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WO1992001475A1 - Compositions a base de principes actifs de medicaments hydrophobes solubilisables dans un solvant aqueux - Google Patents

Compositions a base de principes actifs de medicaments hydrophobes solubilisables dans un solvant aqueux Download PDF

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WO1992001475A1
WO1992001475A1 PCT/FR1991/000595 FR9100595W WO9201475A1 WO 1992001475 A1 WO1992001475 A1 WO 1992001475A1 FR 9100595 W FR9100595 W FR 9100595W WO 9201475 A1 WO9201475 A1 WO 9201475A1
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WO
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sulfate
type
lipophilic
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PCT/FR1991/000595
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Inventor
Louis Chedid
Pierre Lefrancier
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Vacsyn France, S.A.
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Definitions

  • the invention relates to compositions comprising active principles of hydrophobic drugs, which can nevertheless be dissolved in an aqueous solvent.
  • the invention also relates to a process for obtaining such compositions, and to their uses in particular as pharmaceutical compositions.
  • This insolubility in an aqueous solvent is particularly disadvantageous for products intended to be administered in an aqueous physiological solution of the type of those usually used for injectable preparations. It is also applicable to products intended to be administered orally and which have reduced efficacy and bioavailability.
  • these products are immunomodulators capable of increasing the specific immune response (adjuvanted vaccine), or reinforcing non-specific resistance (anti-infectious agent).
  • adjuvant vaccine adjuvanted vaccine
  • anti-infectious agent adjuvanted anti-infectious agent
  • Very hydrophobic in nature they give aqueous suspensions which are difficult to disperse in a completely satisfactory manner (in particular with regard to the level of dispersion compatible with the possibility of injecting them into a patient), by using the various means of dissolution or aqueous dispersion. , based on known techniques, in particular mechanical treatments, or even the use of organic solvents or surfactants.
  • the present invention specifically aims to provide means for the solubilization or homogeneous dispersion in an aqueous solvent of hydrophobic products, such as lipophilic uramyl-peptides, or other active ingredients of lipophilic drugs, carriers of hydrocarbon chains. These sometimes themselves contribute to the low solubility of these products in water, or even to the instability of their aqueous dispersions.
  • hydrophobic products such as lipophilic uramyl-peptides, or other active ingredients of lipophilic drugs, carriers of hydrocarbon chains.
  • the invention relates generally to a composition capable of being dissolved or dispersed in a homogeneous and stable manner in a pharmaceutically acceptable aqueous solution, characterized by the combination: on the one hand, of a lipophilic active principle of drug or "pharmacologically active substance", comprising at least one hydrocarbon group itself comprising at least 3 carbon atoms, and - on the other hand, of a solubilizing osidic derivative, itself water-soluble, pharmaceutically acceptable, itself carrying a hydrocarbon group having at least 3 carbon atoms and comprising one or more hydroxyl functions, at least one of which is substituted by a phosphate or sulfate group, this osidic derivative being in a sufficient proportion relative to the lipophilic active principle for promote the solubilization or dispersion of the entire composition in an aqueous solution.
  • a lipophilic active principle of drug or "pharmacologically active substance” comprising at least one hydrocarbon group itself comprising at least 3 carbon atoms
  • the dissolution or dispersion of the two above-defined constituents of the composition apparently involves the constitution of Van der Walls type bonds between their respective hydrocarbon chains. Often the connections of Van der Walls will be all the more effective as they are numerous and therefore, as the hydrocarbon chains will be longer. It goes without saying that these chain lengths must not, especially with regard to the water-soluble sugar derivative, exceed those which would have the effect of excessively increasing its lipophilicity.
  • lipophilic must be understood as meaning that the substance concerned has in a two-phase system (aqueous solution - organic solution) a partition coefficient favorable to the organic phase; in other words, the lipophilic substance is more soluble in the organic solution than in the aqueous solution.
  • the lipophilic substance can even be practically insoluble in water.
  • water-soluble has the opposite meaning.
  • the partition coefficient of the water-soluble substance in the above two-phase system is in favor of the aqueous phase.
  • solubilizing power of the osidic derivative is attributable to the simultaneous presence in the structure of this osidic derivative of said (or said) group (s) of hypocarbon (s) and of (or) group (s) sulfate or phosphate.
  • Hydrocarbon groups allow the establishment of Van der Waals type connections with the hydrocarbon chain (s) of the active principle and the sulfate or phosphate group (s) allows the solubilization of the non-covalent complex thus formed.
  • the lengths of the hydrocarbon chains carried respectively by the lipophilic active substance on the one hand, the water-soluble solubilizing derivative, on the other hand, are chosen so as to favor the establishment of the above-mentioned Van der Waals type bonds.
  • the pharmacologically active substance can consist of any substance meeting the criteria indicated above.
  • the lipophilicity of the pharmacologically active substance can result either from the length of the hydrocarbon chains which it carries, or - and in particular when these hydrocarbon chains are short - from the number of these chains, or even , of course, the combination of the lengths and the number of these hydrocarbon chains.
  • the active substance may comprise any derivative of muramyl-peptide containing a hydrocarbon chain tending to reduce the water solubility of ⁇ corresponding muramyl peptide therefore • that it is devoid of said hydrocarbon chain.
  • a preferred category of such so-called "lipophilic" muramyl-peptides is further illustrated below.
  • Another category of preferred compounds is constituted by saccharide derivatives or analogues, in particular mono- or di-saccharide lipid A. Certain preferred examples of these analogs are mentioned below.
  • Other pharmaceutical substances can also be dissolved using the techniques of the invention.
  • cyclic peptides of the cyclosporin family for example cyclosporin A (JF Borel et al, Agents Actions - 6 (1976) 1 + 68; is, Immumnology 32 (1977) 1017 ; PJ Tudchka et al., Blood 61 (1983) 318) but also cyclic pseudopeptides, for example valinomycin or polyene macrolides, for example lucensomycin, and the fat-soluble vitamins, in particular vitamins A, D, E, K,
  • any pharmacologically active substance of the polyene, mono or polysaccharide, polypeptide, cyclic or non-cyclic, or even glycopeptide type, which carries at least one hydrocarbon chain as defined above, can be forming the lipophilic constituent of the compositions according to the invention.
  • the invention applies in particular to the solubilization of pharmacologically active substances, the solubility of which would prove to be insufficient for medical application, whatever the route of administration envisaged, since it comprises a hydrocarbon chain which can be associated, via Van de Waals type bonds, with a corresponding hydrocarbon chain carried by an osidic derivative, as defined above.
  • osidic As for the water-soluble osidic derivative, it should be noted that the expression "osidic” as used above, and in what follows, relates generally to any product comprising in its structure one (or more) residue ( saccharide (s). In general, any osidic derivative as defined above can be used in the compositions of the invention, provided that this derivative does not lead to a modification of the pharmacological properties of the above-mentioned active substance, such as this the latter would become inactive or toxic.
  • hydrocarbon chains carried either by the pharmacologically active substance or by the oside derivative are advantageously themselves lipophilic groups. They notably include:
  • branched hydrocarbon structure of 5 to 50, in particular of 10 to 50 carbon atoms, comprising where appropriate, one or more ether, ester, thioether, thioester, or amide bond (s), this branched structure being designated hereinafter by "type B" lipophilic group.
  • a category of preferred sugar derivatives for the production of compositions in accordance with the invention are those which correspond to the following formula (I):
  • R represents a hydrocarbon group comprising at least 3 carbon atoms, in particular a "type A” or “type B” lipophilic group,
  • - represents H, or OH, or an acetamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido group,
  • R 3 and R 4 identical or different, represent either H, or OH, or OCH 3 , or else a sulfate or phosphate group,
  • R represents either H, OH, or 0CH 3 , or else a dare or osamine residue whose anomeric carbon in position 1 (Cl) is engaged in a glycosidic bond, the positions C2, C3 and C4 being respectively substituted by groups R ' 2 , R' 3 , and R ' 4 respectively having the meanings given above for R 2 , R 3 , and R 4 , and the position C6 by a group R' having the meaning given above for
  • R at least one of the groups R 2 , R'g / R 3 , R ' 3 , R 4 or R' representing a sulfate or phosphate residue.
  • the lipophilic groups must not be of such a length or in such a number that the whole of the osidic derivative would tend to become insoluble.
  • Preferred sugar derivatives are chosen from the following compounds:
  • compositions in accordance with the invention will be even more - and in a non-limiting manner - illustrated below.
  • the two hydrocarbon groups where appropriate, lipophilic by themselves, ensuring respectively a non-covalent association between the pharmacologically active substance and the oside derivative, are linear hydrocarbon structures.
  • these groups are such that one of them is composed of a linear hydrocarbon structure, while the other consists of a branched hydrocarbon structure.
  • the branched hydrocarbon structure is then preferably chosen from those consisting of a branched hydrocarbon chain, the branches of which arise on two adjacent carbon atoms, or at most separated by one carbon atom.
  • the linear hydrocarbon structure must then, in order to associate with the branched hydrocarbon chain, have a sufficient length allowing the establishment of non-covalent bonds, in particular of the Van der Walls type, with at least one of the ramifications of the structure. branched hydrocarbon.
  • association of the pharmacologically active substance and the osidic derivative is effected by means of their respective hydrocarbon or even lipophilic groups, as soon as non-covalent bonds are established which are sufficiently strong to allow the linear hydrocarbon structure, to be maintained in a so-called “sandwich" position between the two branches of the branched hydrocarbon structure.
  • the linear hydrocarbon structure has a number of carbon atoms at most equal to the number of carbon atoms of the branches of the branched hydrocarbon structure.
  • a more particular subject of the invention is any composition capable of being dissolved or homogeneously dispersed in an aqueous solvent, characterized in that it comprises:
  • any pharmacologically active substance in particular of a nature insoluble in an aqueous solvent, and onto which is capable of being grafted at least one lipophilic group "type A” or “type B” mentioned above or more generally a shorter hydrocarbon chain, can be used as a pharmacologically active substance included in the compositions of the invention.
  • - R represents H or CH 3 ;
  • - R 6. represents a group -NH 2 , -OH or a group -OW
  • W 1 being a hydrocarbon group having from 1 to 10 carbon atoms
  • X represents an aminoacyl residue from the group comprising alanyl, valyl, isoleucyl, norleucyl, leucyl, threonyl, prolyl, glutaminyl, asparaginyl, ethionyl, tryptophanyl, phenylalanyl, tyrosyl, glycyl;
  • Y represents either OH or NH 2 or a group -OW 2 , W 2 being a hydrocarbon group of 1 to 4 carbon atoms, or else a lipophilic group of type A or of type B,
  • Z represents either H or a "type A” or “type B” lipophilic group, it being understood however that at least one of the two groups Y and Z is always constituted by a "type A” lipophilic group or "type B";
  • n 2 identical or different, represent zero or 1,
  • - A, and B are either identical or different groups respectively comprising from 1 to 3 aminoacyl residues, themselves identical or different from each other, or else a group -NH- (CH 2 ) p -CO- with values of p between 2 and 10.
