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WO1992006182A1 - D-pantolactone hydrolase and production thereof - Google Patents

D-pantolactone hydrolase and production thereof Download PDF

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WO1992006182A1
WO1992006182A1 PCT/JP1991/001351 JP9101351W WO9206182A1 WO 1992006182 A1 WO1992006182 A1 WO 1992006182A1 JP 9101351 W JP9101351 W JP 9101351W WO 9206182 A1 WO9206182 A1 WO 9206182A1
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WO
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pantolactone
hydrolase
enzyme
activity
genus
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Application number
PCT/JP1991/001351
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English (en)
French (fr)
Inventor
Keiji Sakamoto
Hideaki Yamada
Sakayu Shimizu
Original Assignee
Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP91917332A priority patent/EP0504421B1/en
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Priority to DE1991917332 priority patent/DE504421T1/de
Priority to US07/859,439 priority patent/US5372940A/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction

Definitions

  • 5D-pantolactone is known as an intermediate in the production of D-pantothenic acid and pantethine, which are useful as medically or physiologically important vitamins.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel enzyme useful for the optical resolution of D, monolactone and a method for producing the same.
  • D- and penta-lactones have been produced by optically resolving chemically synthesized D- and penta-lactones.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the asymmetric hydrolysis of D, L—pantolactone. As a result, the use of specific microbes has led to the finding that D, L —D in pantolactone — D—Nono by selectively asymmetrically hydrolyzing only pantolactone. By producing ditoluic acid, separating the D-pantoic acid and converting it into D-pantolactone, the efficiency of D, L-pantolactone is reduced. Good GD—We have found that we can get a pantolactone (see Japanese Patent Application No. 1-2 GQ 347).
  • D—pantolactone in L—C pantolactone is selectively asymmetrically hydrolyzed to produce D—pantoic acid, and the! -No ,. Separates the tonic acid, D_NO.
  • the feature is that it is converted to ultraton! ) It has succeeded in providing a method for producing one pantolactone,
  • the present inventors used the above-mentioned method of the present invention for selectively asymmetrically hydrolyzing only D—non-lactone in D, siphon-lactone.
  • pantolactone is selected from microorganisms belonging to the genus Pseudomonas or Arsloderma and cultured. We have succeeded in obtaining a novel D-pan C lactone hydrolase, and therefore, the present invention is directed to it!
  • One pan tractone hydrolase and the above genera There is provided a process for the production of the enzyme that by the microorganisms.
  • the novel enzyme according to the present invention generally comprises: Can be manufactured. That is, Fusarium and Si
  • Genus Lindocarpon Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volterra, Glyocradidium, Eurotium, Nectria, Schizophyllam From microorganisms belonging to the genus Myrocesium, Neurospora, Acrymonium, Tuberculina, Abscissia, Sporothrix, Verticillium or Arsrodhama; A microorganism capable of producing lactone hydrolase is selected, the microorganism is cultured, and the microorganism is collected from the culture. Examples of such microorganisms that are generally available include those listed in Table 1).
  • the IFO No. indicates the catalog number of the Institute for Yeast Research.
  • the medium used for culturing these microorganisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances, and other nutrients as appropriate. As long as it is a medium, either a synthetic medium or a natural medium can be used.
  • Carbon sources include sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as ethanol and glycerin, fatty acids such as oleic acid and stearic acid and esters thereof, rapeseed oil, soybean oil, etc. Oils, nitrogen sources such as ammonium sulfate, sodium nitrate, peptone, casamino acids, cornstea, bran, yeast extract, etc., inorganic salts such as magnesium sulfate, chloride A medium containing malt extract, meat extract and the like as other nutrients such as sodium, calcium carbonate, calcium hydrogen phosphate and calcium dihydrogen phosphate is used.
  • sugars such as glucose and sucrose
  • alcohols such as ethanol and glycerin
  • fatty acids such as oleic acid and stearic acid and esters thereof
  • rapeseed oil soybean oil
  • Oils nitrogen sources such as ammonium sulfate, sodium nitrate, peptone, casamino acids, cornstea, bran, yeast
  • Cultivation is aerobic, usually 1-7 days Degree, medium is 3-9, culture temperature is 10-5 (TC
  • D-pantolactone hydrolase is usually present in cells
  • the method for collecting the enzymes in the cells will be described.
