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WO1992001053A1 - Plasmide contenant l'adn qui code pour la sequence d'acides amines du facteur tcf-ii, cellules transformees par ce plasmide et production d'une substance physiologiquement active grace a l'utilisation de ce plasmide - Google Patents

Plasmide contenant l'adn qui code pour la sequence d'acides amines du facteur tcf-ii, cellules transformees par ce plasmide et production d'une substance physiologiquement active grace a l'utilisation de ce plasmide Download PDF

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WO1992001053A1
WO1992001053A1 PCT/JP1991/000942 JP9100942W WO9201053A1 WO 1992001053 A1 WO1992001053 A1 WO 1992001053A1 JP 9100942 W JP9100942 W JP 9100942W WO 9201053 A1 WO9201053 A1 WO 9201053A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tcf
amino acid
cells
rtcf
cdna
Prior art date
Application number
PCT/JP1991/000942
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English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuyuki Shima
Kanji Higashio
Masaya Nagao
Fumiko Oogaki
Hiroaki Takaoka
Eisuke Tsuda
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to KR1019920700566A priority patent/KR0153009B1/ko
Priority to DK91912323T priority patent/DK0539590T3/da
Priority to US07/838,410 priority patent/US5328836A/en
Priority to DE69131069T priority patent/DE69131069T2/de
Publication of WO1992001053A1 publication Critical patent/WO1992001053A1/ja

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention provides a plasmid containing DN.A which encodes an amino acid sequence of a novel glycoprotein ⁇ (hereinafter referred to as TCF- ⁇ ) derived from human fibroblasts. And a method for producing a biologically active substance using the transformant.
  • TCF- ⁇ novel glycoprotein ⁇
  • the TCF-I of the present invention is useful in the field of drugs or biochemical or pharmacological agents as hepatocyte growth factor, tumor cell-damaging activity factor and the like.
  • a typical bioactive substance produced by human-derived fibroblasts for example, iS-interfuron is a tumor cytotoxic factor. It is a glycoprotein that is secreted extracellularly when fibroblasts are cultured, harvested, and then stimulated with Bori I-Bori C or Sendai virus. In addition to tumor effects, it has been shown to show various physiological activities.
  • Japanese Patent Publication No. 58-146293 discloses a fibroblast-derived tumor cytotoxic glycoprotein called CBF.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 33120/1988 discloses a tumor growth inhibitor ⁇ 'having a molecular weight of 35,000 to 45,000, which is extracted from a human tissue-derived fibroblast culture solution.
  • JP-A-61-561,3] discloses a tumor necrosis factor-like substance extracted from fibroblasts, and JP-A-61-187? Discloses a fibroblast-derived necrosis factor FNF.
  • JP-A-62-103021 The publication discloses physiologically active substances produced from animal fibroblasts and having a cytotoxic effect of a molecular weight of 40,000 to 60,000 and an isoelectric point of 5.0 ⁇ 0.5, respectively.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-10998 discloses that all amino acids of tumor cell-damaging factors having a molecular weight of 36,000 ⁇ 1,000 and an isoelectric point of 10.5 or more obtained from the culture supernatant of human-derived fibroblasts are disclosed.
  • An acid sequence and a cDM sequence encoding it have been disclosed.
  • the present inventors have conducted a search for physiologically active substances contained in the culture supernatant of human-derived fibroblasts, and as a result, have found that various physiological physiological substances differing in the molecular weight, isoelectric point, etc., from the conventionally reported substances.
  • An active glycoprotein was found and a patent application was filed (PCT / JP 90/003 14) (International Publication Number W0 90/10651, International Publication Date September 20, 1990).
  • This novel human fibroblast-derived glycoprotein (TCF-II) is a glycoprotein identified by the following physicochemical properties. a. Molecular weight; SDS electrophoretic molecular weight measurement: 78,000 ⁇ 2,000 or 74,000 ⁇ 2,000 in non-reduced state, 52,000 ⁇ 2,000 in common band A and 30,000 ⁇ 2,000 in reduced form. Two bands, Band B and Band C at 26,000 ⁇ 2,000, are shown.
  • TCF-II of the present invention Preferably have the following N-terminal amino acid sequence and amino acid composition.
  • N-terminal amino acid sequence B and C are sub-chains of band A, and band A has an N-terminal amino acid block. Both subchains B and C have the following N-terminal amino acid sequence:
  • X means unidentified.
  • amino acid composition The following amino acid composition is obtained by hydrolysis with hydrochloric acid.
  • the present inventors determined the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of TCF-II and described it in the above patent application specification.
  • the present inventors purify TCF- ⁇ -encoded mRNA from human fetal lung-derived fibroblasts (IMR-90) according to the following procedure, and then clone the gene into clones.
  • the amino acid sequence was deduced from the nucleotide sequence.
  • RNA solution was prepared from oligo (dT) cellulose chromatographic method. The poly (A) 'RNA was purified from the oligo (dT) cellulose column in 10 ⁇ Tris-HCl buffer.
  • a cDNA synthesis kit (Pharmacia) was used to create a double-stranded cDNA and a EcoRI adapter was prepared. Added. The method of preparation was in accordance with the company's protocol.However, during the synthesis of single-stranded cDNA, an improvement was made to add a reverse transcriptase (AMV RTase) derived from Trimyeloblastosis virus. (40 units / reaction system, Life Science).
  • AMV RTase reverse transcriptase
  • the cDNA obtained in (2) was incorporated into the EcoRI arm (Pimega) of the phage vector gtlO. 3.3 ⁇ g of poly (A) * RNA from ⁇ .
  • the synthesized cDNA was converted to a 150/1 66 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), ImM spermidine, 10 mM magnesium chloride, 15 mM dithiothreitol, 0.2 mgZ ⁇ serum albumin solution (column buffer). After mixing 5.21 of this with the / IgtlO EcoRI arm, it was precipitated with ethanol.
  • This probe is the complementary strand (384 kinds mix) used as the c probe shown below:
  • the recombinant phage DNA solution prepared in (3) was packaged in vitro using Gigapack Gold (Stratagene) and infected with E. coli C600hfl to obtain about 500,000 phage plaques. After adsorbing the plaque on Hybond-filter (Amersham)-After denaturing and neutralizing the filter, baking 80 to 2 hours The primary e- hybridization was screened with the probe created in (i) according to the method of Bell et al. (Nature 310 77-777 (1984). One plaque that was positive in China had a strong clone that would harbor a TCF-II cDNA fragment.
  • hHGF human hepatocyte growth factor
  • TCF- ⁇ cDNA was searched by Polymerase Chain Reaction (PC) method.
  • PC Polymerase Chain Reaction
  • Sa77 primer having a recognition sequence for the restriction enzyme Sail and Sph2203 primer having a recognition sequence for the restriction enzyme Sphl were synthesized using a DNA synthesizer (Applied). These primers are listed below. Show.
  • the approximately 2.3 Kb cDNA fragment digested with the restriction enzymes Sail and Sphl obtained in (i) was digested with the plasmid pUC18 (Nippon Gene) using the restriction enzymes Sail and Sphl.
  • the E. coli DH5a (manufactured by BRL) was transformed into the target fragment using a ligation kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) (according to the protocol attached to BRL). As a result, we were able to obtain a subclone of more than 20 ⁇ .
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the TCF-D cDNA obtained as described above and the amino acid sequence deduced from the sequence. It is 2 ⁇ 2 base pairs (bp) from the translation start signal ATG to the stop signal TAG. When translated into amino acid, it consists of 723 amino acid sequences, and it is the 29th from the 1st methionine residue.
  • TCF-J is the force of two disulfide bonds of two polypeptide chains, .beta. And .beta. Chains; as shown in FIG. 1, initially as one polypeptide chain. It was found to be synthesized. The end of the or-chain of TCF- ⁇ is unknown because it is blocked. The ⁇ -end of the ⁇ -chain and a partial amino acid sequence of the or-chain and some of the ⁇ -chain are determined as described above. This is shown in Fig. 1. The base system II of the obtained TCF-H cDNA was obtained from Hezawa et al. (Biochemical and Biophysical
  • TCF-II cDNA is one of the genes of the new HGF gene family. It turned out to be one.
  • the present invention aims to produce TCF-H by a genetic engineering technique by incorporating this cDNA into an expression vector based on the knowledge about the cDNA of TCF- ⁇ thus obtained.
  • TCF--D obtained by genetic engineering techniques
  • an object of the present invention is to construct an expression vector containing a DNA encoding the amino acid sequence of TCF-D, to obtain a transformed cell transformed with the TCF-II expression vector, this Nea to provide a method for producing a RTCF- [pi or hepatocyte growth factor using the Ru c
  • the present invention provides a method for solving ⁇ such as ⁇ , wherein D is a coded amino acid sequence of TCF- ⁇ . i I Min to the expression plasmid.
  • expression vectors examples include pcDNAI (Invitrogen) pMNSMUsuchiya et al.-Biochemical and Biochemical Research Communication 158 576-583 (1989)).
  • the plasmid of the present invention is generally produced by the following method. That is, first, as described above, the TCF-D cDNA subcloned into the PUC18 brassmid vector (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was excised using a restriction enzyme, while, for example, the expression vector PC DNA I (Invitrogen) was used. Cut out the plasmid fragment from the product (produced by Trodin) using restriction enzymes. Then, both fragments are ligated using ligase, and the TCF-II cDNA fragment is inserted into the pcDNAI fragment to construct TCF-II expression plasmid.
  • TCF- ⁇ cDNA For excision of TCF- ⁇ cDNA, brassmid fragment, etc., various known restriction enzymes can be used, and it is particularly preferable to use BamHI, Sphl, etc., and to ligate. It is preferable to use T4 ligase. Excision or ligation of plasmid fragments can be carried out by conventional means known in the art.
  • a TCF- ⁇ overexpression plasmid pCDTCFdh capable of expressing rTCF- ⁇ in a large amount can be constructed by the method shown in FIG. 4 below.
  • Mouse DHFR gene expression plasmid P AdD26SVpA (3) (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82, 689-693 (1985)) was transformed with EcoR i and Banil, and BamHI and Ps11. Digest each separately, i% MEa force ⁇ one DNA fragments of 1.8 Kb and 0.5 Kb were mixed with Blue RISK SK (Stratagene), which had been digested with EcoRI and Ps11, respectively, by Sgel (Takara Shuzo) electrophoresis. A mouse DHFR gene expression plasmid pBAdDSV was obtained.
  • the plasmid pBAdDSV was digested with EcoRI and Spel, blunt-ended with Klenow fragment, and 1% ME agarose electrophoresis was used to digest the 2.4 Kb DNA fragment with Nae].
  • the plasmid pCDTCFdh obtained in this manner is used to express the TCF-II gene having the TCF-II gene between the site megalovirus promoter and the splicing signal related to the SV40 early gene and the poly (A) addition signal.
