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WO1993001277A1 - Process for culturing t precursor cell line - Google Patents

Process for culturing t precursor cell line Download PDF

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WO1993001277A1
WO1993001277A1 PCT/JP1992/000829 JP9200829W WO9301277A1 WO 1993001277 A1 WO1993001277 A1 WO 1993001277A1 JP 9200829 W JP9200829 W JP 9200829W WO 9301277 A1 WO9301277 A1 WO 9301277A1
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oxygen concentration
culture
nutrient medium
cell
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PCT/JP1992/000829
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Yoshihiro Watanabe
Original Assignee
Japan Tobacco Inc.
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Publication date
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    • C12N2502/00Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing a T precursor cell line for inducing and generating a T cell that has been differentiated and formed from a ⁇ precursor cell line, and to a T cell obtained by using the culture method.
  • T progenitor cells enter the thymic cortex and then interact with myeloid cells such as thymic epithelial cells and macrophages, which are involved in T cell differentiation and thermogenesis.
  • Thymic cells undergoing several stages of differentiation, undergoing rapid differentiation and maturation while rapidly dividing and proliferating, under the control of the adhesion of the cells and the humoral factors produced by them. Migrates to the peripheral lymphoid tissues from the boundary between the thymic cortex and the medulla, and further differentiates and matures.
  • allergic diseases or various autoimmune diseases are caused by the distribution of T cells based on the sensitization of infectious bacteria or foreign antigens as the cause of the onset. Or dysfunction is considered to be a major factor (Ani mesh A. et al, Science, 248, 1380-1388, 1990, I run R. Cohen et al, Immunology Today, 12, No4, 105-110, 1991, and Lars Klareskog et al, Immunol ogical Rev iews, Nol 18, 285-310, 1990, etc.).
  • a commonly used method of culturing cells or tissues is to sediment or suspend and culture the cells or tissues in a nutrient medium.
  • the power of submerged (suspension) culture which is widely known, is to differentiate T cells into T cells by these conventional methods and to mature them.
  • the power of submerged (suspension) culture which is widely known, is to differentiate T cells into T cells by these conventional methods and to mature them.
  • the only culture method that can achieve the differentiation and maturation of T progenitor cells is to use fetal thymus in a gas phase and nutrient medium in an atmosphere where the concentration of carbon dioxide is controlled to 5%.
  • Only the so-called afloat culture method of culturing on the air-liquid interface of liposomes is known (Jenkinsen EJ et al. Eur. J. Immunology, 12, 583, 1982S.
  • Japanese Patent Publication No. 3-5004329 discloses a system in which a gas cylinder containing a mixed gas containing a desired amount of oxygen is sealed in a medium placed in a closed container.
  • proliferation of a human B blast cell line is observed.
  • Differentiation and maturation of force cells have not been achieved.
  • the present invention provides a simpler method than the methods disclosed in the specification, and furthermore, under a higher concentration of dissolved oxygen in a medium, to grow and differentiate T precursor cells.
  • Disclosure of the invention To achieve differentiation and maturation in antigen expression or function [Disclosure of the invention]
  • An object of the present invention is to use a sedimentation (suspension) culture method, which is a general method for culturing cells or tissues, to differentiate and mature T precursor cells on the differentiation antigen phenotype or function.
  • the present invention provides a culture method capable of reproducing and achieving the induction of the obtained T cells, and a T cell obtained by using the culture method.
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for culturing a T precursor cell line in vitro 0, and as a result, the ⁇ progenitor cell line was transformed into a nutrient medium.
  • the dissolved oxygen concentration is higher than the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium under normal atmosphere, that is, when the cells are cultured under high oxygen conditions, the differentiation antigen phenotype or
  • the present inventors have found that functionally differentiated and heat-generated ⁇ cells are extremely efficiently and easily induced and generated, and have completed the present invention.
  • the method for culturing a progenitor cell line according to the present invention comprises the steps of: (a) dissolving the progenitor cell line so that the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium is lower than the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium under normal atmosphere; It is characterized by culturing under conditions.
  • T-progenitor cells are prepared by submerged (suspension) culture, which is widely known as a general method for culturing cells or tissues. Can be induced into normally differentiated and matured ⁇ cells on differentiation antigen phenotype or function, and proliferate. Further, according to the present invention, special equipment is required. The culture can be performed very easily without using it, and large-scale culture is possible. Hereinafter, details of the present invention will be described.
  • progenitor cell line used in the present invention.
  • progenitor cell line used in the present invention means “progenitor cell”, “tissue containing progenitor cell”, or “combination J with T progenitor cell and lymphoid tissue stromal cell line”. Means, and may optionally contain expanded stem cells,
  • the "T progenitor cell line” can be obtained from a tissue having T progenitor cells regardless of species, sex, or age, and is preferably, for example, It can be obtained from a mammal such as a rat, a mouse, a heron, a poma, or a pest, and is more preferably a fetus or newborn of the mammal. Yes, it can be a human.
  • T-lineage cells are lymphoid stem cells differentiated from hematopoietic stem cells, which are mainly found in bone marrow or fetal liver. It has its origin in T cells and generates T cell stem cells by differentiation. These T cell lineage stem cells migrate to the thymus and mature into T cells that have the ability to take on cell-mediated immunity through each stage of proliferation and differentiation.
  • the “ ⁇ progenitor cell J” used in the present invention is, as described above, a ⁇ series that is in all stages of differentiation in a series of processes from lymphocyte stem cells to mature ⁇ cells.
  • fetal thymocyte group J contains a large amount of T cell stem cells that have migrated to the thymus and is a source of “progenitor cells”.
  • ⁇ ⁇ Tissue containing progenitor cells means a tissue containing “ ⁇ progenitor cells” as described above, specifically, for example, a tissue derived from the thymus, bone marrow, or liver. Preferably, it refers to the thymus or bone marrow.
  • lymphoid tissue stromal cell line J refers to a tissue other than the “ ⁇ progenitor cell” that supports and surrounds the “ ⁇ progenitor cell” in the aforementioned tissue containing the rT progenitor cell.
  • a cell line for example, thymic epithelial cells, fibroblasts, intercellular substances, etc.
  • lymphoid tissue stromal cell line obtained from the same or different individuals from the same or different animal species, respectively.
  • human ⁇ precursor cells and the mouse thymic stromal cell line mouse ⁇ precursor cells and the human thymic stromal cell line, human ⁇ precursor cells and the rat Thymic stromal cell line or rat T progenitor and human thymic stromal cell line That Ki out and a real Hodokosuru this Ri by the suit.
  • the "I" nutrient medium J used in the present invention is used to differentiate, proliferate, mature, maintain or preserve the T precursor cell line defined in a). Yes, it can be any medium that is usually used for cell culture, such as RPMI-164 medium or MEM basic medium, for example. Sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, amino acid, vitamin, formone Can contain antibiotics, serum or other chemicals depending on purpose.
  • interlo-kin-1 interlo-kin 1, 2, interlo-kin-1, and interlo-kin 1-4, Interlo-kin-1 5, Interlo-kin-1 6, Inter-open kin-1, 7, Interlo-kin-18, Inter -Lo-kin 1-9, Interlo-kin 10-10, Interlo-kin 11-1, Interlo-kin 12-2, TNF (Tumour Necrosis Factor) ⁇ -interferon, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) and May contain site-forced proteins such as macrophage-colony stimulating factor (M-CSF).
  • TNF Tuour Necrosis Factor
  • the “dissolved oxygen concentration in the nutrient medium” used in the present invention is the concentration of oxygen dissolved in the nutrient medium (liquid phase) for culturing the T precursor cell line defined in a ).
  • Means The ⁇ dissolved oxygen concentration in a nutrient medium under normal atmosphere '' refers to the dissolved oxygen concentration in a nutrient medium that is saturated with respect to a natural atmosphere that has not been artificially modified. It means.
  • the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium is such that the total pressure of the gas phase in contact with the nutrient medium is latm, the oxygen partial pressure of the gas phase is 0.4 atm, and the temperature is 37 ° C.
  • the dissolved oxygen concentration J in the nutrient medium under the conditions described above means that the solubility of a gas is proportional to its partial pressure at a constant temperature in a range where the pressure is not too low. According to Henry's law, it can be said that the concentration of dissolved oxygen in air, which is usually 1 atm, is about twice as high.
  • any means having an oxygen supply capability capable of increasing the amount of oxygen dissolved in the nutrient medium can be used in the present invention.
  • the oxygen concentration in the gas phase to which the nutrient medium (liquid phase) is in contact is in the range of 40% to 95% by volume, particularly 60% to 95% by volume. It is preferable that the concentration of oxygen contained in the nutrient medium (liquid phase) be substantially increased by increasing the content to the range of% by volume.
  • solubility of oxygen is proportional to the partial pressure of oxygen in the gas phase, even if the oxygen concentration is 60% by volume or less, or 40% by volume or less, the gas phase pressure is reduced. It will be readily appreciated by those skilled in the art that it may be possible to increase the dissolved oxygen concentration by slightly increasing it.
  • the concentration of dissolved oxygen in the exchange medium may be adjusted to the concentration of dissolved oxygen in the medium in advance. Immediately after the replacement, the airflow with a high oxygen content may be adjusted.
  • T cell lineage stem cells that have been differentiated and generated from lymphoid stem cells derived from hematopoietic stem cells proliferate under the control of thymic stromal cell lineage adhesion and the control of humoral factors in the living body. It matures through each stage of maturation and maturation.
  • each cell has a phenotypic or differentiation / maturation stage based on the type of differentiation antigen expressed on the cell membrane surface. For example, they can be distinguished and classified based on their biological functions such as antigen-specific proliferation ability, B cell activation ability, cytotoxicity and immunosuppressive ability.
  • the obtained r-differentiated antigen phenotype or functionally differentiated and matured ⁇ cell J refers to a ⁇ -series cell at any stage of differentiation and maturation as described above.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the number of viable cells recovered after culturing under each culture condition and the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium.
  • FIGS. 2 to 7 are graphs showing the distribution of various cells shown below, which are identified based on the size of the cells using a flow cytometer.
  • the axis indicates the relative complexity of cells due to side scattered light, and the horizontal axis indicates the relative size of cells due to forward scattered light. That is,
  • Figure 2 is a graph showing the cell distribution of mouse mature T cells
  • Figure 3 is a graph showing the cell distribution of mouse fetal thymocytes immediately after collection.
  • Figure 4 is a graph showing the cell distribution of mouse fetal thymus after aoat culture under an oxygen concentration of 20%.
  • Fig. 5 is a graph showing the cell distribution after submerged culture of mouse fetal thymus under an oxygen concentration of 5%
  • Fig. 6 is a mouse embryo under the oxygen concentration of 20%.
  • Figure 7 shows cells after submerged culture of mouse fetal thymus under oxygen concentration of 60%. This is a graph showing the distribution.
  • Figures 8 to 13 show the fluorescent colors using a flow cytometer.
  • Graph showing the cell distribution showing the expression status of CD4 and CD8 or CD8, which are differentiation antigens on mouse ⁇ cell membranes, which are identified by the antibody-labeled antibody method. Indicates the expression status of CD4, and the horizontal axis indicates the expression status of CD8. That is,
  • FIG. 8 is a graph showing the distribution of cells showing the expression status of CD4 and / or CD8 in mouse mature T cells.
  • FIG. 9 is a graph showing the cell distribution showing the expression status of CD4 and CD8 or mouse CD8 in mouse fetal thymocytes immediately after collection.
  • Figure 10 shows the cell distribution showing the expression status of CD4 and Z or CD8 after afloat culture of mouse fetal thymus under an oxygen concentration of 20%. rough,
  • Fig. 11 shows the distribution of cells showing the expression status of CD4 and CD8 after submerged culture of mouse fetal thymus under 5% oxygen concentration. rough,
  • Figure 12 shows the cell distribution showing the expression status of CD4 and CD8 after submerged culture of mouse fetal thymus under oxygen concentration of 20% Graph
  • Figure 13 shows the cell distribution showing the expression status of CD4 and CD8 after submerged culture of mouse fetal thymus under oxygen concentration of 40%. It is a graph.
  • Figure 14 shows the cell distribution showing the expression status of CD4 and CD8 after submerged culture of mouse fetal thymus under oxygen concentration of 60%. It is a rough.
  • Figure 15 shows CD4 and C or C after submerged culture of mouse fetal thymus under an oxygen concentration of 80%. This is a graph showing the cell distribution indicating the expression state of D8.
  • Figure 1 6 is Application Benefits Chiu unlabelled cyclic Mi Gin - in grayed La off indicating the degree of (3 H T d R) proliferation of C on A reactive functional T cells was measured have use the lump test Ri preparative is there.
  • the vertical axis represents 3 H Ru indicator der of Ban cormorants DNA synthesis in T cell proliferation - Installing inclusive amount to T d R of the cells (cpm), the horizontal axis No Ri per cell group thymus after culture Indicates the dilution ratio of the cell number.
