WO1992000325A1 - Anticoagulant polypeptides - Google Patents

Description

明 細 書

発明の名称

抗血液凝固活性を有する ポ リ べプチ ド

技術分野 、.

本発明は遺伝子組換え に よ っ て得 られる、 抗血液凝固 作用およ び血栓溶解作用を有す る ヒ ト ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン様の活性を有す る新規な ポ リ べプチ ド、 そ のポ リ ぺ プ チ ドを コ ー ドする デォキ シ リ ボ核酸 （以下 D N A と記載 する） 、 な ら びに組換え D N A技術に よ る 当該ポ リ ぺ プ チ ド の製造方法に関する。 本発明は ま た、 当該ポ リ ぺ プ チ ドを有効成分と し て含有する こ と を特徵と する、 血液 凝固亢進に係わる疾患の予防及び治療剤に関する。

背景技術

現在、 抗血液凝固剤と し てはへパ リ ン ゃ ア ン チ ト ロ ン ビ ン ΙΠ が使用 されでい る。 ま た、 血栓溶解剤 と し て は、 尿ま たは培養腎細胞か ら分離さ れた ゥ ロ キ ナ ー ゼゃ、 溶連菌よ り抽出さ れた ス ト レ プ ト キ ナ ーゼな どが実用 に 供されてお り、 さ ら に最近では、 組織プラ ス ミ ノ ーゲ ン ァ ク チ べ一 夕一も使用され始めてい る。

しか し、 こ れら の物質は、 出血傾向等の副作用を有 し、 作用が抗血液凝固あ る いは血栓溶解のいずれかに偏つ て いる。

基礎研究の分野で、 近年、 N . L . E s m o n ら に よ り、 線 溶を促進する活性化プロ テ ィ ン C生成促進作用 と血液凝 固阻害作用と を有する物質が家兎肺組織抽出物に存在す る こ と が報告 さ れ、 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン と 命名 さ れた (J. Biol, Chem. , 257. 859 (1982) ) 。 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ンは血管内皮細胞上に存在する ト 口 ン ビ ン レセ ブ夕一 であ り、 ト ロ ンポモ ジ ュ リ ン と結合 した ト ロ ン ビ ンは血 液凝固作用を失い、 ト ロ ン ビ ン 一 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン 複 合体はプ ロ ティ ン C を活性化する こ と によ り 抗凝固作用 を示す こ と が丸山 ら によ り 報告されている （ J. Clin. I nvest. , 71, 987 , (1985 )) ₀ すなわ ち、 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン は血液凝固阻害作用 と線溶促進作用の両方の作用を 発揮する 可能性が有 り、 臨床応用が期待されて い る。

現在ま でに、 ヒ 卜 の ト 口 ン ボ モ ジ ュ リ ン に つ い て は、 以下のよ う な取得例が報告 されて い る。 なお、 分子量に つ いては、 断り のない限り ドデ シ ノレ硫酸ナ ト リ ウ ムー ポ リ ア ク リ ルア ミ ド ゲル電気泳動 （ S D S — P A G Ε ) に よ り、 非還元状態での測定値を示 した。

P. W. Ma j erus ら は、 ヒ ト胎盤よ り ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン を精製 し、 分子量 7 5 K と報告 し （ J. Biol. Chem.. 259. 12246. (1984)) 、 青木ら は、 ヒ ト胎盤力 > ら ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン を精製 し、 分子量 7 1 K と報告 した （Thro m bo sis Res.. 31, 353. (1985)および特開昭 6 0 - 1 9 9 8 1 9 号） 。 丸山 ら は、 ヒ ト肺よ り ト ロ ン ボ モ ジユ リ ン を精製 し、 そ の性質は胎盤の も の と 同 じであ る と報告 し た ( J. Clin. Invest.. 75, 987. ( 1985 )) _D さ ら に、 鈴 木 ら は、 ヒ ト血小板よ り ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン を部分精製 し、 分子量を 7 8 K と決めた上で、 電気泳動上の挙動、 ト ロ ン ビ ン と の親和性およ びプ ロ テ イ ン C と の基質親和 性よ り、 血小板、 胎盤およ び肺血管内皮細胞の ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン は互い に等 し い性質を持つ こ と を報告 し た

( J. Biochein. , 104. 628. (1988 )) ₀

また、 前記の ヒ ト の ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン （以下、 ヒ ト ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン と総称する） と類似の性質を有す る 物質 （以下、 ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン様物質 と総称す る ） について は、 以下のよ う な存在例が報告さ れてい る。

