WO1992011285A1 - Neue tnf-peptide - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the invention relates to new peptides derived from tumor necrosis factor (TNF), their production and their use as medicaments.
- TNF tumor necrosis factor
- TNF is one of the main participants in inflammatory reactions (Pharmac. Res. 5, 129, 1988).
- the invention relates to compounds of the formula I.
- A, B, D, E and 3 hydrogen atoms or one of the groups
- F means Asp, Asn or His
- T 1 -T 6 are hydrogen atoms or methyl groups
- Z 1 -Z 6 each represent an oxygen atom or two hydrogen atoms
- GR-NH-CHM-CO- or GR-NH-CHM-CO-W- means and Y -P, -NH-CHQ-CO-P, -V-NH-CHQ-CO-P,
- Carboxyl protecting group stands or
- G and P together also mean a covalent bond or the group -CO- (CH 2 ) a -NH-, where a is a number from 1 to 12, K, R, U, V and W peptide chains from 1-5 naturally occurring represent ⁇ -amino acids,
- L, M and Q are hydrogen atoms or one of the groups -CH 3 , -CH 2 -CH (CH 3 ) 2 , -CH 2 -CO-NH 2 ,
- A, B, D, M, L and Q in pairs one or two
- the peptides of formula I are made up of L-amino acids, but they can contain 1 to 2 D-amino acids or N-methyl-amino acids.
- the side chains of the trifunctional amino acids can carry protective groups or be unprotected.
- physiologically compatible acids hydrochloric acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid,
- the new compounds can be prepared by methods known in peptide chemistry.
- the peptide chain is gradually extended by one amino acid each, starting at the C terminus.
- Fragment coupling can link fragments of different lengths to one another, the fragments in turn by sequential construction from amino acids or in turn by
- Fragment coupling can be obtained.
- the cyclic peptides are obtained after synthesis of the open-chain peptides by a cyclization reaction carried out in high dilution. Both in the sequential structure and in the fragment coupling, the building blocks must be linked by forming an amide bond. Enzymatic and chemical methods are suitable for this.
- activators in particular dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1, are particularly preferred.
- EEDQ 2-dihydroquinoline
- EDCI 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
- PPA n-propanephosphonic anhydride
- BOP-C1 N, N-bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) amidophosphoric acid chloride
- DPPA Diphenylphosphoryl azide
- BOP O-benzotriazolyl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium salts
- TBTU 2,5-diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo 4-hydroxythiophene dioxide
- Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBroP) and 1,1'-carbonyl-diimidazole (CDI).
- the coupling reagents can be used alone or in combination with additives such as N, N'-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP), N-hydroxybenzotriazole (HOBt), N-hydroxybenzotriazine (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (HOSu) or 2-hydroxypyridine .
- While protective groups can normally be dispensed with in enzymatic peptide synthesis, reversible protection of the reactive functional groups of the two reactants which are not involved in the formation of the amide bond is required for chemical synthesis.
- three protecting group techniques known from the literature are preferred: the benzyloxycarbonyl (Z), the t-butyloxycarbonyl (Boc) and the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protective group technique.
- the protective group of the ⁇ -amino function of the chain-extending building block is designated in each case.
- the side chain protecting groups of the trifunctional amino acids are chosen so that they are not necessarily split off together with the ⁇ -amino protecting group. Müller, Methods of Organic Chemistry Vol XV / 1, pp 20 - 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974 provides a detailed overview of amino acid protecting groups.
- the building blocks which serve to build up the peptide chain can be in solution, in suspension or by a similar method as described by Merrifield in 3 Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963. Particular preference is given to processes in which peptides are built up sequentially or by fragment coupling using the Z, Boc or Fmoc protective group technique, the reactants being reacted in solution, and processes in which, similar to the Merrifield technique mentioned, a reaction partner is bound to an insoluble polymeric carrier (hereinafter also called resin).
- the peptide is typically built up sequentially on the polymeric support using the Boc or Fmoc protective group technique, the growing peptide chain at the C-terminus being covalently linked to the insoluble resin particles (see Figs. 1 and 2). This procedure allows reagents and by-products to be removed by filtration, making recrystallization of intermediate products unnecessary.
- the protected amino acids can be attached to any suitable
- Polymers are bound, which are only insoluble in the solvents used and must have a stable physical form that enables easy filtration.
- the polymer must contain a functional group to which the first protected amino acid can be bound by a covalent bond.
- Various polymers are suitable for this purpose, e.g.
- cellulose polyvinyl alcohol, polymethacrylate, sulfonated polystyrene, chloromethylated copolymer of styrene and divinylbenzene
- Merrifield resin 4-methylbenzhydrylamine resin (MBHA resin), phenylacetamidomethyl resin (Pam resin), p -Benzyloxybenzyl alcohol resin, benzhydrylamine resin (BHA resin), 4- (hydroxymethyl) benzoyloxymethyl resin, resin according to Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa.
- BACHEM BACHEM
- HYCRAM resin ORPEGEN
- SASRIN resin BACHEM
- RINK resin RINK resin
- BlOHELLAS o-chloro-trityl resin
- All solvents which prove inert under the reaction conditions are suitable for peptide synthesis in solution, in particular water, N, N'-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, dichloromethane (DCM), 1,4-dioxane, Tetrahydrofuran (THF), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) and mixtures of the solvents mentioned.
