WO1992015692A1

WO1992015692A1 - Novel plasmid

Info

Publication number: WO1992015692A1
Application number: PCT/JP1992/000267
Authority: WO
Inventors: Hideaki Hagiwara; Yasunobu Takeshima
Original assignee: Hagiwara, Yoshihide
Priority date: 1991-03-08
Filing date: 1992-03-06
Publication date: 1992-09-17
Also published as: EP0576674A1; AU1361192A; CA2082407A1; FI925004A0; HU216075B; IL101142A; KR100213526B1; AU638892B2; ES2134209T3; FI107736B; DE69229392T2; JPH04281793A; EP0576674A4; HUT65745A; JP2574549B2; FI925004L; HU9203485D0; DE69229392D1; ATE181109T1; EP0576674B1

Description

明細書

新規プラスミド

技術分野

本発明は新規プラスミドに関し、さらに詳しくは、ラン藻アナキステイス .ニジュランス（Anacystis nidulans) 由来のプラスミド p BA l の Or i A領域含有 DN A断片を含む大腸菌及びラン藻細胞内で複製可能なシャトルベクタープラスミドに関する。

背景技術

ラン藻 Anacystis nidulans は、高等植物、特に紅藻の光合成機構と類似しており、太陽からの光をエネルギー源とじて、水、二酸化炭素とわずかな無機塩類とから有機物質を生合成し、独立栄養的に増殖することが可能である。また、 A. nidulans は単細胞性で寒天培地上にコロニ一を作り、特に R2株は細胞中に DNAを取り込みやすく、微生物遺伝学的方法により形質転換することが可能である。

そこで近年、 A. nidulans R2株の内在性プラスミド（たとえば pU H24、 pUH25) を用いたクローニングベクターが多数開発され

[C. A. M. J. J. von der Hondel et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(3)： 1570-1574 (1980); C. J. Kuhlemeier et al. , Mol. Gen. Genet. 184:249-254 (1981); L. A. Sherman and P. van de Putte, J.

Bacteriol. 150(1) :410-413 (1982); S. Gendel et al. , J. Bacterio

1. 156(1) :148-154 (1983); S. S. Golden and L. A. Sherman, J. Bac teriol. 155(3) :966-972 (1983); C. J. Kuhlemeier et al.， Plasmid 10:156-163 (1983); C. J. Kuhlemeier et al.， Gene 31;109-116 (198 4); D. E. Laudenbach et al. , Mol. Gen. Genet. 199:300-305(1985); M. Y. Gruber et al. , Curr. Microbiol. 15:265-268 (1987) など参照] 、外来遺伝子の導入や遺伝子のクローニングなどに用いられてきている。

R 2株を用いて異種タンパク質を発現させた例としては、ヒ卜の力一ボニック ·ァンヒドラ一ゼおよび大腸菌 1 a c I Qリブレッサータンパク質 [G. D. Price and Μ. β. Badger, Plant Physiol. 91:505-513

(1989) ] 、 Bacillus arayloliquefaciens A50の α—アミラーゼ [I. V. Elanskaya and I. B. Morzunoba, Mol. Genet. Microbiol, yirusol.

0(9):7-ll (1989)] 、 B. sphaericus 1593Mの殺虫タンパク質 [N. Tan deau de Marsac et al.， Mol. Gen. Genet. 209:396-398 (1987)] 、大腸菌の yS—ガラクトシダーゼ [D. J. Scanlan et al. , Gene. 90:43 - 49

(1990)、 Ji. R. Schaefer and S. S. Golden, J. Bacteriol. 171(7) :397 3-3981 (1989)]、大腸菌の Mn—スーパーォキシドジスムターゼ [1ί. Υ.

Gruber et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2608-2612(1980)]、ラムダファージの c I ^tsリプレッサータンパク質 [D. Friedberg and J. Seiiffers, Mol. Gen. Genet. 203:505-510.(1986)]、ラン藻 Synecho systis PPC 6803株のディサチュレース（des A) [H. fada et al.， a ture 347:200-203 (1990) ] などが知られている。

