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WO1992019752A1 - Vecteur de delivrance d'arn - Google Patents

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WO1992019752A1
WO1992019752A1 PCT/FR1992/000393 FR9200393W WO9219752A1 WO 1992019752 A1 WO1992019752 A1 WO 1992019752A1 FR 9200393 W FR9200393 W FR 9200393W WO 9219752 A1 WO9219752 A1 WO 9219752A1
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WO
WIPO (PCT)
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rna
fragment
coding
delivery vector
tumor
Prior art date
Application number
PCT/FR1992/000393
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English (en)
Inventor
Pierre Meulien
Shivadasan Krishnan
Frédéric Martinon
Original Assignee
Transgene S.A.
Pasteur Merieux
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Publication date
Application filed by Transgene S.A., Pasteur Merieux filed Critical Transgene S.A.
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Priority to AU17681/92A priority patent/AU652831B2/en
Priority to JP4509832A priority patent/JPH06502998A/ja
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to means intended for the transfer within a cell of an RNA fragment coding for an antigenic determinant characteristic of a tumor or of a pathogenic agent as well as to pharmaceutical compositions comprising them.
  • the present invention applies in particular to the field of vaccines.
  • Live vaccines which are made up of infectious bacteria or viruses whose virulence has been reduced by mutagenesis or by passage through various media which cause mutations;
  • Subunit vaccines based on bacterial toxins or purified infectious agent antigens.
  • most tumor cells express on their surface antigens which differ either qualitatively or quantitatively from the antigens present on the surface of the corresponding normal cells. These antigens are said to be specific when they are only expressed by tumor cells.
  • these antigens are said to be associated with the tumor; in this case, they are present either in greater quantity or in a different form in the tumor cells.
  • the cells of the immune system recognize the antigens of the foreign germ, react specifically to this intrusion and keep these antigens in memory; they will protect the body during a subsequent infection.
  • T8 lymphocytes cytotoxic lymphocytes
  • T4 lymphocytes helper T lymphocytes
  • Antigen presenting cells capture the antigen, digest it and re-expose fragments on its surface, in association with molecules of the major histocompatibility complex (MHC) of class I or H .
  • MHC major histocompatibility complex
  • T4 lymphocytes stimulate the proliferation of antibody-producing B lymphocytes and that of T8 lymphocytes (cytotoxic T lymphocytes or CTL) when they "see” the fragments of antigens associated with the major class II histocompatibility complex.
  • T8 lymphocytes cytotoxic T lymphocytes or CTL
  • - B lymphocytes produce antibodies which will interact with circulating antigens so as to neutralize them.
  • T8 lymphocytes destroy infected cells when they recognize the fragments of antigens associated with the major class I histocompatibility complex.
  • vaccines are likely to induce both a humoral and cell-mediated response to confer strong and lasting immunity.
  • live vaccines are often the most effective: they simultaneously activate B, T4 and Tg lymphocytes by conferring a good level of immunity.
  • they act in low doses and generally do not require a booster.
  • these vaccines usually need to be kept cold. Maintaining the cold chain during transport is a factor which significantly increases the cost of these vaccines.
  • their attenuated virulence is not zero and they sometimes induce side effects in immunocompromised subjects. Even more serious, they can recover their virulence following reverse mutations, which is extremely rare but strictly intolerable.
  • Subunit vaccines do not have these defects, but they generally stimulate immune cells less well and require adjuvants (molecules which boost their immunogenic power).
  • the hepatitis B vaccine consisting of the major surface antigen of the virus, obtained by recombinant DNA technology, is an example of a successfully developed subunit vaccine. However, in other cases, the results have been disappointing.
  • subunit vaccines are not capable of inducing a sufficiently strong cell-type immune response. This probably results from the impossibility for certain antigens to be correctly processed and / or for their fragments, to come into contact with the molecules of the major histocompatibility complex (MHC) of class I.
  • MHC major histocompatibility complex
  • MHC class I molecules which participate in the cell type immune response
  • peptide fragments take place in the endoplasmic reticulum of the cell.
  • entry into this compartment takes place from the cytosol where the proteins are synthesized by translation of the corresponding messenger RNAs.
  • the passage from the cytosol to the endoplasmic reticulum takes place through two types of mechanisms:
  • This new mode of vaccination clearly promotes the association of MHC class I molecules with the peptide fragments resulting from the digestion of the antigen since it has been shown that the individual thus treated is capable of developing an immune response involving cytotoxic T lymphocytes (CTL).
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • RNA delivery vector which comprises a liposome and at least one RNA fragment coding for an antigenic determinant characteristic of a tumor or of a pathogenic agent, said at least one RNA fragment being encapsulated in said liposome;
  • composition intended for the treatment of a tumor or of a disease induced by a pathogenic agent, for preventive or curative purposes which comprises, as therapeutic agent, an RNA delivery vector according to the invention ;
  • RNA delivery vector for the preventive or curative treatment of a tumor or a disease induced by a pathogenic agent
  • RNA delivery vector for the preparation of a medicament intended for the preventive or curative treatment of a tumor or of a disease induced by a pathogenic agent
  • RNA fragment useful for the purposes of the present invention is by nature a non-infectious RNA fragment, exclusively of the messenger type; that is to say capable of being directly translated into protein by cellular machinery without having to be first replicated or transcribed into DNA. By definition, it does not contain the elements that would allow it to replicate inside a cell. Likewise, it does not contain the genetic information necessary for the reconstitution of a substantially complete pathogenic agent (eg, a bacteria, a virus, or a parasite).
  • a substantially complete pathogenic agent eg, a bacteria, a virus, or a parasite
  • antigenic determinant is meant any peptide comprising at least one epitope characteristic of a tumor antigen or of a pathogenic agent. This antigenic determinant can therefore be the complete native antigen, a precursor or an analog thereof, a fragment of the native antigen or an analog of this fragment.
  • analog is meant a molecule having an amino acid sequence substantially different from that of the native molecule eg, the amino acid sequence of which has a degree of homology of at least about 80%, preferably at least at least 90%, most preferably at least 95% with the sequence of the native molecule.
  • the antigenic determinant can be characteristic of any type of tumor or any pathogenic agent.
  • nucleocapsid protein (nucleoprotein or NP) of the influenza virus type A affecting humans as defined by the sequence of the mRNA which corresponds to it. This sequence was published in Huddleston & Brownlee, Nucl. Ac. Res. (1982) 10 (3): 1029.
  • a peptide comprising the major epitope of the H23-ETA antigen having the sequence: Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-X-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro- Asp-Y-Arg-Pro-X, where X is Pro or Ala and Y is Thr or Asn.
  • RNA delivery vector according to the invention can contain different RNA fragments; each of these fragments coding for a particular antigenic determinant.
  • an RNA delivery vector according to the invention intended for the preventive treatment of influenza can contain both:
  • RNA coding for the nucleoprotein of influenza virus type A and a fragment of RNA coding for the nucleoprotein of influenza virus type B or else,
  • RNA fragment coding for the nucleoprotein of influenza A viruses and one or more RNA fragment (s), each of these coding for the hemaglutinin of a particular strain of the influenza virus.
  • an RNA fragment can be obtained in a conventional manner e.g., by chemical synthesis or by in vitro transcription of the corresponding DNA fragment.
  • liposome is meant a vesicle essentially formed by a membrane made up of lipids in a double layer. Such a vesicle may have one or more membrane strata. In the first case, we speak of a unilamellar vesicle while in the second case it is an oligo- or plurilamellar vesicle.
  • the liposome membrane is made up of amphiphylic lipids such as phospholipids, in combination or not with other lipid constituents.
  • Phospholipids suitable are, for example, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, sphingolipids, cardiolipin, phosphatidylinositol, phosphatidic acid and phosphatidylglycerol.
  • synthetic phospholipids whether or not derived from the phospholipids mentioned above, containing for example various groups such as hydroxyl, imidazole, amine, amides, sulphydiyl groups, etc.
  • lipids such as steroids, cholesterol, aliphatic amines, can be mixed with the phospholipids.
  • lipids are in particular useful as stabilizing or antioxidant agents.
  • a first advantageous lipid mixture consists of phosphatidylcholine (PC) and cholesterol (CH) in variable proportion.
