WO1992019755A1

WO1992019755A1 - MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN β2-GLYCOPROTEIN I AND USE THEREOF

Info

Publication number: WO1992019755A1
Application number: PCT/JP1992/000528
Authority: WO
Inventors: Takao Koike; Eiji Matsuura; Hisato Nagae
Original assignee: Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha
Priority date: 1991-04-24
Filing date: 1992-04-23
Publication date: 1992-11-12
Also published as: AU1673292A

Description

明細ヒト / S 2-グリコプロテイン I に対するモノクローナル抗体およびその用途技術分野

本発明は、ヒト；82-グリコプロテイン I に特異的に反応するモノクロ一ナル抗体およびその用途に関するものである。

背景技術

抗カルジオリピン抗体の測定に関しては、ノヽリスらによる R I Α法（ Lancet i i i： 1211, 1983) 、小池らによる E L I S A法 (Clin, Exp. Immunol. ,56 :193, 1984 ) など、種々の測定方法が報告されている。

しかし、これらの従来法では抗カルジォリピン抗体を定量的に測定できなかったり、感染症由来の抗体と抗リン脂質抗体症候群由来の抗体とを区別して測定できないといった問題を有し、必ずしも満足できるものではなかつた ₀

最近、松浦らは抗リン脂質抗体症候群由来の抗カルジオリピン抗体はカルジオリピンに直接結合するのではなく、カルジォリピンと /32-グリコプロテイン I (別名：アポリポプロテイン H ) との複合体に対して結合性を示すことを見い出した。そして、この原理を利用した抗カルジオリピン抗体の測定法を開発した（Lancet, 336 ： 177, 1,990, 臨床免疫， 22(Suppl.15) :170, 1990) 。この抗カルジオリピン抗体の測定法は前述した従来法の問題点を克服しうる極めて優れた方法であり、今後臨床の場において広く利用されていくものと考えられる。 5 抗カルジオリピン抗体症候群由来の抗カルジオリピン抗体は上述したようにカルジオリピンと S 2-グリコプロティン I との複合体に対して結合性を有することが明らかにされてきたものの、その臨床的意義については未だに不明でめる。

10 抗カルジオリピン抗体の結合性に関する臨床的意義を明らかにすることは、抗カルジオリピン抗体症候群の発症メカニズムの解明にもつながりうることであり、今後の重要課題と考えられている。

この課題を解決するための第一歩として、抗カルジォ

15 リピン抗体が結合する抗原の構成成分の 1 つである /32- グリコプロテイン I を正確に測定することが重要であるが、従来この目的を達成できる方法は報告されていない。すなわち、 yS 2-グリコプロテイン I に対するゥサギ抗血清（ポリクロ一ナル抗体）は既に知られているものの

9/ (発売元： D I A GN O S T I C A S TA G O) 、この抗血清がヒト 2-グリコプロテイン I と特異的に反応するものであるかどうかは不明であり、またこの抗血清を応用してヒト ^ 2-グリコプロテイン I を特異的に測定したとの報告もなされていない。

J 発明の開示よって、本発明の目的はヒト /3 2-グリコプロテイン I を特異的に測定することのできるモノクローナル抗体を提供することにあり、他の目的は、該モノクローナル抗体を利用したヒト /3 2-グリコプロティン I を特異的に測定するための方法およびキットを提供することにある。

本発明者らは上記目的を達成すべく研究を重ねた結果、上記目的に合致したモノクローナル抗体を効率よく取得することができ、このモノクローナル抗体を使用することによりヒト /3 2-グリコプロテイン I を特異的に測定できることを知見し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明はヒト /5 2-グリコプロテイン I に対して特異的に反応するモノクローナル抗体（以下、「本発明のモノクローナル抗体」と称することもある）に関するものである。

また、本発明は本発明のモノクローナル抗体を 1 つの構成試薬として含有してなるヒト / 3 2-グリコプロテイン I を測定するためのキット（以下、「本発明のキット」と称することもある）に関するものである。

さらにまた、本発明は本発明のモノクローナル抗体を測定試薬として使用することを特徴とするヒト 2-グリコプロテイン I の測定法（以下、「本発明の測定法」と称することもある）に関するものである。

図面の簡単な説明

図 1 は、モノクローナル抗体 C o F l 5 の反応性を示したものである。図 2 は、モノクローナル抗体 C o F 1 6の反応性を示したものである。

図 3 は、モノクローナル抗体 C o F 5 のヒト由来各種ァポリポプロティンに対する交差反応性を示したものである o

図 4 は、モノクローナル抗体 C o F 1 5 のヒト由来各種ァポリポプロティンに対する交差反応性を示したものである。

図 5 は、モノクローナル抗体 C o F 1 6 のヒト由来各種アポリポプロテインに対する交差反応性を示したものしめ O o

図 6 は、モノク D—ナル抗体 C o F 1 5の種特異性を示したものである。図中の（―）は血清無添加を意味する o

図 7 は、モノクローナル抗体 C o F l 6 の種特異性を示したものである。図中の（一）は血清無添加を意味す図 8 は、後述の競合的 E L I S A法における標準曲線を示したものである。