  • composition of the invention comprises compounds of the above-mentioned formula (II), in which
  • composition of the invention comprises compounds of formula (II) mentioned above, in which: - n, and n represent zero,
  • - R_ represents -OH, or -NH or On (CH 2 ) H with x ⁇ between 1 and 6, with a preference for x 1 ⁇ 4, -X is L or D-alanyl, L-threonyl, L-valyle ,
  • the biologically active substance capable of being combined with the derivatives of osides, defined above, to form soluble or dispersible compositions in accordance with the invention may also belong to other categories of products. These are, for example immunomodulatory substances, selected from:
  • constituents of bacterial origin inter alia constituents of the bacterial wall: derivatives of trehalose, in particular of the type of TDM (products of the class of trehalose dimycolates), and lipolysaccharides (LPS) which comprise on the one hand lipid chains and, on the other hand, at least one phosphate or sulfate group:
  • lipid A derivatives or analogs mono- or di-saccharide, mono- or diphosphorylated, carrying branched chains or else linear hydrocarbon chains, which may themselves be substituted or not, by linear hydrocarbon chains with means of ester, thioester, ether or thioether bonds, products which, obtained by synthesis or hemisynthesis, have an attenuated toxicity compared to natural Lipid A.
  • a first family is that of analogs or disaccharide derivatives of Lipid A, such as MPL (monophophoryl Lipid A, produced by Ribi immunochem, Research Inc.). These are very hydrophobic structures dispersible in water in a homogeneous manner, in the presence of the above-mentioned derivatives of osides.
  • MPL monophophoryl Lipid A, produced by Ribi immunochem, Research Inc.
  • R 4 and R' ⁇ represent H or P0 4 , with at least R 4 or R'.j being a group P0 4
  • a second family is that of the analogs or monosaccharide derivatives of Lipid A, in particular MRL 953 (product described in PL stuetz et al, in Cellular and molecular aspects of endotoxin reaction A. Nowotny, JJ Spitzec, EJ Zlegler editors. (Elsevier Science Publishers ) 1990, pages 129-144).
  • R. represents H or P0 3
  • R represents P0 3 if R is not P0 3 , or H or one of the meanings given to R 2 and R 3 .
  • Muramylpeptides For the same hydrophobicity reasons as already mentioned with regard to certain Muramylpeptides, their galenical formulation is often difficult. However, like lipophilic Muramylpeptides, they can lead to homogeneous aqueous solutions or dispersions in the presence of the above-mentioned oside derivative.
  • the present invention therefore relates to the use of the compositions according to the invention either alone for stimulating the general defenses of the organism, or with an antigen.
  • the oside derivative and the pharmacologically active substance are, in the combination, advantageously in a weight ratio of 0.25 to 5, in particular from 0.5 to 1.5.
  • the subject of the invention is also the osidic derivatives of formula (I) themselves, since they comprise at least one sulphate group, as well as their process for obtaining according to methods which are conventionally used in synthetic chemistry of mono and oligosaccharides.
  • this methodology proceeds in successive steps starting from the ose or the oligosaccharide to be chemically modified, in order to arrive at the desired derivative, specifically substituted in the desired position.
  • the functions in positions CC 2 , C 3 , C 4 and C 6 of a ose and those corresponding to an oligosaccharide are temporarily protected by protective groups (such as benzyl, benzylidene, acetyl ...) introduced specifically and sequentially on the positions which will not ultimately be the subject of the envisaged chemical modification, taking advantage of the differences in reactivity of said functions.
  • the introduction of the lipophilic groups “type A” or “type B” mentioned above or, moreover, of shorter hydrocarbon chains is advantageously carried out in the following manner: the (or the) primary unprotected hydroxyl functions, can react either in the form substituted by a tosyl group with a fatty acid salt, in the presence of crown ether, or in the free form with a fatty acid chloride, or with the carboxylic function of a fatty acid in the presence of 'a coupling reagent.
  • the derivative obtained is released (deprotection step) from all of its protective groups to result in the desired mono or oligosaccharide derivative.
  • the introduction of the phosphate groups (or groups) is carried out prior to the abovementioned deprotection step, by the so-called phosphite triester method described in Perich, JW et al, Tetrahedron Lett. , (1988), 29., 2369.
  • the introduction of the sulphate group (s) is carried out after the deprotection step mentioned above, in particular by using the trimethylamine-sulfuric anhydride complex according to the method notably described in Ichikawa Y. et al, Carbohydrate Research, 172, (1988), 37-64.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising a composition of the type described above, or a mixture of these compositions, dispersed in a physiologically acceptable aqueous solvent.
  • compositions of the invention can be lyophilized from their aqueous solution or dispersion, and are then in powder form.
  • compositions in the form of dry powder are easily dissolved or dispersed again in an appropriate volume of aqueous solvent.
  • the invention also relates to a method for modifying the solubility properties of a pharmacologically active substance of type (1) described above, this method consisting in the association of substance (1) with an osidic derivative of type (2). ) as described above, under conditions such that when this combination of (1) and (2) is placed in water, a solution (or a dispersion) is obtained which can be used in particular as an injectable preparation, when the the above-mentioned water is sterile.
  • the solubilization of the phar ⁇ macologically active substance (1) is such that one obtains a fluid characterized by a weak opalescence (measurable by nephelometry), the latter being even often absent.
  • This fluid behaves as a solution and is capable of being administered into the body as a solution for injection.
  • the dispersion of a substance in an aqueous medium corresponds to a stable and homogeneous distribution of the molecules of this substance in the mass of this medium, resulting from total or partial solvation by water molecules, and not to a dispersion of this sedimentable substance over time. In particular, no change in physical state is observed in the dispersion within 24 hours of its preparation.
  • compositions described above comprising:
  • the process for obtaining the compositions of the invention is carried out by adding, under the conditions described above, the (or) derivative (s) of sugar to a specified quantity of one (or more) pharmacologically active substance (s).
  • the chloroform solutions (A) and (B) are combined. 5 to 10 ml of distilled water are added and a stream of nitrogen is bubbled from the bottom of the tube containing the two phases, until complete elimination of the chloroform.
  • the aqueous dispersion is lyophilized and the powder obtained is taken up in an aqueous solvent at the desired concentration. A dispersion of the same appearance and quality is obtained as previously.
  • the dispersion obtained is mixed with 0.5 ml of an isotonic solution of ovalbumin at 20 mg / ml. 1 ml of mineral oil (Freund's Incomplete Adjuvant, AIF) is added and the emulsion is carried out.
  • This preparation therefore contains per ml, 0.5 mg of adjuvant, 0.5 mg of P., and 5 mg of ovalbumin b) Methodology
  • the control batches receive a) water / mineral oil emulsion containing the antigen alone, b) the same emulsion containing the adjuvant molecules alone (MDP-GDP).
  • the experimental batches receive the emulsions containing the P sugar derivative.
  • the injections are made subcutaneously in the rear plantar pads of Hartley male guinea pigs weighing 350 g.
  • the animals receive intradermally 0.1 ml of physiological solution alone or containing 0.1 ml of ovalbumin.
  • the induration diameter is measured, which is the sign of the establishment of a state of delayed hypersensitivity.
  • the animals are sacrificed for cardiac puncture and the sera collected.
  • the titration of the circulating antibodies is carried out by the Elisa method according to the conventional methods, in particular those described in: F.AUDIBERT, L. CHEDID, P. LEFRANCIER and J. CHOAY, Immunol. (1976), (21), 143; and M. JOLIVET, F. AUDIBERT, H. GRAS-MASSE, A. TARTAR, D. SCHLESSINGER, R. WITZ and L. CHEDID, Infect. Immunol. (1987), (55), 1498.
  • the figures represent the maximum dilution of the serum allowing an optical density equal to that obtained by using a normal serum diluted 50 times.
  • MDP-GDP is a strong adjuvant of the cell-mediated response and the humoral response and that the addition of P., did not modify their activity.
  • Swiss mice received P MDP-GDP, or MDP-GDP + P 1 by vein 24 hours before infection with 1 x 10 4 Klebsiella pneumoniae.
  • the solution of F. is added to the MDP-GDP to obtain a preparation containing an equivalent quantity of 2 products (weight / weight).
  • TNF tumor necrosis factor
  • LPS bacterial lipopolysaccharide
  • Muramyl peptides stimulate the production of TNF in vitro, but they are clearly less effective than LPS. In vivo, the levels of serum TNF produced after administration of muramyl peptides are below or at the limit of detection possibilities.
  • MDP-GDP and the other derivatives, which have an anti-infectious action, have the property of increasing the response to the LPS injected after, causing a considerable increase in the level of serum TNF.
  • Table II shows the results of an experiment of this type. We see that the pretreatment is more effective 6 hours before the LPS, in particular in the case of the MDP-GPD + P- ,, association but that 16 hours before, the injection of MDP-GDP still has a potentiating effect. of the answer.
  • the blood monocytes are isolated and incubated for 24 hours with different doses of product.
  • the supernatants are removed to measure TNF and IL-6, cytokines which are produced by activated monocytes.
  • Table III shows that the production of TNF is significant only with 10 ⁇ g / ml of MDP-GDP and that the product solubilized with the compound - ⁇ is of slightly higher activity.
  • the assay of IL-6 gives clearer results and also shows a comparable stimulation of monocytes between MDP-GDP and MDP-GDP solubilized in association with P ⁇ d - Action on human polynuclear cells
  • Muramyl-peptides have a direct action on polynuclear cells, which is demonstrated in particular by phagocytosis and the destruction of Candida albicans.
  • the estimation of this action is made by the ability to incorporate glucose treated by the fungus cells that have remained viable.
  • Polynuclear cells (lx 10 6 / ⁇ l) are incubated with the stimulants for 30 minutes and distributed in the microplate wells with a suspension of C. albicans at 1 x 10 4 / m. After 18 hours, the culture medium is eliminated and the incorporation of 3 HD-glucose by the Candida cells is measured after an incubation of 3 hours. 4) Influence of saccharide derivative of P 1 "pyrogenic effect of MDP-GDP.
  • the pyrogenicity tests were carried out on New Zealand rabbits weighing 3 to 4 kg kept in a containment box. The animals received a dose of product in a volume of 0.5 ml / kg intravenously at time zero and their temperature recorded for 5 hours continuously.
  • the recorded temperature differences were:. for group I: 0.15, 0.25; 0.25 ( ⁇ C), an average of: 0.22 ⁇ C ⁇ 0.06; . for group II: 0.40, 0.15, 0.30 ( ⁇ C), ie an average of: 0.28 "C ⁇ 0.12.
  • the minimum pyrogenic dose of MDP-GDP previously determined is equal to: 2 ⁇ g / kg.
  • a dose of 10 ⁇ g / kg was chosen, which gives an approximate temperature increase of 1 ° C.
  • group I 10 ⁇ g / kg of MDP-GDP
  • group II 10 ⁇ g / kg of MDP-GDP + 10 ⁇ g / kg of P- ,.
  • the recorded temperature differences are:. for group I: 0.70, 0.50, 0.85 (° C), an average of: 0.68 ⁇ C ⁇ 0.18; . for group II: 1.15, 0.90, 0.65 ( ⁇ C), or an average of: 0.90 ° C ⁇ 0.25.
