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WO1992010577A1 - Multisite integration cassette for the genome of a yeast - Google Patents

Multisite integration cassette for the genome of a yeast Download PDF

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Publication number
WO1992010577A1
WO1992010577A1 PCT/FR1991/001008 FR9101008W WO9210577A1 WO 1992010577 A1 WO1992010577 A1 WO 1992010577A1 FR 9101008 W FR9101008 W FR 9101008W WO 9210577 A1 WO9210577 A1 WO 9210577A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
yeast
interest
sigma
integration
Prior art date
Application number
PCT/FR1991/001008
Other languages
French (fr)
Inventor
Alain Nicolas
Bernard Kudla
Nathalie Labat
Daniel Pardo
Original Assignee
Eurolysine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eurolysine filed Critical Eurolysine
Priority to JP4502908A priority Critical patent/JPH06504201A/en
Publication of WO1992010577A1 publication Critical patent/WO1992010577A1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome

Definitions

  • the subject of the invention is a cassette for integration into the genome of a yeast, yeast strains transformed by said cassette, and a process for preparing products of interest with a yeast strain thus transformed.
  • integration cassette is meant any construction intended to ensure the integration, in the yeast genome, of a sequence of interest.
  • HICKS et al (1) have described transformation events of a yeast by a plasmid leading to homologous recombination between a sequence present in the yeast genome and a sequence carried by the plasmid. integration into the yeast genome of a sequence which was not originally present there.
  • the subject of the invention is a cassette for integration into the genome of a yeast of the genus Saccharomyces, characterized in that it comprises at least:
  • the integration cassette comprises, as integration sequence, a sequence homologous to a sequence of the Solo LTR type, in particular a Solo LTR sequence, of a yeast of the genus Saccharomyces, especially from S. cerevisiae.
  • the Solo LTR sequences are derived from transposable elements of yeast.
  • Transposable elements are, in the genome of a given microorganism, DNA sequences capable of moving from one position to another.
  • transposable elements identified as retrotransposons, transpose by a mechanism that uses TARN.
  • transposable elements Four types of transposable elements have been described in yeast. They are designated by Ty1, Ty2, Ty3 and Ty4.
  • Each of these elements is composite and consists of an internal region of several kb, flanked by LTR (Long Terminal Repeat) of several hundred base pairs each ( Figure 1). The ends of these LTRs are inverted repeat sequences, up to 10 bp.
  • LTR Long Terminal Repeat
  • the transposition of Ty occurs via an RNA transcribed from one LTR to another and having a terminal repetition of 45 bp. After reverse transcription of this RNA, the copied DNA is integrated into the genome, producing a 5 bp duplication of the chromosomal target on either side of the Ty (5).
  • the Ty can excise itself and leaves an integration LTR sequence called "Solo LTR", surrounded by the 5 bp duplication.
  • the retrotransposons Ty1 and Ty2 are structurally close. They have an internal epsilon domain of 5.3 kb and two flanking direct repeat sequences, called delta elements from 334 to 338 bp. They are present at the rate of 30-35 copies per haploid genome. They transpose by frequently inserting into the 5 'region of genes and generally inducing expression mutations (6,7).
  • Ty3 retrotransposon has limited sequence homologies with the sequences of Ty1 and Ty2 (8). 1 to 4 Ty3 elements have been described per cell, without having observed any mutation due to the transposition of a Ty3 element.
  • Ty3 is a 5.4 kb element composed of an internal domain of 4.7 kb and LTR sequences of 340 bp called Sigma sequences.
  • the genome of the yeast S. cerevisiae also contains approximately 100 copies of Solo Delta sequences not associated with the elements Ty 1 and Ty2.
  • These Solo Delta sequences show between them sequence divergences ranging from 10 to 40% (9). They can be found in groups of four to five elements, and are sometimes found in the several hundred bases which precede tRNAs (10). They probably result from the excision of the internal region of Ty by homologous recombination between its two flanking Delta sequences.
  • the expression cassette according to the invention, it comprises an integration sequence homologous to a Solo Sigma sequence.
  • Solo Sigma sequences Depending on the yeast strains studied, there are approximately 30 copies of Solo Sigma sequences. They have a high conservation of sequence between them since the maximum divergence observed between two sequences is 2.5% (11). Unlike Solo Delta, Solo Sigma have a close association with transfer RNA (tRNA). In particular, they are always located at a distance of 16 to 19 bp in 5 ′ from the point of initiation of transcription of a tRNA and no interaction between the element Sigma and the expression of tRNA seems to occur.
  • tRNA transfer RNA
  • the DNA fragment thus prepared is associated with bacterial DNA fragments comprising in particular an origin of bacterial replication and a selection gene, for example a gene for resistance to an antibiotic. .
  • sequence of interest can code for any product of interest: protein, enzyme or other. It can be heterologous or homologous, depending on whether one wishes the yeast to produce a product which it does not produce naturally, or even increase the level of expression of a product produced naturally by the yeast.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a product of interest by a yeast of the genus Saccharomyces by transformation of a yeast with an integration cassette according to the invention.
  • the integration cassette according to the invention comprise several sequences of interest so as to allow the integration and then the expression of several sequences. This embodiment is particularly advantageous when it is wished to produce simultaneously with a yeast several useful proteins, or alternatively several enzymes coded by genes of a biosynthetic pathway for the preparation of a particular metabolite.
  • the integration cassette according to the invention is used to make sequential integrations of various sequences of interest in the yeast genome.
  • this method can be useful for the integration of several genes from a biosynthetic pathway of a particular metabolite.
  • the invention also relates to a process for the preparation of several products of interest, by a yeast of the genus Saccharomyces according to which:
  • a yeast of the genus Saccharomyces is successively transformed with integration cassettes according to the invention, each comprising as DNA sequence coding for one of the products of interest, or
  • a yeast of the genus Saccharomyces is transformed with an integration cassette according to the invention comprising several sequences of interest each coding for one of the products of interest,
  • the sequence of interest is preferably cloned inside the integration sequence.
  • the yeast of the genus Saccharomyces allowing the preparation of several products of interest is obtained by genetic crossing between two parental strains each carrying a subset of the genes of interest, the genes being integrated into the sites sequences naturally repeated via a multisite integration cassette according to the invention.
  • the genetic recombination of parental characteristics leads to daughter strains bringing together the different sequences of interest, integrated into the sites of naturally repeated sequences, and therefore carrying all of the genes of interest.
  • a yeast strain of the genus Saccharomyces allowing the preparation of several products of interest can, according to yet another aspect of the invention, be obtained by cotransformation of a yeast strain by several integration cassettes according to the invention, bearing different genes of interest. It is also possible to carry out the cotransformation of a yeast of the genus Saccharomyces by an integration cassette according to the invention and a selectable vector.
  • the invention also relates to a yeast strain transformed by an integration cassette according to the invention. More particularly, it relates to a yeast strain of the genus Saccharomyces which contains in its genome at least one sequence of interest integrated into a single copy in at least one non-essential sequence naturally repeated, and dispersed in its genome, at the site of said naturally repeated sequence. It is in particular a strain of S. cerevisiae for which the said naturally repeated sequence dispersed in its genome is a Solo Sigma sequence.
  • the copies of the genes of interest are targeted and integrated at different non-neighboring points on the host DNA.
  • the integration sites are not essential to yeast, and we do not run the risk, thanks to the specificity of targeting during this integration, of causing partial or total inactivation of a gene essential to the cell.
  • the transformation of yeasts by the integration cassette according to the invention can be done by different methods, in particular by electroporation.
  • FIGS. 1 to 23 show:
  • FIG. 1 the general structure of a Ty yeast retrotransposon.
  • FIG. 2 the physical map of the chromosomal region around the Solo Sigma sequences carried by chromosome VIII of S. cerevisiae, near the ARG4 gene.
  • FIG. 3 the nucleotide sequence of the region of chromosome VIII of S. cerevisiae located 4 kb 5 'from the ARG4 gene. Below the sequence are indicated the differences observed with the most frequently obtained Solo Sigma sequence.
  • FIG. 7 the structure of plasmids pBK609, pBK610 and pBK614.
  • FIG. 10 the structure of plasmids pBK61 1, pBK615 and pBK616.
  • FIG. 1 structure of plasmids pBK620 and pBK623
  • ORT720 to ORT730 by a specific ARG4 probe ORT720 to ORT730 by a specific ARG4 probe.
  • FIG. 19 1a same analysis as in Figure 17, except that it relates to the transformers ORT740.1, 740.2, 740.3.
  • the BamHI-Pstl restriction fragment from the 4 kb plasmid p (spo13) 2 (12) containing the element Sigma (FIG. 2) is used to generate different restriction fragments: Xhol-Bg I II (0.8 kb) , BglII-XhoI (1.7 kb) and BglII-EcoRI (2.1 kb). These fragments are then each subcloned into a vector of the BluescriptKS- (Stratagene) type to give the plasmids pBL1, pBL4 and pBL6 respectively.
  • This nucleotide sequence presents at the XhoI site considered, from position 258 to position 598, the 341 base pairs corresponding to the conventional sequences of a Sigma element. This fragment will later be used to direct the integration. In particular, we note from position 258 to 265 and from position 591 to 598 the reverse repeated sequences TGTTGTAT and ATACAACA which correspond to the characteristic limits of this element.
  • the element is bordered by the duplication of the GAATG sequence repeated in direct orientation.
  • This GAATG sequence is not specific to the Sigma element, but specific to the integration locus.
  • This duplication of 5bp on either side of a Sigma element is the sign of the excision of TYIII by intramolecular recombination between its Sigma LTRs. We therefore have at this locus a "Solo Sigma" element.
  • position 241 to 169 the sequences of a transfer RNA gene. It is the gene coding for the tRNA Ala, the majority iso acceptor recognizing the AGC codon. It can be seen that the Sigma element is located 16 base pairs 5 ′ from the initiation point of transcription of this tRNA.
  • each identified Sigma element is designated by SigmaXXX.xx, where XXX in Roman numeral specifies the number of the chromosome carrying the Sigma and xx in Arabic numeral specifies the Sigma on a given chromosome.
  • XXX in Roman numeral specifies the number of the chromosome carrying the Sigma
  • xx in Arabic numeral specifies the Sigma on a given chromosome.
  • sequence obtained comes from SIGMA VIII.I.
  • SIGMAVIII.I has 9 sequence singularities compared to the sequence mainly obtained by Sandmeyer (these sequence singularities are indicated by the indication under the sequence of the corresponding Sandmeyer bases - Figure 3). This divergence represents 9 nucleotides out of 341, or 2.6%.
  • OL1 Mat ⁇ , his3- (11.15), leu2- (3.112), ura3- (257.373), gal2.
  • MGD131 102 A Mat a, his3-1, ade2, arg4- ⁇ 2060, ura3-52, trp1-289.
  • the analysis of these strains is carried out by separating the chromosomes by electrophoresis in pulsed fields (CHEF DR II, Bio-Rad), then the chromosomes once separated are transferred to a Hybond N + nylon membrane (Amersham).
  • the filter obtained is hybridized using the ClaI-HindIII fragment originating from the plasmid pBK605 and labeled with 32 P by "Random
  • the first mutagenesis consists in introducing on each side of the inverted repeat sequences which border the element SIGMAVIII.I restriction sites allowing the precise cloning of this element to the exclusion of any other chromosomal sequence.
  • SIGMAVIII.I by P.C.R. Polymerase Chain Reaction
  • the initial construction used for this mutagenesis is the plasmid pBL6 carrying the 2.1 kb chromosomal fragment BglII-EcoRI containing the
  • SIGMAVIII.I The amplification leads to the synthesis of the DNA fragment comprised between the two primer oligonucleotides used.
  • the reaction mixture (100 ⁇ l) for the PCR reaction comprises:
  • the mixture is incubated at 100 ° C for 3 minutes, then cooled in ice. Then 1 ⁇ l (5 U) of the DNA Taq polymerase thermostable is added to the mixture. This is then covered with 200 ⁇ l of mineral oil.
  • the amplification reaction is carried out in a thermal cycler at
  • a 20-minute polymerization step is carried out at 72 ° C. in order to complete the interrupted syntheses.
  • Part of the amplification product (20 ⁇ l) is separated by agarose gel electrophoresis.
  • the 350 bp DNA fragment obtained is then purified by adsorption on glass beads, taken up in TE and restricted by the enzymes SpeI and SalI.
  • This restricted fragment is then cloned into a vector M1 3mp18 opened by the enzymes XbaI and Sal I to give the plasmid pBK605 (see FIG. 6).
  • the second mutagenesis undertaken aims to create restriction sites at the center of the Sigma element so as to allow the cloning of sequences of interest at this position.
  • the first of these amplifications comprises a mutagenic oligonucleotide SigB central to the element Sigma and a non-mutagenic oligonucleotide REV located in the vector upstream of the Sigma.
  • the second amplification is carried out with the mutagenic oligonucleotide SigA complementary to SigB and a non-mutagenic oligonucleotide UN located in the vector downstream of the Sigma.
  • oligonucleotides SigA and SigB The structure of the oligonucleotides SigA and SigB is given in FIG. 6.
  • the products of these two syntheses are purified on agarose gel.
  • the DNA fragment obtained during the first amplification is restricted by the enzymes SmaI and StuI then cloned into a Bluescript Ks + opened by the enzyme SmaI to give the plasmid pBK609 (FIG. 7).
  • the DNA fragment obtained during the second amplification is restricted by the enzymes SalI and StuI. This fragment is then cloned into the plasmid pBK609 first opened by the enzyme HindIII and treated with Polymerase I fragment from Klenow, then restricted by the enzyme SalI.
  • the ClaI-ClaI restriction fragment obtained from the plasmid pBK610 is introduced into the ClaI site of a plasmid derived from Bluescript KS + lacking the SmaI, PstI, EcoRI and EcoRV sites.
  • the plasmid pBK614 thus obtained is presented in FIG. 7.
  • the duplications of the BamHI and EagI sites are deleted, and the Sigma element is now directly framed by HindIII and ClaI sites.
  • the resulting mutated Sigma element is called SIGMAVIII.I *.
  • the DNA of the EcoRI-NslI restriction fragment (1.1 kb) containing the URA3 gene (13) is purified and introduced into the plasmid pBK614 opened by the enzymes EcoRI and PstI.
  • the resulting plasmid pBK617 is presented in FIG. 9.
  • the DNA of the 2060 bp HpaI-HpaI fragment of the genome of S. cerevisiae containing the transcriptional unit ARG4 (FIG. 2) is cloned at the SmaI site of the polylinker of the plasmids pUC18 and pUC19.
  • the EcoRI-PstI fragments (2.1 kb) of the plasmids resulting from these cloning are purified and inserted into the plasmids pBK610 and pBK614 opened by the enzymes EcoRI and PstI.
  • the plasmids pBK61 1, pBK615 and pBK616 resulting from these constructions are presented in FIG. 10. EXAMPLE 6
  • the OL1 receptor strain, carrying the ura3- (257,373) mutation is transformed by electroporation (Bio-Rad GenePulser) with the fragment
  • the cells are kept at room temperature for 20 to 25 minutes then recentrifuged.
  • the pellet is taken up in 800 ⁇ l (i.e. 10 9 cells / ml) in electroporation buffer:
  • the receptor strain MGD131 102A carrying the arg4- ⁇ 2060 mutation is transformed as before by electroporation using the 2.5 kb Smal-HindIII restriction fragment (Sigma :: ARG4) originating from the digestion of the plasmid pBK611, see FIG. 10.
  • the probe used is the HpaI-HpaI fragment of 2060 bp which contains the transcriptional unit ARG4 (FIG. 2) and which corresponds exactly to the deletion 2060 of the receptor strain. In this way, only the copies of the gene introduced during the transformation are revealed by hybridization.