  • PC phosphatidylcholine
  • CH cholesterol
  • a second advantageous mixture consists of phosphatidylcholine, cholesterol and phosphatidylserine (PS) in variable proportion, for example CH / PC / PS in 5: 4: 1 proportion.
  • the preparation of the liposomes as well as the packaging of the RNA can be carried out according to known techniques.
  • the DNA packaging techniques which are commonly used are applicable in the present case.
  • the membrane can also contain various proteins inserted into the membrane, attached by covalent bond to a lipid of the membrane, directly or indirectly via a binding agent, or simply in interaction with a phospholipid.
  • a protein is linked by covalent bond to a lipid, the latter is preferably a lipid having an amino function such as, for example, phosphatidylethanolamine.
  • these proteins can be used as a targeting agent for liposomes on a particular class of cells. These are, for example, monoclonal antibodies or lymphokines.
  • the RNA fragment (s) encoding an antigenic determinant of a tumor or of a pathogenic agent is (are) advantageously accompanied by an RNA fragment coding for an interleukin-1, an RNA fragment coding for an interleukin-4 or a RNA fragment coding for an interleukin-2; the latter being particularly preferred.
  • an RNA fragment coding for an antigenic determinant or an interleukin comprises, in addition to the coding sequence, all the elements necessary for the translation of the latter.
  • RNA fragments make up a vector or a pharmaceutical composition according to the invention, these can be partially or totally linked to each other, so as to form at least one polycistronic RNA fragment.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • the therapeutic agent or agents according to the invention are combined with a diluent or a support which is acceptable from a pharmaceutical point of view.
  • a composition according to the invention can be administered by any conventional route in use in the field of vaccines, in particular by the subcutaneous route, by the intramuscular route or by the intravenous route, for example in the form of a suspension. injectable. It is indicated that the subcutaneous route is particularly well suited for administration of a composition according to the invention. The administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval. The appropriate dosage will vary depending on various parameters, for example, the individual being treated or the mode of administration.
  • FIG. 2 diagrams the inserts of the plasmids pTG3003 (b.ase pGEM- 3Z), pPM2 (base pUC18), pPM3 (base pUC18), pPM4 (base pUC18), pPM5 (base pGEM-3Z) and pPM6 (base pGEM-3Z ).
  • NP nucleoprotein
  • IL-2 interleukin-2
  • S. signal signal sequence of the precursor of IL-2
  • 3'NTR ⁇ G 3'untranslated end of the rabbit ⁇ -globin gene.
  • FIG. 3 diagrams the inserts of the plasmids pPM9, pPM10, pPM11 and pPM12 (each based on pGEM-4Z).
  • 5'NTR ⁇ G 5'untranslated end of the rabbit ⁇ -globin gene.
  • An EcoI-Sali fragment comprising the cDNA coding for the influenza virus type A nucleoprotein, strain A / NT / 60/68 (Huddleston & Brownlee, Nucl. Ac. Res. (1982) 1Q (3): 1029) is obtained by digestion of the plasmid pNP28 (Jones & Brownlee, Gene (1985) 25: 333).
  • This EcoRf-Sali fragment is inserted into the plasmid pGEM-3Z (Promega Corp; FIG. 1) digested with EcoRI and Sali so as to place the cDNA coding for the nucleoprotein under the control of a promoter recognized by the RNA polymerase of phage T7 .
  • the plasmid pTG3003 is thus obtained.
  • the plasmid pTG3003 is then linearized by digestion with SalI; then transcribed using an in vitro transcription kit (Stratagene; catalog ref.
  • RNA thus obtained is capped by adding to the transcription buffer 10 ⁇ l of a solution of m7G (5 ') ⁇ pp (5') G 5 mM (Pharmacia; product number 27-4635).
  • a cholesterol solution is prepared by dissolving the powdered product (Sigma) in chloroform at the rate of 100 mg / ml. Then in a 30 ml Corex tube . 58 ⁇ l of the cholesterol solution and 110 ⁇ l of a phosphatidylcholine solution at 100 mg / ml (Sigma) are mixed. The final mixture contains approximately
  • the lipid layer deposited at the bottom of the tube is taken up in 1 ml of water.
  • the mixture is homogenized with a vortex and sonicated at the minimum frequency using a Braun Labsonic L sonicator. The operation is carried out for 10 min. by intermittent passages of 15 seconds, spaced by 30 seconds of cold rest.
  • the suspension thus obtained is centrifuged at 16,000 rpm, at 4 ° C for 15 min. to sediment titanium particles and larger vesicles
  • RNA preparation obtained in A 135 ⁇ l of the RNA preparation obtained in A) are added; or approximately 40 ⁇ g of RNA.
  • the mixture is gently immersed in liquid nitrogen, rolling the tube kept vertical between his fingers. When the mixture is completely frozen, it is lyophilized overnight.
  • the lyophilisate is gradually rehydrated in 100 ⁇ l of distilled water. Then added dropwise 0.9 ml of Hepes buffer pH 7.05 of composition: 140 mM NaCl, KC15 mM, Na2_HP ⁇ 4 2H2O 0.75 mM, Hepes 25 mM.
  • the vesicular suspension is then calibrated by successive extrusions through a first and second filter whose pores have a diameter of 400nm and 200nm respectively.
  • the suspension thus obtained contains a majority of oligolamellar vesicles which have encapsulated the RNA.
  • the suspension is deposited on a Sepharose 4B column (10 ml; column of section 1 cm) pre-balanced in Hepes buffer. Elution is continued in Hepes buffer. The eluted fractions of white appearance which contain the vesicles are collected together; this corresponds to a volume of approximately 2 ml.
  • EXAMPLE 2 Induction of a CTL response initiated by liposomes loaded with RNA coding for the nucleoprotein of the influenza A virus.
  • mice Three series of BALB / c mice corresponding respectively (i) to the test, (ii) positive control and (iii) to the negative control are prepared as follows:
  • mice receive 130 hemaglutinating units of the influenza virus type A, strain Caen (A-Caen) intraperitoneally.
  • the different type A strains sometimes differ from each other for certain proteins such as hemaglutinin or neuraminidase but never for nucleoprotein.
  • nucleoprotein there are variations regarding the nucleoprotein between type A and B viruses.
  • mice receive intravenously 200 ⁇ l of a preparation of liposomes prepared as in Example 1, the addition of RNA having been omitted.
  • mice of (i) and (iii) receive an injection identical to the first and under the same conditions.
  • the spleen of the mice is removed and dilacerated.
  • the red cells are eliminated by osmotic shock.
  • the spleen cells are cultured in plates with cups at a rate of 5.10 "cells / cups in a volume of 2 ml in DMEM culture medium (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM L- glutamine, 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol, 10 mM Hepes, 1 mM sodium pyruvate, 10 units / ml penicillin, 10 ⁇ g / ml streptomycin, 2.5 ⁇ g / ml amphotericin and non-amino acids -essential (Flow labs).
  • This medium also contains 5 ⁇ M of peptide NP 147-158R " of formula: Thr-Tyr-Glu-Arg-Thr-Arg-Ala-Leu-Val-Thr-Gly.
  • This peptide corresponds to an epitope systematically recognized by CTL BALB / c mice when they are immunized with influenza A virus (Bodmer et al, Cell (1988) 52: 253).
  • the culture is continued at 37 ° C. under an atmosphere containing 7% CO 2. After 7 days, the initial culture medium is replaced by fresh medium. In each well, 5 10 6 spleen cells of BALB / c mice not subjected to immunization are added, these cells having been irradiated with 4000 Rad of gamma radiation.
  • mice 1 to 10 ⁇ 10 6 mouse mastocytoma cells DBA / 2 (H-2d) histocompatible with BALB / c mice (P815 cells), in DMEM medium, are incubated in the presence of 100 ⁇ Ci of Na2 H 1-O4 (CEA, France ) for 1 hour at 37 ° C. The cells are washed twice, then taken up in DMEM medium.
  • P815 cells infected with the influenza virus type A, Bangkok strain (P815 / A-Ban) or by the influenza virus type B Yamagata strain (P815 / B-Yam) L infection of the P815 cells is first carried out as follows: 10 "cells in 0.5 ml of DMEM medium are infected with 100 haemaglutinating units of virus. After 90 min at 37 ° C., the cells are washed in 20 ml of DMEM medium supplemented with 10% VF to stop infection Expression of virus proteins is continued 3 hr at 37 ° C before the cells are used in the cytolysis test.