  • Figure 17 is a graph showing the extent of proliferation of aro-reactive functional T cells measured using a tritium-labeled thymidine (3H-TdR) uptake test. It is. Ordinate Ru indicator der of Ban cormorants DNA synthesis in T cell proliferation 3 H - T d Installing inclusive of R into the cells (cpm), the horizontal axis represents the Ri per cell groups thymus after culturing cells Represents the dilution of a number.
  • Figure 18 shows the CD4 and Z cells after submerged culturing of a mouse thymus stromal cell line without mouse fetal thymocytes at 60% oxygen. Or a graph showing cell distribution indicating the expression state of CD8.
  • Figure 19 shows the submerged culture of mouse thymus stromal cell lines and 300 mouse fetal thymocytes, each collected separately, under an oxygen concentration of 60%. This is a graph showing the distribution of cells indicating the expression status of CD4 and Z or CD8 later.
  • FIG. 20 is a graph showing the cell distribution indicating the expression status of CD4 and CD8 of mouse mature T cells.
  • FIG. 21 is a graph showing the correlation between the gas phase oxygen concentration in contact with the nutrient medium and the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium.
  • mice C57BL / 6 mice (B6 young mice) at the 6th week after birth reared under constant control conditions and the date of insemination B15 fetal mouse at 15 days of fetal age (Nippon SLC) from multiple C57BL / 6 pregnancy mice (B6 pregnancy mouse) Therefore, the thymus was aseptically collected by a conventional method. 1 1 2>. Obtaining mouse thymocytes
  • the young mouse thymus and the mouse fetal thymus (FT) obtained in 11 were gently sliced using a stainless steel mesh. Aged mouse thymocytes and fetal mouse thymocytes were obtained.
  • thymocytes are suspended in RPMI-1640 complete medium (manufactured by Gibco), and the number of viable cells is counted by the tripan-blue dye inhibition test (tripan-blue dye exclusion test). Has been installed.
  • fetal thymocytes obtained from a B6 mouse mouse embryo at 15 days of fetal age were used.
  • sodium pyruvate, sodium bicarbonate, non-essential amino acid manufactured by Gibco
  • 2-melka RPMI-1640 complete medium containing put ethanol, penicillin, strept mycin, and 10% fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • the number of cells after the culturing was counted by the trypan blue color inhibition method in the same manner as in the above-mentioned 112.
  • Oh Ru suspension culture method in the prior art in the (af loat culture) were grown to about 3 3. 2 X 1 0 4 cel ls / Iobe at day 5 of culture, about five times the cell proliferation is observed, et al. Compared with the previous culture Was.
  • the sedimentation culture method (submerged culuture), under an oxygen concentration of 5% Contact good beauty 2 0%, respectively about 2.
  • 7 X 1 0 4 Ru Oh degree cel ls / lobe of cell proliferation observed et al is but, in contrast to the oxygen concentration is found and this significantly cell proliferation observed we were under the above 4 0%.
  • Oxygen concentration is 4 0%, under 6 0% your good beauty 8 0%, each about 9. 3 X 1 0 4 cel ls / lob e, 2 3. 5 1 0 ⁇ 118 c 0 and 6 per cent Yo beauty 2 8 .
  • T progenitor cells expression of differentiation antigen
  • the air in the container was replaced with 5% of carbon dioxide and 5%, 20%, 40% and 60% of oxygen, respectively.
  • the mixture was replaced with a mixed gas containing 80% and 80% (Iwatani Sangyo Co., Ltd.) and cultured using a submerged culture method (SU bmerged culture) to examine the state of cell differentiation.
  • the cells were cultured using an afloat culture and the state of differentiation was examined in the same manner as in the case of the above item 13.
  • the cell distribution was measured by using a flow cytometer (FACScan; Becton Dickinson).
  • lymphocytes (immature cells) that have not completed differentiation and maturation and that have completed differentiation and maturation and have a diameter of about 5 to 10 m
  • small lymphocytes small lymphoid cells
  • Fig. 2 Most of the mouse mature T cell group (Fig. 2) was observed as small lymphocytes (smal 1 lymphoid cells), and the mouse fetal thymus was also exposed to an oxygen concentration of 20%. Most of the cells that were subjected to afloat culture below (Fig. 4) were also observed as small lymphocytes (small l y mphoid cel l).
  • lymphoblasts immature cells; blastic 1 y mphoid eel 1
  • Fig. 3 mouse fetal thymocyte group
  • the cell group subjected to submerged culture under the condition of oxygen concentration of 60% (Fig. 7) and the mouse mature T cell group (Fig. 2) Float under oxygen and oxygen concentration of 20% Almost all cells are observed as small lymphocytes (smal I lymphoid cells), similar to the cells cultured in afloat culture (Fig. 4). Achieved achievement.
  • flow was determined by fluorochrome-labeled antibody method using a monoclonal antibody against each differentiation antigen of mouse T cells.
  • the expression status of the remous differentiation antigens CD4 and CD8 was measured by a conventional method using a site meter (FACS can; Becton Dickinson).
  • the monoclonal antibody used in this experiment was a phycoerythrine (PE) -labeled mouse CD4 monoclonal antibody (rat neutrophile). Doma GK 1.5; Becton Dickinson (manufactured by) and fluoroscein isocyanate (FITC) -labeled mouse CD8 monoclonal antibody Tony Bridoma 5 3.6.7; Becton Dickinson (manufactured).
  • PE phycoerythrine
  • FITC fluoroscein isocyanate
  • Oxygen increases in proportion The submerged culture cells at a concentration of 60% and 80% were 70 to 80 ° / 80% of the lymphablasts (immature cells; blastic lymphocytes) group. 0 expressed the differentiation antigen.
  • lymphoblasts implant cells
  • suspension culture afloat culture
  • T progenitor cells express the antigen receptor (T cell receptor; TcR) on the cell membrane as one stage of differentiation and maturation.
  • TcR antigen receptor
  • This TcR is composed of subunits called ⁇ , ⁇ , y, and 5 chains, is one of the differentiation antigens, and is a molecule that transmits a growth signal into cells. It associates with CD3 to form CD3TcR. Therefore, by examining the expression of TcRa ⁇ and TcRa5 and the expression of CD3, the differentiation stage and the degree of functional maturation can be evaluated.
  • the T cells that constitute the recognition mechanism for foreign antigens in vivo are cells that mainly express TcR ⁇ , and the thymus is more likely to be a TcR aS cell. It produces many TcRa ⁇ -lineage T cells and supplies them to the periphery.
  • the monoclonal antibody used in this experiment was anti-mouse C D3 monoclonal antibody (Nomstar-noid-bridoma 144-5-2C11; manufactured by Seikagaku Corporation), anti-mouse TcRa mono Clonal antibodies (Hamster Noybridoma H57-5977) and anti-mouse TcRyS Monoclonal antibodies (Hamster Hypride Dormer 3A10).
  • anti-mouse C D3 monoclonal antibody Nomstar-noid-bridoma 144-5-2C11; manufactured by Seikagaku Corporation
  • anti-mouse TcRa mono Clonal antibodies Hamster Noybridoma H57-5977
  • anti-mouse TcRyS Monoclonal antibodies Hamster Hypride Dormer 3A10
  • fluorescein-labeled heron anti-ham stadium noglobulin (Ca1tag, Inc.) was used as a secondary antibody.
  • TcRa ⁇ and TcR ⁇ S were as effective as the cells cultured in suspension culture (afloat cu ure) at an oxygen concentration of 20%. Differentiation was selectively occurring, indicating that normal differentiation of T progenitor cells was achieved.
  • CD3 expressing cells generated under each culture condition TcRa / 5
  • the cells were subjected to submerged culture at an oxygen concentration of 5% and 20%.
  • CD3, TcR ⁇ ⁇ and TcRrS were not sufficiently produced, but sealed, and submerged culture was performed under 60% conditions.
  • the number of CD3 and TcRa ⁇ -positive cells was 7 to 13 times and 14 to 39 times, respectively. This result was equivalent to the result of the cell group subjected to the afloat culture under the oxygen concentration of 20%.
  • mitogens one of which is concananoline.
  • A concanava 1 inA; C on A
  • the proliferation of T cells induced by C on A is caused by the interloukin-2 (interleukin) produced in the culture supernatant from T cells by C on A stimulation. -2; IL-1), etc.
  • the method described in 2-3 above was used for 5 days under various oxygen concentration conditions using a 24-hole microtiter plate.
  • the T cells generated from the thymus cultured during the incubation were cultured in the presence of Con A (15 ⁇ gml; Vector (manufactured by)) and IL-12 (50 units; Genzyme (manufactured by)) Cultivated in RPMI-1640 complete medium containing 10% FCS using a 96-well microtiter plate to obtain functionally mature T with ConA reactivity.
  • Con A 15 ⁇ gml; Vector (manufactured by)
  • IL-12 50 units
  • Genzyme manufactured by
  • C 0 II A reactive T cells were cultured for three days, each termination 6 hours preculture 1.
  • 0 C i bet Li Ji U unlabelled cyclic Mi Jin (3 H - T d R ) was added to the culture medium and the cells glass full i Le collected on te scintigraphy, single te (Clear-sol i; Naka La y Te click, Inc. (Ltd.)) was added 3 H - T d R The incorporation into the cells was measured using a liquid scintillation counter.
  • the proliferation of the cells that were subjected to submerged culture under oxygen concentration of 5% and 20% was performed by afloat culture under oxygen concentration of 20 ° / 0.
  • the growth of the cell group subjected to submerged culture under the oxygen concentration power of 60% is in contrast to the above.
  • Oxygen concentration is about the same as the growth of a cell group subjected to afloat culture under 20% conditions, and the number of functionally mature T cells having ConA reactivity is low. It was shown to be induced and produced to the same extent as differentiation in aged mouse thymus and differentiation in fetal thymus in afloat culture.
  • T cells are educated in the thymus and gain responsiveness to non-self, xenogeneic (mouth) mouse cells, for example, causing graft rejection. This reaction is also mediated by the TcR-CD3 complex on ⁇ cells that have matured and passed through in the thymus, in the same manner as the action of C0 ⁇ described in 3-1 above.
  • the thymus cultured for 6 days under the respective oxygen concentration conditions using a 24-well microtiter plate by the method described in 2-3 above was used.
  • the splenocytes collected from BALB / C mice 6 weeks after birth were transferred to M-Mycin C (25 ⁇ g / 37'C, 3 0 minutes), and then washed three times with RPM1-164 0 medium and added the cell suspension obtained.
  • ⁇ b reactive T cells were cultured for five days, collected by Li Ji U unlabelled cyclic Mi di emissions of each 1. Exit 6 hours preculture (3 H - T d R) of the medium in addition, the cells glass La scan full Note1 collected on one sheet inch, single-te (Clear-sol i; Naka La y Te click, Inc. (Ltd.)) was added 3 H - T d R cells Uptake was measured using a liquid scintillation counter.
  • Propagation of submerged cultures at 5% and 20% oxygen concentration was achieved by afloat culture at 20% oxygen concentration.
  • the growth of the cell group was 1 Z 10 to 15, but in contrast, the cell group subjected to submerged culture at an oxygen concentration of 60% was used.
  • Proliferation is comparable to that of a cell population subjected to afloat ensure at an oxygen concentration of 20%, and functionally mature T cells with aro-reactivity are obtained. It was shown to be induced and produced to a similar extent as differentiation in young mouse thymus and fetal thymus in afloat culture.
  • T precursor cells Differentiation and maturation of T precursor cells in combination with T precursor cells and lymphoid tissue stromal cell lines
  • Examples 1 to 3 showing the ability to achieve normal differentiation and maturation of T progenitor cells using the mouse fetal thymus according to the technique of the present invention in the present invention.
  • T progenitor cells from the same or different individuals from different animal species and the lymphatic tissue stromal cell lines surrounding such T progenitor cells thymic epithelial cells, Normal differentiation and maturation of T progenitor cells by using fibroblasts, other lymphoid tissue stromal cells and intercellular substances. I can do it.
  • T progenitor cells from the same or different individuals from different animal species and the lymphatic tissue stromal cell lines surrounding such T progenitor cells thymic epithelial cells, Normal differentiation and maturation of T progenitor cells by using fibroblasts, other lymphoid tissue stromal cells and intercellular substances.
  • fibroblasts fibroblasts
  • intercellular substances other lymphoid tissue stromal cells and intercellular substances
  • the thorax obtained from a B6 fetal mouse (Nihon SLC Co., Ltd.) on the 15th day of fetal age was transformed into a 1.3 mM 2'-deoxy guanosine (d Guo) and 10 ° / 0 fetal bovine serum (Fetal Calf Serum; FCS) in RPMI-1640 complete medium containing afloat culture for 6 days.