—方、 A. nidulans 6301株でも、内在性プラスミド（pBAl) を用いて pB AS 18 [12kb， K. Shinozaki et al. , Gene. 19:221-22 5 (1982)]. pBAS 5 [14 k b、篠崎一雄、「植物遺伝子操作技術」山ロ彦之監修 P 98— 110、 CMC刊] などのベクター（大腸菌とのシャトルベクター）が開発されているが、いずれのベクターも 1 Okb 以上の長さを持つことからベクターに挿入できる遺伝子の大きさ力、'限定されたり、クローニングに用いることのできる制限酵素認識部位が少ないことなど遺伝子操作上扱いにくい点が多い。また、 6 3 0 1株は R 2 株に比べ遺伝子 D N Aを細胞中に取り込みにくく、その結果、形質転換効率も R 2株に比べ低いという欠点がある。 6 3 0 1株の形質転換効率を向上させる方法として、 H. Daniell ら [Proc. Natl. Acad. Sci. US

5

A 83:2546-2550(1986)] は、 6 3 0 1株の細胞を E D T A— Lysozyrae 処理して permeaplast 化して D N Aを取り込みやすくすることを提案している。実際、この方法を用いて 6 3 0 1株の形質転換効率を高めることに成功しているが、その操作は時間のかかる煩雑なものであるとともに、 E D T A— Lysozyme処理によって細胞にダメージをあたえるな

D

どの問題がある。

そこで、本発明者らは、 A. nidulans 6 3 0 1株の形質転換効率の向上、遺伝子操作上扱いやすいプラスミドの構築等を目的に、まず、ブラスミドを小型化することについて鋭意研究を行い、 6 3 0 1株の内在性 δ プラスミド（p B A l ) をベースにして、その複製開始領域以外の部分をなるベく少なくするとともに、これに大腸菌の C o 1 E l系プラスミドの複製開始領域（0 r i E領域）を含み r o p領域（この領域は r o m領域とも呼ばれるが、本明細書では r 0 p領域という）によって規定される遺伝子を除いた D N A断片と p U C 1 8で用いられているマルチクローニング領域とを組合せることにより、 6 3 0 1株の形質転換効率0

を飛躍的に向上させることのできるブラスミドを創製することに成功し、本発明を完成するに至った。

発明の開示

かくして、本発明によれば、 (a) アナキステイス 'ニジュランス（Anacystis nidulans) 由来のプラスミド p B A 1の O r i A領域と、

(b) マルチクローニング領域と、

(c) コリシン E 1 (C o 1 E 1) 系プラスミドの 0 r i E領域を含み r o p領域によって規定される遺伝子が除かれた領域

を含有することを特徵とする大腸菌及びラン藻細胞内で複製可能なシャトルベクタープラスミドが提供される。

以下、本発明のプラスミドについてさらに詳細に説明する。

本発明のプラスミドを搆成する「アナキスティ'ス ·二デュランス（An acystis nidulahs) 由来のプラスミド p BAlの O r i A領域」（以下、「O r i A」と略称することある）は、ラン藻クロォコッカス属に属するアナキスティス ·ニデユランス 6301株（Synechococcus PPC 63 01、 ATCC 27144..UTEX 625株）の 2つの内在性プラスミドのうち分子量が 5. 04±0. 26 X 10⁶ (電子顕微鏡分析による）又は 5. 2x 10⁶ (ァガロースゲル電気泳動分析による） [K. Shinozaki et ah, G ene. 19:221-224 (1982)] を示すプラスミド p B A 1に由来する複製開始領域を含む遺伝子断片でありミその大きさは一般に 2. 8〜 8. · 0 k b、好ましくは 2. 8〜4. 4k bの範囲内にあることができる。具体的には、 p BAlを制限酵素 Xh o I及び B amH Iで切り出すことにより得られる大きさが約 4. 4k bのO r i A領域含有DNA断片、 P vu I I及び B a mH Iで切り出すことにより得られる大きさが約 3. 3 k bの O r i A領域含有 DN A断片等が挙げられる。

また、「マルチクロ一ニング領域」（以下、「MC領域」と略称することがある）は、多種の制限酵素認識部位を持った配列（ポリリンカ一と ¾いう）であり、具体的には、大腸菌クローニングべクタ一として用いられる C ο 1 E 1系プラスミド pUC、例えば pUC 18由来の、 E c oR I、 S a c l、 Kpn l、 Sma l、 Xma l、 B amH I、 X b a l、 S a l I、 Ac c l、 H i n c l I、 Ps t l、 Sph l、 H _K i n d I I Iの制限酵素認識部位をもつ 55bpの DNA断片が包含される。また pUC12、 pUC 13、 pUC 19等に由来する MC領域も使用可能であり、大腸菌のファージベクター Ml 3由来の MC領域も使用することができる。さらに、化学的に合成した MC領域も使用することができる。