  • the ARG4 gene is present on different chromosomes depending on the transformants (IX for ORT720; VIII for ORT721, 724 and 728; II for ORT722, 723 and 730; XV or VII for ORT725; XII or IV for ORT726 and 729).
  • the intensity of the hybridization signal obtained is variable: higher for ORT722 and 723, lower for ORT729 although this transformant is phenotypically ARG + .
  • the total DNA of the transformants ORT720, 722 and 724 is extracted and analyzed by Southern by a simple restriction ClaI, BglII and BamHI and by a double restriction XhoI + NdeI (figure 15).
  • the probe used is the HpaI-HpaI fragment of 2060 bp, specific for the ARG4 gene.
  • the 180 bp adjacent to the integrated Sigma :: ARG4 element correspond exactly to those initially described for the flanking region of SIGMA VIII.I from position 77 to position 257. These 180 bp cover the Ala tRNA associated with SIGMAVIII .I ( Figure 3).
  • nucleotides A in place of nucleotides C and G which singularize SIGMAVIII.l, and which were initially present in the sequence of the SmaI-HindIII fragment used for the transformation.
  • the receptor strains MGD131 2C and MGD 131 102A carrying the arg4- ⁇ 2060 mutation are cotransformed by electroporation using the restriction fragment HindIII-HindIII of 2.4 kilobases purified from the plasmid pBK620 and a microgram of a replicative plasmid of yeast containing a selection marker, either the LEU2 gene to transform the MGD131 2C strain or the HIS3 gene to transform the MGD 131 102 A strain.
  • the transformants are selected on a selective medium respectively without leucine or histidine and analyzed by a mitotic papillation test using an arg4-BgIII compatible sex sign test strain which allows the screening of cotransformants having integrated the Sigma :: arg4-EcoRV fragment (Nicolas et al. 1989).
  • the replicative plasmid (containing the LEU2 or HIS3 gene) is segregated from the cells by growth in rich YPG medium containing leucine or histidine.
  • arg4-EcoRV transformants is carried out as in EXAMPLE 9 by separation of the chromosomes, transfer to a nylon membrane and hybridization with a probe containing the ARG4 gene.
  • the results presented in FIG. 17 show the integration of the arg4-EcoRV gene on different chromosomes according to the transformants (Chr. XVI for ORT1304 obtained with the strain MGD 1312C; Chr.IX for ORT 1305 and Chr. XV or VII for ORT1306 obtained from the strain MGD 131 102A).
  • the ARG + ura- ORT720 and ORT723 transformants obtained and characterized in Example 8 are transformed by electroporation with the DNA of the ClaI fragment (Sigma :: URA3) purified after digestion of the plasmid pBK617.
  • the URA + transformants obtained are selected on a medium without uracil. These URA + transformants have retained the ability to grow on arginine-free medium. Analysis of 5 ARG4 + URA3 + transformers (designated by
  • ORT720.6, 720.7, 720.8 and ORT723.8, 723.9 chosen at random, is carried out by separation of chromosomes, transfer onto nylon membrane and hybridization of the filter obtained using specific probes ARG4 and URA3
  • the transformers ORT720.6, 720.7 and 720.8 carry the ARG4 gene on chromosome IX like the ORT720 strain from which they are derived.
  • these over-transformers carry the URA3 gene respectively to chromosome XII, VIII and IV.
  • transformers ORT723.8, 723.9 carry on chromosome II the gene ARG4 as the strain ORT723 from which they derive and the gene URA3, respectively on chromosome VIII and XII.
  • URA3 fragment then by the Sigma :: ARG4 fragment
  • the transformant URA + arg- ORT740 obtained and characterized in Example 7 is transformed by electroporation with the DNA of the HindIII fragment (Sigma :: ARG4 of 2.4 kb) purified after digestion of the plasmid pBK615.
  • the ARG + transformants obtained are selected on an arginine-free medium. These transformants have retained the ability to grow in a medium without uracil.
  • these three transformers carry the URA3 gene on chromosome VIII like the ORT740 strain from which they derive and the ARG4 gene on chromosome IX, IV and XII respectively.
  • the primary transformant ORT1305 containing a Sigma :: arg4-EcoRV sequence integrated into chromosome IX has been retransformed with a Sigma :: arg4-BgIII fragment.
  • the ORT 1305 strain of genome S ⁇ gma : arg4-EcoRV (chromosome IX), arg4 2060 (chromosome VIII), ura3-52, trpl, his3, ade2, Mata, was cotransformed by the Sigma :: arg4-BgIII fragment of 2 , 4 kb purified after digestion of the plasmid pBK623 with the enzyme HindIII and the replicative plasmid containing the HIS3 gene.
  • the HIS + transformants are selected on histidine-free medium and genetically analyzed by a self-screening test to identify the cells that have kept the arg4-EcoRV information and acquired the arg4-BgIII marker. These cells, which are still of the arg- phenotype, now have the capacity to generate, by recombination, during the vegetative growth, ARG + prototrophic cells which multiply on an arginine-free medium.
  • the analysis of a few transformants called ORT1320-X, chosen at random, is carried out by separation of chromosomes, transfer and hybridization of the filter obtained using a specific ARG4 probe (figure
  • the S ⁇ gma : arg4-EcoRV and Sigma :: arg4 BgIII cassettes different from 6 base pairs (2 base pairs at the arg4-EcoRV mutation and 4 base pairs at the arg4-BgIII mutation) over one length total of 2400 nucleotides. It is therefore possible to sequentially integrate at least two copies of a gene of interest into the yeast genome by homologous recombination.
  • example 1 1, Cl The type of experiment described above (example 1 1, Cl) was carried out from a parental strain ORD 1306-7D containing two copies S ⁇ gma :: arg4-EcoRV in order to determine if it was possible to introduce a third copy Sigma :: arg4.
  • the receptor strain ORD1306-7D of genotype Sigma :: arg4-EcoRV (Chr.IX), S ⁇ gma :: arg4-RV (Chr.XVI), arg4-2060, h ⁇ s3, ura3-52, trpl, Mata was obtained by sporulation of the diploid ORD 1306 from the crossing of the strains ORT1304 and ORT1305 described in EXAMPLE 10. This demonstrates the possibility of introducing several copies of the Sigma :: gene cassette by crossing transformants and reassorting chromosomes in meiosis.
  • the strain ORD1306-7D was cotransformed with the replicative plasmid HIS + and the fragment Sigma :: arg4-BgIII purified from the plasmid pBK623 digested with the enzyme HindIII.
  • Three HIS + arg- but self-papering (ARG + ) transformants on an arginine-free medium were obtained. The analysis of these three transformants by separation of chromosomes, transfer and hybridization using an ARG4 probe, reveals for each of them (FIG.
  • the MGD 131 102A arg4- ⁇ 2060 ura-52 strain is transformed by electroporation using a DNA mixture comprising:
  • ARG transformants are selected on medium without arginine and subcultured on medium without uracil. In this way, we screen the co-transformants
  • the ARG URA + co-transformants are analyzed (designated by
  • ORT746, 747, 748, 749, 751, 752 and 753) by separation of chromosomes, transfer to nylon membrane and hybridization of the filter obtained using specific probes URA3 and ARG4 ( Figure 22).
  • This chromosome can vary from one co-transformant to another.
  • the ARG4 and URA3 genes are found on the chromosome:
  • Sandermeyer A Yeast Sigma Composite Element, TY3, has Properties of a Retransposon; J. Bio. Chemist. 263: No. 3, 1413-1423 (1988).
  • TyB Homologue of the retrovirus pol gene

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Abstract

A multisite integration cassette in the genome of a yeast of the Saccharomyces is characterized in that it comprises at least: an integration sequence assuring homology with a naturally repeated non-essential sequence dispersed in the genome of the yeast; a sequence of interest. In particular, the integration sequence shows homology with a repeated, dispersed Solo Sigma sequence present in the genome of the yeast. Aplication to the synthesis of products of interest by yeast.

Description

CASSETTE D' INTEGRATION "MULTISITE" POUR LE GENOME D'UNE LEVURE  "MULTISITE" INTEGRATION CASSETTE FOR THE GENOME OF A YEAST
L'invention a pour objet une cassette d'intégration dans le génome d'une levure, des souches de levure transformées par ladite cassette, et un procédé de préparation de produits d'intérêt par une souche de levure ainsi transformée. The subject of the invention is a cassette for integration into the genome of a yeast, yeast strains transformed by said cassette, and a process for preparing products of interest with a yeast strain thus transformed.
On entend par cassette d'intégration toute construction destinée à assurer l'intégration, dans le génome d'une levure, d'une séquence d'intérêt.  By integration cassette is meant any construction intended to ensure the integration, in the yeast genome, of a sequence of interest.
Différentes techniques d'intégration dans la levure ont déjà été proposées. Ainsi, HICKS et al (1 ) ont décrit des événements de transformation d'une levure par un plasmide conduisant par recombinaison homologue entre une séquence présente dans le génome de la levure et une séquence portée par le plasmide. à une intégration dans le génome de la levure d'une séquence qui n'y était pas présente à l'origine.  Different integration techniques in yeast have already been proposed. Thus, HICKS et al (1) have described transformation events of a yeast by a plasmid leading to homologous recombination between a sequence present in the yeast genome and a sequence carried by the plasmid. integration into the yeast genome of a sequence which was not originally present there.
Les méthodes proposées jusqu'à maintenant fondées sur la recombinaison homologue, ont conduit notamment à l'intégration multicopie en tandem d'une séquence d'intérêt dans le génome de la levure. Cependant. ce type d'intégration peut être instable ce qui définit les limites de la technique envisagée pour augmenter les niveaux d'expression de la séquence d'intérêt malgré des taux de transformation tout à fait satisfaisants.  The methods proposed until now based on homologous recombination, have led in particular to the tandem multicopy integration of a sequence of interest in the yeast genome. However. this type of integration can be unstable, which defines the limits of the technique envisaged for increasing the expression levels of the sequence of interest despite quite satisfactory transformation rates.
C'est le cas, par exemple de l'intégration de séquences d'intérêt dans les séquences répétées en tandem de l'ADN codant pour les ARN ribosomiques. Ces séquences sont présentes à environ 100 à 200 copies par cellule (2). Or de telles répétitions naturelles sont fréquemment soumises a des événements de recombinaison de type "crossing over" inégal entre les chromatides soeurs tant en meïose qu'en mitose. En outre, des événements d'excision, dus à des recombinaisons intrachromosomiques entre éléments du tandem ont déjà été décrits, notament par H.C. KLEIN et al. (3). Ce type de réarrangements, peut conduire à une dérive génétique de la souche transformée et peut entraîner la perte de la séquence d'intérêt ( 4).  This is the case, for example, of the integration of sequences of interest into the tandem repeat sequences of the DNA coding for the ribosomal RNAs. These sequences are present in approximately 100 to 200 copies per cell (2). However, such natural repeats are frequently subjected to uneven crossing over type recombination events between the sister chromatids, both in meiosis and in mitosis. In addition, excision events, due to intrachromosomal recombinations between elements of the tandem have already been described, in particular by H.C. KLEIN et al. (3). This type of rearrangement can lead to a genetic drift of the transformed strain and can lead to the loss of the sequence of interest (4).
II y a donc un besoin réel d'une méthode d'intégration dans la levure qui conduise à une intégration à la fois multiple et stable de la séquence d'intérêt dans le génome de la levure, permettant un accroissement sensibie du niveau d'expression de la séquence d'intérêt. Les inventeurs ont maintenant découvert qu'il est possible d'utiliser des séquences naturellement répétées et dispersées du génome d'une levure du genre Saccharomyces dont aucune fonction n'est décrite à ce jour. Cette séquence sera appelée "non essentielle" et sera utilisée pour mettre au point une nouvelle méthode d'intégration dans le génome d'une telle levure. There is therefore a real need for a method of integration in yeast which leads to both a multiple and stable integration of the sequence of interest in the yeast genome, allowing an increased sensitivity of the level of expression. of the sequence of interest. The inventors have now discovered that it is possible to use naturally repeated and dispersed sequences of the genome of a yeast of the genus Saccharomyces, no function of which has been described to date. This sequence will be called "nonessential" and will be used to develop a new method of integrating such a yeast into the genome.
C'est pourquoi l'invention a pour objet une cassette d'intégration dans le génome d'une levure du genre Saccharomyces, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins :  This is why the subject of the invention is a cassette for integration into the genome of a yeast of the genus Saccharomyces, characterized in that it comprises at least:
- une séquence d'intégration présentant de l'homologie avec une séquence non essentielle naturellement répétée et dispersée dans le génome de la levure,  - an integration sequence having homology with a non-essential sequence naturally repeated and dispersed in the yeast genome,
- une séquence d'intérêt.  - a sequence of interest.
Selon un mode de réalisation avantageux de la cassette d'intégration selon l'invention, elle comporte en tant que séquence d'intégration une séquence homologue d'une séquence type Solo LTR, en particulier une séquence Solo LTR, d'une levure du genre Saccharomyces, notamment de S. cerevisiae.  According to an advantageous embodiment of the integration cassette according to the invention, it comprises, as integration sequence, a sequence homologous to a sequence of the Solo LTR type, in particular a Solo LTR sequence, of a yeast of the genus Saccharomyces, especially from S. cerevisiae.
Les séquences Solo LTR sont issues d'éléments transposables de la levure. Les éléments transposables sont, dans le génome d'un microorganisme donné, des séquences d'ADN capables de se déplacer d'une position à l'autre. Chez la levure, des éléments transposables identifiés comme rétrotransposons, transposent par un mécanisme qui utilise TARN.  The Solo LTR sequences are derived from transposable elements of yeast. Transposable elements are, in the genome of a given microorganism, DNA sequences capable of moving from one position to another. In yeast, transposable elements identified as retrotransposons, transpose by a mechanism that uses TARN.
Quatre types d'éléments transposables ont été décrits dans la levure. Ils sont désignés par Ty1, Ty2, Ty3 et Ty4.  Four types of transposable elements have been described in yeast. They are designated by Ty1, Ty2, Ty3 and Ty4.
Chacun de ces éléments est composite et consiste en une région interne de plusieurs kb, flanquée de LTR (Long Terminal Repeat) de plusieurs centaines de paires de bases chacun (figure 1). Les extrémités de ces LTR sont des séquences de répétition inversées, allant jusqu'à 10 pb.  Each of these elements is composite and consists of an internal region of several kb, flanked by LTR (Long Terminal Repeat) of several hundred base pairs each (Figure 1). The ends of these LTRs are inverted repeat sequences, up to 10 bp.
La transposition des Ty se produit par l'intermédiaire d'un ARN transcrit d'un LTR à l'autre et possédant une répétition terminale de 45 pb. Après transcription reverse de cet ARN, l'ADN copié est intégré au génome, produisant une duplication de 5 pb de la cible chromosomique de part et d'autre du Ty (5). Par recombinaison homologue entre ses LTR, le Ty peut s'exciser et laisse au niveau de son intégration une séquence LTR appelée "Solo LTR", entourée de la duplication de 5 pb. Ces éléments Solo sont à eux seuls incapables de transposer. The transposition of Ty occurs via an RNA transcribed from one LTR to another and having a terminal repetition of 45 bp. After reverse transcription of this RNA, the copied DNA is integrated into the genome, producing a 5 bp duplication of the chromosomal target on either side of the Ty (5). By homologous recombination between its LTRs, the Ty can excise itself and leaves an integration LTR sequence called "Solo LTR", surrounded by the 5 bp duplication. These Solo elements alone are incapable of transposing.
Les rétrotransposons Ty1 et Ty2 sont structurellement proches. Ils possèdent un domaine interne epsilon de 5,3 kb et deux séquences flanquantes de répétition directe, appelées éléments delta de 334 à 338 pb. Ils sont présents à raison de 30-35 copies par génome haploïde. Ils se transposent en s'insérant fréquemment dans la région 5' des gènes et en induisant généralement des mutations d'expression (6,7).  The retrotransposons Ty1 and Ty2 are structurally close. They have an internal epsilon domain of 5.3 kb and two flanking direct repeat sequences, called delta elements from 334 to 338 bp. They are present at the rate of 30-35 copies per haploid genome. They transpose by frequently inserting into the 5 'region of genes and generally inducing expression mutations (6,7).