  • FCS Fetal Calf Serum
  • This thymic stromal cell line was plated on a 96-well round bottom plate, supplemented with RPMI-1640 complete medium (200 il Zwell), and further obtained in the same manner as in Examples 12 and 13.
  • the obtained T progenitor cells (mouse fetal thymocytes) were calorie at 30 eel 1 s / wel 1 or 300 ceI 1 s / we, respectively, and the plate was placed in a plastic container. Gaspack; BBL (manufactured)), and replace the air in the container with a mixed gas (Iwatani Sangyo (manufactured by)) containing 5% carbon dioxide, 60% oxygen and 35% nitrogen.
  • the cells were cultured for 7 days by submerged culture.
  • mice T cell differentiation antigens CD4 and CD8, were measured in the same manner as in Example 2-2, in order to capture the results.
  • the culture group in which only the thymic stromal cell line was subra erged culture under the condition of an oxygen concentration of 60% without the addition of T precursor cells (mouse fetal thymocytes) was used as a control.
  • Mouse mature T cells were used for comparison.
  • CD4 positive and / or CD8 positive Most of the mature mouse T cell population (Fig. 20) are CD4 positive and / or CD8 positive, and most of them are CD4 positive CD8 It was positive.
  • T precursor cells mouse fetal thorax cells
  • Fig. 18 the number of recovered cells (including thymic epithelial cells or fibroblasts) was extremely small, and both CD4 positive and Almost no CD8- or CD8-positive cells were found.
  • mouse thymic stromal cell line and T progenitor cells (mouse fetal thymocytes ⁇ ) (30 and 300 cells each), which were separately collected, had an oxygen concentration of 60 and 300, respectively.
  • CD4 positive and / or CD8 positive cells were predominant, and 30 fetal mouse thorax cells were found.
  • 30 to 40% are CD4 positive and / or CD8 positive, and in the case of 300 cells (Fig. 19), 90% or more are CD4 positive CD8 It was positive.
  • Thymic function to proliferate, differentiate and mature B progenitor cells and / or T progenitor cells is lacking Force or congenitally lacks mature B cells and / or mature T cells It causes a variety of diseases involving the immune system. Even if mature B or mature T cells are administered to such animal species in an adoptive immunotherapeutic manner, lymphocyte progenitor cells (such as B and T progenitor cells) will not. Mature B or mature T cells with any antigen specificity due to defects or abnormalities in the proliferation, differentiation and maturation process in the thymus The therapeutic significance is extremely small because of the inability to induce vesicles, so the following experiment was conducted to examine the therapeutic significance of the present invention in such a model. Was conducted.
  • SCID mice severe combined at 6 weeks after birth, a mouse model with impaired differentiation and maturation ability of B precursor cells and T precursor cells and lacking mature B and mature T cells immuno-deficient mouse; severe combined immunodeficiency mouse, Fox Chase
  • the thymus was aseptically obtained in the same manner as in Example 11-11.
  • the obtained thymus was divided into four parts, and each fragment was added to RPMI-1640 complete medium using a 96-well microtiter plate.
  • T progenitor cells were obtained as T progenitor cells in the same manner as in Examples 11 and 112. Thymocytes were obtained and added to RPMI-1640 complete medium containing the SCID mouse thymus fragment at 5 ⁇ 10 4 eel 1 s / wel.
  • the culture plate was submerged for 7 days at 37 ° C under a carbon dioxide concentration of 5% and an oxygen concentration of 20% (atmospheric conditions) and 80%, respectively. Was given.
  • the number of cells after culture was counted by the trypan blue staining inhibition method.
  • both cells cultured at an oxygen concentration of 80% were cultured at an oxygen concentration of 20% (atmospheric conditions). It showed more than twice the survival rate of T progenitor cells compared to the cell group.
  • the cell group cultured using the irradiated or untreated thymus under the condition of an oxygen concentration of 80% the cell group using the irradiated thymus was significantly more T-progenitor cells. High survival rate. Among the surviving cells, differentiated and mature ⁇ cells were found.
  • the number of cells after culturing was counted by the trypable-staining inhibition method.
  • Example 2 Similar to the results of Example 1 using mouse thymocytes, in this experiment using human thymocytes, the oxygen concentration was 20%. Compared to the culture under (atmospheric conditions), the survival of the cells was significantly more than doubled when the oxygen concentration was 70% ( ⁇ oxygen concentration condition).
  • the present invention can be applied to mature lymphocyte-deficient model animals such as SCID mouse, and tissues such as human thymus and the like. It has been shown that normal mature T cells can be induced from T precursor cells. Therefore, research on cellular vaccines and therapeutics against various autoimmune diseases or immune diseases caused by viral infections such as AIDS (aqu ired immuno-de fi ciency syndrome). The application value of the present invention in development can be said to be high.
  • the following experiment was performed to examine the correlation between the gas phase oxygen concentration in contact with the nutrient medium and the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium.
  • the plate is sealed in a plastic sealed container (Gaspack; BBL (manufactured by BBL) or Tedlar Knock; Seikagaku Corporation (manufactured by Seikagaku)), as shown in Fig. 21.
  • a gas mixture (Iwatani Corporation) manufactured by adjusting the mixture ratio of the oxygen concentration (%) and the nitrogen concentration (%) in advance while keeping the carbon dioxide concentration constant (5%) in advance. Replace the air in the blow-in container through the exchange port, and Incubated at 'C for 1-5 days.
  • the dissolved oxygen concentration (mmiig, ⁇ ) of the nutrient medium (liquid phase) is measured by a gas automatic analyzer ( Nova (manufacturer)).
  • the T-progenitor cell line is cultured under a condition where the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium is lower than the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium under normal atmosphere.
  • the oxygen concentration in the gas phase in contact with the nutrient medium can be increased to 40% to 95% by volume to increase the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium.
  • the sedimentation (suspension) cultivation method which is a general method for culturing cells or tissues without requiring special equipment in invitro 0
  • the proliferation and distribution of progenitor cells are Induces cells that reproduce the normal differentiation and maturation process on antigenic phenotype or function, and have any antigen recognition ability that has been heated on differentiation antigenic phenotype or function. Generate By doing so, it is possible to elucidate the details of the mechanism of differentiation and maturation of T-lineage cells.
  • the progenitor cell line can be used to convert infectious diseases such as hepatitis, isoles or human immuno-deficiency virus (HIV), allergy diseases, etc.
  • T cells that recognize the antigen can be induced by culturing in a nutrient medium containing an antigen that causes an autoimmune disease, and the antigen is induced. It can produce or produce any T cell actin that can suppress or treat the symptoms of infectious, allergic and autoimmune diseases.

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Description

明 細 書
τ前駆細胞系の培養方法
(技術分野〕
本発明 は、 τ前駆細胞系から分化、 成熱 し た T細胞 を誘導、 生成させる T前駆細胞系の培養方法及び該培養方法 を用 いて 得 られる T細胞に関す る.
[背景技術〕
τ細胞の最も初期の細胞は主 に骨髄中 ま たは胎児肝臓に お いて多分化機能を 有す る血液幹細胞か ら分化 し た リ ンパ球系 幹細胞と して存在する 力 主に胸腺に移住 し た後、 一連の分 化段階を経て T細胞に成熟 して ゆ く. こ の T前駆細胞の分化、 成熟は胸腺ス ト ロ マ細胞に起因する影響を 強 く 受けて お り、
T 前駆細胞は胸腺皮質内 に入っ た後、 T細胞の分化、 成熱に 閧与する胸腺上皮細胞 を主体と する基質細胞及びマ ク ロ フ ァ ー ジな どの ミ エ ロ イ ド系細胞と の接着及びそれ ら の生産す る 液性因子等の制御の下 に、 急速 に分裂お よ び増殖を し な がら τ 細胞に分化、 成熟 し てゆ く, 幾つかの分化段階 を 経た胸腺 細胞は、 胸腺皮質 と胸腺髓質の境界部 よ り 血流 に乗 り 末梢 リ ンパ組織へと 移住 し、 更に分化、 成熟 して ゆ く。
こ の よ う な T前駆細胞の分化、 成熟の詳細な過程 を研究す る ため に は、 i n V i t r 0にお いて T細胞の増殖、 分化お よ び成 熟が達成 さ れる培養系が必要で あ る。
一方、 ア レルギ ー疾患ま たは種々 の 自 己免疫疾患は、 その 発症原因 と し て感染菌ゃ外来抗原の感作に基づ く T 細胞の分 化 ま た は機能異常が大 きな一因 と考え ら れてい る ( An i mesh A. et al, Science, 248, 1380-1388, 1990, I run R. Cohen et al, Immunology T o day, 12, No4, 105 - 110, 1991お よ び Lar s Klar eskog et al , Immuno 1 ogical Rev iews, Nol 18 , 285 - 310 , 1990等) 。
現在こ の よ う な疾患の治療剤 と して非特異的な抗炎症剤や T細胞機能抑制剤 と し ての免疫抑制剤が応用 さ れて い る 力 その非特異性のた め に疾患の根本的な治癒 を達成す る に は到 つ ていな い。
そ こ で こ の よ う な問題を 克服する た め に疾患の原因 と な つ て いる抗原 を 特定 し、 該抗原 を 用 いる ワ ク チン療法や、 該抗 原 に对する抗体な どに代表 さ れる疾患特異的な抑制因子 を用 い る血清ワ ク チン療法 につ いて の研究が進め ら れて い る。 ま た、 抗原特異性が明か と な っ た T細胞 を用 いて の細胞ワ ク チ ン療法が T細胞分化機能異常が原因と 考え ら れ る疾患に対 し 有効な治療方法に な り 得る と考え られてい る ( Jose C. Gut i errez-Ramos et al, Nature, 346, 271-274, 1990S. t^Rohei Ota et al, Nature, 346, 183-187, 1990等) 。 し 力 し な力 s ら、 任意 の抗原特異性を有する T細胞を in vitroで誘導す る こ と ので き る方法は特定の方法 に限 られていた。
事実、 細胞 ま た は組織を培養する一般的 に用 い ら れて い る 方法と し て、 細胞 ま た は組織を 栄養培地中 に沈降ま た は懸濁 さ せて培養す る沈降 (懸濁) 培養法 ( submerged (suspens io n) culture) が従来よ り 広 く 知 ら れて いる 力、 こ れ ら の従来 法に よ っ て T前駆細胞 を T細胞 に分化、 成熟さ せる こ と は不 可能であ つ た。 現在、 T前駆細胞の分化、 成熟を達成で き る 唯一の培養方 法 と して、 胎児胸腺を 二酸化炭素濃度 を 5 %に コ ン ト ロ ー ル し た大気下で、 気相と 栄養培地の気液界面上で培養す る いわ ゆ る浮遊培義法 ( afloat cul ture) が知 ら れて いる のみであ る ( Jenkinsen E. J. et al.Eur.J. Immunology, 12, 583, 1982S. び Osamu Mazda et a 1 , J . Exp . Me d. , 173 , 539 - 547, 1991等) 。 し か しなが ら こ の方法は特殊な器具を必要と す る う え、 液面側 の細胞の分化が不十分であ り、 ま た細胞の大幅な増殖が伴う T前駆細胞の培養 には適さ ず大量培養が困難で あ る と い う 欠 点 を有 し て いた。
従 っ て、 細胞 ま た は組織の一般的な培養方法で あ る 沈降 (懸衝 ) 培養法 ( submerged (suspension) culture) を 用 い て、 T前駆細胞の分化抗原表現型上ま た は機能上分化、 成熟 し た T細胞への誘導が再現、 達成で き る培養方法の開発が強 く 要望さ れて いる。
ま た特表平 3 — 5 0 4 3 2 9 号公報 に は、 密閉容器中 に配 置 し た培地中 に、 所望の酸素量 を含む混合ガス を封入 し た ガ ス ボンベ と連結 し たシ リ コ ン管 を通 じ、 培地中 に定常的に所 望の酸素量を供給 し、 培地中の溶存酸素濃度を 高め る こ と に よ リ ヒ ト B芽球細胞株を増殖さ せる方法が開示 さ れて い る 力 該方法で は ヒ 卜 B芽球細胞株の増殖は認め ら れ る 力 細胞の 分化及び成熟は達成さ れて いな い。 本発明 は、 当該明細書に 開示さ れて い る方法に比べ、 よ り 簡便な方法に よ り、 ま た、 さ ら に高い培地中溶存酸素濃度下で、 T前駆細 の増殖、 分 化抗原表現上 ま た は機能上の分化、 及び成熟を 達成 さ せ る こ と が可能であ る. [発明の開示〕
本発明の 目 的は、 細胞ま た は組織の一般的な培養方法であ る 沈降 (懸濁) 培養法を用 いて、 T前駆細胞の分化抗原表現 型上ま た は機能上分化、 成熟 し た T細胞への誘導が再現、 達 成でき る培養方法、 お よび該培養方法 を用 いて得 ら れる T細 胞を提供する こ と であ る.