  • the dispersed compositions obtained have pharmacological properties which are of the same nature as those reported above for the dispersions of the composition MDP-GDP-P- ,.
  • the chloroform solutions (A) and (B) are combined. 2 to 3 ml of distilled water are added and a stream of nitrogen is bubbled from the bottom of the tube containing the two phases, until complete elimination of the chloroform. A homogeneous and stable, slightly opalescent aqueous dispersion is obtained.
  • the aqueous dispersion is lyophilized and the powder obtained is taken up in an aqueous solvent at the desired concentration. A dispersion of the same appearance and quality is obtained as previously.
  • MPL is dissolved according to the procedure recommended by Ribi immunochem. Research, Inc .. From a solution in the chloroform: methanol mixture (4: 1) of 20 mg of MPL, a stock solution containing 4 mg / ml of MPL is thus prepared, then by addition of physiological serum free of calcium, 2 mg / ml solution.
  • Compound P 1 does not alter the protective effect of MPL against infection by K. pneumoniae.
  • the chloroform solutions (A) and (B) are combined. 2 to 3 ml of water are added and a stream of nitrogen is bubbled from the bottom of the tube containing the two phases, until the chloroform is completely eliminated. A homogeneous and stable aqueous dispersion is obtained, very slightly opalescent.
  • the aqueous dispersion is lyophilized and the powder obtained is taken up in an aqueous solvent at desired concentration.
  • a dispersion of the same appearance and quality is obtained as above, b) Biological properties of the aqueous dispersion of the
  • mice received the day before the intravenous injection:
  • Figures l (a) and l (b) show that the protective effect of MRL 953 is comparable, regardless of the dispersion method used.
  • Figures l (a) and l (b) indeed include curves representative of the variations in the percentages of surviving mice (% on the ordinate axes) as a function of time (T in days on the abscissa axes) when the substances studied (LPS and MPL953) were administered at the doses indicated on the right of the figures, in the form dispersed in: - a glucose solution (figure l (a)) - a solution of the derivative of oside P., (figure l (b))
  • the invention also relates to the application of the compositions according to the invention to the modulation of biological properties of third-party compounds, administered concomitantly or not.
  • Table VI presents the results obtained. As a result, the use of compound P does not decrease, but on the contrary increases the antiviral activity proper to MDP (Thr) 1 -GDP, and the effect of potentiating the antiviral activity of interferon by this. lipophilic muramylpeptide. TABLE VI
  • TNF activity is evaluated by the cytotoxicity test being measured by the number of viable cells.
  • One unit of TNF represents the concentration which produces 50% cytotoxicity under the given conditions.
  • Aqueous suspensions of lipophilic MDP stimulate the TNF response to stimulation by LPS or by the aqueous dispersion of MRL 953 in the presence of P ,. This effect is slightly accentuated with the aqueous dispersions of these lipophilic MDPs in the presence of the compound P- ,.
  • MDP-GDP suspended in 0.2 ml of physiological saline, alone, or in a glucose solution in the presence of pluronic acid (F 68, SERVA), or else in dispersion in 0.2 ml of physiological saline in presence of compound P 1f is administered intravenously with LPS (S. enteritidis) to Swiss adrenalecto isis mice.
  • LPS S. enteritidis

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Abstract

L'invention concerne toute composition caractérisée en ce qu'elle comprend: d'une part, un principe actif de médicament ou substance pharmacologiquement active, insoluble dans l'eau, cette substance étant substituée par au moins un groupement lipophile, et d'autre part, un dérivé osidique dont l'une au moins des fonctions hydroxyles est substituée par un ou plusieurs groupe(s) phosphate ou sulfate, ce composé étant également substitué par un groupement lipophile, cette composition étant susceptible d'être solubilisée ou dispersée de façon homogène dans un solvant aqueux. L'invention concerne également l'utilisation de telles compositions, notamment en tant que compositions pharmaceutiques en solution dans un solvant aqueux physiologiquement acceptable.

Description

COMPOSITIONS A BASE DE PRINCIPES ACTIFS DE MEDICAMENTS HYDROPHOBES SOLUBILISABLES DANS UN SOLVANT AQUEUX
L'invention concerne des compositions comprenant des principes actifs de médicaments hydrophobes, néanmoins solubilisables dans un solvant aqueux.
L'invention concerne également un procédé d'obtention de telles compositions, et leurs utilisations notamment en tant que compositions pharmaceutiques.
De nombreux produits utilisés dans le domaine pharmaceutique, ou susceptibles de l'être, ne peuvent être solubilisés dans un solvant aqueux.
Cette insolubilité dans un solvant aqueux est particulièrement désavantageuse pour des produits destinés à être administrés dans une solution physiologique aqueuse du type de celles habituellement utilisées pour les préparations injectables. Elle l'est aussi pour les produits destinés à être administrés par voie orale et qui présentent une efficacité et une biodisponibilité réduite.
Parmi ces produits pharmacologiquement actifs et insolubles dans un solvant aqueux, on peut citer notamment, les dérivés lipophiles de mura yl-peptides, tels que ceux décrits dans le brevet européen n* 0 165 123 du 10/05/1985, ou encore dans le brevet européen 4512 du 20/03/1979.
De fait, ces produits sont des immunomodulateurs capables d'augmenter la réponse immune spécifique (adjuvant de vaccin) , ou de renforcer la résistance non-spécifique (agent anti-infectieux) . De nature très hydrophobe, ils donnent des suspensions aqueuses difficiles à disperser de façon totalement satisfaisante (notamment en regard du niveau de dispersion compatible avec la possibilité de les injecter à un patient) , en utilisant les divers moyens de mise en solution ou de dispersion aqueuse, basés sur des techniques connues, notamment des traitements mécaniques, ou encore l'utilisation de solvants organiques ou de surfactants.
La présente invention a précisément pour but de fournir des moyens permettant la solubilisation ou la dispersion homogène dans un solvant aqueux de produits hydrophobes, tels que les uramyl-peptides lipophiles, ou d'autres principes actifs de médicaments lipophiles, porteurs de chaines hydrocarbonées. Celles-ci contribuent parfois elles-mêmes à la faible solubilité, de ces produits dans l'eau, voire à l'instabilité de leurs dispersions aqueuses.
L'invention concerne d•une manière générale une composition susceptible d'être solubilisée ou dispersée de façon homogène et stable dans une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable, caractérisée par l'association : d'une part, d'un principe actif lipophile de médicament ou "substance pharmacologiquement active", comprenant au moins un groupe hydrocarboné comportant lui-même au moins 3 atomes de carbone, et - d'autre part, d'un dérivé osidique solubilisateur, lui-même hydrosoluble, pharmaceutiquement acceptable, portant lui-même un groupe hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone et comprenant une ou plusieurs fonctions hydroxyle, dont au moins l'une est substituée par un groupe phosphate ou sulfate, ce dérivé osidique étant en une proportion suffisante par rapport au principe actif lipophile pour promouvoir la solubilisation ou la dispersion de l'ensemble de la composition dans une solution aqueuse.
La mise en solution ou en dispersion des deux constituants sus-définis de la composition fait apparemment intervenir la constitution de liaisons de type Van der Walls entre leurs chaînes hydrocarbonées respectives. Souvent les liaisons de Van der Walls seront d'autant plus efficaces qu'elles seront nombreuses et donc, que les chaînes hydrocarbonées seront plus longues. Il va de soi que ces longueurs de chaînes ne doivent pas, surtout en ce qui concerne le dérivé osidique hydrosoluble, excéder celles qui auraient pour effet de trop accroître sa lipophilie.
Il est entendu que, dans ce qui précède et ce qui suit, "lipophile" doit être entendu comme signifiant que la substance concernée présente dans un système bi-phasique (solution aqueuse - solution organique) un coefficient de partage favorable à la phase organique ; en d'autres termes la substance lipophile est plus soluble dans la solution organique que dans la solution aqueuse. La substance lipophile peut même être pratiquement insoluble dans l'eau.
A l'inverse, et dans la présente description, l'adjectif "hydrosoluble" a la signification inverse. Le coefficient de partage de la substance hydrosoluble dans le susdit système bi-phasique est en faveur de la phase aqueuse.
On peut faire l'hypothèse que le pouvoir solubilisateur du dérivé osidique est attribuable aux présences simultanées dans la structure de ce dérivé osidique dudit (ou desdits) groupement(s) hypocarboné(s) et du (ou des) groupe(s) sulfate ou phosphate. Les groupements hydrocarbonés permettent 1'établissement de liaisons du type Van der Waals avec la (les) chaine(s) hydrocarbonée(s) du principe actif et le (ou les) groupe(s) sulfate ou phosphate permet(tent) la solubilisâtion du complexe non covalent ainsi formé.
Le cas échéant, les longueurs des chaînes hydrocarbonées respectivement portées par la substance active lipophile d'une part, le dérivé solubilisateur hydrosoluble , d'autre part, sont choisies de façon à favoriser l'établissement des susdites liaisons de type Van der Waals.
La substance pharmacologiquement active peut être constituée par toute substance répondant aux critères indiqués plus haut. D'une façon générale, on remarque que la lipophilie de la substance pharmacologiquement active peut résulter soit de la longueur des chaînes hydrocarbonées qu'elle porte, soit - et en particulier lorsque ces chaînes hydrocarbonées sont courtes - du nombre de ces chaînes, soit encore, bien entendu, de la conjugaison des longueurs et du nombre de ces chaînes hydrocarbonées.
On l'a déjà vu, la substance active peut être constituée par tout dérivé de muramyl-peptide comportant une chaîne hydrocarbonée tendant à réduire lτhydrosolubilité du muramyl-peptide correspondant, dès lors qu•il serait dépourvu de ladite chaîne hydrocarbonée. Une catégorie préférée de tels muramyl-peptides dits "lipophiles" est encore illustrée ci-après.
Une autre catégorie de composés préférés est constituée par des dérivés ou analogues saccharidiques, notamment mono- ou di-saccharidiques du lipide A. Certains exemples préférés de ces analogues sont évoqués plus loin. D'autres substances pharmaceutiques peuvent également être solubilisées en mettant en oeuvre les techniques de l'invention.
Parmi celles-ci, il faut citer en particulier les peptides cycliques de la famille de la cyclosporine, par exemple la cyclosporine A (J.F. Borel et al, Agents Actions - 6 (1976) 1 + 68; is, Immumnology 32 (1977) 1017 ; P.J. Tudchka et al., Blood 61 (1983) 318) mais aussi les pseudopeptides cycliques, par exemple la valinomycine ou des macrolides polyéniques, par exemple la lucensomycine , et les vitamines liposolubles, notamment vitamines A, D, E, K,
D'une façon générale toute substance pharmacologiquement active du type polyénique, mono ou poly-saccharidique, polypeptidique, à caractère cyclique ou non, ou encore glycopeptidique, qui porte au moins une chaîne hydrocarbonée telle qu'elle a été définie plus haut, peut être former le constitutant lipophile des compositions selon l'invention. L'invention s'applique en particulier à la solubilisation de substances pharmacologiquement actives, dont le caractère de solubilité s'avérerait insuffisant pour une application médicale, quelle que soit la voie d'administration envisagée, dès lors qu'elle comporte une chaîne hydrocarbonée qui peut s'associer, par l'intermédiaire de liaisons de type Van de Waals, avec une chaîne hydrocarbonée correspondante portée par un dérivé osidique, tel qu'il a été défini plus haut.