Le rétrotransposon Ty3 présente par contre des homologies de séquence limitées avec les séquences de Ty1 et Ty2 (8). On a décrit de 1 à 4 éléments Ty3 par cellule, sans avoir constaté de mutation due à la transposition d'un élément Ty3. Le Ty3 est un élément de 5,4 kb composé d'un domaine interne de 4,7 kb et de séquences LTR de 340 pb appelées séquences Sigma.  The Ty3 retrotransposon, on the other hand, has limited sequence homologies with the sequences of Ty1 and Ty2 (8). 1 to 4 Ty3 elements have been described per cell, without having observed any mutation due to the transposition of a Ty3 element. Ty3 is a 5.4 kb element composed of an internal domain of 4.7 kb and LTR sequences of 340 bp called Sigma sequences.
Enfin, on a dénombré environ 1 à 4 copies d'éléments Ty4 par cellule. Les séquences flanquantes correspondantes sont appelées éléments Tau.  Finally, there were approximately 1 to 4 copies of Ty4 elements per cell. The corresponding flanking sequences are called Tau elements.
Le génome de la levure S. cerevisiae contient en outre environ 100 copies de séquences Solo Delta non associées avec les éléments Ty 1 et Ty2. Ces séquences Solo Delta montrent entre elles des divergences de séquence pouvant aller de 10 à 40% (9). Elles peuvent se rencontrer en groupes de quatre à cinq éléments, et se retrouvent parfois dans les quelques centaines de bases qui précèdent les ARNt (10). Elles résultent probablement de l'excision de la région interne du Ty par recombinaison homologue entre ses deux séquences Delta flanquantes.  The genome of the yeast S. cerevisiae also contains approximately 100 copies of Solo Delta sequences not associated with the elements Ty 1 and Ty2. These Solo Delta sequences show between them sequence divergences ranging from 10 to 40% (9). They can be found in groups of four to five elements, and are sometimes found in the several hundred bases which precede tRNAs (10). They probably result from the excision of the internal region of Ty by homologous recombination between its two flanking Delta sequences.
De la même façon, on trouve dans le génome de S. cerevisiae des séquences Solo Sigma ou Tau.  In the same way, one finds in the genome of S. cerevisiae sequences Solo Sigma or Tau.
Ces séquences Solo LTR sont particulièrement intéressantes comme séquences d'intégration dans la mesure où elles ne présentent aucune fonction essentielle pour la levure du genre Saccharomyces; par ailleurs, elles possèdent une stabilité naturelle dont peut bénéficier la séquence intégrée. Sans lier les résultats observés par la mise en oeuvre de l'invention à des hypothèses théoriques, on peut rappeler ici qu'il apparaît désormais vraissemblable que des mécanismes cellulaires contrôlent la recombinaison, et donc la stabilité de ces séquences naturellement répétées. Ces mécanismes impliqueraient par exemple des topoisomérases spécifiques. These Solo LTR sequences are particularly interesting as integration sequences insofar as they have no essential function for yeast of the genus Saccharomyces; moreover, they have a natural stability from which the integrated sequence can benefit. Without linking the results observed by the implementation of the invention to theoretical hypotheses, it may be recalled here that it now appears likely that cellular mechanisms control the recombination, and therefore the stability of these naturally repeated sequences. These mechanisms would, for example, involve specific topoisomerases.
Suivant une forme de réalisation avantageuse de la cassette d'expression selon l'invention, elle comprend une séquence d'intégration homologue d'une séquence Solo Sigma.  According to an advantageous embodiment of the expression cassette according to the invention, it comprises an integration sequence homologous to a Solo Sigma sequence.
Selon les souches de levure étudiées, on compte environ 30 copies de séquences Solo Sigma. Elles présentent entre elles une forte conservation de séquence puisque le maximum de divergence constaté entre deux séquences est de 2,5% (11). A la différence des Solo Delta, les Solo Sigma présentent une étroite association avec le ARN de transfert (ARNt). En particulier, elles sont toujours situées à une distance de 16 à 19 pb en 5' du point d'initiation de transcription d'un ARNt et aucune interaction entre l'élément Sigma et l'expression de l'ARNt ne semble se produire.  Depending on the yeast strains studied, there are approximately 30 copies of Solo Sigma sequences. They have a high conservation of sequence between them since the maximum divergence observed between two sequences is 2.5% (11). Unlike Solo Delta, Solo Sigma have a close association with transfer RNA (tRNA). In particular, they are always located at a distance of 16 to 19 bp in 5 ′ from the point of initiation of transcription of a tRNA and no interaction between the element Sigma and the expression of tRNA seems to occur.
Le fait que les Solo Sigma présentent une forte homologie de séquence entre elles, doit permettre, par l'utilisation d'un Solo Sigma donné, de cibler les constructions pour l'intégration dans les autres Solo Sigma de façon équivalente.  The fact that the Solo Sigma present a strong sequence homology between them, should make it possible, by the use of a given Solo Sigma, to target the constructs for integration into the other Solo Sigma in an equivalent manner.
Il devient ainsi possible, avec une seule étape de transformation de prévoir l'intégration d'une séquence d'intérêt à différents loci spécifiques dispersés dans le génome de la levure, et correspondant à différentes séquences Solo Sigma.  It therefore becomes possible, with a single transformation step, to provide for the integration of a sequence of interest at different specific loci dispersed in the yeast genome, and corresponding to different Solo Sigma sequences.
D'autre part, leur localisation stricte, c'est-à-dire toujours à une distance de 16 à 19 pb en 5' de gènes codant pour différents ARNt permet de prévoir l'environnement chromosomique des séquences d'intérêt intégrées à leur niveau.  On the other hand, their strict localization, that is to say always at a distance of 16 to 19 bp in 5 ′ of genes coding for different tRNAs makes it possible to predict the chromosomal environment of the sequences of interest integrated at their level .
Enfin et surtout, leur étroite association avec les ARNt exprimés suggère qu'il est possible de maintenir un Solo Sigma au voisinage direct d'une séquence fortement transcrite. Ainsi, une séquence d'intérêt introduite à ce niveau, à proximité d'un gène essentiel, bénéficiera probablement d'une forte sélection contre tout événement majeur de remaniement qui affecterait l'expression de l'ARNt. Last but not least, their close association with the expressed tRNAs suggests that it is possible to maintain a Solo Sigma in the immediate vicinity of a strongly transcribed sequence. Thus, a sequence of interest introduced at this level, close to an essential gene, will probably benefit from a strong selection against any major event of rearrangement which would affect the expression of tRNA.
On citera plus particulièrement la séquence Solo Sigma localisée sur le chromosome VIII de S. cerevisiae à proximité du gène ARG4.  Mention will be made more particularly of the Solo Sigma sequence located on the chromosome VIII of S. cerevisiae near the ARG4 gene.
Pour préparer la cassette d'intégration, on peut partir d'une séquence To prepare the integration cassette, we can start with a sequence
Solo LTR localisée sur un chromosome de la levure à transformer, et modifier cette séquence en utilisant des techniques connues de l'homme du métier pour produire un fragment d'ADN comportant une séquence d'intérêt et apte à transformer une levure du genre Saccharomyces. Solo LTR located on a chromosome of the yeast to be transformed, and modify this sequence using techniques known to those skilled in the art to produce a DNA fragment comprising a sequence of interest and capable of transforming a yeast of the genus Saccharomyces.
Ces modifications doivent permettre :  These modifications must allow:
(i) de sous-cloner et d'isoler la séquence Solo LTR à l'exclusion de toute autre séquence chromosomique, (i) to subclone and isolate the Solo LTR sequence to the exclusion of any other chromosomal sequence,
(n) de cloner une séquence d'intérêt à l'intérieur de cette séquence Solo LTR, (n) to clone a sequence of interest within this Solo LTR sequence,
(ni) par simple restriction, d'isoler un fragment d'ADN comportant une séquence Solo LTR interrompue par toute séquence d'intérêt à l'exclusion de toute séquence bactérienne.  (ni) by simple restriction, to isolate a DNA fragment comprising a Solo LTR sequence interrupted by any sequence of interest to the exclusion of any bacterial sequence.
Pour permettre sa sélection et son amplification dans les souches bactériennes, on associe au fragment d'ADN ainsi préparé des fragments d'ADN bactérien comportant en particulier une origine de réplication bactérienne et un gène de sélection, par exemple un gène de résistance à un antibiotique.  To allow its selection and its amplification in bacterial strains, the DNA fragment thus prepared is associated with bacterial DNA fragments comprising in particular an origin of bacterial replication and a selection gene, for example a gene for resistance to an antibiotic. .
D'une manière générale, la séquence d'intérêt peut coder pour tout produit d'intérêt : protéine, enzyme ou autre. Elle peut être hétérologue ou homologue, suivant que l'on désire faire produire à la levure un produit qu'elle ne produit pas naturellement, ou encore accroître le niveau d'expression d'un produit fabriqué naturellement par la levure.  In general, the sequence of interest can code for any product of interest: protein, enzyme or other. It can be heterologous or homologous, depending on whether one wishes the yeast to produce a product which it does not produce naturally, or even increase the level of expression of a product produced naturally by the yeast.
C'est pourquoi l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit d'intérêt par une levure du genre Saccharomyces par transformation d'une levure avec une cassette d'intégration selon l'invention. Bien évidemment, il est également possible de faire comporter à la cassette d'intégration selon l'invention plusieurs séquences d'intérêt de façon à permettre l'intégration puis l'expression de plusieurs séquences. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux lorsqu'on souhaite faire produire simultanément à une levure plusieurs protéines utiles, ou encore plusieurs enzymes codés par des gènes d'une voie de biosynthèse pour la préparation d'un métabolite particulier. This is why the invention also relates to a process for the preparation of a product of interest by a yeast of the genus Saccharomyces by transformation of a yeast with an integration cassette according to the invention. Obviously, it is also possible to have the integration cassette according to the invention comprise several sequences of interest so as to allow the integration and then the expression of several sequences. This embodiment is particularly advantageous when it is wished to produce simultaneously with a yeast several useful proteins, or alternatively several enzymes coded by genes of a biosynthetic pathway for the preparation of a particular metabolite.
Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, on utilise la cassette d'intégration selon l'invention pour faire des intégrations séquentielles de diverses séquences d'intérêt dans le génome de la levure. En particulier, comme dans le cas précédent, cette méthode peut être utile pour l'intégration de plusieurs gènes d'une voie de biosynthèse d'un métabolite particulier.  According to another embodiment of the invention, the integration cassette according to the invention is used to make sequential integrations of various sequences of interest in the yeast genome. In particular, as in the previous case, this method can be useful for the integration of several genes from a biosynthetic pathway of a particular metabolite.
C'est pourquoi l'invention a également pour objet un procédé de préparation de plusieurs produits d'intérêt, par une levure du genre Saccharomyces selon lequel :  This is why the invention also relates to a process for the preparation of several products of interest, by a yeast of the genus Saccharomyces according to which:
- on transforme successivement une levure du genre Saccharomyces avec des cassettes d'intégration selon l'invention, comportant chacune en tant que séquence d'intérêt une séquence d'ADN codant pour l'un des produits d'intérêt, ou  a yeast of the genus Saccharomyces is successively transformed with integration cassettes according to the invention, each comprising as DNA sequence coding for one of the products of interest, or
- on transforme une levure du genre Saccharomyces avec une cassette d'intégration selon l'invention comportant plusieurs séquences d'intérêt codant chacune pour l'un des produits d'intérêt,  a yeast of the genus Saccharomyces is transformed with an integration cassette according to the invention comprising several sequences of interest each coding for one of the products of interest,
- on met en culture la souche de levure ainsi transformée, et  - the transformed yeast strain is cultured, and
- on récupère ledit métabolite. - said metabolite is recovered.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, la séquence d'intérêt est de préférence clonée à l'intérieur de la séquence d'intégration.  For the implementation of the invention, the sequence of interest is preferably cloned inside the integration sequence.
Selon un autre aspect de l'invention, la levure du genre Saccharomyces permettant la préparation de plusieurs produits d'intérêt est obtenue par croisement génétique entre deux souches parentales portant chacune un sous-ensemble des gènes d'intérêt, les gènes étant intégrés aux sites des séquences naturellement répétées par l'intermédiaire d'une cassette d'intégration multisite selon l'invention. La recombinaison génétique des caractères parentaux conduit à des souches filles réunissant les différentes séquences d'intérêt, intégrées aux sites des séquences naturellement répétées, et portant donc l'ensemble des gènes d'intérêt. According to another aspect of the invention, the yeast of the genus Saccharomyces allowing the preparation of several products of interest is obtained by genetic crossing between two parental strains each carrying a subset of the genes of interest, the genes being integrated into the sites sequences naturally repeated via a multisite integration cassette according to the invention. The genetic recombination of parental characteristics leads to daughter strains bringing together the different sequences of interest, integrated into the sites of naturally repeated sequences, and therefore carrying all of the genes of interest.
Un tel mécanisme est mis en évidence notamment à l'exemple 1 1C2. Une souche de levure du genre Saccharomyces permettant la préparation de plusieurs produits d'intérêt peut, selon encore un autre aspect de l'invention, être obtenue par cotransformation d'une souche de levure par plusieurs cassettes d'intégration selon l'invention, portant différents gènes d'intérêt. On peut également réaliser la cotransformation d'une levure du genre Saccharomyces par une cassette d'intégration selon l'invention et un vecteur sélectionnable.  Such a mechanism is demonstrated in particular in Example 1 1C2. A yeast strain of the genus Saccharomyces allowing the preparation of several products of interest can, according to yet another aspect of the invention, be obtained by cotransformation of a yeast strain by several integration cassettes according to the invention, bearing different genes of interest. It is also possible to carry out the cotransformation of a yeast of the genus Saccharomyces by an integration cassette according to the invention and a selectable vector.
Ces différents modes d'obtention peuvent être utilisés successivement, en association, pour aboutir à une levure portant l'ensemble des gènes d'intérêt désirés.  These different methods of production can be used successively, in combination, to result in a yeast carrying all of the desired genes of interest.
L'invention concerne également une souche de levure transformée par une cassette d'intégration selon l'invention. Plus particulièrement, elle a pour objet une souche de levure du genre Saccharomyces qui contient dans son génome au moins une séquence d'intérêt intégrée en une seule copie dans au moins une séquence non essentielle naturellement répétée, et dispersée dans son génome, au site de ladite séquence naturellement répétée. Il s'agit notamment d'une souche de S.cerevisiae pour laquelle ladite séquence naturellement répétée et dispersée dans son génome est une séquence Solo Sigma.  The invention also relates to a yeast strain transformed by an integration cassette according to the invention. More particularly, it relates to a yeast strain of the genus Saccharomyces which contains in its genome at least one sequence of interest integrated into a single copy in at least one non-essential sequence naturally repeated, and dispersed in its genome, at the site of said naturally repeated sequence. It is in particular a strain of S. cerevisiae for which the said naturally repeated sequence dispersed in its genome is a Solo Sigma sequence.
L'intégration, conformément à l'invention, des séquences d'intérêt spécifiquement au site de la séquence naturellement répétée présente des avantages certains par rapport aux constructions ayant déjà pu être décrites.  The integration, in accordance with the invention, of the sequences of interest specifically at the site of the naturally repeated sequence has certain advantages over the constructions which have already been described.
