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WO1992016644A1 - Moyens pour le diagnostic in vitro de constituants de granules cytoplasmiques et applications biologiques - Google Patents

Moyens pour le diagnostic in vitro de constituants de granules cytoplasmiques et applications biologiques Download PDF

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WO1992016644A1
WO1992016644A1 PCT/FR1992/000240 FR9200240W WO9216644A1 WO 1992016644 A1 WO1992016644 A1 WO 1992016644A1 FR 9200240 W FR9200240 W FR 9200240W WO 9216644 A1 WO9216644 A1 WO 9216644A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
granzyme
antibodies
perforin
constituents
Prior art date
Application number
PCT/FR1992/000240
Other languages
English (en)
Inventor
Marilyne Sasportes
Jurg Tschopp
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority to JP4508582A priority Critical patent/JPH06506112A/ja
Publication of WO1992016644A1 publication Critical patent/WO1992016644A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6467—Granzymes, e.g. granzyme A (3.4.21.78); granzyme B (3.4.21.79)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes

Definitions

  • the invention relates to means for the in vitro diagnosis of constituents of cytotoxic cells and "helper" T cells which play a role in the immune response of an organism.
  • the immune system is capable of responding specifically or not to the introduction into the body of viral, bacterial or allogenic antigens.
  • Two types of cells are responsible for neutralizing and eliminating these different antigens: B lymphocytes and T lymphocytes. These cells provide the two forms of the immune response: the humoral response, mediated by B cells, and the cellular response, mediated by at least two cell populations, namely cytotoxic T lymphocytes (CTLs), and "natural killer” cells (NK).
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • NK natural killer cells
  • cytolytic proteins In cell-mediated cytotoxicity, two lysis processes have been described. One involves the secretion by effector cells (CTLs and NK cells) of cytolytic proteins in the absence of second intracellular messengers.
  • CTLs and NK cells effector cells
  • the second process called regulated lysis, involves the storage of lytic or lysis-associated proteins in cytoplasmic granules, in large quantities, and their secretion only after activation of the surface receptors of effector cells and production of second intracellular messengers.
  • various proteins have been identified, among which, the perforin or protein which forms pores, a family of proteases which are called granzymes, and proteoglycans, proteins of high molecular weight, responsible for the transport of either perforin, or granzymes, to the cell membrane.
  • proteases which are called granzymes
  • proteoglycans proteins of high molecular weight, responsible for the transport of either perforin, or granzymes, to the cell membrane.
  • Perforin was isolated from a cytotoxic line in rats and humans.
  • the work carried out made it possible to observe that in the presence of Ca 2+ , the molecules of perforin polymerize, insert themselves at the level of the plasma membrane of the target cell and form pores causing the destruction of the target cells.
  • Murine and human cDNA clones have been isolated. The genomic sequences of perforin have been reported recently in mice and humans.
  • granzymes As for granzymes, many teams have described their purification from CTL granules or cells with NK / LAK activity (lymphokine activated killer). They represent the majority of proteins in intracytoplasmic granules (85% versus 10% for perforin). Different granzymes have been isolated and characterized in mice as well as in humans. More particularly, six granzymes named granzymes A to F have been described in the cytoplasmic granules of murine CTLs. A seventh granzyme called granzyme G was recently characterized in mouse CTLs. In humans, two granzymes have been isolated corresponding to granzymes A and B, and a third called H does not correspond to any murine granzyme already isolated.
  • the granzymes are synthesized in the form of premolecules containing a signal peptide characteristic of the secreted proteins or having a granular localization. This signal sequence is followed by an acid activating dipeptide which is generally Gly-Glu or Glu-Glu (propeptide) and must be cleaved by a dipepdityl-peptidase to release the mature protein. There is great homology between the different granzymes, which suggests that they belong to a family of granular serine proteases.
  • TcR T receptor to the antigen
  • the granzymes by proteolysis, could cleave constituents of the extracellular matrix or components of the interstitial medium and thus be involved in the phenomena of migration and infiltration of lymphocytes into the tissues during inflammatory processes.
  • proteoglycans Other proteins have been characterized in the granules of CTLs and "NK" cells: these are proteoglycans. These molecules are said to play a role in the "packaging" of perforin and granzymes. They can also constitute a sort of protective barrier on the internal face of the secretory granules, thus protecting the cytotoxic cell from the effects of its own lytic molecules. Perforin and granzymes have been extensively studied in terms of their gene expression by the techniques of
  • lymphocytic infiltrates detected by histology, phenotypically characterized by immunohistochemistry and which are nevertheless devoid of the expression of the messengers of granzymes and perforin.
  • the interpretation of such results remains a question and raises many questions in relation to the state of immunization of the cells of these infiltrates, the effect of immunosuppressive therapy and the actual function of these cells. Only the monitoring of patients over time should make it possible to study the evolution of these cellular infiltrates, their fate and their relationship to the evolution of the rejection or GVH process depending on the treatment administered.
  • Lymphocytic infiltrates detected by histology remain in fact the only operational criterion on which clinicians rely to confirm the clinical diagnosis, whether rejection or GVH in the case of allografts.
  • the object of the invention is therefore to provide new and very specific means of in vitro diagnosis in humans of the presence of the constituents of the granules mentioned above.
  • the antibodies of the invention which are directed against the constituents of cytoplasmic granules of "helper" T cells or of cytotoxic cells, more especially cytotoxic T lymphocytes and "natural killer” cells, are characterized in that they are acts as monoclonal antibodies capable of specifically recognizing an epitope of a given constituent of a human granule, in particular an epitope of human granzyme or human perforin, giving rise to an antigen / antibody type reaction.
  • the term "capable of specifically recognizing an epitope” as used in the description and the claims means that the monoclonal antibodies react with the epitope in question using the immunological techniques ELISA, Western Blot or Immunoprecipitation described in the examples.
  • the monoclonal anti-granzyme antibodies are in particular anti-granzyme A or anti-granzyme B or even anti-granzyme H antibodies.
  • the monoclonal antibodies of the invention are further characterized by the fact that they belong to the class of IgGs and that they are directed against proteins of molecular weight of approximately 25 to 30 kDa (Granzyme B), 60 kDa (Granzyme A) or approximately 66 to 75 kDa (Perforine).
  • the invention also relates to any fragment of the above monoclonal antibodies as soon as it is capable of interacting specifically with a given constituent of said granules, in particular with a granzyme or perforin.
  • the monoclonal antibodies of the invention are also characterized by the fact that they are as obtained by secretion from strains of hybridomas resulting from the fusion of an immortal non-secreting myeloma cell with an antibody-producing cell directed against a given constituent of granules of human cytotoxic cells.
  • the step of merging the two cell types is in particular carried out according to the most commonly used technique, namely that of Kohler and Milstein, Nature, vol 256, p. 495, 1975.
  • Antibody producing cells are splenocytes. These cells are recovered after in vivo immunization of the animal with the appropriate antigen.
  • the constituents of the purified granules are used and injected with an adjuvant. Particularly satisfactory results are obtained by purifying the constituents of the cytoplasmic granules according to the technique of Krahenb ⁇ hl et al. in J. Immunol, 141, 3471-77, 1988.
  • the constituents of the granules are in native form or, alternatively, in recombinant form.
  • a recombinant human granzyme B or a recombinant human perforin is used.
  • anti-granzyme monoclonal antibody means that the antibody is as induced by the native granzyme molecule and the expression "recombinant anti-granzyme monoclonal antibody” as the monoclonal antibody is as induced by a recombinant granzyme molecule.
  • the other constituents of the granules such as perforin.
  • Immortal cells are non-secreting myeloma cells, which makes it possible to obtain hybridomas secreting only the immunoglobulin of the specificity of the producer cell.
  • the hybridomas obtained are cultured and cloned according to the limiting dilution method.
  • the hybridomas whose culture supernatants have the highest titers of antibodies in ELISA are selected.
  • they are injected into animals, for convenience, mice, rats or rabbits and ascites are thus produced in large quantities.
  • the hybridoma strains are maintained in culture in CO 2 incubators.
  • the recovered monoclonal antibodies can be used as they are or are purified, for example by affinity column and stored by freezing, or optionally lyophilized.
  • the invention relates in particular to the monoclonal antibodies against recombinant human granzyme B and recombinant human anti-perforin.
  • Antibodies of this type have been deposited at the
  • the invention particularly relates to the anti-human granzyme B and anti-human granzyme A monoclonal antibodies produced respectively by the clones called GRB 51D and GRA 66D, deposited in the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM), under the numbers 1- 1060 and 1-1059, March 12, 1991. It also describes the mouse anti-perforin monoclonal antibodies deposited at the CNCM under the number I-1058 on March 12, 1991.
  • the invention also relates to the strains of hybridomas producing monoclonal antibodies defined above and more especially the clones producing high titers of antibodies measured by ELISA test.
  • the hybridoma strains of the invention are characterized in that they are formed from hybrid cells resulting from the fusion of immortal cells with a cell producing antibodies directed against a given constituent of cytoplasmic granules of T-helper cells or cytotoxic cells, in particular antibodies directed against granzymes or perforin.
  • This method comprises the fusion and selection steps defined above in relation to the monoclonal antibodies.
  • proteins against which the monoclonal antibodies of the invention are directed are either native proteins or recombinant proteins. These recombinant proteins are new products and, as such, fall within the scope of the invention.
  • amino acid sequences containing at least the active C-terminal part of the mature protein are amino acid sequences containing at least the active C-terminal part of the mature protein.
  • these proteins are produced in cellular hosts, in particular in bacteria, transformed by introduction of expression vectors, in particular of plasmids, containing the gene fragments coding for the amino acid sequences. wanted.
  • fragments are excised from DNA clones encoding the mature proteins and are introduced by ligation into an appropriate site of the chosen vector.
  • the expressed proteins are recovered from the culture medium, after lysis of the bacteria, and purified.
  • transformed cell hosts expression vectors such as plasmids, and DNA fragments as mentioned above are within the scope of the invention. This targets more specifically the recombinant proteins of perforin and granzyme and the tools used for their expression.
  • the invention thus relates to a fragment of the perforin sequence comprising the C-terminal active part of human perforin, more especially the fragment as expressed by the DNA fragment Ball-Bam HI by pAR 3039. It also relates a fragment of the sequence of human granzyme B as expressed by the DNA fragment Ball-Bam MI by pAR 3038.
  • the invention also describes a fragment of the perforin sequence comprising the active C-terminal part of the mature mouse perforin, more especially the fragment as expressed by the 1400 bp Smal-EcoRV DNA fragment.
  • the invention relates in particular to the amino acid sequence extending from position 98 to 534 in FIG. 1. It also relates to the DNA fragment capable of coding for this amino acid sequence, the vectors containing such a DNA fragment, in particular a plasmid vector, as well as the bacteria transformed by incorporation of such vectors, in particular the transformed bacteria mPerf-PL 40 deposited at the CNCM March 12, 1991 under No. 1-1057.
  • the genes of granzymes and of perforin are inducible in vitro and in vivo during cellular activation in normal or pathological situation.
  • Granzymes appear as early markers of cell activation; perforin appears to be preferably a marker for the cytotoxic activity of a cell. These proteins therefore appear as functional markers of cellular and / or cytotoxic activation in humans.
  • the high specificity of the monoclonal antibodies of the invention makes them particularly valuable for demonstrating the presence of such markers in a fluid or a human biological sample.
  • the invention therefore also relates to the application of these monoclonal antibodies as bioreagents for the in vitro diagnosis in a fluid or biological sample of the presence of constituents of the cytoplasmic granules of T "helper" cells or of cytotoxic cells more especially of granzymes or perforin or alternatively, for example, proteoglycans or lymphotoxin-like molecules.
  • the monoclonal antibodies are free. Alternatively, they are fixed on a non-immunogenic solid support.
  • the sample to be tested is brought into contact with a preparation of monoclonal antibodies, or of a fragment as defined above, immobilized on a solid support, under conditions suitable for the production of an antigen-antibody complex with said constituents, in particular respectively with a granzyme or perforin when they are present in the sample, then the formation of such a complex of antigen-antibody type is demonstrated.
  • said constituent more particularly granzyme or perforin, comprises a marker group. It is most generally a radioactive group.
  • a second antibody is used coupled to a group whose activity can be measured such as an enzyme, such as alkaline phosphatase or a fluorescent group.
  • This detection method makes it possible to reveal with great sensitivity and quickly the presence of said constituents, in particular of granzymes or of perforin in a biological sample, in particular to locate and quantify them for example at the level of biopsies of pathological tissue, or peripheral blood cells.
  • the monoclonal antibodies of the invention and their fragments, free or immobilized are used to carry out diagnostics in pathologies where the course of the disease modifies the level of granzyme or perforin.
  • the contribution of the monoclonal antibodies of the invention is therefore important for diagnosing the presence of activated and / or cytotoxic cells in abnormally high numbers in the affected organ, or in the peripheral blood.
  • the recombinant proteins, more particularly of granzyme B and granzyme H of the invention are of great interest in use as autoantigens for recognition by autoantibodies present in autoimmune sera.
  • the procedure is advantageously carried out according to the usual techniques.
  • the invention also relates to a kit for the in vitro diagnosis of the presence of said constituents of the cytoplasmic granules more especially of granzyme or of perforin in a biological sample.
  • an appropriate solid phase serving as a support for the assay such as a micro-titration plate
  • a preparation of said constituents more particularly of granzyme or of perforin with, where appropriate, a marker group, and when the preparation does not contain a marker group, a preparation of a second antibody with a marker group,
  • Monoclonal antibodies are also capable of constituting therapeutic agents of great interest and can play the role of vectors of enzymes or drugs.
  • FIG. 1 the amino acid sequence of the recombinant perforin, the preparation of which is reported in the examples,
  • FIG. 2 the mode of construction of HLPDE3
  • FIG. 3 a partial restriction map of the plasmid pAR 3038
  • FIG. 5 the mode of construction of the plasmid pAR 3039-HuP
  • mice used are BALB / C mice of haplotype H-2d.