発明を実施するための最良の形態

1 . 本発明のモノクローナル抗体

(1) 特性

本発明のモノク口一ナル抗体は典型的には下記の特性を有し、このようなモノクローナル抗体を使用することにより初めてサンプル中のヒト /32-グリコプロテイン I を特異的に測定することが可能となったのである。

①反応性

後述の実施例に示す E L I S A法により抗体の反応性を調べると、抗体の濃度に依存してヒト 2-グリコプ口ティン I と反応する。

②特異性

後述の実施例に示すィ厶ノブロッティング法で抗体の特異性を調べると、ヒト；5 2-グリコプロテイン I のみに反応し、ヒト由来の他のタンパク質などの抗原性物質とは実質的に反応しない。

③交差性

ヒト由来の各種アポリポプロティンとは実質的に反応しないか、反応する場合でもヒト /3 2-グリコプロティン I の測定上なんら影響を及ぼさない。

④種特異性

他の動物由来の δ 2-グリコプロテイン I とは実質的に反応せず、ヒト由来の /3 2-グリコプロテイン I に特異的である。

(2) 製造法

本発明のモノクローナル抗体の製造法は特に限定されず、公知の方法を適宜応用することにより製造することができる。

使用する免疫源はヒト /3 2-グリコプロテイン I であるが、このものはたとえば、マックニールらの方法（ Pr o Na t l . Acad. Sc i . USA 87 : 4120 , 1 990 ) によりヒト血清から調製することができる。免疫源の精製度は特に制限されない。

また、ヒ卜 /5 2-グリコプロテイン I のアミノ酸配列及び塩基配列は公知となっており、この公知のアミノ酸配列の一部または全部に対応したペプチドを公知の方法により化学的に調製し、これを免疫源として使用してもよい。また、合成したペプチドの抗原性が乏しい場合には、ゥシ血清アルブミン、キーホールリンぺッ卜へモシァニンなどのハプテン抗原の抗体製造に常用されている高分子担体との複合体を免疫源として用いるのが好ましい。さらに、公知の塩基配列を利用して D N A組換え手法によりヒト /5 2-グリコプロテイン I を調製し、これを免疫源として使用してもよい。

免疫源を投与する動物としては、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ャギ、ラット、マウス、モルモット、ィヌ、ブ夕、ゥサギ、サ几、ハト、ニヮトリなどいずれであってもよく、特にマウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ャギ、ヒッジなどが使用上好都合である。

このような動物への免疫源の投与は常法に従って行えばよく、たとえば、完全フロインドアジュバンド、不完全フロインドアジュノくンド、ミョウノくンアジュノくント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳菌アジュバントなどの各種アジュバントと上述の免疫源との懸濁液を調製し、これを上記動物の静脈内、腹腔内、皮下または皮内に投与すればよい。投与量は、動物としてゥサギ、モルモットを使用する場合には蛋白量として 0 . 0 1 〜 1 0 m gZ匹、またはマウス、ラットを使用する場合には、 0 . 0 0 1 〜 l m g 匹程度が好適である。

初回投与後、 1 〜 4週間おきに 1 〜 5 回程度の上記と同様の追加免疫を行うことにより、動物体内でヒト /S 2 - ダリコプロティン I に対する抗体産生を誘導する。次に、免疫を獲得した動物からの脾細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球などの抗体産生細胞を常法により取得する。

抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒトなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。通常、 8 —ァザグァニン耐性株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン一グァニンホスフォリホ " シノレトランスフェラ一ゼ ( Hypoxant ine guanine p osphoribosyl transferase) を欠損し、ヒポキサンチン ' アミノプテリン · チミジン ( H A T) 培地に生育できない。また細胞の性質として免疫グロプリンを分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞株であることが好ましい。 '

ミエローマ細胞株の具体例としては、 P 3 X 6 3 A g 8 ( A T C C T I B — 9 ) ( Nature, 256 , 495- 497 (1975" 、 P 3 x 6 3 A g 8 U. 1 ( P 3 U 1 ) (A T C C C R L - 1 5 9 7 ) ( Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)) 、 P 3 x 6 3 A g 8. 6 5 3 (A T C C C R L - 1 5 8 0 ) ( J. Immunology. 123 .1548-1550 (1979) ) 、 P 2 / N S Iハ — A g 4 - 1 (A T C C T I B - 1 8 ) (Eu ropian J. Immunology, 6, 511-519 (1976) ) . S p 2 / 0 - A g 1 4 ( A T C C C R L - 1 5 8 1 ) Nature, 276 , 269— 270 (1978)) などのマウスミエ口一マ細胞株、 2 1 0. R C Y. A 1 . 2 , 3 ( Υ 3 - A g 1 . 2. 3 ) (A T C C C R L - 1 6 3 1 ) (Natu re, 277 , 131-133 (1979) ：) などのラットミエローマ細胞株、 U— 2 6 6 — A R 1 (Pro atl. Acad. Sci. U.S. A. ,77, 5429(1980)) 、 G M 1 5 0 0 (Nature, 288 , 488 (1980)) 、 K R - 4 (Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 79, 6651 (1982) ) などのヒトミエローマ細胞株を例示することができる。

