵母、 動物細 胞） を形質転換 し、 こ れを培養すれば良い。
また、 C E Aの N ド メ イ ンおよび ド メ イ ン IIIのペプチ ド配列 （ ま たは ド メ イ ン 3 Aおよび 3 B ) はいずれも知 られているので、 上記 の方法に換えて合成法で本発明のぺプチ ドまたはこれ と相同性を有 ， するぺプチ ド を作製 しても良い。 得られた細胞接着活性を担うペプチ ド （以下、 抗原ペプチ ド 」 と い う こ とがある ） を用 いて、 本発明のモ ノ ク ローナル抗体を製造す る には、 常法に したがって抗原べプチ ドで哺乳動物を免疫 した後、 脾臓を摘出 して脾細胞を得、 これを継代細胞と融合さ せ、 その融合 細胞を適当な方法でス ク リ ーニ ング し 、 目的の抗体を発現 して いる 融合細胞を単離 し、 適当な培地中で培養すれば良い。
上記ス ク リ ーニングは、 例えば、 H A T培地での選択培養後、 そ の培養上清につ いて E I A法等で抗原 との反応を確認する こ と によ り 、 更に必要な ら ドメ イ ン III欠失抗原 との反応する工程を組み合わ せる こ と によ り 行なわれる。
得られたモ ノ ク ロナ一ル抗体が細胞接着を阻害するかどう かの確 認は、 例えば次に示す よ う なモデル実験によって確認する こ とがで き る。 すなわち 、 常法に従い C E Aを動物細胞で発現できるブラ ス ミ ド を作製 し、 そのブラス ミ ド を C H O (Chinese hamster ovary )細胞に導入 し、 細胞表面に C E A抗原を発現する細胞株を樹立す る。 ついで、 モ ノ ク ロ ーナル抗体の存在下において C E A発現細 胞株の細胞接着活性を調べ、 この結果をモ ノ ク ロ一ナル抗体非存在 の結果と比較すればよ い。
細胞接着活性は公知の適当な方法で測定する こ とができるが、 例 えば、 2 4穴のプレー ト にある細胞株を生育させてお き、 これに蛍 光物質や放射能で標識 した別の細胞株を加え、 一定時間イ ンキュべ — 卜 したのち、 数回、 バッ フ ァ一で洗って接着 しない細胞を除き、 しかるのち、 接着 した細胞を例えば ト リブシ ンで遊離させるかある いは 1 % N P— 4 0のよ うな界面活性剤で溶解し、 適応 した測定 機器を用 いて蛍光や放射能の強度を測定する こ と によ り行なわれる 以上のよ う に して得 られる本発明のモノ ク ローナル抗体は、 大腸 癌の転移に関与する と される C E Aの細胞接着活性を阻害 し、 本モ ノ ク ロ一ナル抗体を含有する医薬は癌転移阻害剤等の細胞接着阻害 剤と して利用する こ とができる。 また、 本発明マウス モノ ク ローナル抗体から、 公知の技術によ り マウス — ヒ ト キメ ラ抗体およびヒ ト化抗体を作製する こ とが可能と なる ( ature 312 , 643- 646 ( 1984 ) および Nature 332 , 323-327 ( 1988 ) 参照） 。 これ らの抗体の利用に よ り 、 連続投与による抗原 性の問題、 体内半減期の問題な どが解決されるであろ う 。 このよ う なマウス ー ヒ ト キメ ラ抗体およびヒ 卜化抗体も当然本発明に含ま れる。
具体的に、 キメ ラ抗体を作製する場合は、 細胞接着阻害活性を有 するマウスの H鎖、 L鎖の可変領域と ヒ トの定常領域を連結 し、 適 当な発現べクタ一 に組み込めばよ く 、 動物細胞で大量生産できる。 ま た、 ヒ ト化抗体を作製する場合は、 マウスの H鎖、 L鎖可変領 域のう ち 、 抗原結合部位である超可変領域 （ C D R 1 、 2および 3 ) のみを ヒ ト抗体に移植 し、 以下、 キメ ラ抗体の場合と 同様に処理す ればよ く 、 同様に大量生産が可能となる。
本発明の細胞接着阻害剤の製造は、 必要に応 じた適当量のモ ノ ク 口 一ナル抗体を常法に よ り製剤化する こ と によ り おこ なう こ とがで きる。
細胞接着阻害剤の投与絰路と しては、 注射剤、 点滴添加剤、 坐剤 等を用いる非経口投与が好ま しいが、 場合によっては、 錠剤、 散剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 シロ ップ剤等用 いる経口投与を採用する こ と もでき、 各製剤の調製に当っては、 公知の液体も し く は固体の希釈 剤または担体を使用するこ とができる 。 例えば、 注射用製剤を調 製する場合、 本発明抗体を注射用生理食塩水に溶解し 、 更に生理的 浸透圧と等張になるよ う に慣用の塩類および賦形剤、 例えば塩化ナ ト リ ウム、 マンニ トール、 ァ ミ ノ酢酸などを添加、 調製すればよい。 よ り具体的な製剤の例と しては、 注射用蒸留水 l m l に本発明抗 体 2 0 m gを溶解し、 前記塩類等で等張と した注射用製剤が挙げら れる。