  • the polyclonal antibody directed against granzyme B is as obtained according to the technique described by Krâhenb ⁇ hl (see reference above).
  • the REX line is a T line immortalized by the Epstein Barr virus.
  • the monoclonal antibody PAb419 is directed against the T antigen of SV40 (Harlow et al., J of Virology, 861-869, 1981). 1-2 Solutions
  • MILLIEU 1 RPMI 1640 (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO).
  • MEDIUM 2 RPMI 1640 (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 250 u / ml interleukin 2 (Roussel Uclaf, 0.7 10 6 u BRMP / sample ).
  • MEDIUM 3 RPMI (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM sodium pyruvate (GIBCO), 10% inactivated fetal calf serum (GIBCO), 0.36%. glucose (A.P.).
  • MIDDLE 4 Dubecco's M0D Eagle Medium (GIBCO),
  • MEDIUM 5 Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM Sodium pyruvate (GIBCO), 10% inactivated fetal calf serum (GIBCO), 10% inactivated horse serum (GIBCO), 10% NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo), 2% Hypoxanthine (GIBCO), 2% Thymidine (GIBCO), 2% Aminopterin (GIBCO).
  • RIPA 10 mM Tris pH 8.1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1% Na deoxycholate, 0.1% SDS.
  • Laemmli buffer (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970): 62.5 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 15% glycerol, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue. II - Methods
  • Lymphocytes are isolated from peripheral blood by ficoll gradient (PHARMACIA). After 2 washes in medium 5, the cells are counted in Hayem solution and incubated at the rate of 3 ⁇ 10 8 cells in culture flasks (COSTAR) pretreated with inactivated SHN for 1 hour at 37 ° C. The non-adherent cells are then collected, washed in RPMI SHN 10% and fractionated by centrifugation on a discontinuous percoll gradient (PHARMACIA). 4 solutions of different percoll concentration are prepared (31%, 34%, 37% and 41%). One out of two solutions is prepared in RPMI medium (red), or in isotonic Na chloride solution (colorless), thus allowing good visualization of the interfaces.
  • mice with granzymes A and B purified from LGL from peripheral blood or from NK cells. 10 ⁇ g of purified proteins (granzyme A and B) dissolved in 200 ⁇ g of Vaccicox R (109 units), adjuvant, are injected intraperitoneally into a BALB / C mouse. 21 days later, a reminder is carried out thanks to a second intravenous injection (10 ⁇ g of protein dissolved in 200 ⁇ g of physiological saline).
  • the mouse is sacrificed and its spleen is removed in a sterile medium. It is diluted with a 5 ml syringe plunger in a sterile Petri dish containing 5 ml of RPMI. The splenocyte solution is then washed with 50 ml of RPMI. After centrifugation, the cell pellets are stored at room temperature.
  • the NS-1 myeloma cells cultured in medium 2 are centrifuged for 7 min at 1500 rpm, then washed in 50 ml of RPMI.
  • the cell pellets are resuspended in 10 ml of RPMI, and transferred to the tube containing the splenocytes according to the ratio of 1 myeloma cell to 2 splenocytes. This mixture is adjusted to 40 ml with RPMI, then centrifuged for 7 min at 1500 rpm at 20 ° C.
  • the mixed cell pellet is resuspended with 1 ml of PEG (polyethylene glycol 1500, BOEHRINGER), (fusing agent), by gently turning the pipette in the tube for 1 min.
  • PEG polyethylene glycol 1500, BOEHRINGER
  • the PEG is diluted by adding in 1 min 1 ml of RPMI 1640 preheated to 37 ° C and then 7 ml of the same medium in 2 min to reduce the toxicity of this product. After centrifugation at 1800 rpm for 4 min without brake, the cell pellet is resuspended in 10 ml of medium (4) preheated to 37 ° C.
  • Cells are distributed in sterile 96-well flat-bottom plates at the rate of 105 myeloma cells in 100 ⁇ l per well (time 0).
  • the preparation of the 96-well flat-bottom plates is carried out 24 hours before the test. For this purpose, 100 ⁇ l of antigen (purified granzymes A or B), at 1 ⁇ g / ml (in
  • PBS PBS
  • Tween 20 are performed before testing the culture supernatants of the hybridomas. The plates are incubated for 1 hour at
  • the development is carried out by adding 100 ⁇ l of a solution containing the substrate (10 ⁇ l PBS, 3% H2O2 in 12.5 ml of ABTS 180 mg / 1). The plates are read by measuring the OD at 405 nm 15 to 25 min after the addition of the substrate.
  • the supernatants of 28 hybridomas designated GRB were found to be specific for granzyme B in the ELISA test (test carried out with purified protein).
  • the percentage of hybridomas secreting specific antibodies is particularly satisfactory, in fact out of 300 hybridomas resulting from the fusion between the NSI myeloma cells and the splenocytes of the mouse immunized with purified granzyme B, 10% secrete specific antibodies in test ELISA. In the case of granzyme A, 5% of the hybridomas of the second fusion are specific under the same conditions.
  • the hybridomas whose supernatants have the highest positivity in the ELISA test are cloned into 96-well plates with flat bottom. Several dilutions are tested. Cloning is carried out at 100 cells, 10 cells, 1 cell and 0.25 cells per well at the rate of 100 ⁇ l of medium 4 per well.
  • the cells are fed 3 days after cloning with 100 ⁇ l of medium 4, then every 7 days.
  • the culture supernatant of these wells is tested by ELISA on the granzymes purified on granzyme A or B and on the lyzozyme as negative control.
  • Positive hybridomas are transferred to 24-well plates, then to 6-well plates and thereafter in a vial to maintain growth exponential of cells. These hybridomas are injected into the peritoneum of mice to produce ascites. They can be left in culture until cell death in order to obtain highly concentrated supernatants studied in Western blotting or in immunoprecipitation.
  • hybridomas secreting antibodies recognizing granzyme B called respectively GRB98C and GRB51D and three other strains secreting antibodies recognizing granzyme A, called GRA66D, GRA382E and GRA10D are recovered. The remaining hybridomas will be cloned in order to constitute a panel of antibodies directed against human granzymes A and B.
  • the culture supernatant of hybridoma to be tested is diluted 1/10 in 20 mM Tris pH 7.6, 137 mM NaCl (TBS).
  • TBS Tris pH 7.6, 137 mM NaCl
  • the kit strip is incubated for 15 min at room temperature with the diluted supernatant. After 3 washes in TBS, 0.1% Tween 20 (TBS-T), the strip is incubated in a solution of anti-mouse antibodies coupled to peroxidase (diluted 1/500 in TBS-T).
  • the revelation is carried out by incubating the strip for 15 min at room temperature in 3 ml of a solution containing the substrate (1 chloronaphthol tablet dissolved in 10 ml of cold methanol, mixed immediately with 50 ml of TBS containing a drop of hydrogen peroxide). After 3 washes in distilled water, the strips are dried and can be interpreted.
  • the immunization technique used in this study made it possible to obtain hybridomas secreting antibodies of isotype IgG.
  • the antibody isotype was confirmed by the kit marketed by Amersham of mouse monoclonal antibodies.
  • the monoclonal antibodies GRB98C, GRA66D, GRA382E and GRA10D have the IgG1 isotype.
  • the one secreted by the GRB51D hybridoma has the IgG2a isotype.
  • Titration of culture supernatants of cloned hybridomas by ELISA test made it possible to determine a culture supernatant of the hybridoma GRB98C of 1000. Those of the culture supernatants of the hybridomas GRB51D, GRA66D and GRA10D are 10 000.
  • the title of the culture supernatant of the hybridoma GRA382E is 100,000. The high values of these titles should be noted.
  • the protein (purified antigen: granzymes A or B, or negative control) is incubated in Laemmli buffer at 100 ° C for 10 min (1 ⁇ g / gel 12 cm wide), migrates on a denaturing polyacrylamide gel, then is electrotransferred on a nitrocellulose filter (BA83, CERA LAB0) in a graphite electrode device (CERA LABO), in a 39 mM glycine buffer, 48 mM Tris pH 8.3, 0.037% SDS, 20% methanol under a current of 1 mA / cm2 of filter for 1.5 to 2 hours. After transfer, the nitrocellulose filter is colored with 0.2% culvert red and 0.3% trichloroacetic acid to verify the effectiveness of the transfer, then cut into strips 0.6 cm wide.
  • the strips are preincubated in a PBS buffer with 0.2% Tween 20 and 5% skimmed milk for 1 hour at 4 ° C.
  • a set of strips, representing different proteins to be tested, are incubated overnight at 4 ° C. with the hybridoma supernatant diluted 1/10 in the PBS buffer containing 0.2% Tween 20 and 5% skimmed milk.
  • the strips are then washed in PBS buffer containing 0.2% Tween 20 with moderate stirring for 5 times 5 min at laboratory temperature.
  • the strips were incubated with an anti-mouse immunoglobulin coupled to alkaline phosphatase antibody (diluted 1/1000 in PBS buffer above) for 2 hours at laboratory temperature.
  • the strips are equilibrated in the alkaline phosphatase reaction buffer (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2 ) and placed in the presence of the phosphatase substrate (10 ml of reaction buffer, 44 ⁇ l of nitro-blue tetrazolium chloride, 33 ⁇ l of (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidine) salt for 15 minutes at room temperature.
  • the reaction can be stopped by washing the strips with H 2 O.
  • Granzyme B reduced and denatured, is electrotransferred on a nitrocellulose filter.
  • the nitrocellulose strips are incubated with the various antibodies to be tested, then with an anti-mouse antibody conjugated to alkaline phosphatase.
  • the LGLs are placed in culture (medium: RPMI methionine depreciated, supplemented with methionine 35 s: 20 to 50 ⁇ Ci / ml and in 1% inactivated SHN) at a rate of 3 to 5 ⁇ 10 5 cells per ml.
  • the labeling can be carried out in an RPMI medium which has been leucine-depleted and supplemented with 20 to 50 ⁇ Ci / ml of 3H leucine. After a 4 hour incubation at 37 ° C, the cells are washed twice in PBS.
  • the cell pellet is taken up in 500 ⁇ l of RIPA-0.01% BSA (B2518, SIGMA), then sonicated for 15 s (micro sonicator, power 40 watts, probe 0.3-87, BIOBLOCK). The incorporation of radioactivity is followed by counting a fraction precipitated with TCA. The cell extract is aliquoted at 5 x 10 6 cpm.
  • the eluate is incubated for 4 hours at 4 ° C. with shaking, in the presence of 200 ⁇ l of culture supernatant to be tested; 40 ⁇ l of protein A Sepharose R and 20 ⁇ l of RIPA-0.01% BSA (B2518, SIGMA).
  • the antigen-antibodyprotein A Sepharose R complex is filtered, then washed, eluted with 45 ⁇ l of Laemmli buffer and boiled for 10 min at 100 ° C.
  • the samples are deposited on a polyacrylamide gel (12.5%) in the presence of SDS. After migration to 40 mA 200 V, the gel is fixed, treated with EN3HANCE (DUPONT de NEMOURS) washed in distilled water, dried for 1 hour at 80 ° C and fluorographed on Hyperfilm-MP (AMERSHAM) at -80 ° C.
  • EN3HANCE DUPONT de NEMOURS
  • a band is observed at 31 KD corresponding to the migration of the LGL cell extract, immunoprecipitated by the anti-granzyme B antibodies, GRB51D and GRB98C. This band at 31 KD is also observed for the same cell extract immunoprecipitated by the anti-granzyme B polyclonal serum. On the other hand, this band is not detected with a negative control.
  • the migration of the REX cell extract (cells not expressing granzymes) immunoprecipitated by the antibodies described above does not reveal any band at this molecular weight.
  • JANSSEN tetra-methyl-pentadecane
  • the protein A column stored in 0.02% Na azide, is washed with 5 ml of binding buffer. 2 ml of ascites, diluted 1/2 in the binding buffer, are placed on the column. After washing with 15 ml of binding buffer, the IgGs (immunoglobulins G) are eluted with 5 ml of elution buffer. This column is regenerated with 8 ml 0.1 M citric acid pH 3 and stored in 0.02% Na azide.
  • the eluted fractions are desalted on Exocellulose columns with 10 ml of PBS. These desalting columns are regenerated with 15 ml of PBS and stored in 0.02% Na azide.
  • the LGLs were incubated with antibodies recognizing granzymes A and B, selected by the ELISA test as reported above.
  • the analysis is done by light microscopy.
  • GVH graft-against-host reaction
  • the tissue sections are saturated with horse serum (Vectastin kit, VECTOR) for 20 min at room temperature. After washing in PBS, 2.5 ⁇ g of the antibody to be tested are deposited on the section for 30 min at room temperature. The results of experiments carried out with the anti-granzyme antibodies GRA51D and GRA66D are reported.
  • the slides are washed 3 times in PBS and then incubated with 50 ⁇ l of anti-Ig antibodies from biotinylated mice (Vectastin kit) for 30 min at room temperature, then with avidin mixed with biotinylated peroxidase (Vectastin kit) for 1 hour at room temperature.
  • the revelation is carried out by incubating for 10 min at room temperature the slide covered with 50 ⁇ l of a solution containing the substrate (1 tablet (10 mg) of diaminobenzidine, dissolved in 10 ml of 50 mM Tris pH 7.6, mixed immediately with 100 ⁇ l of 0.03% H 2 O 2 ).
  • the slides are washed and the tissue sections are stained with Meyer's Hemalun for 1 min at room temperature.
  • the tissue sections are washed, dehydrated in ethanol baths (70%, 90% and 100%), passed through toluene and mounted with a drop of mounting resin. The analysis is done by light microscopy.
  • a 1400 bp Smal-EcoRV fragment is excised from a complete mouse perforin cDNA clone. This segment codes for the C-terminal part of the perforin of mature mice covering residues 98 to 534 (see single figure).
  • the blunt end of the segment is ligated into the BamHI site of the vector pAR3039 using phosphorylated linkers (5 '- CCG GAT CCGG-3').