  • the bacterial cells obtained by filtering or centrifuging the culture are thoroughly washed with water or a buffer.
  • the obtained cells are suspended in an appropriate buffer, and the cells are disrupted.
  • Crushing is accomplished by mechanical crushing (eg, with a mortar, dynomil, french press, ultrasonic crusher, etc.).
  • D-pantolactone hydrolase in the cell-free extract obtained by removing solids by filtration or centrifugation from the crushed liquid of the cells thus obtained Is collected by a conventional method of enzyme isolation.
  • Enzymes that accumulate in the culture solution outside the cells can be obtained in the same manner as described above, except that the operations of cell separation and cell disruption are omitted.
  • the enzyme according to the present invention is easily and uniformly purified by electrophoresis as described in the Examples. .
  • the properties of the enzyme according to the present invention are as follows.
  • This enzyme solution 2.9 was applied to a DEAE Sephace I column (5.5 x 34 cm) and eluted with a linear gradient of potassium chloride (0 to 0.5 M).
  • the eluted enzymatically active fraction 255 ⁇ was loaded on a hydroxyapatite column (5 x 10cm) and eluted with a linear concentration gradient (0-0.88M) of a phosphate buffer C solution (pH 7.0).
  • the eluted enzymatically active fraction of 425 mJ! was ultrafiltered with an Amicon YM10, and 115 mJI of the resulting enzyme concentrate was added to a 20 raM Tris-HCl buffer ( ⁇ 7.4) containing 0.1 raM dithiothreitol. An analysis was performed for this.
  • This product showed only one band in electrophoresis, and the purified enzyme solution was desalted by gel filtration and lyophilized to obtain 5.1 me of enzyme fine powder.
  • the total activity was "70 U.
  • the specific activity was 232 U Zrae, and the activity yield was 38.8%.
  • the enzymatic activity is measured under the following conditions at 1 mo per minute, 1 unit of the enzymatic activity to hydrolyze D-pantolactone ((!) Is defined as U :).
  • reaction-terminated liquid HPLC (uc I e 0 si! 5C 18 4.6 x 150 ⁇ , eluent 10% meta no Le, flow rate i MilZmin, detection wavelength 23G nm) obtaining the rate of hydrolysis using.
  • Enzymatic activity for example, a hydrolysis rate of 1% If the enzyme solution 1 m per Ri activity 1.6 X 10- 2 ⁇
  • this enzyme is considered to be a dimeric protein consisting of two subunits with a molecular weight of 63,000.
  • This enzyme is inhibited by some heavy metal ions.
  • the typical ones are listed below.
  • the values in parentheses are the values of the activity when the concentration of each metal ion is 2.5 ⁇ , assuming that the activity value when no metal ion is added is 100.
  • this enzyme is inhibited by some heavy metal ions. The typical ones are listed below. The values in parentheses are the values of the activity when the concentration of each metal ion is 2.5 ⁇ , assuming that the activity value when no metal ion is added is 100.
  • Zn 2+ (1G) Cd 2+ (0), Cu 2+ (6), Hg 2+ (0).
  • this enzyme is inhibited by some heavy metal ions. The typical ones are listed below.
  • the values in parentheses are the values of the activity when the concentration of each metal ion is 2.5 ⁇ , assuming that the activity value when no metal ion is added is
  • Example 2 the microorganisms described in Table 1 Nos. 2 to 19 were used in place of Fusarium ⁇ oxyspo / rem (IGF 5942) used in Example 1. After culturing each microorganism, each culture was processed to obtain each cell-free extract.
  • IGF 5942 Fusarium ⁇ oxyspo / rem
  • each enzyme can be obtained as a pure product from the cell-free extract after purification.
  • FIG. 1 shows the relationship between the pH and the activity of the D-pantolactone hydrolase of the present invention
  • FIG. 2 shows the relationship between temperature and activity
  • FIG. Fig. 4 shows the relationship between the activity when treated at each pH for 60 minutes
  • Fig. 4 shows the relationship between the temperature and the activity when treated at PH 7.0 for 60 minutes at each temperature.