  • the TCF-D expression plasmid thus obtained is amplified and purified using Escherichia coli.
  • Escherichia coli various ones such as commercially available MC1061 / P3 are used.
  • Escherichia coli containing the plasmid is cultured in a medium containing ampicillin and the like, amplified and selected, and then the plasmid is removed and purified.
  • a transformant obtained by incorporating the expression plasmid of the present invention in FIG. 2 into Escherichia coli MC1061 / P3 has been deposited with the Microtechnology Research Institute (Accession number: Research Laboratories No. 3479 (FERM BP-3479)).
  • the present invention also relates to a transformed cell obtained by incorporating the TCF-U-expressing plasmid thus obtained into a cell.
  • the cells it is desirable to use animal cells such as C0S-1 cells, CH0 cells, Namalwa cells, ⁇ 2 cells, ⁇ 3BM3 cells, BM cells, and the like. Usual methods such as acid calcium method, DEAE-dextran method, revo- pectin method, and electroporation method are used.
  • the present invention provides a method for culturing the transformant thus obtained and collecting rTCF- ⁇ from the culture solution.
  • the culturing may be performed by the method described in W090 / 10651. That is, animal cells are grown in serum or serum-free medium.
  • An example of a typical medium is a medium in which 5% calf serum is added to Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • hormones such as amino acids, trans-ferrins, fatty acids, and inulin may be added.
  • Force culture for culturing cells in this medium includes stationary culture using T flask, suspension culture using microcarriers, hollow fiber and cell culture.
  • a continuous culture method using a ceramic carrier can be employed.
  • ion exchangers examples include CM Sephadex (manufactured by Pharmacia). Among the active fractions eluted in this way, the fraction showing the strongest activity using the proliferation activity of rat hepatocytes or the cytotoxic activity against mouse L929 cells as an index. Collect, and perform sugar affinity chromatography. ConA-Sepharose is suitable for sugar affinity chromatography. The sugar-finished mouth column was equilibrated with a 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 0.5 M NaCl, and then loaded with the above-mentioned collected fraction. Wash the ram. Thereafter, elution is carried out with an eluate corresponding to the sugar affinity of one sugar chain.
  • Tris-HCl buffer pH 7.0
  • Con A Sepharose described above When Con A Sepharose described above is used, it is eluted with a buffer containing one methyl-D-manno-pyranoside. The eluted active fraction is filtered through water and freeze-dried. Then, it is dissolved in a 0.05M Tris-HCl buffer solution of P! I 6.0 to 7.0, and further separated and purified by HPLC using a strong cation exchange resin. MonoS (Pharmacia) is particularly suitable as a column packed with strong cation exchange resin. Elution from the MonoS column is a gradient elution of 0M to 1.0M NaCl. Collect active fraction c
  • rTCF-D is eluted in a salt strength portion of 0.6 M to 0.9 M.
  • the active fraction obtained in this manner is further purified by heparinse-frose (Pharmacia). Purification is carried out using an affinity-based mat graphi- Elution from Heparin-Sepharose column was performed with a 0.3 M ⁇ 2.0 M NaCl gradient, and the target compound was eluted. Quality ':' is eluted in the salt strength portion of 1,0 to 1.5M. Next, the measurement of the hepatocyte proliferation activity of rTCF-II will be described.
  • Table 1 shows an example of the hepatocyte proliferation activity against ⁇ purified rTCF-- that was solubilized and measured using a liquid scintillation counter.
  • the rTCF-II of the present invention is not only a growth factor for hepatic parenchymal cells, but also a tumor cytotoxic factor, a leukemia strain differentiation-inducing factor, a cell immunoreactive factor, and a vascular endothelial cell growth factor.
  • FIG. 1a and FIG. 1b show the amino acid sequence of TCF-II and the nucleotide sequence encoding it.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of a method for producing a TCF- ⁇ expression plasmid of the present invention.
  • Fig. 3 shows the status of TCF-CF expression.
  • 11-11 is the HGF activity of cells not carrying the TCF-II gene.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of a method for producing a TCF- ⁇ mass expression brass-body of the present invention.
  • Fig. 5 shows the transformed Namait a cell culture (5% CS ⁇ . CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM.
  • (1) contains 0.3-1 NaC] and 0.01% tween 20
  • Figure 6 shows the Con A Sepaco C C6B rTCF-II eluate (0.6M NaCl eluted fraction) from CM Sephatech C50 chromatograph. Indicates a chromatographic graph.
  • Figure (1) is 0.5M NaCl-containing 0.05M Application Benefits scan - HCl buffer (P pH 7.0), (2) is 0.5M NaCl, 0.01% Tsui over emissions 2 0 and 0.3 M alpha-main switch Lou D —Manno villano side house 0.05 ⁇ Tris—shows column chromatography with hydrochloric acid buffer ( ⁇ 7.0). —— ⁇ —— indicates absorbance (OD.280 nm), and Hata indicates cytotoxic activity against the L929-C18 strain.
  • FIG. 7 shows Mono S-HPLC of the rTCF-H eluted fraction from Con A Sepharose-6-Phase 2 Chromatography 1.
  • —1 # —— indicates the cytotoxicity against L929-C1S strain
  • Figure 8 shows the rTCF II elution fraction from Mono 5-HPLC. '-Indicates HPLC.
  • FIG. 10 shows the cytotoxic activity of rTCF- ⁇ on various tumor cell lines.
  • ——m-one indicates KB
  • FIG. 11 shows the hepatocyte proliferation activity of rTCF- ⁇ .
  • Example 1 Example 1
  • TCF- ⁇ cDNA (Fig. 1) subcloned into PUC18 plasmid vector (Nippon Gene) and pcDNA I expression vector (Invitrogen) Were cut out by the following restriction enzyme treatment to obtain their DNA fragments.
  • 1 g of pUC18 plasmid into which TCF- ⁇ cDNA has been inserted and 1 ⁇ g of -pcDAI plasmid are separately added to 20 mM Tris-HC £: PH8.5, 10 mM MgC I 2 , 1 mM Di thio threi. to ⁇ , lOOmM KC £, dissolved in buffer 10 /, add 1 unit each of restriction enzymes BamHI and Sph1 and react with 3 7 for 1 hour, then 1% ME agarose gel (Takara Shuzo) ) After electrophoresis, a TCF-H cDNA fragment of about 2.3 Kb and a pcDN'A1 fragment of about 4. Kb were recovered using DE81 vapor (manufactured by Pittman).
  • TCF-D cDNA fragment lOOng and pcDNA I fragment 5 ng were converted to 60 m.
  • Tris-HCl, pH7.6, ImMATP, 1 mil spell'mid, 10 ⁇ .HgCCt, 1 ⁇ mM DTT was dissolved in a buffer containing 10 1 -300 liters of T4 ligase was added, and the mixture was ligated overnight at 15 minutes.
  • Escherichia coli C1061 / P3 was transformed using the above reaction solution according to a conventional method to obtain a transformed bacterium having a TCF- ⁇ expression plasmid.
  • the above transformed Escherichia coli was cultured in a 1-cm culture medium containing 25 ⁇ g Z 'ambicilin, and the final concentration was 170 ⁇ g Zid when 0D600 showed 0.8. Chloramphenicol was added to the mixture, and the cells were treated overnight by the method of Maniatis ⁇ (Molecular cloning 2nd edition) and cultivated overnight by the polyethylen glycol method and centrifuged with cesium chloride density gradient. The TCF-B expression plasmid was purified by the method.
  • TCF- ⁇ expression plasmid was introduced into COS-I cells by the calcium phosphate method.
  • pcD AI was introduced into the COS-Iffl cell in the same manner.
  • Plasmid 72 hours after transfection (: 05-1 Examination of the presence or absence of rTCF- ⁇ 'expression in the culture supernatant using the proliferation activity of rat hepatocytes as an index According to the method of Gohda et al. (J. Clin Invest. 81 414-419, (1988)), the DNA synthesis ability of rat hepatocytes was measured by the amount of 3 H-thymidine incorporation. Figure 3 shows.
  • rat hepatocyte proliferating activity was observed in the C0S-I cell supernatant 72 hours after introduction of TCF-- expression plasmid, and rTCF- ⁇ ⁇ was expressed. Was confirmed. No proliferative activity was observed in C0S-I cells transfected with the PCDNA I vector alone.
  • mouse DHFR gene expression plus Mi de pAD 26SV P A (3) ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 689-693, (1985)) EcoRl and BamHI to And 1.8 kb DNA fragments were previously digested with EcoRI and Pstl, respectively, by 1% ME agarose gel (Takara Shuzo) electrophoresis. (Stratagene) and ligated with T4 DNA ligase according to the method described in Example 1 to obtain a mouse DHFR gene expression plasmid pBAdDSV.
  • the plasmid pCDTCFdh obtained in this manner is a TCF-II gene having a TCF-II gene between the site megalovirus promoter and the subsequence signal associated with the SV40 early gene and the poly (A) addition signal. Plasmid that harbors both an expression unit and a mouse DHFR expression unit that has the mouse DHFR gene between the adenovirus major late mouth motor and the 40 early gene-related poly (A) addition signal It is.
  • the TCF-II overexpression plasmid pCDTCFdh was introduced into a human Namal cell ATCC CRL1432 by the lipofectin method (Focus 11 (2), 37 (1989)) shown below.
  • pCDTCFdh plasmid 10 ⁇ g and pMC I neo plasmid 1 u are also dissolved in 10 TE buffers (1 ⁇ mfl Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5). Then, a DNA solution was prepared by adding 1,5-6 OPTI-ME (manufactured by Gibco) to this. According to the protocol of BRL, a lipofuctin solution was prepared by adding 0.1 lipofuctin (1 g nom. BR) to 0 PTI-MEM of 1.4.
  • Namaruwa cells 1 X 1 0 7 eel is a 0.3 m £ CD OPT I - the solution 1.5 i to 1.5 id of re port one that Nigoshi suspended in MM 'Cu Chi emissions solution, 0.3 ⁇ Namaruwa cell suspension of In addition, gently stir the mixture with a tent. 9 0
  • the cells were sowed at a concentration of 96 ⁇ m per plate and cultured for about 2 weeks. From the obtained MTX-resistant cell lines, cell lines having a high TCF- ⁇ concentration in the culture supernatant were screened by ELISA.
  • the obtained TCF- ⁇ high-producing strain was cloned by limiting dilution in RPMI-1640 medium containing 10% FCS and 10% high predosing factor (manufactured by ORIGIN) by limiting dilution.
  • the TCF-II production ability in the culture supernatant of the cells was about 1 m / £.
  • the G 2 H 3 C 2 cells AIST microorganisms Industrial Institute Accession No. Byekenjo preferred No. 3480 (FERM BP- 3480: was deposited as.
