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WO1993000907A1 - Verwendung eines antibiotikums des typs 2-desoxystreptamins - Google Patents

Verwendung eines antibiotikums des typs 2-desoxystreptamins Download PDF

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WO1993000907A1
WO1993000907A1 PCT/AT1992/000087 AT9200087W WO9300907A1 WO 1993000907 A1 WO1993000907 A1 WO 1993000907A1 AT 9200087 W AT9200087 W AT 9200087W WO 9300907 A1 WO9300907 A1 WO 9300907A1
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intron
deoxystreptamine
introns
antibiotic
group
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PCT/AT1992/000087
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Inventor
Uwe Von Ahsen
Julian Davies
Renée Schroeder
Original Assignee
Ahsen Uwe
Julian Davies
Schroeder Renee
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the invention relates to the use of an antibiotic of the type 2-deoxystreptamine. So far, pathogens or other microorganisms which have a damaging effect on the human or animal organism have been treated by antibiotics, depending on the type of antibiotics either a larger spectrum being covered, that is to say so-called broad-spectrum antibiotics, or with a precise knowledge of the patient -unit antibiotics are used, which are specifically based on bacteria and the like. are directed. All these antibiotics have the disadvantage that they are very widely spread, i.e. act unspecifically, so that those organisms are damaged which the human or animal body needs to live, i.e. which live in symbiosis with the human organism. A particularly good example of this are the intestinal bacteria that humans need to digest food. These intestinal bacteria are also killed or at best only damaged by the antibiotics used up to now.
  • Group 1 introns are mainly found in prokaryotes and individual eukaryotes. That that is to say that the organisms which usually appear as pathogens or other pests are essentially those which contain group 1 introns. Thus, if those organisms that contain group 1 introns can be prevented from growing in a targeted manner, harmful organisms can be targeted in a targeted manner without damaging the organisms necessary for human life.
  • the invention therefore lies in the use of an antibiotic of the type 2-deoxystreptamine, in particular a 4,6 or 4,5, 2-deoxystreptamine substituted with amino sugar to inhibit the growth of group 1 introns. tendency organisms, in particular in a method for producing a medicament.
  • an antibiotic of the 4,6-substituted 2-deoxy streptamine type can be gentamicin (B, Cl, Cla, C2), kanamycin (A, B, C), Tobra-5 mycin or amikamycin.
  • Neomycin B, paromomycin, ribostamycin, lividomycin or butirosin can be used as the antibiotic of the 4,5-substituted 2-deoxystreptamine type. Because of their bactericidal activity, the antibiotics mentioned can be used against gram-negative and against gram-positive bacteria in the clinical and generally antimicrobial field (see publication by Davis & Yagisawa, 1983; Cundcliffe, 1990).
  • 2-deoxystreptamine inhibits the self-excision of Group 1 intron RNA from their exons.
  • the coding region of a gene is interrupted by non-coding regions, the introns. These introns and the coding areas, the exons, are overwritten during transcription from the DNA into the RNA and the introns are now spliced out at the RNA level.
  • the coding regions are ligated together again so that a functional gene product, the protein, is formed.
  • the group 1 introns can be described as follows:
  • RNA can have a characteristic secondary structure, these pairings being denoted from P1 to P10, depending on the affiliation to a specific subgroup within group 1 introns. Sequence preservation is less important than structural preservation (see Burke et al., 1987).
  • the splicing mechanism is initiated by an external cofactor, guanosine. It is generally believed that the hydroxyl group of the ribose of guanosine is attached to the phosphorus ester bond of the last NuMeotide of the previous one Exons and the first nucleotide of the intron makes a nucleophilic attack and is covalently bound to the 5 'end of the intron RNA. The released hydroxyl at the 3 'end of the previous exon in turn attacks the phosphorus ester bond between the last nucleotide of the intron and the first nucleotide of the subsequent exon, breaks it open and ligates to the exon, the intron is released. There are two reesterifications.
  • Group 1 introns are able to carry out this process autocatalytically, ie without the addition of proteins, in vitro.