- the peptide synthesis on the polymeric support can be carried out in all inert organic solvents in which the amino acid derivatives used are soluble; however, preference is given to solvents which additionally have resin-swelling properties, such as DMF, DCM, NMP,
- the peptide is split off from the polymeric carrier.
- the conditions under which the various types of resin can be split off are known from the literature. Acid and palladium-catalyzed cleavage reactions are most common
- TNF activity Some of the new peptides show TNF activity. These are TNF agonists. Another part of the peptides has a high affinity for the cellular TNF receptor, but without having an activity comparable to TNF. So you pose
- TNF antagonists In competition with natural TNF, they bind to the cellular TNF receptor and thus suppress the
- the new peptides prove to be valuable Medicines used to treat neoplastic and autoimmune diseases, as well as to fight and prevent infections, inflammation and rejection
- Transplants can be used.
- TNF-sensitive indicator cells compete.
- the agonistic evaluation of the new peptides is based on their TNFmRNA inducing effect in human monocytes.
- the test J. Immunol. 144, 1144 (1990) was carried out as follows:
- the antagonistic evaluation of the new peptides is based on their ability to inhibit rHuTNF-induced induction of TNFmRNA in this test system.
- the agonistic effect of the new peptides is based on their induction of radical oxygen release (oxygen burst) in human granulocytes.
- the test (Methods in Enzymology 133, 449 (1986) was carried out as follows:
- the antagonistic evaluation of the new peptides is based on their ability to inhibit the rHuTNF-induced radical oxygen release in this test system. ad IV: cytotoxicity test
- the agonistic evaluation of the new peptides is based on their cytotoxic effects on TNF-sensitive tumor cells. The test was carried out as follows:
- the peptide concentration was determined in a proliferation test. After 24 hours of incubation, the incorporation of 3 H- ⁇ dR into the DNA of the MCF-7 cells was determined 50% inhibits.
- the antagonistic evaluation of the new peptides is based on their ability to inhibit the cytotoxic effects of rHuTNF in this test system.
- proteogenic amino acids are abbreviated in the examples with the well-known three-letter code.
- proteogenic amino acids are abbreviated in the examples with the well-known three-letter code.
- the peptide resin obtained according to Ia was dried in vacuo and in a reaction vessel of a Teflon HF apparatus
- Hydrogen fluoride condensed (10 ml / g resin). The mixture was allowed to warm to 0 ° C and stirred at this temperature for 45 min. The hydrogen fluoride was then stripped off in vacuo and the residue was washed with ethyl acetate in order to remove remaining scavengers. The peptide was extracted with 30% acetic acid, filtered and the filtrate lyophilized.
- the peptide resin (Pam or Merrifield resin) was suspended in DMF (15 ml / g resin) and, after addition with hydrazine hydrate (20 equivalents), stirred for 2 days at room temperature. For working up, the resin was filtered off and the filtrate was evaporated to dryness. The residue was crystallized from DMF / Et 2 O or MeOH / Et 2 O. III. Processing of the peptide resins obtained according to Ib
- the peptide resin obtained according to Ib was dried in vacuo and then, depending on the amino acid composition, subjected to one of the following cleavage procedures (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc-Workshop Manual, Melbourne 1985).
- the purity of the end products obtained was determined using
- Boc-Asn-OH Boc-Cys (pMB) -OH
- Boc-Asp (OCHx) -OH implemented.
- the peptide resin obtained was dried in vacuo; the yield was 1.79 g.
- the crude peptide obtained after TFA cleavage according to AIII was dissolved in 500 ml of degassed DMF. After adding 210 mg of NaHCO 3 and 440 mg of BOP, the mixture was stirred at room temperature for three days. The mixture was then evaporated to dryness and the crude peptide was purified by gel chromatography (SEPHADEX ® LH 20). The isolated monomer (150 mg) was subjected to an HF cleavage according to All and the deprotected peptide was purified by medium pressure chromatography (cf. AIV; 55 to 75% A; 0.25% min -1 ). 37 mg of pure product were obtained.
- the cyclized product (420 mg) was subjected to HF cleavage according to All.
- the lyophilized crude product was cyclized as described above and by gel chromatography (SEPHADEX ® G-25) and medium pressure chromatography (cf. AIV;. 55 to 75% A, 0.25% min -1) purified. 38 mg of pure product were obtained.
- the crude peptide (853 mg) obtained after the TFA cleavage according to AIII was dissolved in 500 ml degassed DMF. After adding 240 mg of NaHCO3 and 440 mg of BOP, the mixture was stirred at room temperature for 3 days.
- Fmoc-Asn (Trt) -OH implemented.
- the resin was suspended in DMF containing 1% acetic acid, 3 equivalents of Fmoc-leucinal (produced from Fmoc-leucine O, N-dimethylhydroxamate according to Castro, B ., Fehrentz, J.-A. (1983) Synthesis, 676-678) and 3 equivalents of NaBH 3 CN.
- 3 h negative ninhydrin test
- washing was carried out intensively and according to Alb with 1 mmol each
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Abstract
Es werden Peptide der Formel (I), worin A, B, D, E, F, J, T, X, Y, Z die in der Beschreibung angegebenen Bedeutungen besitzen, sowie deren Herstellung beschrieben. Die neuen Peptide eignen sich zur Bekämpfung von Krankheiten.
Description
Neue TNF-Peptide
Beschreibung Die Erfindung betrifft neue, vom Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.