Quant au dérivé osidique hydrosoluble, il convient de noter que l'expression "osidique" telle qu'utilisée ci-dessus, et dans ce qui suit, se rapporte de façon générale à tout produit comprenant dans sa structure un (ou plusieurs) résidu(s) saccharidique(s) . D'une manière générale, tout dérivé osidique tel que défini ci-dessus est utilisable dans les compositions de l'invention, dès lors que ce dérivé n'entraîne pas une modification des propriétés pharmacologiques de la substance active sus¬ mentionnée, telle que cette dernière deviendrait inactive ou toxique.
Les chaînes hydrocarbonées portées, soit par la substance pharmacologiquement active, soit par le dérivé d'oside, sont avantageusement elles-mêmes des groupements lipophiles. Elles sont notamment constituées :
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci- après par groupement lipophile "de type A",
. soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci- après par groupement lipophile "de type B".
Une catégorie de dérivés osidiques préférés pour la production de compositions conformes à l'invention sont ceux qui répondent à la formule (I) suivante :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle :
- R représente un groupement hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbones, notamment un groupement lipophile "de type A" ou "de type B",
- représente H, ou OH, ou un groupement acétamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido,
- R3 et R4, identiques ou différents, représentent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate,
- R représente soit H, soit OH, ou 0CH3, ou encore un résidu ose ou osamine dont le carbone anomérique en position 1 (Cl) est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituées par des groupes R'2, R'3, et R'4 ayant respectivement les significations données ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un groupe R' ayant la signification donnée ci-dessus pour
R, l'un au moins des groupes R2, R'g/ R3, R'3, R4 ou R' représentant un résidu sulfate ou phosphate.
A titre d'exemple de dérivés osidiques répondant à la formule (I) sus-mentionnée, on peut citer les composés suivants :
- α ou β-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-OR- 2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine,
- a ou 0-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano- se,
- 4-sulfate-6-OR-glucopyranose,
- 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-α,α'-D-tréhalose, R ayant la signification indiquée ci-dessus.
Il va de soi que les groupements lipophiles ne doivent pas être d'une longueur telle ou en un nombre tel que l'ensemble du dérivé osidique tendrait à devenir insoluble.
Des dérivés osidiques préférés sont choisis parmi les composés suivants :
- α ou 0-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6- octanoyl-2-désoxy -glucosamine,
- α ou 9-méthyl-glycoside-N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3- dipalmitoyl) glycéroyl-2-désoxy-glucosamine,
- N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine,
- N-acétyl-4-sulfate-6- (2 , 3-dipalmitoyl) -glycéroyl-2- désoxy-D-glucosamine ,
- α ou 0-méthyl-glycoside 4 -suif ate-6 -octanoyl-glu- copyranoside ,
- a ou 3-méthyl-glycoside 4-sulfate-6- (2 , 3-dipalmi- toyl) -glycéroyl-D-glucopyranoside ,
- 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose,
- 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glycéroyl- glucopyranose
- 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl-α,α'-D-tréhalose,
- 4,4'di-sulfate-6,6• (2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-α-α*- D-tréhalose.
Certaines catégories de compositions conformes à 1•invention seront encore davantage - et de façon non limitative - illustrées dans ce qui suit.
Les deux groupements hydrocarbonés, le cas échéant, lipophiles par eux-mêmes, assurant respectivement une association non covalente entre la substance pharmacologiquement active et le dérivé d'oside, sont des structures hydrocarbonées linéaires. Cependant de manière avantageuse, ces groupements sont tels que l'un d'entre eux est composé d'une structure hydrocarbonée linéaire, tandis que l'autre est constitué d'une structure hydrocarbonée ramifiée.
La structure hydrocarbonée ramifiée est alors de préférence choisie parmi celles constituées d'une chaîne hydrocarbonée ramifiée, dont les ramifications prennent naissance sur deux atomes de carbone adjacents, ou au plus séparés par un atome de carbone.
De préférence la structure hydrocarbonée linéaire doit alors, pour s'associer à la chaîne hydrocarbonée ramifiée, avoir une longueur suffisante permettant l'instauration de liaisons non covalentes, notamment du type Van der Walls, avec l'une au moins des ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
Ainsi, l'association de la substance pharmacologiquement active et du dérivé osidique s'effectue-t-elle par 1'intermédiaire de leurs groupements hydrocarbonés, voire lipophiles respectifs, dès lors que s'établissent des liaisons non covalentes suffisamment fortes pour permettre à la structure hydrocarbonée linéaire, d'être maintenue dans une position dite en "sandwich" entre les deux ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
De préférence, la structure hydrocarbonée linéaire possède un nombre d'atomes de carbone au plus égal au nombre d'atomes de carbone des ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
L'association du dérivé osidique tel que décrit ci-dessus, de nature amphiphile et hydrosoluble, à la substance pharmacologiquement active hydrophobe et insoluble dans l'eau, permet la dispersion homogène de cette dernière dans un solvant aqueux.
L'invention a plus particulièrement pour objet, toute composition susceptible d'être solubilisée ou dispersée de façon homogène dans un solvant aqueux, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu¬ ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par un groupement lipophile "de type A", . soit par un groupement lipophile "de type B",
(2) un dérivé osidique associé de façon non covalente à la substance (1) , ce dérivé osidique étant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B",
. soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
D'une manière générale, toute substance pharmacologiquement active, notamment de nature insoluble dans un solvant aqueux, et sur lequel est susceptible d'être greffé au moins un groupement lipophile "de type A" ou "de type B" sus-mentionnés ou plus généralement une chaîne hydrocarbonée plus courte, peut être utilisé en tant que substance pharmocologiquement active entrant dans les compositions de l'invention.
Les techniques décrites plus loin à titre d'exemples pour le greffage de ces groupements lipophiles ou chaînes hydrocarbonées sur des dérivés d'oside sont également applicables au greffage de chaînes de même nature sur les substances phamacologiquement actives insolubles, dès lors qu'elles en seraient elles-mêmes dépourvues.
Parmi les substances pharmacologiquement actives (ou principes actifs lipophiles) entrant dans les compositions de l'invention, on peut citer les dérivés lipophiles de muramyl-peptide répondant à la formule (II) suivante :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle
- R représente H ou CH3 ;
- R 6. représente un groupe -NH2, -OH ou un groupe -OW
W1 étant un groupe hydrocarboné comportant de 1 à 10 atomes de carbone ;
X représente un résidu aminoacyle du groupe comprenant alanyle, valyle, isoleucyle, norleucyle, leucyle, thréonyle, prolyle, glutaminyle, asparaginyle, éthionyle, tryptophanyle, phénylalanyle, tyrosyle, glycyle ; - Y représente soit OH, soit NH2, ou un groupe -OW2, W2 étant un groupe hydrocarboné de 1 à 4 atomes de carbone, ou encore un groupement lipophile du type A ou du type B,
- Z représente soit H, soit un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", étant cependant entendu que l'un au moins des deux groupes Y et Z est toujours constitué par un groupement lipophile "de type A" ou "de type B" ;
- n-| et n2, identiques ou différents, représentent zéro ou 1,
- A, et B, sont soit des groupes respectivement identiques ou différents comprenant de 1 à 3 résidus aminoacyles, eux-mêmes identiques ou différents entre eux, ou encore un groupe -NH-(CH2)p-CO- avec des valeurs de p comprises entre 2 et 10.
Une composition particulièrement préférée de l'invention, comprend des composés de formule (II) sus-mentionnée, dans laquelle
- n-j et n2 représentent zéro,
- Rg représente CH3,
- Rf. représente -OH, -NH2 ou -On (CH ) H avec x, compris entre 1 et 6, avec une préférence pour X!=4, -X est L ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle,
- lorsque Y représente -0-CH2-CHO(R7)-CH20(R8) , Z représente H, et lorsque Z représente
O
II
-C-CHO(R7)-CH20(R8) , Y représente -OH, -NH2 ou un groupe -0W2j W2 ayant la signification indiquée ci- dessus, et R7 et R8 étant des groupes palmitoyle.
Une autre composition préférée de l'invention comprend des composés de formule (II) sus-mentionnée, dans laquelle : - n, et n représentent zéro,
- R5 représente CH3
- R_ représente -OH, ou -NH ou On (CH2) H avec x^ compris entre 1 et 6, avec une préférence pour x1≈4, -X est L ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle,
- lorsque Y représente -0-(CH2)xH avec x2 = 8, Z représente H, et lorsque Z représente -C0(CH2)xH, avec x = 8, Y représente -OH, -NH2, ou un groupe -OW , W2 ayant la signification indiquée ci-dessus.
La substance biologiquement active susceptible d'être associée avec les dérivés d'osides, définis plus haut, pour former des compositions solubilisables ou dispersables conformes à l'invention, peut encore appartenir à d'autres catégories de produits. Il s'agit, par exemple de substances immunomodulatrices, sélectionnées parmi :
- des constituants d'origine bactérienne, entre autres des constituants de la paroi bactérienne : dérivés du tréhalose, notamment du type du TDM (produits de la classe des tréhalose dimycolates) , et lipolysaccharides (LPS) qui comportent d'une part des chaînes lipidiques et, d'autre part, au moins un groupe phosphate ou sulfate :
- des fractions lipidiques obtenus à partir de ces LPS, en particulier le "Lipide A" (cf par exemple article de Ernst Th. Rietschel et al intitulé "Molecular structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity" (Structure moléculaire des endotoxines bactériennes en relation avec leur bioactivité) dans l'ouvrage lui-même intitulé "Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions" (Aspects cellulaires et moléculaires des réactions mettant en oeuvre des endotoxines) , sous la direction de A. Nowotny, J.J. Spitzer et E.J. Ziegler ; 1990, Elsevier Science Publishers B.V. (Division biomédicale) , pages 15-32) ; on rappelle pour mémoire la formule du "Lipide A" (III) :
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000016_0001
(CH2)y (CH2)χ COO CH ! I I I CH3 CH3 (CH2)y (CH2> i \ CH3 CH3 x = 10 y - 12
- des analogues des précédents constituants d'origine bactérienne ou des produits (naturels, hémisynthétiques ou de synthèse) correspondant à des fragments de ces constituants d'origine bactérienne, notamment des dérivés détoxifiés. On mentionnera tout particulièrement des dérivés ou analogues du lipide A, mono- ou di-saccharidiques, mono- ou diphosphorylés, porteurs de chaînes ramifiées ou encore de chaînes hydrocarbonées linéaires, pouvant être elles-mêmes substituées ou non, par des chaînes hydrocarbonées linéaires au moyen de liaisons ester, thioester, éther ou thioether, produits qui, obtenus par synthèse ou hémisynthèse, ont une toxicité atténuée par rapport au Lipide A naturel. Une première famille est celle des analogues ou dérivés disaccharidiques du Lipide A, tel que les MPL (monophophoryl Lipid A, produit par Ribi immunochem, Research Inc.) . Ce sont des structures très hydrophobes dispersables dans l'eau de façon homogène, en présence des susdits dérivés d'osides.