  • a number of Group I introns have been shown to require proteins in vivo for the splicing process (see Cech, 1990).
  • the occurrence of group 1 introns extends from the nuclear genome of never eukaryotes, mitochondria from lower fungi, chloroplasts to eubacteria, bacteriophages and archaebacteria.
  • Group 1 introns have not been found in higher eukaryotes. Their occurrence is not limited to genes coding for proteins, they also occur in genes for tRNA and rRNA. A recent and comprehensive compilation of the occurrence and the splicing mechanism can be found in the publication by Michel & Westhoff, 1991.
  • the medicaments produced according to the invention can thus generally be used to inhibit the growth of organisms which contain a group 1 intron and are normally not sensitive to the antibiotics mentioned.
  • the use of these drugs is said to extend particularly to the therapeutic field, the site of action of the antibiotics mentioned being of interest to the intron RNA and not to the ribosomal RNA.
  • FIG. 1 shows various radiographs of introns which have been cleaved by means of guanosine triphosphate (hereinafter referred to as GTP), the effect of the antibiotic being shown.
  • GTP guanosine triphosphate
  • 2 illustrates the cleavage process of the preRNA and the ligation of the two exons with cleavage of the linear intron.
  • 3 shows the basic structural formulas of the most important antibiotics used, the effectiveness limit being given below the individual groups with regard to the antibiotics tested.
  • FIG. 4a shows the secondary structure of the core region, which shows the 3 'interface of the td intron (FIG. 4a) and the sunY intron (FIG. 4b).
  • the procedure for measuring the effect of antibiotics on group 1 introns was carried out as follows:
  • the gene used for this procedure is the thymidylate synthase from the
  • Coliphagen T4 The gene was cloned into the vector pTZ18U (company USB) with a truncated intron delta P6 (Schroeder et al. 1991). To produce the non-spliced precursor, the plasmid is linearized with EcoRI and transcribed in vitro. The transcription conditions are as follows: 1 ⁇ g DNA in a volume of 20 ⁇ l at 30 ° C.
  • RNA precursor is then purified by gel electrophoresis (5% acrylamide / 7M urea in Tris-Borate-EDTA).
  • RNA precursor For the antibiotic inhibition test, 20,000 cpm of RNA precursor are placed in 5 ⁇ l of splicing buffer (2.5 ⁇ M GTP, 40 / M Tris-HCl, 8mM MgCl 2 , 0.4 mM spermidine), with increasing amounts of antibiotic (usually 0.1 ⁇ M to 2 mM) incubated at 37 ° C for 10 minutes.
  • the reaction mixture is then precipitated by adding 45 ⁇ l stop solution (2.5 mM EDTA, 0.1 mg / ml yeast tRNA) and 150 ⁇ l 0.3 M NaOAc / ethanol. After resuspension in 5 ⁇ l of water and heating to 65 ° C.
  • FIG. 1A shows the analogous relationships with respect to sunY intron.
  • FIG. IC shows a parallel experiment with a group 2 intron, and it can clearly be seen that the preRNA is split here into the linear intron (L intron) and into the ligated E1, E2 exons, regardless of the Antibiotic concentration.
  • gentamicin was used, which, as can be seen from FIGS. 1A and 1B, specifically inhibits group 1 introns.
  • FIGS. ID and 1E also show, a tobramycin being used instead of the gentamicin in FIG. 1 and paromomycin in the embodiment according to FIG. 1E.
  • preRNA means the RNA tested, In-E2 the connection of intron with exon 2, L-In the linear intron, E1-E2 the ligated exons El and E2 and El alone exon 1.
  • the two exons E1 and E2 are indicated by the strong bars, the splitting mechanism of the preRNA being represented by the treatment with GTP. It can be seen that in the first step exon 1 is split off from the intron exon 2 fragment.
  • the cleavage is initiated by the exogenous guanosine (G-OH), the guanosine attacking the G bond side, cutting open on the 5 'cleavage side by nucleophilic attack and covalently connecting to the first nucleotide of the intron .
  • G-OH exogenous guanosine
  • the OH group attaches itself to the exon El on the 3 'side.