  • RPMI 1640 medium supplemented with 5% bovine serum (CS) 2.5 ⁇ l of the transformed Namal ⁇ cells were inoculated at 4 ⁇ 10 5 cells / fl? I-every 37.2 days of culture. Twenty pounds of the culture was collected by a fed-batch culture method in which the same medium was added for 2.5 pounds.
  • Mouse L929 (ATCC CC1) was subcloned to obtain a subclonal L929-C18 strain most sensitive to TCF-II.
  • the L929-C18 strain was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% FCS until it became confluent, and the cells were exfoliated and collected by trypsin treatment.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • % FS suspending the 1 ug / McHenry Chino My Thin D so that the cell density of 6 X 1 0 5 cel ls to ⁇ Mu DMEM.
  • 96 DMEM prepared in the same manner as the cell suspension was added to each well of a 6-well microplate (3072, manufactured by Flucon Co., Ltd.), and the sample containing rTCF-II of the present invention was also prepared. Dissolve or dilute with DMEM prepared in the same manner, add 50 U1 to the first hole of the dilution line, mix, and add the 501 to the second hole and mix. Create a dilution series by repeating this operation.
  • a cell death rate of ⁇ ⁇ % is shown, and the dilution rate is defined as the ordinal number (u / mi) of TCF- ⁇ .
  • Con A Sepharose C6B (Pharmacia) was equilibrated with 0.5 M NaCK 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 containing pH 7.0, 0.05 M Tris-HCl buffer, and the diameter was 2.
  • a 5 cm x 8 cm column was filled. The column was washed well with the same buffer, and loaded with the rTCF-II fraction (pH 7.0) eluted with the CM Sephadex C-50 column chromatograph. After that, the column was washed again with a 0.5 M NaCl solution containing 0.05 M of Tris-HCl buffer, 10 times the column volume, and then 0.5 M NaCl, 0.01% Tween was added. Tsu 20 and 0.
  • the fraction eluted first was collected and diluted with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.0, so that the NaCl concentration was 0.3 M or less.
  • the Mono S color for HPLC equilibrated with a phosphate buffer of 0.01% phoenix 20 pH 7.0. (America).
  • the elution pattern is shown in FIG.
  • the active fraction was eluted with the peak at 0.76M C1.
  • the active fraction was collected to increase the purity, loaded onto Mono S column again, and eluted again with the same buffer at a concentration gradient up to 1 M NaCl.
  • the molecular weight was measured by electrophoresis using a polyacrylamide gel containing 0.1% SDS.
  • Figure 9 shows the SDS electrophoresis pattern.
  • rTCF-II showed 78,000 soil 2,000 and 74,000 ⁇ 2,000 adjacent bands in the non-reduced state.
  • the electrophoresis after reduction treatment with butanol was performed using a common band A with a molecular weight of 52,000 ⁇ 2,000, a band KB with a molecular weight of 30,000 ⁇ 2,000 and a band C with a molecular weight of 26,000 ⁇ 2,000.
  • rTCF- ⁇ 100 ug of rTCF- ⁇ was reduced and separated into three polypeptides by molecular weight analysis using the electroblotting method: A with a molecular weight of 52,000, B with a molecular weight of 32,000, and C with a molecular weight of 22,000.
  • the N-terminal amino acid sequence of each polypeptide chain was analyzed using an ABLIDE 477 A type protein sequencer. A could not be analyzed because the N-terminal was blocked, but both B and C showed the common N-terminal amino acid sequence shown below.
  • rTCF- ⁇ Since the N-terminal amino acid sequences of B and C are completely identical, rTCF- ⁇ has an A chain with a molecular weight of 52,000 and a B chain with a molecular weight of 32,000 or a C chain with a molecular weight of 26,000. S - c of this and was observed to have a Terodi 'mer structure to the S bond (5) rTCF- ⁇ biological activity
  • Human tumor cell lines KB and mouse tumor cell lines, Sarcoma2-180 and Meth A sarcoma were used as test tumor lines.
  • the tumor cell line KB Sarcoma 180 was prepared in 10% FCS-supplied DMEM, and Meth A sarcoma was prepared in 10% FCS-supplied RPMI 1640 at a cell density of 1 ⁇ 10 4 cells. Further, for the IMR-90 normal cells were prepared to give a cell density of 1 X 1 0 5 cells / ⁇ to 1 0% FCS ⁇ DMEM. Each cell suspension was added in a ratio of 50/1 to each well of a 96-well flat bottom microplate plate (Falcon, 3072). rTCF- ⁇ is ⁇ ,
  • rTCF-II solution was prepared by dissolving and diluting it in RPMI 1640 with 10% FCS.
  • the rTCF- ⁇ solution was added to each well containing the respective cell suspension at a concentration of 501, and the final concentration of rTCF- ⁇ was 0, 2, 4, 8, 16, 16, 31, 2, 62, 125, and It was adjusted to 250, 500, and 1000 ng Zffl.
  • C0 2 Lee Nkyubeta one, on 3 7, and cultured for 4 days.
  • For each cell only the number of viable cells in each well was counted using a hemocytometer, and the average value of the experimental values on two sides was determined.
  • the cytotoxic activity (%) of each cell was determined using the group without rTCF-II as a control by the following formula, and the relationship with the rTCF-II concentration was determined. Average rTCF- ⁇ in control group
  • rTCF- ⁇ had strong cytotoxic activity against Sarcoma 180 and Meth A sarcoma, and also cytotoxic activity against KB cells. However, it did not show any cytotoxic activity against IMK-90, a normal human cell.