細胞接着阻害剤にお ける本発明モ ノ クローナル抗体の使用量は特 に限定さ れる ものではないが、 当該抗体の毒性も低 く 、 安全性も高 いので、 非経口投与の場合、 一般には l 〜 1 0 0 0 m g程度使用す れば良い。
以下、 本発明を参考例および実施例をもってさ ら に詳 し く 説明す る。
参 考 例 1
N _ III発現べク タ一の作製および抗原 （ C E A N— III ) の 発現.：
C E A欠失抗原 N— III発現べクタ一 は以下の通り作製 した。 C E A発現べク タ一 p d K C R - d h f r C E A ( Oika a, S. ら
B.B.R. C . , 164， 39， 1989.)を P s t I (宝）消化する こ と に よ り 得 られる 6 1 2 2 b p と 2 2 9 3 b pのフラグメ ン ト を T 4 D N A リ ガ一ゼを用 いて結合させ、 N— III発現べクタ一 p d K C R - d h f r - C E A N — II【を作製 した。
発現べク夕一の細胞への導入、 発現細胞の樹立は全て公知の技術 ( Oikawa, S.ら 、 B.B.R.C., 164, 39, 1989.)で行い、 C E A N - IIIを抗原 と して得た。
このものは、 N ドメ イ ン と して C E Aの 1 〜 1 0 8 のア ミ ノ酸配 列と、 III ド メ イ ン と して C E Aの 4 6 5〜 6 4 2のア ミ ノ酸配列を 有 して いた。
参 考 例 2
可溶 C E A N— III画分の作製 ：
p d K C R - d h f r - C E A N— IIIを導入 した C H O細胞を 下記と同様に して P I — P L C処理し 、 C E A N— IIIを抗原 と し て得た。
( P I 一 P L C処理）
1 .7 5 x 1 0 e個の C H O N— III細胞を 0 .1 2 5 % 卜 リ ブシ ン と 0 .0 1 % E D T A含有 P B Sで処理し、 浮遊化 した。 こ れら の細胞を 5 m l の P B S に懸濁 し、 最終瀵度 0 .2単位/ m lの P I 一 P L C ( フナコ シ株式会社、 東京） を加えて、 3 7 °Cで 2時間反 応させる こ と によ りお こなった。
実 施 例 1
ハイプリ ドーマの作製 ：
ハイブ リ ド一マの作製は、 ミ ルシユ タイ ン らの方法 （ Nature，
256, 495 , ( 1975 )) に従って行なう 。 すなわち、 C E A N— ΙΠ発 現ベクターを導入 した C H OZ N— ΠΙ細胞も し く は同細胞よ り調製 された可溶 N— III画分をフ ロ イ ン ドの完全アジュバン ト中に懸濁 し マウス （ BALB/c) の腹腔内 7〜 1 0 日毎に 3回注射し 、 マウス を免 疫する。 最終免疫の 3 日後にマウスの脾臓を取り 出 し、 その細胞 (脾細胞） とマウス ミ エ口一マ細胞とポ リ エチレング リ コールを用 いて融合させ、 常法に従い H A T培地 （ 1 0 %血清加 R P M I 1 6 40培地にヒポキサンチン、 ア ミ ノ ブテ リ ンおよびチ ミ ジ ンを加 えたもの） によ る融合細胞 （ハイプリ ドーマ） の選択的培養を行な う 。 その後、 培養上清について E L I S A法によ り 精製 C E Aに 対する反応から第 1次スク リ ーニングを行なった。
第 1次ス ク リ ーニングで陽性と判定されたハイプリ ドーマを、 更 に限界希釈法によるサブク ローニングに付し、 モ ノ ク ローン と した モ ノ ク ロ一ン化されたハイブリ ドーマの産生する抗体 （MoAb) のサ ブクラスは、 市販のマウスグロブリ ン同定キヅ ト を用 いて同定した , 上記のよう に して細胞接着阻害活性を有する抗体を産生する 7個 のハイブ リ ドーマクロ ーン C 2 4 9、 E 5 5 、 F 2 8 7、 F 3 6 1 G 1 2 5 、 G 2 1 3お よび G 2 9 2を得た。 なお、 本明細書中に おいては、 ハイ ブリ ド ーマおよびそのハイブ リ ドーマ によって生産 されたモ ノ ク ロ ーナル抗体の表示を同 じ記号によって行なう 。