細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエローマ細胞を選定する。

細胞融合は、イーグルの最少必須培地（ME M) 、ダ几べッコ変法イーグル培地（ D M E M ) 、 R P M I — 1 6 4 0 培地などの動物細胞培養用培地中で 1 0 ⁶ 〜 1 0 ³ Zm l のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比 I ： 4 〜 1 0 に混合し、 3 7でで 1 〜 1 0分間細胞同士を接触させることにより効率よく融合を行うことができる。細胞融合を促進させるために、平均分子量 1 ， 0 0 0 〜 6 ， 0 0 0 のポリエチレングリコール ( P E G) 、ポリビニールアルコール、センダイウィルスなどの融合促進剤を使用することができる。また、電気パルスを利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体產生細胞とミエローマ細胞を融合させることもできる。

細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択的増殖を利用する方法を用いることができる。たとえば、細胞懸濁液を 1 5 %ゥシ胎児血清（ F C S ) 含有 R P M I — 1 6 4 0培地などで適当に希釈後、マイクロプレート上に 1 0 ³ 〜 1 0 ⁶ ウヱル程度まき、各ゥエルに選択培地（たとえば、 H A T培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。ミエ口一マ細胞として 8 — ァザグァニン耐性株、選択培地として HA T 培地を用いた場合は、未融合のミエローマ細胞は培養 1 0 日目ぐらいまでに死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もインビトロ（ in vitro) では長期間生育できないので、培養 1 0〜 1 4 日目力、ら生育してくる細胞をノヽイブリドーマとして得ることができる。

ヒト /S 2-グリコプロテイン I を認識するモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマの検索は、酵素免疫測定法（ E I A、 E L I S A ) . ラジオィ厶ノアッセィ ( R I A ) などによって行うことができる。たとえば、ヒト /32-グリコプロテイン I を吸着させた 9 6 ウエノレ E L I S A用マイクロプレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加してヒト ^ 2-グリコプロテイン I と反応させ、次いで結合した特異抗体に酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、あるいはピオチン標識抗免疫グロブリン抗体を反応させたのちアビジン D —酵素標識体を反応させ、次いでいずれの場合とも各ゥエルに酵素基質を加えて発色させる。ヒト 3 2-グリコプロテイン I を固定化したゥエルのみで発色する培養上清を選別することにより、ヒト jS 2-グリコプロテイン I と特異的に反応する抗体を産生するハイプリドーマを検索することができる。

また、上記スクリーニングにおいて使用するヒト 2- グリコプロテイン I としては精製度の高いものが好ましく、具体的には 9 0 %以上の精製度のものを使用することによりヒト ^ 2-グリコプロテイン I に特異的に反応するモノクローナル抗体を產生するハイブリドーマを効率的にスクリーニングすることができる。

ハイプリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フイブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などにより行うことができる。

このようにして取得したハイブリドーマカヽらモノクローナル抗体を生産する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法などが採用されうる。

細胞培養法においては、ハイプリドーマを 1 0 〜 1 5 % F C S含有 R P M I — 1 6 4 0 培地、無血清培地などの動物細胞培養用培地中で通常の方法で培養し、その培養上清液から抗体を取得することができる。

腹水から回収する方法では、ハイプリドーマと腫瘍組織適合性が一致する動物に、プリスタン（ 2 , 6 , 1 0， 1 4 —テトラメチルペン夕デカン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、たとえばマウスの場合にはハイブリド一マを約 1 0 ^s 個ノ匹腹腔内投与する。ハイプリドーマは 1 0〜 1 8 日ほどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度に抗体を生産する。

抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、 D E A E セルロースなどの陰イオン交換体を利用するィォン交換クロマトグラフィー、プロテイン A —セファロ一スなどを用いるァフィ二ティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィ一などの公知の方法を適宜に選択し、組み合わせることにより精製することができる。 2 . 本発明の測定法

本発明の測定法は上述の本発明のモノクローナル抗体を試薬として使用することを特徴としており、測定原理、条件等には制限されない。

反応様式による分類として、競合反応法と非競合反応法（ィ厶ノメトリックアツセィ）が知られており、本発明においてはいずれの方法も採用できる。

検出方法による分類として、抗原抗体反応の結果を直接検出する非標識法（ネフユロメトリ一など）と、なんらかのマーカーを使用して検出する標識法が知られているが、本発明ではいずれの方法によってもよい。

B F分離を行う必要のあるヘテロジニアス法と必要のないホモジニァス法が知られており、本発明にはいずれの方法を適用してもよい。

反応相による分類として、全反応が液相で行われる液栢法と免疫反応の相手を固相化して反応を行う固相法が知られている力本発明におい'てはいずれの方法も採用できる。

これら、公知の一般法の中から、本発明の測定法の目的に適合する方法を適宜選択すればよい。

なお、一般的方法の詳細についてはたとえば以下の文献に詳細に記載されている。

①入江寛編「続ラジオィムノアツセィ」（（株）講談社、昭和 5 4年 5月 1 日発行）

②石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 2版）（（株）医学書院、 1 9 8 2年 1 2月 1 5 日発行）

③臨床病理臨時増刊特集第 5 3号「臨床検査のためのィムノアツセィー技術と応用一」（臨床病理刊行会、 1 9 8 3年発行）

φ 「バイオテクノロジ—事典」（（株）シーエムシ一、 1 9 8 6年 1 0 月 9 日発行）

⑤ rMethods in ENZYM0し OGY Vol.70j ( Immunochemical techniques (Part A) )