  • hepatocytes were isolated from 200 g of a rat rat.
  • the hepatic parenchymal cells were seeded at 8.8 ⁇ 10 4 cells / 0.5 ffifiZwell at a concentration of 24 ⁇ l plate (manufactured by Falcon) and cultured at 37 ° C.
  • the medium used was a Williams E (manufactured by Flora Volatile Inc.) medium containing 10% fetal calf serum (FCS) and 10 M dexamethasone (hereinafter abbreviated as basal medium).
  • the present invention creates a TCF-II expression vector containing a DNA encoding the amino acid sequence of TCF-II, and uses this to produce rTCF-D by a genetic engineering method.
  • -D can be produced in large quantities and economically.
  • the obtained rTCF-If can be used as a hepatocyte growth factor in the field of medicine. It can also be used as a biochemical or pharmacological reagent.

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Description

明 細 書
TCF - Πのア ミ ノ駿配列をコー ドする DN A を含むプラス ミ ド 形質転換細胞及びこれを用いて生理活性物質を生産する方法 技 術 分 野
本発明は、 ヒ ト線維芽細胞由来の新規な糖蛋白踅 （以下、 TCF- Π という ） のア ミ ノ酸配列をコー ドする DN.A を舍むプラ ス ミ ド、 こ のプラ ス ミ ドで形質転換した細胞及びこ の形質転 換体を用いて生理活性物質を生産する方法に関する
本発明の TCF- I [ 、 肝細胞増殖因子、 腫瘍細胞障害活性因 子等と して医薬あるいは生化学的も し く は薬理作用の試薬等 の分野で有用である。
背 景 技 術
ヒ ト由来の線維芽細胞が産生する生理活性物質、 例えば腫 瘍細胞障害因子と しては iS—ィ ンタ ーフ ュ ロ ンが代表的な物 質である。 これは線維芽細胞を培養後、 細胞をハーべス ト し ついでボリ I —ボリ Cやセ ンダイ ウ ィ ルスで剌激する と細胞 外に分泌される糖蛋白質であり、 抗ウ ィ ルス 、 抗腫瘍効果の 他に、 種々の生理活性を示すこ とが明らかになつている。 特 開昭 58- 146293 号公報には、 CBF と呼ばれる線維芽細胞由来 の腫瘍細胞障害性糖蛋白質が開示されている。 特開昭 6 】 - 33120 号公報には ヒ ト組織由来の線維芽細胞培養液よ り抽出 される分子量 35,000〜45,000の腫瘍増殖阻害因子 ΠΝΓ' が開 示されている。 又、 特開昭 61-561,3]号公報には線雄芽細胞よ り抽出される腫瘍壊死因子様物質か、 特開昭 61-187? 号公報 は、 線維芽細胞由来壌死因子 FNF 、 特開昭 62-103021 号 公報には、 動物線維芽細胞から産生される分子量 40,000〜 60,000、 等電点 5. 0 ± 0. 5の細胞障害作用を有する生理活性 物質がそれぞれ開示されている。 さ らに、 特開昭 64-10998号 公報には、 ヒ ト由来の線維芽細胞の培養上清から得られる分 子量 36,000 ±1,000 , 等電点 10.5以上の腫瘍細胞障害因子の 全ァ ミノ酸配列およびこれをコ一ドする cDM配列が開示され ている。
発 明 の 開 示
本発明者らは、 ヒ ト由来の線維芽細胞の培養上清に舍まれ る生理活性物質について検索を進めた結果、 従来報告されて いる物質とは分子量、 等電点等において異なる種々の生理活 性を有する糖蛋白質を見出して特許出願した（PCT/JP 90/003 14) (国際公開番号 W0 90/10651 国際公開日 1990 年 9月 2 0 H ) 。
このヒ ト線維芽細胞由来の新規な糖蛋白質 （TCF- Π ) は下 記に示す物理化学的特性により特定される糖蛋白質である。 a.分子量 ； SDS 電気泳動法による分子量測定で、 非還元では 78,000± 2,000 又は 74,000 ± 2,000 の分子量であり、 還元 した場合、 52,000 ±2，000 の共通バン ド Aと、 30,000 ± 2, 000 のバン ド B及び 26, 000 ± 2,000 のバン ド Cの 2本の バン ドを示す。
等電点 ； 7.4〜 8. 6
c.熱安定性 ； 6 0 t , 1 0分間の加熱によつても安定 d. pH安定性'； pH 6〜 9 の範囲で安定
e.糖鎖 ； コ ンカナバリ ン A (ConA)セ フ ァ ロースに吸着性を示 f.生理活性 ； KB細胞、 HeLa細胞、 L 一 929 細胞の増殖を抑制 し、 IMft-90細胞の増殖を抑制しない。
g.抗体との反応性 ； 抗 TN'F 抗体、 抗リ ンホ トキ シ ン抗体、 抗 ィ ンターフ ュ ロ ン /3抗体によって障害活性が中和され い, さ らに、 本発明の TCF- Π は、 下記の N末端ァ ミ ノ酸配列 及びア ミ ノ酸組成を有するものが好ま しい。
h. N末端ァ ミ ノ酸配列 ； 上記 B及び Cがバン ド Aのサブチヱ — ンとなっており、 又バ ン ド Aは N末端ア ノ酸がブ口 .,' ク されている。 サブチヱー ン B及び Cは共に以下の N末端 ァ ミ ノ酸配列をもつ ；
Val-Val-Asn-Gly- Ile-Pro-Thr- またに
Val-Val-Asn-Gly-I le-Pro-Thr-X-Thr-Asn - He
- Gly-X-Met-Va卜 Ser- Leu
ただし Xは未同定を意味する。
i.ア ミ ノ酸組成 ； 塩酸で加水分解する と次のア ミ ノ酸組成を 示す。
A. A nmo 1 mol %
Asp 10.375 12.97
Glu 7.750 9.69
Ser 5.000 6.25
Gl 7.250 9.06
H i s 3.000 3.75
Arg 5.37 6,72 Thr 5.125 6.41
Ala 2.625 3.28
Pro 5.625 7.03
Tyr 3.875 4.84
Val 4.125 5.16
Met 1.875 2.34
Cys ND
He 5.000 6.25
Leu 4.875 6.09
Phe 2.250 2.81
Trp ND
し ys 5.875 7.34
合計 80.000 100 (99.99)
さらに、 本発明者らは TCF- IIのア ミノ酸配列をコー ドする 塩基配列を決定し、 上記特許出願明細書中に記載した。 すな わち、 本発明者らは、 下記に示す手順に従って、 ヒ ト胎児肺 由来線維芽細胞（IMR-90)から、 TCF- Πをコー ドした mRNAを精 製した後、 その遺伝子をクローニ ングして塩基配列を決定し. その塩基配列からァ ミノ酸配列を推定した。
(1) IMR-90細胞からのポリ （A)+ RNA の抽出
5 % ©New born calf serum (N'BCS)を添加したダルべッコ 改変ィーグル（DME)培地を用いて培養した IMR-90細胞 2 X 108 個から、 グァニジ ンチオ シァネー ト一塩化セ シウ ム法（B i 0 - chemistry 18 5294-5299 (1979) ) によ り ト ータル RNA を調 製した。 I MR- 90細胞に 6 Mグァニジ ンチオ シァネー ト、 5 m! ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム、 0.5 %ザルコ ： ール、 0.1 M -- メ ルカ ブ トエタノ ール溶液 2 8 ¾βを添加し、 ホモ ジ ィ ナイ ズした。
4 fflfiの 5. 7 Μ塩化セ シウ ム、 0. 1 M EDTA溶液をポ リ ア ロマ 一遠心管に入れ、 その上にホモ ジ ィ ナイ ズ溶液 7 をのせ、 ベ ッ ク マ ン超遠心機 4 0 Ti 口 一ターで 35, OOOrpm, 20。 (： 、 16時 間超遠心分離を行った。 遠心後、 沈鏺を 9 5 %エタ ノ ールで 2 回洗浄し、 2 0 0 1 の 10mM ト リ ス塩酸緩衝液 （PH 7. 5 ) , 1 m EDT 溶液て' 6 5 て、 δ分間加熱する こ とにより溶解し. 卜一タル RNA 溶液と した。 ト一タル から 、 オ リ ゴ （dT)セ ルロースカ ラ ム ク ロマ ト法によ り 、 ポ リ （A) ' RNA を精製し た。 ォ リ ゴ（dT)セルロースカ ラ ムを 1 0 ηιΜ ト リ ス塩酸緩衝液
(pH7.4) , 1 mM EDTA, 0.5M 塩化ナ ト リ ウ ム 、 0.05%SDS で 平衡化し、 トータル RNA を通し、 吸着画分を 1 0 mM ト リ ス塩 酸緩衝液 （PH7.4) , 1 mM EDTA, 0.05 %SDS で溶出し、 ポリ
(A) - RNA 溶液と した。
(2) cDNA の合成
(1)で得た po : (A) - RN を铸型と して、 cDNA合成キ ッ ト (フ ア ルマ シア社） によ りニ本鎮 cDN Aを作成し、 EcoRI ァダ プタ一を付加した。 作成方法は同社のプロ ト コ一ルに従つた が.、 一本鎖 cDNAの合成の際、 ト リ骨髄芽球症ウ ィ ルス由来の 逆転写酵素（AMV RTase) を添加する改良を加えた （ 4 0 unit s/反応系、 ラ イ フサ イ エ ンス社） 。
(3) c NA ラ イ ブラ リ 一の作成
(2)で得た - cDNA をフ ァ ージベク ター gtlOの EcoRI arm (プ π メ ガ社 > に組み込んだ。 3.3 μ g のポ リ （ A ) * RN A から Ά. 成した cDNA を 150/ 1 の 66mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH7.6)、 I mMスペルミ ジン、 10mM塩化マグネシウム、 15mMジチオス レ ィ トール、 0.2 mgZ ゥ シ血清アルブミ ン溶液 （カ ラム緩衝 液） に溶解し、 このう ちの 5. 2 1 を の / I gtlO EcoRI armと混合後、 エタノ ールで沈澱させた。 この沈澱を 9 〃 1 のカ ラム緩衝液に再溶解し、 1 μ 1 の lOmMアデノ シン三リ ン 酸、 1 1 の T4 DNAリ ガーゼ（350 units/ 1 ) を加え、 16 •Cで一晩反応し、 ス gtlOと cDNAの組換えファージ DNA を作成 ί 一 c
(4) cDNA ライ ブラ リーのスク リ ーニング
( i ) オ リ ゴヌク レオチ ド プローブの作成
TCF- Π β鎮の Ν末端の 1 番目から 6番目のァ ミ ノ酸配列に 相当する 1 7 mer の相補鎖ォ リ ゴヌク レオチ ド混合物（384種 mix)を合成し、 T4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼ （宝酒造社製） r -3Z P ) ATP (アマシ ャ ム社） を用いて 5' 未満を標識 してプローブとして用いた。 このプローブは下記で示される c プローブとして用いる相補鎖 （384 種 mix) :