Von Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3666, 1975) wurde berichtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Stairrm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden
(Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF beschrieben (Nature 312, 724, 1984;
J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).
Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten:
ValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnPro
GlnAlaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly ValGluLeuArgAspAsnGlnLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuIleTyrSer
GlnValLeuPheLysGlyGlnGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrlle
SerArglleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlalleLysSerPro
CysGlnArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProlleTyrLeu
GlyGlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGluIleAsnArgProAsp TyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyllelleAlaLeu
Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).
Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF einer der Hauptbeteiligten an entzündlichen Reaktionen (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). Im Tiermodell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Science 229, 869, 1985) und der Graft versus Host Disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) gezeigt werden.
Es wurde nun gefunden, daß Peptide mit wesentlich geringerem Molekulargewicht günstige Eigenschaften besitzen.
Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel I
worin
A,B,D, E und 3 Wasserstoffatome oder eine der Gruppen
-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C6H5, -CH(OH)-CH3,
oder -(CH2)b-T
(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Bedeutung einer OH-, CH3S-, (CH3)2CH-,
C6H5-, p-HO-C6H4-, H2N-, HS-, HO-CO-, H2N-CO- oder H2N-C(=NH)-NH-Gruppe) bedeuten
F Asp, Asn oder His bedeutet,
T1-T6 Wasserstoffatome oder Methylgruppen sind,
Z1-Z6 jeweils für ein Sauerstoffatom oder zwei Wasserstoffatome stehen
X die Gruppen G-, G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-,
G-R-NH-CHM-CO-oder G-R-NH-CHM-CO-W- bedeutet und
Y -P, -NH-CHQ-CO-P, -V-NH-CHQ-CO-P,
-NH-CHQ-CO-U-P, -V-NH-CHQ-CO-U-P, -NH-CHQ-K-NH-CHL-CO-P,
-V-NH-CHQ-K-NH-CHL-CO-P,
-NH-CHQ-K-NH-CHL-CO-U-P oder
-V-NH-CHQ-K-NH-CHL-CO-U-P ist, wobei in X und Y G ein Wasserstoffatom oder eine
Aminoschutzgruppe bedeutet,
P für eine OH- oder NH2-Gruppe oder eine
Carboxylschutzgruppe steht oder
G und P zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe -CO-(CH2)a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist, K, R, U, V und W Peptidketten aus 1-5 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren darstellen,
L, M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen -CH3, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-CO-NH2,
-(CH2)3-NH-C(NH)-NH2, -(CH2)2-CO-NH2,
-CH(CH3)2, -CH2OH, -(CH2)2COOH, sind oder
A, B, D, M, L und Q paarweise eine oder zwei
-(CH2)c-S-S-(CH2)d-,
-(CH2)e-CO-NH-(CH2)f- oder
-(CH 2)e-NH-CO-(CH2)g-NH-CO- (CH2)f-Brücke(n) (mit c und d in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.
Die Peptide der Formel I sind aus L-Aminosäuren aufgebaut, sie können aber 1 bis 2 D-Aminosäuren oder N-Methyl-Aminosäuren enthalten. Die Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren können Schutzgruppen tragen oder ungeschützt vorliegen.
Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure,
Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.
Die neuen Peptide können insbesondere offenkettig (G = H,
Aminoschutzgruppe; P = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe, A, B, D, M, L, Q nicht miteinander verbunden), Disulfid-verbrückt (G = H, Aminoschutzgruppe; P = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe; A + Q, B + Q, D + Q oder M + Q = -(CH2)c-S-S-(CH2)d- ),
Seitenketten-verbrückt (G = H, Aminoschutzgruppe, P = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe, A + Q, B + Q, D + Q oder
M + Q= -(CH2)e-NH-CO-(CH2)f- oder
-(CH2)e-NH-CO-(CH2)g-NH-CO-(CH2)f-), Kopf-Schwanz-verknüpft (G + P = kovalente Bindung oder -CO-(CH2)a-NH-) OH, NH2,
Carboxylschutzgruppe) oder bicyclisch (G = H, Aminoschutzgruppe; P = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe, M + D und A + Q oder A + L und D + Q entsprechen jeweils -(CH2)c-S-S-(CH2)d-Brücken oder
-(CH2)e-NH-CO-(CH2)f-Brücken) sein, oder reduzierte Peptidbindungen enthalten. Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.
So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragmentverknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der
Fragmentkupplung können Fragmente unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, wobei die Fragmente wiederum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch
Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclischeπ Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführte Cyclisierungsreaktion erhalten.
Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkupplung müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden.
Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1 - 364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31 - 34, 71 - 82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85 - 128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDCI), n-Propanphosphonsäureanhydrid (PPA), N,N-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorsäurechlorid (BOP-C1), Diphenylphosphorylazid (DPPA), Castro's Reagenz (BOP), O-Benzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethy1uronium-Salze (TBTU), 2,5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Steglichs Reagenz; HOTDO),
Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium-hexafluoro-phosphat (PyBroP) und 1,1'-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N,N'-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.
Während bei der enzymatisehen Peptidsynthese normalerweise auf Schutzgruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein reversibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reaktiven funktionellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthesen werden drei literaturbekannte Schutzgruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl(Z)-, die t-Butyloxycarbonyl(Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Schutzgruppentechnik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteines. Die Seitenkettenschutzgruppen der trifunktionellen Aminosäuren werden so gewählt,
daß sie nicht notwendigerweise zusammen mit der α-Aminoschutzgruppe abgespalten werden. Eine ausführliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20 - 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974.
Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können in Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in 3. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell oder durch Fragmentkupplung unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlöslichen polymeren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Verwendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit überflüssig. Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeignete
Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionelle Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten Polymerisate, z.B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), PhenylacetamidomethylHarz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzylalkohol-Harz, BenzhydrylaminHarz (BHA-Harz), 4-(Hydroxymethyl)-benzoyloxymethyl-Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa.
BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN), SASRIN-Harz (Fa. BACHEM) (Dimethoxyphenyl-aminomethyl)-phenoxy-Harz, RINK-Harz; (Tetrahedron Lett. 28, 3787 (1987, Fa. Novabiochem) oder o-Chlor-Trityl-Harz (Fa. BlOHELLAS).
Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser, N,N'-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Dichlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt werden; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaften besitzen, wie DMF, DCM, NMP,
Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel.
Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger abgespalten. Die Bedingungen, unter denen sich die verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen
Anwendung, insbesondere die Spaltung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluormethansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die
Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemisehen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z.B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungsreaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen.
Ein Teil der neuen Peptide zeigt TNF-Wirkung. Diese stellen TNF-Agonisten dar. Ein anderer Teil der Peptide besitzt eine hohe Affinität für den zellulären TNF-Rezeptor, ohne jedoch eine mit TNF vergleichbare Aktivität zu besitzen. Sie stellen also
TNF-Antagonisten dar. Sie binden in Konkurrenz zu natürlichem TNF an den zellulären TNF-Rezeptor und unterdrücken so die
TNF-Wirkung. Die neuen Peptide erweisen sich als wertvolle
Arzneimittel, die zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zu Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei
Transplantationen eingesetzt werden können.
Die Charakterisierung der neuen Peptide auf ihre agonistische oder antagonistische Wirkung erfolgte im wesentlichen in folgenden Testsystemen: I. Rezeptorbindungstest
II. Monozytenaktivierungstest: Induktion von TNFmRNA
III. Granulozytenaktivierungstest: Freisetzung von Sauerstoffradikalen
IV. Zytotoxizitätstest ad I. Rezeptorbindungstest
Sowohl die agonistische als auch die antagonistische Wirkung von Peptiden setzt voraus, daß letztere an den TNF-Rezeptor binden. Das bedeutet, daß Peptide mit agonistischer bzw. antagonistischer Wirkung und rHu-TNF um die Bindung am TNF-Rezeptor auf
TNF-sensitiven Indikatorzellen konkurrieren. Ein
Kompetitions-Rezeptorbindungstest (int. J. Cancer 38, 127 (1986) wurde wie folgt durchgeführt:
Unter Verwendung von humanen U937-Zellen ( 2 × 106 Zellen pro Gruppe, 300 μl Assayvolumen) und 1 ng 125I-markiertem rHuTNF (Laktoperoxidase-Methode nach Bolton) wurde die
Peptid-Konzentration ermittelt, die zu einer 50 %igen Verdrängung des vorgelegten 125I-rHuTNF vom TNF-Rezeptor führt. ad II. Monozytenaktivierungstest
Die agonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren TNFmRNA induzierenden Wirkung in humanen Monozyten. Der Test (J. Immunol. 144, 1144 (1990) wurde wie folgt durchgeführt:
Humane periphere Blutmonozyten (5 bis 10 × 106 pro Gruppe, 3 ml Assayvolumen) wurden für 2 Stunden bei 37°C mit den Peptiden inkubiert. RNA wurde extrahiert und die Induktion von TNF mRNA wurde mittels Northern blot Analyse gemessen.
Die antagonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren Fähigkeit, in diesem Testsystem die rHuTNF-bedingte Induktion von TNFmRNA zu hemmen. ad III: Granulozytenaktivierungstest
Die agonistische Wirkung der neuen Peptide basiert auf deren Induktion der Radikalsauerstoff-Freisetzung (Oxygen burst) in humanen Granulozyten. Der Test (Methods in Enzymology 133, 449 (1986) wurde wie folgt durchgeführt:
Unter Verwendung von polymorphonukleären Neutrophilen (2,5 × 105 pro Gruppe, 500 μl Assayvolumen) wurde in einem Chemilumineszenstest die Peptid-induzierte Freisetzung von Radikalsauerstoff gemessen.
Die antagonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren Eigenschaft, in diesem Testsystem die rHuTNF-induzierte Radikalsauerstoff-Freisetzung zu hemmen. ad IV: Zytotoxizitätstest
Die agonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren zytotoxischen Wirkung auf TNF-sensitive Tumorzellen. Der Test wurde wie folgt durchgeführt:
Unter Verwendung von humanen MCF-7 Zellen (2 × 104 Zellen pro Gruppe, 200 μl Assayvolumen) wurde in einem Proliferationstest die Peptidkonzentration ermittelt, die nach 24 Stunden Inkubation den Einbau von 3H-τdR in die DNA der MCF-7 Zellen zu 50 % hemmt.
Die antagonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren Fähigkeit, in diesem Testsystem die zytotoxischen Effekte von rHuTNF zu hemmen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteogenen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem bekannten Dreibuchstaben-Code abgekürzt. Darüber hinaus bedeuten:
Ac = Essigsäure, Sar = Sarcosin.