上記 7個のハイブリ ドーマク ローンのうち、 代表的な抗体を産生 するハイ ブリ ドーマ G 1 2 5 については、 平成 4年 2月 1 4 日付け で工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研条寄第 3 7 5 0号
( FERM BP- 3750 ) と して寄託した。 実 施 例 2
モ ノ ク ロ ーナル抗体の調製 ：
実施例 1 で得 られたハイ プ リ ドーマを B A L B / c マウスの腹腔 内に接種 し、 腹水を回収 した。 得られた腹水 2 0 m l を遠心分離 して清澄化 した後、 3 5 m l のプロテイ ン A —セフ ァ ロ一ス C L 4
B カラム （ フ アルマシ ァ L K B社製） に通し、 このカラム を 3 M 塩化ナ 卜 リ ウム を含有する 1 . 5 M グ リ シン緩衝液 （ p H 8 .9 ) で洗浄 した後、 力ラム に吸着 したモ ノ クローナル抗体を 0 . 1 M ク ェン酸緩衝液 ( P H 4 .0 ) に よ り溶出 した。
10 このよ に して得ら れた 7種類のモ ノ ク ロ ーナル抗体 C 2 4 9 、 E 5 5 、 F 1 6 5 、 F 2 8 7 、 F 3 6 1 、 G 1 2 5 、 G 2 1 3 およ び G 2 9 2 はそれぞれ下表に示すィ ム ノ グロブリ ンサブクラ ス に属 するものであつ た。
第 1 表
丄 ij
グループ * ク ロ一ン ク ラ ス
C 2 4 9 I S G 1 ( κ )
1 E 5 5 I g G 2a ( A: )
20 F 2 8 7 I S G 1 ( K )
2 G 1 2 5 I S G 1 ( K )
F 3 6 1 I S G l { K )
25 3 G 2 1 3 I g G 1 ( K )
2 9 2 I S G 1 ( K )
G
* グループは、 抗体が認識するェ ピ ト 一プによっ て分けら れる すなわち 、 グループ 1 は ドメ イ ン N ( C E A特異的） を、 グル一 プ 2は ド メ イ ン N ( N C A共通） を、 グループ 3は ド メ イ ン ΠΙをそ れぞれェ ピ 卜一プと して認識するものである。
実 施 例 3
F ab画分の調製 ：
実施例 2 によって得 られる各モ ノ ク ローナル抗体をパパイ ン結合 ビーズ （市販品） と共に、 2 2 °Cにて 8時間イ ンキュベー ト して消 化をおこなった。 この上清を回収後、 プロテイ ン A—セファ ロ一 ス C丄 4 Bカラム に通 し、 素通 し画分を F ab画分と して得た。
実 施 例 4
細胞接着阻害活性の測定 ：
細胞接着阻害活性の測定は公知の技術である細胞接着アツセィ法 ( 0ikawa，S.ら、 B.B.R. ， 164， 39 , 1989. ) に準じて行った。 す なわち、 1 X 1 07個の C E Aを発現する C H 0細胞株 （ C H 0ノ C E A ) を P K H 2 (ザィ ナチシス社製） にて蛍光標識した後、 3 m lの培地に縣濁させる。 そのう ちの O . l m l を 2 4穴のプレー 卜 に単層 （monolayer) 生育している非標識 C H 0ノ C E A細胞株 に加え、 5 % C 02イ ンキュベータ中、 3 7 で 3 0分間イ ンキュ ペー ト した。 P B Sで 2回洗ったのち、 接着 した細胞を 0 .1 % ト リ ブシン にて遊離させ、 蛍光強度を蛍光強度測定機で測定する。 標識 C H OZ C E A細胞の C E A非発現 C H O細胞に対する接着を ブラ ンク と した。
実 施 例 5
モ ノ ク ロ 一ナル抗体による C E Aの細胞接着の阻害 ： 各抗体よ り調製した F ab画分を用い、 細胞接着アツセィ法 （ 3 7 °C、 3 0分） を行なった。 すなわち、 2 7 g m 1の F ab画分 存在下で、 どの程度 C E Aのホモ接着活性が阻害されるかを調べ た。 なお、 ノ ー ン （ N o n e ) は抗体非存在下での細胞接着活性 を示す。 この結果を図 1 に示す。 図 1 よ り 下式に従い接着阻害率 を算出 した。 A 2 A 1
接着阻害率 （ ％ ) = 0 0
A 2 - B
A 1： F ab画分存在下での C E Aホモ接着活性
A 2： F ab画分非存在下での C E Aホモ接着活性
B ： ブラ ン クの接着活性