  • This plasmid is called pAR3039-perf.
  • E.coli DE3 bacteria are transformed with this plasmid which contain in their genome the T7 polymerase gene under the control of an inducible promoter
  • the recombinant 45 kDa perforin is purified by lysing the bacterial pellet (from 100 ml of culture) with 20 ml of a solution containing 50 mM Tris-HCl, pH
  • the bacterial DNA is then fragmented by sonication and the protein inclusion bodies are centrifuged for 15 minutes at 12,000 rpm. The pellet is washed three times with a solution of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA and 300 mM NaCl and dissolved in SDS-PAGE buffer.
  • the 45 kDa recombinant protein is separated from the majority of bacterial proteins by SDS-PAGE (10% polyacrylamide gel) and subjected to electroelution using the ISC0 protein elution device.
  • 1 to 2 mg of recombinant perforin is routinely obtained from 100 ml of bacterial culture.
  • Maize OFA rats are immunized intraperitoneally with 50 ⁇ g of murine recombinant perforin (or rMup) and then by a second injection, intraperitoneally, 3 weeks later. 3 days before removing the splenocytes (for the production of hybridomas), 50 ⁇ g of rMuP are injected into the tail vein without adjuvant. 2) Production of hybridomas and selection:
  • the fusion of Sp2 / O-Ag86 myeloma cells not producing immunoglobulins is carried out with splenocytes from rats immunized with rMuP. Briefly, the splenocytes are recovered by introducing carefully into the tissues of the spleen with a needle and a syringe of RPMI medium devoid of serum. The splenocytes are washed with the medium as carried out with the myeloma cells.
  • 108 splenocytes are then mixed with 107 myeloma cells in a 50 ml FALCON tube and subjected to centrifugation for 10 minutes at 1000 rpm. We eliminate as much supernatant as possible.
  • the cells are resuspended by gently tapping the walls of the tube and 0.4 ml of hot polyethylene glycol 1500 50% (w / v) (PEG, Serva, cat. No. 33123) is added dropwise while maintaining the tube in a water bath at 37 oC. After the addition of all the PEG, the tube is maintained at 37 ° C for 3 min and then centrifuged at 800 rpm for 5 min.
  • PEG polyethylene glycol 1500 50% (w / v)
  • RPMI medium devoid of serum (at 37 ° C.) is added over 2 min, then again 5 ml at once.
  • the cells are centrifuged at 1000 rpm for 5 min.
  • the supernatant is removed and 50 ml of complete RPMI medium - 5% FCS is added.
  • the cell suspension is distributed into ten 96-well plates to which peritoneal monocytes / macrophages (feeder cells) from Balb / c mice (1 to 5 days before) have been added beforehand. The plates are incubated at 37 ° C.
  • 96-well microtiter plates (Dynatech, MIC 2000) are covered for approximately 14 hours at 4 ° C. with 100 ⁇ l of rMuP (10 ⁇ g / ml in PBS).
  • the wells are covered with granules derived from murine CTL B6.1 (solubilized in 1.5 M NaCl, ultracentrifuged and diluted 1/10 in water) or granules of human LAK cells (solubilized in phosphate 0.5 M, ultracentrifuged and diluted 1/5 in water). After washing the wells three times with 0.02% Tween-20 PBS, 100 ⁇ l of hybridoma supernatant is added to each well in 2 h at room temperature.
  • the wells are washed as indicated above and 50 ⁇ l of goat anti-rat immunoglobulins conjugated with alkaline phosphatase (Sigma) are added in 1 hour. After washing, 100 ⁇ l of phosphatase substrate (p-nitrophenyl phosphate, Sigma 104 tablets) is added and the A405nm is measured as soon as the color begins to appear.
  • phosphatase substrate p-nitrophenyl phosphate, Sigma 104 tablets
  • the negative control wells are incubated with cRPMI-5% FCS instead of being incubated with supernatants of hybridomas. We thus recover the anti-perforin monoclonal antibody designated by the abbreviation CE2.10 deposited at the CNCM under the number 1-1058 on March 12, 1991.
  • the fixed cells are resuspended in 1 ml 0.2% PBS.
  • Tween 900 ⁇ l PBS + 100 ⁇ l of Tween 2% stock solution).
  • washing solution 1 PBS 2% FCS, final 10 mM NaN3
  • the suspension is centrifuged 8 min at 250 rpm.
  • the supernatant is rejected; the cellular samples are then accessible for the study of intragranular proteins.
  • an antibody buffer solution In order to reduce non-specific binding, 50 ⁇ l of an antibody buffer solution are added to the cell pellet.
  • - Permeabilization control an anti-cytoskeleton antibody, the anti-tubulin ⁇ , (1a tubulin a being a strictly intra-cellular protein), is tested on all cell populations.
  • washing solution (2) 0.2% PBS, Tween 20, 2% FCS, 10 mM final NaN3). Centrifugation is carried out 8 min at
  • Tertiary antibody in order to carry out a simultaneous cytofluorometry study of the expression of perforin and granzyme B according to the phenotype and the functional state of the lymphocytes, an incubation with antibodies recognizing membrane antigens is carried out.
  • anti CD3 at a rate of 0.125 ⁇ g (2.5 ⁇ l / test),. anti CD8 at 0.03 ⁇ g (2.5 ⁇ l / test) and
  • the cells thus treated are resuspended in PBS-azide medium and analyzed within two hours. If the cells are analyzed later, they are returned to PBS-PFA 1% medium.
  • This technique was used to compare the expression of granzyme B and perforin in umbilical cord blood lymphocytes with that of adult lymphocytes and assess cytoxicity in the case of transplants.
  • the material used consists of frozen biopsies and bronchoalveolar washes for lung rejections.
  • TBS buffer Solution A 100 ⁇ l + solution B 100 ⁇ l + 800 ⁇ l ED pH 7.6
  • TEN 50 mM Tris and 0.5 mM EDTA + 300 mM NaCl DE3 strain (E.coli) containing a chromosome with the T7 polymerase gene under the control of a promoter inducible by IPTG
  • the cultures are diluted to 1:10 in M9 + Amp. CAA, trp.
  • the T7 RNA polymerase gene is induced with 0.4 mM IPTG.
  • the cells are recovered and stored on ice before centrifugation carried out in 50 ml tubes, at 3500 rpm, 30 min at 4 ° C.
  • the pellet is frozen to -20 ° C if necessary.
  • the lysis is allowed to take place on ice for 30 min to 2 hours.
  • the pellet is washed two to three times in TEA and then sonication is carried out to clarify the medium if necessary.
  • the pellet is taken up in 500 ⁇ l of SDS buffer. For complete cell extraction, 1 ml of cell pellet is resuspended in approximately 200 ⁇ l of SDS buffer.
  • a control is also prepared without induction by IPTG or a plasmid with an insert in a wrong orientation.
  • nucleotide 116 is changed from A to T by mutagenesis in vitro, which results in a change in the amino acid site of granzyme 3 (from glu to val ).
  • This construction allows the expression of the recombinant granzyme B whose sequence differs from that of the native human granzyme B in that it is preceded by Met and that amino acid 6 is not Glu but Val.
  • the bacterial expression vector PAR 3038 uses the promoter of bacteriophage T7 to selectively express the recombinant proteins.
  • the DE3 bacteria of the E. coli strain containing an endogenous chromosomal T7 polymerase gene under the control of a promoter inducible by IPTG, are transformed by the plasmid AR-3038 B.
  • the cells are allowed to grow 2 to 3 hours until an absorbance at 600 nm of 0.8 to 0.9.
  • the TA polymerase gene is then induced for 3 hours by the addition of 0.4 mM IPTG.
  • the cells are collected and the recombinant protein is isolated from the insoluble protein fraction.
  • the cell pellet (of 50 ⁇ l of culture) is resuspended in 5 ml of Tris Hcl (50 mM), 0.5 mM EDTA, pH 7.5, supplemented with 0.75 mg / ml of lysozyme and left on ice for two hours.
  • the protein precipitate is recovered by centrifugation (6000 g, 30 min, 40 ° C) washed three times in 50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 300 mM NaCl, pH 7.5 and dissolved in SDS-PAGE buffer.
  • the 25 kDa recombinant protein is separated from the main bacterial proteins by SDS-PAGE and electroeluted using the Biorad protein eluting device, following the manufacturer's instructions.
  • Figure 4 gives the nucleotide sequence of human granzyme B and the corresponding amino acid sequence.
  • a human perforin cDNA is used as isolated from a cDNA library (lambda ZAP-LAK) in a vector pBs / clone 15.
  • the plasmid containing a cDNA insert of human perforin is called pAR 3039 HuP.
  • This plasmid contains an ampicillin resistance gene.
  • the construction method is shown in FIG. 5.
  • the Sma / Eco RI cDNA insert comprises 1600 base pairs; this fragment codes for the amino acid sequence going from position Arg98 to Trp534.
  • RNA Transcription into RNA is induced by IPTG.
  • pAR 3039 is adapted with BamHI to Smal using as adapter GATCCCCGGG (Pharmacia).
  • the Hu perforin Sma I fragment (from pBS / clone 15) is subjected to a ligation step.
  • the open reading frame is controlled by sequencing.
  • FIG. 6 represents the nucleotide pAR 3039 - HuP and the amino acid sequence deduced from the recombinant protein. The sequence of clone 34 is also indicated.

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Abstract

L'invention concerne des moyens pour la détection de constituants de granules cytoplasmiques sécrétés par des cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques en particulier pour la détection de granzyme ou de perforine caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement un épitope de ces constituants en donnant lieu à une réaction immunologique de type antigène-anticorps.

Description

MOYENS POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO DE CONSTITUANTS DE
GRANULES CYTOPLASMIQUES ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES
L'invention concerne des moyens pour le diagnostic in vitro de constituants des cellules cytotoxiques et des cellules T "helper" jouant un rôle dans la réponse immunitaire d'un organisme.
Le système immunitaire est capable de répondre spécifiquement ou non à l' introduction dans l'organisme d'antigènes viraux, bactériens ou allogéniques. Deux types de cellules sont responsables de la neutralisation et de l'élimination de ces différents antigènes : les lymphocytes B et les lymphocytes T. Ces cellules assurent les deux formes de la réponse immunitaire : la réponse humorale, médiée par les cellules B, et la réponse cellulaire, médiée par au moins deux populations cellulaires, à savoir les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs), et les cellules "natural killer" (NK).
Dans la cytotoxicité à médiation cellulaire, deux processus de lyse ont été décrits. L'un comporte la sécrétion par les cellules effectrices (CTLs et cellules NK) de protéines cytolytiques en l'absence de seconds messagers intracellulaires. Le deuxième processus, appelé lyse régulée, comprend le stockage des protéines lytiques ou associées à la lyse dans les granules cytoplasmiques, en grande quantité, et leur sécrétion seulement après activation des récepteurs de surface des cellules effectrices et production de seconds messagers intracellulaires.
Dans ces granules, différentes protéines ont été identifiées, parmi lesquelles, la perforine ou protéine qui forme des pores, une famille de protéases que l'on appelle les granzymes, et les protéoglycanes, protéines de haut poids moléculaire, chargées du transport soit de la perforine, soit des granzymes, vers la membrane cellulaire. Au cours de l'interaction de l'effecteur avec sa cible et de son activation, il se produit une exocytose des vésicules intracytoplasmiques granulaires qui sécrètent leur contenu dans l'espace intercellulaire formé par le contact effecteur/cible, provoquant la lyse de la cellule cible.
La perforine a été isolée à partir d'une lignée cytotoxique chez le rat et chez l'homme.
Les travaux effectués ont permis d'observer qu'en présence de Ca2+, les molécules de perforine polymérisent, s ' insèrent au niveau de la membrane plasmique de la cellule cible et forment des pores entraînant la destruction des cellules cibles.
Des clones d'ADNc murin et humain ont été isolés, On a rapporté récemment les séquences génomiques de la perforine chez la souris et l'homme.
Quant aux granzymes, de nombreuses équipes ont décrit leur purification à partir de granules de CTLs ou de cellules à activité NK/LAK (lymphokine activated killer). Ils représentent la majorité des protéines des granules intracytoplasmiques (85 % versus 10 % pour la perforine). Différents granzymes ont été isolés et caractérisés chez la souris ainsi que chez l'homme. Plus particulièrement, six granzymes nommés granzymes A à F ont été décrits dans les granules cytoplasmiques de CTLs murins. Un septième granzyme appelé granzyme G a été récemment caractérisé dans les CTLs de souris. Chez l'homme, on a isolé deux granzymes correspondant aux granzymes A et B, et un troisième appelé H ne correspondant à aucun granzyme murin déjà isolé.
Les granzymes sont synthétisés sous forme de prémolécules contenant un peptide signal caractéristique des protéines sécrétées ou ayant une localisation granulaire. Cette séquence signal est suivie d'un dipeptide acide d'activation qui est en général Gly-Glu ou Glu-Glu (propeptide) et doit être clivé par une dipepdityl-peptidase pour libérer la protéine mature. Il existe une grande homologie entre les différents granzymes, ce qui suggère qu'ils appartiennent à une famille de serines protéases granulaires.
Ils contiennent tous les résidus His57, Asp102 et Serl95 qui forment la triade catalytique des serines estérases. Tous les granzymes matures commencent par la séquence N-terminale Ile-Ile-Gly-Gly (résidus 16-19), puis une séquence variable ( résidus 20-23), suivie d 'une séquence conservée (résidus 24-30). Ce sont des protéines plus ou moins glycolysées. Six résidus Cys conservés forment trois ponts disulfures intra-chaîne.
L'approche par la biologie moléculaire a permis d'isoler des gènes codant pour des granzymes exprimés spécifiquement dans les CTLs.
Plusieurs rôles ont été attribués aux granzymes.
On a rapporté notamment une action indirecte sur la perforine en augmentant son activité lytique, favorisant la fragmentation de l'ADN de la cellule cible.