  • the guanosine attacks the 5 'side of exon 2, the linear guanosine being cut out.
  • the two exons E1 and E2 are then ligated, and the intron, which contains the guanosine at its ends, is separated.
  • 3A to 3C show a series of 2-deoxystreptamine compounds with which the tests shown in FIG. 1 were carried out. Both Concentrations were given the best concentration of activity for the individual substances.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Antibiotikums des Typs 2-Desoxystreptamin, insbesondere eines 4,6 bzw. 4,5 mit Aminozuckern substituierten 2-Desoxystreptamins, zur Hemmung des Wachstums von Gruppe I Introns enthaltenden Organismen, insbesondere in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments.

Description

Verwendung eines Antibiotikums des Typs 2-Desoxystreptamins
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Antibiotikums des Typs 2-Desoxystreptamins. Bisher werden Krankheitserreger bzw. sonstige Mikroorganismen, die auf den menschlichen bzw. tierischen Organismus schädigende Wirkung haben, durch Anti¬ biotika behandelt, wobei je nach Art der Antibiotika entweder ein größeres Spektrum abgedeckt wird, also sogenannte Breitbandantibiotika, oder aber bei genauer Kenntnis des Krank-heitserregers Antibiotika eingesetzt werden, die speziell auf Bakterien u.dgl. gerichtet sind. All diese Antibiotika haben den Nachteil, daß sie sehr weit gestreut, d.h. unspezifisch wirken, sodaß auch jene Organismen geschädigt werden, die der menschliche bzw. tierische Körper zum Leben benötigt, die also in Symbiose mit dem menschlichen Organismus leben. Ein besonders gutes Beispiel dafür sind die Darmbakterien, die der Mensch zur Verdauung der Nahrung benötigt. Auch diese Darmbakterien werden durch die bisher eingesetzten Antibiotika abgetötet bzw. im besten Fall nur geschädigt.
Es ist daher seit langem das Bestreben der Wissenschaftler, Antibiotika zu ent¬ wickeln, welche gezielt auf bestimmte Mikroorganismen anwendbar sind.
Es hat sich nun gezeigt, . daß unterschiedliche Reaktionen zwischen Antibiotika und Organismen auftreten, und zwar abhängig davon, ob in der Ribosomen-RNA Introns der Gruppe 1 enthalten sind. Gruppe 1 Introns sind vor allem in Prokaryonten und einzelnen Eukaryonten enthalten. D.h. also, daß die üblicherweise als Krank¬ heitserreger oder sonstige Schädlinge auftretenden Organismen im wesentlichen jene sind, welche Gruppe 1 Introns enthalten. Wenn also jene Organismen gezielt am Wachstum gehindert werden können, welche Gruppe 1 Introns enthalten, so können damit gezielt schädliche Organismen bekämpft werden, ohne daß für das menschliche Leben notwendige Organismen geschädigt werden.
Der Erfindung liegt daher in der Verwendung eines Antibiotikums des Typs 2-Desoxystreptamins, insbesondere eines 4,6 bzw. 4,5, mit Aminozucker substituier- ten 2-Desoxystreptamins zur Hemmung des Wachstums von Gruppe 1 Introns enthal- tenden Organismen, insbesondere in einem Verfahren zur Herstellung eines Medika¬ ments.
Vorteilhafterweise kann als Antibiotikum vom Typ des 4,6 substituierten 2-Desoxy streptamins Gentamicin (B, Cl, Cla, C2), Kanamycin (A, B, C), Tobra- 5 mycin oder Amikamycin eingesetzt werden. Als Antibiotikum vom Typ des 4,5 substituierten 2-Desoxystreptamins kann Neomycin B, Paromomycin, Ribostamycin, Lividomycin oder Butirosin eingesetzt werden. Die angeführten Antibiotika können wegen ihrer bakteriziden Wirkung gegen gram-negative als auch gegen gram-positive Bakterien im klinischen und generell antimikrobiellen Bereich eingesetzt werden (sie- he dazu Veröffentlichung von Davis & Yagisawa, 1983; Cundcliffe, 1990).