この 目 的を達成する ため に、 本発明者 ら は、 i n V i t r 0に お け る T前駆細胞系の培養方法に 関 し鋭意研究を 重ねた結果、 Τ前駆細胞系 を、 栄養培地中の溶存酸素濃度が、 通常の大気 下 におけ る栄養培地中溶存酸素濃度よ リ 髙ぃ条件下 に、 即ち 高濃度酸素条件下 に培養す る こ と に よ り、 分化抗原表現型上 ま たは機能上分化、 成熱し た Τ細胞が極め て効率良 く ま た簡 便に誘導、 生成さ れる こ と を見 出 し、 本発明 を 完成す る に至 つ た。
即ち、 本発明 に よ る Τ前駆細胞系の培養方法 は、 Τ前駆細 胞系を、 栄養培地中の溶存酸素濃度が、 通常の大気下 に お け る 栄養培地中溶存酸素濃度 よ リ 髙ぃ条件下 に培養す る こ と を 特徵と す る も ので ある,
本発明 に よ れば、 細胞ま た は組織の一般的な培養方法 と し て広 く 知 ら れてい る沈降 (懸濁) 培養法 ( submerged (suspe nsion) culture) に よ り、 T前駆細胞 を正常に分化抗原表現 型上ま た は機能上分化、 成熟 し た Τ細胞に誘導 し、 増殖さ せ る こ と がで き る。 更に本発明 に よ れば、 特殊な器具 を 必要 と せず極めて容易 に培養する こ と ができ、 ま た大量培養が可能 で ある。 以下、 本発明の詳細 を説明す る。
本発明 にお いて用 い られる 「 τ前駆細胞系」 、 Γ Τ前駆細 胞」 、 Γ Τ前駆細胞を含む組織」 、 「 リ ンパ組織間質細胞系 J 、
「栄養培地」 、 「栄養培地中溶存酸素濃度」 及 び 「分化抗原 表現型上ま た は機能上分化、 成熟 し た τ細胞 J な る用語は下 記の如き意味を 以て定義さ れる。
a ) Γ T前駆細胞系 J
本発明で用い られる Γ Τ前駆細胞系」 と は、 Γ Τ前駆細胞」 、 Γ Τ前駆細胞 を含む組織」 ま た は 「 T 前駆細胞お よ び リ ンパ 組織間質細胞系 と の組み合わせ J を意味 し、 場合に よ り 増結 幹細胞を含んでいても よ い,
該 Γ T前駆細胞系」 は、 種差、 性差お よ び年齢に 限定 さ れ る こ と な く T前駆細胞 を有する組織か ら採取す る こ と がで き、 好 ま し く は、 例え ばラ ッ ト、 マ ウ ス、 ゥ サギ、 ゥ マ ま た は ゥ シ等の哺乳動物か ら採取す る こ と がで き、 さ ら に好ま し く は 前記哺乳動物の胎児ま た は新生児であ り、 ヒ ト であ っ て も よ い。
免疫応答に闋与する細胞群は免疫担当細胞と 総称 さ れ、 そ の中でも T系列お よ び B 系列の リ ンパ球は抗原記憶に関与 し 免疫応答の中心的役割 を演 じて いる. 本発明 は、 こ の う ち の T 系列細胞に関す る。 こ の T系列細胞 は、 主に骨髄 ま た は胎 児肝臓に存在す る 造血幹細胞か ら分化 し た リ ン パ球系幹細胞 にその起源を有 し、 分化に よ り T細胞系幹細胞 を発生す る。 こ の T細胞系幹細胞は、 胸腺に移住 し、 増殖を 伴い分化の各 段階を経て細胞性免疫を担う 能力 を有す る T細胞に成熟する。
即ち、 本発明で用 い ら れる 「 τ前駆細胞 J と は、 前述の よ う に リ ンパ球系幹細胞か ら成熟 τ細胞 に達する 一連の過程に お ける あ ら ゆ る分化段階に ある τ系列細胞 を意味す る。 例え ば、 本明細書中で用 い られる 「胎児胸腺細胞 J 群は、 胸腺に 移住し た T細胞系幹細胞を 多 く 含んで お り Γ Τ 前駆細胞」 源 と して極めて有用 であ る。 Γ Τ 前駆細胞を 含む組織 J と は、 前記の よ う な 「 τ 前駆細胞」 を 含む組織を 意味 し、 具体的に は、 例え ば胸腺、 骨髄 ま た は肝臓由来の組織を 意味 し、 特に 好ま し く は胸腺ま た は骨髄を意味する。 「 リ ンパ組織間質細 胞系 J と は、 前記の如 き r T前駆細胞 を含む組織」 に お いて 「 τ前駆細胞」 を 支持 し、 取 り 囲んで いる 「 τ 前駆細胞」 以 外の細胞系 (例え ば、 胸腺上皮細胞、 繊維芽細胞及び細胞間 物質等) を意味 し、 本発明 では、 各々 同一 ま た は異な る動物 種の同一 ま た は各々異な る個体か ら取得 し た 「 τ前駆細胞 J と 「 リ ンパ組織間質細胞系」 と を組み合わせて実施す る こ と ができ、 例え ば、 胎児胸腺細胞 と胸腺間質細胞系 と を組み合 わせて実施で き、 さ ら に具体的 に は、 例え ば、 ヒ ト τ前駆細 胞 と マ ウ ス胸腺間質細胞系、 マ ウ ス τ 前駆細胞 と ヒ ト 胸腺間 質細胞系、 ヒ ト τ 前駆細胞 と ラ ッ ト胸腺間質細胞系 ま た は ラ ッ ト T前駆細胞と ヒ 卜 胸腺間質細胞系 な どの組合せ に よ り 実 施する こ と がで き る。
b ) 「栄養培地」 本発明で用 い ら れる I"栄養培地 J と は、 a ) で定義さ れる T前駆細胞系 を、 分化、 増殖、 成熟、 維持ま た は保存さ せ る た め に用 い ら れる ものであ り、 通常、 細胞培養 に用 い ら れる よ う な如何な る培地であ っ ても よ い。 例示す る な ら R P M I 一 1 6 4 0培地ま たは M E M基本培地等を 挙げる こ と がで き る, 基本成分と して ナ ト リ ウ ム、 カ リ ウ ム、 カ ルシ ウ ム、 マ グネ シ ウ ム、 リ ン、 塩素、 ア ミ ノ 酸、 ビ タ ミ ン、 ホルモ ン、 抗生物質、 血清ま た は 目的 に応 じ てそ の他の化学成分 を 含有 し 得る.
ま た、 目 的に応 じて イ ン タ ー ロ イ キ ン一 1、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 2、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 3、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 4、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 5、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 6、 イ ン タ ー 口 ィ キ ン一 7、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 8、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 9、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 1 0、 イ ン タ ー ロ イ キ ン一 1 1、 イ ン タ 一 ロ イ キ ン一 1 2、 T N F ( Tumour Necrosis Factor) 、 γ 一イ ン タ ー フ ェ ロ ン、 顆粒球マ ク ロ フ ァ ー ジ コ ロ ニ ー剌激因 子 ( G M— C S F ) 、 顆粒球コ ロ ニ ー 刺激因子 ( G — C S F ) ま たはマ ク ロ フ ァ ー ジ コ ロ ニー刺激因子 ( M - C S F ) な ど のサイ ト 力 イ ン を含有 し得る。 さ ら に、 肝炎 ウ ィ ルス あ る い は H I V ( Human Immuno-def i c i ency Virus) な どに よ る感染 症、 ア レ ルギ ー疾患お よ び 自 己免疫疾患を 惹起す る抗原 を 含 有する栄養培地を 用 い る こ と に よ り、 該抗原が惹起す る 感染 症、 そ れ に基づ く 炎症 ま た はア レルギ ー お よ び 自 己免疫疾患 の症状 を 抑制ま た は治療す る こ と がで き る T細胞ワ ク チ ン を 誘導、 生成さ せる こ と がで き る。 c ) Γ栄養培地中溶存酸素濃度 J
本発明で用 い ら れる 「栄養培地中溶存酸素濃度」 と は、 a ) に おいて定義さ れる T 前駆細胞系 を培養す る た め の栄養培地 (液相) 中 に溶存する酸素の濃度 を意味す る。 ま た 「通常の 大気下に おける栄養培地中 の溶存酸素濃度」 と は、 人為的に 手 を加えていな い 自然状態の大気に対 し て飽和状態下に あ る 栄養培地中の溶存酸素濃度 を意味する ものであ る。 従っ て、 例え ば 「栄養培地中の溶存酸素濃度が、 栄養培地 と 接す る気 相の全圧が l a t m、 該気相の酸素分圧が 0 . 4 a t m であ リ 温度が 3 7 °Cの状態下に おけ る栄養培地中溶存酸素濃度 J と は、 圧力のあ ま リ 髙 く な い範囲にお いて は一定温度で気体 の溶解度はその分圧に比例する と い う ヘン リ ー ( H e n r y ) の法則に従う な ら、 通常の、 即 ち 1 a t m の空気に対す る溶 存酸素濃度の約 2 倍の濃度であ る と い う こ と がで き る。
溶存酸素濃度を 高め る手段と し て は、 栄養培地中 に溶存す る酸素量を高め る こ と ので き る 酸素供給能力 を 有す る手段で あ れば如何な る手段を も本発明 に用い る こ と がで き、 特に は 栄養培地 (液相) が接 して いる 気相に おけ る酸素濃度 を 4 0 容量%乃至 9 5 容量% の範囲に、 特に 6 0 容量%乃至 9 5 容 量%の範囲に高め る こ と に よ り 実質的 に栄養培地 (液相) 中 に容存す る容存酸素濃度を 髙め る こ と が好 ま し レ、。
酸素濃度は、 場合に よ り 0ん a t m (気圧) 、 m m H g ま た は M (モル) 等の異なる単位で表さ れる 力 いずれの単位 を 用いて表さ れた濃度も、 各々 相互に他の単位 に換算す る こ と がで き、 本発明 を構成す る酸素濃度 は、 あ る一単位で表 さ れた酸素濃度のみ に限定さ れる も ので はな い こ と は言 う ま で あ な い。
ま た、 酸素の溶解度 は気相の酸素分圧 と 比例関係 に あ る の で、 酸素濃度が 6 0 容量%以下、 ま た は 4 0 容量%以下であ つ ても、 気相の圧力 を 若干高め る こ と に よ っ て溶存酸素濃度 を 髙め る こ と が可能で あろ う こ と は、 当業者に容易 に理解さ れるであ ろ う,
ま た、 培養中の培地の一部を 交換す る必要があ る 場合 に は、 交換培地も予め溶存酸素濃度を 培地中 の溶存酸素濃度 に調節 し てお く こ と が望 ま し い力 交換後直ち に酸素含量の高い気 流 を も っ て調整 し ても よ い。
d ) 「分化抗原表現型上 ま た は機能上分化、 成熟 し た
T細胞」
造血幹細胞 に 由来す る リ ンパ球系幹細胞か ら 分化 し発生 し た T細胞系幹細胞 は、 胸腺間質細胞系の接着や生体内液性因 子の制御のも と に増殖 し、 分化お よ び成熟の各段階 を経て成 熟 して ゆ く。
こ の分化、 成熟の各段階は、 細胞の膜表面に発現す る分化 抗原の種類の差異 に基づ く 表現型上ま た は分化、 成熟の各段 階 において各々 の細胞が有 して い る、 例え ば抗原特異的な増 殖能、 B 細胞活性化能、 細胞障害能及び免疫抑制能等の生物 学的機能上か ら識別、 分類する こ と がで き る。
本発明 の方法を 用 い る こ と に よ り i n v r oに お レ、て a ) で 定義さ れる Γ Τ前駆細胞系」 を 用 いて、 こ れ ら 全て の分化、 成熟段階 を再現、 達成する こ と が可能であ り、 本発明で用 い ら れる r分化抗原表現型上 ま た は機能上分化、 成熟 し た Τ細 胞 J と は前記の如 きあ ら ゆ る分化、 成熟段階に あ る τ系列細 胞 を意味する。 〔図面の簡単な説明〕
図 1 は、 各培養条件下に おけ る培養後の 回収生細胞数 と 栄 養培地中溶存酸素濃度の相闋闋係を示す グ ラ フ であ る。
図 2 乃至図 7 は、 フ ロ ー サイ ト メ 一 タ ー を用 いて細胞の大 き さ に基づいて識別さ れる 下記 に示 し た各種細胞の分布 を示 す グ ラ フ であ り、 縦軸は側方散乱光に よ る 細胞の相対的な複 雑性を、 横軸は前方散乱光 に よ る細胞の相対的な大 き さ を 示 す。 即ち、
図 2 は、 マ ウ ス成熟 T細胞の細胞分布を 示す グラ フ、 図 3 は、 採取直後の マ ウ ス胎児胸腺細胞の細胞分布 を 示す グ ラ フ、
図 4 は、 酸素濃度 2 0 %条件下でマ ウ ス胎児胸腺 を 浮遊培 養 (a oat culture) し た後の細胞分布を 示す グラ フ、