Ils pourraient également intervenir dans le mécanisme du détachement du CTL de sa cible après la délivrance du coup létal par clivage du complexe TcR/ antigène (TcR = récepteur T à l'antigène) et des autres complexes récepteur/ligands impliqués dans les phénomènes d'adhésion cellulaire.
Enfin les granzymes, par protéolyse, pourraient cliver des constituants de la matrice extracellulaire ou des composants du milieu interstitiel et être ainsi impliqués dans les phénomènes de migration et d'infiltration des lymphocytes dans les tissus au cours de processus inflammatoires.
D'autres protéines ont été caractérisées dans les granules de CTLs et de cellules "NK" : il s'agit des proteoglycanes. Ces molécules joueraient notamment un rôle dans le "packaging" de la perforine et des granzymes. Elles peuvent également constituer une sorte de barrière protectrice de la face interne des granules sécrétoires, protégeant ainsi la cellule cytotoxique des effets de ses propres molécules lytiques. La perforine et les granzymes ont été très étudiés au niveau de leur expression génique par les techniques de
Northern Blot et de Dot Blot et plus récemment par la technique d'hybridation in situ utilisant des ribosondes spécifiques.
Les études réalisées in vitro et, in vivo en situation pathologique chez la souris et chez l'homme, montrent que ces gènes sont inductibles au cours de l'activation cellulaire de lymphocytes T, de cellules présentant une activité NK/LAK et ce, de façon précoce. Chez l'homme, l'expression des gènes des granzymes et de la perforine a pu être observée dans différentes situations pathologiques comme les désordres hématologiques, les maladies auto-immunes, les maladies dermatologiques et les maladies infectieuses parasitaires, bactériennes ou virales. Enfin, les ARNm des granzymes et ou de la perforine ont pu être détectés par hybridation in situ au site de plusieurs types d'allogreffes.
L'expression du gène du granzyme B a été observée au niveau des cellules infiltrant des allogreffes de reins. L'expression des gènes du granzyme B et/ou de la perforine a pu être détectée dans les cellules préférentiellement CD8+ dans les infiltrats lymphocytaires de biopsies endomyocardiques réalisées chez des patients présentant un rejet. Une étude similaire a été réalisée au niveau de biopsies de peaux de patients atteints de GVH (Graft versus host reaction) après greffe de moelle allogénique HLA génoou phéno-identique.
Les études réalisées ont permis d' observer lors de la suspicion d'un rejet au cours d'une greffe d'organe
(coeur, rein) ou d'une GVH après greffe de moelle osseuse, la présence d' infiltrats lymphocytaires "silencieux" détectés par l'histologie, caractérisés phénotypiquement par l'immunohistochimie et qui sont néanmoins dépourvus de l'expression des messagers des granzymes et de la perforine. L'interprétation de tels résultats demeure une interrogation et soulève de nombreuses questions en relation avec l' état d'immunisation des cellules de ces infiltrats, l'effet du traitement immunosuppresseur et la fonction réelle de ces cellules. Seul le suivi des patients dans le temps devrait permettre d'étudier l'évolution de ces infiltrats cellulaires, leur devenir et leur relation à l'évolution du processus de rejet ou de GVH en fonction du traitement administré.
On mesure donc l'intérêt de la recherche de l'expression génique des granzymes et de la perforine au cours de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique in vivo.
La plupart des études effectuées ont été réalisées par Northern Blot, Dot Blot, hybridation in situ. Bien qu' informatives, ces techniques sont lourdes et ne permettent en aucun cas d'étudier un grand nombre de patients avec le suivi nécessaire à la connaissance de l'évolution de leur pathologie.
Les infiltrats lymphocytaires dét<- 'tés par l'histologie restent en fait le seul critère opérationnel sur lequel s'appuient les cliniciens pour confirmer le diagnostic clinique, qu'il s'agisse de rejet ou de GVH dans le cas des allogreffes.
Il est clair que dans toutes ces applications à la clinique, au lieu de détecter des messagers des granzymes et de la perforine, il serait plus aisé de détecter les protéines à l'aide d'anticorps.
L'aspect fondamental qui implique la compréhension du rôle biologique des granzymes et de la perforine requiert également une analyse fine et efficace à l'aide d'anticorps.
Mettant à profit leur avance technique dans ce domaine et leur grande maîtrise des techniques d'isolement et de purification des granzymes et de la perforine, les inventeurs ont développé de nouveaux outils permettant de diagnostiquer chez l'homme la présence de constituants des granules cytoplasmiques dans des échantillons biologiques à étudier.
Utilisant l'approche immunologique pour résoudre les problèmes posés à ce jour, les inventeurs ont produit des anticorps de haute spécificité vis-à-vis des protéines précitées.
L' invention a donc pour but de fournir de nouveaux moyens très spécifiques de diagnostic in vitro chez l'homme de la présence des constituants des granules évoqués ci- dessus.
Elle vise également une méthode de diagnostic permettant de simplifier la détection de ces produits en recherche clinique et fondamentale.
Les anticorps de l'invention, qui sont dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules "natural killer", sont caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de reconnaître spécifiquement un épitope d'un constituant donné d'un granule humain, en particulier un épitope de granzyme humain ou de la perforine humaine, en donnant lieu à une réaction du type antigène /anticorps.
L'expression "constituant des granules" telle qu'utilisée dans la description et les revendications recouvre aussi bien la forme native du constituant, qu'une forme recombinante active telle qu'obtenue par les techniques classiques de génie génétique sur la base de la séquence d'acides aminés des granzymes ou de la perforine chez l'homme, ou des séquences d'acides aminés déduites des séquences de nucléotides des gènes humains codant pour ces protéines. Ainsi les granzymes ou la perforine auxquels il est fait référence sont soit sous leur forme native, soit sous une forme recombinante, comportant au moins la partie active de ces granzymes ou perforine.
L'expression "capable de reconnaître spécifiquement un épitope" telle qu'utilisée dans la description et les revendications signifie que les anticorps monoclonaux réagissent avec l'épitope en question en utilisant les techniques immunologiques ELISA, Western Blot ou Immunoprécipitation décrites dans les exemples. Les anticorps monoclonaux anti-granzymes sont en particulier des anticorps anti-granzyme A ou anti-granzyme B ou encore anti-granzyme H humains.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont encore caractérisés par le fait qu'ils appartiennent à la classe des IgG et qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (Granzyme B), 60 kDa (Granzyme A) ou 66 à 75 kDa environ (Perforine).
L'invention vise également tout fragment des anticorps monoclonaux ci-dessus dès lors qu'il est capable d' interagir spécifiquement avec un constituant donné desdits granules, en particulier avec un granzyme ou de la perforine.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont également caractérisés par le fait qu'ils sont tels qu'obtenus par sécrétion à partir de souches d'hybridomes résultant de la fusion d'une cellule immortelle de myélome non sécréteur avec une cellule productrice d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules de cellules cytotoxiques humaines.
L'étape de fusion des deux types cellulaires est notamment réalisée selon la technique la plus couramment utilisée à savoir celle de Kôhler et Milstein, Nature, vol 256, p. 495, 1975.
Les cellules productrices d'anticorps sont des splénocytes. Ces cellules sont récupérées après immunisation in vivo de l'animal avec l'antigène approprié.
Pour l'étape d'immunisation, on utilise les constituants des granules purifiés et on les injecte avec un adjuvant. Des résultats particulièrement satisfaisants sont obtenus en purifiant les constituants des granules cytoplasmiques selon la technique de Krahenbϋhl et al. dans J. Immunol, 141, 3471-77, 1988.
Les constituants des granules sont sous forme native ou, en variante, sous forme recombinante. On utilise notamment un granzyme B humain recombinant ou une perforine humaine recombinante. Dans la description et les revendications, l'expression "anticorps monoclonal anti-granzyme" signifie que l'anticorps est tel qu'induit par la molécule native de granzyme et l'expression "anticorps monoclonal anti- granzyme recombinant" que l'anticorps monoclonal est tel qu'induit par une molécule recombinante de granzyme. Il en est de même pour les autres constituants des granules, comme la perforine.
Les cellules immortelles sont des cellules de myélome non sécréteur, ce qui permet d'obtenir des hybridomes ne sécrétant que l'immunoglobuline de la spécificité de la cellule productrice.
Conformément à la technique classique, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clones selon le procédé de dilution limite. On sélectionne avantageusement les hybridomes dont les surnageants de culture présentent les titres les plus élevés d'anticorps en ELISA. Pour accroître la production d'anticorps, on les injecte à des animaux, par raison de commodité, à des souris, à des rats ou à des lapins et des ascites sont ainsi produites en grande quantité. En variante, les souches d'hybridomes sont maintenues en culture dans des incubateurs à CO2.
Les anticorps monoclonaux récupérés peuvent être utilisés tels quels ou sont purifiés, par exemple par colonne d'affinité et conservés par congélation, ou éventuellement lyophilisés.
L'invention vise en particulier les anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain recombinant et anti-perforine humaine recombinante.
Des anticorps de ce type ont été déposés à la
D.S.M. (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) le 13 mars 1992.
L'invention vise tout spécialement les anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain et anti-granzyme A humain respectivement produits par les clones appelés GRB 51D et GRA 66D, déposés à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), sous les numéros 1-1060 et 1-1059, le 12 mars 1991. Elle décrit également les anticorps monoclonaux anti-perforine de souris déposés à la CNCM sous le n° I- 1058 le 12 mars 1991.
L'invention vise également les souches d'hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux définis ci-dessus et plus spécialement les clones produisant des titres élevés d'anticorps mesurés par test ELISA.
Les souches d'hybridomes de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules immortelles avec une cellule produisant des anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules T- "helper" ou de cellules cytotoxiques, notamment des anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine.
Le procédé d'obtention de ces hybridomes entre également dans le cadre de l'invention. Ce procédé comprend des étapes de fusion et de sélection définies plus haut en rapport avec les anticorps monoclonaux.
Comme indiqué ci-dessus, les protéines contre lesquelles sont dirigés les anticorps monoclonaux de l'invention sont soit des protéines natives, soit des protéines recombinantes. Ces protéines recombinantes sont des produits nouveaux et, en tant que tels, entrent dans le cadre de l' invention.
II s'agit plus spécialement de séquences d'acides aminés renfermant au moins la partie C-terminale active de la protéine mature .
On citera en particulier les granzymes B recombinants humains et la perforine recombinante humaine.
En opérant selon les techniques classiques du génie génétique, ces protéines sont produites dans des hôtes cellulaires, notamment dans des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant les fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.
Ces fragments sont excisés à partir de clones d'ADN codant pour les protéines matures et sont introduits par ligaturation dans un site approprié du vecteur choisi. Les protéines exprimées sont récupérées du milieu de culture, après lyse des bactéries, et purifiées.
La mise en oeuvre de ces techniques conduit à l'élaboration d'outils qui constituent des produits nouveaux. Ainsi, les hôtes cellulaires transformés, les vecteurs d'expression tels que plasmides, et fragments d'ADN tels qu'évoqués ci-dessus entrent dans le cadre de l'invention. Celle-ci vise plus spécialement les protéines recombinantes de perforine et de granzyme et les outils mis en oeuvre pour leur expression.
L'invention vise ainsi un fragment de la séquence de la perforine comportant la partie active C-terminale de la perforine humaine, plus spécialement le fragment tel qu'exprimé par le fragment d'ADN Ball-Bam HI par pAR 3039. Elle vise également un fragment de la séquence du granzyme B humain tel qu'exprimé par le fragment d'ADN Ball-Bam MI par pAR 3038.
L'invention décrit également un fragment de la séquence de la perforine comportant la partie active C- terminale de la perforine mature de souris, plus spécialement le fragment tel qu'exprimé par le fragment d'ADN Smal-EcoRV de 1400 pb. L'invention vise en particulier la séquence d'acides aminés s 'étendant de la position 98 à 534 sur la figure 1. Elle vise également le fragment d'ADN capable de coder pour cette séquence d'acides aminés, les vecteurs renfermant un tel fragment d'ADN, en particulier un vecteur plasmidique, ainsi que les bactéries transformées par incorporation de tels vecteurs, en particulier les bactéries transformées mPerf-PL 40 déposées à la C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n° 1-1057.
Comme indiqué ci-dessus, les gènes des granzymes et de la perforine sont inductibles in vitro et in vivo au cours de l'activation cellulaire en situation normale ou pathologique. Les granzymes apparaissent comme des marqueurs précoces de l'activation cellulaire ; la perforine semble être preferentiellement un marqueur de l' activité cytotoxique d'une cellule. Ces protéines apparaissent donc comme des marqueurs fonctionnels de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique chez l'homme.
La spécificité élevée des anticorps monoclonaux de l'invention les rend particulièrement précieux pour mettre en évidence la présence de tels marqueurs dans un fluide ou un échantillon biologique humain.
L'invention vise donc également l'application de ces anticorps monoclonaux en tant que bioréactifs pour le diagnostic in vitro dans un fluide ou échantillon biologique de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques plus spécialement de granzymes ou de perforine ou encore, par exemple, de proteoglycanes ou de molécules de type lymphotoxine.
Dans cette application, les anticorps monoclonaux sont libres. En variante, ils sont fixés sur un support solide non immunogène.
La méthode selon l'invention de diagnostic in vitro de la présence de granzymes ou de perforine ou autre constituant desdits granules cytoplasmiques est caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes :
- on met en contact l'échantillon à tester avec une préparation d'anticorps monoclonaux, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec lesdits constituants, en particulier respectivement avec un granzyme ou la perforine lorsqu'ils sont présents dans l'échantillon, puis on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps.
Pour révéler la réaction immunologique, ledit constituant, plus spécialement le granzyme ou la perforine comporte un groupe marqueur. Il s'agit le plus généralement d'un groupe radioactif. En variante, on utilise un deuxième anticorps couplé à un groupement dont l'activité peut être mesurée telle une enzyme, comme la phosphatase alcaline ou un groupe fluorescent. Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité et rapidement la présence desdits constituants, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, notamment de les localiser et de les quantifier par exemple au niveau de biopsies de tissu pathologique, ou de cellules du sang périphérique.