3' -CACCACTTACCGTAGGG -5 '
G G G C A A A A T T T T
( ii：) 組換えファージのスク リ ーニング
(3)で作成した組換えファージ DNA 溶液を Gigapack Gold (ス ト ラタ ジーン社） を用いて in vi troで packaging し、 大腸菌 C600hflに感染させ、 約 50万個のファージのプラークを得た。 プラ一クを Hy bond- フ ィ ルター（アマシャム社）に吸着させ 後-、 フ ィ ルターをアルカ リ変性、 中和後、 80て 2時間 baking した e ハイ ブリ ダィ ゼーシ ョ ン'は . Bell ら (Nature 310 77 -777 (1984) の方法に従い.、 ( i ) で作成したプローブで一 次スク リ ーニ ングした。 一次ス ク リ 一ニ ンダで陽性てあった プラークのなかに TCF- Π cDNA 断片を舍むと思われるク ロー ン力く 1 つ得られた。
(5)ア ミ ノ酸に翻訳される全領域を含む TCF- Π cDNA のク ロー 二 ング
TCF- Π の /9鎖 N末端ア ミ ノ酸配列および 鎮および β の リ シルェ ン ドぺプチダーゼ処理によ り得られたそれぞれ一き ί; 内部ァ ミ ノ酸配列 （ ατ ) ( 1 文字表示） NYMGNLSQTRSGL およ び （/5 ) TSXSVYGWGYTGLIKYDGLL (X は未同定を示す） 力く、 ヒ ト肝細胞増殖因子（hHGF)のァ ミ ノ酸配列とよ く 一致している ため、 TCF- Π は hHGFの遺伝子ファ ミ リ 一の一種と考えられた c hHGF こつ ヽて Iま、 宮沢ら（Biochemical and Biophysical Research Communication 163 967-973 (1989) ) , 中村（Nature 342 440-443 (1989) )によ ってその cDNAの塩基配列が報告さ れている 、 両者でァ ミ ノ酸配列が 1 4箇所異なり、 hHGF遣 伝子フ ァ ミ リ ーの存在が示唆されていた。 そ こで両者で一致 している、 ポリ ヌ ク レオチ ド鎖コー ド領域周辺の 5 ' —およ び 3 ' —非翻訳領域の DNA の塩基配列を基にプライ マーとな るオ リ ゴヌク レオチ ドを合成し、 Polymerase Chain Reaction (PC ) 法による TCF- Π cDNA の検索を行った。 まず.、 DNA 台 成機 （アプライ ド社） により制限酵素 Sai lの認識配列を有す る Sa卜 77プラ イ マーと、 制限酵素 Sphlの認識配列を有する Sph2203 プライ マーを合成した。 これらプラ ィ マ一を下記に 示す。
Sal-77プラ イ マー ：
5 ' -GGTCGACTAGGCACTGACTCCGAACAGGATTC -3'
Sal 1
Sph2203 プラ イ マー ：
5 ' -GGCATGCACAGTTGTATTGGTGGGTGCTTCAG-3 '
SPh I
PC 法によるク ロ一ニングは以下の手順で行つた。
( i ) PC
(2)で合成した cDNA(150 μ I のカ ラム
緩衝液に溶解） 1 1
2 0 M Sal-77 ブラ イ マー 2. 5 1
2 0 M Sph2203フ'ラ イ マー 2. 5 1
1 0 xPCR反応液（500mM塩化力 リ ウム、 lOOmM ト リ ス塩酸緩衝 液 （pH8.3)、 1 5 mM塩化マグネシウム、
0. 1 % (w/v) ゼラチ ン） 1 0 μ \
1.25mM dGTP, dATP, dTTP, dCTP混合液 1 6 1
Ampli Taq ( δ units/ μ 1 宝酒造） 0. 5 〃 】 蒸留水 6 7. 5 / 1
上記の溶液を 0. 5 用の微量遠心チューブ中で混合後、 ミ ネラルオイ ル （シグマ社） 約 100 μ 1 で液面をおおった後、 Quick Thermo System (日本ジエネテイ クス社） により PCR を行った。 反応条件は次に示した。 9 4 てで 7分前処理後、 5 5 て 3分 （アニーリ ング反応） 、 7 2 て 4分 （ポリ メ ラーゼ反応'） 、 9 4 X 2分 （変性） の三段階の反応を 3 5 画繰り返した後、 後処理と して 5 5 て 3分、 7 2 て 1 1 分処理し、 室温に戻した （ （注） それぞれの時間は温度が変 化する時間も舍む。 ） 。 反応液のう ちの一部をァガロースゲ ル電気泳動にかけたとこ ろ約 2. 3 キロベース （Kb') の DNA 断 片が得られ、 これが目的の TCF- Π cDNA と考え られた。 そこ で反応液 4本分から得た DNA をエタ ノ ールて'沈殺させた後、 制限酵素 Sailと Sphlで消化し、 ァガロースゲル電気泳動にか け、 DE81ペーパー （ヮ ッ トマン社製） で約 2.3Kb の DNA 断片 を回収した。
( ϋ ) サブク α—ユング
( i ) で得られた制限酵素 Sailと Sphlで消化された約 2. 3 Kbの cDNA断片を、 プラス ミ ドべク ター pUC18(日本ジーン社製） を制限酵素 Sailと Sphlで消化したべク ター断片にラ イ ゲーシ ヨ ンキ ッ ト （宝酒造社製）を用いて挿入し、 大腸菌 DH5 a (BRL社 製）の形質転換を行った（BRL社添付のプロ トコールに従った）。 結果と して、 20偭以上のサブク ローンを得る こ とが出来た。
( iii ) 塩基配列决定
得られたサブク ロー ンについてダイ デォキシ法 （ Sequenase Ver.2.0 東洋紡製）により塩基配列を決定した。 Ampi Taq (宝 酒造社製） のヌク レオチ ド取り込みの ミ スを複数個のサブク ロー ンの塩基配列を解析する こ とにより補正した。 上述のよ う に して得られた TCF- D cDNAの塩基配列と、 その配列から 予想されるァ ミ ノ酸配列を第 1図に示した。 翻訳開始信号 ATG から停止信号 TAG まで 2Π2塩基対（bp)であり 、 マ ； ノ 酸に ϋ 訳する と 723 個のア ミ ノ酸配列からなり 、 1 番目のメ チォ二 ン残基から 29番目のァ 二 ン残基までがシグナル配列と予想 された。 TCF- J は .、 鎖、 β鎖の二本のポリ ぺプチ ド鎮がジ' スルフ ィ ド結合している力；、 第 1 図に示すように最初は 1 本 のポリ ぺプチ ド鎖として合成される こ とがわかった。 TCF - Ε の or鎖の Ν未端はブロ ッ ク されているために不明である力 β鎖の Ν末端および or鎖， β鎖の一部内部ァ ミ ノ酸配列が前 述のごと ぐ決定しており、 第 1 図中に示した。 得られた TCF - H cDNA の塩基配歹 IIは宫沢ら（Biochemical and Biophysical
Research Communication 163 967-973 (1989) ) の発見し た hHGFと極めてよ く 一致するが宫沢らの hHGFのァ ミ ノ酸配列 でいう と、 162 番目のフエ二ルァラニンから 166 番目のセ リ ンまでの 5残基（F-L- P- S-S) が、 今回の TCF- H cDNA でば欠 失している点が異なり、 TCF- II cDNA は新しい HGF 遺伝子フ ァ ミ リ ーの遣伝子の 1 つである ことがわかった。
本発明は、 このよう にして得られた TCF- Π の cDNAに関する 知見を基に、 この cDNAを発現ベクター中に組み込み、 TCF- H を遺伝子工学的手法によつて製造しょう とするものである
(以下、 遺伝子工学的手法によつて得られた TCF- Πを rTCF- D という） 。
従って、 本発明の課題は、 TCF- D のア ミ ノ酸配列をコー ド する DNA を舍む発現ベク ターの構築とこの TCF- II発現べク タ 一で形質転換された形質転換細胞及びこれを用いて rTCF- Π あるいは肝細胞増殖因子を製造する方法を提供する こ とにあ る c
本発明は'、 このような課題を解決するためになされた σ であって、 まず、 TCF- Π のマ ミ ノ酸配列をコ一 ドした D を i I 舍む発現プラ ス ミ ドに閔する。
発現ベク ターと しては pc DNA I (イ ンビ ト 一ジェ ン社） pMNSMUsuchiya他- Biochemical and Bioph sical Research Communication 158 576-583 (1989)) などがあげられる。
本発明のプラス ミ ドは、 一般に次の方法で作製される。 す なわち、 まず前記したよう に PUC18 ブラス ミ ドベクター （日 本ジーン社製） にサブク ローニングされている TCF- D cDNA を制限酵素を用いて切り出し、 一方例えば発現ベク ター PC DNA I (イ ンビ ト ロージヱ ン社製） から制限酵素を用いてプ ラ ス ミ ド断片を切り出す。 そ して両断片をリガーゼを用いてラ ィ ゲーショ ンし、 TCF- Π cDNA 断片を pcDNAI断片中に挿入し て TCF- Π発現プラス ミ ドを構築する。
TCF- Π cDNA 、 ブラス ミ ド断片等の切出しは従来知られて いる種々の制限酵素が用いられる力く、 特に BamHI 、 Sphl等を 用いる ことが好ま し く 、 また リ ガ一ゼと しては T4リ ガーゼを 用いる こ とが好ま しい。 プラス ミ ド断片の切り出し、 あるい はライ ゲ一ショ ンの方法は従来知られている通常の手段によ つて行う こ とができる。
また、 本発明では、 次の第 4図に示す方法によって rTCF- Π を大量に発現させる こ とのできる TCF- Π大量発現プラス ミ ド pCDTCFdhを構築する こ とができ る。
マ ウ ス DHFR遺伝子発現プラ ス ミ ド PAdD26SVpA(3)(Proc. Natl Acad. Sci . USA, 82, 689- 693 (1985) )を EcoR i と Banil , ¾ よひ BamH I と Ps 11とでそ ぞれ別に消化し、 i % MEァ力 π一 スゲル（宝酒造社製）電気泳動により、 それぞれ 1.8Kb 、 0.5 Kbの DNA 断片をあらかじめ EcoRI 、 Ps 11で消化したブルース ク リ プ ト SK （ス ト ラタ ジーン製） と混合し、 T4 DNAリ 力一 ゼでラ イ ゲーシ ヨ ンを行い、 マウ ス DHFR遺伝子発現プラ ス ミ ド pBAdDSV を得た。
プラス ミ ド pBAdDSV を EcoRI と Spelで消化した後、 ク レノ ゥフ ラ グメ ン トで平滑末端と した後、 1 %MEァガロース電気 泳動により、 2.4Kb の DNA 断片をあらかじめ Nae]で消化した TCF- Π発現プラ ス ミ ド （第 2図 6.3Kb)に T4 DNAリ ガーゼに より挿入し、 TCF- Π大量発現ブラ ミ ド pCDTCFdhを得た。 この よう にして得られたプラス ミ ド pCDTCFdhは、 サイ トメ ガロウ ィ ルスプロモーターと SV40初期遺伝子関連のスプライ スシグ ナルおよびポリ （A) 付加シグナルの間に TCF- Π遺伝子を有す る TCF- Π発現単位と、 アデノ ウイルス主要後期プロモータと SV40初期遺伝子関連のポリ （A) 付加シグナルの間にマウス DH FR遺伝子を有するマウス DHFR発現単位の双方を舍むブラス ミ ドである。
こ のよ う にして得られた TCF- D発現ブラス ミ ドを大腸菌を 用いて増幅し精製を行う。 大腸菌としては、 市販されている MC1061/P3 等種々のものが用いられる。 プラス ミ ドを組み込 んだ大腸菌を、 ァ ンピシ リ ン等を舍む培地中で培養して増幅 するとともに選択を行い、 さ らにプラス ミ ドを取り出して精 製する。 本発明の発現ブラス ミ ド第 2図を大腸菌 MC1061/P3 に組み込んだ形質転換体は微ェ研に寄託している ί受託番号 ¾ェ研条寄—第 3479号（FERM BP- 3479)〕 。 O