  • the P815 cells are then distributed in the wells of a microtiter plate at the rate of 3000 cells per well.
  • the spleen cells effector cells
  • DMEM medium DMEM medium
  • effector cells in DMEM medium
  • the peptide NP 147-158R " is finally added to the final concentration of 2.5 ⁇ M.
  • the final volume is 200 ⁇ l.
  • the plate is then incubated 4 hr at 37 ° C and then centrifuged. From each well, take 100 ⁇ l of supernatant. The radioactivity of each sample is measured and the results are expressed in the table below, as a percentage of the release of chromium due to the activity of CTL:
  • KXHMPLE 3 Second preparation of liposomes loaded with RNA coding for the nucleoprotein of the influenza A virus.
  • RNA is obtained as previously described in 1A.
  • a cholesterol solution is prepared by dissolving the powdered product in chloroform at the rate of 100 mg / ml. Then, in a 30 ml Corex tube, 58 ⁇ l of the cholesterol solution are mixed, 176 ⁇ l of a dipalmitoyl phosphatidylcholine solution at 50 mg / ml and 219 ⁇ l of a phosphatidylserine solution at 10 mg / ml. The final mixture contains approximately 30 ⁇ moles of lipids.
  • the lipid layer deposited at the bottom of the tube (approximately 30 ⁇ moles) is taken up in 300 ⁇ moles of octyl- ⁇ -glucoside.
  • the solution should be clear.
  • RNA prepared in 3A is added.
  • this mixture is dialyzed against 10 mM Hepes buffer pH 7.05 containing 150 mM NaCl and 2.7 g of Biobeads-SM2 adsorbent (9 mg of adsorbent / ⁇ mole of detergent). The dialysis is continued with stirring for 16 hr at room temperature.
  • the plasmid pTG3003 described in 1A is partially digested with SphI and treated with Klenow polymerase.
  • We religion by inserting a MluI linker and selecting a plasmid having lost the SphI site located 3 ′ of the sequence coding for NP, with replacement by MluI; or the plasmid pPM1.
  • sequence coding for IL-2 is recovered, in the form of the EcoRI-JCbal fragment of a phage M13 marketed by British Biotechnology under the reference BBG3. This fragment is inserted into pUC18 (Viera & Messing, Gene (1982) 19: 259) to give the plasmid pPM2.
  • a .Xbal-HindIII fragment comprising the 3 'untranslated end of the rabbit ⁇ -globin gene is synthesized by PCR using the primers OPM1 and OPM2.
  • This fragment is inserted into pPM2, previously digested with Xbal and HindIII.
  • the plasmid pPM3 is thus obtained.
  • a synthetic DNA fragment comprising the sequence coding for the signal peptide of human IL-2 is inserted into pPM3 previously digested with EcoRI and -Xhol to give the plasmid pPM4.
  • This synthetic DNA fragment is formed by hybridization of the following oligonucleotides:
  • the assembly coding for the precursor of IL-2 and the 3 'untranslated region of the rabbit ⁇ -globin gene is recovered from pPM4 in the form of a SalI - MluI fragment to be inserted into pPM1 previously digested with Sali and MluI in order to give the plasmid pPM5.
  • the plasmid pPM5 is then linearized by MluI digestion; then transcribed using an in vitro transcription kit (Megascript from Ambion).
  • the RNA thus obtained is capped by adding to the transcription buffer 10 ⁇ l of a solution of m7G (5 ') pp ⁇ (5') G 5 mM (Pharmacia; product number 27-4635).
  • the plasmid pPM5 is digested with StuI and Hpal so as to eliminate almost all of the region coding for the precursor of IL-2; then religated to give the plasmid pPM6.
  • pPM6 is then linearized by MluI digestion; then transcribed using an in vitro transcription kit (Megascript from Ambion). The RNA thus obtained is capped by adding to the transcription buffer 10 ⁇ l of a solution of m7G (5 ') ppp (5') G 5 mM (Pharmacia; product n ° 27-4635).
  • RNA obtained in 5A / 30 ⁇ mol of lipids is used.
  • the plasmid pTG2148 described in patent application EPA 305 209 comprises the DNA fragment coding for the fusion protein (Buckland et al, J. Gen. Virol. (1987) £ 8: 1695).
  • pTG2148 is digested with HindIII and Hpal from mother to eliminate the 5 'untranslated region of the gene coding for the fusion protein. This is replaced by the 5 'untranslated region of the rabbit ⁇ -globin gene reconstructed by hybridization of the oligonucleotides OPM5 and 6.
  • the plasmid pPM7 is thus obtained.
  • OPM6 Hpal 5 'AACAGTACTGCCATGAATATGGCAGAGACGTTCACCTTGAGACCCATGGTGG CTGTTTTGGGGGATTGCAAGTAAACACAGTTGTGTCAAAAGCAAGTGTA 3' HindIII
  • the plasmid pGEM-4Z (Stratagene) is digested with EcoRI, then treated with Klenow polymerase. We religion by inserting a MluI linker to obtain the plasmid pPM8.
  • the 5 'untranslated region of the ⁇ -globin gene and the sequence coding for the fusion protein are recovered from pPM7 in the form of a HindIII-Sacl fragment. This is inserted into pPM8 previously digested with HindIII and Sac1. The plasmid pPM9 is thus obtained in which the sequence coding for the fusion protein is placed under the control of the T7 promoter.
  • pPM9 is linearized by MluI digestion; then transcribed using an in vitro transcription kit (Megascript from Ambion). The RNA thus obtained is capped * by adding to the transcription buffer, 10 ⁇ l of a solution of m7G (5 ') ⁇ pp (5') G 5 mM (Pharmacia; product number 27-4635).
  • RNA obtained in 6A / 30 ⁇ mol of lipids is used.
  • EXAMPLE 7 Second preparation of liposomes loaded with RNA coding for the fusion protein of the measles virus.
  • a synthetic DNA fragment, of sequence (double strand) is prepared:
  • This DNA fragment is inserted into pPM9, probably digested with SacI and MluI, to give the plasmid pPM10 which no longer has a SacI site.
  • the .Xbal - MluI fragment of pPM5 which comprises the 3 'untranslated end of the ⁇ -globin gene is recovered, then inserted into pPM10 previously digested put Xbal and MluI to give the plasmid pPM11.
  • RNA thus obtained is capped by adding to the transcription buffer, 10 ⁇ l of a solution of m7G (5 ') p ⁇ p (5') G 5 mM (Pharmacia; product number 27-4635).
  • RNA obtained in 7A / 30 ⁇ mol of lipids is used.
  • EXAMPLE 8 Preparation of liposomes loaded with RNAs coding for (i) the fusion protein of the measles virus and (ii) human interleukin-2.
  • the assembly coding for the precursor of IL-2 and the 3 'untranslated region of the ⁇ -globin gene of the plasmid pPM4 is recovered in the form of an EcoIU-Mul fragment. This fragment is inserted into pPM11 previously digested with EcoRI and MluI to give the plasmid pPM12.
  • pPM12 is then linearized by MluI digestion; then transcribed using an in vitro transcription kit (Megascript from Ambion). The RNA thus obtained is capped by adding to the transcription buffer, 10 ⁇ l of a solution of m7G (5 ') p ⁇ p (5') G 5 mM (Pharmacia; product number 27-4635).
  • RNA obtained in 8A / 30 ⁇ mol of iipids is used.
  • the CTL response is implemented and analyzed as described in Example 2, except for 2 modifications: it is specified that 500 ⁇ l of each of the liposomal preparations obtained in Examples 3, 4 and 5 are used to inject a mouse ( first injection as well as booster) and that the injections are made subcutaneously.
  • RNA coding for NP alone, encapsulated in liposomes is capable of inducing an immune response only after booster (comparison tests # 1 and 3);
  • RNA coding for NP and IL-2 encapsulated in liposomes is capable of inducing an immune response after a single injection (comparison tests
  • mice receive 4 x 10 'plaque forming units of the vaccinia virus WTGFM1173 intraperitoneally in a single injection.
  • WTGFM1173 contains the measles virus fusion protein gene. It has been described as an active immunogenic agent
  • mice receive, subcutaneously, approximately 30 moles of lipids in the form of empty liposomes prepared according to the method described in 3B (with the exception of the addition of RNA) as a first injection and as a booster 15 days later.