A. Allgemeine Arbeitsvorschrϊften
I. Die Synthese der Peptide gemäß Anspruch 1 erfolgte mit Hilfe der Standardmethoden der Festphasenpeptidsynthese an einem vollautomatischen Peptidsynthesizer Modell 430A der Firma APPLIED BIOSYSTEMS. Das Gerät benutzt für die Boc- und Fmoc-Schutzgruppentechnik unterschiedliche Synthesezyklen. a) Synthesezyklus für die Boc-Schutzgruppentechnik
1. 30 % Trifluoressigsäure in DCM 1 × 3 min
2. 50 % Trifluoressigsäure in DCM 1 × 17 min
3. DCM-Waschschritt 5 × 1 min
4. 5 % Diisopropylethylamin in DCM 1 × 1 min 5. 5 % Diisopropylethylamin in NMP 1 × 1 min
6. NMP-Waschschritt 5 × 1 min
7. Zugabe der voraktivierten geschützten
Aminosäure (Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und 1 Äquivalent HOBt in
in NMP/DCM) ; Peptidkupplung (1. Teil) 1 × 30 min
8. Zugabe von DMSO zur Reaktionsmischung
bis zu einem Volumenanteil von 20 % DMSO
9. Peptidkupplung (2. Teil) 1 × 16 min
10. Zugabe von 3,8 Äquivalenten Diisopropylethylamin zur Reaktionsmischung
11. Peptidkupplung (3. Teil) 1 × 7 min
12. DCM-Waschschritt 3 × 1 min
13. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung
der Kupplung (zurück zu 5.)
14. 10 % Essigsäureanhydrid, 5 % Diisopropylethylamin in DCM 1 × 2 min
15. 10 % Essigsäureanhydrid in DCM 1 × 4 min
16. DCM-Waschschritt 4 × 1 min
17. zurück zu 1. b) Synthesezyklus für die Fmoc-Schutzgruppentechnik
1. DMF-Waschschritt 1 × 1 min
2. 20 % Piperidin in DMF 1 × 4 min 3. 20 % Piperidin in DMF 1 × 16 min
4. DMF-Waschschritt 5 × 1 min
5. Zugabe der voraktivierten geschützten
Aminsäure (Aktivierung durch 1 Äquivalent TBTU und 1,5 Äquivalent DIPEA
in DMF) ; Peptidkupplung 1 × 61 min 6. DMF-Waschschritt 3 × 1 min
7. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung
der Kupplung (zurück zu 5.)
8. 10 % Essigsäureanhydrid in DMF 1 × 8 min
9. DMF-waschschritt 3 × 1 min 10. zurück zu 2. Aufarbeitung der nach Ia erhaltenen Peptidharze
Das nach Ia erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und in ein Reaktionsgefäß einer Teflon-HF-Apparatur
(Fa. PENINSULA) transferiert. Nach Zugabe eines Scavengers, vorzugsweise Anisol (1 ml/g Harz), sowie im Falle von tryptophanhaltigen Peptiden eines Thiols zur Entfernung der indolischen Formylgruppe, vorzugsweise Ethandithiol
(0,5 ml/g Harz) wurde unter Kühlung mit flüssigem N2
Fluorwasserstoff einkondensiert (10 ml/g Harz). Man ließ die Mischung sich auf 0°C erwärmen und rührte 45 min bei dieser Temperatur. Anschließend wurde der Fluorwasserstoff im Vakuum abgezogen und der Rückstand mit Essigester gewaschen, um restlichen Scavenger zu entfernen. Das Peptid wurde mit 30 %iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat lyophilisiert.
Zur Herstellung von Peptidhydraziden wurde das Peptidharz (Pam- oder Merrifieldharz) in DMF suspendiert (15 ml/g Harz) und nach Versetzen mit Hydrazinhydrat (20 Äquivalente) 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus DMF/Et2O oder MeOH/Et2O kristallisiert.
III. Aufarbeitung der nach Ib erhaltenen Peptidharze
Das gemäß Ib erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und anschließend in Abhängigkeit von der Aminosäurezusammensetzung einer der folgenden Spaltungsprozeduren unterworfen (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc-Workshop Manual, Melbourne 1985).
Die Suspension des Peptidharzes in der geeigneten
TFA-Mischung wurde bei Raumtemperatur für die angegebene Zeit gerührt, danach wurde das Harz abfiltriert und mit TFA sowie DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden weitgehend eingeengt und das Peptid durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Nach Abkühlung im Eisbad wurde der Niederschlag abfiltriert, in 30 % Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. IV. Reinigung und Charakterisierung der Peptide
Die Reinigung erfolgte mittels Gelchromatographie
(SEPHADEX® G-10, G-15/10 % HOAc; SEPHADEX® LH20/MeOH) und anschließender Mitteldruckchromatographie (Stationäre Phase: HD-SIL C-18, 20-45 μ, 100 Å; mobile Phase: Gradient mit A = 0, 1 % TFA/MeOH, B = 0, 1 % TFA/H2O) .