Ainsi elle est particulièrement appropriée pour diagnostiquer un rejet dans le cas de transplantation d'organes, (rein, coeur, / poumon, foie, pancréas) et à des fins de diagnostic précoce de GVH [peau, foie, intestin]) dans le cas de greffe de moelle osseuse.
Outre ces applications immunohistologiques, les anticorps monoclonaux de l'invention et leurs fragments, libres ou immobilisés, sont utilisés pour réaliser des diagnostics dans des pathologies où l'évolution de la maladie modifie le taux de granzyme ou de perforine.
Ils pourraient permettre par exemple de suivre le devenir d'une greffe chez un patient, et en particulier les implications du traitement immunosuppresseur qui pourrait être éventuellement modulé. Cette surveillance pourrait être effectuée par l'étude cinétique des "infiltrats lymphocytaires" présents au niveau de biopsies prélevées au site de la greffe. Ils revêtent également un grand intérêt dans le cas de maladies auto-immunes, dermatologiques, infectieuses (microbiennes, parasitaires ou virales (HIV)).
L'apport des anticorps monoclonaux de l'invention est donc important pour diagnostiquer la présence de cellules activées et/ou cytotoxiques en nombre anormalement élevé au niveau de l'organe atteint, ou au niveau du sang périphérique.
Ils sont également utilisables pour effectuer des études de différenciation cellulaire, les granzymes étant des marqueurs de la différentiation cellulaire T ou B.
On notera que dans le cas de maladies auto-immunes les protéases impliquées constituent des auto-antigènes.
Elles peuvent donc être utilisées pour reconnaître les auto-anticorps formés. A cet égard, les protéines recombinantes, plus particulièrement de granzyme B et de granzyme H de l'invention, présentent un grand intérêt dans une utilisation comme auto-antigènes en vue d'une reconnaissance par des auto-anticorps présents, dans des sérums auto-immuns. Pour effectuer cette réaction, on opère avantageusement selon les techniques habituelles.
L'invention vise également un kit pour le diagnostic in vitro de la présence desdits constituants des granules cytoplasmiques plus spécialement de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique.
Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration,
- une préparation d ' anticorps monoclonal ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus,
- une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur, des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
Les anticorps monoclonaux sont susceptibles également de constituer des agents thérapeutiques de grand intérêt et peuvent jouer le rôle de vecteurs d'enzymes ou de médicaments.
On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention. Les figures 1 à ... représentent respectivement
- 1a figure 1 la séquence d'acides aminés de la perforine recombinante dont la préparation est rapportée dans les exemples,
- 1a figure 2, le mode de construction de HLPDE3, - 1a figure 3, une carte de restriction partielle du plasmide pAR 3038,
- 1a figure 4, la séquence de nucléotides du granzyme B humain et la séquence correspondante d'acides aminés (1 à 227) utilisée pour former des anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain recombinant,
- la figure 5, le mode de construction du plasmide pAR 3039-HuP, et
- la figure 6, la séquence de nucléotides pAR 3039
HuP et la séquence déduite d'acides aminés de la protéine recombinante, ainsi que la séquence obtenue à partir du clone 34.
I - Matériel
1-1 Matériel
- Les granzymes A et B sont séparés des autres protéines des granules cytoplasmiques des LGL (lymphocytes à larges granules) sur une colonne Mono S échangeuse de cations (HR/5, PHARMACIA) connectée à un système FPLC (PHARMACIA) selon la technique décrite par (Krëhenbϋl et al., dans J. Immunol, indiqué ci-dessus).
- Les souris utilisées sont des souris BALB/C d'haplotype H-2d.
- Le myélome NS-1, non sécréteur d'haplotype H-2d, apporte dans la fusion son pouvoir de prolifération. Il est contre-sélectionné en milieu HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine, Thymidine) car il porte la mutation HPRT- (Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6,292-295, 1976).
- L'anticorps polyclonal dirigé contre le granzyme B est tel qu'obtenu selon la technique décrite par Krâhenbϋhl (voir référence ci-dessus).
- La lignée REX est une lignée T immortalisée par le virus d'Epstein Barr.
- L'anticorps monoclonal PAb419 est dirigé contre l'antigène T de SV40 (Harlow et al., J of Virology, 861-869, 1981). 1-2 Solutions
MILLIEU 1 : RPMI 1640 (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO).
MILIEU 2 : RPMI 1640 (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 250 u/ml interleukine 2 (Roussel Uclaf, 0,7 106 u BRMP / échantillon).
MILIEU 3 : RPMI (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 0,36 %. glucose (A.P.).
MILIEU 4 : Dubecco's M0D Eagle Médium (GIBCO),
100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 10 % sérum de cheval inactivé (GIBCO), 10 % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo).
MILIEU 5 : Dubecco's MOD Eagle Médium (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de Sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 10 % sérum de cheval inactivé (GIBCO), 10 % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo), 2 % Hypoxanthine (GIBCO), 2 % Thymidine (GIBCO), 2 % Aminoptérine ( GIBCO).
RIPA : 10 mM Tris pH 8,1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % NP40, 1 % desoxycholate de Na, 0,1 % SDS.
Tampon de lavage des immunoprécipitations : 100 mM
Tris pH 9, 0,5 M LiCl, 1 % mercaptoéthanol.
Tampon Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970) : 62,5 mM Tris pH 6,8, 2 % SDS, 15 % glycérol, 5 % β-mercaptoéthanol, 0,01 % bleu de bromophénol. II - Méthodes
II-1 Isolement des LGL du sang périphérique
On opère comme décrit par Chouaib et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6875-6879, 1988.
Les lymphocytes sont isolés du sang périphérique par gradient de ficoll (PHARMACIA). Après 2 lavages en milieu 5, les cellules sont numérées en solution de Hayem et incubées à raison de 3 x 108 cellules dans des flacons de culture (COSTAR) prétraités avec du SHN inactivé pendant 1 heure à 37°C. Les cellules non adhérentes sont alors collectées, lavées en RPMI SHN 10 % et fractionnées par centrifugation sur un gradient discontinu de percoll (PHARMACIA). 4 solutions de concentration différente de percoll sont préparées (31 %, 34 %, 37 % et 41 %). Une solution sur deux est préparée dans du milieu RPMI (rouge), ou dans une solution de chlorure de Na isotonique (incolore), permettant ainsi une bonne visualisation des interfaces. Après avoir coulé 4 ml de la solution à 41 % puis déposé délicatement sur celle-ci 2 ml de chaque solution par concentration décroissante dans des tubes coniques de 15 ml (NUNCLON DELTA, PAUL BLOCK), 3 x 108 lymphocytes contenus dans 2 ml de RPMI sont déposés à la surface du gradient. Les tubes sont centrifugés 30 min à 1400 t/min sans frein à température ambiante. Les anneaux de LGL situés à l'interface 37 - 41 % sont récupérés à la pipette Pasteur, lavés 3 fois en RPMI, puis regroupés. Les cellules sont numérées et mises en culture dans du milieu 2 à raison de 5 x 105 cellules par ml. Les LGL représentent 2 à 5 % de la population totale des lymphocytes.
II-2 Immunisation de souris avec les granzymes A et B purifiés à partir de LGL du sang périphérique ou de cellules NK. 10 μg de protéines purifiées (granzyme A et B) dissoutes dans 200 μg de VaccicoxR (109 unités), adjuvant, sont injectées par voie intra-péritonéale à une souris BALB/C. 21 jours après, on effectue un rappel grâce à une 2ème injection par voie intra-veineuse (10 μg de protéines dissoutes dans 200 μg de sérum physiologique).
II-3 Fusion cellulaire On opère comme décrit par Oi et Herzenberg, dans
Selected methods in cellular immunology. Freeman and co. Mishell, Shiigi, eds. 1980)
Trois jours après le rappel, la souris est sacrifiée et sa rate est prélevée en milieu stérile. Elle est dilacérée avec un piston de seringue de 5 ml dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de RPMI. La solution de splenocytes est ensuite lavée avec 50 ml de RPMI. Après centrifugation, les culots cellulaires sont conservés à température ambiante.
Les cellules de myélome NS-1 mis en culture dans du milieu 2 sont centrifugés pendant 7 min à 1500 t/min, puis lavés dans 50 ml de RPMI. Les culots cellulaires sont resuspendus dans 10 ml de RPMI, et transférés dans le tube contenant les splenocytes selon le rapport de 1 cellule de myélome pour 2 splenocytes. Ce mélange est ajusté à 40 ml avec du RPMI, puis centrifugé pendant 7 min à 1500 t/min à 20°C.
Le culot cellulaire mixte est resuspendu avec 1 ml de PEG (polyéthylène glycol 1500, BOEHRINGER), (agent fusionnant), en tournant doucement la pipette dans le tube pendant 1 min. Le PEG est dilué en ajoutant en 1 min 1 ml de RPMI 1640 préchauffé à 37°C puis 7 ml du même milieu en 2 min pour atténuer la toxicité de ce produit. Après centrifugation à 1800 t/min pendant 4 min sans frein, le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de milieu (4) préchauffé à 37°C. Les cellules sont distribuées dans des plaques stériles de 96 puits à fond plat à raison de 105 cellules du myélome dans 100 μl par puits (temps 0).
24 heures après la fusion (jour 1), 100 μl de milieu 5 (sélection HAT) préchauffé à 37 "C sont ajoutés dans chaque puits. Ce milieu sélectionne les hybridomes et tue les cellules de myélome qui n'ont pas fusionné.
Au jour 7, 100 μl de milieu sont aspirés et remplacés par 100 μl de milieu 4 neuf. Au jour 10, le contenu des puits positifs (test ELISA ; kit AMERSHAM), est transféré sur plaque à fond plat de 24 puits dans lesquels on ajoute 1 ml de milieu de culture 4. Au jour 13, les hybridomes sécréteurs peuvent être conservés par congélation en azote liquide dans du SVF/10% DMS0. II-4 Recherche des hybridomes sécrétant des anticorps anti-granzymes A et B humains par test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).
(kit Anti-IG de souris, anticorps entier lié à de la peroxydase de raifort, AMERSHAM)
La préparation des plaques de 96 puits à fond plat est réalisée 24 heures avant le test. A cet effet, 100 μl d'antigène (granzymes A ou B purifiés), à 1 μg/ml (dans du
PBS ) sont distribués dans les puits. Les plaques sont mises à 4°C pendant 24 heures.
2 à 5 lavages avec 200 μl par puits de PBS, 0,1 %
Tween 20 sont effectués avant de tester les surnageants de culture des hybridomes. Les plaques sont incubées 1 heure à
37 °C avec 50 μl par puits de surnageant de culture de l'hybridome à tester.
Après 3 lavages avec du PBS, 0,1 % Tween 20, 50 μl d'anticorps secondaire (conjugué à la peroxydase et dilué au 1/500© dans du PBS, 0,2 % Tween 20) sont ajoutés dans chaque puits. L'incubation se fait à 37°C pendant 30 min.
Les plaques sont de nouveau lavées 3 fois avec du
PBS, 0,1 % Tween 20. La révélation est effectuée en ajoutant 100 μl d'une solution contenant le substrat (10 μl PBS, 3 % H2O2 dans 12,5 ml d'ABTS 180 mg/1). Les plaques sont lues par mesure de la DO à 405 nm 15 à 25 min après l'addition du substrat.
Après fusion des cellules du myélome NSI avec les splenocytes provenant de la souris immunisée avec le granzyme B, en opérant comme indiqué ci-dessus, les surnageants de 28 hybridomes désignés GRB se sont avérés être spécifiques du granzyme B en test ELISA (test réalisé avec de la protéine purifiée).
La même démarche suivie avec le granzyme A, a conduit à isoler 15 hybridomes appelés GRA sécrétant des anticorps spécifiques du granzyme A, en test ELISA (test réalisé avec de la protéine purifiée).
Le pourcentage d' hybridomes sécréteurs d'anticorps spécifiques est particulièrement satisfaisant, en effet sur 300 hybridomes issus de la fusion entre les cellules du myélome NSI et les splenocytes de la souris immunisée avec le granzyme B purifié, 10 % sécrètent des anticorps spécifiques en test ELISA. Dans le cas du granzyme A, 5 % des hybridomes de la seconde fusion sont spécifiques dans les mêmes conditions.
II-5 Clonage des hybridomes par dilution limite.
Les hybridomes dont les surnageants présentent la plus forte positivité en test ELISA sont clones dans des plaques de 96 puits à fond plat. Plusieurs dilutions sont testées. Le clonage est effectué à 100 cellules, 10 cellules, 1 cellule et 0,25 cellules par puits à raison de 100 μl de milieu 4 par puits.
Les cellules sont nourries 3 jours après le clonage avec 100 μl de milieu 4, puis tous les 7 jours. Lorsque la croissance cellulaire, contrôlée sur microscope inversé, semble importante, le surnageant de culture de ces puits est testé en ELISA sur les granzymes purifiés sur du granzyme A ou B et sur le lyzozyme comme contrôle négatif.
Les hybridomes positifs sont transférés dans les plaques de 24 puits puis sur des plaques de 6 puits et par la suite en flacon pour maintenir la croissance exponentielle des cellules. Ces hybridomes sont injectés dans le péritoine des souris pour produire des ascites. Ils peuvent être laissés en culture jusqu'à la mort cellulaire afin d'obtenir des surnageants très concentrés étudiés en Western Blot ou en immunoprécipitation.
On récupère deux hybridomes sécrétant des anticorps reconnaissant le granzyme B, appelés respectivement GRB98C et GRB51D et trois autres souches sécrétant des anticorps reconnaissant le granzyme A, appelés GRA66D, GRA382E et GRA10D. Les hybridomes restants seront clones afin de constituer un panel d'anticorps dirigés contre les granzymes humains A et B.