  • mice receive a first injection subcutaneously and a booster 15 days later.
  • the first injection and the booster each correspond to approximately 0.4 - 0.6 ml of the liposomal preparations of Examples 6, 7 and 8.
  • About 15 days after the booster the mice are tested by intracerebral injection of 50 l of a 10% suspension of brain cells of newborn mice previously infected with the SSPE isolate of the measles virus (Wild et al, J. Med. Virol. (1979) 4: 103).

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Abstract

Un vecteur de délivrance d'ARN qui comprend un liposome et au moins un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène, ledit au moins un fragment d'ARN étant encapsulé dans ledit liposome.

Description

Vecteur de délivrance d'ARN
La présente invention concerne des moyens destinés au transfert à l'intérieur d'une cellule d'un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène ainsi qu'aux compositions pharmaceutiques les comprenant. La présente invention s'applique en particulier au domaine des vaccins.
D'une manière générale, la vaccination traditionnelle consiste à sensibiliser le système immunitaire d'un individu à un agent infectieux (bactérie, virus ou parasite). A cette fin, trois types de vaccins ont été proposés et développés selon les cas, de manière plus ou moins empirique :
- Les vaccins inactivés (ou tués) obtenus à partir de bactéries ou de virus entiers qui ont perdu leur infectivité grâce à des traitements chimiques ;
Les vaccins vivants qui sont constitués par des bactéries ou des virus infectieux dont la virulence a été atténuée par mutagénèse ou par passages dans divers milieux qui provoquent des mutations ; et
Les vaccins sous-unités, à base de toxines bactériennes ou d'antigènes d'agents infectieux purifiés. D'autre part, on a récemment proposé d'appliquer le principe des vaccins à la prévention des tumeurs malignes. En effet, la plupart des cellules tumorales expriment à leur surface des antigènes qui diffèrent soit qualitativement, soit quantitativement des antigènes présents à la surface des cellules normales correspondantes. Ces antigènes sont dits spécifiques lorsqu'ils sont uniquement exprimés par des cellules tumorales. Lorsqu'ils sont présents à la fois sur des cellules normales et tumorales, ces antigènes sont dits associés à la tumeur ; dans ce cas, ils sont présents soit en plus grande quantité, soit sous une forme différente dans les cellules tumorales.
Une fois le vaccin administré, les cellules du système immunitaire reconnaissent les antigènes du germe étranger, réagissent spécifiquement à cette intrusion et gardent ces antigènes en mémoire ; elles protégeront l'organisme lors d'une infection ultérieure.
D'une manière générale il existe deux grands types de réponse immunitaire : la réponse de type humoral qui est caractérisée par la production d'anticorps par les lymphocytes B et la réponse immunitaire à médiation cellulaire qui met en jeu des cellules effectrices i.e., essentiellement les lymphocytes T8 (lymphocytes cytotoxiques). Ces réponses sont initialement activées par les cellules présentatrices d'antigènes et modulées par les cellules régulatrices i.e., les lymphocytes T4 (lymphocytes T helper) et les lymphocytes T suppresseurs.
Dans ses très grandes lignes, la réponse immunitaire fonctionne ainsi :
- Les cellules présentatrices d'antigène (monocytes, macrophages et lymphocytes B) capturent l'antigène, le digèrent et en réexposent des fragments à leur surface, en association avec des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de classe I ou H.
- Les lymphocytes T4 stimulent la prolifération des lymphocytes B producteurs d'anticorps et celle des lymphocytes T8 (lymphocytes T cytotoxiques ou CTL) quand ils "voient" les fragments d'antigènes associés au complexe majeur d'histocompatibilité de classe II. - Les lymphocytes B produisent les anticorps qui vont interagir avec les antigènes circulants de manière à les neutraliser.
- Enfin les lymphocytes T8 détruisent les cellules infectées quand ils reconnaissent les fragments d'antigènes associés au complexe majeur d'histocompatibilité de classe I.
On pense actuellement que les vaccins doivent probablement induire à la fois une réponse humorale et à médiation cellulaire pour conférer une immunité solide et durable.
Parmi les types de vaccins cités ci-dessus, les vaccins vivants sont souvent les plus efficaces : ils activent simultanément les lymphocytes B, T4 et Tg en conférant un bon niveau d'immunité. De plus, comme ils se multiplient dans l'organisme, ils agissent à faibles doses et n'exigent généralement pas de rappel. Malheureusement, pour demeurer vivants, ces vaccins doivent généralement être conservés au froid. Le maintien de la chaîne du froid lors des transports est un facteur qui grève de façon non-négligeable le coût de ces vaccins. Enfin, leur virulence qui est atténuée n'est pas nulle et ils induisent parfois des effets secondaires chez des sujets immunodéprimés. Plus grave encore, ils peuvent recouvrer leur virulence à la suite de mutations inverses, ce qui est rarissime mais proprement intolérable.
Les vaccins sous-unités n'ont pas ces défauts mais ils stimulent • généralement moins bien les cellules immunitaires et nécessitent des adjuvants (des molécules qui renforcent leur pouvoir immunogène). Le vaccin contre l'hépatite B, constitué par l'antigène majeur de surface du virus, obtenu par la technologie de l'ADN recombinant, est un exemple de vaccin sous-unité développé avec succès. Toutefois, dans d'autres cas, les résultats ont été décevants.
On pense qu'un facteur limitant le succès des vaccins sous-unités réside dans le fait qu'ils ne sont pas capables d'induire une réponse immunitaire de type cellulaire suffisamment forte. Ceci résulte vraisemblablement de l'impossibilité pour certains antigènes d'être correctement processés et/ou pour leurs fragments, d'entrer en contact avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de classe I.
En effet, l'association entre les molécules du MHC de classe I (qui participent à la réponse immunitaire de type cellulaire) et les fragments peptidiques a lieu dans le reticulum endoplasmique de la cellule. Pour cela, il faut donc, au préalable, que l'antigène parvienne jusque dans ce compartiment cellulaire. D'une façon générale, l'entrée dans ce compartiment se fait à partir du cytosol où les protéines sont synthétisées par traduction des ARN messagers correspondants. Le passage du cytosol au reticulum endoplasmique s'effectue grâce à deux types de mécanismes :
- soit un mécanisme de sécrétion lorsque la protéine est synthétisée sous forme de précurseur (mis enjeu d'un peptide signal),
- soit un mécanisme de "pompe" à peptides.
Les types de vaccins connus jusqu'à présent ne permettent absolument pas de maîtriser cette donnée importante qu'est l'association des molécules du MHC de classe I et des fragments peptidiques. Le plus souvent, les éléments infectieux (bactéries, virus, parasites ou antigènes) sont en effet absorbés par les cellules phagocytaires selon le mécanisme d'endocytose (ou phagocytose). Les vésicules d'endocytose fusionnent avec des lysosomes dont le contenu enzymatique assure la dégradation du matériel phagocyté. Ces vésicules x endocytaires et lysosomales forment un ensemble distinct du reticulum endoplasmique et ne sont pas en contact avec ce dernier.
Par conséquent, même si un antigène est capable d'induire une production d'anticorps neutralisants à son encontre, il n'est absolument pas certain qu'il se révélera au bout du compte efficace pour la mise en oeuvre d'un vaccin sous- unité.
On a maintenant trouvé de manière surprenante que la synthèse d'un antigène pouvait être réalisée directement dans les cellules présentatrices d'antigènes de l'individu à immuniser, lorsque l'ARN codant pour cet antigène était administré sous forme apropriée e.g., sous forme de composition liposomale. Le destin de l'ARN ainsi injecté était en effet hautement incertain compte-tenu de sa très courte demi-vie. De plus, il n'était absolument pas évident que l'ARN soit correctement délivré dans le cytosol et qu'il soit pris en charge par la machinerie cellulaire assurant le processus de traduction.
Ce nouveau mode de vaccination favorise nettement l'association des molécules MHC de classe I avec les fragments peptidiques issus de la digestion de l'antigène puisqu'il a été montré que l'individu ainsi traité était capable de développer une réponse immunitaire mettant en jeu les lymphocytes T cytotoxiques (CTL).