P. . Majerus ら は ヒ ト 血漿か ら部分精製 し、 分子量 6 3 K と 5 4 K の も のが存在す る こ と を示 し た。 ま た、 尿中に も類似の物質が存在する こ と を示 した （ J. Cl in. Invest. , 7_5, 2178, ( 1985 ) ：) 。 さ ら に、 石井 ら は尿中 に は、 分子量 1 0 5 K, 6 3 Κ, 6 0 Κ, 3 3 Κ, 3 1 Κおよ び 2 8 Κ (何れも還元 · 非還元の別が不明） の も のが排泄 される こ と を報告 した （第 1 0 8 回薬学会抄録， 6F05, 11-1. ( 1988)) 。 そ の他、 尿中か ら の取得例 と し て、 分子量 2 0 0 Κ, 4 8 Κ および 4 0 Κ の混合物 （特 開昭 6 3 — 3 0 4 2 3 号） 、 およ び、 3 9 Κ およ び 3 1 Κ (特開昭 6 3 - 1 4 6 8 9 8 号） の も の が報告 されて いる。

C. T. Esmon ら は ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン分子の一部分に 相当す る化学合成ぺ プチ ド を製造 し てい る （特開平 2 — 1 9 3 9 9 号） 。 一方、 遺伝子工学の手法 によ り、 鈴木 ら は ヒ ト 肺 c D N A ラ イ ブラ リ ー か ら、 シ グナ ノレぺ プチ ドを含む ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン前駆体の遺伝子を ク ロ ー ニ ン グ し、 全 遺伝子構造を解明 し、 ァ ミ ノ 酸 1 8 個の シ グナ ルべプチ ド に铳 く 5 5 7 残基のァ ミ ノ 酸配列を明 ら か に し、 ヒ ト ト 口 ン ボ モ ジ ュ リ ン の N末端ァ ミ ノ 酸配列 は Ala Pro Al a Glu Proであ る と して い る （ EMBO Journal, 6, 1891, (1987 )) 。 さ ら に、 鈴木 ら は、 遺伝子工学で作製 した ヒ ト ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン は、 天然の組織よ り 精製 し た ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン と 同 じ 活性を有す る こ と （ J. Biol.

Chem.. 264. 4872 (1989 ) ) 、 ま た、 ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ユ リ ン様活性はァ ミ ノ 末端か ら 3 4 5 — 4 6 2 番目 の ァ ミ ノ 酸残基に限局 さ れて お り、 そ の部分が一部で も欠 け る と活性を失 う こ と を示 し た （ J. Biol. Chem. , 264. 103 51, (1989)お よ び第 1 2 回国際血栓止血学会抄録 3 3 4 頁、 演題番号 1039, ( 1989)) 。 また、 Κ. Ψ. Jackmanら も ヒ ト ト 口 ン ボ モ ジ ュ リ ン前駆体の全遺伝子構造を解明 し、 ア ミ ノ 酸 1 6 個の シ グナ ルぺプチ ド に続 く 5 5 9 残基の ア ミ ノ 酸配列を明 らかに し、 ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の N末端ァ ミ ノ 酸配列は Phe Pro Ala Pro Ala Glu Proであ る と し て い る （ Proc. Natl . Acad. Sci. USA. 84. 6425,

(1987) ) 。 ま た、 D. Wen ら も ヒ ト 臍帯静脈 c D N A ラ ィ ブラ リ ーか ら、 卜 ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン前駆体 の全遺伝子 構造を解明 し、 ァ ミ ノ 酸 2 1 個の シ グ ナ ルぺ プチ ドに続 く 5 5 4 残基のア ミ ノ 酸配列を明 ら か に し、 ヒ ト ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ンの N末端ァ ミ ノ 酸配列は Glu Proであ る と し て いる （ Biochemistry, 26. 4350, (1987)) ₀

ま た Andersen ら も遺伝子工学の手法に よ り、 ヒ ト ト 口 ン ボ モ ジ ュ リ ン分子の一部分に相当する ヒ ト ト 口 ン ボ モ ジ ユ リ ン -様物質の産生を試みて い る （国際特許公開 ff 0 88/09811) o