En effet les copies du gènes d'intérêt sont ciblées et intégrées en différents points non voisins sur l'ADN hôte. En outre, on sait que les sites d'intégration ne sont pas essentiels à la levure, et on ne court pas le risque, grâce à la spécificité du ciblage lors de cette intégration, de provoquer la l'inactivation partielle ou totale d'un gène indispensable à la cellule. La transformation des levures par la cassette d'intégration selon l'invention peut se faire par différentes méthodes, notamment par électroporation. In fact, the copies of the genes of interest are targeted and integrated at different non-neighboring points on the host DNA. In addition, we know that the integration sites are not essential to yeast, and we do not run the risk, thanks to the specificity of targeting during this integration, of causing partial or total inactivation of a gene essential to the cell. The transformation of yeasts by the integration cassette according to the invention can be done by different methods, in particular by electroporation.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée suivante d'exemples de réalisation, accompagnés des figures 1 à 23, qui montrent :  Other characteristics and advantages of the invention will appear during the following detailed description of exemplary embodiments, accompanied by FIGS. 1 to 23, which show:
- Figure 1 : la structure générale d'un rétrotransposon Ty de levure. - Figure 1: the general structure of a Ty yeast retrotransposon.
- Figure 2 : la carte physique de la région chromosomique autour des séquences Solo Sigma portées par le chromosome VIII de S. cerevisiae, à proximité du gène ARG4. - Figure 2: the physical map of the chromosomal region around the Solo Sigma sequences carried by chromosome VIII of S. cerevisiae, near the ARG4 gene.
- Figure 3 : la séquence nucleotidique de la région du chromosome VIII de S.cerevisiae située à 4 kb en 5' du gène ARG4. Sous la séquence sont indiquées les différences constatées avec la séquence Solo Sigma la plus fréquemment obtenue.  - Figure 3: the nucleotide sequence of the region of chromosome VIII of S. cerevisiae located 4 kb 5 'from the ARG4 gene. Below the sequence are indicated the differences observed with the most frequently obtained Solo Sigma sequence.
- Figure 4 : l'analyse par autoradiographie du contenu en séquences Solo  - Figure 4: autoradiography analysis of the content in Solo sequences
Sigma des souches de S.cerevisiae, OL1, MGD131 102A et YNN295.  Sigma of the strains of S. cerevisiae, OL1, MGD131 102A and YNN295.
- Figure 5 : les différentes étapes conduisant par mutagénèse dirigée à l'introduction, de part et d'autre des séquences répétées inversées qui bordent l'élément Sigma VIII.I, de sites de restriction permettant le clonage précis de la séquence Sigma à l'exclusion de toute autre séquence chromosomique.  - Figure 5: the different stages leading by mutagenesis directed to the introduction, on both sides of the inverted repeat sequences which border the element Sigma VIII.I, of restriction sites allowing the precise cloning of the Sigma sequence at l exclusion of any other chromosomal sequence.
- Figure 6 : les différents oligonucléotides nécessaires pour introduire, par une technique de mutagénèse par PCR, des sites de restriction au centre de la séquence Sigma clonée dans le plasmide pBK605, pour permettre le clonage d'une séquence d'intérêt à cette position.  - Figure 6: the different oligonucleotides necessary to introduce, by a PCR mutagenesis technique, restriction sites at the center of the Sigma sequence cloned in the plasmid pBK605, to allow the cloning of a sequence of interest at this position.
- Figure 7 : la structure des plasmides pBK609, pBK610 et pBK614. - Figure 7: the structure of plasmids pBK609, pBK610 and pBK614.
- Figure 8 : la séquence nucleotidique du fragment Clal-HinDIII du plasmide pBK610. - Figure 9 : la structure du plasmide pBK617. - Figure 8: the nucleotide sequence of the ClaI-HinDIII fragment of the plasmid pBK610. - Figure 9: the structure of the plasmid pBK617.
- Figure 10 : la structure des plasmides pBK61 1 , pBK615 et pBK616. - Figure 10: the structure of plasmids pBK61 1, pBK615 and pBK616.
- Figure 1 1 : structure des plasmides pBK620 et pBK623 - Figure 1 1: structure of plasmids pBK620 and pBK623
- Figure 12 :une autoradiographie des chromosomes des transformants  - Figure 12: an autoradiography of the chromosomes of the transformants
ORT786.1 à ORT786.9 par une sonde spécifique URA3. ORT786.1 to ORT786.9 by a specific URA3 probe.
- Figure 13 : une autoradiographie des chromosomes des transformants - Figure 13: autoradiography of the chromosomes of the transformants
ORT731 à ORT740 par une sonde spécifique URA3.  ORT731 to ORT740 by a specific URA3 probe.
- Figure 14 : une autoradiographie des chromosomes des transformants  - Figure 14: an autoradiography of the chromosomes of the transformants
ORT720 à ORT730 par une sonde spécifique ARG4.  ORT720 to ORT730 by a specific ARG4 probe.
- Figure 15 : figure 15a) :1a structure et les séquences bordantes du fragment SmaI-HindIII du plasmide pBK61 1. figure 15b) : l'analyse par Southern des transformants ARG+ obtenus. - Figure 15: Figure 15a): 1a structure and the bordering sequences of the SmaI-HindIII fragment of the plasmid pBK61 1. Figure 15b): Southern analysis of the ARG + transformants obtained.
- Figure 16 :1a technique utilisée pour déterminer les modalités d'intégration appelée amplification par PCR inverse, ainsi que les séquences génomiques des transformants ORT724 et ORT723. - Figure 16: 1a technique used to determine the integration modalities called amplification by reverse PCR, as well as the genomic sequences of transformants ORT724 and ORT723.
- Figure 17 : l'analyse par autoradiographie des chromosomes des transformants ORT1304, OR T1305 et OR T1306.- Figure 17: autoradiography analysis of the chromosomes of transformants ORT1304, OR T1305 and OR T1306.
- Figure 18 : l'analyse par autoradiographie des chromosomes de différents surtransformants ARG URA à l'aide d'une sonde spécifique- Figure 18: autoradiography analysis of chromosomes of different ARG URA transformers using a specific probe
URA3 et ARG4 (surtransformants ORT720.6, 720.7, 720.8, 723.8, 723.9). URA3 and ARG4 (transformers ORT720.6, 720.7, 720.8, 723.8, 723.9).
- Figure 19 : 1a même analyse qu'à la figure 17, sauf qu'elle concerne les surtransformants ORT740.1, 740.2, 740.3.  - Figure 19: 1a same analysis as in Figure 17, except that it relates to the transformers ORT740.1, 740.2, 740.3.
- Figure 20 : l'analyse par autoradiographie des chromosomes des transformants ORT 1320-X. - Figure 20: autoradiography analysis of the chromosomes of the ORT 1320-X transformants.
- Figure 21 : l'analyse par autoradiographie des chromosomes des transformants ORT 1327-X.  - Figure 21: autoradiographic analysis of the chromosomes of the ORT 1327-X transformants.
- Figure 22 : 1a même analyse qu'aux figures 17 et 18, sauf qu'elle concerne les cotransformants ORT746, 747, 748, 749, 751 , - Figure 22: the same analysis as in Figures 17 and 18, except that it concerns the cotransformants ORT746, 747, 748, 749, 751,
752, 753. EXEMPLE 1 752, 753. EXAMPLE 1
Clonage et caractérisatïon d'un élément Sigma porté par le chromosome Cloning and characterization of a Sigma element carried by the chromosome
VIII de S. cerevisiae, à proximité du gène ARG4 VIII of S. cerevisiae, near the ARG4 gene
Il fut détecté par hybridation à l'aide d'une séquence spécifique isolée à partir d'une séquence Sigma connue (11), puis l'existence d'un site de restriction Xhol caractéristique de l'élément Sigma a permis de préciser sa localisation à 4 kb en 5' du gène ARG4.  It was detected by hybridization using a specific sequence isolated from a known Sigma sequence (11), then the existence of an Xhol restriction site characteristic of the Sigma element made it possible to specify its location. 4 kb 5 'to the ARG4 gene.
La carte de restriction de la région chromosomique correspondante est donnée à la figure 2.  The restriction map of the corresponding chromosomal region is given in Figure 2.
On utilise le fragment de restriction BamHI-Pstl provenant du plasmide p(spo13)2 (12) de 4 kb contenant l'élément Sigma (figure 2) pour générer différents fragments de restriction : Xhol-Bg l II (0,8 kb), BglII-XhoI (1,7 kb) et BglII-EcoRI (2,1 kb). Ces fragments sont ensuite sous-clonés chacun dans un vecteur de type BluescriptKS- (Stratagène) pour donner respectivement les plasmides pBL1, pBL4 et pBL6.  The BamHI-Pstl restriction fragment from the 4 kb plasmid p (spo13) 2 (12) containing the element Sigma (FIG. 2) is used to generate different restriction fragments: Xhol-Bg I II (0.8 kb) , BglII-XhoI (1.7 kb) and BglII-EcoRI (2.1 kb). These fragments are then each subcloned into a vector of the BluescriptKS- (Stratagene) type to give the plasmids pBL1, pBL4 and pBL6 respectively.
Ces différents plasmides permettent d'obtenir de l'ADN simple brin et sont séquencés par la technique de Sanger à partir de l'oligonucléotide amorce T3.  These different plasmids make it possible to obtain single-stranded DNA and are sequenced by the Sanger technique from the oligonucleotide primer T3.
La séquence nucléotidique de la zone du chromosome VIII au voisinage du gène ARG4 obtenue est présentée à la figure 3.  The nucleotide sequence of the region of chromosome VIII in the vicinity of the ARG4 gene obtained is presented in FIG. 3.
Cette séquence nucléotidique présente au niveau du site XhoI considéré, de la position 258 à la position 598, les 341 paires de base correspondant aux séquences classiques d'un élément Sigma. Ce fragment sera ultérieurement utilisé pour diriger l'intégration. En particulier, on note de la position 258 à 265 et de la position 591 à 598 les séquences répétées inversées TGTTGTAT et ATACAACA qui correspondent aux bornes caractéristiques de cet élément.  This nucleotide sequence presents at the XhoI site considered, from position 258 to position 598, the 341 base pairs corresponding to the conventional sequences of a Sigma element. This fragment will later be used to direct the integration. In particular, we note from position 258 to 265 and from position 591 to 598 the reverse repeated sequences TGTTGTAT and ATACAACA which correspond to the characteristic limits of this element.
De plus, l'élément est bordé par la duplication de la séquence GAATG répétée en orientation directe. Cette séquence GAATG n'est pas spécifique de l'élément Sigma, mais spécifique du locus d'intégration. Cette duplication de 5bp de part et d'autre d'un élément Sigma est le signe de l'excision du TYIII par recombinaison intramoléculaire entre ses LTR Sigma. Nous avons donc à ce locus un élément "Solo Sigma". Par ailleurs, on trouve de la position 241 à 169 les séquences d'un gène d'ARN de transfert. Il s'agit du gène codant pour l'ARNt Ala, isoaccepteur majoritaire reconnaissant le codon AGC. On constate que l'élément Sigma se trouve 16 paires de bases en 5' du point d'initiation de transcription de cet ARNt. In addition, the element is bordered by the duplication of the GAATG sequence repeated in direct orientation. This GAATG sequence is not specific to the Sigma element, but specific to the integration locus. This duplication of 5bp on either side of a Sigma element is the sign of the excision of TYIII by intramolecular recombination between its Sigma LTRs. We therefore have at this locus a "Solo Sigma" element. In addition, we find from position 241 to 169 the sequences of a transfer RNA gene. It is the gene coding for the tRNA Ala, the majority iso acceptor recognizing the AGC codon. It can be seen that the Sigma element is located 16 base pairs 5 ′ from the initiation point of transcription of this tRNA.
Dans la suite de la description, chaque élément Sigma identifié est désigné par SigmaXXX.xx, où XXX en chiffre romain spécifie le numéro du chromosome portant le Sigma et xx en chiffre arabe spécifie le Sigma sur un chromosome donné. Par exemple, la séquence obtenue provient du SIGMA VIII.I.  In the following description, each identified Sigma element is designated by SigmaXXX.xx, where XXX in Roman numeral specifies the number of the chromosome carrying the Sigma and xx in Arabic numeral specifies the Sigma on a given chromosome. For example, the sequence obtained comes from SIGMA VIII.I.
En comparant la séquence de ce SIGMA VIII.I avec celles des différents Sigma clones aléatoirement par Sandmeyer (1 1 ), on observe une correspondance avec le clone n° 7 de Sandmeyer. On constate en outre que SIGMAVIII.I présente 9 singularités de séquence par rapport à la séquence majoritairement obtenue par Sandmeyer (ces singularités de séquence sont signalées par l'indication sous la séquence des bases correspondantes de Sandmeyer - figure 3). Cette divergence représente 9 nucléotides sur 341 , soit 2,6%.  By comparing the sequence of this SIGMA VIII.I with those of the various Sigma clones randomly by Sandmeyer (11), a correspondence with clone No. 7 of Sandmeyer is observed. We also note that SIGMAVIII.I has 9 sequence singularities compared to the sequence mainly obtained by Sandmeyer (these sequence singularities are indicated by the indication under the sequence of the corresponding Sandmeyer bases - Figure 3). This divergence represents 9 nucleotides out of 341, or 2.6%.
EXEMPLE 2 EXAMPLE 2
Caractérisation du contenu en séquences Sigma du génome de Saccharomyces cerevisiae  Characterization of the content in Sigma sequences of the genome of Saccharomyces cerevisiae
On étudie les souches de Saccharomyces cerevisiae OL1, MGD131 102A utilisées ultérieurement comme réceptrices de transformation. The strains of Saccharomyces cerevisiae OL1, MGD131 102A, which are used later as transformation receptors, are studied.
Ces souches présentent les génotypes suivants :  These strains have the following genotypes:
OL1 : Matα , his3-(11,15), leu2-(3,1 12), ura3-(257,373), gal2. OL1: Matα, his3- (11.15), leu2- (3.112), ura3- (257.373), gal2.
MGD131 102 A : Mat a, his3-1, ade2, arg4- Δ 2060, ura3-52, trp1-289. L'analyse de ces souches est effectuée en séparant les chromosomes par electrophorese en champs puisés (CHEF DR II, Bio-Rad), puis les chromosomes une fois séparés sont transférés sur membrane de nylon Hybond N+ (Amersham). Le filtre obtenu est hybride à l'aide du fragment ClaI-HindIII provenant du plasmide pBK605 et marqué au 32 P par "RandomMGD131 102 A: Mat a, his3-1, ade2, arg4- Δ 2060, ura3-52, trp1-289. The analysis of these strains is carried out by separating the chromosomes by electrophoresis in pulsed fields (CHEF DR II, Bio-Rad), then the chromosomes once separated are transferred to a Hybond N + nylon membrane (Amersham). The filter obtained is hybridized using the ClaI-HindIII fragment originating from the plasmid pBK605 and labeled with 32 P by "Random
Primming". Ce fragment porte uniquement les séquences SIGMAVIII.IPrimming ". This fragment only carries the SIGMAVIII.I sequences
(figure 6). La construction du plasmide pBK605 est décrite de façon détaillée à l'exemple 3. (figure 6). The construction of the plasmid pBK605 is described in detail in Example 3.
On constate sur les autoradiographies présentées à la figure 4 que dans la souche OL1 comme dans la souche MGD 131 102A, les trois chromosomes VI, X et XIII sont dépourvus d'éléments Sigma, que les chromosomes I, III, IX, XI et II semblent ne porter qu'un élément, et que les autres chromosomes en portent plusieurs. On constate que le chromosome It is noted on the autoradiographies presented in FIG. 4 that in the strain OL1 as in the strain MGD 131 102A, the three chromosomes VI, X and XIII are devoid of Sigma elements, that chromosomes I, III, IX, XI and II appear to carry only one element, and the other chromosomes carry several. We see that the chromosome
VIII, à partir duquel VIII.I a été isolé, semble porter plusieurs éléments. VIII, from which VIII.I was isolated, seems to carry several elements.