II-6 Caractérisation de l' isotype des anticorps clones
Le surnageant de culture de l'hybridome à tester est dilué au 1/10e en 20 mM Tris pH 7,6, 137 mM NaCl (TBS). La bandelette du kit est incubée 15 min à température ambiante avec le surnageant dilué. Après 3 lavages en TBS, 0,1 % Tween 20 (TBS-T), la bandelette est incubée dans une solution d' anticorps anti-souris couplés à la peroxydase (dilués au 1/500e dans du TBS-T).
La révélation s'effectue par incubation de la bandelette durant 15 min à température ambiante dans 3 ml d'une solution contenant le substrat (1 pastille de chloronaphtol dissoute dans 10 ml de méthanol froid, mélangés extemporanément à 50 ml de TBS contenant une goutte de peroxyde d'hydrogène). Après 3 lavages en eau distillée, les bandelettes sont séchées et peuvent être interprétées.
La technique d'immunisation utilisée dans cette étude a permis d'obtenir des hybridomes sécrétant des anticorps d' isotype IgG. L'isotype des anticorps a été confirmé par le kit commercialisé par Amersham d'anticorps monoclonaux de souris. Les anticorps monoclonaux GRB98C, GRA66D, GRA382E et GRA10D présentent l'isotype IgG1. Celui sécrété par l'hybridome GRB51D présente l'isotype IgG2a. La titration des surnageants de culture des hybridomes clones par test ELISA a permis de déterminer un titre du surnageant de culture de l'hybridome GRB98C de 1000. Ceux des surnageants de culture des hybridomes GRB51D, GRA66D et GRA10D sont de 10 000. Le titre du surnageant de culture de l'hybridome GRA382E est de 100 000. Il convient de noter les valeurs élevées de ces titres.
II-7 Détermination de la spécificité de ces anticorps par les techniques d' électro-transfert de protéines et d'immunorévélation (Western blot). On opère comme décrit par Towbin et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci.
76, 4350-4354, 1979.
La protéine (antigène purifié : granzymes A ou B, ou témoin négatif) est incubée dans du tampon de Laemmli à 100°C pendant 10 min (1 μg/gel de 12 cm de largeur), migre sur un gel de polyacrylamide dénaturant, puis est électrotransférée sur filtre de nitrocellulose (BA83, CERA LAB0) dans un appareil à électrodes en graphite (CERA LABO), dans un tampon 39 mM de glycine, 48 mM Tris pH 8,3, 0,037 % SDS, 20 % méthanol sous un courant de 1 mA/cm2 de filtre pendant 1,5 à 2 heures. Après transfert, le filtre de nitrocellulose est coloré avec du rouge ponceau 0,2 %, et de l'acide trichloracetique 0,3 % pour vérifier l'efficacité du transfert, puis découpé en bandelettes de 0,6 cm de largeur.
Les bandelettes sont préincubées dans un tampon PBS avec 0,2 % de Tween 20 et 5 % de lait écrémé pendant 1 heure à 4°C. Un jeu de bandelettes, représentant différentes protéines à tester, sont incubées 1 nuit à 4°C avec le surnageant d'hybridome dilué au 1/10 dans le tampon PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 5 % de lait écrémé. Les bandelettes sont ensuite lavées dans du tampon PBS contenant 0,2 % de Tween 20 sous agitation moyenne pendant 5 fois 5 min à température du laboratoire. Les bandelettes sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines de souris couplé à la phosphatase alcaline (dilué au 1/1000e dans le tampon PBS ci-dessus) pendant 2 heures à température du laboratoire. Après 5 lavages de 5 min dans du PBS, les bandelettes sont équilibrées dans le tampon de réaction de la phosphatase alcaline (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2) et mises en présence du substrat de la phosphatase (10 ml de tampon de réaction, 44 μl de chlorure de tétrazolium nitro-bleu, 33 μl de sel de (5- bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidine) pendant 15 minutes à température ambiante. La réaction peut être stoppée en lavant les bandelettes avec H2O.
Le granzyme B, réduit et dénaturé, est électrotransféré sur un filtre de nitrocellulose. Les bandelettes de nitrocellulose sont incubées avec les différents anticorps à tester, puis avec un anticorps antisouris conjugué à la phosphatase alcaline.
Dans ces conditions, une bande à 31 KD est observée sur la bandelette incubée avec le sérum polyclonal anti-granzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée sur les bandelettes incubées avec les anticorps anti-granzyme B GRB51D et GRB98C. Les contrôles (bandelettes incubées avec l'anticorps dirigé contre l'antigène T de SV 40, avec les anticorps anti-granzyme A GRA66D, GRA382E et GRA10D) sont également négatifs. Les anticorps anti-granzyme B ne reconnaissent donc pas le granzyme B dans les conditions de cette expérience de Western blot.
II-8 Marquage des cellules in vitro et immunoprécipitation. Les LGL sont mis en culture (milieu : RPMI dépiété en méthionine, complémenté en 35s méthionine : 20 à 50 μCi/ml et en 1 % SHN inactivé) à raison de 3 à 5 x 105 cellules par ml. Le marquage peut être effectué dans un milieu RPMI dépiété en leucine et complémenté par 20 à 50 μCi/ml de 3H leucine. Après une incubation de 4 heures à 37°C, les cellules sont lavées 2 fois en PBS. Le culot cellulaire est repris dans 500 μl de RIPA-0,01 % BSA (B2518, SIGMA), puis soniqué pendant 15 s (micro sonicateur, puissance 40 watts, sonde 0,3-87, BIOBLOCK). L'incorporation de radioactivité est suivie par comptage d'une fraction précipitée au TCA. L'extrait cellulaire est aliquoté par 5 x 106 cpm.
- Immunoprécipitation (selon Kress et al., dans J. Virol. 31, 472-483, 1979).
L'incubation, pendant 30 min à 4°C avec agitation sur roue, de l'extrait cellulaire avec 60 μl de protéine A SépharoseR (PHARMACIA, CL4B SépharoseR) permet de diminuer le bruit de fond. L'échantillon est ensuite filtré sur un frite ( polyéthylène poreux). 10 μl de sérum normal de souris et 30 μl de protéine A SépharoseR sont ajoutés à l'éluat et laissés 1 heure à 4°C avec agitation. Cette solution est filtrée sur le même filtre. La dernière étape de diminution du bruit de fond est réalisée grâce à l' addition de 30 μl de protéine A SépharoseR au filtrat et à une incubation de 30 min à 4°C avec agitation. Après filtration, l'éluat est incubé, 4 heures à 4ºC avec agitation, en présence de 200 μl de surnageant de culture à tester ; 40 μl de protéine A SépharoseR et 20 μl de RIPA-0,01 % BSA (B2518, SIGMA). Le complexe antigène-anticorpsprotéine A SépharoseR est filtré, puis lavé, élue par 45 μl de tampon de Laemmli et bouilli 10 min à 100ºC.
Les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide (12,5 %) en présence de SDS. Après migration à 40 mA 200 V, le gel est fixé, traité au EN3HANCE (DUPONT de NEMOURS) lavé en eau distillée, séché 1 heure à 80°C et fluorographié sur Hyperfilm-MP (AMERSHAM) à -80°C.
On rapporte ci-après les résultats d'expériences d'immunoprécipitation suivies de séparation sur gel d'acrylamide, réalisées pour vérifier la capacité des anticorps monoclonaux anti-granzymes B d'immunoprécipiter les granzymes B contenus dans les granules des LGL. Dans cette expérience, on utilise des extraits de cellules (LGL ou REX) marquées à la 35s-méthionine. L'immunoprécipitation est réalisée à l'aide des surnageants de culture des hybridomes à tester. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 %. Le temps d'autoradiographie est de 7 jours.
On observe une bande à 31 KD correspondant à la migration de l'extrait cellulaire de LGL, immunoprécipité par les anticorps anti-granzyme B, GRB51D et GRB98C. Cette bande à 31 KD est aussi observée pour le même extrait cellulaire immunoprécipité par le sérum polyclonal anti- granzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée avec un contrôle négatif. La migration de l'extrait cellulaire REX (cellules n'exprimant pas les granzymes) immunoprécipité par les anticorps décrits précédemment ne révèle aucune bande à ce poids moléculaire. Ces résultats montrent que les anticorps GRB51D et GRB98C reconnaissent bien le granzyme B.
Pour la caractérisation des anticorps anti- granzyme A (GRA66D, GRA382E, GRA10D), les immunoprécipitations ont été réalisées sur des extraits de LGL et de lignées cellulaires REX marqués à la leucine 3H ; en effet la séquence en acides aminés du granzyme A est pauvre en méthionine, mais elle contient à l ' inverse 26 leucines. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 %. Le temps d' autoradiographie est de 1 mois. Une bande supplémentaire de faible intensité à 32 Kd est observée uniquement avec l'extrait cellulaire de LGL immunoprécipité par l'anticorps GRA66D, mais non par les anticorps GRA382E et GRA10D, ni par un anticorps servant de contrôle négatif. II-9 Production d'ascites
Une injection de 500 μl de tetra-méthyl-pentadécane (JANSSEN) est effectuée en intrapéritonéal à une souris BALB/C. On opère comme décrit par Hoogenraad et Wraight, dans Methods Enzymol, 121, 375-381, 1986. Dix jours plus tard, 107 hybridomes lavés dans du sérum physiologique sont injectés en intra-péritonéal. Les souris sont ponctionnées chaque jour. Le liquide péritonéal est centrifugé pendant 7 min à 1500 t/min à 4°C. L'ascite récupérée à l'aide d'une pipette Pasteur est filtrée sur 0,2 μm (NALGENE), puis centrifugée à 4°C pendant 30 min à 12000 g pour éliminer les lipides et conservée à -80ºC.
II-10 Purification des anticorps
(ImmunoPure IgG Purification kit, PIERCE)
La colonne de protéine A, stockée en 0,02 % azide de Na, est lavée avec 5 ml de tampon de liaison. 2 ml d'ascite, diluée au 1/2 dans le tampon de liaison, sont déposés sur la colonne. Après lavage avec 15 ml de tampon de liaison, les IgG ( immunoglobulines G) sont éluées avec 5 ml de tampon d'élution. Cette colonne est régénérée avec 8 ml 0,1 M d'acide citrique pH 3 et stockée en 0,02 % azide de Na.
Les fractions éluées sont dessalées sur des colonnes d'Exocellulose avec 10 ml de PBS. Ces colonnes de dessalage sont régénérées avec 15 ml de PBS et stockées en 0,02 % azide de Na. Les fractions dessalées des IgG sont dosées par mesure de la DO à 280 nm pour déterminer la concentration des immunoglobulines dans chaque fraction selon la formule : [IgG] en mg/1 = DO à 280 nm/1,4. II-11 Détection des granzymes au niveau des LGL par immunocytochimie.
Les LGL ont été incubés avec des anticorps reconnaissant les granzymes A et B, sélectionnés par le test ELISA comme rapporté plus haut.
2 x 105 cellules par lames sont cytocentrifugées pendant 5 min à 250 t/min et fixées dans l'acétone pendant 10 min à 4°C. Après 2 lavages en PBS, 10 μl par lame de l'anticorps à tester (dilué au 1/2 dans du PBS, 1 % BSA) sont ajoutés et laissés pendant 1 heure à 37 °C. Les lames sont lavées 2 fois en PBS puis 200 μl par lame de l'anticorps anti Ig de souris (dilué au 1/500e dans du PBS, 1 % BSA) sont ajoutés et laissés 30 min à 37 °C. Après 2 lavages en PBS, la révélation est effectuée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 200 μl d'une solution contenant le substrat, 1 pastille (10 mg) de 3,3' diaminobenzidine (SIGMA) dissoute dans 10 ml de 50 mM Tris pH 7,6, mélangés extemporanément à 100 μl de H2O2 à 0,3 %. Les lames sont lavées et les cellules sont colorées par de l'Hémalun de Meyer (MERCK) pendant 1 min à température ambiante. Les cellules sont lavées, déshydratées dans des bains d'éthanol (70 %, 90 % et 100 %), passées dans du toluène et montées avec une goutte de résine de montage (BIOLYON).
L'analyse est faite en microscopie photonique.
Dans ces conditions, une coloration marron du cytoplasme est observée, révélant la fixation de ces anticorps. Aucune coloration n'est obtenue avec un anticorps utilisé comme contrôle négatif. Lorsque les LGL sont activés une nuit en présence d'IL-2 recombinant (250 U/ml), une partie seulement de la population cellulaire est colorée. Après sept jours de culture en présence d'IL2 à la même concentration toute la population cellulaire est colorée.
II-12 Détection des granzymes A et B sur les biopsies de peau de patients présentant une GVH par immunohistochimie.
Lors d'une greffe de moelle allogénique réalisée en identité HLA, le syndrome clinique de la réaction du greffon contre l'hôte ou GVH est fréquemment observé. Les manifestations cliniques de la GVH se caractérisent par des atteintes de la peau, de l'intestin et du foie. Les biopsies de peaux sont considérées comme le meilleur matériel pour établir le diagnostic de GVH grâce à l' histologie et l'immunohistochimie. Les biopsies de 2 patients (RAP : leucémie myeloïde chronique (LMC) ; REN : leucémie aiguë myeloïde (LAM)) présentant des lésions compatibles avec une GVH ont été étudiées. Les biopsies de peau congelées en OCT (Tissue-Tek, MILES), fixées en acétone pendant 10 min à 4°C, sont coupées à froid à 5 μm. Les coupes de tissus sont saturées avec du sérum de cheval (kit Vectastin, VECTOR) pendant 20 min à température ambiante. Après un lavage en PBS, 2,5 μg de l' anticorps à tester sont déposés sur la coupe pendant 30 min à température ambiante. On rapporte les résultats d'expériences réalisées avec les anticorps anti-granzymes GRA51D et GRA66D. Les lames sont lavées 3 fois en PBS puis incubées avec 50 μl d'anticorps anti Ig de souris biotinylés (kit Vectastin) pendant 30 min à température ambiante, puis avec de l'avidine mélangée à de la peroxidase biotinylée (kit Vectastin) pendant 1 heure à température ambiante. Après 2 lavages en PBS, la révélation est effectuée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 50 μl d'une solution contenant le substrat ( 1 pastille (10 mg) de diaminobenzidine, dissoute dans 10 ml de Tris 50 mM pH 7,6, mélangés extemporanément à 100 μl de H2O2 à 0,03 %). Les lames sont lavées et les coupes de tissus sont colorées par de l'Hémalun de Meyer pendant 1 min à température ambiante. Les coupes de tissus sont lavées, déshydratées dans des bains d'éthanol (70 %, 90 % et 100 %), passées dans du toluène et montées avec une goutte de résine de montage. L'analyse est faite en microscopie photonique.