本発明は、 また、 このよう にして得られた TCF- U 発現 ラ ス ミ ドを細胞中に組み込み、 得られる形質転換された細胞に 関する。 細胞と しては C0S-1 細胞、 CH0 細胞、 Namalwa 細胞 Φ 2 細胞、 ΠΗ3Τ3細胞、 BM 細胞等の動物細胞を用いる こ と が望ま し く 、 その形質転換法は、 従来用いられている リ ン酸 カルシウ ム法、 DEAE - デキス ト ラ ン法、 リ ボフヱク チ ン法、 エ レク ト ロポ レーショ ン法等の通常の方法が用いられる。
さ らに、 本発明は、 このよう にして得られた形質転換体を 培養し、 その培養液から rTCF- Π を採取する方法に閬する。 培養に当っては、 W090/10651に記載される方法で培養すると よい。 すなわち、 動物細胞を血清培地も し く は無血清培地中 で増殖させる。 代表的な培地の例と してはダルベッ コ一モデ フア イ ドィ ーグル培地（DMEM)に子牛血清を 5 %添加した培地 が挙げられる。 この他に必要に応じ、 ア ミ ノ酸、 ト ラ ンスフ エ リ ン、 脂肪酸、 ィ ン シユ リ ンなどのホルモ ンを添加しても よい。
こ の培地中で細胞を培養する力 培養に当っては、 Tフ ラ スコ等を使用した静置培養、 マイ ク ロキャ リ ア一を使用した 浮遊培養、 ホ ロ一フ ァ イ バ一やセ ラ ミ ッ ク担体を使用した連 続培養の方法が採用し得る。 培養条件は、 5 %C02 、 95%空 気雰囲気下で、 20〜37ての温度、 培地は 2 〜 3 日ごとに交換 する こ とが好ま しい。 このよう にして所望の細胞密度に到達 した後は、 7 〜10日ごとに培地を交換し、 培養液を回収する : 回収した培養液より 目的物質である糖蛋白質を抽出精製する t 回収した培養液は分子量 6, 000 以下をカ ツ トする UF膜処理 により約 10倍に濃縮し、 その後、 陽イ オ ン交換体に吸着させ た後、 NaCl濃度 0. 3 M 〜 0. 6 M の緩衝液で溶出する。 イ オ ン 交換体としては CMセ フア デッ ク ス （ フ アルマシア社製） 等力く 例示できる。 このよう にして溶出される活性画分のう ちでラ ト肝実質細胞の増殖活性、 も し く はマウ ス L929細胞に対す る細胞障害活性を指標と して最も強い活性を示す画分を集め、 さ らに糖ァフ ィ 二ティ一ク ロマ トグラフ ィ 一を行う。 糖ァフ ィ ニテ ィ 一ク ロマ ト グラ フ ィ 一と しては ConA—セフ ァ ロース が適している。 糖ァフ ィ 二ティ ーク 口マ トカ ラムは 0.5M NaCl を舍む PH7.0 の 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で平衡化した後、 上 記回収画分を負荷し、 さ らにカ ラムを洗浄する。 その後糖ァ フ ィ ニティ 一の結合糖鎖に応じた溶出液で溶出する。 上述し た Con Aセファ ロ一スを使用した場合は、 一メ チル— D —マ ンノ ピラノ サイ ドを舍む緩衝液で溶出される。 溶出された活 性画分は、 水に対して透折を行い、 凍結乾燥する。 その後 P!i 6.0 〜7.0 の 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液に溶解し、 強陽イ オ ン 交換樹脂を充瑱剤と した HPLCにより さ らに分離精製を行う。 強陽ィ ォ ン交換樹脂充塡カラム と しては MonoS (フ ア ルマ シア 社製） が特に適する。 MonoS カ ラムからの溶出は、 0M— 1.0M の NaClのグラジェン ト溶出を行い。 活性画分を集める c
rTCF- D は、 0.6M〜0.9Mの塩強度部分に溶出される こ の よう に して得られた活性画分をさ らにへパリ ンーセ フ ァ ロー ス （. フ ア ルマ シア社製） を使用したァ フ ィ 二テ ィ ーク 口 マ ト グ ラ フ ィ一'によ り精製する。 へパ リ ン一 セフ ァ ロースカ ラム からの溶出は 0.3M→2.0Mの NaClグラ ジェ ン トで行い、 目的物 質':'よ 1,0 〜1.5Mの塩強度部分に溶出される。 次に、 rTCF- II の肝細胞増殖活性の測定について記述する。
セ ク レ ンの方法（ ethod i n eel！ b i o i o g . v o 1 13. p29. Academic Press. New Y'or k . ( 1976 ) ) こ従 tヽ、 ゥ ィ ス 々一系雄 ラ ッ トより肝実質細胞を単離した。 この肝実質細胞を 8. > - 1 0 4 個 /0 , 5 ra£ /ゥ エ ルの濃度で 2 4 ゥ エルのプ スチ ·' ク プレー ト （ フ ァ ルコ ン社製） に插き .、 5 %の CO 2 存在下 3 7 てで培養した。 培地は . 1 0 %牛新生児血清 (ハイ ク 口
r
ン） 、 10 デキサメ タ ' / ン 、 100L ぺ二 ；: ：！ ： . lOOug i ス ト レプ トマイ シ ンを舍むウ イ リ ア ズ E培地 （ フ ローラ ボラ ト リ ーズ社製） を使用した （以下、 基礎培地という ） 。 24時間培養後、 被験試料を含む基礎培地に交換し更に 2 4 時 間培養の後、 3H—チ ミ ジ ン （アマシャム社製） を 4 Ci/ (86Ci/mm0 )を舍む基礎培地に交換し 2時間培養した後、 DNA 合成を測定した。 上記培養によるラベル後、 細胞を冷 PBS、 10%過塩素酸及び 95%ェタノ ールて、 それぞれ 2 回洗浄した のち風乾し、 10mM 塩化マグネ シウ ムを舍む、 10%SDS の 0.8m) で可溶化し、 液体シ ンチ レ一 シ ョ ンカ ウ ンタ一にて測定した < 純化した rTCF- Π に対する肝細胞増殖活性の例を第 1 表 示す。
弟 1 表
被 度 BT- m B¾I +tt Kft Ά if ΒΛ ¾¾料 濃
(ng /mi ) ( dpm/wel 1 , xlO3) 無添加 2 L 7 ± 9. 2
Figure imgf000018_0001
薬） を用いた。 表より rTCF- D の肝細胞増殖活性は、 hEGF© それより強いことが判る。
本発明の rTCF- Πは、 肝実質細胞の増殖因子となるほか、 腫瘍細胞障 因子、 白血病株分化誘導因子、 細胞免疫活性因 子、 血管内皮細胞増殖因子となる。
図面の簡単な説明
第 1図 a及び第 1図 b は、 TCF- Πのァ ミノ酸配列及びそれ をコー ドする塩基配列を示す。
第 2図は、 本発明の TCF- Π発現プラスミ ドの作製方法の概 略図を示す。
第 3図は、 TCF- Πの発現の状況を示す。
図中、 一一〇一一 は TCF- Π遺伝子を保有しない細胞の HGF 活性 TP:し は TCF- II遺伝子を保有する細胞の
HGF 活性を示す。
第 4図は、 本発明の TCF- Π大量発現ブラス -Η ドの作製方法 Ο概 ¾図を示す。
第 5図は、 形質転換ナマルヮ （Namait a)細胞培養液 （ 5 % CS舍有.） の CMセ フ " テ "； ク ス Γ-50力 ム ク 匚 'マ ト ' - つ 一 を示す。
図中'、 （1)は 0.3?1 NaC】 および 0.01%ツイ ー ン 2 0 を舍む
0.05. ト リ ス —塩酸緩衝液 （PH6.8 〜7.0)、 （2)は NaCl および 0.01%ッィ ー ン 2 0 を舍む G.05. ト リ ス 一塩酸緩衝液 (PH7.0) によ る カ ラム ク ロマ ト グラ フ ィ ーを示す。 —— O— は吸光度（OD.280nm)、 一一 ·—— は L929- C18株に対する細胞 障害活性を示す。
第 6図は、 CMセ フ ァ テ ッ ク ス C 50ク ロマ 卜グラ フ ィ ーから の rTCF- Π溶出液（0.6M NaCl溶出画分） の Con A セ フ ア コ一 ス Cい 6B ァ フ ィ 二テ ィ ク ロマ ト グラ フ ィ ーを示す。
図中（1)は 0.5M NaCl 含有 0.05M ト リ ス —塩酸緩衝液 （PH7.0)、 (2)は 0.5M NaCl 、 0.01%ツイ ーン 2 0 および 0.3M α—メ チ ルー D—マ ンノ ビラ ノ サイ ド舍有 0.05Μ ト リ ス—塩酸緩衝液 (ΡΗ7.0)による カ ラム ク ロマ ト グラ フ ィ ーを示す。 ——〇—— は吸光度（OD.280nm) , 秦 は L929- C18株に対する細胞 障害活性を示す。
第 7図は、 Con A セ フ ァ ロース -6Β ァ フ ィ 二テ イ ク ロマ ト グラフ ィ一からの rTCF- H溶出画分の Mono S-HPLC を示す。 図中、 は吸光度（0D.280nm)、 —一 #—— は L929-C1S 株に対する細胞障害性、 --……は C1濃度勾配をそれぞれ示す
第 8図は、 Mono 5-HPLC からの rTCF Π溶出画分のへハ。 ' ン -HPLC を示す。
図中、 一"― は吸光度（0D.280nm. ——參—— し 92 1 対する細胞障害活性、 一… は aC 度勾配をそれぞれ示- 第 9図は、 rTCF- Π (非還元及び還元） の SDS 電気泳動を 示 3
第 1 0図は、 rTCF- Πの各種腫瘍細胞株に対する細胞障害 活性を示す。
図中、 ——▲—— は Sarcoma 180 、 ——秦—— は Meth A sarcoma 、 ——厶一一 は KB 、 ——〇—— は IMR-90 に対す る細胞障害活性をそれぞれ示す。
第 1 1図は rTCF- Π の肝細胞増殖活性を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示し、 本発明をさ らに具体的に説明する。 実施例 1
(DTCF- Π発現ブラスミ ドの構築
第 2図に示すように PUC18 プラス ミ ドベクター（ 日本ジー ン社） にサブクローユングされた TCF- Π cDNA (第 1図） およ び pcDNA I 発現べクター（ イ ンビ ト ロ一ジヱン社） を以下の 制限酵素処理により切り出しそれらの DNA 断片を得た。
TCF- Π cDNA が挿入された pUC18 プラスミ ド 1 gおよび- pcD A I プラス ミ ド 1 〃 gをそれぞれ別々に 20mM Tris-HC £ ： PH8.5, 10mM MgC I 2 , 1 mM D i th i o thre i to】， lOOmM KC £ を舍むバッ ファー 1 0 / に溶解させ、 制限酵素 BamH I , Sph 1 それぞれ 1 ユニッ トずつを加え 3 7 てで 1 時間反応させた 後、 1 %MEァガロースゲル（宝酒造製）電気泳動にかけ、 DE81 ベーパー （ヮ ッ トマン社製） で約 2.3Kb の TCF- H cDNA 断片 および約 4. Kb の pcDN'A 1 断片を回収した。
次に TCF- Π cDN 断片を、 pcDNA I 断片に以下の反応によ り挿入した。
TCF- D cDNA 断片 lOOng および pcDNA I 断片 5 O ngを 6 0 m.^ Tris-HC i , pH7.6, ImMATP, 1 milスペル'ミ ジ ン， 1 0 ηι .HgC ί t , 1 δ mM DTTを含むバ ッ フ ァ ー 1 0 1 に溶解させ-. 300 ュニ ッ 卜 の T4リ ガーゼを加え、 1 5 てで一晩ラ イ ゲ一シ ョ ンを行った。
次に、 上記反応液を用い常法に従い大腸菌 C1061/P3 の形 質転換を行い、 TCF- Π発現プラ ス ¾ ドを保有する形質転換菌 を得た