Ces analogues du Lipide A répondent à la formule générale (IV) ,
Figure imgf000017_0001
dans laquelle:
R4 et R'τ représentent H ou P04, avec au moins R4 ou R'.j étant un groupe P04
R2, R3 et R'2, R'3 représentent CO-CH(OR)-(CH2)X-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant C0-(CH2)y-CH3 y étant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12.
Une deuxième famille est celle des analogues ou dérivés monosaccharidiques du Lipide A, notamment le MRL 953 (produit décrit dans P.L. stuetz et al, in Cellular and molecular aspects of endotoxin reaction A. Nowotny, J.J. Spitzec, E.J. Zlegler éditeurs. (Elsevier Science Publishers) 1990, pages 129-144).
Ces analogues et dérivés monosaccharidiques du Lipide A répondent à la formule générale (V) :
Figure imgf000018_0001
NHR2
dans laquelle :
R., représente H ou P03
R2 et R3 représentent CO-CH(R)-(CH2)x-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant H ou OH ou encore CO-(CH2)y-CH3, y étant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12,
R représente P03 si R n'est pas P03, ou H ou encore l'une des significations données à R2 et R3.
Pour les mêmes raisons d'hydrophobicité que déjà évoquées à propos de certains Muramylpeptides, leur formulation galénique est souvent difficile. Néanmoins, comme les Muramylpeptides lipophiles ils peuvent conduire à des solutions ou dispersions aqueuses homogènes en présence du susdit dérivé d'oside.
La présente invention concerne donc l'utilisation des compositions selon 1*invention soit seules pour stimuler les défenses générales de l'organisme, soit avec un antigène.
Le dérivé d'oside et la substance pharmacologiquement active sont, dans l'association, avantageusement dans un rapport pondéral de 0,25 à 5, notamment de 0,5 à 1,5. L'invention a également pour objet les dérivés osidiques de formule (I) eux-mêmes, dès lors qu'ils comportent au moins un groupe sulfate, ainsi que leur procédé d'obtention selon des méthodes qui sont classiquement utilisées en chimie de synthèse des mono et des oligosaccharides.
A titre illustratif, cette méthodologie procède par étapes successives à partir de 1'ose ou de l'oligosaccharide à modifier chimiquement, pour parvenir au dérivé recherché, spécifiquement substitué sur la position voulue. Pour ce faire, les fonctions en positions C C2, C3, C4 et C6 d'un ose et celles correspondantes d'un oligosaccharide, sont protégées temporairement par des groupements protecteurs (tels que benzyle, benzylidène, acétyle...) introduits spécifiquement et séquentiellement sur les positions qui ne seront pas finalement l'objet de la modification chimique envisagée, en tirant partie des différences de réactivité desdites fonctions.
Puis 1'introduction des groupements lipophiles "de type A" ou "de type B" sus-mentionnés ou d'ailleurs de chaînes hydrocarbonées plus courtes, est avantageusement effectuée de la manière suivante : les (ou la) fonctions hydroxyles primaires non protégées, peuvent réagir soit sous forme substituée par un groupe tosyle avec un sel d'acide gras, en présence d'éther couronne, soit sous forme libre avec un chlorure d'acide gras, ou avec la fonction carboxylique d'un acide gras en présence d'un réactif de couplage.
Après introduction des (ou de la) modifications chimiques envisagées sur les (ou la) positions restées libres, le dérivé obtenu est libéré (étape de déprotection) de tous ses groupements protecteurs pour aboutir au dérivé mono ou oligosaccharidique voulu. Le cas échéant, l'introduction des (ou du) groupes phosphates est réalisée préalablement à l'étape de déprotection sus-mentionnée, par la méthode dite phosphite triester décrite dans Perich, J.W. et al, Tetrahedron Lett. , (1988), 29., 2369.
L'introduction du (ou des), groupe(s) sulfate est réalisée après l'étape de déprotection sus-mentionnée, notamment par utilisation du complexe triméthylamine- anhydride sulfurique selon la méthode notamment décrite dans Ichikawa Y. et al, Carbohydrate Research, 172, (1988), 37-64.
L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant une composition du type de celles décrites ci-dessus, ou un mélange de ces compositions, dispersée(s) dans un solvant aqueux physiologiquement acceptable.
De manière avantageuse, les compositions de l'invention peuvent être lyophilisées à partir de leur solution ou dispersion aqueuse, et se présentent alors sous forme de poudre.
Ces compositions sous forme de poudre sèche, sont aisément solubilisées ou dispersées à nouveau dans un volume approprié de solvant aqueux.
L'invention concerne également un procédé de modification des propriétés de solubilité d'une substance pharmacologiquement active du type (1) décrite ci-dessus, ce procédé consistant en l'association de la substance (1) avec un dérivé osidique de type (2) tel que décrit ci-dessus, dans des conditions telles que lorsque cette association de (1) et (2) est mise dans l'eau, on obtient une solution (ou une dispersion) utilisable notamment en tant que préparation injectable, lorsque l'eau sus¬ mentionnée est stérile. La solubilisation de la substance phar¬ macologiquement active (1) est telle que l'on obtient un fluide caractérisé par une faible opalescence (mesurable par néphélométrie) , celle-ci étant même souvent absente.
Ce fluide se comporte comme une solution et est susceptible d'être administré dans l'organisme en tant que solution injectable. La dispersion d'une substance dans un milieu aqueux correspond à une répartition stable et homogène des molécules de cette substance dans la masse de ce milieu, résultant d'une solvatation totale ou partielle par des molécules d'eau, et non à une dispersion de cette substance sédimentable avec le temps. En particulier on n'observe aucun changement d'état physique dans la dispersion dans les 24 heures qui suivent sa préparation.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention des compositions décrites ci-dessus comprenant :
- la solubilisation du (ou des) dérivé osidique dans une quantité déterminée d'un solvant aqueux,
- l'addition sous agitation à la solution précédemment obtenue, d'une quantité déterminée d'une (ou plusieurs) substance pharmacologiquement active, soit en suspension dans un solvant aqueux, soit en solution dans un solvant organique,
- le cas échéant, l'élimination du solvant organique,
- le cas échéant encore, la lyophilisation de la solution précédente.
En variante, le procédé d'obtention des compositions de l'invention est réalisé en additionnant, dans les conditions précédemment décrites, le (ou les) dérivé(s) osidique(s) à une quantité déterminée d'une (ou plusieurs) substance(s) pharmacologiquement active(s) .
L'invention est davantage illustrée dans la description détaillée qui suit, sans que cette dernière ne revête un caractère limitatif.
Description de la synthèse du sel de sodium du 6,6' di-octanoyl- , •-disulfonyl-α,o«-D-tréhalose (ou com¬ posé i)
.6,6'octanoyl-2,3-2' ,3• ,tétra-O-benzyl-α , '-D-tréhalo¬ se
Dissolution dans le THF sec (50 ml) , sous argon, à l'abri de la lumière de 3 mmoles de 2,3-2* ,3'- tetra-0-benzyl-α,α'-D-tréhalose (A.F. Hadfield, L. Hough, and A.C. Richardson - Carbohyd. Res. 63, (1978), 51) de 7,5 mmoles d'acide octanoïque, et de 7,87 mmoles de triphénylphosphine. A la solution refroidie à 0°C, addition en 15 minutes d'une solution de diisopropylazodicarboxylate (8,02 mmoles) dans le THF sec (25 ml) . Purification sur silice 60 H sous pression dans le mélange de toluène/CH2Cl2/AcoET : 30/10/5. Huile : m = 2,58 g (90 %) .
. Sel de sodium du 6,6'-dioctanoyl-2,3-2',3'-tetra-0- benzyl-4.41-di-sulfonyl-o,α'-D-tréhalose.
A 1,5 mmole du produit précédent en solution dans le DMF sec (15 ml) , addition de 15 mmoles de complexe triméthylamine/anhydride sulfurique (2,1 g) et incubation à 50°C en conditions anhydrides pendant 2 jours. Addition de CH30H (10 ml), puis, extension par du chloroforme (10 ml) et percolation sur Sephadex LH20 dans le mélange CHC13-CH30H : I/I. Après concentration, purification sur colonne de silice 60H sous pression, dans le mélange CHC13-CH30H-H20 : 15/5/05 (1,7 g : huile). Dissolution dans le mélange DMF-H20 : I/I (80 ml) et percolation sur colonne de résine Dowex 50 WX4 H+ (85 ml) par élution avec le même mélange de solvants : neutralisation par NaOH 0,1N : lyophilisation m = 1, 51 g (87 %) . . Sel de sodium du 6,6'-dioctanoyl-4,4'-di-0-sulfonyl- ,α*-D-tréhalose (C28 H48Na2°19s2 : 798,79)
1,5 g du dérivé précédent, solubilisé dans 150 ml d'un mélange eau/alcool (6,5/10), est hydrogéné en présence de 750 mg de Pd/C à 10 %. Après filtration, concentration,lyophilisation en solution aqueuse. Purification sur silice 60-G dans CHCl3-CH3OH-CH3COOH- H20 : 40/20/8/2. Concentration, coévaporation avec du toluène, lyophilisation en solution aqueuse. Percolation sur Sephadex LH20 dans le méthanol. Concentration dessiccation, lyophilisation en solution dans l'eau m = 525 mg (51 %) .
Teneur en sulfate : 2,7 Eq/g (conductimétrie) . teneur en acide octanoïque : 1,97 Eq/mole (CPV) .
EXEMPLES DE MISES EN OEUVRE DU DERIVE D'OSIDE Pi DANS DES COMPOSITIONS CONFORMES A L'INVENTION
EXEMPLE - I :
1) : Description de mises en oeuvre de la dispersion aqueuse de MDP-GDF, c'est-à-dire le α(N-acetyl-mura- myl-L-alanyl- D-isoglutamine) -/3,7-dipalxnitoyl-sn-Gly- cerol, avec le composé P^
- Premier mode de mise en oeuyre
10 mg de P1 sont dissous dans 10 ml d'eau distillée. A la solution sont ajoutés 10 mg de MDP- GDP, sous forte agitation. La dispersion aqueuse obtenue est d'aspect opalescent et ne sédimente pas ou très peu, (une nouvelle agitation permet d'obtenir à nouveau la dispersion homogène) . Après lyophilisation, on peut par addition d'eau ou de soluté physiologique, reconstituer une dispersion d'aspect identique. Deuxième mode de mise en oeuvre 22
Mode de mise en oeuvre 2.20,57 mg de MDP-GDP sont dissous dans 2 ml de chloroforme (solution A) . 20 mg de P., sont dissous dans 1 ml de chloroforme (solution B) .
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont réunies. On ajoute de 5 à 10 ml d'eau distillée et on fait barboter un courant d'azote à partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'à élimination complète du chloroforme.
On obtient une dispersion aqueuse homogène et stable, légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisée et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la concentration désirée. On obtient une dispersion de même aspect et qualité que précédemment.