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Description

明 細 書
D —パン ト ラク 卜 ン加水分解酵素
およびその製造法
[産業上の利用分野 ]
5 D —パン ト ラ ク 卜 ンは医学上または生理学上重要なビ タ ミ ン と して有用な D —パン ト テン酸やパンテチンの製 造における中間体と して知られて いる 。 本発明は D , し 一パン ト ラク ト ンの光学分割に有用な新規な酵素および その製造法に関する ものである 。
[背景技術 ]
従来、 D — ノ、 °ン ト ラ ク ト ンは化学的に合成された D , し 一 パ ン ト ラ ク ト ンを光学分割する こ と によ り製造され て いる 。
しか しながら 、 この方法は、 キニーネ、 ブルシン等の ^ 高価な分割剤を必要と する ものであ り 、 D —パン ト ラ ク ト ンの回収も容易でない等の欠点を有 して いる 。
一方、 D , L —パン ト ラ ク ト ンの酵素的不斉加水分解 によ る光学分割法と しては特開昭 5 7— 1 5 2895号および特 開昭 62— 294092号各公報に記載されて いる方法が知られ C て いる 。 この方法は微生物を用いて D ， L 一 パン ト ラ ク ト ン中め し 一パン 卜 ラ ク ト ンを選択的に不斉加水分解 し、 D — ノ、。ン ト ラ ク ト ンを得る方法であるが、 L ー ノ、。ン ト ラ ク 卜 ンを完全に加水分解 し得ないので光学純度の高い D ー ノ、。ン ト ラク ト ンを得る こ と ができ ないと い う 欠点を有 . して いる上、 基質濃度および反応速度が共に低いめで、 実際に、 D 二パン ト ラ ク ト ンを製造する方法と しての意 義は低い。
本発明者らは、 D , L —パン ト ラ ク ト ンの不斉加水分 解につき 、 鋭意研究をおこなった結果、 先に、 特定の微 5 生物を用いる こ と によ り 、 D , L —パン ト ラ ク ト ン中の D —パン ト ラ ク ト ンのみを選択的に不斉加水分解せ しめ る こ と によ り 、 D — ノヽ。ン 卜 イ ン酸を生成せしめ、 その D 一パン 卜イ ン酸を分離し、 D —パン トラ ク ト ンに変換す る こ と によ って 、 D , L—パン ト ラク ト ンから効率よ く G D —パン ト ラク ト ンを取得 し得る こ と を見いだした （特 願平 1 一 2 G Q 347参照） 。
すなわち、 フサリ ウム属、 シ リ ン ドロカルポン属、 ジ ペレラ属、 ァスペルジラス属、 ぺニシ リ ウム属、 リ ゾプ ス属、 ボルテラ属、 グリ オク ラディ ウム属、 ユーロテ ィ
■5 ゥム属、 ネク ト リ ァ属、 シゾフ ィ ラム属、 ミ ロセシウム 属、 ノィ ロスボラ属、 ァク リ モニゥム属、 ッベルク リ ナ 属、 アブシジァ属、 スポロス リ クス属、 バーテ ィ シ リ ウ ム属またはァルスロダーマ属に属する微生物よ り選ばれ たラ ク 卜 ン加水分解能を有する微生物を用いて ！） ， L— C パン ト ラク ト ン中の D —パン トラク ト ンを選択的に不斉 加水分解せしめる こ と によ り 、 D —パン ト イ ン酸を生成 せ しめ、 その！） ー ノ、。ン トイ ン酸を分離し、 D _ ノ、。ン 卜 ラ ク ト ンに変換する こ と を特徴とする ！） 一パン ト ラ ク ト ン の製造法を提供する こ と に成功したものであ り 、 前述の
25 D , L ー ノ ン ト ラク ト ン中の L 一 ノ、。ン ト ラク ト ンを選択 的に不斉加水分解する方法に比べ、 基質濃度をかな り高 く でき る こ と および反応時間を短 く 設定でき る こ と 、 更 に、 光学純度の極めて高い！） 一パン ト ラ ク ト ンを得る こ と ができ るな ど多 く の長所を有する ものである 。