⑥ 「Methods in ENZYM0L0GY Vol.73j ( Immunochemical techniques (Part B ) ⑦ 「Methods in ENZY 0L0GY Vol.74」（ Immunochemical techniques (Part C) )

⑧ 「Methods in ENZYM0L0GY Vol.84」（ Immunochemical techniques (Part D： Selected Immunoassay) )

⑨ 「Methods in ENZYM0L0GY Vol.92」（ Immunochemical techniques (Part E .-Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )

[⑤〜⑨はァ力デミックプレス社発行]

また、本発明の測定法で使用する本発明のモノクロ一ナル抗体の使用態様は採用する測定法に応じたものに適宜誘導すればよい。具体的には標識化抗体、固相化抗体などを例示できる。

使用する抗体は抗体そのものであってもよいが、非特異的な吸着を防止する意味から抗体の活性フラグメン卜を使用するのが好ましい。抗体の活性フラグメントは、抗体の特徴を保持するもの（たとえば、 F ( a b ' ) 2 F a b ' 、 F a bなどの各種フラグメント）であればいずれのものであってもよい。これら活性フラグメントの調製は、精製抗体をパパイン、ペプシン、トリプシンなどのプロテア一ゼを用いて限定分解する方法など公知の方法を適用して行うことができる（たとえば「免疫生化学研究法（続生化学実験講座 5 ) J 、日本生化学会編、 8 9頁（ 1 9 8 6年）参照）。

抗体に結合させる標識剤としては、放射性同位体（たとえば ³² P、 ³ H、 ¹⁴ Cなど）、酵素（たとえば /3 —ガラクトシダ一ゼ、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース— 6 — リン酸デヒドロゲナーゼ、力タラーゼ、グルコースォキシダ一ゼ、乳酸ォキシダーゼ、アルコールォキシダ一ゼ、モノアミンォキシダーゼなど）、補酵素 · 補欠分子族（たとえば、 F A D、 F M N、 A T P、ピオチン、ヘムなど）、フルォレセイン誘導体 (たとえば、フルォレセインイソチオシァネート、フルォレセインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体 (たとえば、テ卜ラメチルローダミン B イソチオシァネートなど）、ゥ厶ベリフエロンおよび 1 —ァニリノ一 8 一ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノ一ル誘導体（たとえば、ルミノール、イソルミノール、 N— ( 6 — ァミノへキシル）一 N —ェチルイソノレミノ一ルなど）などを用いることができる。抗体またはその活性フラグメントと標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座 5 免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（ 1 9 8 6 年発行）第 1 0 2〜 1 1 2頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。

抗体を固定するための担体物質の材質としては、たとえばポリ塩化ビュル、ポリスチレン、スチレン一ジビニルベンゼン共重合体、スチレン一無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルァミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セフアデックスなど）、ァガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース (ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げられ、これらはァミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、ァシル基、水酸基などの官能基を導入したものであってもよい。なお、担体物質の材質は蛋白質の結合能の低いものが好ましく、このような材質としては未処理のポリスチレン、ポリ塩化ビニルが例示される。

担体物質の形状は、平板状（マイクロタイタープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などが例示され、測定法に応じた適宜な形状の担体を選択することができる。また、リボソーム（多層もしくは単層の脂質膜）なども抗体を固定するための担体物質として使用することもできる。

本発明のモノクローナル抗体と担体物質との結合法は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法（たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和 5 0 年 3 月 2 0 日、（株）講談社発行）参照）を採用することができる。とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は、直接行ってもよく、両物質の間に他の物質を介して行ってもよい。

3 . 本発明のキット本発明のキットは、本発明のモノクローナル抗体をキッ卜の構成試薬の 1 つとして含有することを特徴とするものであり、キッ卜の他の試薬構成は採用した測定法によって異なっていてもよい。

競合反応法に基づくキッ卜の場合には、たとえば以下の試薬構成をとりうる。

① 固栢化抗原（抗体）

② 標識化抗体（抗原）溶液

③ 既知濃度の抗原液

また、サンドイッチ法に基づくキッ卜の場合にはたとえば以下の試薬構成をとりうる。

① 固相化第一抗体

② 第二抗体溶液

標識化抗ィムノグロブリン抗体溶液

④ 既知濃度の抗原液

以上のキットの中で「抗体 J とは本発明のモノクロ一ナル抗体であり、「抗原」とはヒト yS 2-グリコプロティン I であることはレ、うまでもない。また、サンドイッチ法に基づくキットの場合には「第一抗体」と「第二抗体 j はヒト S 2-グリコプロテイン I 上の異なった抗原決定基を認識するものであることは、その測定原理から容易に理解しうる。また、サンドイッチ法に基づくキットの変型としては、たとえば以下の試薬構成をとりうる。

① 固相化第一抗体

標識化第二抗体溶液 ③ 既知濃度の抗原液

本発明のモノクローナル抗体を使用することにより、初めてヒト /S 2-グリコプロティン I を特異的に測定することが可能になった。従って、本発明は抗カルジォリピン抗体症候群の発症メカニズムを解明するための道具として有用である。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。実施例 1 ヒト /S 2-グリコプロテイン I ( 82- G P I ) に対するマウスモノクロ一ナル抗体の作製 ①モノクローナル抗体產生ハイブリドーマの作製