Le procédé permet une formulation galénique aisée des principes actifs de médicaments lipophiles correspondant à la formule générale (II) . Il en résulte des préparations qui conservent les activités pharmacologiques de ces produits, notamment en tant que régulateur de la réponse immune, telles qu'elles ont été revendiquées dans le brevet européen n° 0 165 123 .
2) : Influence de l'utilisation de i sur l'activité adjuvante du MDP-GDP étudiée chez le cobaye. a) Préparation de l'émulsion
1 mg de P1 est dissous dans 0.5 ml de soluté physiologique, cette solution est ajoutée goutte à goutte à 1 mg de MDP-GDP en poudre.
La dispersion obtenue est mélangée à 0,5 ml d'une solution isotonique en ovalbumine à 20 mg/ml. Elle est additionnée de 1 ml d'huile minérale (Adjuvant Incomplet de Freund, AIF) et on procède à l'émulsion. Cette préparation contient donc par ml, 0,5 mg d'adjuvant, 0,5mg de P., et 5 mg d'ovalbumine b) Méthodologie
Les lots témoins reçoivent a) de l'émulsion eau/huile minérale contenant l'antigène seul, b) la même emulsion contenant les molécules adjuvantes seules (MDP-GDP) . Les lots expérimentaux reçoivent les émulsions contenant le dérivé osidique P,. Les injections se font par voie sous cutanée dans les coussinets plantaires arrières de cobayes mâles Hartley pesant 350 g. Après 3 semaines les animaux reçoivent par voie intradermique 0,1 ml de soluté physiologique seul ou contenant 0,1 ml d'ovalbumine. Après 48 heures, on mesure le diamètre d'induration qui est le signe de l'établissement d'un état d'hypersensibilité retardée. Après 24 heures, les animaux sont sacrifiés p, r ponction cardiaque et les sérums recueillis. Le titrage des anticorps circulant se fait par la méthode Elisa suivant les modalités classiques, notamment celles décrites dans : F.AUDIBERT, L. CHEDID, P. LEFRANCIER and J. CHOAY, Immunol. (1976), (21), 143 ; et M. JOLIVET, F. AUDIBERT, H. GRAS-MASSE, A. TARTAR, D. SCHLESSINGER, R. WITZ and L. CHEDID, Infect. Immunol. (1987), (55), 1498.
c) Résultats
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau suivant :
IMMUNISATION HYPERSENSIBILITE TITRE ANTI¬ RETARDEE - CORPS ELISA diamètre d*indu¬ ration mm
AIF 0.0.0.0 22.000, 37.000, 65.000, 95.000
AIF+P, 0.0.0.0 7.000, 8.000, 100 μg 21.000.
AIF+MDP-GDP lOOμg 8,14,15,17 241.000,295.000 325.000,641.000.
AIF+MDP-GDP 5,16,20,25 157.000,275.000, lOOμg+P, 275.000,318.0000. 100 μg
: Tous les animaux ont reçu 1 mg d'ovalbumine.
Les chiffres représentent la dilution maximum du sérum permettant d'obtenir une densité optique égale à celle obtenue en utilisant un sérum normal dilué 50 fois.
Ces résultats montrent que le MDP-GDP est un fort adjuvant de la réponse à médiation cellulaire et de la réponse humorale et que l'addition de P., n'a pas modifié leur activité.
3) : Influence du dérivé osidique Pi sur les propriétés immunostimulantes des muramyl-peptides. a - Activité anti-infectieuse
Les souris Swiss ont reçu P le MDP-GDP , ou le MDP-GDP + P1 par voie veineuse 24 heures avant l'infection par 1 x 104 Klebsiella pneumoniae. La solution de F. est ajoutée au MDP-GDP pour obtenir une préparation contenant une quantité équivalente de 2 produits (poids/poids) .
Les résultats du tableau I montrent que P1 seul n'a aucune action protectrice contre l'infection. La comparaison de l'activité des différentes doses de MDP-GDP, seul ou avec P1f ne montre pas de différences significatives.
On peut conclure de ces expérimentations que le composé P. n'inhibe pas 1'activité anti-infectieuse du MDP-GDP. b - Action du MDP-GDP sur la production de TNF circulant
Le TNF (tumor necrosis factor) , est une protéine synthétisée par les cellules r_ la lignée monocytes/macrophages lorsqu'elles sonr stimulées. Le LPS (lipopolysaccharide bactérien) est un inducteur très puissant de la production TNF. Les muramyl¬ peptides stimulent in vitro la production de TNF mais ils sont nettement moins efficaces que le LPS. In vivo, les taux de TNF sérique produit après 1'administration de muramyl-peptides sont au-dessous ou à la limite des possibilités de détection.
Le MDP-GDP, et les autres dérivés, qui ont une action anti-infectieuse, ont la propriété d'augmenter la réponse au LPS injecté après, provoquant une augmentation considérable du taux de TNF sérique. Le tableau II représente les résultats d'une expérience de ce type. On voit que le prétraitement est plus efficace 6 heures avant le LPS, en particulier dans le cas de l'association MDP-GPD + P-,, mais que 16 heures avant, l'injection de MDP-GDP a encore un effet de potentialisation de la réponse. c - Action du MDP-GDP in vitro sur les monocytes du sang humain.
Les monocytes du sang sont isolés et incubés pendant 24 heures avec différentes doses de produit. Les surnageants sont prélevés pour doser le TNF et l'IL-6, cytokines qui sont produites par les monocytes activés.
Le Tableau III montre que la production de TNF n'est significative qu'avec 10 μg/ml de MDP-GDP et que le produit solubilisé avec le composé - ^ est d'une activité légèrement plus élevée. Le dosage de l'IL-6 donne des résultats plus nets et montre également une stimulation comparable des monocytes entre le MDP-GDP et le MDP-GDP solubilisé en association avec P^ d - Action sur les polynucléaires humains
Les muramyl-peptides ont une action directe sur les polynucléaires qui est mise en évidence notamment par la phagocytose et la destruction de Candida albicans.
L'estimation de cette action est faite par la capacité d'incorporer du glucose traité par les cellules du champignon restées viables.
Dans les deux expériences reportées sur le Tableau IV, les cellules témoins non stimulées ont déjà une activité de base relativement élevée. Toutefois, l'addition du muramyl-peptide, avec ou sans P-j, produit une augmentation de l'activité inhibitrice des cellules sur la croissance du champignon.
En conclusion, que ce soit dans les expériences faites in vivo chez la souris ou in vitro avec les cellules humaines, la solubilisation du MDP-GDP par le composé P., ne diminue jamais son activité. Le composé P.] seul est toujours inactif. TABLEAU I
Action protectrice du MDP-GDP solubilisé par le composé Pi chez la souris infectée par Klebsiella pneumoniae
Traitement i.v., Survie à J + 15 % Protection* à J-l
37,5 ns 37,5 ns 68,7 P < 0.01 37,5 ns
37,5 ns 37,5 ns 43,7 P < 0.02
Figure imgf000029_0001
75 P < 0.02
* : Les calculs statistiques sont faits en tenant compte pour chaque lot de leurs témoins respectifs. TABLEAU II
Influence du prétraitement par le MDP-GDP solubilisé par P1 sur la réponse TNF induite par le LPS
Traitement avec lOOμg LPS iv Activité TNF dans le iv/souris avant le LPS 25 μg sérum*
U/ml μg/ l
h-6 P-,
h-6 MDP-GDP/P-,
h-6 MDP-GDP h-6 MDP-GDP/P,
h-16 MDP-GDP h-16 MDP-GDP/P,
Figure imgf000030_0001
: 2 heures après 1'injection d'épreuve avec le LPS Activité exprimée en U/ml et en équivalent TNF recombinant murin, dans le test de cytotoxicite de la lignée cellulaire L292.
TABLEAU III
Action du MDP-GDP in vitro sur les monocytes humains
Stimulant μg/ml Activité dans le surnageant
TNF U/ml IL-6 U/ml
< 10
Figure imgf000031_0001
Cellules à 2 x 10O/BU, incubées pendant 24 heures avec les produits.
TABLEAU IV
Action du MDP-GDP sur les polynucléaires humains
Stimulant μg/ l Inhibition de croissance du Candida (%) 1ère exp. 2ème exp.
Figure imgf000032_0001
Les polynucléaires (l x 106/πιl) sont incubés avec les stimulants pendant 30 minutes et distribués dans les puits des microplaques avec une suspension de C. albicans à 1 x 104/m . Après 18 heures, le milieu de culture est éliminé et 1'incorporation de 3H-D-glucose par les cellules de Candida est mesurée après une incubation de 3 heures. 4) : influence du dérivé osidique P sur 1»effet pyrogène du MDP-GDP.
Les essais de pyrogénicité ont été réalisés sur des lapins néozélandais de 3 à 4 kilogrammes maintenus en boîte à contention. Les animaux ont reçu une dose de produit dans un volume de 0.5 ml/kg par voie veineuse au temps zéro et leur température enregistrée pendant 5 heures en continu.
(a) . Evaluation de la pyrogénicité de P1
Deux lots de trois lapins ont été constitués : . groupe I : 10 μg/kg de T?ι ; . groupe II : 100 μg/kg de P,.
Les différences de température enregistrées étaient : . pour le groupe I : 0.15, 0.25; 0.25 (βC), soit une moyenne de : 0.22βC ± 0.06 ; . pour le groupe II : 0.40, 0.15, 0.30 (βC), soit une moyenne de : 0.28"C ± 0.12.
Cette expérience indique que P^ est totalement dénué d'effet pyrogène chez le lapin et dans les conditions drastiques d'un enregistrement effectué durant 5 heures.
(b) . Evaluation de la pyrogénicité de MDP-GDP en présence de P1
La dose minimale pyrogène de MDP-GDP préalablement déterminée, est égale à : 2 μg/kg.
Il a été choisi une dose de 10 μg/kg qui donne approximativement une augmentation de température de 1°C.
Deux lots de trois lapins ont été constitués : . groupe I : 10 μg/kg de MDP-GDP ; . groupe II : 10 μg/kg de MDP-GDP + 10 μg/kg de P-,.
Les différences de température enregistrées sont : . pour le groupe I : 0.70, 0.50, 0.85 (°C), soit une moyenne de : 0.68βC ± 0.18 ; . pour le groupe II : 1.15, 0.90, 0.65 (βC), soit une moyenne de : 0.90°C ± 0.25.
Un test statistique de Student (unpaired two- tailed t test, p = 0.2866) indique que cette différence n'est pas significative et donc que P. n'induit pas une synergie de l'effet pyrogène d'un autre produit comme le MDP-GDP.
Les compositions dispersées obtenues présentent des propriétés pharmacologiques qui sont de même nature que celles rapportées ci-dessus pour les dispersions de la composition MDP-GDP-P-,. On fait encore retour dans 1•exemple V sur des résultats pharmacologiques particulièrement intéressants qui mettent aussi en oeuvre des compositions dispersables à base de MDP(Thr)'-GDP et P
EXEMPLE II - Production d'une composition dispersable dans une solution aqueuse à base de l'α-acétyl- muramyl-L-thréonyl-D-isoglutamine)-^,7-dipalmitoyl-sn -glycérol (MDP(Thr)^--GDP)
Cette dispersion en présence du composé PI, est obtenue exactement dans les mêmes conditions que pour le MDP-GDP
EXEMPLE III - Production d'une composition dispersable dans une solution aqueuse d'un analogue monophosphorylé du Lipide A
2.1 mg du dérivé monophosphorylé du lipide A (MPL produit par Ribi Immunochem. Research, Inc.) est dissous dans 0,5 ml de chloroforme (solution A). 3,8 mg de P^ sont dissous dans 1 ml de chloroforme (solution B) .