En conséquence, l'invention propose :
(i) Un vecteur de délivrance d'ARN qui comprend un liposome et au moins un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène, ledit au moins un fragment d'ARN étant encapsulé dans ledit liposome ;
(ii) Une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une tumeur ou d'une maladie induite par un agent pathogène, à des fins préventives ou curatives, qui comprend à titre d'agent thérapeutique un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention ;
(iϋ) L'usage d'un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention pour traiter de manière préventive ou curative, une tumeur ou une maladie induite par un agent pathogène ;
(iv) L'usage d'un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif d'une tumeur ou d'une maladie induite par un agent pathogène ;
(v) Une méthode de traitement curatif ou préventif d'une tumeur ou d'une maladie induite par un agent pathogène qu: comprend l'acte d'administrer une quantité suffisante d'un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Un fragment d'ARN utile aux fins de la présente invention est par nature un fragment d'ARN non-infectieux, exclusivement de type messager ; c'est-à- dire capable d'être directement traduit en protéine par la machinerie cellulaire sans devoir être d'abord répliqué ou transcrit en ADN. Par définition, il ne contient pas les éléments qui lui permettraient de se répliquer à l'intérieur d'une cellule. De même il ne contient pas l'information génétique nécessaire à la reconstitution d'un agent pathogène (e.g., une bactérie, un virus, ou un parasite) substantiellement complet.
Par "déterminant antigénique", on entend n'importe quel peptide comportant au moins un épitope caractéristique d'un antigène de tumeur ou d'un agent pathogène. Ce déterminant antigénique peut donc être l'antigène natif complet, un précurseur ou un analogue de celui-ci, un fragment de l'antigène natif ou un analogue de ce fragment. Par "analogue", on entend une molécule ayant une séquence en acides aminés sensiblement différente de celle de la molécule native e.g., dont la séquence en acides aminés présente un degré d'homologie au moins d'environ 80%, de préférence d'au moins 90%, de manière tout à fait préférée d'au moins 95% avec la séquence de.la molécule native.
D'une manière générale, le déterminant antigénique peut être caratéristique de n'importe quel type de tumeur ou de n'importe quel agent pathogène.
Afin d'illustrer ce qui précède, on cite à titre d'exemple :
- La protéine de la nucléocapside (nucléoprotéine ou NP) du virus de la grippe de type A affectant les humains telle que définie par la séquence de l' ARNm qui lui correspond. Cette séquence a été publiée dans Huddleston & Brownlee, Nucl. Ac. Res. (1982) 10 (3) : 1029.
- La protéine de fusion (F) du virus de la rougeole
- Un peptide comportant l'épitope de séquence : Thr-Tyr-Glu-Arg-Thr-Arg- Ala-Leu-Val-Arg. Cet épitope est caractéristique de la nucléoprotéine des virus de la grippe type A. - Un peptide comportant la séquence : Thr-Tyr-Glu-Arg-Thr-Arg-Ala-Leu- Val-Thr.
- L'antigène de tumeur H23-ETA associé au cancer du sein chez les humains, tel que décrit dans Wreschner et al, J. Biochem. (1990) 189 : 463.
- Un peptide comportant l'épitope majeur de l'antigène H23-ETA, ayant la séquence : Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-X-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro- Asp-Y-Arg-Pro-X, dans laquelle X est Pro ou Ala et Y est Thr ou Asn.
Un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention peut contenir différents fragments d'ARN ; chacuns de ces fragments codant pour un déterminant antigénique particulier. Par exemple, un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention destiné au traitement préventif de la grippe peut contenir à la fois :
- Un fragment d'ARN codant pour la nucléoprotéine des virus de la grippe de type A et un fragment d'ARN codant pour la nucléoprotéine des virus de la grippe de type B ou bien,
- Un fragment d'ARN codant pour la nucléoprotéine des virus de la grippe de type A et un ou plusieurs fragment(s) d'ARN, chacun de ces derniers codant pour l'hémaglutinine d'une souche particulière du virus de la grippe.
Aux fins de la présente invention, un fragment d'ARN peut être obtenu de manière conventionnelle e.g., par synthèse chimique ou par transcription in vitro du fragment d'ADN correspondant.
Par "liposome", on entend une vésicule essentiellement formée d'une membrane constituée de lipides en double couche. Une telle vésicule peut présenter une ou plusieurs strates membranaires. Dans le premier cas, on parle d'une vésicule unilamellaire tandis que dans le deuxième cas il s'agit d'une vésicule oligo- ou plurilamellaire. De mamère typique, la membrane des liposomes est constituée de lipides amphiphyliques tels que les phospholipides, en association ou non avec d'autres consituants lipidiques. Des phospholipides appropriés sont par exemple, la phosphatidylcholine, la phosphatidylsérine, la phosphatidyléthanolamine, les sphingolipides, la cardiolipine, le phosphatidylinositol, l'acide phosphatidique et le phosphatidylglycérol. De plus, on peut aussi prévoir d'utiliser des phospholipides synthétiques dérivés ou non des phospholipides mentionnés ci-dessus, contenant par exemple, des groupements variés tels que des groupement hydroxyles, imidazoles, aminé, amides, sulphydiyles, etc.
De préférence, d'autres lipides tels que des stéroides, le cholestérol, des aminés aliphatiques, peuvent être mélangés aux phospholipides. De tels lipides sont en particulier utiles à titre d'agents stabilisants ou anti-oxy dants.
Aux fins de la présente invention, un premier mélange lipidique avantageux est constitué de phosphatidylcholine (PC) et de cholestérol (CH) en proportion variable. On indique toutefois que des proportions PC : CH satisfaisantes sont de l'ordre (en terme de part) de 5 : 1 à 5 : 5. Un tel mélange à part égale convient particulièrement. Un deuxième mélange avantageux est constitué de phosphatidylcholine, de cholestérol et de phosphatidylsérine (PS) en proportion variable, par exemple CH/PC/PS en proportion 5:4:1.
La préparation des liposomes ainsi que l'encapsidation de l'ARN peut être mises en oeuvre selon des techniques connues. En particulier, les techniques d'encapsidation de l'ADN qui sont couramment utilisées, sont applicables dans le cas présent.
En outre, la membrane peut aussi contenir diverses protéines insérées dans la membrane, attachées par liaison covalente à un lipide de la membrane, directement ou indirectement via un agent de liaison, ou simplement en interaction avec un phospholipide. Lorsque'une protéine est liée par liaison covalente à un lipide, ce dernier est de préférence un lipide possédant une fonction aminé tel que par exemple, la phosphatidyléthanolamine. Avantageusement ces protéines peuvent être utilisées comme agent de ciblage des liposomes sur une classe particulière de cellules. Ce sont par exemple, des anticorps monoclonaux ou des lymphokines. Aux fins de la présente invention, le (ou les) fragment(s) d'ARN codant pour un déterminant antigénique d'une tumeur ou d'un agent pathogène est (sont) avantageusement accompagné(s) d'un fragment d'ARN codant pour une interleukine-1, d'un fragment d'ARN codant pour une interleukine-4 ou d'un fragment d'ARN codant pour une interleukine-2 ; ce dernier étant tout particulièrement préféré.
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, il doit être entendu qu'un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique ou une interleukine comporte outre la séquence codante, tous les éléments nécessaires à la traduction de cette dernière.
Lorsque différents fragments d'ARN composent un vecteur ou une composition pharmaceutique selon l'invention, ceux-ci peuvent être partiellement ou totalement liés les uns aux autres, de manière à former au moins un fragment d'ARN polycistronique.
Enfin, une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on associe le ou les agents thérapeutiques selon l'invention avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intra- musculaire ou par voie intra-veineuse, par exemple sous forme de suspension injectable. On indique que la voie sous-cutanée est particulièrement bien adaptée pour administration d'une composition selon l'invention. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration.
L'invention est illustrée ci-après en se référant aux figures suivantes :
La figure 1 représente le plasmide pGEM-3Z. La figure 2 schématise les inserts des plasmides pTG3003 (b.ase pGEM- 3Z), pPM2 (base pUC18), pPM3 (base pUC18), pPM4 (base pUC18), pPM5 (base pGEM-3Z) et pPM6 (base pGEM-3Z). NP = nucléoprotéine ; IL-2 = interleukine-2 ; S. signal = séquence signal du précurseur de l'IL-2 ; 3'NTRβG = extrémité 3'non-traduite du gène de la β-globine de lapin.