公知の方法（Pro Natl. Acad. Sci. USA 87:4120 (1990)) により調製されたヒト /S 2- G P I ( 0 . 2 m g /m 1 ) を生理食塩水に溶解させ、完全フロインドアジュバンドと 1 ： 1 の比率で混合してェマルジヨンとしたものを B A L B Z cマウス（雌， 6週令）の腹腔内に 1 0 g / 0 0 a 1 投与（ i. p. ) して初回免疫とした。初回免疫後、 2週間おきに数回、同様の方法で免疫（ i . P.) した後、最終免疫としてヒト /32- G P I 生理食塩水溶液（ 1 O z g Z l 0 0 / 1 ) をマウスの尾静脈に投与 ( i. V. ) した。最終免疫から 3 日後にマウスの脾臓を摘出し、イーグルの最少必須培地（M E M) で洗浄し脾細胞浮遊液を調製した。同時にマウスミエローマ P 3 X 6 3 A g 8 U 1 ( P 3 U 1 ) (A T C C C R L - 1 5 9 7 ) を ME Mで洗浄し、脾細胞と P 3 U 1 を 1 0 ： 1 で混合した後、遠心分離して得たペレットに 5 0 %ポリェチレングリコール（ P E G) 1 0 0 0含有 M E M溶液 1 m l を徐々に加えて細胞融合を行った。さらに、 ME M 溶液を加えて 1 O m l とし、遠心分離して得たペレツトを 1 0 %ゥシ胎児血清（ F C S ) 含有 R F M I — 1 6 4 0培地に P 3 U 1 として 3 x l 0 ⁴細胞 Z 0. 1 m l となるように懸濁させ、 9 6 ウェルマイクロタイタ一プレ一卜に各ウェブレ 0. 1 m l ずつ分注した。翌日、ヒポキサンチン一チミジン一アミノブテリン含有 ME M培地 (HA T培地）を 0. 1 m l 添加し、その後 3〜 4 日ごとに培地の半分量を新しい HA T培地で交換した。

融合から 1 4 日目にハイブリドーマのスクリーニングをした。すなわち、あらかじめ精製ヒト 52- G P I (精製度 9 9 9 以上）（ 1 0 g/m l ) をコートし 1 %ゥシ血清アルブミン（ B S A ) でブロッキングした 9 6 ゥエルマイクロ夕イタ一プレートに培養上清 5 0 1 を添加し室温で 1 時間反応させた。 P B S 2 0 0 Z 1 で 3回洗浄した後、ピオチン化抗マウス I g G (ベクター社製）溶液 5 0 1 を加えて室温でさらに 1 時間反応させた。反応後、 P B Sで 3回洗浄し、アビジン D—ペルォキシダ一ゼ（ベクタ一社製）溶液 5 0 // 1 を加えて室温で 3 0分間反応させた。さらに P B Sで同様に洗浄し、基質溶液（ 4 ーァミノアンチピリン（ 0. 2 5 m gZm 1 ) 、フエノール（ 0. 2 5 m g/m l ) 、 0. 4 2 5 M過酸化水素含有） 2 0 0 1 を加え、室温で反応させ、 5 5 0 n mの吸光度を測定しヒト 2-G P I に特異的に反応する抗体を検出し、特異抗体産生ハイプリドーマを選別した（表 1 ) 。

表 1 抗原特異抗体陽性細胞増殖全ゥエル数

ゥエルウェブレ |¾ β 2-G P I 1 2 0 4 0 0 7 6 8 このようにして選別した各ハイプリドーマをさらに限界希釈法を用いてクローニングし、ヒト /S 2-G P I に対し極めて反応性の高い抗体を産生するハイプリドーマ 1 0 株（ C o F 5、 C o F 6、 C o F 1 5、 C o F 1 6、 C o F 1 8、 C o F 1 9、 C o F 2 0、 C o F 2 1 、 C o F 2 2、 C o F 2 3 ) を樹立した。

②モノクロ一ナル抗体の調製および精製

3 種の樹立株細胞（ C o F 5、 C o F 1 5、 C o F 1 6 ) を、あら力、じめプリスタン 0 . 5 m l で処理したマウスの腹腔内へ 3 X 1 0 ⁶ 個ずつ投与し、約 2 週間後に腹水を採取した。採取した腹水に同量の P B S を加えて希釈した後、硫酸アンモニゥ厶を加え、 5 0 %飽和硫酸アンモニゥム濃度で沈澱する画分を遠心分離で回収した ₍ この沈澱画分を P B Sで再溶解し、同緩衝液に対して 2 日間透析した。次に上記の硫安粗 I g G画分から I g G を精製するためプロテイン A—セファロ一スカラムによる了フィニティ一クロマトグラフィーを行った。まず、プロテイン A— セファロース（ファノレマシア社製） 2 0 m l を 1 . 5 x 2 0 c mのガラス製カラムに充填し、 3 m M塩化ナトリウムを含む 1 . 5 Mグリシン緩衝液（ p H 8. 9 ) にて平衡化した。次に先の硫安画分を等量の同グリシン緩衝液で 2倍希釈してカラムに加え充分量の同グリシン緩衝液で非吸着蛋白を洗浄除去した後、吸着した I g Gを 0. 1 Mクェン酸緩衝液（p H 3. 0 ) にて溶出した。こうして得られた I g G面分を変性を避けるため速やかに、 P B Sに対して 1 晚透析して本発明のモノクローナル抗体を得た。