On observe comme précédemment in vitro, dans le cas des LGL, une coloration du cytoplasme des lymphocytes infiltrant la peau. Aucune coloration n'est obtenue avec l'anticorps contrôle utilisé comme témoin négatif.
De plus, la coloration indiquant la fixation des différents anticorps anti-granzymes se trouve être localisée au niveau des infiltrats lymphocytaires qui ont été caractérisés en immunohistochimie par les marqueurs membranaires de différenciation des lymphocytes (CD3, CD4, CD8). III - Production de perforine recombinante de souris. Pour produire de la perforine recombinante de souris, on utilise un vecteur d'expression procaryote pAR3039 qui exprime les protéines sous le contrôle des signaux de transcription et de traduction du phage T 7 (voir Studier et al., : J. Mol. Biol., 189, 113-130, 1986).
On excise un fragment Smal-EcoRV de 1400 pb d'un clone d'ADNc complet de perforine de souris. Ce segment code pour la partie C-terminale de la perforine de souris mature recouvrant les résidus 98 à 534 (voir figure unique).
L'extrémité franche du segment est ligaturée dans le site BamHl du vecteur pAR3039 à l'aide de linkers phosphorylés (5' - CCG GAT CCGG-3').
Ce plasmide est appelé pAR3039-perf.
On transforme avec ce plasmide des bactéries E.coli DE3 qui contiennent dans leur génome le gène de la polymérase T7 sous le contrôle d'un promoteur inductible
IPTG. Des bactéries correspondantes ont été déposées à la
C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n° 1-1057.
La synthèse de la perforine recombinante est induite par IPTG dans les bactéries transformées.
On purifie la perforine recombinante de 45 kDa en lysant le culot bactérien (à partir de 100 ml de culture) avec 20 ml d'une solution contenant 50 mM de Tris-HCl, pH
7,5, 0,5 mM d'EDTA et 10 μg/ml de lypozyme pendant 12 heures sur de la glace.
Après addition de 1,5 ml de NaCl 5M et de 1,5 ml de NP-40 à 10 %, on maintient les bactéries lysées 20 minutes sur de la glace.
L'ADN bactérien est ensuite fragmenté par sonication et les corps d'inclusion protéiques sont centrifugés, 15 minutes à 12000 t/min. Le culot est lavé à trois reprises avec une solution de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM d'EDTA et 300 mM de NaCl et dissous dans du tampon SDS-PAGE.
La protéine recombinante de 45 kDa est séparée de la majorité des protéines bactériennes par SDS-PAGE (10 % de gel de polyacrylamide) et soumise à une électroélution en utilisant le dispositif d'élution de protéines ISC0.
On obtient en routine de 1 à 2 mg de perforine recombinante à partir de 100 ml de culture bactérienne.
IV - Production de l'anticorps monoclonal anti- perforine CE2.10 1) Processus d 'imimimisation :
Des rats maies OFA sont immunisés par voie intrapéritonéale avec 50 μg de perforine recombinante murine (ou rMup) puis par une seconde injection, par voie intrapéritonéale, 3 semaines plus tard. 3 jours avant de prélever les splenocytes (pour la production d'hybridomes), on injecte 50 μg de rMuP dans la veine de la queue sans adjuvant. 2) Production d'hybridomes et sélection :
En opérant comme décrit par Harlow et Lane dans Cold Spring Harbor Laboratory - New-York, 1988, on réalise la fusion de cellules de myélome Sp2/O-Ag86 ne produisant pas d'immunoglobulines avec des splenocytes de rats immunisés avec la rMuP. Brièvement, les splenocytes sont récupérés en introduisant avec précaution dans les tissus de la rate avec une aiguille et une seringue du milieu RPMI dépourvu de sérum. Les splenocytes sont lavés avec le milieu comme effectué avec les cellules de myélome. 108 splenocytes sont alors mélangés avec 107 cellules de myélome dans un tube FALCON de 50 ml et soumis à centrifugation pendant 10 minutes à 1 000 t/min. On élimine autant de surnageant que possible. Les cellules sont remises en suspension en tapant doucement sur les parois du tube et on ajoute goutte à goutte 0,4 ml de polyéthylène glycol 1500 chaud 50 % (p/v) (PEG, Serva, cat. N° 33123) tout en maintenant le tube dans un bain marie à 37 ºC. Après l'addition de tout le PEG, le tube est maintenu à 37°C pendant 3 min puis centrifugé à 800 t/min pendant 5 min. Sans enlever le surnageant, on ajoute 5 ml de milieu RPMI dépourvu de sérum (à 37°C) en 2 min, puis à nouveau 5 ml en une fois. Les cellules sont centrifugées à 1 000 t/min pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et on ajoute 50 ml d'un milieu RPMI complet - 5 % de FCS. La suspension cellulaire est distribuée dans dix plaques de 96 puits auxquelles on a ajouté au préalable des monocytes péritonéaux/macrophages (cellules nourricières) provenant de souris Balb/c (1 à 5 jours avant). Les plaques sont incubées à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de C02 pendant 24 heures, avant de remplacer le milieu avec un milieu frais cRPMI-5% FCS supplémenté avec 1 % de HAT (Gibco). On laisse les cellules croître pendant environ 10 jours. A ce stade, environ 70 % des puits comportent des clones qui se sont développés, beaucoup d'entr'eux possédant plus d'un seul clone. Environ 20 jours après la fusion, les cellules dans 1a majorité des puits contenant des hybridomes ont atteint une densité pratiquement maximale et 100 μl de chaque puits sont prélevées pour effectuer un test ELISA sur de la rMuP et de la perforine de murin native. Des hybridomes fortement positifs sont sous-clonés comme décrit dans l'article de Harlow dont question ci-dessus et soumis à une autre opération de sélection.
Sélection par test ELISA pour obtenir un anticorps monoclonal anti-perforine.
Des plaques de microtitration de 96 puits (Dynatech, MIC 2000) sont recouvertes pendant environ 14 heures à 4°C avec 100 μl de rMuP (10 μg/ml dans PBS). En variante, les puits sont recouverts de granules dérivés de CTL B6.1 de murin (solubilisés dans 1,5 M de NaCl, ultracentrifugés et dilués à 1/10 dans l'eau) ou de granules de cellules LAK humaines (solubilisés dans du phosphate 0,5 M, ultracentrifugés et dilués à 1/5 dans l'eau). Après lavage des puits à trois reprises avec PBS 0,02 % Tween-20, on ajoute 100 μl de surnageant d'hybridomes dans chaque puits en 2 h à température ambiante. Les puits sont lavés comme indiqué plus haut et on ajoute 50 μl d'immunoglobulines de chèvre anti-rat conjuguées à de la phosphatase alcaline (Sigma) en 1 heure. Après le lavage, on ajoute 100 μl de substrat de phosphatase (p-nitrophényl phosphate, Sigma 104 tablettes) et on mesure le A405nm dès que la couleur commence à apparaître. Les puits témoins négatifs sont incubés avec cRPMI-5 % FCS au lieu d'être incubés avec des surnageants d 'hybridomes. On récupère ainsi l'anticorps monoclonal anti-perforine désigné par l'abréviation CE2.10 déposé à la CNCM sous le nº 1-1058 le 12 mars 1991.
V - Etude de l'expression de la perforine et du granzyme B en cytométrie en fluκ.
On rapporte ci-après les résultats obtenus en suivant la méthode, légèrement modifiée, de Schmid I et al. Cytometry, 12 : 279-285, 1991.
Matériel : Toutes les solutions sont préparées en PBS.
- Paraformaldéhyde Solution mère à 3 % (PFA),
- Sérum de veau foetal (SVF) filtré à 0,2 μ,
- Tween 20. Solution mère à 2 %,
- Aride NaN3. Solution mère à 200 mM Technique :
Fixation :
1.106 cellules lavées en PBS sont remises en suspension dans 850 μl de PBS (4°C), 150 μl de PFA (4ºC) sont ajoutés et la suspension homogénéisée. Les échantillons sont mis à incuber à 4ºC pendant 1 heure, puis centrifugés 8 min à 250 g.
Perméabilisation :
Les cellules fixées sont remises en suspension dans 1 ml PBS 0,2 %. Tween (900 μl PBS + 100 μl de solution mère Tween 2 %).
Les échantillons sont ensuite mis à incuber pendant 15 min à 37°C. On ajoute alors 2 ml d'une solution de lavage 1 (solution de lavage 1 = PBS 2 % de SVF, 10 mM final de NaN3 ) . La suspension est centrifugée 8 min à 250 t/min.
Le surnageant est rejeté ; les échantillons cellulaires sont ensuite accessibles à l'étude des protéines intra-granulaires.
Incubation :
anticorps primaire :
De façon à réduire la fixation non spécifique, on ajoute au culot cellulaire 50 μl d'une solution tampon pour anticorps.
On remet en suspension, puis on ajoute 50 μl d'anticorps antiperforine 1/3000 (soit 1/6000 final) et d'anticorps anti-granzyme B 0,25 μg.
Témoins utilisés :
témoin négatif : une immunoglobuline irrélevante de souris, de type IgG1 est utilisée sur la suspension cellulaire à étudier.
- Contrôle de perméabilisation : un anticorps anti-cytosquelette, l'antitubuline α, (1a tubuline a étant une protéine strictement intra-cellulaire), est testé sur toutes les populations cellulaires.
- Témoin positif cellulaire : cellules LGL en culture,
- témoin négatif cellulaire : lignée lymphoïde
MOLT 4.
Les échantillons ainsi traités sont incubés 30 min à 4ºC, puis lavés 2 fois en solution de lavage (2)
(solution de lavage (2) = PBS 0,2 %, Tween 20, 2 % SVF, 10 mM NaN3 final). On effectue une centrifugation 8 min à
250 g.
Anticorps secondaire : 60 ng de GAM sont ajoutés dans 50 μl de PBS au culot cellulaire remis en suspension dans 50 μl de tampon pour anticorps. On laisse incuber 30 min à 4°C, puis on procède à deux lavages en solution (2).
Anticorps tertiaire : de façon à réaliser une étude simultanée en cytofluorometrie de l' expression de la perforine et du granzyme B en fonction du phénotype et de l'état fonctionnel des lymphocytes une incubation avec des anticorps reconnaissant des antigènes de membrane est réalisée.
On utilise des anticorps
. anti CD3, à raison de 0,125 μg (2,5 μl/test), . anti CD8 à raison de 0,03 μg (2,5 μl/test) et
. anti CD25 à raison de 7,5 μl/test
sous un volume de 50 μl PBS.
On ajoute aux cellules 50 μl de tampon pour anticorps et 50 μl d'anticorps. On laisse incuber 30 min à 4°C, puis on effectue deux lavages à l'aide d'un mélange PBS-azide.
Les cellules ainsi traitées sont remises en suspension en milieu PBS-azide et analysées dans les deux heures qui suivent. Si les cellules sont analysées plus tardivement, elles sont remises en milieu PBS-PFA 1 %.
Cette technique a été utilisée pour comparer l'expression du granzyme B et de la perforine dans des lymphocytes du sang de cordon ombilical avec celle de lymphocytes adultes et évaluer la cytoxicite dans le cas de greffes.
VI - Applications cliniques :
On rapporte ci-après les résultats d'études concernant l'utilisation des anticorps de l'invention dans différentes situations pathologiques telles que :
- les rejets de coeur après transplantation,
- les rejets de poumons après transplantation.
Ces deux modèles permettent d'étudier l'activation cytotoxique de cellules qui infiltrent un greffon.
Cette approche permet d'être étendue à tous les modèles de rejets de greffes quels qu'ils soient. Le matériel utilisé est constitué par des biopsies congelées et des lavages bronchoalvéolaires pour les rejets de poumon.
D'autres modèles impliquant un rôle des cellules cytotoxiques dans la pathologie elle-même ou dans la réponse immunitaire générée par cette pathologie ont également été étudiés, à savoir
- les tumeurs cutanées,
la réponse cellulaire T dans les lymphomes malins non Hodgkinien.
La technique utilisée dans tous ces modèles est la technique APAAP, en trois couches
On suit le protocole suivant :
1° - décongélation des lames gardées au congélateur à température ambiante 15 min,
2° - inscription sur chaque lame au crayon de l'anticorps à tester,
3° - fixation dans un bain d' acétone 10 min à température ambiante,
4° - séchage 3 - 4 min,
5° - réhydratation 10 min dans du tampon TBS pH
7,6, 30 % de SVF,
6° - application d'une première couche et incubation à température ambiante en chambre humide 30 min, 7º - rinçages dans TBS pH 7,6 à deux reprises 5 min,
8° - incubation avec la deuxième couche (anticorps de lapin anti Ig souris),
9e - rinçages deux à trois fois en TBS pH 7,6,
10° - application d'une troisième couche d'anticorps (complexe P.A. couplé à un anticorps de souris anti P.A. 30 min en chambre humide),
11° - rinçages deux fois en T.B.S. pH 7,6 puis T.B.S.. pH 8,2,
12° - révélation de la phosphatase alcaline 20 à 30 min dans l'obscurité,
13° - rinçage,
14° - contrecoloration,
15° - montage en milieu aqueux.