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont réunies. On ajoute de 2 à 3 ml d'eau distillée et fait barboter un courant d'azote à partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'à élimination complète du chloroforme. On obtient une dispersion aqueuse homogène et stable, légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisée et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la concentration désirée. On obtient une dispersion de même aspect et qualité que précédemment.
Propriétés biologiques de la dispersion aqueuse de MPL (monophosphoryl Lipid A, Ribi immunochem. Research, Inc.) avec le composé P1
Activité antibactérienne.
Le MPL est mis en solution selon la procédure recommandée par Ribi immunochem. Research, Inc.. A partir d'une solution dans le mélange chloroforme : méthanol (4:1) de 20 mg de MPL, une solution mère contenant 4 mg/ml de MPL est ainsi préparée, puis par addition de sérum physiologique dépourvu de calcium, solution à 2 mg/ml.
L'essai est réalisé comme décrit dans l'exemple 1, paragraphe 3a.
Le composé P1 n'altère pas l'effet protecteur du MPL vis-à-vis d'une infection par K.pneumoniae.
TABLEAU V Effet protecteur du MPL (Ribi immunochem. Research Inc.) seul ou en présence du composé P1f vis-à-vis d'une infection par une forte dose (4 x 10 5) de K.pneumoniae, chez la souris Swiss.
TRAITEMENT SURVIVANTS/TOTAL
AU JOUR + 15
0/8
0/8 4/8 7/8
1/8 4/8
Figure imgf000036_0001
8/8
EXEMPLE IV - Dispersion aqueuse d'un analogue monosaccharidique du Lipide A, le MRL 953 (analogue monosaccharidique monophosphorylé) , de formule VI, avec le composé P1
Figure imgf000037_0001
a) Production de la dispersion
10,65 mg de MRL 953 sont dissous dans 0,5 ml de chloroforme (solution A). 16,91 mg de P, sont dissous dans 0,5 ml de chloroforme (solution B) .
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont réunies. On ajoute 2 à 3 ml d'eau et fait barboter un courant d'azote à partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'à élimination complète du chloroforme. On obtient une dispersion aqueuse homogène et stable, très légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisée et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la concentration désirée. On obtient une dispersion de même aspect et qualité que précédemment, b) Propriétés biologiques de la dispersion aqueuse du
MRL 953 avec le composé P1
Activité antibactérienne (figures l(a) et l(b)
L'effet protecteur contre une infection par K pneumoniae a été évalué chez des souris Swiss femelles (âgées le 5 à 6 semaines) .
Les souris ont reçu la veille de 1'inf ction par voie intraveineuse :
- 0,2 ml de sérum physiologique,
- LPS (lipopolysaccharide de Sal onella enteritidis) en suspension dans 0,2 ml de sérum physiologique,
0,2 ml de (1) la dispersion aqueuse de P., + MRL 953, contenant 30, 10, 3 et 1 μg de MRL 953 (2) la dispersion dans un solution de glucosée de MRL 953, contenant 30, 10, 3, et 1 mg de MRL 953. L'infection par K.pneumoniae est réalisée par injection intra-veineuse d'une suspension de 0,2 ml d'une suspension de bactéries (contenant 4,5 x 103 bactéries) . La mortalité est notée pendant les deux semaines qui suivent l'inoculation des bactéries.
La comparaison des figures l(a) et l(b) montre que l'effet protecteur du MRL 953 est comparable, quelle que soit la méthode de dispersion employée. Les figures l(a) et l(b) comprennent en effet des courbes représentatives des variations des pourcentages de souris survivantes (% sur les axes des ordonnées) en fonction du temps (T en jours sur les axes des abscisses) lorsque les substances étudiées (LPS et MPL953) ont été administrées aux doses indiquées à la droite des figures, sous forme dispersée dans : - une solution glucosée (figure l(a) ) - une solution du dérivé d'oside P., (figure l(b) )
Il résulte de 1•examen des figures que 1'effet protecteur des substances étudiées, plus particulièrement du MRL953, vis-à-vis d'une infection par K.pneumoniae chez la souris est du même ordre de grandeur dans les deux cas de figure. Il serait même plus efficace, lorsque le MLR953 est administré sous forme de dispersion, en association avec le dérivé d'oside P-,.
EXEMPLE V - influence des dispersions selon l'invention sur les propriétés biologiques d'un principe actif tiers
L'association de certains muramylpeptides avec un dérivé d'oside peut de façon très intéressante entraîner vis-à-vis d'un principe actif tiers :
. soit un accroissement de l'activité biologique du principe actif tiers,
. soit une diminution de la toxicité de ce principe actif tiers,
. soit les deux à la fois.
Ainsi, par exemple, remarque-t-on :
. un accroissement important de 1'activité antivirale de l'interféron, lorsque ce dernier principe actif est administré postérieurement à l'administration de l'association du MDP(Thr)1-GDP et du composé P-, dans les conditions permettant la formation de leur dispersion aqueuse ;
. une diminution de la synergie toxique du LPS avec un muramylpeptide présentant un certain effet pyrogène, par exemple le MDP-GDP du composé P1# dans des conditions correspondant à celles déjà décrites dans les exemples précédents. En particulier des doses de LPS, lethales pour la souris lorsqu'ils lui sont administrés seuls, ne le sont plus lorsque ces mêmes
Figure imgf000040_0001
es sont adm n strées en assoc at on avec le mélange de MDP-GDP et le composé P,.
En d'autres termes, 1•invention concerne encore l'application des compositions selon l'invention à la modulation de propriétés biologiques de composés tiers, administrés de façon concomitante ou non.
Ces effets de modulation sont encore illustrés de façon non-limitative par les exemples dont les résultats sont rapportés ci-dessous.
(1) - influence de l'utilisation du composé P1 sur les propriétés immunostimulantes des muramylpeptides lipophiles a) - Augmentation de 1'activité antivirale de l'interféron par le MDP(Thr)1-GDP Le modèle expérimental est 1*encéphalomyocardite de la souris. Les animaux sont des souris mâles (Swiss, 17 g) . Elles reçoivent par la voie intrapéritonéale soit une suspension aqueuse du seul MDP(Thr)1-GDP, soit une dispersion aqueuse de MDP(Thr)1-GDP et de composé
Pi-
Après 24 heures, il leur est injecté le virus de
1'encéphalomyocardite par voie intrapéritonéale à raison de 100 fois la DL 50. Une heure après cette injection, certains animaux reçoivent par voie intrapéritonéale 25.000 U.l. d'interféron a,β de souris.
Le tableau VI présente les résultats obtenus. Il en résulte que l'utilisation du composé P, ne diminue pas, mais au contraire augmente l'activité antivirale propre du MDP(Thr)1-GDP, et l'effet de potentialisation de l'activité antivirale de l'interféron par ce muramylpeptide lipophile. TABLEAU VI
Augmentation de l'activité antivirale de l'interféron a,β vis-à-vis d'une infection par le virus de 1'encéphalomyocardite, chez la souris
TRAITEMENT i.p. INTERPERON ,β % DE SURVIE A J - 1
Témoin - 0 %
P (600 μg) - 0 %
MDP(Thr)1-GDP (600 μg) - 20 %
Figure imgf000041_0001
|MDP(Thr)1-GDP (600 μg) - 35 %
+ 30 %
P, (600 μg) + 30 %
MDP(Thr)1-GDP (600 μg) + 46 % |P, (600 μg) +
|MDP(Thr) -GDP (600 μg) + 70 %
b) - Influence d'un pré-traitement par les muramylpeptides lipophiles sur la production de TNF circulant consécutive à l'injection de LPS ou d'un analogue synthétique de Lipide A (Tableau VII) Les souris Swiss reçoivent une injection intraveineuse de :
- 0,2 ml de sérum physiologique,
- du MDP-GDP en suspension dans 0,2 ml de sérum physiologique,
- du MDP(Thr)1-GDP en suspension aqueuse, seul, ou en dispersion aqueuse, en présence du composé P,,
- du Murabutide en solution dans 0,2 ml de sérum physiologique. L'injection intraveineuse qui précède est faite 6 heures avant l'injection de LPS (S. enteritidis) dans du sérum physiologique ou bien de MRL 953 dispersé dans du sérum physiologique en présence de P,.
Les animaux sont saignés à l'aorte abdominale de 1,5 à 2 heures (temps optimum de réponse) après cette dernière injection. L'activité TNF est évaluée par le test de cytotoxicite étant mesurée par le nombre de cellules viables. Une unité de TNF représente la concentration qui produit 50 % de cytotoxicite dans les conditions données.
Les suspensions aqueuses de MDP lipophiles stimulent la réponse TNF à la stimulation par le LPS ou par la dispersion aqueuse de MRL 953 en présence de P,. Cet effet est légèrement accentué avec les dispersions aqueuses de ces MDP lipophiles en présence du composé P-,.
TABLEAU VII
Influence d'un pré-traitement par un MDP lipophile sur la production de TNF sérique consécutive à l'injection de LPS ou d'un analogue synthétique du Lipide A (MRL 953) .
Figure imgf000043_0001
|MDP(Thr)1-GDP 100 μg
1+ P, LPS 7,347
Figure imgf000043_0002
c) - Diminution de la synergie toxique du LPS et du MDP-GDP en présence du composé P, (TABLEAU VIII)
Le MDP-GDP, mis en suspension dans 0,2 ml de sérum physiologique, seul, ou dans une solution glucosée en présence d'acide pluronique (F 68, SERVA) , ou encore en dispersion dans 0,2 ml de sérum physiologique en présence du composé P1f est administrée par voie intraveineuse avec le LPS (S. enteritidis) à des souris Swiss adrénalecto isées.
La mortalité est notée en 3 jours, mais elle se produit le plus souvent en 24 à 48 heures.
Les suspensions de MDP-GDP dans le sérum physiologique ou dans une solution glucosée d'acide pluronique augmente la toxicité du LPS injecté simultanément. La dispersion de MDP-GDP en présence de P., diminue cet effet.
Cette diminution de l'effet toxique n'est r>as due à un effet direct du composé P1 sur le LPS ont la toxicité demeure chez la souris normale en présence du composé P.| (résultats non présentés) .