実施例 2 モノクローナル抗体の性質の解析① （クラス、タイプの検索）

ヒト ^ 2— G P I ( 5 〃 gZm l ) を 5 0 〃 1 Zゥエルずつコートし 1 %ゥシ血清アルブミン（ B S A) 含有 P B Sでブロッキング処理を施してある 9 6 ウェルマイクロタイタ一プレートにハイプリドーマの培養上清または精製モノクローナル抗体を添加し、 M o n o A b— 1 D E I Aキット（ Z ym e d社製）を用いて抗体のクラス、タイプの検索を行った。結果は表 2に示す通りであ

タ Π—ソ fnF18 CnFl ク /ラノスタイブ 1 1 k IeGl K 1 '*' * ^u ^a? ク Π—ン CoF20 CoF21 COF22 CoF23 クラス ,タイブ I Gi, K IgGi, K IgGi, K IgGi, 実施例 3 モノクロ一ナル抗体の性質の解析② （モノク口一ナル抗ヒト ^ 2- G P I 抗体の反応特異性）ノヽイブリドーマ（ C 0 F 5 C 0 F 1 5 C 0 F 1 6 ) の産生するモノクローナル抗体（抗体名は、それを産生するハイプリドーマ名と同じである）の抗原特異性の確認は S D S — ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 ( S D S - P A G E ) を用いたィムノブ口ティング法および固相酵素免疫測定法（ E L I S A ) により行った。 ( A ) ィムノブロッテイング法による特異性の解析

S D S — P A G Eは L a mm l i の方法（Nature, 227 :680, 1972) に準じ行った。松浦らの報告（Lancet、 336 :177-178, 1990) の通り、ヒト /32-G P I は還元、および非還元下、分子量 5 0 k Dを示す。本発明では精製ヒト /S 2 - G P I および健常人血清を電気泳動し以下に示す方法でィムノブロッティングを行った。 S D S— P A G Eによって得られた分離ゲルをニトロセルロース膜に乗せ、 6 0 V、 1 2時間通電してニトロセルロース膜に蛋白を転写した。こうして得られたニトロセルロース膜を試料の泳動ラインに沿って短冊上に切断し、一部はアミドブラックを用いて蛋白を染色した。他の膜は 3 %ゼラチン溶液に 3 7 °C、 1 時間浸してプロッキング処理を行った後、 P B Sで適宜希釈したモノクローナル抗ヒト / 52- G P I抗体（ C o F 5、 C o F l 5、 C o F 1 6 ) を室温で 1 時間反応させた。 P B Sで充分洗浄した後、ペルォキシダーゼ標識抗マウス I g G抗体を室温で 1 時間反応させた。さらに、ニトロセルロース膜を同様に洗净し、基質溶液（カラ一ディベロッパー (バイオラッド社製） 3 0 m g、メタノール 1 0 m 1 、 P B S 5 0 m l 、過酸化水素水 3 0 1 含有）と反応さ . せ、適当に癸色した時点で水洗いをして反応を停止した。その結果、これら 3種のモノクローナル抗体（ C o F 5、 C o F l 5、 C o F l 6 ) はいずれも分子量 5 O k Dのヒト 2- G P I に極めて強い反応性を示し、他のいかなるヒト由来の血清蛋白にも反応しなかった。

( B ) E L I S Aによる特異性の解析

モノクローナル抗体の特異性解析のための E L I S A の基本操作法は次の通りである。精製ヒト /S 2- G P I の P B S溶液（ 5 〃 gZm l ) を 2 5 1 ずつ 9 6 ゥエルマイクロタイ夕一プレートの各ゥエルに入れ 4 °Cで 1 晚放置した後、 1 % B S A含有 P B S 2 0 0 // 1 を各ゥェルに入れさらに室温で 1 時間放置しプロッキングを施した。 P B Sで 3 回洗浄した後、各種モノクローナル抗体

5 0 β 1 を入れ室温で 1 時間反応させた。競合的阻害試験ではこの反応系に各図の中に記載した濃度になるよう阻害物質を添加した。その後 P B Sで同様に洗浄し、ァルカリフォスファタ一ゼ標識抗マウス I g G抗体 5 0

1 を加え室温でさらに 1 時間反応させた。洗浄後、基質溶液（ Ρ —二トロフヱニールリン酸） 1 0 0 〃 1 を入れ、室温で 1 時間反応させた後、 4 0 5 n mの吸光度を測定した。