Die Reinheit der erhaltenen Endprodukte wurde mit
analytischer HPLC (Stationäre Phase: 100 × 2,1 mm VYDAC C-18, 5 μ, 300 Å; mobile Phase = CH3CN/H2O-Gradient, gepuffert mit 0, 1 % TFA, 40°C) bestimmt. Zur
Charakterisierung wurden Aminosäureanalyse und
Fast-Atom-Bombardment-Massenspektroskopie herangezogen. B. Spezielle Arbeitsvorschriften
Beispiel 1
H-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-NH2
1,28 g Fmoc-Leu-RINK-Harz (Substitution - 0,39 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurden gemäß Alb mit je 1 mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH Fmoc-Gln(OtBu)-OH
Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Arg(Pmc)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Leu-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Leu-OH
umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 2 - 4 gemäß Alb) und anschließend im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 2,2 g. 1,1 g des so erhaltenen Harzes wurden einer TFA-Spaltung gemäß AIII unterworfen. Das Rohprodukt (270 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX® G-10) und Mitteldruckchromatographie (vgl AIV; 40 - 60 % A; 0,25 % min-1) gereinigt. Beispiel 2
H-Arg-Arg-Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-AspAsn-Gly-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-OH 0,46 g Fmoc-Glu(OtBu)-p-Alkoxybenzylalkoholharz (Substitution ~ 0,55 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mmol, wurden gemäß Alb mit je 1 mmol
Fmoc-Ser(OtBu)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Pro-OH Fmoc-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Arg (PMc)-OH Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Leu-OH Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Leu-OH Fmoc-Glu(OtBu)OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Gly-OH Fmoc-Val-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Gly-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Arg (PMc)-OH
Fmoc-Arg (PMc)-OH umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus entschützt
(Ausführung der Schritte 2 - 4 gemäß Alb). Das erhaltene
Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,2 g. Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid (584 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX® G - 10) und
Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 40 - 60 %; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 180 mg Reinprodukt erhalten.
Analog Beispiel 1 und 2 lassen sich herstellen: (zur Kupplung der N-Methyl-Aminosäuren wurde PyBroP als Kupplungsreagenz
verwendet):
3. H-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-OH
4. H-Leu-Ala-Asn-Gly-MeVal-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-OH
5. H-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-MeLeu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-OH
6. H-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-OH
7. H-Leu-Ala-Asn-Sar-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-OH
8. H-Ala-Leu-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gly-LeuVal-OH
9. Ac-Arg-Arg-Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-ArgAsp-As n-Gly-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-OH Beispiel 10
0,98 g Boc-Cys(pMB)-MBHA-Harz (Substitution ~ 0,51 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurden gemäß Ala mit je 2 mmol Boc-Val-OH Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Asn-OH
Boc-Val-OH Boc-Leu-Oh Boc-Ala-OH
Boc-Leu-OH Boc-Glu(OBzl)-OH
Boc-Gln-OH Boc-Val-OH
Boc-Asn-OH Boc-Cys(pMB)-OH
Boc-Asp(OCHx)-OH umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert
(Ausführung der Schritte 1 - 6 und 14 - 16 gemäß Ala).
Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,79 g.
0,9 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß AII unterworfen. Das lyophilisierte Rohprodukt wurde in 2 1 0,1 %iger Essigsäure aufgenommen und der pH anschließend mit wäßrigem
Ammoniak auf 8,4 eingestellt. Unter Argonatmosphäre wurde langsam 0,01 n K3[Fe(CN)6]-Lösung zugetropft, bis die gelblich-grüne
Färbung länger als 15 min bestehen blieb. Es wurde noch 1 h nachgerührt, dann mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert und mit 15 ml einer wäßrigen Suspension eines Anionenaustauschers (BIORAD® 3 × 4A, Chloridform) versetzt. Nach 30 min wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert, das Filtrat am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.
Alle benutzten Lösungsmittel wurden vorher mit Stickstoff gesättigt, um eventuelle Oxidation der freien Cysteinreste zu verhindern.
Das Rohprodukt wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX® G-15) gereinigt. Es wurden 78 mg Reinprodukt erhalten. Analog Beispiel 10 lassen sich herstellen (für die Synthese der entsprechenden Peptidsäuren wurde Boc-Cys(pMB)-PAM-Harz verwendet):
Beispiel 30
1 g Harz nach Rink et al. (Fa. NOVABIOCHEM), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurde gemäß Alb mit je 2 mmol
Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Gln-(Trt)-OH Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Glu(OBzl)-OH Fmoc-Val-OH Fmoc-Asp (OChx)-OH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Leu-OH Fmoc-Arg(Tos)-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH
Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Ala-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus
acetyliert (Ausführung der Schritte 2 - 4 und 8 - 9 gemäß Alb). Das Peptidharz wurde in Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,95 g.
Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohprodukt
(720 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 250 mg NaHCO3 und 440 mg BOP wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene eingedampft, und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX LH 20) gereinigt. Da isolierte Monomere (370 mg) wurde einer HF-Spaltung gemäß All unterworfen und das entschützte Peptid durch Mitteldruckchromatogrpahie (vgl. AIV; 55 bis 75 % A; 0, 25 % min-1) gereinigt. Es wurden 83 mg Reinprodukt erhalten.
Beispiel 40
1,09 g Fmoc-Gly-p-Alkoxybenzylalkohol-Harz
(Substitution ~ 0,46 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurde gemäß Alb mit je 2 mmol
Fmoc-Asn-(Trt)-OH Fmoc-Asp(QChx)-OH
Fmoc-Ala-OH Fmoc-Arg(Tos)-OH
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Glu(0Bzl)-0H
Fmoc-Val-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz
N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 2 - 4 gemäß Alb) und anschließend im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 1,43 g.