図 5 は、 酸素濃度 5 %条件下でマ ウ ス胎児胸腺 を 沈降培養 ( submerged culture) し た後の細胞分布 を 示す グラ フ、 図 6 は、 酸素濃度 2 0 %条件下でマ ウ ス胎児胸腺 を 沈降培 養 (submerged culture) し た後の細胞分布 を示す グラ フ、 図 7 は、 酸素濃度 6 0 %条件下でマ ウ ス胎児胸腺 を 沈降培 養 ( submerged culture) し た後の細胞分布を示す グ ラ フ であ る。
図 8 乃至図 1 3 は、 フ ロ ーサイ ト メ ー タ ー を 用 いて蛍光色 素標識抗体法に よ り 識別さ れる マ ウ ス τ細胞膜上の分化抗原 で ある C D 4 お よ びノ ま た は C D 8 の発現状態 を 示す細胞分 布 を示す グラ フ で あ り、 縦軸は C D 4 の発現状態を、 横軸は C D 8 の発現状態 を表す。 即ち、
図 8 は、 マ ウ ス成熟 T細胞の C D 4 およ びノ ま た は C D 8 の発現状態を示す細胞分布を示す グラ フ、
図 9 は、 採取直後のマ ウ ス胎児胸腺細胞の C D 4 お よ びノ ま た は C D 8 の発現状態を 示す細胞分布を 示す グラ フ、
図 1 0 は、 酸素濃度 2 0 %条件下で マ ウ ス胎児胸腺 を 浮遊 培養 ( afloat culture) し た後の C D 4 お よ び Zま た は C D 8 の発現状態を示す細胞分布を 示す グ ラ フ、
図 1 1 は、 酸素濃度 5 %条件下でマ ウ ス胎児胸腺 を 沈降培 養 ( submerged culture) し た後の C D 4 お よ びノま た は C D 8 の発現状態を示す細胞分布を 示す グ ラ フ、
図 1 2 は、 酸素濃度 2 0 %条件下でマ ウ ス胎児胸腺 を 沈 降培養 ( submerged cul ture) し た後の C D 4 お よ び ま た は C D 8 の発現状態 を示す細胞分布を示す グ ラ フ、
図 1 3 は、 酸素濃度 4 0 %条件下で マ ウ ス胎児胸腺 を 沈降 培養 ( submerged cul ture) し た後の C D 4 お よ びノ ま た は C D 8 の発現状態を示す細胞分布 を示す グラ フで あ る。
図 1 4 は、 酸素濃度 6 0 %条件下で マ ウ ス胎児胸腺 を 沈降 培養 ( submerged cul ture) し た後の C D 4 お よ び ま た は C D 8 の発現状態を 示す細胞分布 を 示す グ ラ フ で あ る。
図 1 5 は、 酸素濃度 8 0 %条件下で マ ウ ス胎児胸腺を 沈降 培養 ( submerged cul ture) し た後の C D 4 お よ びノ ま た は C D 8 の発現状態を示す細胞分布 を示す グ ラ フ で あ る。
図 1 6 は、 ト リ チウ ム標識サイ ミ ジン ( 3H — T d R ) 取 り 込み試験 を用 いて測定 した C o n A反応性機能的 T細胞の増 殖の程度 を示す グ ラ フ であ る。 なお、 縦軸は T細胞増殖に伴 う D N A合成の指標であ る 3 H — T d Rの細胞への取 り 込み量 ( c p m ) を、 横軸は培養後の細胞群胸腺あた り の細胞数の 希釈率を表す。
図 1 7 は、 ト リ チ ウ ム標識サ イ ミ ジ ン ( 3 H — T d R ) 取 り 込み試験を用 いて測定 し た ァ ロ 反応性機能的 T細胞の増殖の 程度を示す グラ フ であ る。 縦軸 は T細胞増殖に伴 う D N A合 成の指標であ る 3 H — T d Rの細胞への取 り 込み量 ( c p m ) を、 横軸は培養後の細胞群胸腺あた り の細胞数の希釈率 を表 す。
図 1 8 は、 マ ウ ス胎児胸腺細胞を含 ま な いマ ウ ス胸腺間質 細胞系 を 酸素濃度 6 0 %条件下 で沈降培養 ( submerged cult ure) し た後の C D 4 お よび Zま た は C D 8 の発現状態を 示す 細胞分布 を示す グ ラ フ であ る。
図 1 9 は、 各々 別々 に採取 し たマ ウ ス胸腺間質細胞系 お よ びマ ウ ス胎児胸腺細胞 3 0 0 個 を酸素濃度 6 0 %条件下で沈 降培養 ( submerged culture) し た後の C D 4 お よ び Zま た は C D 8 の発現状態 を示す細胞分布を示す グ ラ フ であ る。
図 2 0 は、 マ ウ ス成熟 T細胞の C D 4 お よ び ま た は C D 8 の発現状態を示す細胞分布を 示す グ ラ フ であ る。
図 2 1 は、 栄養培地 と接す る気相酸素濃度と 該栄養培地中 溶存酸素濃度 と の相関関係 を示す グラ フ で あ る。 [発明 を 実施す る ため の最良の形態〕
以下 に、 本発明 の態様を 実施例に よ り 更 に具体的 に説明す る 力 本発明 は以下 に記載 さ れ る態様に限定 さ れる も の では な レヽ こ と は言 う ま で も な い。
実施例 1
< 1 - 1 >. マ ウ ス胸腺の取得
一定に コ ン ト ロ ール さ れた条件下で飼育 さ れた 出生後 6 週 間 目 の C57BL/6 系マ ウ ス ( B 6 系若齢マ ウ ス) 、 お よ び授精 日 を一致させた複数の C57BL/6系妊娠マ ウ ス ( B 6 系妊娠マ ウ ス ) か ら取 り 出 し た胎齢 1 5 日 目 の B 6 系胎児マ ウ ス ( 日 本 S L C社 (製) ) か ら、 常法に よ り 胸腺を無菌的に採取 し た。 ぐ 1 一 2 >. マ ウ ス胸腺細胞の取得
お よ びカ ウ ン ト
1 一 1 で取得 し た 若齢マ ウ ス 胸腺 お よ びマ ウ ス 胎児胸腺 ( Fetal Thymus; F T ) を ス テン レ ス 製メ ッ シ ュ を 用 い て穏 やかに細切 し、 若齢マ ウ ス胸腺細胞お よ びマ ウ ス胎児胸腺細 胞 を それぞれ取得 し た。
こ れ ら の胸腺細胞を RPMI - 1640完全培地 ( Gibco社 (製) ) に懸濁 し、 ト リ パ ン ブルー 染色阻止法 ( tripan-blue dye ex elusion test) に よ り 生細胞数 を カ ウ ン ト し た。
< 1 - 3 >. 各酸素濃度条件に よ る
T前駆細胞の培養
胎齢 1 5 日 目 の B 6 系マ ウ ス胎児か ら取得 し た胎児胸腺細 胞 ( 7. 0 X 1 04ce 11 s/ 1 obe) を 2 4穴マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト を用 い、 ピルビ ン酸ナ ト リ ウ ム、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム、 非必須ア ミ ノ 酸 (Gibco社 (製) ) 、 2 - メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ル、 ペニシ リ ン、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン お よ び 1 0 %胎児牛血 清 (Fetal Calf Serum; F C S ) を含有する RPM I- 1640完全培 地中 に加え、 プ レー ト を プラ ス チ ッ ク容器 ( Gaspack; B B L 社 (製) ま た はテ ド ラ ーバ ッ ク ; 生化学工業社 (製) ) 内 に 封入 し容器内 の空気を 二酸化炭素を 5 %、 酸素 を各々 5 %、 2 0 %、 3 0 %、 4 0 %、 6 0 % お よ び 8 0 %含む混合ガス (岩谷産業社 (製) ) で置換し、 3 7 °Cで沈降培養法 ( subni erged culuture) に よ リ 5 日 間培養 し た。
なお、 本発明 と 従来技術 と の比較の ため胎齢 1 5 日 目 の B 6 系マ ウ ス胎児か ら取得し た胎児胸腺細胞 ( 7. 0 X 1 0 " cells/lobe) を 2 4穴マイ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト を 用 い、 ピ ル ビン酸ナ ト リ ウ ム、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム、 非必須ア ミ ノ 酸 ( Gibco社 (製) ) 、 2 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ル、 ペ ニ シ リ ン、 ス ト レ プ ト マ イ シ ンお よ び 1 0 %胎児牛血清 ( Fetal Calf S erum; F C S ) を含有する RPM I - 1640完全培地中 に浮遊さ せた フ ィ ル タ ー (直径 1 3 m m、 細孔サイ ズ 8 m ; Nuc 1 eopo re 社 (製) ) 上で、 3 7 °C、 二酸化炭素濃度 5 % お よ び酸素濃 度 2 0 %条件下で浮遊培養法 ( af loat culture) に よ り 5 日 間培養 し た。
培養後の細胞数は、 前記 1 一 2 と 同様に ト リ パ ン ブル ー染 色阻止法に よ り カ ウ ン ト し た。
結果を表 1 に示 した。 ま た、 各培養細胞群の培養後の 回収 生細胞数 と 栄養培地中溶存酸素濃度の 関係 を調べ る ため培養 後の培地中溶存酸素濃度を、 血液ガス濃度培養装置 ( Stat P rof i le; ノ ィ オメ ディ カル社 (製) ) に よ り 測定 し、 結果 を 図 1 に示 し た。
表 1
Figure imgf000018_0001
従来技術で あ る浮遊培養法 ( af loat culture) で は培養 5 日 目 で約 3 3. 2 X 1 04cel ls/Iobeに増殖 し、 培養前に比べ 約 5 倍の細胞増殖が認め ら れた。
一方、 沈降培養法 ( submerged culuture) で は、 酸素濃度 が 5 % お よ び 2 0 %の下で は、 各々約 2. 4 X 1 0 4 c e 11 s / 1 obeお よ び 3. 7 X 1 0 4cel ls/lobeの細胞増殖が認め ら れる 程度で あ るが、 こ れ ら と は対照的 に酸素濃度が 4 0 %以上の 下では有意に細胞増殖が認め ら れた。 酸素濃度が 4 0 %、 6 0 %お よ び 8 0 % の下では、 各々約 9. 3 X 1 0 4cel ls/lob e、 2 3. 5 1 0 ^118ハ0&6ぉ ょ び 2 8. 8 X 1 0 4cel 1 s
11 obeの細胞増殖が認め られ、 特に酸素濃度が 8 0 %の下で は 培養前に比べ約 4 倍の細胞増殖が達成 さ れ、 煩雑さ を伴い大 量培養に は不適で あ る従来の浮遊培養法 ( afloat cu ure) に比べ遜色はなかつ た。 実施例 2
T前駆細胞の分化 (分化抗原の発現) 前記 1 一 3 と 同様に して、 容器内の空気 を二酸化炭素 を 5 %、 酸素 を各々 5 %、 2 0 %、 4 0 %、 6 0 % お よ び 8 0 % 含む混合ガス (岩谷産業社 (製) ) で置換 し沈降培養法 ( SU bmerged culture) を用いて培養し細胞の分化の状態を調べた。
なお、 本発明 と 従来技術 と の比較の ため前記 1 一 3 と 同様 に し て浮遊培養法 ( af loat culture) を用 いて培養 し分化の 状態を調べた。
ま た対照と し て マ ウ ス成熟 T 細胞を 用 い た。 < 2 - 1 >. 細胞の分布
培養後の T前駆細胞の分化の様子を 捉え る た め フ 口 — サイ ト メ ー タ 一 ( F A C S c a n ; Becton Dickinson社 (製) ) を用 いて細胞の分布を 測定 した。
結果を 図 2 乃至図 7 に示 し た。
本実験で は分化、 成熟を 完了 して い ない状態 に あ る リ ン パ 芽球 (幼若細胞; blastic lymphoid cel l) お よ び分化、 成熟 を 完了 し た直径約 5 乃至 1 0 mの小 リ ン パ球 ( smal l lymp ho id cell) に大別する こ と がで き る細胞の分布を調べる こ と に よ り T前駆細胞の分化、 成熟の状態 を認識す る こ と がで き る,
マ ウ ス成熟 T細胞群 (図 2 ) はその ほ と ん どが小 リ ン パ球 ( smal 1 lymphoid cell) と して観察さ れ、 同様にマ ウ ス胎児 胸腺を酸素濃度 2 0 %条件下で浮遊培養 ( afloat culture) を施し た細胞群 (図 4 ) も ほ と ん どが小 リ ンパ球 ( smal l 1 y mphoid cel l) と し て観察 さ れた。