Die Wirkung des 2-Desoxystreptamins liegt darin, daß sie die Selbstexzision von Gruppe 1 Intron RNA aus deren Exons inhibieren. Der codierende Bereich eines Gens wird nämlich in vielen Fällen von nichtcodierenden Bereichen, den Introns, unterbrochen. Diese Introns und die codierenden Bereiche, die Exons, werden bei der Transkription von der DNA in die RNA überschrieben und die Introns nun auf RNA- Ebene herausgespleißt. Für die nachfolgende Translation ist es essentiell, daß die codierenden Bereiche wieder zusammen ligiert werden, damit ein funktionelles Gen¬ produkt, das Protein, entsteht. Aufgrund des Spleißmechanismus, der angenommenen RNA-Sekundär- bzw. Tertiärstruktur und dem Vorkommen in den Organismen kön- nen die Gruppe 1 Introns folgendermaßen beschrieben werden:
Sie haben einen Satz von konservierten Sequenzen, deren Bereiche mit P, Q, R, S bezeichnet werden, wobei der Abstand zwischen diesen Bereichen unterschied¬ lich groß sein kann. Die RNA kann aufgrund von Paarungsmδglichkeiten eine cha¬ rakteristische Sekundärstruktur aufweisen, wobei diese Paarungen von Pl bis P10 bezeichnet werden, und zwar abhängig von der Zugehörigkeit zu einer bestimmten Untergruppe innerhalb der Gruppe 1 Introns. Es kommt dabei weniger auf Sequenz¬ konservierung als auf Strukturkonservierung an (siehe dazu Burke et al., 1987).
Der Spleißmechanismus wird durch einen externen Kofaktor, Guanosin, einge¬ leitet. Dabei wird allgemein angenommen, daß die Hydroxylgruppe der Ribose des Guanosins an die Phosphoresterbindung des letzten NuMeotids des vorhergehenden Exons und des ersten Nukleotids des Introns einen nukleophilen Angriff unternimmt und dabei kovalent an das 5 ' Ende der Intron RNA gebunden wird. Das freigesetzte Hydroxyl am 3' Ende des vorhergehenden Exons wiederum greift die Phosphorester¬ bindung zwischen dem letzten Nukleotid des Introns und dem ersten Nukleotik des nachfolgenden Exons an, bricht diese auf und ligiert sich an das Exon, das Intron wird freigesetzt. Es handelt sich um zwei Umesterifizierungen. Einige Gruppe 1 In¬ trons sind in der Lage, diesen Prozeß autokatalytisch, d.h. ohne Zugabe von Protei¬ nen, in vitro durchzuführen. Für eine Reihe von Gruppe I Introns ist gezeigt worden, daß in vivo Proteine für den Spleißprozeß notwendig sind (siehe Cech, 1990). Das Vorkommen der Gruppe 1 Introns erstreckt sich vom Kerngenom von nie¬ deren Eukaryonten, Mitochondrien von niederen Pilzen, Chloroplasten bis zu Eubak- terien, Bakteriophagen und Archaebakterien. Gruppe 1 Introns sind nicht in höheren Eukaryonten gefunden worden. Ihr Vorkommen ist nicht auf für Proteine kodierende Gene beschränkt, sie kommen auch in Genen für die tRNA und rRNA vor. Eine rezente und umfassende Kompilation des Vorkommens und des Spleißmechanismus findet sich in der Publikation von Michel & Westhoff, 1991.
Die erfindungsgemäß hergestellten Medikamente können somit generell für die Hemmung des Wachstums von solchen Organismen verwendet werden, die ein Grup¬ pe 1 Intron enthalten und normalerweise nicht sensitiv gegen die angeführten Antibio- tika sind. Die Anwendung dieser Medikamente soll sich dabei besonders auf den therapeutischen Bereich erstrecken, wobei der Wirkungsort der genannten Antibiotika an der Intron RNA und nicht an der ribosomalen RNA interessant ist.