On remarquera que l'intérêt de ces résultats réside dans le fait que l'association avec le dérivé d'oside permet d'envisager l'utilisation in vivo d'un plus grand nombre de produits lipophiles, par exemple de muramylpeptides lipophiles qui, tels le MDP-GDP, peuvent présenter une certaine pyroginicité résiduelle, sans que l'on ait pour autant à craindre une synergie toxique importante, in vivo, de ces produits avec les LPS des organismes infectieux éventuellement présents chez l'hôte. TABLEAU VIII
Réduction de la synergie toxique du LPS et du MDP-GDP en présence de P^
Figure imgf000045_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition susceptible d'être solubilisée ou dispersée de façon homogène et stable dans une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable, caractérisée par l'association : d'une part, d'un principe actif lipophile de médicament ou "substance pharmacologiquement active", comprenant au moins un groupe hydrocarboné comportant lui-même au moins 3 atomes de carbone, et - d'autre part, d'un dérivé osidique solubilisateur, lui-même hydrosoluble, pharmaceutiquement acceptable, portant lui-même un groupe hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone et comprenant une ou plusieurs fonctions hydroxyle, dont au moins l'une est substituée par un groupe phosphate ou sulfate, ce dérivé osidique étant en une proportior. suffisante par rapport au principe actif lipophile pour promouvoir la solubilisation ou la dispersion de l'ensemble de la composition dans une solution aqueuse.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active lipophile est une substance de type saccharide, peptide ou polypeptide, à caractère cyclique ou non, glycopeptides à caractère cyclique ou non, porteur d'au moins une chaîne hydrocarbonée comportant au moins trois atomes de carbone.
3. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le groupe hydrocarboné est constitué :
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A",
. soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci- après par groupement lipophile "de type B".
4. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 3, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est un dérivé lipophile de muramyl-peptide.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est choisie parmi les composés répondant à la formule (II) suivante :
Figure imgf000047_0001
) _ 2- Y
dans laquelle
- R représente H ou CH ;
- R représente un groupe - NH2, -OH ou un groupe -OW-j,
W., étant un groupe hydrocarboné comportant de 1 à 10 atomes de carbone ; X représente un résidu aminoacyle du groupe comprenant alanyle, valyle, isoleucyle, norleucyle, leucyle, thréonyle, prolyle, glutaminyle, asparaginyle, méthionyle, tryptophanyle, phénylalanyle, tyrosyle, glycyle ;
- Y représente soit OH, soit NH2, ou un groupe -OW2, W2 étant un groupe hydrocarboné de 1 à 4 atomes de carbone, soit encore un groupement lipophile "de type A" ou "de type B",
- Z représente soit H, soit un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", étant cependant entendu que l'un au moins des deux groupes Y et Z est toujours constitué par un groupement lipophile du type A ou du type B ;
- n-| et n2, identiques ou différents, représentent zéro ou 1,
- AT et B, sont soit des groupes respectivement identiques ou différents comprenant de 1 à 3 résidus aminoacyles, eux-mêmes identiques ou différents entre eux, ou encore un groupe -NH-(CH2)p-CO- avec des valeurs de p comprises entre 2 et 10.
6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est choisie parmi les composés de formule (II) dans laquelle :
- n, et n2 représentent zéro,
- R5 représente CH3,
- R$ représente -OH, -NH2 ou -On (CH ) H avec x^ compris
2 X1 entre 1 et 6 , avec une préférence pour x1=4 ,
- X est L ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle,
- lorsque Y représente -0-CH -CHO (R7) -CH20 (R8) , Z représente H, et lorsque Z représente
O -C-CHO(R7)-CH20(R8) , Y représente -OH, -NH2 ou un groupe -OW2j W ayant la signification indiquée dans la revendication 6, et R7 et R8 étant des groupes palmitoyles.
7. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est choisie parmi les composés de formule (II) dans laquelle :
- n, et n2 représentent zéro,
- Rg représente CH3,
- Ra représente -OH, ou -NH ou -On (CH2) H avec x, compris entre 1 et 6, avec une préférence pour x-≈4 ,
- X est L ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle,
- lorsque Y représente -0-(CH2)xH avec x2 = 8, Z
2 représente H, et lorsque Z représente -CO(CH2)x H, avec x2 = 8, Y représente -OH, -NH2, ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiquée dans la revendication 6.
8. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est formée à partir de constituants d'origine bactérienne, entre autres des constituants de la paroi bactérienne : dérivés du tréhalose, notamment du type du TDM (produits de la classe des tréhalose dimycolates) , lipolysaccharides (LPS) , comportant d'une part des chaînes lipidiques et, d'autre part, au moins un groupe phosphate ou sulfate.
9. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce gue la substance p rmacologiquement active est une fraction lipidique ot anue à partir de ces LPS, en particulier le "Lipide A", cette fraction comportant au moins un groupe phosphate ou sulfate.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est formée de dérivés ou analogues du lipide A, mono- ou di-saccharidiques, mono- ou diphosphorylés, porteurs de chaînes ramifiées ou encore de chaînes hydrocarbonées linéaires, pouvant être elles-mêmes substituées ou non, par des chaînes hydrocarbonées linéaires au moyen de liaisons ester, thioester, éther ou thioether.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est constituée par un lipide A monophosphorylé, notamment le MPL.
12. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est constituée par un analogue du lipide A répondant à la formule générale (IV),
Figure imgf000050_0001
NHR'2
dans laquelle:
R4 et R'τ représentent H ou P0 , avec au moins R^ ou R', étant un groupe P04
R2, R3 et R*2, R*3 représentent C0-CH(0R)-(CH2)x-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant CO-(CH2)y-CH3 y étant compris entre
5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12.
13. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est constituée par un dérivé monosaccharidique du lipide A répondant à la formule générale (V) :
Figure imgf000051_0001
NHR2 dans laquelle :
R, représente H ou P03
R et R3 représentent CO-CH(R)-(CH2)X-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant H ou OH ou encore C0-(CH2)y-CH3, y étant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12,
R4 représente PC^ si R1 n ' est pas P03 , ou H ou encore l ' une des significations données à R et R3.
14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que le dérivé monosaccharidique du lipide A est le composé de formule VI :
Figure imgf000052_0001
15. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active lipophile est une substance de type peptide cyclique, tel qu'une cyclosporine.
16. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est une substance de type peptidique, tel que la gramicidine, ou une substance de type macrolide, telle que la leucensomycine, ou une substance de type pseudopeptidique, tel que la valinomycine, ou une vitamine liposoluble, notamment de type vitamine A, D, E, K,
17. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que le dérivé osidique est représenté par la formule (I) suivante :
Figure imgf000053_0001
dans laquelle :
- R représente un groupement hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone, notamment un groupement lipophile "de type A" ou "de type B",
- R représente H, ou OH, ou un groupement acétamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido,
- R3 et R4, identiques ou différents, représentent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate,
- R représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un résidu ose ou osamine dont le carbone ano érique en position 1 (Cl) est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituées par des groupes R'2, R'3, et R'4 ayant respectivement les significations données ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un groupe R' ayant la signification donnée ci-dessus pour
R, l'un au moins des groupes R2, R' , R3, R'3, R4 ou R'4 représentant un résidu sulfate ou phosphate.
18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que le groupe R ou le groupe R' est constitué : . soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une liaison éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A",
. soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci- après par groupement lipophile "de type B".
19. Composition selon la revendication 17 ou la revendication 18, caractérisée en ce que le dérivé osidique est choisi parmi les composés suivants :
- ou /3-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-0R- 2-désoxy-glucosamine,
- N-acétyl 4-sulfate-6-0R-2-desoxy-glucosamine,
- a ou 0-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano- se,
- 4-sulfate-6-OR-glucopyranose,
- 6,6'-di-OR-4,4•-di-sulfate-α, •-D-tréhalose,
R ayant la signification indiquée dans la revendication 17 ou 18.
20. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que le dérivé osidique est choisi parmi les composés suivants :
- a ou j8-méthyl-glycoside N-acéty1-4-suifate-6- octanoyl-2-désoxy -glucosamine,
- α ou /S-méthyl-glycoside-N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3- dipalmitoyl) glycéroyl-2-désoxy-glucosamine,
- N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine,
- N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-2- désoxy-D-glucosamine, - ou 0-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu- copyranoside,
- a ou ?-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi- toyl)-glycéroyl-D-glucopyranoside,
- 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose,
- 4-suyl-D-glucopyranoside,
- 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose,
- 4-sulfate-6(2,3-di-pal itoyl)-glycéroyl- glucopyranose
- 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl-α,α'-D-tréhalose,
- 4,4'di-sulfate-6,6' (2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-α-α•- D-tréhalose.
21. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 en combinaison avec l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu¬ ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par une groupement lipophile "de type A", . soit par une groupement lipophile "de type B",
(2) un dérivé osidique associé de façon non covalente à la substance (1) , ce dérivé osidique étant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B",
. soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
.
22. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 en combinaison avec l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu¬ ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par une groupement lipophile "de type A", . soit par une groupement lipophile "de type B",
(2) un dérivé osidique associé de façon non covalente à la substance (1) , ce dérivé osidique étant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B",
. soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé osidique sus- entionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
23. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que le dérivé d'oside et la substance pharmacologiquement active sont avantageusement dans un rapport pondéral de 0,25 à 4, notamment de 0,5 à 1,5.
24. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce qu'elle est à l'état anhydre, notamment sous forme de lyophilisât.
25. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, soit à l'état anhydre, soit à l'état dispersé dans un solvant aqueux physiologiquement acceptable.
26. Dérivé d'oside répondant à la formule générale (I) suivante :
dans laquelle
Figure imgf000057_0001
- R représente un groupement hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone,
- R représente H, ou OH, ou un groupement acétamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido,
- R3 et R4, identiques ou différents, représentent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate,
- R représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un résidu ose ou osamine dont le carbone anomérique en position 1 (Cl) est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituées par des groupes R'2, R'3, et R' ayant respectivement les significations données ci-dessus pour R , R3, et R4, et la position C6 par un groupe R' ayant la signification donnée ci-dessus pour
R, l'un au moins des groupes R2, R'2, R3, R*3, R4 ou R' représentant un résidu sulfate ou phosphate, étant entendu que l'un au moins des groupes précédents est un groupe sulfate.
27. Dérivé d'oside selon la revendication 26, caractérisée en ce que le groupe R ou le groupe R* est constitué : . soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une liaison éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A",
. soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci- après par groupement lipophile "de type B".
28. Dérivé d'oside selon la revendication 26 ou la revendication 27, répondant à l'une des formules suivantes :
- α ou 3-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-OR- 2-désoxy-glucosamine,
- N-acétyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine,
- α ou /3-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano- se,
- 4-sulfate-6-OR-glucopyranose,
- 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-α,α•-D-tréhalose,
R ayant la signification indiquée dans la revendication 26 ou la revendication 27.
29. Dérivé d'oside selon la revendication 26, répondant à l'une des formules suivantes:
- α ou /3-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6- octanoyl-2-désoxy -glucosamine,
- a ou j9-méthyl-glycoside-N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3- dipalmitoyl) glycéroy1-2-désoxy-glucosamine,
- N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine,
- N-acéty1-4-suifate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-2- désoxy-D-glucosamine,
- α ou )3-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu- copyranoside, - ou 0-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi- toyl)-glycéroyl-D-glucopyranoside,
- 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose,
- 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glycéroyl- glucopyranose
- 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl-α,α'-D-tréhalose,
- 4,4»di-sulfate-6,6' ( 2 ,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-α-α'- D-tréhalose.
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