—方、 マ ウ ス胎児胸腺を 酸素濃度が 5 % お よ び 2 0 % の条 件下で沈降培養 ( submerged culture) を施 し た細胞群 (各々 図 5、 図 6 ) は、 採取直後のマ ウ ス胎児胸腺細胞群 (図 3 ) と 同様にそ の ほ と ん どが リ ンパ芽球 (幼若細胞; blastic 1 y mphoid eel 1 ) と し て観察さ れ分化、 成熟が達成さ れていな い こ と が示 さ れた。
一方、 こ れ ら と は対照的 に、 酸素濃度が 6 0 %条件下 で沈 降培養 ( submerged culture) を施 し た細胞群 (図 7 ) はマ ウ ス成熟 T細胞群 (図 2 ) お よ び酸素濃度が 2 0 %条件下で浮 遊培養 ( afloat culture) を施 し た細胞群 (図 4 ) と 同様に ほ と ん どが小 リ ンパ球 ( smal I lymphoid cel l) と し て観察 さ れ、 T前駆細胞の分化、 成熟の達成が認め ら れた。
< 2 - 2 >. 分化抗原の発現
培養後の T前駆細胞の分化の様子を 捉え る た め マ ウ ス T細 胞の各々 の分化抗原に対す る モ ノ ク ロ ーナル抗体を 用 い た蛍 光色素標識抗体法 に よ り フ ロ ー サイ ト メ ー タ ー ( F A C S c a n ; Becton Dickinson社 (製) ) を 用 い常法 に よ リ マ ウ ス 分化抗原 C D 4 お よ び C D 8 の発現状態を 測定 し た。
なお、 本実験で用 い たモ ノ ク ロ ーナル抗体は、 ピ コ エ リ ス リ ン (phycoerythrine ; P E ) 標識マ ウ ス C D 4 モ ノ ク ロ一 ナ ル抗体 ( ラ ッ ト ノヽ イ ブ リ ド ー マ G K 1. 5 ; Becton Dicki nson社 (製) ) お よ びフ ルォ レ スセ イ ン ( f luorscein i soth iocyanate; F I T C ) 標識マ ウ ス C D 8 モ ノ ク ロ ー ナル抗体 ( ラ ヅ ト ノヽイ ブ リ ド ー マ 5 3. 6. 7 ; Becton Dickinson社 (製) ) であ る。
結果を表 2 お よ び図 8 乃至図 1 5 に示 し た。
表 2
分化抗原発現細胞の割合 (%)
(CD 4およびノまたは CD 8抗原陽性) 気相酸素濃度 細胞群全体に占める blastic lymphoid cell (体積%) 割合 群に占める割合 浮遊培養法 (afloat
culture)
20 97. 9 90. 5 沈降培養 (submerged
culture)
5 16. 7 1 6. 7
20 59. 3 34. 3
40 84. 1 56. 2
60 92. 6 69. 8
80 96. 4 8 1. 1 マ ウ ス成熟 T細胞群 (図 8 ) のほ と ん ど は C D 4 陽性お よ び /ま た は C D 8 陽性であ っ た。 その う ち のほ と ん どは C D 4 陽性 C D 8 陽性であ り、 同様 にマ ウ ス胎児胸腺細胞 を 酸素 濃度が 2 0 %条件下浮遊培養 ( afloat culture) を施 し た細 胞群 (図 1 0 ) も C D 4陽性お よ び/ ま た は C D 8 陽性であ る細胞は全体の 9 0 %以上であっ た。
一方、 マ ウ ス胎児胸腺細胞を 酸素濃度が 5 % お よ び 2 0 % 条件下で沈降培養 ( submerged culture) を施 し た細胞群 (各 々 図 1 1、 図 1 2 ) で はそのほ と ん どが C D 4 陰性 C D 8 陰 性であ り 採取直後のマ ウ ス胎児胸腺細胞群 (図 9 ) と 同様に、 分化抗原表現型上、 未分化細胞の ま ま であ っ た。
こ れ ら と は対照的に、 酸素濃度が 4 0 %条件下で沈降培養 ( submerged culture) を施 し た細胞群 (図 1 3 ) で は全体の 8 0 %以上が C D 4陽性お よびノま た は C D 8 陽性で あ り、 酸素濃度が 6 0 % お よ び 8 0 %条件下で沈降培養 ( submerge d culture) を施 し た細胞群 (各々 図 1 4、 図 1 5 ) で はマ ウ ス成熟 T細胞群 (図 8 ) お よ び酸素濃度が 2 0 %条件下で浮 遊培養 ( afloat culture) を施 し た細胞群 (図 1 0 ) と 同様 に全体の 9 0 %以上が C D 4陽性お よ び ま た は C D 8 陽性 で あ り、 し かも その う ち の ほ と ん どが C D 4 陽性 C D 8 陽性 で あ り 分化抗原表現型上、 T前駆細胞の分化、 成熟の達成が 認め ら れた。
ま た、 沈降培養法 ( submerged cvUture) に おいて、 酸素濃 度が高 く な る に従 い リ ンパ芽球 (幼若細胞; bias tic lympho id cel l) 群に 占め る分化抗原発現細胞の割合が増加 し、 酸素 濃度が 6 0 % お よ び 8 0 %条件下での沈降培養 ( submerged culture) 細胞群で は リ ンパ芽球 (幼若細胞; blastic l ymph oid cel l) 群の 7 0 乃至 8 0 °/0 が分化抗原 を発現 し た。
こ の結果は酸素濃度が 2 0 %条件下で浮遊培養 ( af loat c ulture) を施 し た細胞群中の リ ンパ芽球 (幼若細胞; bl asti c lymph id cel l) 群中 に 占める 分化抗原発現細胞の割合に近 似 してお り、 分化抗原表現型上の分化がほ ぼ完全 に達成 さ れ て いる こ と が示さ れた。
< 2 - 3 >. T細胞受容体の発現
T前駆細胞は分化、 成熟の一つの段階と して細胞膜上 に抗 原受容体 ( T cel l receptor ; T c R ) を 発現す る。 こ の T c R は α、 β、 y およ び 5 鎖と 呼ばれる サ ブユニ ッ ト か ら構 成 され、 分化抗原 の一つであ り、 細胞内 に増殖 シ グナル を伝 達する分子であ る C D 3 と 会合 し C D 3 一 T c R を形成 して い る。 従っ て、 T c R a ^ お よ び T c R ァ 5 の発現 と C D 3 の発現を調べる こ と に よ っ て そ の分化段階 と機能的成熟の度 合 を評価で き る。 ま た、 生体内 で外来抗原 に対す る 認識機構 を 構成す る T細胞 は主 に T c R β を 発現 して い る細胞であ リ、 胸腺は T c R ァ S 系 Τ細胞 よ り は る力 に多 く の T c R a ^ 系 T細胞を生産 し末梢に供給 し てい る。
本実験で は、 マ ウ ス T細胞の分化抗原 C D 3、 T c R a ^ お よび T c R y δ に対する モ ノ ク ロ ー ナル抗体 を 用 い前記 2 一 2 と 同様に し て C D 3、 T c R a /S お よ び T c R ァ S の発 現状態を測定 し た。
なお、 本実験で用 い たモ ノ ク ロ ーナル抗体は、 抗マ ウ ス C D 3 モ ノ ク ロ ー ナル抗体 ( ノヽム ス タ ーノヽイ ブ リ ド ー マ 1 4 5 - 2 C 1 1 ; 生化学工業社 (製) ) 、 抗マ ウ ス T c R a モ ノ ク ロ ー ナル抗体 (ハ ムス タ ー ノヽイ ブ リ ド ー マ H 5 7 - 5 9 7 ) お よ び抗マ ウ ス T c R y S モ ノ ク ロ ー ナル抗体 (ハムス タ ーハイ プ リ ドー マ 3 A 1 0 ) である。 ま た二次抗体 と し て フ ルォ レ スセ イ ン標識ゥ サギ抗ハムス タ ー ィ ム ノ グロ ブ リ ン ( C a 1 t a g社 (製) ) を用 いた.
結果を表 3 に示 し た。
表 3
発現細胞の割合 (%) 気相酸素 (発現細胞数; X 1 0っ 培養形態 濃度
/0 D 3 Ύ c R β T c K r
培養前 2. 3 0. 3 2. 1
/八
( 0. 1 6) ( ϋ, 0 2) \ / (八 0 , 11 5 c: 、
浮遊培養(afloat
c" 1
ulture J Λ
俊 Δ U 0 0. (
( 1 9. 9 ) ( 1 7. 4) ( 1. 7 0 )
4 5. 9 1 1. 3 2 8. 5 ( 0. 9 6 ) ( 0. 24 ) (0. 6 0 ) 沈降培養(submer
ged culture)後 2 0 49. 2 1 9. 3 24. 3
( 1. 7 0 ) ( 0. 6 8 ) (0. 8 5 )
6 0 6 3. 2 4 6. 9 1 4. 4
( 1 2. 6 ) (9. 4 0) (2. 9 0) C D 3 の発現に ついては、 酸素濃度が 6 0 %条件下で沈降 培養 ( submerged cul ture) を施 し た細胞群は 6 3. 2 %力 C D 3 陽性であ り、 酸素濃度が 2 0 %条件下浮遊培養 ( af loat culture) を施 し た細胞群での発現率 5 5. 7 % と 比べ同等 以上であ り、 T前駆細胞の分化が達成 さ れて い る こ と を示 し て い る。
T c 及び T c R y S の発現に つ い ては、 酸素濃度が
2 0 %条件下浮遊培養 ( af loat culture) を施 し た細胞群で は T c R a 3 お よ び T C R Y S の発現は、 各々 4 8. 8 % お よ び 4. 7 %であ り T c R α /9 系 T細胞の分化が選択的 に起 こ っ て い る こ と を 示 し て レ、 る。
—方、 酸素濃度が 5 %お よ び 2 0 %条件下で沈降培養 ( su bmerged cul ture) を施 した細胞群では各々 T c R a /3 の発現 が 1 1. 3 % お よ び 1 9. 3 %、 ま た T c R ァ S の発現力 s 2 8. 5 % お よ び 2 4. 3 %であ り、 主 に T c R γ S 系 T細胞 への分化が支持さ れて お り、 T c R a /5 系 T細胞への分化は 不十分であ っ た.
こ れ ら と は対象 的 に、 酸素濃度が 6 0 % 条件下沈降培養 ( submerged culture) を施 し た細胞群では、 T c R a ^ お よ び T c R γ S の発現が各々 4 6. 9 % お よ び 1 4. 4 % であ リ、 酸素濃度が 2 0 %条件下浮遊培養 ( af loat cu ure) を 施 し た細胞群と 同等に T c R a ^ 系 T 細胞への分化が選択的 に起こ っ てお り、 T前駆細胞の正常な分化が達成 さ れて い る こ と が示さ れた,
更に、 各培養条件で生成 し た C D 3 発現細胞、 T c R a /5 発現細胞お よ び T c R r S 発現細胞の生成細胞数を カ ウ ン 卜 し た結果、 酸素濃度が 5 % お よ び 2 0 %条件下 に 沈降培養 ( submerged culture) を施 し た細胞群では、 C D 3、 T c R α ^ お よ び T c R r S と も十分な生成は認め ら れなかっ たの に封し、 6 0 %条件下に沈降培養 ( submerged culture) を施 し た細胞群で は、 C D 3、 T c R a ^ 陽性細胞数が各々 7 乃 至 1 3 倍、 1 4 乃至 3 9 倍生成 し た。 こ の結果は酸素濃度が 2 0 %条件下浮遊培養 ( afloat culture) を施 し た細胞群の 結果と 同等であ っ た。 実施例 3
機能性 T細胞の生成
ぐ 3 — 1 〉. 機能性 T細胞のマ イ ト ジ ェ ン
に よ る増殖能
リ ンパ球を 活性化 し、 D N A合成お よ び細胞増殖 を 誘引す る物質はマ イ ト ジェン (mitogen; 分裂促進因子) と総称さ れ、 その中の一つ であ る コ ンカ ナノ リ ン A ( concanava 1 i n-A; C o n A ) は 2 — 3 に示 し た T細胞上の抗原認識に関与す る C D 3 — T c R複合体を介 し て作用 し、 T細胞の増殖を誘発す る, C o n A に よ り 誘発さ れる T細胞の増殖は、 C o n A刺 激に よ リ T細胞か ら培養上清に産生 さ れる イ ン タ ー ロ イ キ ン - 2 ( Inter leukin-2; I L 一 2 ) 等のサイ ト 力 イ ン に よ り 維 持さ れて いる.