0 さらに、本発明において、 0 r i Aと MC領域と組合せて使用きれる「Co 1 El ·系プラスミド由来の Or i E領域を含み r o p領域によつて規定される遺伝子が除かれた領域」（以下、「Or i EJ と略称することがある）は、大腸菌で用いられているコピー数が 1細胞体当り 20 〜30個である Co 1 E 1系プラスミドの複製開始領域を意味し、そのような Or i Eの代表例としては、プラスミド PBR322から制限酵素 Pvu l I、 Av a l、 BamH I、 E c o 47 I I I、 Ec oRV、 P s t Iなどを用いて切り出すことができる大きさが 1. 5〜4. l k b、好ましくは 1. 5〜2. 5 k bの 0 r i E含有 DNA断片が挙げられ、その他にプラスミド pUC 18等に由来する 0 r i E含有 DNA断- 片も使用することができる。

また、これらの Or i E含有 DNA断片はクローニングを行なう際のマーカーとなりうるアンピシリン耐性遺伝子（Amp 等の薬剤耐性遺伝子を含むことができる。

本発明により提供されるプラスミドは、以上に述べた 0 r i A、 MC 領域及び O r i Eの 3つの必須の遺伝子領域をそれぞれ含有する DNA 断片を有する限り、他の遺伝情報を担う DNA断片、例えば抗生物質耐性マーカ一であるアンピシリン耐性遺伝子を含む DN A断片、クロラムフエニコール耐性遺伝子を含む D N A断片等をさらに含みうるが、典型的な具体例は、 O r i A、 MC領域及び O r i Eの 3つの遺伝子領域をそれぞれ含有する D N A断片から実質的になり、分子量がそれぞれ約 4. 48メガダルトン（約 6. 9 k b) 、約 4. 15メガダルトン（約 6. 4 kb) および約 3. 76メガダルトン（約 5. 8 kb) であるプラスミドで、本発明者らが「プラスミド pBAXi 8」及び「プラスミド p BAX20J とそれぞれ命名した 2種のプラスミドである。

なお、本明細書において、プラスミドの分子量はァガロースゲル電気泳動法により測定した値である。 '

以下、このプラスミド pBAXl 8及び P BAX20について.さらに詳細に説明する。

図面の簡単な説明

第 1図はプラスミド p BAXl 8の制限酵素地図であり、第 2図はプラスミド p BAX20の制限酵素地図であり、第 3図はブラスミド AX18及び p BAX20の構築図である。

プラスミド p BAXl 8及び p B AX 20の種々の制限酵素による認識部位の数及び該制限酵素による分解断片の長さ（kb) は下記の表

- 一

1に示すとおりである。また、.プラスミド pBAXl 8及び P BAX2 0の制限酵素地図を第 1図及び第 2図にす。プラスミド pBAX18 プラスミド ρΒΑΧ20 制限酵素認識部位分解断片の認識部位分解断片の

の数長さ (kb) の数長さ (kb)

EcoEI 1 6.9 1 5.8

BamHI 1 6.9 1 5.8

Xbal 1 6.9 1 5.8

Smal 1 6.9 1 5.8

Bglll 1 6.9 5.8

n n_naTx υ. ο 0. 0

o

EcoRV 6.9 0.8

¹ ¹

Seal ¹ 6.9 ¹ 5.8

PvuII 2 6.4、 0.45 1 5.8

Hindlll 3 .5.1、 1.5、 3 4.0、 1.5、

0.3 0.3

Kpnl 4 2,8、 1.7、 3 3.3、 1.7、

1.5、 0.84 0.84

Pstl 5 3.8、 1.45、 5 2.7、 1.45、

0.85、 0.55、 0.88.0.55、

0.25 0.25

以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミド p B AX 18及び p BAX20は、例えば次のようにして製造することができる。まず、アナキスティス '二デュランス由来のプラスミド p BA lの 0 r i A含有 DNA断片の調製は、例えば、アナキスティス ·ニデユランスと大腸菌とのシャトルベクタ P B A S 18 [K. Shinozaki et al. , Gene 19:221-224 (1982)参照] を大腸菌で常法 (T. Maniatis et al.， Molecular cloning 一 a Laboratory Manual— Cold Spring Hobor Lab oratory刊）に従ってクロ一ニングし、そのクローニングされたプラスミド pBAS 18を常法（T. Maniatis et al.， Molecular cloning) に従って、制限酵素 BamH I及び Xho Iの組合わせ又は制限酵素 B amH I及び P v u I Iの組合わせを用いて D N A断片を切り出すことによって行なうことができ、これにより、大きさがそれぞれ約 4. I k