Der Wirkmechanismus des Antibiotikums auf Gruppe 1 Introns wird nachste¬ hend anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Fig. 1 zeigt verschiedene Radiograph-Darstellungen von Introns, die mittels Guanosintriphosphat (im folgenden GTP bezeichnet) gespalten wurden, wobei die Wirkung des Antibiotikums gezeigt ist. Fig. 2 veranschaulicht den Spaltvorgang der preRNA und die Ligierung der beiden Exons unter Abspaltung des linearen Introns. Fig. 3 gibt die Grundstrukturformeln der wichtigsten eingesetzten Antibiotika wieder, wobei unterhalb der einzelnen Grup- pen bezüglich der getesteten Antibiotika die Wirksamkeitsgrenze angeführt ist. Fig. 4 k
zeigt die Sekundärstruktur der Core-Region, die die 3' Schnittstelle von dem td- Intron (Fig. 4a) und dem sunY-Intron (Fig. 4b) zeigt.
Das Verfahren zur Messung der Wirkung von Antibiotika auf Gruppe 1 Introns wurde dabei wie folgt durchgeführt: Das zu diesem Verfahren verwendete Gen ist die Thymidylatsynthase aus dem
Coliphagen T4. Das Gen wurde in den Vektor pTZ18U (Firma USB) mit einem ver¬ kürzten Intron delta P6 kloniert (Schroeder et al. 1991). Zur Herstellung der unges- pleißten Vorstufe wird das Plasmid mit EcoRI linearisiert und in vitro transkribiert. Die Transkrip-tionsbedingungen sind wie folgt: 1 μg DNA in einem Volumen von 20 μl bei 30° C für 1 Stunde in einem Puffer aus 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,4 mM Spermidine, 5 mM DTT, 10 Einheiten T7 RNA Polymerase (Strata- gene), 10 /_ Ci (Alpha-35S)-CTP (Amersham) und 10 Einheiten RNase Inhibitor (Boehringer Mannheim). Die RNA Vorstufe wird dann mittels Gelelektrophorese (5 % Acrylamide/7M Harnstoff in Tris-Borat-EDTA) gereinigt. Für den Antibiotika- Inhibierungstest werden 20.000 cpm RNA Vorstufe in 5 μl Spleißingpuffer (2,5 μM GTP, 40 /M Tris-HCl, 8mM MgCl2, 0,4 mM Spermidine), mit steigenden Mengen Antibiotikum (in der Regel 0,1 μM bis 2 mM) für 10 Minuten bei 37° C inkubiert. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mittels Zugabe von 45 μl Stoplδsung (2,5 mM EDTA, 0,1 mg/ml Hefe tRNA) und 150 μl 0.3 M NaOAc/Äthanol gefallt. Nach Resuspension in 5 μl Wasser und Erhitzen auf 65° C für 5 Minuten mit weiteren 5 μl Denaturierungsmix (100 % Formamid, 0,1 % Bromphenolblau, 0,1 % Xylenxyanol) werden die Reaktionsprodukte wie oben beschrieben auf einem 5 % Acrylamidgel/7M Harnstoff aufgetrennt und mit einem Röntgenfilm sichtbar ge¬ macht. Aus den Fig. 1A bis 1E ist die Inhibierungswirkung des 2-Desoxystreptamins auf Gruppe 1 Introns erkennbar, wobei insbesondere aus Fig. 1A ersichtlich ist, daß das Gentamicin zwar die Auftrennung in zwei Bruchstücke, von welchen das eine Exon El und das andere die Verbindung Intron E2 ist, zuläßt, jedoch das Abspalten des Introns vom E2 Exon und die Ligierung der beiden Exons behindert. In der Fig. 1A ist erkennbar, daß selbst bei ganz niedrigen Dosierungen von GTP bereits eine Aufspaltung auftritt, daß jedoch auch dann bereits bei niedrigen Gentamicin- Konzentrationen die Abspaltung des Introns und die Ligierung der beiden Exons be¬ hindert wird. Fig. 1B zeigt die analogen Verhältnisse in bezug auf sunY Intron. Fig. IC gibt einen Parallelversuch mit einem Gruppe 2 Intron wieder, und es ist klar er- kennbar, daß hier die Aufspaltung der preRNA in das lineare Intron (L Intron) und in die ligierten El, E2 Exons erfolgt, und zwar unabhängig von der Antibiotika- Konzentration. Im vorliegenden Fall wurde Gentamicin verwendet, welches, wie aus den Fig. 1A und 1B ersichtlich, Gruppe 1 Introns gezielt hemmt. Die Verfahrensbe¬ dingungen waren in allen angeführten Ausführungsformen die gleichen. Ähnliches wie Fig. 1A zeigen auch die Fig. ID und 1E, wobei in Fig. ID anstelle des Gentami- cins ein Tobramycin und beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1E Paromomycin eingesetzt wurde.