Produits utilisés :
* tampon T.B.S. 0,05 M, pH 7,6
solution A TRIS = 60,55 g dans 11 H2O distillée, pH 7,6
solution B + Nacl - 87,66 dans 11 H2O distillées, pH 7,6
* tampon TBS 0,05 M = Solution A 100 μl + solution B 100 μl + 800 μl ED pH 7,6
* Révélateur : pour 100 ml de Tris
1°/ Naphtol ASTR phosphate 20 mg
2°/ Dimethylformamide 2 ml
3°/ TRIS pH 8,2, 0,01 M 100 ml
4°/ Levamisol 2,4 g pour 10 ml d'ED 130 μl
5°/ Fast Red TR sait 100 mg
67 Filtration * Anticorps monoclonaux
deuxième couche : Dako 10g 20 %, Z 259 80 % dilué dans TBS
7,6 à utiliser 1/20 de Ac2 20 % SHN Ab
troisème couche : A.PAAP D 651 1/50 dilué dans 20 % SHN VII - Expression du granzyme B humain recombinant et de la perforine humaine recombinante clans das hâtas bactériens
(T7 PQL).
On opère comme décrit ci-dessus par Studier et al. dans J. Mol. Biol (1986), 189, P 113-130.
MATERIEL Plasmide Site amont Fusion Cadre Terminaison
aval site de ouvert
clonage pAR3038 Bal I BamHI(8mères) ATC To EcoRV pAR3039 Bal I BamHI(10mères) GAT To EcoRV
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
CAT ATG GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAG CAA ATG GGT CGC ATC' C Smères
CGG GAT C' C 10mères Nd eI. NheI M9 + CAA, Trp. Amp milieu
M9 milieu plus 2 g/l casaminoacides
3,3 ml de tryptophane à
10 mg/ml 50 mM Tris-Ci (pH 7.5) Stock : 1 M pH7,5
0,5 m EDTA Stock : 0,5 M
10 mg/ml lysozyme fraîchement préparé
IPTG dans H20 stérile (stock à 20°C, 20 mg/ml = 0,Q84M, dilué 210 fois)
5 M NaCl
10 % NP-40 dans H2O
TEN : 50 mM Tris et 0,5 mM EDTA + 300 mM NaCl Souche DE3 (E.coli) contenant un chromosome avec le gène de la T7 polymérase soue le contrôle d'un promoteur inductible par IPTG
( 1 ) Croissance des cellules :
Exemple : E.coli DE3 ; T7 HLP ; à des fins analytiques le volume est réduit de 5 fois.
1. On démarre sur 14 h environ (inoculum) à partir de plaques fraîchement préparées (moins de 48 h) de LB-Amp (50 μg/ml) dans M9 + CAA, Trp. Amp. On prélève pour déposer dans un Erlen de 100 ml. Le volume doit être de 10 % du volume souhaité pour la culture (il est également possible de faire croître les cellules dans LB).
2. On dilue à 1:10 les cultures dans M9 + Amp. CAA, trp. On laisse la croissance s'effectuer j usqu ' à une mesure de DO600 = 0,8 - 0,9 (habituellement 2 à 3 heures) à 37"C avec une bonne aération.
3. On induit le gène de l'ARN polymérase T7 avec IPTG 0,4 mM.
4. On laisse la croissance s'effectuer pendant 3 heures.
5. On récupère les cellules et les conserve sur la glace avant la centrifugation réalisée dans des tubes de 50 ml, à 3500 t/min, 30 min à 4°C.
6. Le culot est congelé jusqu'à -20°C si nécessaire.
(2) lyse cellulaire et préparation de fractions de protéines insolubles.
1. Pour 50 μl de culture, on remet en suspension (50 mM Tris + HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA, et on ajoute 150 μl 25 mg/ml de lysozyme (fraîchement préparé dans l'eau).
2. On laisse la lyse s'effectuer sur de la glace 30 min à 2 heures.
3. On ajoute 0,75 ml de NaCl 5M, ce qui doit entraîner la lyse des cellules. On utilise un Vortex puis on ajoute 0,75 ml 10 % NP-40. On réutilise le Vortex. Le mélange est très visqueux et conservé sur de la glace 10 à 30 min pour obtenir la lyse de toutes les cellules. 4. On applique un traitement de sonication pour casser l'ADN (pulsations de 2 x 10 - 15 sec. jusqu'à l'obtention d'un milieu liquide).
5. On fait tourner les protéines ppr.
6. On lave le culot deux à trois fois dans TEA puis on effectue une sonication pour clarifier le milieu si nécessaire.
7. On reprend le culot dans 500 μl de tampon SDS. Pour une extraction cellulaire complète, on remet en suspension 1 ml de culot cellulaire dans environ 200 μl de tampon SDS.
On prépare également un témoin sans induction par IPTG ou un plasmide avec un insert dans une mauvaise orientation.
VIII - Granzyme B humain recombinant
. Construction du vecteur pAR - 3038 - GraB
Toutes les techniques de clonage utilisées sont réalisées en opérant selon Maniatis et al. dans Molecular Cloning. A laboratory manual New York ; Cold Spring Harbor, Laboratory Press - Schmidt et al., 1987 /J. Immunol. 139, 250-256.
A partir d'un clone HLP, on isole un insert d'ADN- c complet de granzyme B humain (mobilisation de l'insert avec BamHl). L'ADN-c entier est sous-cloné dans le site BamHl de ml3mp8.
En utilisant la technique de Kunkel (kit Bio-Rad,
Kunkel et al. Methods in Enzymology, 1987, 154, 367, 382), on change le nucléotide 116 d'un A en T par mutagénèse in vitro, ce qui entraîne un changement dans le site de l'acide aminé du granzyme 3 (de glu en val).
Ce changement de nucléotide génère un nouveau site de restriction Bail qui permet d'isoler le fragment Bail - BamHl du clone du granzyme B correspondant aux acides aminés de la région 6 à 227, plus une région de nucléotides non traduits (voir les figures 2 et 3). Par ligation le fragment Bail - BamHl est introduit dans le vecteur PAR-3038, qui a été coupé par Nde I et BamHl et déphosphorylé. On utilise un linker synthétique Ndel - Ball qui comprend les 6 premiers résidus du granzyme B pour adapter le site Ndel du vecteur et le site Bail du granzyme B.
Cette construction permet l'expression du granzyme B recombinant dont la séquence diffère de celle du granzyme B humain natif par le fait qu'elle est précédée par Met et que l' acide aminé 6 n'est pas Glu mais Val.
. Expression du granzyme B recombinant
Le vecteur d'expression bactérien PAR 3038 utilise le promoteur du bactériophage T7 pour exprimer sélectivement les protéines recombinantes.
Les bactéries DE3 de la souche d' E.coli contenant un gène de la polymérase T7 chromosomale endogène sous le contrôle d'un promoteur inductible par IPTG, sont transformées par le plasmide AR-3038 B.
La synthèse de la protéine recombinante est induite dans les cellules DE3, transfectées avec le plasmide PAR-3038. GraB comme suit :
un inoculum de 14 heures environ, provenant de plaques sur lesquelles ont récemment été appliqués L Broth- 50 μg/ml d'ampicilline, est dilué au l/10ème dans le même milieu. On laisse pousser les cellules 2 à 3 heures jusqu'à une absorbance à 600 nm de 0,8 à 0,9.
Le gène de la TA polymérase est alors induit pendant 3 heures par addition de 0,4 mM d'IPTG.
Les cellules sont recueillies et la protéine recombinante est isolée de la fraction protéique insoluble.
En bref, le culot cellulaire (de 50 μl de culture) est remis en suspension dans 5 ml de Tris Hcl (50 mM), 0,5 mM d'EDTA, pH 7,5, supplémenté avec 0,75 mg/ml de lysozyme et laissé sur de la glace pendant deux heures.
On ajoute 750 μl de NaCl 5 M et 750 μl de BP-40 à 10 % sous agitation vigoureuse. On maintient le milieu 30 min sur de la glace, puis on casse les chaînes d'ADN bactérien par sonication (trois impulsions de 15 sec) jusqu'à ce que la solution perde sa viscosité et devienne liquide.
Le précipité de protéine est récupéré par centrifugation (6000 g, 30 min, 40°C) lavé à trois reprises dans 50 mM de Tris-HCl, 0,5 mM d'EDTA, 300 mM de NaCl, pH 7,5 et dissous dans un tampon SDS-PAGE. La protéine recombinante de 25 kDa est séparée des protéines bactériennes principales par SDS-PAGE et électro-éluées en utilisant le dispositif d'elution de protéines Biorad, en suivant les instructions du constructeur.
A partir de 400 ml de culture bactérienne, on obtient environ 1 à 2 mg de protéine recombinante de manière répétée.
La figure 4 donne la séquence de nucléotides du granzyme B humain et la séquence correspondante d' acides aminés. IX - Perforine B humaine recombinante :
On utilise un ADNc de perforine humaine tel qu'isolé à partir d'une banque d'ADNc (lambda ZAP-LAK) dans un vecteur pBs/clone 15. Le plasmide renfermant un insert d'ADNc de la perforine humaine est appelé pAR 3039 HuP. Ce plasmide comporte un gène de résistance à l'ampicilline. Le mode de construction est représenté sur la figure 5. L' insert d'ADNc Sma/Eco RI comporte 1600 paires de base ; ce fragment code pour la séquence d'acides aminés allant de la position Arg98 à Trp534.
La transcription en ARN est induite par IPTG. Pour la construction, pAR 3039 est adapté avec BamHl à Smal en utilisant comme adaptateur GATCCCCGGG (Pharmacia). Le fragment Hu perforine Sma I (de pBS/clone 15) est soumis à une étape de ligation. Le cadre ouvert de lecture est contrôlé par sêquençage. La figure 6 représente le nucléotide pAR 3039 - HuP et la séquence d'acides aminés déduite de la protéine recombinante. On indique également la séquence du clone 34.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Anticorps dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules activées T "helper" ou de cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules "natural killer", caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de réagir spécifiquement avec un épitope d'un constituant donné d'un granule humain, sous forme native ou sous forme recombinante, en particulier un épitope de granzyme humain ou de perforine humaine, sous forme native ou recombinante, en donnant lieu à un composé du type antigène-anticorps.
2/ Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce que les anticorps monoclonaux anti- granzymes sont des anticorps monoclonaux anti-granzyme A, B ou H humains.
3/ Anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils appartiennent à la classe des IgG, qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (granzyme B), 60 kDa
(granzyme A) ou 66-75 kDa environ (perforine).
4/ Anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, tels qu'induits par un procédé comprenant les étapes :
- de fusion de cellules de myélome non sécréteur avec des cellules productrices d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules cytotoxiques ou de cellules T "helper", en particulier d'anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine.
- de sélection de cellules hybrides capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis desdits constituants,
- de clonage de ces hybridomes,
et
- de purification des anticorps monoclonaux tels que produits par exemple à partir de liquides d'ascites ou de milieux de culture. 5/ Anticorps selon la revendication 4, caractérisés en ce que les anticorps produits par les cellules utilisées dans l'étape de fusion sont induits par des constituants de granule sous forme native.
6/ Anticorps selon la revendication 4, caractérisés en ce que les anticorps produits par les cellules utilisées dans l'étape de fusion sont induits par des constituants de granule sous forme recombinante, notamment par un granzyme B humain recombinant ou une perforine humaine recombinante.
7/ Anticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain et anti-granzyme A humain tels que sécrétés par les clones GRB 51D et GRA 66D déposés à la CNCM sous les n° I-1060 et I- 1059 le 12 mars 1991, ou encore d'anticorps anti-granzyme B humain recombinant ou anti-perforine humaine recombinante tels que sécrétés par les clones déposés à la DSM le 13 mars 1992.
8/ Souches d' hybridomes caractérisées en ce qu'elles sont capables de sécréter des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications précédentes.
9/ Souches d'hybridomes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules de myélome avec des cellules produisant des anticorps spécifiques après immunisation avec un constituant donné des granules cytoplasmiques de cellules cytotoxiques, plus spécialement avec des granzymes ou de la perforine purifiés, ou des granzymes et perforine recombinants.
10/ Clones producteurs d'anticorps monoclonaux anti-granzyme déposés à la CNCM sous les n° 1-1060 et I-1059 le 12 mars 1991 et à la DSM le 13 mars 1992.
11/ Clone producteur d'anticorps monoclonaux anti-perforine recombinante humaine déposé à la DSM le 13 mars 1992.
12/ Procédé pour la préparation d'un hybridome selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il comp -brend les étapes de fusion et de sélection définies dans la revendication 4.
13/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les cellules de myélome sont des cellules de myélone NS1 et que les cellules productrices d'anticorps monoclonaux sont des splenocytes.
14/ Méthode de détection in vitro de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact de l'échantillon provenant d'un patient susceptible d'être atteint d'une maladie s'accompagnant de l'exocytose desdits constituants, en particulier de granzyme ou de perforine, avec une préparation d' anticorps monoclonal ou d'un fragment de ce dernier, tel que défini ci-dessus, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène- anticorps, et la détection de la liaison immunologique.
15/ Kit pour la détection in vitro de la présence des constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques en particulier de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titrage,
une préparation d'anticorps monoclonal spécifique ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus,
- une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et, lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un tel groupe,
- un système de détection spécifique du marqueur, des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection. 16/ Application des anticorps monoclonaux selon l' une quelconque des revendications 1 à 7 à la détection de la présence de constituants des granules cytoplasmiques sécrétés par des cellules cytotoxiques.
17/ Protéines des granules cytoplasmiques des cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, caractérisées en ce qu'il s'agit de protéines recombinantes telles qu'obtenues, par génie génétique, dans des hôtes cellulaires, notamment des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant des fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.
18/ Fragments d'ADN caractérisés en ce qu'ils sont constitués par la séquence codante vis-à-vis d'une protéine selon la revendication 17, ou qu'ils comportent une telle séquence, et qu'ils sont le cas échéant incorporés dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide.
19/ Vecteurs d'expression notamment plasmide renfermant un fragment d'ADN selon la revendication 18, et hôtes cellulaires transformés par ces vecteurs.
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