5

b及び約 3. 3 k bの 0 r i A含有 DNA断片が得られる。これらの D N A断片の 5' 突出端は場合により T₄DNAポリメラーゼによって平滑末端化することができる。

—方、プラスミド pUCの MC領域は、例えばプラスミド pUC 18 を制限酵素 Ec oR I及び H i n d I I Iを用いて切り出すことにより

ID

調製することができる。 - さらに、 Co I Elプラスミドの Or i E領域を含み r o p領域によつて規定される遺伝子が除かれた領域を含む DNA断片の供耠源と'しては、 Co 1 E1プラスミドとして代表的なプラスミド PBR322を使用するのが便利である。

5

上記の如くして調製された MC領域を制限酵素 E c oR I及び H i n d I I Iで処理したプラスミド pBR322と一緒にし、 T₄DNAリガーゼを作用させて、プラスミド p BR322に上記 MC領域がみ込まれたプラスミド PBR322Mを作成する。次いで、このプラスミド pBR322Mを制限酵素 E c o 47 I I I及び Pvu I I処理して得0

られる Or i E及び MC領域を含む約 2. 5kbの DNA断片と、上記のようにして調製された 0 r i A含有 DNA断片とを一緒にし、 T₄D NAリガーゼを作用させることにより、目的とするプラスミド pBAX 18及び pB AX 20を得ることができる。なお、プラスミド pBAXl 8および P B AX 20の構築図を第 3図に示し、そのさらに具体的な調製法については後記実施例でさらに詳細に説明する。

このようにして調製される本発明プラスミドは、大腸菌の細胞中で自律複製可能な 0 r i E領域と、アナキスティス ·二デュランスの細胞中で自律複製可能な Or i A領域を有するシャトルベクターである。従つて、本発明のプラスミドは、増殖の速い大腸菌を用いて大量に調製することができ、このようにして大量に調製されるプラスミド DNAを用いればアナキスティス ·二デュランスなどのラン藻細胞を効率よ'く形質転換することができる。

また、本発明のプラスミドは、マルチクローニング領域が導入されていることにより、（外来）遺伝子を挿入するための認識部位としてブラスミド pBAS 18で唯一用いられる E c oR I認識部位以外に Sma I、 BamH I、 Xb a l、 S c a l、 EcoRVなどの認識部位が利用可能である。

さらに、本発明のプラスミドの大きさは、プラスミド pBAlの Or i A領域以外の DNA部分が除かれていることにより、プラスミド pB AS 18 (12kb) の約半分（6. 9kb〜5. 8 k b) にまで小型化することができ、これにより、本発明のプラスミドはプラスミド pB AS 18に導入できる（外来）遺伝子よりも大きな（外来）遺伝子を導入することが可能となる。

以上のような遺伝子操作上の特性を有する本発明のブラスミドの宿主細胞への導入は、それ自体既知の方法、例えば、 D. A. Lightfoot et. al., J. General Microbiol. 134:1509-1514 (1988)等の文献に記載の方法で行うことができる。

このようにして形質転換されたアナキスティス ·二デュランス 630 1株の形質転換効率は、プラスミド pB AS 18を用いて形質転換したときの値に比べ約 1000倍の効率を得ることができる。従って、本発明のプラスミドを用いれば、（外来）遺伝子を揷入した場合においても、目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを有する細胞を容易に選抜することが可能である。

本発明のプラスミドに組み込み可能な構造遺伝子としては、アナキスティス ·ニデユランス由来の構造遺伝子、他のラン藻細胞由来の構造遺伝子、他のバクテリア由来の構造遺伝子、高等動植物細胞由来の構造遺伝子などが挙げられ、その起源は何ら限定されるものではない。また、本発明のプラスミドに組み込み可能な構造遺伝子としては、化学的に合成された構造遺伝子であってもよい。そのような遺伝子の例としては化学合成ヒトースーパーォキシド ' ジスムターゼ [h^SOD、 h-SO D-A 1 a⁶ (特開平 2— 156884号公報参照）など] が挙げられる。