そ こ で本実験で は、 前記 2 — 3 に示 し た方法 に よ り、 2 4 穴マイ ク 口 タ イ タ 一プ レ ー ト を 用 い各酸素濃度条件下で 5 日 間培養 し た胸腺か ら生.成 し た T 細胞を C o n A ( 1 5 μ g m l ; Vector社 (製) ) お よ び I L一 2 ( 5 0 単位; Genzym e社 (製) ) 存在下、 1 0 % F C S を含有す る RPMI-1640完全 培地中で 9 6 穴マ イ ク ロ タ イ タ ー プレ ー ト を用 い培養 し、 C o n A反応性を有する機能的に成熟し た T 細胞の誘導、 生成 を 検討 し た。
なお、 T細胞の C 0 II A反応性は、 3 日 間の培養 を行い、 培養終了 6 時間前 に各々 1. 0 C i の ト リ チ ウ ム標識サイ ミ ジン (3 H — T d R ) を培地中 に加え、 細胞を ガラ ス フ ィ ル タ ー上に回収 し シンチ レ一タ ー ( Clear-sol i ; ナカ ラ イ テ ク ス社 (製) ) を加え 3 H — T d R の細胞への取 り 込み を液体シ ン チ レ ー シ ヨ ンカ ウ ン タ 一 を用 いて測定 し た。
結果を 図 1 6 に示 し た。
酸素濃度が 5 % お よ び 2 0 %条件下で沈降培養 ( submerge d culture) を施し た細胞群の増殖は、 酸素濃度が 2 0 °/0条件 下浮遊培養 ( af loat culture) を施 し た細胞群の増殖の 1 4 乃至 1 3 で あ る が、 こ れ ら と は対照的 に酸素濃度力 6 0 %条件下沈降培養 ( submerged cul ture) を施 し た細胞群の増 殖は、 酸素濃度が 2 0 %条件下浮遊培養 ( afl oat cul ture) を 施 し た細胞群の増殖 と 同程度であ り、 C o n A反応性 を 有 す る機能的に成熟 し た T細胞が若齢マ ウ ス胸腺内での分化お よ び浮遊培養 ( af loat cul ture) での胎児胸腺内での分化 と 同程度 に誘導、 生成さ れる こ と が示さ れた。
< 3 - 2 >. 機能性 T 細胞のァ ロ ( BALB/Cマ ウ ス )
脾臓細胞 に対す る 反応性 T細胞は胸腺中 で教育を 受け、 非自 己で あ る 異種 (ァ 口 ) マ ウ ス細胞に対す る反応性を獲得 し、 例え ば移植片拒絶を起 こ す。 こ の反応も前記 3 — 1 に記載 し た C 0 η Αの作用 と 同 様 に胸腺内で成熟 し通過 し た Τ細胞上の T c R — C D 3 複合 体 を介す る。
そこ で本実験で は、 前記 2 — 3 に示 し た方法 に よ り、 2 4 穴マイ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト を 用 い各酸素濃度条件下で 6 日 間培養 し た胸腺か ら生成 し た T 細胞を、 出生後 6 週間 目 の BA LB/Cマ ウ ス か ら採取 し た脾臓細胞を マ イ ト マ イ シ ン C ( 2 5 μ g / 3 7 'C、 3 0 分間) で予め処理 し た後 RPM 1-164 0培地で 3 回洗浄 して得 られた細胞浮遊を加え た 9 6 穴マ イ ク ロ タ イ タ 一 プ レ ー ト ( 5 X l 0 5cel ls weI l) を用 い、 ァ ロ 細胞に対 し反応性 を有する T細胞の生成を 検討 し た。
なお、 T細胞の ァ ロ 反応性は、 5 日 間の培養 を行い、 培養 終了 6 時間前に各々 1. の ト リ チ ウ ム標識サイ ミ ジ ン (3 H — T d R ) を培地中 に加え、 細胞 を ガ ラ ス フ ィ ル タ 一 上に回収し シ ンチ レ 一 タ ー ( Clear-sol i ; ナカ ラ イ テ ク ス社 (製) ) を加え 3 H — T d Rの細胞への取 り 込み を液体シ ン チ レ ー シ ヨ ンカ ウ ン タ ー を用 いて測定 し た。
結果を 図 1 7 に示 し た。
酸素濃度が 5 % お よ び 2 0 %条件下で沈降培養 ( submerge d culture) を施 し た細胞群の増殖は、 酸素濃度が 2 0 %条件 下浮遊培養 ( af loat cul ture) を施 し た細胞群の増殖の 1 Z 1 0 乃至 1 5 で あ る が、 こ れ ら と は対照的に酸素濃度が 6 0 %条件下沈降培養 ( submerged cul ture) を 施 し た細胞群の 増殖は、 酸素濃度が 2 0 %条件下浮遊培養 ( af loat ensure) を 施 し た細胞群の増殖 と 同程度であ り、 ァ ロ 反応性を有す る 機能的に成熟 し た T細胞が若齢マ ウ ス胸腺内で の分化お よ び 浮遊培養 ( afloat culture) で の胎児胸腺内で の分化 と 同程 度 に誘導、 生成さ れる こ と が示 さ れた。 実施例 4
T前駆細胞お よび リ ンパ組織間質細胞系 と の 組合せ に よ る T前駆細胞の分化、 成熟
実施例 1 乃至 3 にお いて本発明の技術に よ る マ ウ ス胎児胸 腺 を用 いた T前駆細胞の正常な分化、 成熟の達成 を 示 し た力 本発明 に おいて は各々 同一の ま た は異な る動物種の同一の ま た は各々 異な る個体か ら採取 し た T前駆細胞お よ びその よ う な T前駆細胞を取 り 囲む リ ンパ組織間質細胞系 (胸腺上皮細 胞、 線維芽細胞、 その他の リ ンパ組織間質細胞お よ び ま た は細胞間物質な ど) と を用 いる こ と に よ つ ても T前駆細胞の 正常な分化、 成熟 を達成さ せる こ と がで き る。 こ こ にその一 態様を記載す る。
胎齢 1 5 日 目 の B 6 系胎児マ ウ ス ( 日 本 S L C社 (製) ) か ら取得 し た胸線 を 1. 3 5 m Mの 2 ' — デォ キ シ グア ノ シ ン ( d G u 0 ) お よ び 1 0 °/0胎児牛血清 ( Fetal Calf Serum ; F C S ) を含有する RPMI-1640完全培地中で 6 日 間浮遊培養 ( af loat culture) を 施 し、 培養後更 に d G u 0 を 含有 し な い前記完全培地中 で 1 2 時間浮遊培養 ( af loat cul ture) を 施 し、 血液系細胞の消失 し た胸腺間質細胞系 を 取得 し た。 こ の胸腺間質細胞系 を 9 6 穴丸底プ レ ー ト に ま き、 RPMI - 1 640完全培地を加え ( 2 0 0 i l Zwel l) 、 更に実施例 1 一 2 と 同様に して取得 した T前駆細胞 (マ ウ ス胎児胸腺細胞) を 各々 3 0 eel 1 s/wel 1ま たは 3 0 0 ce I 1 s /we 11ずつカロえ、 プレ ー ト を プラ ス チ ッ ク容器 ( Gaspack; B B L社 (製) ) 内 に封 入 し容器内の空気を二酸化炭素 を 5 %、 酸素を 6 0 %お よ び 窒素を 3 5 %含む混合ガス (岩谷産業社 (製) ) で置換 し沈 降培養 ( submerged culture) に よ り 7 日 間培養 し た。
培養後、 回収 し た細胞お よ び胸腺組織を ス テ ン レ ス製メ ッ シ ュ を用 いて穏やかに細切 し T細胞を 取得 し、 培養後の T前 駆細胞の分化、 成熟の様子 を捉え る た め実施例 2 — 2 と 同様 に してマ ウ ス T細胞分化抗原で あ る C D 4 お よ び C D 8 の発 現状態を測定 し た。
尚、 T前駆細胞 (マ ウ ス胎児胸線細胞) を加えな いで胸腺 間質細胞系のみを 酸素濃度が 6 0 %条件下で沈降培養 ( subra erged culture) し た培養群を対照 と して用 い、 ま た比較のた め マ ウ ス成熟 T細胞を用 い た。
結果を 図 1 8 乃至図 2 0 に示 し た.
マ ウ ス成熟 T細胞群 (図 2 0 ) の ほ と ん どは C D 4 陽性お よ びノま た は C D 8 陽性で あ り、 更に その う ち の ほ と ん どは C D 4 陽性 C D 8 陽性であ っ た。
T前駆細胞 (マ ウ ス胎児胸線細胞) を加えな いで酸素濃度 が 6 0 %条件下沈降培養 ( submerged culture) を 施 し た 群
(図 1 8 ) で は回収さ れた細胞 (胸線上皮細胞 ま た は線維芽 細胞な ども含む) も極めて わずかであ り、 C D 4 陽性お よ び ノま たは C D 8 陽性である細胞もほ とん ど認め られなかっ た。
—方、 各々 別々 に採取 し たマ ウ ス胸腺間質細胞系 と T前駆 細胞 (マ ウ ス胎児胸線細胞 ·) (各々 3 0個お よ び 3 0 0 個) を酸素濃度が 6 0 %条件下沈降培養 ( submerged culture) を 施 した細胞群では、 C D 4 陽性お よ び /ま た は C D 8 陽性細 胞が多 く 認め ら れ、 マ ウ ス胎児胸線細胞が 3 0 個の場合 に は 3 0 乃至 4 0 %が C D 4陽性お よ び/ ま た は C D 8 陽性であ リ、 3 0 0 個の場合 (図 1 9 ) に は 9 0 %以上が C D 4 陽性 C D 8 陽性で あ っ た。
こ の結果はマ ウ ス成熟 T細胞群の結果と 匹敵 し て お り、 各 々 別々 に取得 し た マ ウ ス胎児胸腺細胞 と マ ウ ス胸腺間質細胞 系 と を組み合わせても分化抗原表現型上 T前駆細胞の分化、 成熟が達成 さ れて いる こ と が認め られた。 実施例 5
成熟 T細胞欠損動物モ デル にお け る
異種 T前駆細胞の培養
B前駆細胞及び ま た は T前駆細胞 を増殖、 分化及び成熟 さ せる胸腺機能が欠損 して いる 力 ま た は先天的 に成熟 B細 胞及び / ま た は成熟 T細胞が欠損 して いる 場合 に は、 免疫系 に 関与す る様々 な疾患が引 き起 こ さ れる。 こ の よ う な動物種 に、 成熟 B あ る い は成熟 T細胞 を養子免疫療法的 に投与 し た と しても、 リ ンパ球系前駆細胞 ( B前駆細胞及 び T 前駆細胞 等) が欠損あ る い は胸腺で の増殖、 分化及び成熟過程の異常 に よ り、 任意の抗原特異性 を有す る成熟 B あ る い は成熟 T細 胞 を誘導する こ と がで き な いた め治療学的意味は極めて小さ い, そ こ で、 こ の よ う なモ デル に おけ る本発明の治療学的意 義を検討する ため以下の実験を 行っ た。
B前駆細胞及び T前駆細胞の分化、 成熟能に 障害が有 り、 成熟 B及び成熟 T細胞を欠損し ている マ ウ スモ デルであ る、 出生後 6 週間 目 の S C I D マ ゥ ス (severe combined immuno- def icient mouse; 重症複合免疫不全症マ ウ ス, Fox Chase社
(製) ) か ら、 実施例 1 一 1 と 同様に して無菌的 に胸腺を取 得 した。 取得 し た胸腺を 4 分割 し、 各断片 を、 9 6 穴マ イ ク ロ タ イ タ一プ レ ー 卜 を 用い て RPMI-1640完全培地 に加え た。
さ ら に、 胎齢 1 4 日 目 の C57BL/6系マ ウ ス ( 日 本 S L C 社 (製) ) か ら実施例 1 一 1 及び 1 一 2 と 同様に し て T前駆細 胞 と し て胎児胸腺細胞 を取得 し、 前記 S C I D マ ウ ス胸腺断 片含有 RPMI-1640完全培地に 5 X 1 04 eel 1 s/wel 1ずつ加えた。
該培養プレ ー ト を、 3 7 °C条件下、 二酸化炭素濃度 5 %、 酸素濃度が各々 2 0 % (大気条件下) 、 8 0 %条件下で 7 日 間沈降培養( submerged cu 1 ture)を施 し た。
なお、 T前駆細胞の分化及び成熟効率を 向上 さ せる ため、 放射線処理 ( 2. 5 G r ) に よ り、 S C I Dマ ウ ス胸腺内 に 存在する分化及び成熟能を 有さ ない T前駆細胞 を 除去 し た S C I D マ ウ ス胸腺 を用 いて、 前記と 同様の条件下で培養 を 行 つ た.
培養後の細胞数は、 ト リ パ ン ブルー染色阻止法に よ り カ ウ ン 卜 し た.