On constate que dans la souche de S. cerevisiae YNN295 (BioRad), utilisée comme marqueur de migration chromosomique, le contenu en Sigma diffère de celui obtenu avec les souches OL1 et MGD131 102A. Le résultat peut varier d'une souche à l'autre tant pour les chromosomes qui portent des Sigma que pour le nombre de Sigma présents par chromosome.  It is noted that in the strain of S. cerevisiae YNN295 (BioRad), used as a marker for chromosomal migration, the content in Sigma differs from that obtained with the strains OL1 and MGD131 102A. The result can vary from one strain to another both for the chromosomes which carry Sigma as for the number of Sigma present by chromosome.
Enfin, le résultat obtenu montre que le SIGMAVIII.I choisi permet d'hybrider un nombre d'éléments estimés à une trentaine par génome haploïde. Il devrait donc permettre de diriger l'intégration d'une séquence d'intérêt dans les autres Solo Sigma.  Finally, the result obtained shows that the SIGMAVIII.I chosen makes it possible to hybridize a number of elements estimated at around thirty per haploid genome. It should therefore make it possible to direct the integration of a sequence of interest in the other Solo Sigma.
EXEMPLE 3 EXAMPLE 3
Construction des vecteurs intégratifs pBK610 et pBK614  Construction of the integrative vectors pBK610 and pBK614
1 - MUTAGENES DIRIGES DU SIGMAVIII.1 1 - SIGMAVIII.1 DIRECTED MUTAGENES
La première mutagénèse consiste à introduire de part et d'autre des séquences répétées inversées qui bordent l'élément SIGMAVIII.I des sites de restriction permettant le clonage précis de cet élément à l'exclusion de toute autre séquence chromosomique.  The first mutagenesis consists in introducing on each side of the inverted repeat sequences which border the element SIGMAVIII.I restriction sites allowing the precise cloning of this element to the exclusion of any other chromosomal sequence.
Pour ce faire, on effectue l'amplification des séquences de To do this, amplification of the sequences of
SIGMAVIII.I par P.C.R. (Polymerase Chain Reaction) en utilisant les oligonucléotides amorce mutagènes A et B détaillés à la figure 5. La construction initiale utilisée pour cette mutagénèse est le plasmide pBL6 porteur du fragment chromosomique BglII-EcoRI de 2,1 kb contenant leSIGMAVIII.I by P.C.R. (Polymerase Chain Reaction) using the mutagenic primer oligonucleotides A and B detailed in FIG. 5. The initial construction used for this mutagenesis is the plasmid pBL6 carrying the 2.1 kb chromosomal fragment BglII-EcoRI containing the
SIGMAVIII.I. L'amplification conduit à la synthèse du fragment d'ADN compris entre les deux oligonucléotides amorce utilisés. L'incorporation physique des oligonucléotides A et B lors de cette synthèse conduit à la création de sites SpeI, EagI, C laI directement en 5' des séquences Sigma et de sites HindIII, Sal I et XbaI directement en 3' desdites séquences. SIGMAVIII.I. The amplification leads to the synthesis of the DNA fragment comprised between the two primer oligonucleotides used. The physical incorporation of oligonucleotides A and B during this synthesis leads to the creation of SpeI, EagI, C laI sites directly in 5 'of the Sigma sequences and of HindIII, Sal I and XbaI sites directly in 3' of said sequences.
Le mélange réactionnei ( 100μl) pour la réaction PCR comprend : The reaction mixture (100 μl) for the PCR reaction comprises:
- 53 μl d'eau désionisée et stérile - 53 μl of deionized and sterile water
- 10 μl de tampon 10x : 0,5M KCL  - 10 μl of 10x buffer: 0.5M KCL
0,1M Tns-C l pH8,3  0.1M Tns-C l pH8.3
15 mM MgC(2) 15 mM MgC (2)
0,1 % (m/v) gélatine  0.1% (m / v) gelatin
- 16 μl des quatre dNTPs (1,25 mM de chaque)  - 16 μl of the four dNTPs (1.25 mM each)
- 5 μl de l'oligonucléotide A (20 μM)  - 5 μl of oligonucleotide A (20 μM)
- 5 μl de l'oligonucléotide B (20 μM)  - 5 μl of oligonucleotide B (20 μM)
- 10 μl du plasmide pBL6 (50 ng) - 10 μl of the plasmid pBL6 (50 ng)
Le mélange est incubé à 100°C pendant 3 minutes, puis refroidi dans la glace. On ajoute ensuite 1 μl (5 U) de l'ADN Taq polymérase thermostable au mélange. Celui-ci est ensuite recouvert de 200 μl d'huile minérale.  The mixture is incubated at 100 ° C for 3 minutes, then cooled in ice. Then 1 μl (5 U) of the DNA Taq polymerase thermostable is added to the mixture. This is then covered with 200 μl of mineral oil.
On effectue la réaction d'amplification dans un Cycleur thermique à The amplification reaction is carried out in a thermal cycler at
ADN de Perkin Elmer Cetus pendant 25 cycles, un cycle comprenant :Perkin Elmer Cetus DNA for 25 cycles, one cycle including:
- une étape de dénaturation de l'ADN pendant 2 minutes à 94°C- a DNA denaturation step for 2 minutes at 94 ° C
- une étape d'hybridation pendant 2 minutes à 37°C - a hybridization step for 2 minutes at 37 ° C
- une étape de polymérisation pendant 2 minutes à 72°C.  - a polymerization step for 2 minutes at 72 ° C.
Après 25 cycles, on effectue une étape de polymérisation de 20 minutes à 72°C afin de terminer les synthèses interrompues.  After 25 cycles, a 20-minute polymerization step is carried out at 72 ° C. in order to complete the interrupted syntheses.
On sépare une partie du produit de l'amplification (20 μl) par électrophorèse en gel d'agarose. Le fragment d'ADN de 350 bp obtenu est ensuite purifié par adsorption sur billes de verre, repris en TE et restreint par les enzymes SpeI et SalI.  Part of the amplification product (20 μl) is separated by agarose gel electrophoresis. The 350 bp DNA fragment obtained is then purified by adsorption on glass beads, taken up in TE and restricted by the enzymes SpeI and SalI.
Ce fragment restreint est ensuite clone dans un vecteur M1 3mp18 ouvert par les enzymes XbaI et Sal I pour donner le plasmide pBK605 (v oir figure 6). La seconde mutagénèse entreprise a pour but de créer des sites de restriction au centre de l'élément Sigma de façon à permettre le clonage de séquences d'intérêt à cette position. This restricted fragment is then cloned into a vector M1 3mp18 opened by the enzymes XbaI and Sal I to give the plasmid pBK605 (see FIG. 6). The second mutagenesis undertaken aims to create restriction sites at the center of the Sigma element so as to allow the cloning of sequences of interest at this position.
Pour ce faire, on effectue deux amplifications P.C.R. indépendamment à partir du plasmide pBK605 (figure 6).  To do this, two P.C.R. independently from plasmid pBK605 (Figure 6).
La première de ces amplifications comporte un oligonucléotide mutagène SigB central à l'élément Sigma et un oligonucléotide non mutagène REV situé dans le vecteur en amont du Sigma.  The first of these amplifications comprises a mutagenic oligonucleotide SigB central to the element Sigma and a non-mutagenic oligonucleotide REV located in the vector upstream of the Sigma.
La seconde amplification est réalisée avec l'oligonucléotide mutagène SigA complémentaire de SigB et un oligonucléotide non mutagène UN situé dans le vecteur en aval du Sigma.  The second amplification is carried out with the mutagenic oligonucleotide SigA complementary to SigB and a non-mutagenic oligonucleotide UN located in the vector downstream of the Sigma.
La structure des oligonucléotides SigA et SigB est donnée à la figure 6.  The structure of the oligonucleotides SigA and SigB is given in FIG. 6.
De la sorte, les deux moitiés de l'élément Sigma sont synthétisées avec pour chacune d'elles deux nouveaux sites : BalI ou EaeI et StuI.  In this way, the two halves of the Sigma element are synthesized with for each of them two new sites: BalI or EaeI and StuI.
Les produits de ces deux synthèses sont purifiés sur gel d'agarose. Le fragment d'ADN obtenu lors de la première amplification est restreint par les enzymes SmaI et StuI puis clone dans un Bluescript Ks+ ouvert par l'enzyme SmaI pour donner le plasmide pBK609 (figure 7). The products of these two syntheses are purified on agarose gel. The DNA fragment obtained during the first amplification is restricted by the enzymes SmaI and StuI then cloned into a Bluescript Ks + opened by the enzyme SmaI to give the plasmid pBK609 (FIG. 7).
Le fragment d'ADN obtenu lors de la seconde amplification est restreint par les enzymes SalI et StuI. Ce fragment est ensuite cloné dans le plasmide pBK609 d'abord ouvert par l'enzyme HindIII et traité par la Polymérase I fragment de Klenow, puis restreint par l'enzyme SalI.  The DNA fragment obtained during the second amplification is restricted by the enzymes SalI and StuI. This fragment is then cloned into the plasmid pBK609 first opened by the enzyme HindIII and treated with Polymerase I fragment from Klenow, then restricted by the enzyme SalI.
Le plasmide résultant, pBK610 est présenté à la figure 7.  The resulting plasmid, pBK610 is shown in Figure 7.
Le fragment de restriction ClaI-ClaI obtenu du plasmide pBK610 est introduit au site ClaI d'un plasmide dérivé du Bluescript KS+ dépourvu des sites SmaI, PstI, EcoRI et EcoRV. The ClaI-ClaI restriction fragment obtained from the plasmid pBK610 is introduced into the ClaI site of a plasmid derived from Bluescript KS + lacking the SmaI, PstI, EcoRI and EcoRV sites.
Le plasmide pBK614 ainsi obtenu est présenté à la figure 7. Dans ce dernier plasmide, les duplications des sites BamHI et EagI sont supprimées, et l'élément Sigma est maintenant directement encadré de sites HindIII et ClaI.  The plasmid pBK614 thus obtained is presented in FIG. 7. In this latter plasmid, the duplications of the BamHI and EagI sites are deleted, and the Sigma element is now directly framed by HindIII and ClaI sites.
Le fragment ClaI - HindIII du plasmide pBK610 a été séquence et la séquence est présentée en figure 8. L'analyse de cette séquence montre que l'élément Sigma muté est maintenant directement bordé de sites de restriction et qu'il possède en son milieu quatre sites uniques : The ClaI - HindIII fragment of the plasmid pBK610 has been sequenced and the sequence is presented in FIG. 8. Analysis of this sequence shows that the mutated Sigma element is now directly bordered by restriction sites and that it has four unique sites in its middle:
BalI ou EaeI, PstI, EcoRI et EcoRV.  BalI or EaeI, PstI, EcoRI and EcoRV.
Il faut noter que les 38 nucléotides porteurs de ces sites de restriction, soit la séquence :  It should be noted that the 38 nucleotides carrying these restriction sites, ie the sequence:
CCAAAGAGGGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTCCT  CCAAAGAGGGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTCCT
sont introduits en lieu et place des 12 nucléotides centraux TGGAAGCGGA du SIGMAVIII.I. are introduced in place of the 12 central nucleotides TGGAAGCGGA of SIGMAVIII.I.
Ces nucléotides hétérologues sont représentés en italiques dans la figure 8.  These heterologous nucleotides are shown in italics in Figure 8.
L'élément Sigma muté résultant est appelé SIGMAVIII.I *.  The resulting mutated Sigma element is called SIGMAVIII.I *.
EXEMPLE 4 EXAMPLE 4
Construction d'un vecteur intégratif contenant le gène URA3 de S. cerevisiae Construction of an integrative vector containing the URA3 gene of S. cerevisiae
L'ADN du fragment de restriction EcoRI-NslI (1,1 kb) contenant le gène URA3 (13) est purifié et introduit dans le plasmide pBK614 ouvert par les enzymes EcoRI et PstI. The DNA of the EcoRI-NslI restriction fragment (1.1 kb) containing the URA3 gene (13) is purified and introduced into the plasmid pBK614 opened by the enzymes EcoRI and PstI.
Le plasmide pBK617 résultant est présenté à la figure 9.  The resulting plasmid pBK617 is presented in FIG. 9.
EXEMPLE 5 EXAMPLE 5
Construction de vecteurs intégratifs contenant le gène ARG4 de S. cerevisiae  Construction of integrative vectors containing the ARG4 gene of S. cerevisiae
L'ADN du fragment HpaI-HpaI de 2060 pb du génome de S. cerevisiae contenant l'unité transcriptionnelle ARG4 (figure 2) est clone au site SmaI du polylinker des plasmides pUC18 et pUC19. Les fragments EcoRI-PstI (2,1 kb) des plasmides résultant de ces clonages sont purifiés et insérés dans les plasmides pBK610 et pBK614 ouverts par les enzymes EcoRI et PstI. Les plasmides pBK61 1, pBK615 et pBK616 résultants de ces constructions sont présentés à la figure 10. EXEMPLE 6 The DNA of the 2060 bp HpaI-HpaI fragment of the genome of S. cerevisiae containing the transcriptional unit ARG4 (FIG. 2) is cloned at the SmaI site of the polylinker of the plasmids pUC18 and pUC19. The EcoRI-PstI fragments (2.1 kb) of the plasmids resulting from these cloning are purified and inserted into the plasmids pBK610 and pBK614 opened by the enzymes EcoRI and PstI. The plasmids pBK61 1, pBK615 and pBK616 resulting from these constructions are presented in FIG. 10. EXAMPLE 6
Construction de vecteurs integratifs contenant les gènes mutés arg4-EcoRV et arg4-BgIII de S. cerevisiae L'ADN du fragment de restriction HpaI-HpaI de 2060 paires de bases contenant le gène ARG4 muté soit arg4-EcoRV, soit arg4-BgIII (Nicolas et al. 1989), purifié respectivement des plasmides pNPS308 et pMY232 est clone au site EcoRV du plasmide pBK614. Les plasmides pBK620 et pBK623 résultants de ces constructions sont présentés dans la figure 11. Ces cassettes sont appelées Sigma::arg4 car elles contiennent des formes mutées du gène ARG4.  Construction of integrative vectors containing the mutated arg4-EcoRV and arg4-BgIII genes of S. cerevisiae The DNA of the restriction fragment HpaI-HpaI of 2060 base pairs containing the mutated ARG4 gene either arg4-EcoRV or arg4-BgIII (Nicolas et al. 1989), respectively purified from plasmids pNPS308 and pMY232 is cloned at the EcoRV site of the plasmid pBK614. The plasmids pBK620 and pBK623 resulting from these constructions are presented in FIG. 11. These cassettes are called Sigma :: arg4 because they contain mutated forms of the ARG4 gene.
EXEMPLE 7 EXAMPLE 7
Transformation de la souche OL1 par le fragment Sigma::URA3  Transformation of the OL1 strain by the Sigma :: URA3 fragment
(SIGMA VIII.I* interrompu par le gène URA3)  (SIGMA VIII.I * interrupted by the URA3 gene)
La souche réceptrice OL1, porteuse de la mutation ura3-(257,373) est transformée par électroporation (Bio-Rad GenePulser) avec le fragmentThe OL1 receptor strain, carrying the ura3- (257,373) mutation is transformed by electroporation (Bio-Rad GenePulser) with the fragment
HindIII-HindIII de 1,4 kb (Sigma::URA3), purifié d'un gel d'agarose après la digestion du plasmide pBK617. 1.4 kb HindIII-HindIII (Sigma :: URA3), purified from an agarose gel after digestion of the plasmid pBK617.
Pour ce faire, 80 ml d'une culture en YPD parvenue à 2×107 cellules/ml sont centrifugés 5 minutes à 3500 tpm. Le culot cellulaire est repris en 8 ml de Dithiothréitol 25 mM. To do this, 80 ml of a YPD culture which reaches 2 × 10 7 cells / ml are centrifuged for 5 minutes at 3500 rpm. The cell pellet is taken up in 8 ml of 25 mM Dithiothreitol.