Das nach TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid wurden in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 210 mg NaHCO3 und 440 mg BOP wurde drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene eingedampft und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Das isolierte Monomere (150 mg) wurde einer HF-Spaltung gemäß All unterworfen und das entschützte Peptid durch MItteldruekchromatographie (vgl. AIV; 55 bis 75 % A; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 37 mg Reinprodukt erhalten.
Analog Beispiel 40 lassen sich herstellen:
η
Beispiel 44
1,2 g Harz nach Rink et al. (Fa. NOVABIOCHEMI) entsprechend einer Ansatzgröße von 0,6 mmol wurde gemäß Alb mit je 2 mmol
Fmoc-Gly-OH Fmoc-Gln(Trt)-θH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Cys(pMB)-0H
Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Cys(pMB)-OH Fmoc-Arg (Pmc)-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Leu-OH Fmoc-Cys(Trt)-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Cys(Trt)-OH Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Leu-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus
acetyliert (Ausführung der Schritte 2 bis 4 und 8 bis 9 gemäß
AIb). Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; Ausbeute 3,05 g.
Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid (975 mg) wurde in 3 1 0,1 %iger Essigsäure aufgenommen und der pH anschließend mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eignestellt. Unter Argonatmosphäre wurde langsam 0,01 n K3[Fe(CN)6]-Lösung zugetropft. Es wurde noch 1 h nachgerührt, dann mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert und mit 15 ml einer wäßrigen Suspension eines Anionenaustauschers (BIORAD 3 × 4A, Chloridform) versetzt. Nach 30 min wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert, das Filtrat auf eine HD-Sil C-19 RP-Säule gegeben, mehrmals mit Wasser gewaschen und das Produkt schließlich mit Methanol eluiert und mittels Gelchromatographie (SEPHADEX® G25) gereinigt.
Das cyclisierte Produkte (420 mg) wurde einer HF-Spaltung gemäß All unterworfen. Das lyophilisierte Rohprodukt wurde wie oben beschrieben cyclisiert und mittels Gelchromatographie (SEPHADEX® G-25) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 55 bis 75 % A; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 38 mg Reinprodukt erhalten.
1,2 g Harz nach Rink et al. (Fa. NOVABIOCHEMI) entsprechend einer Ansatzgröße von 0,6 mmol wurde gemäß Alb mit je 2 mmol
Fmoc-Gly-OH Fmoc-Gln(Trt)-OH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Glu(OBzl)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Cys(pMB)-OH
Fmoc-Ser(Bzl)-OH Fmoc-Asp (OChx)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Cys(pMB)-OH Fmoc-Arg(Tos)-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Leu-OH Fmoc-Asp (OtBu)-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Leu-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus
acetyliert (Ausführung der Schritte 2 bis 4 und 8 bis 9 gemäß Alb). Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; Ausbeute 2,96 g.
Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid (853 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 240 mg NaHCO3 und 440 mg BOP wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde zur Trockene eingedampft und das Rohpeptid durch
Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Das isolierte Monomere (395 mg) wurde einer HF-Spaltung gemäß All unterworfen, in 3 1 1 %iger Essigsäure aufgenommen und der pH mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eingestellt. Unter Argonatmosphäre wurde langsam 0,01 n K3[Fe(CN)6]-Lösung zugetropft. Es wurde noch 1 h
nachgerührt, dann mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert und mit 15 ml einer wäßrigen Suspension eines Anionenaustauschers (BIORAD 3 × 4A, Chloridform) versetzt. Nach 30 min wurde das
Ionenaustauscherharz abfiltriert, das Filtrat auf eine HD-Sil C-19 RP-Säule gegeben, mehrmals mit Wasser gewaschen und das Produkt schließlich mit Methanol eluiert. Das bicyclische
Rohprodukt wurde mittels Gelchromatographie (SEPHADEX® 625) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 55 bis 75 % A; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 86 mg Reinprodukt erhalten.
Ac-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-NH2
0,8 g Harz nach Rink et a. (Fa. NOVABIOCHEM) entsprechend einer Ansatzgröße von 0,4 mmol wurde gemäß AIb mit je 1 mmol
Fmoc-Leu-OH Fmoc-Asp(OtBu)-OH
Fmoc-Gln(Trt)-OH Fmoc-Arg(Pmc)-OH
Fmoc-Asn(Trt)-OH umgesetzt. Nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe (Ausführung der Schritte 2 bis 4 gemäß Alb) wurde der Harz in DMF, das 1 % Essigsäure enthielt, suspendiert, 3 Äquivalente Fmoc-Leucinal (hergestellt aus Fmoc-Leucin O, N-Dimethylhydroxamat nach Castro, B., Fehrentz, J.-A. (1983) Synthesis, 676-678) und 3 Äquivalente NaBH3CN dazugegeben. Nach 3 h (negativer Ninhydrintest) wurde intensiv gewaschen und gemäß Alb mit je 1 mmol
Fmoc-Glu(OtBu)-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Asn(Trt)
Fmoc-Gly-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Leu-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus
acetyliert (Ausführung der Schritte 2 bis 4 und 8 bis 9 gemäß Alb). Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet (Ausbeute:
1,55 g).