こ の形質転換体は微ェ研に受託番号 微ェ研条寄第 3479号 (FER BP- 3479) と して寄託されている。 第 2図に、 構築した TCF- Π発現プラス ミ ドを示す。
(2) TCF 発現ブラ ス ミ ドの調製と精製
上記の形質転換大腸菌を 2 5 μ g Z' のア ン ビシ リ ンを舍 む 1 £ の し培地で培養し、 0D600 が 0.8 を示した時点で、 終 濃度が 170 μ g Z idになるよう にク ロラムフエ二コールを加 え一晩培丧した Maniatis <ό (Molecular cloning 2nd edition) の方法に従いアル力 リ法およびポ リ エチ レ ングリ コ一 ル法で処理し、 塩化セ シウ ム密度勾配遠心法により、 TCF- B 発現プラス ミ ドを精製した。
(3) TCF- D発現プラ ス ミ ドの勛物細胞への導入
Parkerら（J. Virology 31 360-369. 1979) の方法に従い. Π ン酸カルシウム法によ り、 COS- I 細胞に TCF- Π発現プラ ミ ドを導入した。 ネガチ イ ヴコ ン ト 一ルと して pcD A I へ ク タ一のみを同様にして C0S-I ffl胞に導入した。 (4) rTCF- Π発現の確認
プラス ミ ド:導入後、 7 2時間目の(：05-1 培養上清中におけ る、 rTCF- Π'の発現の有無を、 ラ ッ ト肝実質細胞の増殖活性 を指標と して検討した。 Gohda ら（J. Clin Invest. 81 414 -419, (1988))の方法に従い、 ラ ッ トの肝実質細胞の DNA 合成 能を3 Hサイ ミ ジンの取込み量で測定した。 その結果を第 3図 に示す。
第 3図に示されるよう に TCF- Π発現プラス ミ ドを導入して 72時間目の C0S-I 細胞上清中にラ ッ ト肝実質細胞増殖活性が 認められ、 rTCF- Πが発現しているこ とが確認された。 PCDNA I ベクターのみを導入した C0S-I 細胞中には、 増殖活性は認 められなかった。
実施例 2
(DTCF- Π大量発現プラス ミ ドの構築
第 4図に示すよう に、 マウ ス DHFR遺伝子発現プラ ス ミ ド pAD 26SVPA(3) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 689-693, (1985)) を EcoRl と BamHI 、 および BaroHI と Ps 11とでそれぞれ別に消 化し、 1 %MEァガロースゲル （宝酒造社製） 電気泳動により、 それぞれ 1.8Kb、 0.5Kbの DNA 断片をあらかじめ EcoRI 、 Pstl で消化したブルースク リ プ ト SK十（ス ト ラタ ジー ン社製）と混 合し、 実施例 1 に示した方法に従い、 T4 DNAリ ガーゼでラ イ ゲーシ ヨ ンを行い、 マウ ス DHFR遺伝子発現プラ ス ミ ド pBAdDSV を得た。
プラ ス ミ'ド pBAdDSV を EcoRI と Spelで消化した後、 ク レノ ゥ フ ラ グメ 卜で平滑末端と した後、 1 % MEァガロース電気 泳動により 、 2.4Kb の DM 断片をあらかじめ Naelで消化した TCF- Π発現プラ ス ミ ド （第 2図 6.3Kb)に T4 DMリ ガーゼによ り挿入し 、 TCF- Π大量発現プラ ミ ド pCDTCFdhを得た。 このよ う にして得られたプラス ミ ド pCDTCFdhは、 サイ トメ ガロウ イ ルスプロモーターと SV40初期遺伝子関連のスブラ イ ス シグナ ルおよびポリ （A) 付加シグナルの間に TCF - Π遺伝子を有する TCF- Π発現単位と、 アデノ ウ イ ルス主要後期つ'口モータ と 40初期遺伝子関連のポリ （A) 付加シグナルの間にマ ウ ス DHFR 遺伝子を有するマウ ス DHFR発現単位の双方を舍むプラス ミ ト- である。
(2)TCF- Π大量発現ブラ ミ ドの ヒ トナマルヮ細胞への導入およ び TCF- Π遺伝子の発現
TCF- Π大量発現プラ ス ミ ド pCDTCFdhを、 ヒ ト ナマルヮ細胞 ATCC CRL1432に下記に示すリ ポフエクチン法（Focus 11 (2), 37 (1989)) により導入した。
pCDTCFdh プラ ス ミ ド 1 0 ^ g と pMC I neo プラ ス ミ ド 1 u も (フナコ シ社製）を 10 の TEバッ フ ァ一 （ 1 ϋ mfl Tris, 1 mM EDTA, pH7.5)に溶解し、 これに 1, 5 ¾6の OPT I - ME (ギブコ社 製） を加えた DNA 溶液を調製した。 リ ボフ ュ ク チ ン溶液は、 BRL のプロ ト コ ールに従い、 1.4 の 0PTI-MEMに 0.1 の リ ポフ ユ ク チ ン （ 1 g ノ m£ . BRいを加えたも 0を調製した c ナマルヮ細胞は、 1 X 1 0 7 eel Is を 0.3 m£ CD OPT I - M Mに懸 濁した 上記 溶液 1.5 iに 1.5 idの リ ポ一 ' ク チ ン 液、 0.3 ^のナマルヮ細胞懸濁液を加え、 軽く ピへ .:' テ ン グを して撹拌した後、 2 5 0«の丁フラ スコ （住友へ一ク ラ 9 0
ト社製） に移し、 C0Z イ ンキュベータ一中で 4時間培養した 後、 7 ^の増殖培地 （ 1 0 %FCS を舍む RPMI- 1640 培地） を 加え、 一晩培養した。 その後増殖培地を交換して 3 日間培養 した後、 500 u g の濃度の G418 (シグマ社製） を舍む増 殖培地に交換してさ らに 2週間培養した。 得られた G418耐性 細胞を、 5 O nMメ ソ ト レキセー ト （MTX)、 1 0 %の透析1^5 を舍む or- MEM. (ギブコ社製）培地に懸濁し、 5000cel Is/well の濃度で 9 6 ゥヱルマイ ク ロプレー トにまき、 約 2週間培養 した。 得られた MTX 耐性細胞株から培養上清中の TCF- Π濃度 の高い細胞株を ELISA 法でスク リ ーニングした。 得られた TC F- Π高生産株を 1 0 %FCS 、 1 0 %ハイ プリ ドーマク ロー二 ングファ クター （オリ ジヱ ン社製） を含む RPMI-1640 培地で 限界希釈法により、 細胞のク ローユングを行ない、 得られた ク ロ一ンについて ELISA 法でスク リ ーニングし TCF- Π高生産 ク ローン G2H3C2を得た。 この細胞の培養上清中の TCF- II生産 能は約 1 m /£であつた。 この G2H3C2細胞は工業技術院微生 物工業研究所に受託番号 微ェ研条寄第 3480号（FERM BP- 3480: として寄託した。
(3) rTCF- Π の精製
1)形質転換ナマルヮ（N'amalwa) 細胞（G 2H 3C 2)の培養
RPMI 1640 に牛血清（CS)を 5 %添加した培地 2. 5 £に形質 転換ナマルヮ細胞を 4 X 1 05cells/fl?iとなるように接種し-, 3 7 . 2 日間培養毎に同培地を 2. 5 £添加する流加培養法 により 2 0 £の培養液を採取した。
2 rTCF- Π の活性測定法 マゥス L929 (ATCC CCし 1)をサブク 口一二ングし TCF- Π に 最も感受性の高いサブク ロー ン L929- C18株を得た。 L929-C18 株を 1 0 %FCS を含むダルベ ッ コ改変イ ーグル培地（DMEM)で コ ンフルェ ン 卜になるまて'培養し、 その後 ト リ プシ ン処理に より細胞を剥離採取し、 1 0 % F S および 1 u g / のマク チノ マイ シ ン Dを舍む DMEMに 6 X 1 0 5 cel ls の細胞密 度になるよう に懸濁させる。 9 6穴マ イ ク ロ プレー ト ( フ ルコ ン社製、 3072) の各ゥエルに細胞懸濁液と同様に調製し た DMEMを 5 0 1 加え、 本発明 rTCF- Π を舍む、試料も同様 に調製した DMEMで溶解または希釈し、 希釈列の第 1 穴に 5 0 U 1 を添加し、 混合後、 その 5 0 1 を第 2穴に添加混合す る。 この操作を繰り返しながら希釈列を作成する。
試料の希釈列に各ゥエル当たり、 細胞懸濁液を 5 0 〗 づ つ添加し、 C02 イ ンキュベーター内で、 3 7 て、 2 日間培養 する。 培養後、 上清を静かに捨て、 生理食塩水で 2 回洗浄後、 各ゥエルに接着した生存細胞をメ タ ノ ール ： 水 = 1 : 4 の澄 合液に溶解した 0. 5 %ク リ スタルパィ ォ レ ッ ト溶液を 50 1 づっ添加し、 染色固定する。 蒸留水で各ゥエルを洗浄し、 染 色プレー トを風乾し、 色素をセ レ ンソ ン緩衝液 （ 6. 1 rn£、 0.1 M ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム 3. 9 、 0. I N塩酸、 1 0 ffl£エタ ノ ー ルを混合） で溶出し、 マイ ク ロタ イ ター分光光度計で 570 nm の吸光度を測定する。
δ ϋ %の細胞死滅率を示 希釈率を TCF- Π の萆位数 ( u / mi ) と規定する。
3) rTCF- D の精製 1)で得た培養液 2 0 を HC1 で pH 6.2 〜7.0 に調整し、 こ れに予め PH7.0 の 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で平衡化した CMセ フアデッ ク ス C-50を湿重量として 1.5kg 加え、 PH 6.5 〜7.0 下でゆるやかに撹拌しながら 4 てで 2 4 時間吸着させた。 吸 着後、 樹脂をブッフナ一漏斗上、 ヮ ッ トマ ン No.2濾紙で濾過 し、 回収した樹脂は、 PH7.0 の 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で洗 浄した。 約 15Q0g の洗浄後の樹脂を径 7 cm X 4 0 cmのカ ラ ム に充塡し、 0.01%ッィ 一ン 2 0 および 0. 3 MNaCl舍有 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液、 PH 7.0 で溶出した。 280nm の吸収をモニ ターし、 蛋白質がほぼ溶出し終えたところで更に塩濃度を 0. 6 Μ食塩に上げて溶出を行った。 各フラク ショ ンについて 細胞障害活性を測定した。 このよう にして得た溶出パターン を第 5図に示した。 0. 6 Μの NaCl濃度で溶出される画分に強 い細胞障害活性が認められた。 こ の画分を集めて rTCF- Π画 分と した。 次いで、 Con A セフ ァ ロース Cい 6B (フ ア ルマ シア 社製） を 0.5 MNaCK 1 mM CaCl2、 1 mM MgCl2 含有の pH 7.0 、 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で平衡化し、 径 2. 5 cm X 8 cm のカ ラ ムに充鎮した。 このカ ラムを同じ緩衝液でよ く洗浄し, CMセフ ア デ ッ ク ス C- 50カ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ーで溶出され た rTCF- II画分（pH7.0) を負荷した。 その後再度カ ラ ム容量 の 1 0倍量の 0.5 Mの NaCl舍有 p .O 、 0.05M ト リ ス塩酸緩 衝液でカ ラ ムを洗浄した後、 0. 5 MNaCl、 0,01%ツィ ーツ 20 および 0. 3 M a—メ チル一 D マ ンノ ビラノ サィ ド含有 PH 7.0 、 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で 1 時間当たり 7 0 の流速 で溶出した。 各溶出画分は細胞障害活性を測定すると共に 280nit) の蛋白吸収をモ ニター 第 6図に溶出パター ンを 不