5 [発明の開示 ]
本発明者らは上述 した、 本発明者らによ る D , しー パ ン ト ラ ク ト ン中の D —ノ ン ト ラク ト ンのみを選択的に不 斉加水分解する方法において使用 した特定の微生物よ り 、 D — ラ ク ト ンを特異的に加水分解する新規な酵素を採取 • する こ と に成功 した。 すなわち、 本発明者らはフサ リ ウ ム属、 シ リ ン ドロカルポン属、 ジべレラ属、 ァスペルジ ラス属、 ぺニシ リ ウム属、 リ ゾプス属、 ボルテラ属、 グ リ オク ラデ ィ ウム属、 ユーロテ ィ ゥム属、 ネク ト リ ァ属、 シゾフ ィ ラム属、 ミ ロセシウム属、 ノイ ロスポラ属、 ァ • " ク リ モニゥム属、 ッベルク リ ナ属、 アブシジァ属、 スポ ロス リ クス属、 バーテ イ シ リ ゥム属またはァルスロダー マ属に属する微生物の中から D — パ ン ト ラ ク ト ンを特異 的に加水分解する新規な酵素の生産能を有する微生物を 選んで培養 し、 その培養体から得られる新規な D —パン C ト ラ ク ト ン加水分解酵素を得る こ と に成功 した。 したが つて 、 本発明はかかる ！） 一パン ト ラ ク ト ン加水分解酵素 および上記 した属に属する微生物によ る該酵素の製造法 を提供する ものである 。
以下に、 本発明を詳細に説明する 。
- 本発明に係る新規な酵素は、 一般には、 下記の如く し て製造する こ とができ る 。 すなわち、 フサ リ ウム属、 シ
Γ
リ ン ドロカルポン属、 ジべレラ属、 ァスペルジラス属、 ぺニシ リ ウム属、 リ ゾプス属、 ボルテラ属、 グリ オク ラ デ ィ ウム属、 ユーロテ ィ ゥム属、 ネク ト リ ァ属、 シゾフ イ ラム属、 ミ ロセシウム属、 ノイ ロスポラ属、 ァク リ モ ニゥム属、 ッベルク リ ナ属、 アブシジァ属、 スポロス リ ク ス属、 バーテ ィ シ リ ウム属またはァルス ロダーマ属に 属する微生物中から、 D —パン 卜 ラ ク ト ン加水分解酵素 生産能を有する微生物を選びこの微生物を培養し、 その 培養物中よ り採取する こ と によ る ものである 。 このよ う な微生物と しては一般に入手 し得る ものの例と して第 1 表記載の もク）を掲げるこ とができ る 。
Figure imgf000006_0001
第 1 表 （ つづき ）
Figure imgf000007_0001
第 1 表 （つづき ）
Figure imgf000008_0001
註 ： I F O No.は、 財団法人醌酵研究所カタ ログ番号を示 す これら微生物の培養にあた り使用する培地と しては炭 素源、 窒素源、 無機物、 その他の栄養素を適宜含有する 培地であれば合成培地または天然培地のいずれも使用可 能である 。
炭素源と してはグルコース、 シュク ロース、 等の糖質、 エタ ノール、 グリ セ リ ン等のアルコール類、 ォレイ ン酸、 ステア リ ン酸な どの脂肪酸およびそのエステル類、 菜種 油、 大豆油等の油類、 窒素源と して 、 硫酸アンモニゥム、 硝酸ナ ト リ ウム、 ペプ ト ン、 カザミ ノ酸、 コーンステ ィ 一プリ カ一、 ふすま 、 酵母エキス等、 無機塩類と して 、 硫酸マグネシウム、 塩化ナ ト リ ウム、 炭酸カルシウム、 リ ン酸一水素カ リ ウム、 リ ン酸二水素カ リ ウム等、 他の 栄養素と して 、 麦芽エキス、 肉エキス等を含有する培地 を用いる 。
培養は好気的におこない、 通常、 培養時間は 1〜 7 日 程度、 培地の は 3 〜 9 、 培養温度は 1 0〜 5 (TCでおこな
5
う .