さ ら に P. W. Majerusら も、 同 じ く 遺伝子工学の手段 に よ り ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の c D N A ク ロ ー ンを開 発 し、 ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の全 ア ミ ノ 酸配列を も つ タ ンパ ク 質を発現 さ せて い る （特開昭 6 3 - 3 0 1 7 9 ' 1 号） 。 発明の開示

本発明者 ら は、 ヒ ト c D N A ラ イ ブ ラ リ ー よ り ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン前駆体遺 子を取 り 出 し、 そ の一部構 造を種々 の D N A フ ラ グ メ ン ト と し て作製 し、 それを微 ' 生物や細胞に組み込んで、 対応す る ポ リ べ プチ ドの生物 活性を研究 していた。 ま た、 本発明者 ら 自身の別の研究 に よ り、 ヒ ト 尿よ り 分子量 7 2 K の ト ロ ン ボ モ ジ ユ リ ソ 様の物質を得、 （欧州特許公開 E P 3 7 6 2 5 1 ) そ の構造及び活性が、 既に報告 さ れて い る ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン と異な る こ と を明 ら かに し た。 以下こ の物質 を と ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン と 呼ぶ。 こ の ヒ ト 尿 ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン と 同一のァ ミ ノ 酸配列 を有す る ポ リ ぺ プチ ドおよ びそ の ァ ミ ノ 酸配列 の一部に ァ ミ ノ 酸の置換、 欠 損、 付加等が施さ れた変異型ポ リ べプチ ドを コ 一 ドす る D N Aを作製 し、 それを組み込んだ微生物や細胞にて遺 伝子を発現させ、 得られた ボ リ ペプチ ドの生物活性を測 定する こ と に よ り、 新たな ト ロ ン ビ ン結合能、 抗血液凝 固作用お よび血栓溶解作用を有する ボ リ ぺプチ ドを取得 する こ と に成功 し、 本発明を完成 した。 以下 これ らのポ リ ぺプチ ドを組換え ヒ ト 尿 ト ロ ンボモ ジュ リ ン （ r u T M と略す） と呼ぶ。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明は抗血液 固作用および血栓溶解作用な どの ヒ ト ト ロ ン ボモ ジュ リ ン と同様の作用を有する、 遺伝子組 換えによ っ て得られる新規なポ リ ぺプチ ド、 そのポ リ ぺ プチ ドを コ一 ドす る D N A、 な らびに組換え D N A技術 によ る当該ポ リ ベプチ ドの製造方法および当該ポ リ ぺ プ チ ドを有効成分と して含有する こ と を特徵と する、 血液 凝固亢進に係わる疾患の予防及び治療剤に関する も ので あ る。 本発明においては、 下記に示 される ア ミ ノ 酸配列 を有する こ と を特徴とする、 ト ロ ン ビ ン結合能、 抗血液 凝固作用および血栓溶解作用を有す る ポ リ ぺ プチ ドが提 供される。 なお、 本発明においてはア ミ ノ 酸配列を N末 端か ら 3 文字表記で記載 し た。 ア ミ ノ 酸番号は鈴木 ら の ヒ ト ト ロ ン ボモ ジ ユ リ ン （ EMBO Journal, 6, 1891, (19 87) ) の ものを基本に用いた。

Xi Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Va 1 Glu

5 10

Pro Leu Ala Val Gl u Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala.

160 165 170

Val Ser lie Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg

175 180

Gl Ala Asp Phe Gin Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser

185 190

Ala Ala Val Ala Pro Leu Gl Leu Gin Leu Met Cys 195 200 205

Thr A 1 a Pro Pro Gly A 1 a Val Gin Gly His Trp Ala

210 215

Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu 220 225 230

Asn Gly Gl Cys Glu His Ala Cys Asn Ala lie Pro

235 240

Gl Ala Pro Arg C s Gin Cys Pro Ala Gly Ala Ala

245 250

Leu Gin Ala Asp Gl Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala 255 260 265

Thr Gin Ser C s Asn Asp Leu Cys Glu His Phe C s

270 275

Val Pro Asn Pro Asp Gin Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 280 285 290 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin

295 300 His Arg C s G 1 u Asp V a 1 Asp Asp C s l ie Leu G 1 u

305 310

Pro Ser Pro Cys Pro Gin Arg Cys Va 1 Asn Thr Gin 315 320 325

Gly G ly Phe G lu C s His Cys Tyr ' Pro Asn Tyr Asp

330 335 Leu Val Asp Gly Gl u Cys Va 1 G 1 u Pro Val Asp Pro 340 345 350

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Gl u Tyr Gin C s Gin Pro

355 360

Leu Asn Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu

365 370

Gly Phe Ala Pro l ie Pro His Glu Pro His Arg Cys 375 380 385

Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala C s Pro Ala Asp

390 395

C s Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser C s Glu C s Pro 400 405 410