①モノクローナル抗体のヒト S 2- G P I への反応性

図 1 および図 2 に各々モノクローナル抗体 C 0 F 1 5 および C o F 1 6 の固相化したヒト S 2- G P I への反応性を示した。すなわち、ヒト /32- G P I ( 5 〃 g / m 1 、対照として P B S ) をコートし、 1 % B S Aでブロッキングしたプレートに図に示すごとく 0 . 3 1 〜 2 0 g Zm l の抗体を反応させたところ、ヒト /52-G P I ( 1 0 〃 g /m l ) 固相化プレートに対して、 C o F l 5、 C o F 1 6 の両抗体は濃度依存的に結合した。

②モノクローナル抗体の抗原特異性：各種ヒト由来のァポリポプロティンによる阻害活性の比較

図 3 から図 5 には抗体の各種ヒト由来のアポリポプロティン（アポリポプロテイン H ( a p 0 H ) 、アポリポプロテイン A l ( a p o A l ) 、アポリポプロテイン A 2 ( a p 0 A 2 ) 、アポリポプロテイン B ( a p o B ) 、およびアポリポプロテイン E ( a p o E ) ) に対する交差反応性の有無について検討した結果を示した。いずれのモノクローナル抗体（ C o F 5、 C o F 1 5、 C o F 1 6 ) の固相化ヒト 52- G P I に対する結合も 0. 4〜 1 0 gノ m 1 のァポリポプロティン H、すなわち 2- G P I の添加で濃度依存（競合）的に阻害されるが、その他のアポリポプロテイン（すなわち a p o A 1、 a p o A 2、 a p o Bおよび a p o E) を添加しても有意な阻害効果は認められなかった。

③モノクローナル抗体の抗原特異性：異なる動物種の血清による阻害活性の比較

ヒト血清中には約 2 0 の ^ 2-G P I すなわちアポリポプロティン Hが存在することが知られている。従って、アポリポプロテイン Hの代わりに各種の動物血清（マウス（ B A L B Z c ) 、ャギ、ゥサギ、ゥシ (胎児血清）、およびヒト血清）を用いて、これらモノクロ一ナル抗体（ C 0 F 1 5 および C 0 F 1 6 ) 力ヒト由来の S 2- G P I (アポリポプロテイン H ) に特異的であるかどうかを調べた。図 6および図 7に示す通り、ヒト血清 1 0倍および 5 0倍希釈濃度で有意に C 0 F 1 5 および C o F 1 6 の固栢化ヒト S 2- G P I に対する結合が阻害されたが、他の動物種の血清では如何なる阻害効果も認められなかった。

なお、上記以外のハイプリドーマ（ C 0 F 5、 C o F 6、 C o F 1 8、 C o F 1 9、 C o F 2 0、 C o F 2 1 、 C o F 2 2、 C o F 2 3 ) が産生するモノクローナル抗体に関しても上記と同じ実験を行ったところ、同様の結果が得られた。

実施例 4 精製ヒト /32- G P I 、ラット血清および牛血清を用いた阻害活性測定によるモノクローナル抗体の特異性の確認

各抗体の特異性をヒト /82- G P I 固相プレートを用いて阻害活性を測定する方法で確認した。

すなわち、 P B Sにて 1 0 〃 gノ m 1 の濃度に溶解した精製ヒト /52- G P I抗原溶液を 9 6穴マイクロプレート（ファルコン社）に 1 ゥヱル当たり 5 0 〃 1 ずつ分注し、 4 °Cでー晚静置して抗原をプレートに結合させた。ァスピレーターを用いて残余の抗原液を除去し、 1 ゥェル当たり 2 0 0 1 の P B Sを分注して、これをァスピレ一ターで除去することでプレートを洗浄した。以上の洗浄操作は 3 回繰り返して行った。洗浄したプレートを逆さにし、ペーパータオル上で軽く数回叩き、ゥヱル中に残っている液を除き、 3 %ゼラチン— P B S溶液を 1 ゥエル当たり 2 0 0 〃 1 分注し、 2 5 °Cで 3 0分間静置した。静置後、ゥヱルから液を取り除き、ペーパー夕ォル上で数回強く叩き、残った液を完全に除いた。

次に、 H E P E S緩衝液にて 5 gノ m 1 の濃度に溶解した精製ヒト ^ 2- G P I 溶液、 5倍に希釈したラット血清、同じく 5倍に希釈したゥシ血清または H E P E S 緩衝液（対照）をゥルに 2 5 p. 1 ずつ分注した。 H E P E S緩衝液にて適時希釈調製しておいたゥサギ抗 /32 - G P I抗血清（D I A G N O S T I C A S TA G O社製）、マウス抗 ^ 2- G P I抗血清（ャマサ醤油社製）及びモノクロナ一ル抗体（ C o f 6、 C o f 2 0、 C o f 2 2、 C o f 2 3 ) 溶液の各溶液を 1 ゥュル当たり 2 5 α ΐ ずつ分注し、マクロプレートミキサーにて軽く撹拌し、室温にて 1 時間静置反応させた。残余の抗体溶液をァスピレーターにて除去後、上記の手順にて 3回洗浄し、二次抗体を 1 ゥニル当たり 5 0 1 ずつ分注した。二次抗体としては、ゥサギ由来の抗血清を反応させたゥエルに対してはペルォキシダ一ゼ（ H R Ρ ) 標識ャギ抗ゥサギ I g G抗体を、マウス由来の抗血清及びモノクローナル抗体溶液を反応させたゥエルには H R P標識ャギ抗マウス I g G抗体をそれぞれ 1 % B S A— P B S緩衝液にて適時希釈し、それを分注した。室温で 1 時間静置後、残余の 2次抗体液をァスピレーターで取り除き、上記の手順にて 3回洗浄後、 TM B Z 1 0 111 1 に対し 1 %過酸化水素水 5 0 n 1 を使用直前によく混合した基質溶液を 1 ゥニル当たり 1 0 0 / 1 分注し、室温で 1 0分間反応させた。 2 N硫酸を 1 ゥエル当たり I O O I 分注し、発色反応停止後、マイクロプレートリーダ一にて 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