実施例

以下、実施例をあげて本発明のプラスミドについてさらに具体的に説明する。

実施例 1

(ベクタ一の造成)'

(1) p BR322へのマルチクローングサイト（pUC18由来）の導入

A) pBR322のEc όRΊ—H i nd ϊ I I消化、アル力リフォスファターゼ処理

p BR322DNA溶液 20〃1 (10〃g) に 5X H i n d i I I buffer (5 OmMT r i s -HC 1 (pH7. 5) 、 35 mMM g C 1₂、 3 0 OmMNa C 1 ) 40 1、 H i n d I I I [宝酒造（株）社製] 80u nits (1 0 βϊ 及び滅菌水 130〃1を加え、 37°Cで 2時間ィンキュベートした。反応後、この溶液に 5 X E c o R I buffer (50 ΟιΜΤ r i s -HC 1 (pH7. 5) 35mMM C 1₂ 25 OmMNa C 1 , 35BM2—メルカプトエタノール、 0. 05%ゥシ血清アルブミン） 4 0 ΐ, E c oR I [宝酒造（株）社製] 120 units (10 ^1) 及び滅菌水 50 ^1を加え、さらに 37でで 2時間反応させた。反応後、フエノールークロロホルム処理、エタノール沈殿して DNAを集め、 10 0〃1の0. 1ΪΤ r i s— HC 1 (pH8. 0) に溶解した。この溶液に 10 / 1のアルカリフォスファターゼ [宝酒造（株）社製] 溶液（luni tZl 0〃1アルカリフォスファターゼ、 1 OmMT r i s— HC 1 (ρΗ7. 5) 、 5 OmMNa C 1、 lmMZn S0₄) を加え、 37 で 1時間インキュペートした。反応後、 1.0 //1のアルカリフォスファターゼ溶液を加え、さらに 65 で 30分間インキュベートした。この溶液をフエノ一ルークロロホルム処理し、エタノール沈殿して DN Aを Θ収した。 B) pUC 18からのマルチクローニングサイト（E c oR I— H i n d I I I ) の単離

pUC 18 DNA溶液 30 βΐ (20 zg) に 10 X K buffer (20 OmMT r i s -HC 1 (pH8. 5) 、 100 mMM g C 1 ₂、 1 OoMMD T T、 100 mMMK C I ) 20 /^1、 H i n d i I 1 80 units (10〃 1) 及び滅菌水 140〃1を加えたエツペンドルフチューブ 2本用意し、 37でで 3時間インキュベートした。反応後、フエノールークロロホルム処理し、エタノール沈殿して DNA集め、 112. 5〃1の滅菌水に溶解した。これらの溶液に 5 X Ec oRI buffer 30〃1、 EcoR

I 9 Ounits (7. 5 Ό を加え、 37 で 3時間インキュベートした。 DNAをエタノール沈殿して回収し、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動

5

を行い目的の DNA断片（約 50 bp) を分離した。 DNAをゲルから電気的に溶出し、フエノールークロロホルム処理、エタノール沈殿して精製した。

C) p BR322 (EcoR I— Hi nd i I I消化）とマルチクローニングの連結

10

p BR322 (EcoRI—Hi nd i I I、 AP処理） DNAO. 2 £g とマルチクロニングサイト DNA0. 2 jfig (1

に TE (1 OBMT r i s— HC 1 (pH8. 0 ) 、 1 mME D T A) .1 jttl、 Takara ligation Kit A液 24〃 1を加え、よく撹拌した。この溶液に Takara ligation Kit B液 3 1を加え 16 で 4時間インキュベート丄 5

した。

D) プラスミド PBR322Mのクローニング ligation溶液 3〃1 ( 40 ng) に 5 OmMC a C 1₂処理した E. c o 1 i HB 101の細胞懸濁液 200 ilを加え、おだやかに混合した。この混合液を氷水中で 30分間ィンキュベートした後、さらに 42でで 0

2分間ィンキュベートして DNAを細胞中にとりこませた。この懸濁液に 1. 8mlの 2ΥΤ (16gZlトリプトン、 10 g/1酵母抽出液、 5 gZlNaC I) 液体培地を加え、 37^で 1時間の振とう培養後、 L B (l OgZlトリプトン、 8g71NaC l、 5 gZl酵母抽出エキス）寒天培地（5 ノ mlアンピシリンを含む）にプレートした。得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することにより目的のプラスミド（pBR322M) を保持しているコロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコロニーを 200011の2丫丁液体培地（100 igZmlアンピシリンを含む）で培養し、プラスミド DN