Claims
1. Verbindungen der Formel I
( )
X
worin
A, B, D, E und J Wasserstoffatome oder eine der Gruppen
-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C6H5, -CH(OH)-CH3, 
oder
-(CH2)b-T
(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Bedeutung einer OH-, CH3S-, (CH3)2CH-, C6H5-, p-HO-C6H4-, HS-, HO-CO-,
H2N-CO-, H2N oder H2N-C(=NH)-NH-Gruppe) bedeuten
F Asp, Asn oder His bedeutet,
T1-T6 Wasserstoffatome oder Methylgruppen sind,
Z1-Z6 jeweils für ein Sauerstoffatom oder zwei
Wasserstoffatome stehen
X die Gruppen G-, G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-,
G-R-NH-CHM-CO-oder G-R-NH-CHM-CO-W- bedeutet und Y -P, -NH-CHQ-CO-P, -V-NH-CHQ-CO-P,
-NH-CHQ-CO-U-P, -V-NH-CHQ-CO-U-P,
-NH-CHQ-K-NH-CHL-CO-P,
-V-NH-CHQ-K-NH-CHL-CO-P,
-NH-CHQ-K-NH-CHL-CO-U-P oder
-V-NH-CHQ-K-NH-CHL-CO-U-P ist, wobei in X und Y
G ein Wasserstoffatom oder eine
Aminoschutzgruppe bedeutet,
P für eine OH- oder NH2-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder
G und P zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe -CO-(CH2)a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist,
K, R, U, V und W Peptidketten aus 1-5
natürlich vorkommenden α-Aminosäuren darstellen,
L, M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen -CH3, -CH2-CH(CH3)2,
-CH2-CO-NH 2, - (CH2)3-NH-C (NH)-NH2, -(CH2)2-CO-NH2, -CH(CH3)2, -CH2OH,
-(CH2)2COOH, sind oder
A, B, D, M, L und Q paarweise eine oder zwei -(CH2)c-S-S-(CH2)d-,
-(CH2)e-CO-NH-(CH2)f- oder
-(CH2)e-NH-CO-(CH2)g-NH-CO-(CH2)f-Brücke (n) (mit c und d in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.
2. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe und P eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxylschutzgruppe darstellen und A, B, D, M, L und Q nicht miteinander verbunden sind.
3. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe und P eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxylschutzgruppe darstellen und M und Q, A und Q, B und Q oder D und Q zusammen eine -(CH2)c-S-S-(CH2)d- Brücke bedeuten.
4. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe und P eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxylschutzgruppe darstellen und M und Q, A und Q, B und Q oder D und Q zusammen eine Gruppe
-(CH2)e-NH-CO-(CH2)f- Oder -(CH2)e-NH-CO-(CH2)g-NH-CO-(CH2)f bedeuten.
5. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G + P zusammen eine
kovalente Bindung oder -CO-(CH2)a-NH- bedeuten.
6. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe und P eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxylschutzgruppe darstellen und entweder M + D und A + Q oder A + L und D + Q zusammen -(CH2)c-S-S-(CH2)d- oder -(CH2)e-NH-CO-(CH2)f-Brücken (mit e und f in der
Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4) bedeuten.
7. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe und P eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxylschutzgruppe darstellen und Z1 bis Z6 jeweils zwei Wasserstoffatome bedeuten.
8. Peptide gemäß Anspruch 1 bis 7 zur Verwendung bei der
Bekämpfung von Krankheiten.
9. Verwendung der Peptide gemäß Ansprüchen 1 bis 7 zur Bekämpfung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von
Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen.
10. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man diese nach in der PeptidChemie bekannten Methoden herstellt.
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|---|---|---|---|
| DE19904041187 DE4041187A1 (de) | 1990-12-21 | 1990-12-21 | Neue tnf-peptide |
| DEP4041187.7 | 1990-12-21 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO1992011285A1 true WO1992011285A1 (de) | 1992-07-09 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/EP1991/002405 WO1992011285A1 (de) | 1990-12-21 | 1991-12-13 | Neue tnf-peptide |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015044900A1 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Therapeutic immunomodulating compounds |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0347728A2 (de) * | 1988-06-20 | 1989-12-27 | Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Monoklonaler Antikörper gegen menschliches Lymphotoxin und seine Verwendung |
| WO1990006942A1 (de) * | 1988-12-12 | 1990-06-28 | Basf Aktiengesellschaft | Neue tnf-peptide |
-
1990
- 1990-12-21 DE DE19904041187 patent/DE4041187A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-12-13 WO PCT/EP1991/002405 patent/WO1992011285A1/de unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0347728A2 (de) * | 1988-06-20 | 1989-12-27 | Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Monoklonaler Antikörper gegen menschliches Lymphotoxin und seine Verwendung |
| WO1990006942A1 (de) * | 1988-12-12 | 1990-06-28 | Basf Aktiengesellschaft | Neue tnf-peptide |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Chemical Abstracts, Band 45, Nr. 17, 28. Oktober 1991, (Columbus, Ohio, US), A.E. POSTLETHWAITE et al.: "Stimulation of fibroblast chemotaxis by human recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and a synthetic TNF-alpha 31-68 peptide", siehe Seite 716, Zusammenfassung Nr. 181051d, & J. EXP. MED. 1990, 172(6), 1749-56, siehe die Zusammenfassung * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015044900A1 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Therapeutic immunomodulating compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4041187A1 (de) | 1992-06-25 |
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