結果を表 4 に示 し た。 な お、 値は、 4分割胸腺断片 を 用 い た各実験値の平均値で ある, 表 4 気相濃度 (体積 培養後細胞数 (cel l s/ l obe)
N5 C05 放射線処理 放射線未処理
2 0 7 5 5 . 3 X 1 04
8 0 1 5 5 2 . 8 X 1 04
2 0 7 5 5 1 . 6 X 1 04
8 0 1 5 5 3 . 8 X 1 04
放射線処理及び未処理の胸腺 を用い だ実験で は、 共に酸素 濃度が 8 0 %条件下で培養を施 し た細胞群は、 酸素濃度が 2 0 %条件下 (大気条件下) で培養を施 し た細胞群に比べ 2 倍 以上の T 前駆細胞の生存率 を示 し た。
ま た、 放射線処理ま たは未処理の胸腺を 用いて酸素濃度が 8 0 %条件下で培養を 施し た細胞群で は、 放射線処理胸腺を 用 いた細胞群の方が、 T前駆細胞の有意な生存率を 示 し た。 生存 し た細胞の中 には、 分化、 成熟 し た τ 細胞が見 ら れた。 実施例 6
髙酸素濃度条件に お ける
ヒ ト T前駆細胞の培養
2歳齢の心臓疾患患者の外科手術時に、 心臓に近接す る胸 腺の一部が切除さ れる。 こ の際に取得 さ れた ヒ ト胸腺を 一定 重量 (約 1 0 m g ) に断片化 し た。 作成 し た胸腺断片 ( 5 X 1 0 5celis/胸腺断片) を実施例 1 と 同様に操作 し、 3 7 'Cで、 二酸化炭素濃度 5 %、 酸素濃度が各々 2 0 %、 7 0 %条件下 で 1 4 日 間沈降培養(submerged culture)を 施 し た。
培養後の細胞数は、 ト リ パ ン ブル—染色阻止法に よ リ カ ウ ン 卜 し た.
結果を表 5 に示 し た, 表 5
Figure imgf000036_0001
マ ウ ス胸腺細胞 を用 いた実施例 1 の結果 と 同様に、 ヒ ト胸 腺細胞を 用 いた本実験にお いて も、 酸素濃度が 2 0 %条件下 (大気条件下) で の培養 に比べ、 酸素濃度 が 7 0 %条件下 (髙酸素濃度条件下) では有意 に 2倍以上の細胞の生存維持 が認め ら れた。
実施例 5 及び 6 から得 ら れた結果に よ り、 本発明が、 S C I Dマ ウ ス等の成熟 リ ンパ球欠損モデル動物、 及びヒ ト 胸腺 等の組織において も、 異系 ま た は同系の T前駆細胞か ら正常 成熟 T細胞を誘導する こ と がで き る こ と が示さ れた。 従っ て、 種々 の 自 己免疫疾患あ る い は A I D S (aqu i red i mmuno-de f i ci ency syndrome)等の ウ イ ルス感染に よ る 免疫疾患 に対す る 細胞ワ ク チンや治療薬の研究開発にお け る本発明の応用価値 は髙い と い う こ と がで き る。 実施例 7
気相酸素濃度 と液相溶存酸素濃度
と の相関関係
栄養培地と接す る気相酸素濃度 と該栄養培地中溶存酸素濃 度 と の相関性を検討す る た め以下の実験を 行っ た。
実施例 1 で取得 し た マ ウ ス胎児胸腺 ( 7 X 1 04cel ls/iob e) を 含有 ま た は非含有 RPMI- 1640完全培地 を加えた 9 6 穴マ イ ク ロ タ イ タ一プレ ー ト を プラ スチ ッ ク密閉容器 ( Gaspack; B B L社 (製) ま たはテ ド ラ ー ノ ッ ク ; 生化学工業社 (製) ) 内 に封入 し、 図 2 1 に示す よ う に、 二酸化炭素濃度 を 予め一 定 ( 5 % ) に保ち、 酸素濃度 ( % ) 及 び窒素濃度 ( % ) の混 合比を予め調整 し た混合ガス (岩谷産業社 (製) ) を 該容器 ガス交換 口 か ら 吹き込み容器内 の空気 を十分に置換 し、 3 7 'Cで 1 乃至 5 日 間静置 した。
気相と 液相 と の間で二酸化炭素、 酸素及 び窒素各々 の濃度 が平衡に達し た後、 栄養培地 (液相) の溶存酸素濃度 (mmiig, μ Μ) を、 ガス 自 動分析計 ( N o v a 社 (製) ) を用 いて測 定 し た。
結果を 図 2 1 に示 し た,
栄養培地 (液相) の体積に比較 して、 該栄養培地 と接する 混合ガス (気相) の体積が相封的に十分多 い場合に は、 気相 酸素濃度 と液相溶存酸素濃度と の間に は比例関係が成立 し た。 ま た、 気相の体積が相封的に十分多 く な い場合 に は、 該比例 直線下部 (図 2 1 斜線部) に含ま れる 対応関係も発生 し得る こ と が示さ れた. 以上詳述 し た よ う に、 本発明 に よれば、 T前駆細胞系 を、 栄養培地中の溶存酸素濃度が、 通常の大気下に お け る栄養培 地中溶存酸素濃度 よ リ 髙ぃ条件下に、 例え ば好適な一手段と し て栄養培地 と接する気相の酸素濃度 を 4 0 容量%乃至 9 5 容量% に高め る こ と に よ り 栄養培地中 の溶存酸素濃度 を 高め た条件下 に培養す る こ と に よ り、 in V i t r 0に お いて特殊な器 具 を必要 と する こ と な く 細胞ま た は組織の一般的な培養方法 で あ る沈降 (懸濁) 培養法 ( submerged (suspension) cultu re) に よ り、 T系列細胞の大量培養は も と よ り、 Τ前駆細胞 の増殖お よ び分化抗原表現型上 ま た は機能上の正常な分化、 成熟の過程を再現 し、 且つ分化抗原表現型上ま た は機能上成 熱 し た任意の抗原認識能を 有す る Τ細胞を 誘導、 生成さ せる こ と がで き、 T系列細胞の分化、 成熟機構の詳細 を 解明す る こ と が可能であ る。
さ ら に は、 本発明の方法 を用 い、 Τ前駆細胞系 を、 肝炎 ゥ イ ソレス ある いは H I V ( human immuno-def i c i ency virus) な ど に よ る感染症、 ア レ ルギ ー疾患 ま た は 自 己免疫疾患 を 惹起 す る抗原 を含有す る栄養培地中 で培養する こ と に よ リ 該抗原 を認識す る T細胞を誘導す る こ と がで き、 該抗原が惹起す る 感染症、 ア レルギ ー疾患お よび 自 己免疫疾患の症状 を抑制ま た は治療す る こ と がで.き る任意の T細胞ヮ ク チ ン を 製造す る こ と がで き る,

Claims

請求の範囲
1. T前駆細胞系 を、 栄養培地中 の溶存酸素濃度が、 通 常の大気下 にお け る栄養培地中溶存酸素濃度よ リ 髙ぃ条件下 に培養す る こ と を 特徵 と す る T前駆細胞系の培養方法.
2. T前駆細胞系が、 T前駆細胞 を含む組織で あ る請求 の範囲第 1 項に記载の培養方法.
3. T前駆細胞系力 T前駆細胞及び リ ン パ組織間質細 胞系と か ら な る請求の範囲第 1 項に記載の培養方法.
4. T前駆細胞系が、 T前駆細胞であ る請求の範囲 1 記 載の培養方法.
5. T前駆細胞及びリ ンパ組織間質細胞系が、 各 々 同一 動物種の同一 ま た は各々異なる 個体由来で ある 請求の範囲第 3 項に記載の培養方法.
6. T前駆細胞及び リ ンパ組織間質細胞系が、 各 々 異種 動物種の同一ま た は各々異な る 個体由来で あ る請求の範囲第 3 項に記載の培養方法.
7. 栄養培地中の溶存酸素濃度が、 通常の大気下 に おい て、 温度が 3 6 乃至 3 8 'Cの状態下に おけ る栄養培地中溶存 酸素濃度 よ り 高い条件下に培養する こ と を 特徴 と す る請求の 範囲第 1 項に記載の培養方法.
8. 栄養培地中の溶存酸素濃度が、 栄養培地 と 接す る気 相の全圧力 S l a t m、 該気相の酸素分圧が 0. 4 a t mであ リ 温度が 3 6 乃至 3 8 'Cの状態下 にお け る 栄養培地中溶存酸 素濃度 よ リ 高い条伴下 に培養す る こ と を特徴と す る 請求の範 囲第 7項に記載の培養'方法.
9. 栄養培地 と接する 気相の酸素濃度が 4 0 容量%乃至 9 5容量 0 /0であ る こ と を特徵と する請求の範囲第 1 項に記載 の培養方法.
1 0. 栄養培地が感染症、 ア レルギ ー疾患ま た は 自 己免疫 疾患を惹起す る抗原を 含有 して いる栄養培地で あ る請求の範 囲第 1 項に記載の培養方法.
1 1. 請求の範囲第 1 0 項に記載の方法 に ょ リ 産生 さ れた T細胞.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0797450A4 (en) * 1994-12-01 2000-02-02 New England Deaconess Hospital In vitro t-lymphopoiesis system
JP3818324B2 (ja) * 1996-03-26 2006-09-06 三菱瓦斯化学株式会社 ガス濃度調節剤及び低酸素濃度環境の調節方法
US8022058B2 (en) 2000-05-10 2011-09-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US7393652B2 (en) 2000-05-10 2008-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for identifying a chemical compound that directly enhances binding of FKBP12.6 to PKA-phosphorylated type 2 ryanodine receptor (RyR2)
US7879840B2 (en) 2005-08-25 2011-02-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US7718644B2 (en) 2004-01-22 2010-05-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-arrhythmic and heart failure drugs that target the leak in the ryanodine receptor (RyR2) and uses thereof
US7544678B2 (en) 2002-11-05 2009-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-arrythmic and heart failure drugs that target the leak in the ryanodine receptor (RyR2)
AU2004220548A1 (en) 2003-03-07 2004-09-23 The Trustees Of Columbia University, In The City Of New York Type 1 ryanodine receptor-based methods
US8710045B2 (en) 2004-01-22 2014-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the ryanodine receptors
US7704990B2 (en) 2005-08-25 2010-04-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US20210008120A1 (en) 2018-03-13 2021-01-14 Oxacell Ag Cell products with improved stability and uses thereof
US12241086B2 (en) * 2020-04-15 2025-03-04 Amgen Inc. Process for generating genetically engineered autologous T cells

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61166393A (ja) * 1985-01-14 1986-07-28 Mitsubishi Chem Ind Ltd Bリンパ球及び/又はtリンパ球の培養法
JPH02131572A (ja) * 1988-11-11 1990-05-21 Ihara Chem Ind Co Ltd リンフォカイン活性化キラー細胞及びその製造法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4284724A (en) * 1977-08-25 1981-08-18 Hideki Fukuda Method of highly concentrated cultivation of yeasts
DE2940446C2 (de) * 1979-10-05 1982-07-08 B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen
US4448879A (en) * 1981-03-26 1984-05-15 Hooper Trading Company High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2
JPS6192566A (ja) * 1984-10-12 1986-05-10 Wakunaga Seiyaku Kk 抗体産生細胞の調製方法
US4720462A (en) * 1985-11-05 1988-01-19 Robert Rosenson Culture system for the culture of solid tissue masses and method of using the same
ATE82588T1 (de) * 1986-04-28 1992-12-15 Endotronics Inc Zuchtverfahren fuer leukocyten.
EP0420876A1 (en) * 1988-05-23 1991-04-10 Massachusetts Institute Of Technology Growth of animal cells at high oxygen concentration
JP2870851B2 (ja) * 1989-09-21 1999-03-17 富士レビオ株式会社 ヒト成熟t細胞株
US5147784A (en) * 1990-04-12 1992-09-15 Systemix, Inc. T-lymphocyte progenitor cell assay

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61166393A (ja) * 1985-01-14 1986-07-28 Mitsubishi Chem Ind Ltd Bリンパ球及び/又はtリンパ球の培養法
JPH02131572A (ja) * 1988-11-11 1990-05-21 Ihara Chem Ind Co Ltd リンフォカイン活性化キラー細胞及びその製造法

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Publication number Publication date
CA2090677C (en) 1996-08-27
EP0552372A4 (en) 1994-11-30
US5476780A (en) 1995-12-19
KR0152100B1 (ko) 1998-10-01
KR930702508A (ko) 1993-09-09
CA2090677A1 (en) 1993-01-05
US5792655A (en) 1998-08-11
ATE180830T1 (de) 1999-06-15
DE69229333D1 (de) 1999-07-08
EP0552372A1 (en) 1993-07-28
EP0552372B1 (en) 1999-06-02

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