Aを SDS—アル力リ法により大量に調製した。

(2) Pvu l I -E c o 47 I I I断片（2550bp) の単離前記（1) で調製した p BR322Mプラスミド DNAl O^g (1 0 nl) に 10 X M buffer (100mMTr i s-HC l (_PH7. 5 ) 、 10 OmMMg C 12. 10mMDTT、 50 OmMN a C 1 ) 20//1、 P v u I I [宝酒造（株）社製] 12 Ounits (10 1) および滅菌水を加え 200〃1としたエツペンドルフチューブ 3本用意した。これらのチユーブを 37でで 3時間インキュベートした。反応後、フエノールークロロホルム処理し、 DN Aをエタノール沈殿して集め、 174 1の滅菌水にそれぞれ溶解した。これらの溶液に 10X H buffer 20 1および E c o 47 I I I [宝酒造（株）社製] 24 unitsずつ加え、 37 でで 3時間ィンキュベートした。 DNAをエタノール沈殿して回収し、目的の DNA断片（2550 b p) を 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動により分離した。分離した DNA断片は Geneclean を用いて精製し、の 0. lMT r i s—HC l (pH8. 0 ) 溶液とした。'この溶液に 5 lの了ルカリフォスファターゼ溶液を加え、 37°Cで 1時間ィンキュペートした。反応後、 5〃1のアルカリフォスファターゼ溶液を加え、 65 で 30分間さらにインキュベートした。反応後、フエノール —クロ口ホルム処理し、エタノール沈殿して DNAを集め、 20〃1の TEに溶解した。

(3) p BAS 18の A. nidulans における複製開始点の分離

P BR322の B amH Iサイトに nidulans 6301株の内在性プラスミド（p BA l、 B amH I消化）を揷入した大腸菌と A. ni dulans との間のシャトルベクター p B A S 18 (K. Shinozaki ら、 Ge ne. 19:221-224 (1982)) を E. c o 1 i HB 101に導入し、 LB液体培地（50 igZmlアンピシリンを含む）で培養し、 SDS—アル力リ法を用いて大量に調製した。調製した p BAS 18DNA 14 £g (2 O jtzl) に 10X K buffer 20 ΐ, B amH I [宝酒造（株）社製] 100 units (10 / l) および滅菌水を加えて 200 /1としたエツべンドルフチューブ 3本用意し、 30でで 3時間インキュベートした。反応後、 DNAをエタノール沈殿して回収し、目的の DNA断片（p BA 1、約 8. 0Kb p) を 1%ァガロースゲル電気泳動を行い分離し、 Ge neclean により精製した。分離 ·精製した p BAl (B amH I消化）

に 10X K buffer 5 fil、 Xh o I [宝酒造

(株）社製] 2.4units (2〃1) および滅菌水 38〃1を加え、 37 で 3時間インキュベートした。反応後、フエノールークロロホルム処理し、エタノール沈殿して DN Aを集めこ。得られた p B A 1の B amH I -Xh o I消化 DNAの両末端を Takara Blanting Kit を用いて平滑末端化した。

(4 )一小一型（匕 E. c o 1 i -A. nidulans シャトルベクター p B AX 1 8 (6. 9 k b p) の造成

平滑末端化 DNA 4 Ong (2 β1) と P v u I I -E c o 47 I I I 靳片の DNA200ng (4 ^1) に Takara ligation Kit A液 48〃1 を加え、よく撹拌した後、 B液 6 ^1を加え、 16 で 4時間インキュベートした。この溶液を用い E. c o 1 i HB 101株を形質転換し、 LB寒天培地（50〃gZmlアンピシリン、 1. 5%寒天を含む）にプレートしてコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することにより目的のプラスミド p BAX l 8を保持するコロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコロニーを 45mlの 2 YT液体培地（100 ^gZmlのアンピシリンを含む）で培養し、プラスミド DNAを SDS—アルカリ法により調製した。