Glu Gly Tyr l ie Leu Asp Asp Gly Phe l ie Cys Thr

415 420

Asp l ie Asp Glu C s Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser

425 430

Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 435 440 445

Yi [式中 X iは下記式 ：

Met Leu G 1 Val Leu V a 1 Leu G ly Ala Leu Ala Leu

- 15 -10

Ala Gly Leu Gly Phe Pro Ala Pro Ala

- 5 — -1 1

で表される配列、 ま たはそ の N末端か ら任意数も し く は すべての ァ ミ ノ 酸が欠失 し た配列を示 し、 Y 1は下記式 ： lie C s Gl Pro Asp Ser Ala Leu Z A r g His

450 455

[但 し、 2 は Val ま た は Ala]

で表される配列ま たはそ の C末端か ら任意数 も し く はす ベてのァ ミ ノ 酸が欠失 した配列を示す ]

好ま し く は、 X 1は下記式：

Ala Pro Ala で表される配列、 Yiは下記式：

lie C s Gly Pro Asp Ser Ala Leu Z Arg

450 455

[但 し、 Z は Val ま た は Ala]

で表さ れる配列ま たはそ の C末端か ら任意数 も し く はす ベてのァ ミ ノ 酸が欠失 したァ ミ ノ 酸配列を示すポ リ ぺ プ チ ド₀

更に好ま し く は、 Xiは下記式： Λ 1 a Pro Ala

1

で表さ れ る配列、 Yiは下記式 ：

11 e Cys Gl Pro Asp Ser Ala Leu Z Arg

- 50 455

[但 し、 1 は V a 1 ま た は Ala]

で表さ れ る ア ミ ノ 酸配列を有す る ポ リ ペプチ ド、 ま た は X 1は下記式 ：

A 1 a Pro A 1 a

1

で表 さ れ る配列、 のすベ て の ァ ミ ノ 酸が欠失 し た ァ ミ ノ 酸配列 を有する ポ リ ぺ プチ ド。

更に、 本発明の ポ リ ペ プチ ド は、 上記配列中の少な く と も 1 つ のァ ミ ノ 酸残基が糖鎖を有 していて も良い し、 有 して い な く て も良い。 こ こ で い う 糖鎖と は、 単糖 も し く はそ れ以上の直鎖 も し く は分枝鎖の糖鎖を意味 し、 い わ ゆ る N — グ リ コ シ ド結合型あ る い は 0 — グ リ コ シ ド結 合型の い.ずれであ っ て も良 い。 結合型糖鎖の違い によ つ て ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン の活性が変化す る こ と が知 られて お り、 0 — グ リ コ シ ド結合型糖鎖に関 して、 最近 Parkin son. J. F. ら （ J. Biol. Chem. 265, 12602, (1990) ) は コ ン ド ロ ィ チ ン硫酸様糖鎖が遺伝子工学的手法で作成 し た ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン に結合 し て い る こ と を報告 し て い る。 こ の よ う な糖鑌を有す る ポ リ べ プチ ド も本発明 の ポ リ ぺ プチ ドに含有 さ れ る。 と こ ろ で、 近年の技術水準を持っ てすれば、 ポ リ ぺ ブ チ ドの活性に影響を与えず、 そ の化学構造の一部を変化 さ せ る こ と は きわ めて容易であ る。 従 っ て、 上記ア ミ ノ 酸配列の一部にア ミ ノ 酸の置換、 欠損、 付加等を施 し た ア ミ ノ 酸配列を有す る ポ リ べプチ ド も、 本発明の ポ リ ぺ プチ ドに包含 され る。

本発明 によ る と、 上記の本発明の ポ リ ぺ ブチ ドを コ 一 ドする D N A が提供される。 本発明の D N A に は、 本発 明のポ リ ペプチ ド に、 前述の置換、 欠損、 付加等が施 さ れたポ リ べプチ ド を コ一 ドする塩基配列を有す る D N A も包含 さ れる。