Bei allen beiliegenden Beispielen bedeutet preRNA die getestete RNA, In-E2 die Verbindung von Intron mit Exon 2, L-In das Linearintron, E1-E2 die ligierten Exons El und E2 und El alleine Exon 1.
Bei der Darstellung in Fig. 2 werden durch die starken Balken die beiden Exons El und E2 angedeutet, wobei der Aufspaltmechanismus der preRNA durch die Be¬ handlung mit GTP wiedergegeben ist. Es ist erkennbar, daß im ersten Schritt das Exon 1 von dem Bruchstück Intron-Exon 2 abgespalten wird. Im ersten Schritt der Aufspaltung wird durch das exogene Guanosin (G-OH) das Aufspalten eingeleitet, wobei das Guanosin die G-Bindungsseite angreift, auf der 5'-Spaltseite durch nukleo- philes Angreifen aufschneidet und kovalent mit dem ersten Nukleotid des Introns verbunden wird. Die OH-Gruppe lagert sich dabei an das Exon El an der 3 ' Seite an. Dann greift das Guanosin die 5' Seite des Exons 2 an, wobei das lineare Guanosin herausgeschnitten wird. In einem zweiten Schritt erfolgt dann die Ligierung der bei¬ den Exons El und E2, und das Intron, das an seinen Enden jeweils das Guanosin enthält, liegt herausgetrennt vor.
In den Fig. 3A bis 3C sind eine Reihe von 2-Desoxystreptaminverbindungen angeführt, mit welchen die in Fig. 1 angeführten Tests durchgeführt wurden. Bei den Konzentrationen wurde die beste Wirkungskonzentration zu den einzelnen Substanzen angegeben.
Fig. 4 zeigt die sekundäre Struktur der Kemregion, die die 3' Spaltstelle um¬ gibt, und zwar unter A das td-Intron und unter B das sunY-Intron. Die dargestellte Konfiguration zeigt die Situation knapp vor der zweiten Stufe der Aufspaltung (die 5' Spaltseite ist abgespalten, das letzte G des Introns befindet sich auf der G- Bindungsseite. Die Paarungs-elemente Pl, P7, P9 und P10 sind entsprechend ange¬ deutet. Dieses Modell wurde von der Tetrahymenastruktur abgenommen, wie sie von Michel et al. (9) angeführt wird. Die oben angeführten Buchstaben betreffen das Intron, und die unten angeführten Buchstaben die Exonreste. Die Nummern neben den beiden Resten geben die Nukleotidposition im Intron wieder. Der G-Rest ist die Guanosin-Bindungsseite (9).

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung eines Antibiotikums des Typs 2-Desoxystreptamin, insbesonde¬ re eines 4,6 bzw. 4,5 mit Aminozuckern substituierten 2-Desoxystremptamins, zur Hemmung des Wachstums von Gruppe I Introns enthaltenden Organismen, insbeson¬ dere in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments.
2. Verwendung nach Anspruch 1, mit der Maßgabe, daß als Antibiotikum vom Typ des 4,6 substituierten 2-Desoxystreptamins Gentamicin (B, Cl, Cla, C2) Kana- mycin (A, B, C), Tobramycin oder Amikamycin eingesetzt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1, mit der Maßgabe, daß als Antibiotikum vom
Typ 4,5 des substituierten 2-Desoxystreptamins Neomycin B, Paramomycin, Ribosta- mycin, Lividomycin oder Butirosin eingesetzt wird.
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