Les cellules sont gardées à température ambiante 20 à 25 minutes puis recentrifugées.  The cells are kept at room temperature for 20 to 25 minutes then recentrifuged.
Le culot est repris en 800 μl (soit 109 cellules/ml) en tampon d'éiectroporation : The pellet is taken up in 800 μl (i.e. 10 9 cells / ml) in electroporation buffer:
- Sucrose 270 m M  - Sucrose 270 m M
- Tris-Cl 10 mM pH8  - Tris-Cl 10 mM pH8
- MgCl2 0,1 mM - MgCl 2 0.1 mM
Dans une cuvette d'électroporation de 2 mm on place :  In a 2 mm electroporation cuvette:
- 100 μl de cellules (108 cellules) - 100 μl of cells (10 8 cells)
- 10 μl du fragment purifié (de 100 à 500 ng)  - 10 μl of the purified fragment (from 100 to 500 ng)
- 1 μl d'ADN entraîneur (10 μg d'ADN de thymus de veau soniqué). La cuvette est placée dans la chambre d'électroporation et est soumise à une décharge électrique selon les conditions : - 1 μl of trainer DNA (10 μg of sonicated calf thymus DNA). The cuvette is placed in the electroporation chamber and is subjected to an electric discharge according to the conditions:
- voltage 450 V/cm  - voltage 450 V / cm
- capacitance 250 μF  - capacitance 250 μF
- dérivation 200Ω. - 200Ω bypass.
On ajoute immédiatement après le choc 400 μl d'eau stérile à température ambiante dans la cuvette afin de refroidir le mélange. De 100 à 500 μl du mélange sont ensuite étalés sur milieu sélectif et les cellules sont laissées 48 H à 30°C.  400 μl of sterile water at room temperature are added immediately after the shock to the bowl in order to cool the mixture. From 100 to 500 μl of the mixture are then spread on selective medium and the cells are left for 48 hours at 30 ° C.
De la sorte, de 300 à 600 transformants URA+ sont obtenus par microgramme de fragment linéaire sur milieu sélectif sans uracile. In this way, 300 to 600 URA + transformants are obtained per microgram of linear fragment on selective medium without uracil.
L'analyse de 9 transformants URA3+ (désignés ORT 786.1 à 786.9) choisis au hasard, est réalisée par séparation de chromosomes, transfert et hybridation du filtre obtenu à l'aide d'une sonde spécifique constituée du fragment HindIII- HindIII du gène URA3 (13). The analysis of 9 URA3 + transformants (designated ORT 786.1 to 786.9) chosen at random is carried out by separation of chromosomes, transfer and hybridization of the filter obtained using a specific probe consisting of the HindIII- HindIII fragment of the URA3 gene (13).
Le résultat de cette hybridation est présentée sur la figure 12. On constate que sur cette autoradiographie tous les transformants analysés présentent un signal au niveau du chromosome V, porteur des séquences mutantes ura3-(257,373), comme cela est observé pour la souche réceptrice OL1. D'autre part, les transformants ORT786.1, .2, .4, .6, .8 et .9 portent une copie additionnelle de la séquence URA3 dispersée respectivement aux chromosomes XV ou VII, XIV, II, IX, XV ou VII. Pour les transformants ORT786.3, .5, .7 aucune bande additionnelle n'est visible. Ceci peut s'expliquer soit par une conversion génique de l'allèle mutant ura3-(257,373) vers la forme sauvage, soit par l'intégration d'une copie additionnelle de la séquence URA3 au chromosome V ou VIII.  The result of this hybridization is presented in FIG. 12. It can be seen that on this autoradiography all the transformants analyzed present a signal at the level of chromosome V, carrying the mutant sequences ura3- (257,373), as is observed for the receptor strain OL1 . On the other hand, the transformants ORT786.1, .2, .4, .6, .8 and .9 carry an additional copy of the URA3 sequence dispersed respectively to chromosomes XV or VII, XIV, II, IX, XV or VII . For transformants ORT786.3, .5, .7 no additional band is visible. This can be explained either by a gene conversion from the mutant ura3- (257,373) allele to the wild form, or by the integration of an additional copy of the URA3 sequence into chromosome V or VIII.
EXEMPLE 8 EXAMPLE 8
Transformation de la souche MGD131 102A par le fragment Sigma::URA3 (Sigma VIII.I* interrompu par le gène URA3).  Transformation of the strain MGD131 102A by the fragment Sigma :: URA3 (Sigma VIII.I * interrupted by the URA3 gene).
Afin de pouvoir généraliser les résultats décrits précédemments, l'étude a été poursuivie dans une autre souche modèle MGD1 31 102A. Cette souche, présentant la mutation ura3-52, a été transformée comme précédemment par électroporation à l'aide du fragment purifiéIn order to be able to generalize the results described above, the study was continued in another strain, MGD1 31 102A. This strain, presenting the mutation ura3-52, was transformed as previously by electroporation using the purified fragment
HindIII- HindIII de 1,4 kb (Sigma::URA3) issu de la restriction du plasmide pBK617. Les transformants URA+ obtenus (de 150 à 350 par μg d'ADN) sont sélectionnés sur milieu sans uracile. 1.4 kb HindIII- HindIII (Sigma :: URA3) derived from the restriction of the plasmid pBK617. The URA + transformants obtained (from 150 to 350 per μg of DNA) are selected on a medium without uracil.
L'analyse de 10 transformants URA+ (désignés par ORT731 à ORT740), choisis au hasard, est réalisée par séparation de chromosomes, transfert et hybridation du filtre obtenu à l'aide d'une sonde spécifique URA3 (figure 13). The analysis of 10 URA + transformants (designated by ORT731 to ORT740), chosen at random, is carried out by separation of chromosomes, transfer and hybridization of the filter obtained using a specific URA3 probe (Figure 13).
On observe l'intégration d'une copie additionnelle URA3 dans tous les transformants analysés et ceci à différents chromosomes selon les transformants, soit au chromosome VIII pour ORT733, 736 et 738, soit au chromosome XVI pour ORT735, soit au chromosome XV pour ORT732, 736, 737 et 739 et soit au chromosome XII pour ORT734.  We observe the integration of an additional copy URA3 in all the transformants analyzed and this at different chromosomes depending on the transformants, either on chromosome VIII for ORT733, 736 and 738, or on chromosome XVI for ORT735, or on chromosome XV for ORT732, 736, 737 and 739 and either on chromosome XII for ORT734.
Dans chaque transformant on révèle en plus la copie du gène muté ura3-52 située au chromosome V.  In each transformant, the copy of the mutated ura3-52 gene located on chromosome V is also revealed.
Ce résultat montre que le système utilisé "un gène dans un élément Sigma" permet de disperser une séquence d'intérêt dans le génome d'une deuxième souche et démontre que l'invention est potentiellement utilisable dans toute souche porteuse d'éléments Solo Sigma répétés et dispersés.  This result shows that the system used "a gene in a Sigma element" makes it possible to disperse a sequence of interest in the genome of a second strain and demonstrates that the invention is potentially usable in any strain carrying repeated Solo Sigma elements. and scattered.
EXEMPLE 9 EXAMPLE 9
Transformations de la souche MGD131 102A par le fragment Sigma::ARG4  Transformations of strain MGD131 102A by the Sigma :: ARG4 fragment
(SigmaVIII.I* interrompu par le gène ARG4) Afin de généraliser l'utilisation de l'invention de la cassette d'intégration multisite à une autre séquence d'intérêt, la souche réceptrice MGD131 102A porteuse de la mutation arg4-Δ2060 est transformée comme précédemment par électroporation à l'aide du fragment de restriction Smal-HindIII de 2,5 kb (Sigma::ARG4) provenant de la digestion du plasmide pBK611, voir figure 10.  (SigmaVIII.I * interrupted by the ARG4 gene) In order to generalize the use of the invention of the multisite integration cassette to another sequence of interest, the receptor strain MGD131 102A carrying the arg4-Δ2060 mutation is transformed as before by electroporation using the 2.5 kb Smal-HindIII restriction fragment (Sigma :: ARG4) originating from the digestion of the plasmid pBK611, see FIG. 10.
De 150 à 1 200 transformants par μg de fragment sont obtenus sur milieu sélectif sans arginine. L'analyse de 10 transformants ARG+ (désignés par ORT720 à ORT729), choisis au hasard, est réalisée par séparation de chromosomes, transfert et hybridation du filtre obtenu à l'aide d'une sonde spécifique ARG4. From 150 to 1,200 transformants per μg of fragment are obtained on a selective medium without arginine. The analysis of 10 ARG + transformants (designated by ORT720 to ORT729), chosen at random, is carried out by separation of chromosomes, transfer and hybridization of the filter obtained using a specific ARG4 probe.
La sonde utilisée est le fragment HpaI-HpaI de 2060 pb qui contient l'unité transcriptionnelle ARG4 (figure 2) et qui correspond exactement à la délétion 2060 de la souche réceptrice. De la sorte, ne sont révélées par hybridation que les copies du gène introduites lors de la transformation.  The probe used is the HpaI-HpaI fragment of 2060 bp which contains the transcriptional unit ARG4 (FIG. 2) and which corresponds exactly to the deletion 2060 of the receptor strain. In this way, only the copies of the gene introduced during the transformation are revealed by hybridization.
Le résultat de cette hybridation est présenté à la figure 14. The result of this hybridization is presented in Figure 14.
Sur cette autoradiographie on constate plusieurs faits : On this autoradiography we note several facts:
- le gène ARG4 est présent sur différents chromosomes selon les transformants (IX pour ORT720; VIII pour ORT721, 724 et 728; II pour ORT722, 723 et 730; XV ou VII pour ORT725; XII ou IV pour ORT726 et 729).  - the ARG4 gene is present on different chromosomes depending on the transformants (IX for ORT720; VIII for ORT721, 724 and 728; II for ORT722, 723 and 730; XV or VII for ORT725; XII or IV for ORT726 and 729).
- l'intensité du signal d'hybridation obtenu est variable : plus importante pour ORT722 et 723, faible pour ORT729 bien que ce transformant soit phénotypiquement ARG+. - The intensity of the hybridization signal obtained is variable: higher for ORT722 and 723, lower for ORT729 although this transformant is phenotypically ARG + .
Afin de préciser la structure et le nombre de copies intégrées du fragment Sιgma::ARG4, l'ADN total des transformants ORT720, 722 et 724 est extrait et analysé par Southern par une simple restriction ClaI, BglII et BamHI et par une double restriction XhoI+NdeI (figure 15).  In order to specify the structure and the number of integrated copies of the Sιgma :: ARG4 fragment, the total DNA of the transformants ORT720, 722 and 724 is extracted and analyzed by Southern by a simple restriction ClaI, BglII and BamHI and by a double restriction XhoI + NdeI (figure 15).
La sonde utilisée est le fragment HpaI-HpaI de 2060 pb, spécifique du gène ARG4.  The probe used is the HpaI-HpaI fragment of 2060 bp, specific for the ARG4 gene.
Tous les transformants analysés présentent une bande unique All transformants analyzed present a single band
XhoI-NdeI de 2,45 kb, comme attendu par la digestion XhoI-NdeI du plasmide pBK61 1. XhoI-NdeI of 2.45 kb, as expected by the XhoI-NdeI digestion of the plasmid pBK61 1.
L'analyse des résultats obtenus pour ORT724 (deux bande de 2,35 et 2,75kb avec BglII et une bande de 4,45 kb avec BamHI) sont compatibles avec l'existence d'une intégration en copie unique du gène ARG4 dans le Sigma VIII.I de départ (voir la carte de restriction de cette région figure 2). Les profils de restriction BglII et BamHI des transformants ORT720 et 722 similaires à celui de ORT724 tendent à montrer qu'une intégration en copie unique du gène ARG4 s'est produite dans ces transformants. Les résultats obtenus montrent que le système utilisé "un gène dans un élément Sigma" permet de disperser dans le génome un second type de séquence d'intérêt. The analysis of the results obtained for ORT724 (two bands of 2.35 and 2.75 kb with BglII and a band of 4.45 kb with BamHI) are compatible with the existence of a single copy integration of the ARG4 gene in the Starting Sigma VIII.I (see the restriction map for this region in Figure 2). The BglII and BamHI restriction profiles of the transformants ORT720 and 722 similar to that of ORT724 tend to show that a single copy integration of the ARG4 gene has occurred in these transformants. The results obtained show that the system used "a gene in a Sigma element" makes it possible to disperse in the genome a second type of sequence of interest.
Afin de déterminer précisément les modalités d'intégration de deux des transformants obtenus (ORT723 et ORT724), l'ADN bordant chaque insertion du côté du site XhoI est amplifié par une méthode dite "inverse P.C.R.", puis le fragment amplifié obtenu est séquence. L'obtention d'un fragment d'amplification unique pour ces deux transformants suggère l'intégration d'une seule copie dans le génome.  In order to determine precisely the methods of integration of two of the transformants obtained (ORT723 and ORT724), the DNA bordering each insertion on the side of the XhoI site is amplified by a method called "reverse P.C.R.", then the amplified fragment obtained is sequenced. Obtaining a unique amplification fragment for these two transformants suggests the integration of a single copy into the genome.
La technique d'amplification et les séquences obtenues sont présentées à la figure 16.  The amplification technique and the sequences obtained are presented in FIG. 16.
Pour ORT724, dont le fragment Sigma::ARG4 est intégré au chromosome VIII, la séquence lue révèle que :  For ORT724, of which the Sigma :: ARG4 fragment is integrated into chromosome VIII, the sequence read reveals that:
- tous les nucléosides spécifiques du SIGMA VIII.I de la position 347 à la position 258 sont retrouvés.  - all the nucleosides specific to SIGMA VIII.I from position 347 to position 258 are found.
- tous les nucléotides hétérologues localisés en 5' du site XhoI initialement présents dans le fragment SmaI-HindIII sont délétés, en particulier la séquence correspondant au site de restriction ClaI (figure 16).  all the heterologous nucleotides located 5 ′ from the XhoI site initially present in the SmaI-HindIII fragment are deleted, in particular the sequence corresponding to the ClaI restriction site (FIG. 16).
De plus, les 180 pb adjacentes à l'élément Sigma::ARG4 intégré correspondent exactement à celles initialement décrites pour la région flanquante du SIGMA VIII.I de la position 77 à la position 257. Ces 180 pb couvrent le tARN Ala associé au SIGMAVIII.I (figure 3).  In addition, the 180 bp adjacent to the integrated Sigma :: ARG4 element correspond exactly to those initially described for the flanking region of SIGMA VIII.I from position 77 to position 257. These 180 bp cover the Ala tRNA associated with SIGMAVIII .I (Figure 3).
Ceci démontre que l'intégration du fragment Sigma::ARG4 s'est bien produit dans le transformant ORT724 par recombinaison homologue avec le SIGMA VII.I de départ.  This demonstrates that the integration of the Sigma :: ARG4 fragment has indeed occurred in the transformant ORT724 by homologous recombination with the starting SIGMA VII.I.
Pour le transformant ORT723, dont le fragment Sigma::ARG4 est intégré dans le chromosome II, la séquence montre que :  For the transformant ORT723, of which the Sigma :: ARG4 fragment is integrated into chromosome II, the sequence shows that:
- les nucléotides spécifiques d'un Sigma sont retrouvés jusqu'à l'extrémité de la séquence inversée répétée TGTTGTA. De même manière que précédemment, tous les nucléotides hétérologues qui bordent le fragment SmaI-HindIII utilisé pour la transformation sont délétés. Une nouvelle séquence chromosomique inconnue démarre au ras de la séquence Sιgma::ARG4 intégralement préservée. De plus, à 16 pb en 5' du Sιgma::ARG4 intégré, on observe une séquence correspondant à un ARNt Ala. - the specific nucleotides of a Sigma are found up to the end of the repeated reverse sequence TGTTGTA. As before, all the heterologous nucleotides which border the SmaI-HindIII fragment used for the transformation are deleted. A new unknown chromosomal sequence starts close to the fully preserved Sιgma :: ARG4 sequence. In addition, at 16 bp in 5 'from the integrated Sιgma :: ARG4, a sequence corresponding to an Ala tRNA is observed.