本発明 の D N A は本発明のポ リ ぺ プチ ドを コ一 ドす る 塩基配列を有す る も のであ ればいずれで も よ いが、 好 ま し く は、 下記に示 さ れる塩基配列を有す る こ と を特徵 と す る。 な お、 本発.明 にお いては D N A の塩基配列は 5 ' 末端側か ら記載 し た。 ま た本発明において G, C お よ び T はデォキ シアデニル酸、 デォ キ シ グァ ニ ル酸、 デォ キ シ シチ ジル酸お よ びチ ミ ジル酸をそれぞれ表わす。

X₂ GAGCCGC AGCCGGGTGG CAGCCAGTGC GTCGAGCACG 100 ACTGCTTCGC GCTCTACCCG GGCCCCGCGA CCTTCCTCAA 140 TGCCAGTCAG ATCTGGGACG GACTGCGGGG CCACCTAATG 180 ACAGTGCGCT CCTCGGTGGC TGCCGATGTC ATTTCCTTGC 220 TACTGAACGG CGACGGCGGC GTTGGCCGCC GGCGCCTCTG 260 GATCGGCCTG CAGCTGCCAC CCGGCTGCGG CGACCCCAAG 300 CGCCTCGGGC CCCTGCGCGG CTTCCAGTGG GTTACGGGAG 340 Ο^δΤ 丄 3V 丄 V3V3 丄 3丄 V3 丄丄丄 3

008 T 03丄 33丄 V3V丄 丄 333 3丄∑)V3丄 3丄 33 V丄

09Π 3VV3000V03 9丄 3 3V3 3丄 ί)丄 339丄 3V 丄丄

ΟΖΖΐ 丄丄 3丄 I00V3V0000 丄 丄

08ΤΤ 丄 3333V∑mi) 33丄 3丄 333丄 3 丄 33V丄 丄 3

0 Π 3000V00013 丄 丄 3丄丄 33丄 3333

00Π V3{ 33339V £) 丄 3丄 3丄 3V3 丄 33 丄 丄 3V

090T V丄 333V丄 33丄 丄 丄丄 333丄 OVOVOVVOIO

ΟΖΟΐ 丄 3丄 33丄 3丄 333丄 3 丄 3 V丄 丄 3V9丄

086 V33丄 333丄 3333 VV00VD330D

0 6 丄 33333Vi)V{) 3丄 3V丄 33丄 33 00000V03V9

006 丄 丄 339丄 3丄丄 3V 3 丄 3丄 3 丄 3

098 3丄 333丄 V 33丄 33丄 3333 000 VOVOOOV

0Z 3010000000 390000V000 3丄 丄 33 OOOOiOOOOO 09L 丄 333丄 丄 丄 OOim 30V030I300 0090VV9VD0 0 丄 丄 339丄丄 33393 0300300V00 0V0Q00010V OOi 33333 3丄 3 OOOVOOOOOO 0000330V09 丄 3丄 丄

099 V丄丄 3393丄 33 33丄 333丄 333 033933丄 3000100000 0Z9 丄 丄 IOVOOOOVDO 303300D003 丄丄

08S 33V丄 丄 V 33丄 3丄 33333 33丄 3333333 03000030V0 0 S 3丄 3丄 39ΰ丄 3V 3333 V39丄 33 丄丄

009 3丄 3丄 33丄丄: )3 3丄 丄 3 V00V3DV00V 09 393丄 3丄 0V000V0030 丄 ί)丄 {)丄 33丄 3333丄

02 3丄 3丄 333丄 33 3丄 3丄丄 33333 339丄 3丄 3333 I300001VV0 09S 丄 丄 333 33V丄 V丄 OVOVVO VV3V

- 81 - eZ.800/I6df/X3d sreoo/re O CGGCGGCTTC TGCTCCGGGG TGTGCCACAA CCTCCCCGGT 1380 ACCTTCGAGT GC Y₂ 1392 [但 し、 式中 S は G ま た は X 2は下記式：

ATGCTTGGGG TCCTGGTCCT TGGCGCGCTG GCCCTGGCCG 40 GCCTGGGGTT CCCCGCWCCC G CA 63 [但 し、 E は T ま たは A ]

で表さ れる配列、 ま たはそ の 5 ' 末端か ら 3 塩基単位で 任意数 も し く はすべての塩基が欠失 した配列を示 し、 Y₂ は下記式 ：

ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGYCCGC CAC 1425

[但 し、 1 は T ま たは C ]