上記の如き 培養方法によ り培養をおこな う 場合には .. 培養液および Zまたは菌体中に D —パン ト ラ ク ト ン加水
5 分解酵素が多量生成するのでその酵素を次のごと き方法 で採取する 。
D —パン ト ラ ク 卜 ン加水分解酵素は通常菌体中に存在 するので、 菌体中の酵素の採取法について述べる 。 培養 終了後、 培養液を 過または遠心分離 して得られる菌体 を水または緩衝液でよ く 洗浄する 。 得られた菌体を適 i の緩衝液に懸濁 し、 菌体を破砕する 。 破砕には機械的破 砕 （例えば、 乳鉢、 ダイ ノ ミ ル、 フ レ ンチプレス 、 超音 波破砕機その他によ る ） によ っておこなわれる 。
かく して得られた菌体の破砕液中よ り 、 固形物を沪過 または遠心分離によ って除去 して得られた無細胞抽出液 中の D —パン ト ラ ク ト ン加水分解酵素は酵素単離の常法 によ って採取される 。
例えば、 硫安沈殿法、 イ オン交換ク ロマ ト グラ フ ィ ー 法、 ァフ ィ 二テ ィ ーク ロマ トグラ フ ィ ー法、 ゲル沪過法、 限外 過法等の方法を組み合わせて用いればよ い。
菌体外の培養液中に蓄積する酵素については、 菌体分 離および菌体破砕の操作を省略する以外は上記と 同様に おこない、 取得する こ と ができ る 。
このよ う に して本発明に係る酵素は実施例において述 ベられて いる よ う に容易に電気泳動的に均一に精製され る 。
本発明に係る酵素の性質は以下の通 り である 。
(a) 作 用
バン ト ラ ク ト ンに作用 し対応する酸を生成する
5 ） 基質特異性
D —パン ト ラク ト ンに特異的に作用 し、 L—パン トラ ク ト ンには作用 しない
(c) pH安定性
5〜 9で安定 （測定法 ： 酵素溶液 40 J1 に各 pHの 200 - mM緩衝液 を加え、 30Cで 30分反応後、 後述の酵 素活性測定法に準じ活性を測定）
(d) 至適
7.0〜 7.5 (測定法 ： ！） 一パン ト ラク ト ン 2.5%濃度 250 wM各緩街溶液 200 ί に酵素溶液 50 ，β を加え、 5 30eCで 60分反応後、 活性を測定）
(e) 至適温度
50で付近 （測定法 ： 各温度で 60分反応後、 酵素活性測 定法に準 じ活性を測定）
(f) 各種金属イ オン、 阻害剤の影響
« cd2 +、 Hg2+、 Cu2 +、 E DT Aによ って阻害される
次に実施例を挙げて本発明の酵素の製造例を具体的に 説明するが、 本発明はこれらの実施例によって限定され る ものではない。
実施例 1
25 フサ リ ウム - ォキシスポルム （ IF0 5942 ) をシュク ロ ース 5 %、 硝酸ソーダ 0.4%、 リ ン酸第二カ リ 0.2%、 硫酸マグネシウム 0.05%、 塩化カ リ ウム 0.05%、 硫酸第 二鉄 0.001%、 硫酸亜鉛 0.002 %の組成 （ 6.0 ) を有 する培地 500mJl を含む 2 ϋ 振盪フ ラスコ 30本に植菌 し、 5 28 Cで 7 日間振盪培養 した。 培養液を遠心分離機で処理 し、 湿菌体 800 g を得た。 菌体に 0.1 mMジチオスレィ ト ールを含む 20mMト リ ス塩酸緩衝液 （ 7.4)2.5J! を加え 、 ダイ ノ ミルで磨砕後、 遠心分離によ り無細胞抽出液 2.3 S を得た。 この無細胞抽出液め比活性および D —パン トC イ ン酸の光学純度の測定結果を第 2表の実施例 NO. 1 に示 す。 さ らに、 この無細胞抽出液に塩化カ リ ウム 572 g を 加え溶解させ、 Octy I Sep ha rose C14Bカラム （ 3 x 28cm ) に負荷 し、 3 M塩化カ リ ウムで溶離 した。 溶出 した活性 画分 2.4』 を 0.1 raMジチオスレィ トールを含む 20mMト リ ス塩酸緩衝液 （ PH 7.4 ) に対 して透析をおこなった。 こ の酵素液 2.9』 を DEAE Sephace I カラム （ 5.5 x 34cm ) に負荷し、 塩化カ リ ウムの直線濃度勾配 （ 0 → 0. 5 M ) で溶離した。 溶出 した酵素活性画分 255ηιϋ をハイ ドロキ シアパタ イ トカラム （ 5 x 10cm ) に負荷 し、 リ ン酸緩衝C 液 （ pH 7.0 ) の直線濃度 ¾配 （ 0 — 0.88M ) で溶離 した。