La figure 3 schématise les inserts des plasmides pPM9, pPMlO, pPMll et pPM12 (chacun à base de pGEM-4Z). 5'NTRβG = extrémité 5'non traduite du gène de la β-globine de lapin.
EXEMPLE 1 : Préparation de liposomes chargés en ARN cod-ant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe de type A.
1A. Préparation de l'ARN.
Un fragment EcoI - Sali comprenant le cDNA codant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe de type A, souche A/NT/60/68 (Huddleston & Brownlee, Nucl. Ac. Res. (1982) 1Q (3) : 1029) est obtenu par digestion du plasmide pNP28 (Jones & Brownlee, Gène (1985) 25 : 333).
Ce fragment EcoRf - Sali est inséré dans le plasmide pGEM-3Z (Promega Corp ; Figure 1) digéré par EcoRI et Sali de manière à placer le cDNA codant pour la nucléoprotéine sous le contrôle d'un promoteur reconnu par la RNA polymérase du phage T7. On obtient ainsi le plasmide pTG3003.
Le plasmide pTG3003 est ensuite linéarisé par digestion avec Sali ; puis transcrit en utilisant un kit de transcription in vitro (Stratagène ; réf. catalogue
200341) selon les instructions du fournisseur. L'ARN ainsi obtenu est cappé par adjonction dans le tampon de transcription de 10 μl d'une solution de m7G(5')ρpp(5')G 5 mM (Pharmacia ; n° produit 27-4635).
1B. Préparation des liposomes.
On prépare une solution de cholestérol en dissolvant le produit en poudre (Sigma) dans du chloroforme à raison de 100 mg/ml. Puis dans un tube Corex de 30 ml. on mélaiige 58 μl de la solution de cholestérol et 110 μl d'une solution de phosphatidylcholine à 100 mg/ml (Sigma). Le mélange final contient environ
30 μmoles de lipides.
Ce mélange est agité vigoureusement au vortex. Puis on laisse le solvant s'évaporer à 40°C. L'opération de séchage est complétée par lyophilisation pendant environ 1 hr.
La couche lipidique déposée au fond du tube est reprise dans 1 ml d'eau. Le mélange est homogénéisé au vortex et soniqué à la fréquence minimale en utilisant un sonicateur Labsonic L de Braun. L'opération s'effectue pendant 10 min. par passages intermittents de 15 secondes, espacés par 30 secondes de repos au froid.
La suspension ainsi obtenue est centrifugée à 16000 rpm, à 4°C pendant 15 min. pour sédimenter les particules de titane et les vésicules les plus grandes
(Biofuge/Heraeus en tube eppendorff). Puis le surnageant contenant une majorité de vésicules unilamellaires ayant pour diamètre 50 microns environ, est récupéré dans des tubes Corex de 15 ml.
A la suspension vésiculaire obtenue en B), on ajoute 135 μl de la préparation d'ARN obtenue en A) ; soit 40 μg d'ARN environ. Le mélange est plongé doucement dans l'azote liquide, en roulant entre ses doigts le tube maintenu vertical. Lorsque le mélange est complètement congelé, on le lyophilise pendant toute une nuit.
Le lyophilisât est réhydraté progressivement dans 100 μl d'eau distillée. Puis on ajoute goutte à goutte 0,9 ml de tampon Hepes pH 7,05 de composition : NaCl 140 mM, KC15 mM, Na2_HPθ4 2H2O 0,75 mM, Hepes 25 mM. La suspension vésiculaire est ensuite calibrée par extrusions successives au travers d'un premier et deuxième filtre dont les pores ont respectivement un diamètre de 400nm et de 200nm. La suspension ainsi obtenue contient une majorité de vésicules oligolamellaires qui ont encapsulé l'ARN.
Afin d'éliminer de manière substantielle l'ARN non-encapsulé, la suspension est déposée sur une colonne de Sepharose 4B (10 ml ; colonne de section 1 cm) prééquilibrée en tampon Hepes. L'élution est poursuivie en tampon Hepes. Les fractions éluées d'aspect blanc qui contiennent les vésicules sont collectées ensemble ; ceci correspond à un volume d'environ 2 ml. EXEMPLE 2 : Induction d'une réponse CTL initiée par des liposomes chargés en ARN codant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe de type A.
Trois séries de souris BALB/c correspondant respectivement (i) au test, (ii) contrôle positif et (iii) au contrôle négatif sont préparées comme suit :
(i) Test : les souris reçoivent par voie intra-veineuse 200 μl de la préparation de liposomes obtenue à l'exemple 1.
(ii) Contrôle positif : les souris reçoivent par voie intra-péritonéale 130 unités hémaglutinantes du virus de la grippe de type A, souche Caen (A-Caen). Les différentes souches de type A diffèrent parfois entre elles pour certaines protéines comme l'hémaglutinine ou la neuraminidase mais jamais pour la nucléoprotéine. Par contre il existe des variations en ce qui concerne la nucléoprotéine entre les virus de type A et B.
(iii) Contrôle négatif : les souris reçoivent par voie intra-veineuse 200 μl d'une préparation de liposomes préparées comme à l'exemple 1, l'addition d'ARN ayant été ommise.
15 jours après, les souris de (i) et (iii) reçoivent une injection identique à la première et dans les mêmes conditions.
15 jours après la deuxième injection, la rate des souris est prélevée et dilacéréè. Les hématies sont éliminées par choc osmotique. Puis les cellules spléniques sont mises en culture dans des plaques à godets à raison de 5.10" cellules/godets sous un volume de 2 ml en milieu de culture DMEM (Gibco) complémenté à 10 % de sérum de veau fétal, 2 mM de L-glutamine, 50 μM de β-mercaptoethanol, 10 mM d'Hepes, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 unités/ml de pénicilline, 10 μg/ml de streptomycine, 2,5 μg/ml d'amphotéricine et des acides aminés non-essentiels (Flow labs).
Ce milieu contient en outre 5 μM du peptide NP 147-158R" de formule : Thr-Tyr-Glu-Arg-Thr-Arg-Ala-Leu-Val-Thr-Gly. Ce peptide correspond à un épitope systématiquement reconnu par les CTL des souris BALB/c lorsqu'elles sont immunisées avec le virus de la grippe de type A (Bodmer et al, Cell (1988) 52 : 253).
La culture est poursuivie à 37°C sous atmosphère à 7 % de C02- Au bout de 7 jours, le milieu de culture initial est remplacé par du milieu frais. Dans chaque godet, on ajoute, de plus, 5 106 cellules de rate de souris BALB/c non soumises à immunisation, ces cellules ayant été irradiées par 4000 Rad de rayonnement gamma.
Au I2lème jour de culture, l'activité des CTL est détectée par le test classique de relargage du 5**Cr notamment décrit par Martinon et al, J. Immunol. (1989) 142 : 3489. Des précisions sont données comme suit :
1 à lOxlO6 cellules de mastocytome de souris DBA/2 (H-2d) histocompatible avec les souris BALB/c (cellules P815), en milieu DMEM, sont incubées en présence de 100 μCi de Na2 H 1-O4 (CEA, France) pendant 1 hr à 37°C. Les cellules sont lavées deux fois, puis reprises en milieu DMEM.
L'opération est répétée en utilisant des cellules P815 infectées par le virus de la grippe de type A, souche Bangkok (P815/ A-Ban) ou par le virus de la grippe de type B souche Yamagata (P815/B-Yam) L'infection des cellules P815 est au préalable menée comme suit : 10" cellules dans 0,5 ml de milieu DMEM sont infectées par 100 unités hémaglutinantes de virus. Après 90 min à 37°C, les cellules sont lavées dans 20 ml de milieu DMEM complémenté avec 10 % de S VF pour stopper l'infection. L'expression des protéines du virus est poursuivie 3 hr à 37°C avant que les cellules soient utilisées d.ans le test de cytolyse.