(5) p B AX20 (約 5. 8 k b ) の作成

(3) で調製した B amH I— Xh o I (平滑末端化） DNA断片 1 fig (4〃1) に 10X M buffer 2〃l、 P v u I I 1 βΐ {12 unit s) 及び滅菌水 13 1を加え、 37 °Cで 3時間インキュベートした。この反応液 2 1(10 Ong)に（2) で調製した P V u I I - E c o 47 DNA断片10 Ong (2 1) 及び Takara ligation Kit A液 16〃1 を加え、よく撹^した後、さらに、 B液を加え、 16でで 2時間ィンキュベートした。反応後、この溶液を用いて. E. c 0 1 i HB 1 01株を形質転換し、 LB寒天培地（50 ^gZmlアンピシリン、 1. 5%寒天を含む）にプレートしてコロニーを得た。得られたコロニーから目的のプラス'ミド（p BAX20) を保持しているコロニーをスクリ一二ングし、 200mlの 2 YT液体培地（100 zgZmlアンピシリンを含む）で培養し、プラスミド DNAを SDS—アルカリ法により調製した。

実施例 2

A. nidulans 6301の形質転換 10 Offllの BG— 11液体培地で 1〜5日間培養した細胞を 8000 rpmで 5分間遠心して集め、 1 Oralの新鮮な液体培地に懸濁した（10⁸ 〜10⁹ cells/ml) 。この細胞懸濁液を 1 mlずつポリプロピレンチューブ（Falcon 2059) に分注し、それぞれのチューブに実施例 1で調製したプラスミド DNAを l g (p BAS 18は 10〃g) の濃度で加えた。これらのチューブをそれぞれアルミホイルでおおい、 30でで 1晚培養した後、おおっていたアルミホイルをはずし、光照射下（10 00〜2000ルクス）、 30°Cでさらに 6時間培養した。これらの細胞懸濁液を 5倍に希釈し（p B AS 18を加えたものはそのまま）、 1 00〜500〃1ずつ BG— 11寒天培地（1 / gZnilアンピシリン、 1 mMチォ硫酸ナトリウム、 1. 5%寒天を含む）にプレートした。これらのプレートを光照射下（2000〜3000ルクス）で 4〜10日間培し。

このようにして得られたコロニーの形質転換効率は、本発明プラスミドを用いた場合 10-³〜10 -⁴ cellsZ gブラスミド DN Aという値を示し、プラスミド pBAS 18を用いた場合（10—7 cells 〃gプラスミド DNA) の約 1000倍の効率を得ることに成功した。

産業上の利用可能性

本発明のプラスミドは、大腸菌を用いて大量に調製することができ、大腸菌及びラン藻細胞内で複製可能であって、シャトルベクターとして、各種の構造遺伝子のラン藻細胞での発現に有用である。

Claims

請求の範囲

1. (a) アナキスティス ·ニジュランス（Anacystis nidulans) 由来のプラスミド pBAlの Or i A領域と、

(b) マルチクローニング領域と、

(c) コリシン E 1系プラスミドの O r i E領域を含み r o p領域によって規定される遺伝子が除かれた領域

を含有することを特徴とする大腸菌及びラン藻細胞内で複製可能なシャトルベクタープラスミド。

2. 0 r i A領域（a) がプラスミド p B A 1から切り出される大きさが 2. 8〜8. 0 k bの O r i A領域含有 DNA断片である請求の範囲第 1項記載のプラスミド。

3. 0 r i E領域（c) がプラスミド p BR322から切り出される大きさが 1. 5〜4. 1 k bの 0 r i E領域を含み r o p領域によって規定される遣伝子が除かれた DN A断片である請求の範囲第 1項記載のプラスミド。

4. 0 r i Eを含み r o p領域によって規定される遺伝子が除かれた D NA断片がさらにアンピシリン耐性遺伝子（Amp を含有する請求の範囲第 3項記載のプスミド。

5. 大きさが約 6. 9 k bであり且つ第 1図に示す制限酵素地図によつて特徴づけられるベクタープラスミド PBAX18。

6. 大きさが約 5. 8 k bであり且つ第 2図に示す制限酵素地図によつて特徴づけられるベクタープラスミド pBAX20。

7. 構造遺伝子をさらに含有する請求の範囲第 1項記載のプラスミドで形質転換されたラン藻細胞。 IS

/15692 PCT/JP92/00267

8. ラン藻細胞がアナキスティス ·ニデユランス 6 3 0 1株である請求の範囲第 8項記載のラン藻細胞。