溶出 した酵素活性画分 425m J! をア ミ コ ン YM10で限外沪過 し、 得られた酵素濃縮液 115mJI を 0.1 raMジチオスレィ ト ールを含む 20raMト リ ス塩酸緩衝液 （ ρΗ 7.4 ) に対 して透 析をおこなった。 この酵素液 190m』 をア ミ コ ン YM30で限 外濃縮 し、 得られた酵素液 14.5m2を Sephacry I S-30C 力 ラム （ 2.5 X 95 cm ) に負荷し、 0.2 M塩化カ リ ウムで溶 離した。 溶出 した酵素活性画分 44.5m2を 0.1 Π1Μジチォス レイ トールを含む 20ntH卜 リ ス塩酸緩衝液 （ PH 7.4) に対 して透析をおこなった後、 Q Seharose Fast Flowカラム ( 1.8 X 3 cm ) に負荷 し、 塩化カ リ ウムの直線濃度勾配 ( 0 → 1 M ) で溶離した。 溶出 した酵素活性画分 7 m2を 0. iitMジチオスレィ トールを含む 20πιΗト リ ス塩酸緩衝液 ( H 7.4) に対して透析をおこない、 精製酵素溶液 6.8 ffl£を得た。 この ものは電気泳動において 1 本のバン ド の みを示 し、 この精製酵素溶液をゲル 過によ る脱塩後、 凍結乾燥 し 、 酵素微粉末 5.1 meを得た。 全活性は " 70 U . 比活性は 232 U Zrae、 活性収率は 38.8%であった。
このよ う に して精製された D—パン ト ラ ク ト ン加水分 解酵素の性質を以下に示す。
(1) 酵素活性測定法 ：
酵素活性の測定は下記条件で 1 分間に 1 mo,(! の D— パン ト ラク 卜 ン を加水分解する酵素活性を 1 単位 （ U : とする 。
D—パン ト ラ ク ト ン 10%濃度の 0.5M PIPES 緩衝溶 液 （ PH 7.0 ) 200 /^ ϋ に酵素溶液 を加え、 3G。Cで 20分間反応させた後 2 IBM EDTA の メ タ ノ ー ル溶液
250 ϋ を加え反応を停止させる 。 反応終了液を HPLC ( u c I e 0 s i！ 5C18 4.6 x 150 瞻 、 溶離液 10%メ タ ノー ル、 流速 i milZmin 、 検出波長 23G nm ) を用いて加水 分解率を求める 。 酵素话性は例えば加水分解率が 1 % であれば、 酵素溶液 1 m 当た り の活性は 1.6 X 10— 2 υ
Ζ Βΐίίと なる 。
(2) 精製酵素の比活性 ： 232 U Z mir · 蛋白質
(3) 分子量 ：
ゲル 過法を用いて測定 した場合は 125000、 SDS ポリ ア ク リ ルア ミ ド ゲル電気泳動法を用いて 測定 した場 合は 63000 であ っ た 。 こ め こ と か ら本酵素は分子量 63000 のサブュニ ッ ト 2個からなる二量体蛋白である と考え られる 。
( 4 ) 等電点 ： 4.7
(5) 至適 PH ： 7 〜 7· 5
(6) PH安定性 ： 5 〜 9 で安定 （ 3(TC、 6G分処理 ）
(7) 至適温度 ： 50で付近
(8) 温度安定性 ： 50でまで安定 （ PH 7.0、 60分処理 ） (9) 基質特異性 ：