Enfin, la séquence spécifique du Sigma présente deux caractéristiques importantes :  Finally, the specific sequence of Sigma has two important characteristics:
- à la position 343 on trouve le nucléotide G qui singularise le SIGMAVIII.I (figure 3).  - at position 343 we find nucleotide G which singles out SIGMAVIII.I (Figure 3).
- aux positions 307 et 309, on trouve respectivement deux nucléotides A à la place des nucléotides C et G qui singularisent le SIGMAVIII.l, et qui étaient initialement présents dans la séquence du fragment SmaI-HindIII utilisé pour la transformation.  - At positions 307 and 309, there are respectively two nucleotides A in place of nucleotides C and G which singularize SIGMAVIII.l, and which were initially present in the sequence of the SmaI-HindIII fragment used for the transformation.
Ces résultats démontrent que dans le transformant ORT723 l'intégration du fragment Sigma::ARG4 s'est produite par recombinaison homologue dans un Sigma chromosomique préexistant, comme dans le cas précédent. De ce fait, pour ORT723, il est possible de préciser que la recombinaison s'est probablement effectuée entre les nucléotides 309 et 343 des éléments Sigma impliqués. EXEMPLE 10  These results demonstrate that in the transformant ORT723 the integration of the Sigma :: ARG4 fragment occurred by homologous recombination in a preexisting chromosomal Sigma, as in the previous case. Therefore, for ORT723, it is possible to specify that the recombination probably took place between nucleotides 309 and 343 of the Sigma elements involved. EXAMPLE 10
Transformation des souches MGD131 2C et MGD131 102A par le fragment Sigma::arg4-EcoRV. (SIGMA VIII.I interrompu par le gène arg4-EcoRV)  Transformation of strains MGD131 2C and MGD131 102A with the Sigma :: arg4-EcoRV fragment. (SIGMA VIII.I interrupted by the arg4-EcoRV gene)
Les souches réceptrices MGD131 2C et MGD 131 102A porteuses de la mutation arg4-ϋ2060 sont cotransformées par électroporation à l'aide du fragment de restriction HindIII-HindIII de 2.4 kilobases purifié du plasmide pBK620 et d'un microgramme d'un plasmide réplicatif de levure contenant un marqueur de sélection, soit le gène LEU2 pour transformer la souche MGD131 2C soit le gène HIS3 pour transformer la souche MGD 131 102 A. Les transformants sont sélectionnés sur milieu sélectif respectivement sans leucine ou sans histidine et analysés par un test de papillation mitotique en utilisant une souche testrice arg4-BgIII de signe sexuel compatible qui permet de cribler les cotransformants ayant intégré le fragment Sigma:: arg4-EcoRV (Nicolas et al. 1989). Le plasmide réplicatif (contenant le gène LEU2 ou HIS3) est ségrégé des cellules par croissance en milieu riche YPG contenant de la leucine ou de l'histidine. The receptor strains MGD131 2C and MGD 131 102A carrying the arg4-ϋ2060 mutation are cotransformed by electroporation using the restriction fragment HindIII-HindIII of 2.4 kilobases purified from the plasmid pBK620 and a microgram of a replicative plasmid of yeast containing a selection marker, either the LEU2 gene to transform the MGD131 2C strain or the HIS3 gene to transform the MGD 131 102 A strain. The transformants are selected on a selective medium respectively without leucine or histidine and analyzed by a mitotic papillation test using an arg4-BgIII compatible sex sign test strain which allows the screening of cotransformants having integrated the Sigma :: arg4-EcoRV fragment (Nicolas et al. 1989). The replicative plasmid (containing the LEU2 or HIS3 gene) is segregated from the cells by growth in rich YPG medium containing leucine or histidine.
L'analyse physique des transformants Sigma::arg4-EcoRV est réalisée comme dans l'EXEMPLE 9 par séparation des chromosomes, transfert sur membrane de nylon et hybridation avec une sonde contenant le gène ARG4. Les résultats présentés en figure 17, montrent l'intégration du gène arg4-EcoRV sur différents chromosomes selon les transformants (Chr. XVI pour ORT1304 obtenu avec la souche MGD 1312C ; Chr.IX pour ORT 1305 et Chr. XV ou VII pour ORT1306 obtenus à partir de la souche MGD 131 102A). Physical analysis of the Sigma :: arg4-EcoRV transformants is carried out as in EXAMPLE 9 by separation of the chromosomes, transfer to a nylon membrane and hybridization with a probe containing the ARG4 gene. The results presented in FIG. 17 show the integration of the arg4-EcoRV gene on different chromosomes according to the transformants (Chr. XVI for ORT1304 obtained with the strain MGD 1312C; Chr.IX for ORT 1305 and Chr. XV or VII for ORT1306 obtained from the strain MGD 131 102A).
Ces résultats montrent que le système utilisé "un gène inséré dans un élément Sigma" permet par cotransformation de disperser sans sélection une séquence d'intérêt dans le génôme. L'exemple montre l'intégration d'une séquence mutante d'un gène. These results show that the system used "a gene inserted into a Sigma element" allows by cotransformation to disperse without selection a sequence of interest in the genome. The example shows the integration of a mutant sequence of a gene.
EXEMPLE 11 EXAMPLE 11
Transformations séquentielles de la souche MGD131 102A a) par le fragment Sigma::ARG4 puis par le fragment Sιgma::URA3. Sequential transformations of the strain MGD131 102A a) by the Sigma :: ARG4 fragment then by the Sιgma :: URA3 fragment.
Les transformants ARG+ ura- ORT720 et ORT723 obtenus et caractérisés dans l'exemple 8 sont transformés par électroporation par l'ADN du fragment ClaI (Sigma::URA3) purifié après digestion du plasmide pBK617. The ARG + ura- ORT720 and ORT723 transformants obtained and characterized in Example 8 are transformed by electroporation with the DNA of the ClaI fragment (Sigma :: URA3) purified after digestion of the plasmid pBK617.
Les transformants URA+ obtenus sont sélectionnés sur milieu sans uracile. Ces transformants URA + ont gardé la faculté de croître sur milieu sans arginine. L'analyse de 5 surtransformants ARG4+ URA3+ (désignés parThe URA + transformants obtained are selected on a medium without uracil. These URA + transformants have retained the ability to grow on arginine-free medium. Analysis of 5 ARG4 + URA3 + transformers (designated by
ORT720.6, 720.7, 720.8 et ORT723.8, 723.9) choisis au hasard, est réalisée par séparation de chromosomes, transfert sur membrane de nylon et hybridation du filtre obtenu à l'aide des sondes spécifiques ARG4 et URA3ORT720.6, 720.7, 720.8 and ORT723.8, 723.9) chosen at random, is carried out by separation of chromosomes, transfer onto nylon membrane and hybridization of the filter obtained using specific probes ARG4 and URA3
(figure 18). (figure 18).
Les surtransformants ORT720.6, 720.7 et 720.8 portent au chromosome IX le gène ARG4 comme la souche ORT720 dont ils dérivent. D'autre part, ces surtransformants portent le gène URA3 respectivement au chromosome XII, VIII et IV.  The transformers ORT720.6, 720.7 and 720.8 carry the ARG4 gene on chromosome IX like the ORT720 strain from which they are derived. On the other hand, these over-transformers carry the URA3 gene respectively to chromosome XII, VIII and IV.
Par ailleurs, les surtransformants ORT723.8, 723.9 portent au chromosome II le gène ARG4 comme la souche ORT723 dont ils dérivent et le gène URA3, respectivement au chromosome VIII et XII. b) par le fragment Sigma::URA3 puis par le fragment Sigma::ARG4  Furthermore, the transformers ORT723.8, 723.9 carry on chromosome II the gene ARG4 as the strain ORT723 from which they derive and the gene URA3, respectively on chromosome VIII and XII. b) by the Sigma :: URA3 fragment then by the Sigma :: ARG4 fragment
De manière symétrique, le transformant URA+ arg- ORT740 obtenu et caractérisé à l'exemple 7 est transformé par électroporation avec l'ADN du fragment HindIII (Sigma::ARG4 de 2,4 kb) purifié après digestion du plasmide pBK615. Symmetrically, the transformant URA + arg- ORT740 obtained and characterized in Example 7 is transformed by electroporation with the DNA of the HindIII fragment (Sigma :: ARG4 of 2.4 kb) purified after digestion of the plasmid pBK615.
Les transformants ARG+ obtenus sont sélectionnés sur milieu sans arginine. Ces transformants ont conservé la faculté de croître sur milieu sans uracile. The ARG + transformants obtained are selected on an arginine-free medium. These transformants have retained the ability to grow in a medium without uracil.
L'analyse de 3 surtransformants URA+ ARG+ (désignés par ORT740.1 , 740.2, 740.3) choisis au hasard, est réalisée par séparation de chromosomes, transfert sur membrane de nylon et hybridation du filtre obtenu à l'aide des sondes spécifiques ARG4 et URA3 (figure 19). The analysis of 3 transformers URA + ARG + (designated by ORT740.1, 740.2, 740.3) chosen at random, is carried out by separation of chromosomes, transfer onto nylon membrane and hybridization of the filter obtained using specific probes ARG4 and URA3 (Figure 19).
On constate que ces trois surtransformants portent le gène URA3 au chromosome VIII comme la souche ORT740 dont ils dérivent et le gène ARG4 respectivement au chromosome IX, IV et XII.  It is found that these three transformers carry the URA3 gene on chromosome VIII like the ORT740 strain from which they derive and the ARG4 gene on chromosome IX, IV and XII respectively.
Il est donc possible de la sorte d'obtenir par le système d'intégration proposé selon l'invention la dispersion de différents types de séquences dans la même cellule, à des loci différents et variables. c) par les fragments Sigma::arg4. It is therefore possible in this way to obtain by the integration system proposed according to the invention the dispersion of different types of sequences in the same cell, at different and variable loci. c) by the Sigma :: arg4 fragments.
* Cl Transformation de la souche ORT1305 contenant une copie Sigma::arg4-EcoRV par le fragment Sigma::arg4-BgIII. * C1 Transformation of the strain ORT1305 containing a Sigma :: arg4-EcoRV copy with the Sigma :: arg4-BgIII fragment.
(Sigma VIII.I interrompu par le gène arg4-BgIII).  (Sigma VIII.I interrupted by the arg4-BgIII gene).
Afin de déterminer si une souche transformante obtenue par intégration d'une première cassette Sigma::arg4 pouvait être à nouveau transformée pour introduire une seconde cassette, le transformant primaire ORT1305 contenant une séquence Sigma::arg4-EcoRV intégrée au chromosome IX a été retransformé par un fragment Sigma::arg4-BgIII. La souche ORT 1305 de génotype Sιgma::arg4-EcoRV (chromosome IX), arg4 2060 (chromosome VIII), ura3-52, trpl, his3, ade2, Mata, a été cotransformée par le fragment Sigma::arg4-BgIII de 2,4 kb purifié après digestion du plasmide pBK623 par l'enzyme HindIII et le plasmide replicatif contenant le gène HIS3. In order to determine whether a transforming strain obtained by integration of a first Sigma :: arg4 cassette could be further transformed to introduce a second cassette, the primary transformant ORT1305 containing a Sigma :: arg4-EcoRV sequence integrated into chromosome IX has been retransformed with a Sigma :: arg4-BgIII fragment. The ORT 1305 strain of genome Sιgma :: arg4-EcoRV (chromosome IX), arg4 2060 (chromosome VIII), ura3-52, trpl, his3, ade2, Mata, was cotransformed by the Sigma :: arg4-BgIII fragment of 2 , 4 kb purified after digestion of the plasmid pBK623 with the enzyme HindIII and the replicative plasmid containing the HIS3 gene.
Les transformants HIS+ sont sélectionnés sur milieu sans histidine et analysés génétiquement par un test d'autopapiilation pour identifier les cellules ayant gardé l'information arg4-EcoRV et acquis le marqueur arg4-BgIII. Ces cellules qui sont toujours de phénotype arg- ont désormais la capacité de générer par recqmbinaison au cours de la croissance végétative des cellules prototrophes ARG+ qui se multiplient sur un milieu sans arginine. L'analyse de quelques transformants appelés ORT1320-X, choisis au hasard, est réalisée par séparation de chromosomes, transfert et hybridation du filtre obtenu à l'aide d'une sonde spécifique ARG4 (figureThe HIS + transformants are selected on histidine-free medium and genetically analyzed by a self-screening test to identify the cells that have kept the arg4-EcoRV information and acquired the arg4-BgIII marker. These cells, which are still of the arg- phenotype, now have the capacity to generate, by recombination, during the vegetative growth, ARG + prototrophic cells which multiply on an arginine-free medium. The analysis of a few transformants called ORT1320-X, chosen at random, is carried out by separation of chromosomes, transfer and hybridization of the filter obtained using a specific ARG4 probe (figure
20). Comme prévu, ces transformants présentent deux bandes d'hybridation, l'une au chromosome IX correspondant à la copie parentale arg4-EcoRV, l'autre dispersée sur les différents chromosomes correspondant à la copie nouvellement introduite (Chr. V, ORT1320-14; Chr. VIII, ORT1320-19, ORT1320-27 et ORT1320-33; Chr.XV/VII, ORT1320-30 et Chr.l, ORT1320- 34 pour les exemples de la figure 20). Ces résultats démontrent la possibilité d'intégrer séquentiellement deux cassettes Sιgma::arg4. Les cassettes Sιgma::arg4-EcoRV et Sigma::arg4 BgIII différent de 6 paires de bases (2 paires de bases au niveau de la mutation arg4-EcoRV et 4 paires de bases au niveau de la mutation arg4-BgIII) sur une longueur totale de 2400 nucléotides. Il est donc possible d'intégrer séquentiellement au moins deux copies d'un gène d'intérêt dans le génome de la levure par recombinaison homologue. 20). As expected, these transformants have two hybridization bands, one at chromosome IX corresponding to the parental copy arg4-EcoRV, the other dispersed on the different chromosomes corresponding to the newly introduced copy (Chr. V, ORT1320-14; Chr. VIII, ORT1320-19, ORT1320-27 and ORT1320-33; Chr.XV / VII, ORT1320-30 and Chr.l, ORT1320-34 for the examples in Figure 20). These results demonstrate the possibility of sequentially integrating two Sιgma :: arg4 cassettes. The Sιgma :: arg4-EcoRV and Sigma :: arg4 BgIII cassettes different from 6 base pairs (2 base pairs at the arg4-EcoRV mutation and 4 base pairs at the arg4-BgIII mutation) over one length total of 2400 nucleotides. It is therefore possible to sequentially integrate at least two copies of a gene of interest into the yeast genome by homologous recombination.
* C2- Transformation de la souche ORD1306-7D contenant deux copies Sigma::arg4-EcoRV par le fragment Sιgma::arg4-BgIII. * C2- Transformation of the strain ORD1306-7D containing two Sigma :: arg4-EcoRV copies with the Sιgma :: arg4-BgIII fragment.
(Sigma VIII.I* interrompu par le gène arg4-BgIII). (Sigma VIII.I * interrupted by the arg4-BgIII gene).
Le type d'expérience décrite ci-dessus (exemple 1 1 , Cl ) a été réalisé à partir d'une souche parentale ORD 1306-7D contenant deux copies Sιgma::arg4-EcoRV afin de déterminer s'il était possible d'introduire une troisième copie Sigma::arg4. The type of experiment described above (example 1 1, Cl) was carried out from a parental strain ORD 1306-7D containing two copies Sιgma :: arg4-EcoRV in order to determine if it was possible to introduce a third copy Sigma :: arg4.