この結果の 1 例を図 2 に示すが、 図 2の結果から明 らかなよ う に 各抗体 （ F ab画分） に よる接着阻害活性にはェピ トーブの違い によ る差が認め られた。 すなわち 、 ド メ イ ン N認識の抗体は ド メ イ ン ΠΙ認識の抗体に比べ、 比較的強い阻害活性を示 した。 特に G 1 2 5 (グループ 2 ) は 1 0 0 %の強い活性を有 して いた 。 また 、 C 2 4 9 、 E 5 5 および F 2 8 7 ( グループ 1 ) は 5 1 .8〜 8 2 .1 %の中程度の阻害を示 した。
実 施 例 6
モ ノ ク ロ ーナル抗体によ る肝転移の阻害 ：
2 X 1 Ο β個の C H O / C E A細胞を 5 0 gのモ ノ ク ローナル 抗体 （ F a b画分） の存在下で、 4 °Cにて 1 時間イ ンキュベー ト し た。 ヌ ー ドマウス を麻酔下で開腹し、 脾臓内 に上記の細胞浮遊液 を移植 した。 1 7 日後に、 転移能の指標と して肝臓の重量、 転移 巣の有無及び転移結節数を評価 した。 この結果を第 2表に、 それ ぞれ肝重量および転移形成数な らびに耘移結節数と して示す。
第 2 表
抗 体 4' 用 量 転移形成数 [百分率] 車云 移 結 節 数
( β. マウス） i s ) (個体数） (%) (個 1匹）
C 249 50 1.82±0.13* 5/8 [ 6 2.5 ] 23, 5, 3, 3, 2, 0, 0, 0
G 1 25 50 1.67±0.16** 4/7 [ 5 7. 1 ] 12, 6, 5, 2， 0， 0, 0
正常マウス 5 0 3.48±1.76 7/8 [ 8 7.5 ] >50, >50, >50, >50, >50, >50,
I gG (比較） 2, 0
なし （対照） 2.34±0.54 8/8 [ 1 00 ] >50, >50, 45, 38, 35, 28, 4, 3
1) 抗体は F a b画分を用いた。
* スチュ一デン トの t一検定で未処理群に対して P< 0.05
** スチューデン トの t一検定で未処理群に対して P < 0.0 1
第 2表か ら明 らかな よ う に、 C 24 9及び G 1 2 5 の前処理によ り 、 C H O Z C E A細胞の肝転移が抑制された。 比較と して は正 常マウスの I g G画分よ り調製 した F a b画分を用いた。 第 2表 に示すよ う に、 この比較群にお いて転移の抑制は全 く 認め ら れなか つた。 これらの結果は、 C E Aの細胞接着活性を阻害するモ ノ ク 口一ナル抗体が、 癌転移阻害剤と して有用である こ と を示 している 産 業 上 の 利 用 可 能 性
従来、 癌の他臓器への転移を有効に防御する こ とができなかった が、 本発明のモ ノ ク ロ ーナル抗体を投与すれば、 当該抗体が癌細胞 の接着话性を阻害 し、 この結果 と して癌細胞が他臓器へ転移する こ と を防止でき るので、 癌転移阻害剤等の細胞接着阻害剤と して有効 である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 少な く と も ヒ 卜の癌胎児性抗原糖蛋白質における N ドメ イ ンの ぺプチ ド配列および ドメ イ ン ΠΙの一部または全部のぺブチ ド配列 も し く はこれ と相同性を有する配列を含むぺブチ ド に対するモ ノ ク ロ一ナル抗体。
2 . ヒ 卜 の癌胎児性抗原糖蛋白質にお ける N ドメ イ ン を認識するも のである請求項第 1 項記載のモ ノ ク ローナル抗体。 .
3 . ヒ 卜 の非特異的交差抗原糖蛋白質における N ドメ イ ンを認識す るものである請求項第 1 項記載のモ ノ ク 口一ナル抗体。
4 . 少な く と も ヒ トの癌胎児性抗原糖蛋白質における N ドメ イ ンの ぺプチ ド配列および ドメ イ ン IIIの一部または全部のぺプチ ド配 列も し く はこれ と相同性を有する配列を含むぺプチ ド に対する乇 ノ クロ一ナル抗体を有効成分と して含有する細胞接着阻害剤。
5 . モ ノ ク ローナル抗体が、 ヒ 卜の癌胎児性抗原糖蛋白質における N ド メ イ ンを認識するものである請求項第 4項記載の細胞接着阻 害剤。
6 . モ ノ ク ローナル抗体が、 ヒ トの非特異的交差抗原糖蛋白質にお ける N ド メ イ ンを認識するものであ る請求項第 4項記載の細胞接 着阻害剤
7 . 癌転移阻害剤と して使用されるものである請求項第 4項ない し 第 6項のいずれかの項記載の細胞接着阻害剤。
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