阻害活性は、対照群の発色を 1 0 0 として各溶液を入れたゥエルの発色を割合を求め、更にその値を 1 0 0力、ら引いた、阻害率（）で表した。 2

その結果、表 3 に示すように、ゥサギ抗血清はラット血清およびゥシ血清の両血清でヒト δ 2- G P I に対する結合が大きく阻害された。またマウス抗血清もラット血清で結合が阻害された。それに対し、本発明のモノクローナル抗体（ C o f 6 、 C 0 f 2 0 , C o f 2 2 、 C o f 2 3 ) は、ラット血清、ゥシ血清のいずれの血清でもほとんど結合の阻害は受けず、本発明のモノクロナール抗体がラット ^ 2- G P I およびゥシ 2- G P I には反応せず、ヒト /32- G P I に特異的であることが再確認された。

表 3

抗体阻宝率 ( % )

ヒト; S 2-GPI ラット血清ゥシ血清ゥサギ抗血清 5 8 . 2 4 5 . 4 3 4 . 2 マウス抗血清 4 0 . 2 2 4 . 2 0 . 0 モノクロナール抗体

C 0 f 6 3 6 . 2 0 . 0 0 . 0

C 0 f 2 0 5 6 . 7 1 . 3 0 . 9

C o f 2 2 5 9 . 0 2 . 3 0 . 0 C o f 2 3 6 6 . 5 0 . 0 0 . 0

実施例 5 競合的 E L I S A法によるヒト； S 2- G P I の

ヒト S 2- G P I を定量するために、まず精製ヒト 2 - G P I の希釈溶液をスタンダードに用い、ヒト 52- G P I 固栢プレート並びに抗ヒト；52- G P I モノクローナル抗体を用いた競合的 E L I S A法によって標準曲線を作衣 L 7 o

すなわち、予め作製しておいたヒ卜 S 2 - G P I 固相プレートを実施例 4 と同様の手順で、洗浄、ブロッキングの各処理を行い、スタンダードとして H E P E S緩衝液にて 0 . 0 6 〜 6 4 0 g /m l の濃度に溶解した精製ヒト ^ 2- G P I 溶液、及び対照群として H E P E S緩衝液をそれぞれ 1 ゥエル当たり 2 5 1 ずつ分注した。鐃けて実施例 4 と同様に希釈したモノクローナル抗体 ( C o f 2 3 ) の抗体溶液を 1 ゥル当たり 2 5 〃 1 分注し、マクロプレートミキサーにて軽く攪はんし、室温にて 1 時間静置反応させた。以降、実施例 4 に記載した手順と同様にして、洗浄、二次反応、洗浄、基質溶液の分注、発色停止及び吸光度測定の各操作を行った。

以上のようにして得られた測定値は、対照群の発色を 1 0 0 として発色の割合を求め、更にその値を 1 0 0 から引くことによって表される阻害率を算出し、ヒト /S 2 - G P I の標準曲線を作成した。結果結果を図 8 に示す。図 8 力、ら明らかなように、上述の C o f 2 3 のモノクローナル抗体を使用した競合的 E L I S A法においては、 1 〜 3 0 0 〃 g Zm l 程度の範囲のヒト ^ 2- G P I を定量することが可能である。

産業上の利用可能性

ヒト ^ 2-グリコプロテイン I に特異的に反応する本発明によって得られるモノクロ一ナル抗体を利用することにより、被検試料中のヒト / S 2-グリコプロテイン I を正確に測定することが可能である。従って、本発明のモノクロ一ナル抗体は、例えば抗カルジオリピン抗体症候群の発症メカニズムを解明するための道具として極めて有用であ。

Claims

請求の範囲

1. ヒト 2-グリコプロテイン I に特異的に反応するモノクローナル抗体。

2. 下記の特徴を有する、請求の範囲第 1 項記載のモノクローナル抗体；

①反応性

抗体の濃度に依存してヒト 5 2-グリコプロティン I と反応する；

②特異性

ヒト由来の他の抗原性物質とは実質的に反応せず、ヒト；5 2-グリコプロテイン I のみに反応する； ⑧交差性

ヒト由来の各種アポリポプロテインとは実質的に反応しない；

④種特異性

他の動物由来の S 2-グリコプロテイン I とは実質的に反応しない；

3. 請求の範囲第 1 項記載のモノクローナル抗体を 1 つの構成試薬として含有してなるヒト /8 2-グリコプロテイン I を測定するためのキット。

4. 請求の範囲第 1 項記載のモノクローナル抗体を測定試薬として使用することを特徵とするヒト ^ 2 -グリコプロテイン I の測定法。