La souche réceptrice ORD1306-7D de génotype Sigma::arg4-EcoRV (Chr.IX), Sιgma::arg4-RV (Chr.XVI), arg4- 2060, hιs3, ura3-52, trpl, Mata a été obtenue par sporulation du diploïde ORD 1306 issu du croisement des souches ORT1304 et ORT1305 décrites dans l'EXEMPLE 10. Ceci démontre la possibilité d'introduire plusieurs copies de la cassette Sigma::gène par croisement des transformants et réassortiment des chromosomes en méïose.  The receptor strain ORD1306-7D of genotype Sigma :: arg4-EcoRV (Chr.IX), Sιgma :: arg4-RV (Chr.XVI), arg4-2060, hιs3, ura3-52, trpl, Mata was obtained by sporulation of the diploid ORD 1306 from the crossing of the strains ORT1304 and ORT1305 described in EXAMPLE 10. This demonstrates the possibility of introducing several copies of the Sigma :: gene cassette by crossing transformants and reassorting chromosomes in meiosis.
La souche ORD1306-7D a été cotransformée avec le plasmide replicatif HIS+ et le fragment Sigma::arg4-BgIII purifié du plasmide pBK623 digéré par l'enzyme HindIII. Trois transformants HIS+ arg- mais autopapillant (ARG+) sur un milieu sans arginine ont été obtenus. L'analyse de ces trois transformants par séparation de chromosomes, transfert et hybridation à l'aide d'une sonde ARG4, révèle pour chacun d'eux (figure 21), la présence de trois bandes d'hybridation correspondant aux deux bandes parentales (Chr.IX et XVI) et à une nouvelle bande, différente suivant les transformants, qui démontre l'insertion dispersée d'une troisième copie de la cassette Sigma::arg4 (Chr. II, ORT1327-21;Chr. IV ou XII, ORT1327-23 et Chr.XV ou VII, ORT1327-27). Ces résultats démontrent que l'utilisation de la cassette Sιgma::gène permet l'intégration par recombinaison homologue de plusieurs copies d'un gène d'intérêt par transformations séquentielles. L'isolement de ce type d'intégrants est réalisé par simple criblage génétique ou moléculaire. The strain ORD1306-7D was cotransformed with the replicative plasmid HIS + and the fragment Sigma :: arg4-BgIII purified from the plasmid pBK623 digested with the enzyme HindIII. Three HIS + arg- but self-papering (ARG + ) transformants on an arginine-free medium were obtained. The analysis of these three transformants by separation of chromosomes, transfer and hybridization using an ARG4 probe, reveals for each of them (FIG. 21), the presence of three hybridization bands corresponding to the two parental bands ( Chr.IX and XVI) and to a new band, different depending on the transformants, which demonstrates the dispersed insertion of a third copy of the Sigma :: arg4 cassette (Chr. II, ORT1327-21; Chr. IV or XII, ORT1327-23 and Chr.XV or VII, ORT1327-27). These results demonstrate that the use of the Sιgma :: gene cassette allows the integration by homologous recombination of several copies of a gene of interest by sequential transformations. The isolation of this type of integrants is achieved by simple genetic or molecular screening.
EXEMPLE 12 EXAMPLE 12
Co-transformation de la souche de levure MGD131 102A par les fragments Co-transformation of the yeast strain MGD131 102A with the fragments
Sigma::ARG4 et Sigma::URA3 Sigma :: ARG4 and Sigma :: URA3
La souche MGD 131 102A arg4- Δ 2060 ura-52 est transformée par électroporation à l'aide d'un mélange d'ADN comportant :  The MGD 131 102A arg4- Δ 2060 ura-52 strain is transformed by electroporation using a DNA mixture comprising:
- le fragment HindIIl (Sigma::ARG4 de 2,4 Kb) purifié après digestion du plasmide pBK615  - the HindIIl fragment (Sigma :: ARG4 of 2.4 Kb) purified after digestion of the plasmid pBK615
- le fragment ClaI (Sigma::URA3 de 1,4 Kb) issu de la restriction du plasmide pBK617.  - the ClaI fragment (Sigma :: URA3, 1.4 Kb) resulting from the restriction of the plasmid pBK617.
Les transformants ARG sont sélectionnés sur milieu sans arginine et repiqués sur milieu sans uracile. De la sorte, on crible les co-transformants ARG transformants are selected on medium without arginine and subcultured on medium without uracil. In this way, we screen the co-transformants
ARG+ URA+. ARG + URA + .
On effectue l'analyse de co-transformants ARG URA+ (désignés parThe ARG URA + co-transformants are analyzed (designated by
ORT746, 747, 748, 749, 751, 752 et 753) par séparation de chromosomes, transfert sur membrane de nylon et hybridation du filtre obtenu à l'aide des sondes spécifiques URA3 et ARG4 (figure 22). ORT746, 747, 748, 749, 751, 752 and 753) by separation of chromosomes, transfer to nylon membrane and hybridization of the filter obtained using specific probes URA3 and ARG4 (Figure 22).
Il ressort de cette analyse que les gènes ARG4 et URA3 se retrouvent, dans chaque co-transformant, intégrés au même chromosome. It emerges from this analysis that the ARG4 and URA3 genes are found, in each co-transformant, integrated into the same chromosome.
Ce chromosome peut varier d'un co-transformant à l'autre. On trouve en effet les gènes ARG4 et URA3 au chromosome : This chromosome can vary from one co-transformant to another. The ARG4 and URA3 genes are found on the chromosome:
- XII pour ORT749  - XII for ORT749
- IV pour ORT747  - IV for ORT747
- XV ou VII pour ORT746, 748 et 753  - XV or VII for ORT746, 748 and 753
- II pour ORT751  - II for ORT751
_ XIV pour ORT752 BIBLIOGRAPHIE _ XIV for ORT752 BIBLIOGRAPHY
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LEGENDES RELATIVES AUX FIGURESLEGENDS RELATING TO FIGURES
Légende relative à la figure 1 Figure 1 legend
LTR : Long Terminal Repeat LTR: Long Terminal Repeat
Delta pour Tyl et Tyll (332 bp)  Delta for Tyl and Tyll (332 bp)
Sigma pour Tylll (341 bp)  Sigma for Tylll (341 bp)
Internal Inverted Repeat (8 bp)
Figure imgf000031_0002
Internal Inverted Repeat (8 bp)
Figure imgf000031_0002
■ Duplication de 5bp de la cible TyA : Homologue du gène gag des rétrovirus ■ 5bp duplication of the TyA target: Homologue of the retrovirus gag gene
TyB : Homologue du gène pol des rétrovirus TyB: Homologue of the retrovirus pol gene
Légende relative à la figure 2 Figure 2 legend
Figure imgf000031_0001
Légende relative à la figure 3 Séquences inversées répétées du SIGMA
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000031_0001
Caption for Figure 3 Repeated inverted SIGMA sequences
Figure imgf000032_0001
Séquences dupliquées de la cible d'intégration
Figure imgf000032_0002
du TYIII. Duplicate sequences of the integration target
Figure imgf000032_0002
of TYIII.
Limites du gène codant pour l'ARNt Ala. Limits of the gene encoding the tRNA Ala.
Figure imgf000032_0003
Figure imgf000032_0003
Localisation de l'anticodon AGC de l'ARNt. Location of the AGC anticodon of tRNA.
Figure imgf000032_0004
Figure imgf000032_0004
Sous la séquence sont annotées les différences constatées avec la séquence SIGMA la plus fréquemment obtenue.  Below the sequence are noted the differences observed with the most frequently obtained SIGMA sequence.
Légende relative à la figure 5 Figure 5 legend
Oligonucléotides mutagènes Mutagenic oligonucleotides
Figure imgf000032_0005
Figure imgf000032_0006
Séquences génomiques du chromosome VIII
Figure imgf000032_0007
Séquences du Sigma
Figure imgf000032_0008
Séquence inversées répétées
Figure imgf000032_0005
Figure imgf000032_0006
Genomic sequences of chromosome VIII
Figure imgf000032_0007
Sigma sequences
Figure imgf000032_0008
Reverse sequence repeated
Légende relative à la figure 7 Figure 7 legend
Ap ApaI Bh BamHI Bg BglIIAp ApaI Bh BamHI Bg BglII
Bx BstXI E EcoRI Ev EcoRVBx BstXI E EcoRI Ev EcoRV
HIII HinDIII Hp HpaI Kp KnpIHIII HinDIII Hp HpaI Kp KnpI
Nd NdeI Nt Not/EagI Sa SalINd NdeI Nt Not / EagI Sa SalI
SI SacI SII SacII Sm SmaISI SacI SII SacII Sm SmaI
Xb XbaI Xh XhoI Xb XbaI Xh XhoI
Séquences du sigmaSigma sequences
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0001
Séquences inversées répétées Repeated reverse sequences
Figure imgf000033_0002
Figure imgf000033_0002
Légende relative à la figure 8 Figure 8 legend
Figure imgf000033_0003
Séquences inversées répétées du SIGMA. Légende relative à la figure 9
Figure imgf000033_0003
Repeated inverted SIGMA sequences. Figure 9 legend
Ap ApaI Bh BamHI Bg BglIIAp ApaI Bh BamHI Bg BglII
Bx BstXI E EcoRI Ev EcoRVBx BstXI E EcoRI Ev EcoRV
HIII HinDIII Hp HpaI Kp KnpIHIII HinDIII Hp HpaI Kp KnpI
Nd NdeI Nt Not/EagI Sa SalINd NdeI Nt Not / EagI Sa SalI
SI SacI SII SacII Sm SmaISI SacI SII SacII Sm SmaI
Xb XbaI Xh XhoIXb XbaI Xh XhoI
Figure imgf000034_0001
Séquences du sigma
Figure imgf000034_0001
Sigma sequences
Figure imgf000034_0002
Séquences inversées répétées
Figure imgf000034_0002
Repeated reverse sequences

Claims

REVENDICATIONS
1. Cassette d'intégration multisite dans le génome d'une levure, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins :  1. Multisite integration cassette in the genome of a yeast, characterized in that it comprises at least:
- une séquence d'intégration présentant de l'homologie avec une séquence "non essentielle" naturellement répétée et dispersée dans le génome de la levure,  an integration sequence exhibiting homology with a "nonessential" sequence naturally repeated and dispersed in the yeast genome,
- une séquence d'intérêt.  - a sequence of interest.
2. Cassette d'intégration multisite selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ladite séquence d'intégration est une séquence présentant de l'homologie avec une séquence type Solo LTR d'une levure, notamment du genre Saccharomyces.  2. Multisite integration cassette according to claim 1, characterized in that said integration sequence is a sequence having homology with a Solo LTR type sequence of a yeast, in particular of the genus Saccharomyces.
3. Cassette d'intégration multisite selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite séquence type Solo LTR est choisie parmi les Solo LTR de S. cerevisiae.  3. Multisite integration cassette according to claim 2, characterized in that said sequence of Solo LTR type is chosen from the Solo LTR of S. cerevisiae.
4. Cassette d'intégration multisite selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite séquence type Solo LTR est la séquence Solo Sigma de S. cerevisiae.  4. Multisite integration cassette according to claim 3, characterized in that said sequence type Solo LTR is the sequence Solo Sigma of S. cerevisiae.
5. Cassette d'intégration multisite selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite séquence Solo Sigma est la séquence Solo Sigma localisée sur le chromosome VIII de S. cerevisiae à proximité du gène ARG4.  5. Multisite integration cassette according to claim 4, characterized in that said Solo Sigma sequence is the Solo Sigma sequence located on chromosome VIII of S. cerevisiae near the ARG4 gene.
6. Cassette d'intégration multisite selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite séquence d'intérêt est clonée à l'intérieur de ladite séquence d'intégration.  6. Multisite integration cassette according to one of the preceding claims, characterized in that said sequence of interest is cloned inside said integration sequence.
7. Cassette d'intégration multisite selon l'une des revendications 1 à 7. Multisite integration cassette according to one of claims 1 to
6, caractérisée en ce que ladite séquence d'intérêt peut être ciblée par recombinaison homologue vers les séquences naturellement répétées présentant l'homologie. 6, characterized in that said sequence of interest can be targeted by homologous recombination towards naturally repeated sequences exhibiting homology.
8. Souche de levure transformée par une cassette d'intégration multisite selon l'une des revendications précédentes.  8. Yeast strain transformed by a multisite integration cassette according to one of the preceding claims.
9. Souche de levure du genre Saccharomyces caractérisée en ce qu'elle contient dans son génome au moins une séquence d'intérêt intégrée en une seule copie dans au moins une séquence naturellement répétée et dispersée de son génome, au site de ladite séquence naturellement répétée. 9. Yeast strain of the genus Saccharomyces characterized in that it contains in its genome at least one sequence of interest integrated into a single copy in at least one naturally repeated and dispersed sequence of its genome, at the site of said naturally repeated sequence .
10. Souche de S.cerevisiae caractérisée en ce qu'elle contient dans son génome au moins une séquence d'intérêt intégrée dans au moins une séquence Solo Sigma, au site de ladite séquence Solo Sigma. 10. A strain of S.cerevisiae characterized in that it contains in its genome at least one sequence of interest integrated into at least one Solo Sigma sequence, at the site of said Solo Sigma sequence.
11. Procédé de préparation d'un produit d'intérêt par une levure du genre S accharomyces, selon lequel :  11. Process for the preparation of a product of interest by a yeast of the genus S accharomyces, according to which:
- on transforme une levure du genre Saccharomyces par une cassette d'intégration selon l'une des revendications 1 à 7,  a yeast of the genus Saccharomyces is transformed by an integration cassette according to one of claims 1 to 7,
- on met en culture la levure ainsi transformée, et  - the transformed yeast is cultured, and
- on récupère le produit obtenu.  - the product obtained is recovered.
12. Procédé de préparation de plusieurs produits d'intérêt par une levure du genre Saccharomyces selon lequel :  12. Process for the preparation of several products of interest by a yeast of the genus Saccharomyces according to which:
- on transforme successivement une levure du genre Saccharomyces par une cassette d'intégration selon l'une des revendications 1 à 7, comportant chacune, en tant que séquence d'intérêt, une séquence d'ADN codant pour l'un des produits d'intérêt, ou  - a yeast of the genus Saccharomyces is successively transformed by an integration cassette according to one of claims 1 to 7, each comprising, as sequence of interest, a DNA sequence coding for one of the products of interest, or
- on transforme une levure du genre Saccharomyces par une cassette d'intégration selon l'une des revendications 1 à 7, comportant plusieurs séquences d'intérêt codant chacune pour l'un des produits d'intérêt, et a yeast of the genus Saccharomyces is transformed by an integration cassette according to one of claims 1 to 7, comprising several sequences of interest each coding for one of the products of interest, and
- on met en culture la levure ainsi transformée, et - the transformed yeast is cultured, and
- on récupère lesdits produits d'intérêt. - said products of interest are recovered.
13. Procédé de préparation de plusieurs produits d'intérêt par une levure du genre Saccharomyces selon l'une des revendications 1 1 et 12, dans lequel  13. A method of preparing several products of interest with a yeast of the genus Saccharomyces according to one of claims 1 1 and 12, in which
- on réalise la cotransformation d'une levure du genre Saccharomyces par au moins deux cassettes d'intégration selon l'une des revendications I à - The cotransformation of a yeast of the genus Saccharomyces is carried out by at least two integration cassettes according to one of claims I to
7, comportant chacune, en tant que séquence d'intérêt, au moins une séquence d'ADN codant pour l'un des produits d'intérêt, 7, each comprising, as sequence of interest, at least one DNA sequence coding for one of the products of interest,
- on met en culture la levure ainsi transformée, et  - the transformed yeast is cultured, and
- on récupère lesdits produits d'intérêt.  - said products of interest are recovered.
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