最初に溶出される画分を回収し、 NaCl濃度が 0. 3 M以下と なるよう に、 0.01 Mリ ン酸緩衝液、 PH 7. 0 で希釈した。 希釈 液の PHを再度 G.5 〜7.0 となるよう に調整した後、 0.01 %ッ ィ ー ン 20舍有 PH7.0 の リ ン酸緩衝液で平衡化した HPLC用 Mono S カ ラ 丄 （フ ア ルマ シア社製） に負荷した。 負荷後、 0.01% ツイ ーン 2 0舍有 PH 7.0 の 0.01 M リ ン酸緩衝液で 2 0分間、 0. 5 ιύ /分の流速で洗浄した後、 0. 5 mi /分の流速で 6 0 '分 間で最終塩濃度が 1 MNaClとなるような濃度勾配で溶出を行 つた。 溶出パターンは第 7図に示した。 活性画分は 0.76M C1を頂点と して溶出された。 精製度を上げるため活性画分を 回収し、 再度 Mono Sカ ラ ムに負荷し、 同じ緩衝液で、 NaCl濃 度 1 Mまでの濃度勾配で再度溶出した。
活性画分を回収し、 NaCl濃度が 0. 3 Mとなるよう に 0.01% ツイ 一 ン 2 0舍有 PH7.5 、 1 0 mil ト リ ス塩酸緩衝液で希釈後、 0.3MNaClおよび 0.01%ツイ 一ン 20舍有 pH7.5 、 1 0 mM ト リ ス 塩酸緩衝液で平衡化した HPLC用へパリ ンカ ラム （東ソ一社製） に負荷した。 負荷後、 0.3 MNaCl 0.01%ツ イ 一 ン 2 0舍有 PH7.5 、 1 O iriM ト リ ス塩酸緩衝液で、 流速 0. δ id /分で 2 0 分間洗浄した。 更に同じ PHの緩衝液を用い.、 流速 0.5 分 て' 6 0分間で NaC 1濃度が 0. 3 から 2. 0 Mになるよう な塩濃 度勾配で溶出した ί'き出パター ンを第 8図に示し 。 ：：のよ う に して rTCF- Π の精製標品を得た。 20 £ の培養液から 1] .G の活性な蛋白質を得る こ とが出来た： 細胞障害活性で測定 したこの精製蛋白質の比活性は約 530 万単位であった。
(4) rTCF- Πの物理化学的諸性質
上記のようにして得られた rTCF- Πの物理化学的性質を測 定した結果を以下に示す。
① SDS 電気泳動法による分子量測定
0.1 % SDS を舍むポリ ァク リ ルァ ミ ドゲルを用いて電気泳 動による分子量測定を行った。 SDS 電気泳動パター ンを図 9 に示した。 rTCF- Π は非還元状態で 78, 000土 2, 000 及び 74,000 ± 2,000 の近接したバン ドを示した。 また 2 — メ ル力 ブ トエタノールによる還元処理した電気泳動では、 分子量 52, 000 ± 2, 000 の共通バン ド Aと 30,000 ± 2,000 のバン K B および 26, 000 ±2, 000 のバン ド Cからなる 3つのポリぺプチ ド鎖に分かれる。
② 等電点
LKB 社製等電点電気泳動装置を用い Phast Gel IEF3- 9によ る等電点を測定したところ、 7.4 〜 8.6 の等電点を示した。
③熱安定性
PH7.5 に調整した 0.01 %ツイ 一ン 2 0を舍む 0.1 M ト リ ス 塩酸緩衝液に 600u/ となるように rTCF- Πを溶解し、 この 活性を有する液を 2 5、 3 5、 5 0、 6 0、 7 0、 8 0、 90、 9 5 °Cの各温度で 1 0分間処理し、 2 5 T.の活性に対する相 対活性を求めた。 6 0 てまでは安定であった。
④ PH安定性
第 2表に示す組成の各緩衝液 （いずれも 0.01%ッィ 一ン 20 を含有） を調製し、 各 PHの緩衝液に 600u/ となる よ う に rTCF- Π を溶解し、 3 7 ΐて、 i 時間放置後の活性を測定し
ΡΗ 8 、 室温で 1 時間放置した場合の活性を 100 %と し、 そ ぞれの ρΗでの活性を相対活性で求めた。 その結果、 ρΗ 6〜 9 の範囲で安定であつた。
第 2表 緩衝液
3 1/10 M グリ シン—塩酸
6 1/10 M 酢酸緩衝液
8 1/10 M ト リ フ 一塩酸
Figure imgf000029_0001
12 1/10 グリ ン'ン一水酸化ナ ト リ ウ
⑤ N末ァ ミ ノ酸配列
100 u g の rTCF- Πを還元し、 エ レク ト ロブロ ッ ト法によ り 、 分子量 52, 000の A、 32, 000の B、 26, 000の Cの 3つのポ リ ぺプチ ドに分離し、 各ボリ ぺプチ ド鎖についてアブラ イ ド 社製 477 A型プロティ ン シーク ェ ンサによ り N末ァ ミ ノ酸配 列を分折した。 Aは N末がプロ ッ ク されているためか分析で きなかったが、 B、 Cは共に下記に示す共通の N末ア ミ ノ 酸 配列を示した。
Va Vaト Asn - G 1 y- I le-Pro- Thr- Arg - Thr - Asn - I le - Gly-Trp-
1 5 10
Met - Val- Ser -し eu- Arg-Tyr- Arg- Asn
15 20
Bおよび Cの N末ァ ミ ノ酸配列が全 く 同一である こ とから rTCF- Π は分子量 52, 000の A鎖と分子量 32, 000の B鎖あるい は分子量 26, 000の C鎖が S — S結合したへテロダィ' マー構造 を有している こ とが認められた c (5) rTCF- Πの生物活性
1)腫瘍細胞障害活性
供試腫瘍株としてヒ ト腫瘍細胞株、 KB及びマウス腫瘍細胞 株、 Sarcoma2- 180 および Meth A sarcomaを用いた。 また、 正 常細胞としてヒ ト胎児肺由来正常 2倍体線維芽細胞、 IMR- 90 を用いた。
腫瘍細胞株である KB、 Sarcoma 180 は 1 0 % FCS舍有 DMEM に、 また Meth A sarcomaは 1 0 %FCS 舍有 RPMI 1640 に 1 X 1 0 4 cells の細胞密度になるように調製した。 また、 正常細胞である IMR-90については 1 0 %FCS 舍有 DMEMに 1 X 1 0 5 cells /ηώの細胞密度になるように調製した。 9 6穴 平底マイ ク口プレー ト （フアルコ ン社製、 3072) の各ゥエル に各細胞懸濁液を 50 / 1 づっ添加した。 rTCF- Πは ΚΒ、
Sarcoma 180 および IMR- 90用には 1 0 %FCS 舍有 DMEMに、
Meth A sarcoma用には 1 0 %FCS 舍有 RPMI 1640 に溶解、 希 釈し、 rTCF- II溶液を調製した。 それぞれの細胞慇濁液を加 えた各ゥエルに rTCF- Π溶液を 5 0 1づっ添加し、 rTCF- Π の最終濃度が 0、 2、 4、 8、 1 6、 3 1、 6 2、 125 、 250 、 500 、 1000ngZffl£になるよう に調製した。 混合後、 C02 イ ンキュベータ一中、 3 7 て、 4 日間培養した。 各細胞につ いては各ゥェル中の生細胞数のみを血球計算盤を用いて計数 し、 2面の実験値の平均値を求めた。 各細胞について rTCF- Π無添加群を対照として、 細胞障害活性 （％) を以下の計算 式により計箕し、 r TCF- Π濃度との閬係を求めた。 対照群の平均 rTCF- Π添加区
生細胞数 の平均生細胞数
細胞障害 （cells/ffl£) (cells/ )
活性 （％) = X100 対照群の平均生細胞数（cells/ )
この結果、 得られた rTCF- Πの供試細胞株に対する細胞障 害活性を第 1 0図に示した。
rTCF- Π は Sarcoma 180 や Meth A sarcomaに対して強い細 胞障害活性を、 また KB細胞に対しても細胞障害活性を有して いた。 しかしながら、 ヒ ト正常細胞である IMK-90に対しては、 全く 細胞障害活性を示さなかった。
2) rTCF- Πの肝細胞増殖活性
セグ レ ンの方法（Method in cell biology Vol . 13 , p29 Academic Press, New York) こ從レ、、 ウ ィ スター系ラ ッ ト 200 gより肝実質細胞を単離した。 この肝実質細胞を 8.8 X 1 04 個/ 0. 5 ffifiZwellの濃度で、 2 4 ゥエルプレー ト （フ ァルコ ン社製） に播き、 3 7 てで培養した。 培地は 1 0 %牛 胎児血清 （ FCS)、 1 0 Mデキサメ タゾンを含むウイ リ アム ズ E (フ ローラ ボラ ト リ 一社製） 培地を使用した （以下基礎 培地と略す） 。 2 4時間培養後、 rTCF- IIを舍む基礎培地に 交換し、 更に 2 4時間の培養後3 H—チ ジ ン （アマシャム社 製） を最終濃度 4 Ci//a£になるように添加し、 次いで 2時 間培養した。 その後、 細胞を冷 PBS 、 5 %過塩素酸および 9 5 %エタ ノ ールでそれぞれ 2回洗浄した後、 風乾し、 1 O mM 塩化マグネシゥムを舍む 1 0 %SDS で可溶化し . 液体シンチ レー シ ョ ンカ ウ ンターで DNA 合成量を測定した。 rTCF - IIの 肝細胞増殖効果を第 1 1図に示した。 産業上の利用可能性
本発明は、 TCF- IIのア ミノ酸配列をコー ドする DNA を舍む TCF- II発現べクタ一を創製し、 これを用いて遺伝子工学的手 法によって rTCF- Dを製造するので、 TCF- Dを大量にしかも 経済的に製造することができる。 そして、 得られる rTCF- If ば、 肝細胞増殖因子等として、 医薬の分野で利用することが できる。 また、 生化学的あるいは薬理学用の試薬としても用 いりれる。
微生物への言及
1 . p c T C F ( S ) / C 1 0 6 1 / P 3
寄託機関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所
住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号 寄 託 日 ： 平成 2年 （ 1990年） 7月 13日
受 託 番 号 ： F E R M B P - 3 4 7 9
I ブタぺス ト条約に基づいた寄託 ： 日本国内 寄託 （受託番号 ： FERM P-11605) より移管] 2. T C d G 2 H 3 C 2
寄託機関
名 称 通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所
住 所 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号 寄 託 '日 平成 3年 （1991年） 7月 10日
¾■ 託 番 号 F E R B P — 3 4 8 0

Claims

、 請 求 の 範 囲
(1) TCF - D のァ ミ ノ酸配列をコ一 ドする DN A を舍むプラ ス ミ K
(2) TCF D のア ミ ノ酸配列をコー ドする DN A が第 丄 図に示さ れる DNA である請求項 (1)に記載されるブラ ス ミ ド
(3) 請求項 (2)に記載されるプラ ス ミ ドで形質転換された宿主 細胞
(4) 微ェ研条菌寄第 3479号（FERM BP- 3479)である請求項 (3)に 記載される宿主細胞
(5) 微ェ研条菌寄第 3480号（FERM BP- 3480)である請求項 (3)に 記載される宿主細胞
(6) TCF- Πのア ミ ノ酸配列をコー ドする DNA を舍むプラス ミ ドにより形質転換した細胞を培養し、 rTCF- Πを採取する ことを特徴とする TCF- Πの生産方法。
(7) TCF- IIのァ ミ ノ酸配列をコー ドする DNA を舍むプラス ミ ドによ り形質転換した細胞を培養し、 培養液より肝細胞増 殖因子を回収するこ とを特徵とする肝細胞増殖因子の生産 方法
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