D —ノ、 °ン ト ラ ク ト ン （ Km： 82πιΗ ) に特異的に作用 し、 し 一ノ、。ン ト ラ ク ト ンには作用 しない。 その他、 D -ガ ラ ク 卜 ノ ラ ク 卜 ン （ Km : 3.6 ntM) 、 D —グロノ ラ ク ト ン （ Km : 29mM〉 、 D —マンノ ノ ラ ク 卜 ン （ Km : 23niM) に も作用する 。 ただ し、 Kmは ミ カエ リ ス定数を表わす。 (10) 阻害剤 ：
本酵素はい く つかの重金属イ オンによ って活性を阻害 される 。 代表的なものを次に掲げる 。 括弧内は金属ィ オン無添加時の活性の値を 100 と した場合、 各金属ィ オン 2.5 πιΜ濃度の場合の活性の値である 。 Zn2+(1G)、 Cd2+ (0) 、 Cu2+(6) 、 Hg2+ (0) 。 また本酵素は 5 mMの
EDTAによ って完全に阻害される 。
実施例 2 〜 19
実施例 1 において使用 した、 フサ リ ウム ■ ォキシスポ /レム （ IFG 5942 ) に替えて第 1 表 No. 2 〜 19に記載されて いる微生物を用いて 、 実施例 1 に記載の方法に準拠して 各微生物を培養 したのち、 各培養液を処理 し、 各々の無 細胞抽出液を得た。
無細胞抽出液からは必要に応じ、 精製の後、 各酵素を 純品と して取得する こ と ができ る 。
この各無細胞抽出液を用い、 酵素活性測定法に準じて 各々 の比活性お よび生成する ！） 一パン ト イ ン酸の光学 純度を測定した結果を第 2表実施例 No.2 〜 19に示す。 D 一パン ト イ ン酸の光学純度の測定は HPLC ( HCI GEL CRS 10W 4.6 x 50 mm、 溶離液 2 πΐΜ CuS04 i 10%メ タ ノール溶 液、 流速 0.8mJl /rain 、 検出波長 254 ηπι ) を用いておこ なった （J. Ghroraatogに， 474, 405 ( 1989 ) ) β
第 2
Figure imgf000015_0001
【図面の簡単な説明】
第 1 図は本発明の D —パン ト ラク ト ン加水分解酵素の PHと活性の関係を表わ し、 第 2 図は温度と活性の閲係を 表わ し、 第 3 図は 30で,でそれぞれの pHで 60分間処理 した と き の と活性の関係を表わ し、 第 4図は PH 7.0でそれ ぞれの温度で 60分間処理 したと きの温度と活性の関係を 表わす。

Claims

' 請 求 の 範 囲
(1 ) 下記性質を有する D —パン ト ラク ト ン加水分解酵素
(a) 作 用
パン ト ラ ク ト ンに作用 し対応する酸を生成する
(b) 基質特異性
D —パン ト ラ ク ト ンに特異的に作用 し、 L —パン 卜 ラ ク ト ンには作用 しない
(c) pH安定性
5 〜 9 で安定
(d) 至適 ί)Η
7 . 0 - 7 . 5
(e) 至適温度
50で付近
け） 各種金属イ オン、 阻害剤の影響
Cd2 +、 Hg2 +、 Cu2 +、 EDTAによ って阻害される
(2) フサ リ ウム属、 シ リ ン ド ロカルボン属、 ジべレラ属 ァスペルジラス属、 ぺニシ リ ウム属、 リ ゾプス属、 ボ ルテラ属、 グリ オク ラデ ィ ウム属、 ユーロテ ィ ゥム属 . ネク ト リ ァ属、 シゾフ ィ ラム属、 ミ ロセ シウム属、 ノ イ ロスポラ属、 アタ リ モニゥム属、 ッベルク リ ナ属、 アブシジァ属、 スポロス リ クス属、 バーテ イ シ リ ゥム 属またはァルス ロダーマ属に属する微生物であって 、 D —パン 卜 ラ ク ト ン加水分解酵素生産能を有する微生 物を培養 し、 培養体から D —パン ト ラ ク ト ン加水分解 酵素を採取する こ と を特徴と する微生物によ る D — パ ン 卜 ラク ト ン加水分解酵素の製造法
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