Les cellules P815 (cellules cibles) sont alors distribuées dans les puits d'une plaque de microtitration à raison de 3000 cellules par puits. Dans les trois cas (i), (ii) et (UT), les cellules spléniques (cellules effectrices), en milieu DMEM, sont ajoutées dans chaque puit de manière à constituer des séries formant une gamme de rapport cellules effectrices / cellules cibles comprise entre 100/1 et 0,3/1 approximativement. Le peptide NP 147-158R" est enfin ajouté à la concentration finale de 2,5 μM. Dans chaque puit, le volume final est de 200 μl. La plaque est ensuite incubée 4 hr à 37°C puis centrifugée. Dans chaque puit, on prélève 100 μl de surnageant. La radioactivité de chaque prélèvement est mesurée et les résultats sont exprimés dans le tableau ci-dessous, en pourcentage du relargage du chrome dû à l'activité des CTL :
(relargage observé - relargage spontané) lOOx
(quantité totale de chrome incorporée - relargage spontané)
Figure imgf000017_0001
KXHMPLE 3 : Deuxième préparation de liposomes chargés en ARN codant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe de type A.
3A. L'ARN est obtenu comme précédemment décrit en 1A.
3B. Préparation des liposomes.
On prépare une solution de cholestérol en dissolvant le produit en poudre dans du chloroforme à raison de 100 mg/ml. Puis, dans un tube Corex de 30 ml, on mélange 58 μl de la solution de cholestérol, 176 μl d'une solution de dipalmitoyl phosphatidylcholine à 50 mg/ml et 219 μl d'une solution de phosphatidylsérine à 10 mg/ml. Le mélange final contient environ 30 μmoles de lipides.
Ce mélange est vigoureusement agité au vortex. Puis on laisse le solvant s'évaporer à 40°C. L'opération de séchage est complétée par lyophilisation pendant 1 hr.
La couche lipidique déposée au fond du tube (environ 30 μmoles) est reprise par 300 μmoles d'octyl-β-glucoside. La solution doit être limpide.
A cette préparation, on ajoute environ 50 μg d'ARN préparé en 3A. Afin d'éliminer le détergent, ce mélange est dialyse contre du tampon Hepes 10 mM pH 7,05 contenant 150 mM NaCl et 2,7 g d'adsorbant Biobeads-SM2 (9 mg d'adsorbant/μmole de détergent). La dialyse est poursuivie sous agitation pendant 16 hr à température ambiante.
La suspension vésiculaire est ensuite calibrée par trois extrusions successives à 40°C au travers de membranes dont les pores ont un diamètre de 200 nm ; puis enfin éluée en tampon Hépès sur une colonne de Sépharose CL4B. EXEMPLE 4 : Préparation de liposomes chargés en ARNs codant pour (i) la nucléoprotéine du virus de la grippe de type A et (ii) rinterleukine-2 humaine.
4A. Préparation de l'ARN.
Le plasmide pTG3003 décrit en 1A est partiellement digéré par SphI et traité à la polymérase Klenow. On religue en insérant un linker MluI et on sélectionne un plasmide ayant perdu le site SphI situé en 3' de la séquence codant pour NP, avec remplacement par MluI ; soit le plasmide pPMl.
D'autre part, on récupère la séquence codant pour l'IL-2, sous forme du fragment EcoRI - JCbal d'un phage M13 commercialisé par British Biotechnology sous la référence BBG3. Ce fragment est inséré dans pUC18 (Viera & Messing, Gène (1982) 19 : 259) pour donner le plasmide pPM2.
Un fragment .Xbal - HindIII comport.ant l'extrémité 3' non-traduite du gène de la β-globine de lapin (Kafatos et al, PNAS (1977) 72 : 5618 est synthétisé par PCR en utilisant les amorces OPM1 et OPM2.
OPM1 :
Xbal 5 / TTTTTCTAGAGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAC 3 '
OPM2 :
" HindIII MluI 5 ' AAAAAAGCTTACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTGCAATGAAAATAAATTTCC 3 '
Ce fragment est inséré dans pPM2, préalablement digéré par Xbal et HindIII. On obtient ainsi le plasmide pPM3.
Un fragment d'ADN synthétique comportant la séquence codant pour le peptide signal de l'IL-2 humaine est inséré dans pPM3 préalablement digéré par EcoRI et -Xhol pour donner le plasmide pPM4. Ce fragment d'ADN synthétique est formé par hybridation des oligonucléotides suivants :
OPM3 :
EcoRI Sali
5' AATTCGCGCGTCGACATAGGCCTATCCACC ATG TAC AGG ATG CAA
CTC GTG TCA TGC ATT GCA CTA AGT CTT GCA CTT GTC ACA AAC
AGT GCT CCT ACT AGC 3' X ol
OPM4 :
Xhol 5' TCGAGCT AGT AGG AGC ACT GTT TGT GAC AAG TGC AAG ACT TAG TGC AAT GCA TGA CAC GAG TTG CAT CCT GTA CAT GGTGGATAGGCCTATGTCGACGCGCG 3'
Sali EcoRI
Enfin l'ensemble codant pour le précurseur de l'IL-2 et la région 3' non- traduite du gène de la β-globine de lapin est récupéré à partir de pPM4 sous forme d'un fragment Sali - MluI pour être inséré dans pPMl préalablement digéré par Sali et MluI po donner le plasmide pPM5.
Le plasmide pPM5 est ensuite linéarisé par digestion MluI ; puis transcrit en utilisant un kit de transcription in vitro (Megascript de Ambion). L'ARN ainsi obtenu est cappé par adjonction dans le tampon de transcription de 10 μl d'une solution de m7G(5')ppρ(5')G 5 mM (Pharmacia ; n° produit 27-4635).
4B. La préparation des liposomes est réalisée comme précédemment décrit en 3B.
On utilise environ 66μg d'ARN obtenu en 4A / 30 μmoles de lipides. EXEMPLE 5 : Troisième préparation de liposomes chargés en ARN codant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe de type A.
5A. Préparation d'ARN.
Le plasmide pPM5 est digéré par StuI et Hpal de manière à éliminer la quasi-totalité de la région codant pour le précurseur de l'IL-2 ; puis religué pour donner le plasmide pPM6.
pPM6 est ensuite linéarisé par digestion MluI ; puis transcrit en utilisant un kit de transcription in vitro (Megascript de Ambion). L'ARN ainsi obtenu est cappé par adjonction dans le tampon de transcription de 10 μl d'une solution de m7G(5')ppp(5')G 5 mM (Pharmacia ; n° produit 27-4635).
5B. La préparation des liposomes est réalisée comme précédemment décrit en 3B
On utilise environ 66μg d'ARN obtenu en 5A/30 μmoles de lipides.
EXEMPLE 6 : Préparation de liposomes chargés en ARN codant pour la protéine de fusion du virus de la rougeole.
6A. Préparation de l'ARN.
Le plasmide pTG2148 décrit dans la demande de brevet EPA 305 209 comporte le fragment d'ADN codant pour la protéine de fusion (Buckland et al, J. Gen. Virol. (1987) £8 : 1695). pTG2148 est digéré par HindIII et Hpal de mamère à éliminer la région 5' non-traduite du gène codant pour la protéine de fusion. Celle-ci est remplacée par la région 5' non-traduite du gène de la β- globine de lapin reconstruite par hybridation des oligonucléotides OPM5 et 6. On obtient ainsi le plasmide pPM7. OPM5 î HindIII 5' AGCTTACACTTGCTTTTGACACAACTGTGTTTACTTGCAATCCCCCAAAACAGC CACCATGGGTCTCAAGGTGAACGTCTCTGCCATATTCATGGCAGTACTGTT 3' Hpal
OPM6 : Hpal 5' AACAGTACTGCCATGAATATGGCAGAGACGTTCACCTTGAGACCCATGGTGG CTGTTTTGGGGGATTGCAAGTAAACACAGTTGTGTCAAAAGCAAGTGTA 3' HindIII
D'autre part, le plasmide pGEM-4Z (Stratagène) est digéré par EcoRI, puis traité à la polymérase Klenow. On religue en insérant un linker MluI pour obtenir le plasmide pPM8.
Enfin, la région 5' non-traduite du gène de la β-globine et la séquence codant pour la protéine de fusion sont récupérées à partir de pPM7 sous forme d'un fragment HindIII - Sacl. Celui-ci est inséré dans pPM8 préalablement digéré par HindIII et Sacl. On obtient ainsi le plasmide pPM9 dans lequel la séquence codant pour la protéine de fusion est placée sous le contrôle du promoteur T7.
pPM9 est linéarisé par digestion MluI ; puis transcrit en utilisant un kit de transcription in vitro (Megascript de Ambion). L'ARN ainsi obtenu est cappé * par adjonction dans le tampon de transcription, de 10 μl d'une solution de m7G(5')ρpp(5')G 5 mM (Pharmacia ; n° produit 27-4635).
6B. La préparation de liposomes est réalisée comme précédemment décrit en 3B.
On utilise environ 60 μg d'ARN obtenu en 6A/30 μmoles de lipides. EXEMPLE 7 : Deuxième préparation de liposomes chargés en ARN codant pour la protéine de fusion du virus de la rougeole.
7A. Préparation de l'ARN .
On prépare un fragment d'ADN synthétique, de séquence (en double brin):
EcoRI Xbal MluI
5 ' GAATTCCACTCTAGACACA 3 ' 3 ' TCGACTTAAGGTGAGATCTGTGTGCGC 5 ' extrémité cohésive Sali
Ce fragment d'ADN est inséré d.ans pPM9 probablement digéré par Sacl et MluI pour donner le plasmide pPMlO qui ne comporte plus de site Sacl.
Le fragment .Xbal - MluI de pPM5 qui comporte l'extrémité 3' non- traduite du gène de la β-globine est récupéré, puis inséré dans pPMlO préalablement digéré put Xbal et MluI pour donner le plasmide pPMll.
pPMll est ensuite linéarisé par digestion MluI ; puis transcrit en utilisant un kit de transcription in vitro (Megascript de Ambion). L'ARN ainsi obtenu est cappé par adjonction dans le tampon de transcription, de 10 μl d'une solution de m7G(5')pρp(5')G 5 mM (Pharmacia ; n° produit 27-4635).
7B. La préparation des liposomes est réalisée comme précédemment décrit en 3B1
On utilise environ 60 μg d'ARN obtenu en 7A/30 μmoles de lipides. EXEMPLE 8 : Préparation de liposomes chargés en ARNs codant pour (i) la protéine de fusion du virus de la rougeole et (ii) l'interleukine-2 humaine.
8A. Préparation de l'ARN.
L'ensemble codant pour le précurseur de l'IL-2 et la région 3' non-traduite du gène de la β-globine du plasmide pPM4 est récupéré sous forme d'un fragment EcoIU - Mul. Ce fragment est inséré dans pPMll préalablement digéré par EcoRI et MluI pour donner le plasmide pPM12.
pPM12 est ensuite linéarisé par digestion MluI ; puis transcrit en utilisant un kit de transcription in vitro (Megascript de Ambion). L'ARN ainsi obtenu est cappé par adjonction dans le tampon de transcription, de 10 μl d'une solution de m7G(5')pρp(5')G 5 mM (Pharmacia ; n° produit 27-4635).
8B. La préparation de liposomes est réalisée comme précédemment décrit en 3B.
On utilise environ 87 μg d'ARN obtenu en 8A/30 μmoles de iipides.
EXEMPLE 9 : Induction d'une réponse CTL initiée par les liposomes préparés dans les exemples 3, 4 et 5.
La réponse CTL est mise en oeuvre et analysée comme décrit dans l'Exemple 2, à 2 modifications près : on précise que l'on utilise 500 μl de chacune des préparations liposomales obtenues dans les exemples 3, 4 et 5 pour injecter une souris (première injection ainsi que rappel) et que l'on effectue les injections par voie sous-cutanée.
Certains tests sont effectués 15 jours après la première injection.
D'autre part, des expériences parallèles permettent de tester (i) l'ARN mélangé à des liposomes mais non encapsulé et (ii) l'ARN pur. Dans le cas (i), on injecte sous un volume de 0,5 - 1 ml, 50 μg d'ARN préparé en 1A mélangé à des liposomes vides préparés selon le procédé décrit en 3B à l'exception de l'addition d'ARN, correspondant à environ 30 μmoles de lipides. Dans le cas (ii), on injecte 50 μg d'ARN préparé en 1A sous un volume d'environ 0,5 - 1 ml.
Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.
Injection Effecteurs P815/- P815 P815 P815
/cible /NP /A-Ban /B-Yam
Figure imgf000025_0001
Ces résultats montrent en particulier que :
- l'ARN seul est inefficace pour induire une réponse immunitaire ;
- l'ARN mélangé à des liposomes mais non encapsulé est inefficace pour induire une réponse immunitaire ;
- l'ARN codant pour NP seul, encapsulé dans des liposomes, est capable d'induire une réponse immunitaire seulement après rappel (comparaison tests # l et 3) ; et
- l'ARN codant pour NP et IL-2, encapsulé dans des liposomes est capable d'induire une réponse immunitaire après une seule injection (comparaison tests
# 2 et 3).
EXEMPLE 10 : Immunisation des souris à rencontre du virus de la rougeole en utilisant les liposomes préparés dans les exemples 6, 7 et 8.
Le modèle animal qui est mis en oeuvre est substantiellement tel que décrit dans Drillien et al, PNAS (1988) 8 : 1252.
On constitue 5 lots de 8 souris BALB/c.
Un lot est réservé au contrôle positif. Ces souris reçoivent 4 x 10' unités formant plages du virus de la vaccine WTGFM1173 par voie intra-péritonéale en une seule injection. WTGFM1173 contient le gène de la protéine de fusion du virus de la rougeole. Il a été décrit comme un agent immunogène actif
(Drillien et al, supra).
Un lot est réservé au contrôle négatif. Ces souris reçoivent par voie sous- cutanée, environ 30 moles de lipides sous forme de liposomes vides préparés selon le procédé décrit en 3B (à l'exception de l'addition d'ARN) en première injection et en rappel 15 jours après.
Les 3 autres lots sont réservés aux tests. Les souris reçoivent par voie sous- cutanée une première injection et un rappel 15 jours après. La première injection et le rappel correspondent chacun à environ 0,4 - 0,6 ml des préparations liposomales des exemples 6, 7 et 8. Environ 15 jours après le rappel, les souris sont testées par injection intracérébraie de 50 1 d'une suspension à 10 % de cellules de cerveau de souriceaux nouveau-nés préalablement infectés par l'isolât SSPE du virus de la rougeole (Wild et al, J. Med. Virol. (1979) 4 : 103).
Ce test indique que les liposomes des exemples 6, 7 et 8 ont une action immunogène similaire à celle du VVTGFM1173.

Claims

REVENDICATTONS
i. Un vecteur de délivrance d'ARN qui comprend un liposome et au moins un fragment d'ARN messager codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène, ledit au moins un fragment d'ARN étant encapsulé dans ledit liposome.
2. Un vecteur de délivrance d'ARN selon la revendication 1, qui comprend un liposome, au moins un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène et un fragment d'ARN codant pour une interleukine-2 ; ledit au moins un fragment d'ARN et ledit fragment d'ARN codant pour une interleukine-2 étant encapsulé dans ledit liposome.
3. Un vecteur de délivrance d'ARN selon la revendication 2, dans lequel ledit au moins un fragment d'ARN et ledit fragment d'ARN codant pour une interleukine-2 étant lié l'un à l'autre de manière à former un fragment d'ARN polycistroπique.
4. Un vecteur de délivrance d'ARN selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel ledit au moins un fragment d'ADN code pour un déterminant antigénique caractéristique d'un virus de la grippe qui est sélectionné parmi la protéine de la nucléocapside dudit virus et l'hémaglutinine dudit virus.
5. Un vecteur de délivrance d'ARN selon la revendication 4, dans lequel un premier fragment d'ARN code pour la protéine de la nucléocapside du virus de la grippe et un deuxième fragment d'ARN code pour l'hémaglutinine du virus de la grippe ; lesdits premier et deuxième fragments d'ARN étant liés l'un à l'autre de mamère à former un fragment d'ARN polydstronique qui est encapsulé dans ledit liposome.
6. Une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention d'une tumeur ou d'une maladie induite par un agent pathogène, qui comprend à titre d'agent thérapeutique un vecteur de délivrance d'ARN selon l'une des revendications 1 à 5, avec un diluent ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
7. L'usage d'un vecteur de délivrance d'ARN selon l'une des revendications 1 à 6, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif d'une tumeur ou d'une maladie induite par un agent pathogène ;
8. Une méthode de traitement curatif ou préventif d'une tumeur ou d'une maladie induite par un agent pathogène qui comprend l'acte d'administrer une quantité suffisante d'un vecteur de délivrance d'ARN selon l'une des revendications 1 à 6, à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
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