で表される配列、 ま たはそ の 3 ' 末端か ら 3 塩基単位で 任意数も し く はすべての塩基が欠失 した配列を示す ] 本発明の D N A は、 ま た、 上記塩基配列に加えて、 そ の 5 ， 末端に適当な プロ モータ ーや S D配列 （ も し く は 任意の リ ボ ソ ー ム結合部位） を有 していて も良 く、 更に 必要に応 じて翻訳開始コ ド ン、 およ び 3 ， 末端に終止 コ ド ンを コ 一 ドする塩基配列を有 していて も良い。

更に好ま し く は、 は下記式：

GCECCCGCA 63

[但 し、 は T ま たは A]

で表される配列、 Y2は下記式：

ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGICCGC 1422

[但 し、 ； Ϊ は T ま たは C]

で表される塩基配列を有す る D N A、 または、 X ₂は下記 式：

GCWCCCGCA 63

[但 し、 1 [ は T ま たは A]

で表さ れる配列、 Y 2のすベ て の塩基配列が欠失 していて いる D N Ao

周知のよ う に、 遺伝暗号の縮重に従い、 遺伝子か ら コ 一 ドされる ポ リ べ プチ ドのア ミ ノ 酸配列を換え る こ と な く、 その遺伝子配列の、 少な く と も 1 つの塩基を他の塩 基に置換する こ と ができ る。 した力 S つ て、 本発明の D N A は、 遺伝子コ ー ドの縮重に基 き、 上記塩基配列の 1 個 以上の塩基が置換 さ れた塩基配列を有 して いて も よ く 、 特に、 本発明のポ リ ペプチ ドを遺伝子工学的に製造す る 際に、 特定の宿主細胞で使用頻度の高い コ ド ン と な る よ う に、 1 個以上の塩基を置換 した塩基配列を有 していて も良い。

本発明の D N A は、 天然物を材料 と して調製する力 ま たは化学的に合成する こ とができ る。 以下にそれら の 方法の例を示す。

天然物を材料と する場合には、 ト 口 ン ボ モ ジ ュ リ ン m R N A を有する細胞も し く は組織よ り 作製 した c D N A ラ イ ブラ リ ーか、 市販の c D N A ラ イ ブラ リ 一、 も し く は染色体遺伝子を材料と し て、 本発明の D N A を含有す る D N A を得、 それを変換 して、 本発明の D N A を得 る こ とがで き る。

c D N A ラ イ ブ ラ リ 一を作製する に は、 ま ず、 公知の 方法 (例えば Mol ecu lar Cloning, a laboratory manual, T . Man i at i s et a 1. , Cold Spring Harbor Laboratory, ( 1982 )) に準 じて、 ヒ ト ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン に対する m R N A を有す る ヒ ト 組織あ る い は ヒ ト 細胞か ら m R N A を抽出す る。 次に、 公知の方法に従い、 得 ら れた m R N A を铸型 と して、 一本鎮 c D N Aを作製 し、 その後、 一 本鎖 c D N Aか ら二本鎖 c D N Aを合成す る （Molecula r Cloning, a laboratory manual, 既出， Landの方法、 Nucleic Acid Reserch, 9 , 2251-2266, (1981)、 Okayam a - Bergの方法、 Mol. Cell. Biol. , 2, 161- 170, ( 1982 )、 お よ び Gubler - Hoffmanの方法、 Gene, H. 263 ( 1983 )参 照） 。 得 られたニ本鑌 c D N A を p B R 3 2 2 や p U C 1 8 に代表さ れる プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー あ る い は λ g t 1 0 や λ g t 1 1 等に代表 さ れる フ ァ ー ジベ ク タ ー に ク 口 ー ン化後、 大腸菌等を形質転換 して D N A ラ イ ブ ラ リ ー を得る こ と ができ る。

染色体遺伝子を材料と す る場合に は、 ヒ ト 組織あ る い は ヒ ト 細胞か ら染色体 D N Aを抽出 し、 こ れを適当な制 限酵素あ る い は物理的手段にて分断後、 ブ ラ ス ミ ドあ る い はフ ァ ー ジへク ロ ー ン化 し、 大腸菌等を形質転換 して D N A ラ イ ブ ラ リ ー を得 る こ と がで き る。

こ の よ う に し て得 られた D N A ラ イ ブ ラ リ ー よ り、 本 発明の D N Aを含有する D N Aを検出 し分離する。 す な わ ち、 適当な標識プ ロ ー ブを用 いた ハ イ プ リ ダ イ ゼー シ ョ ン法 （ Wallace et a 1. , ucleic Acid Res. , 9. 879, (1981) ) 等公知方法にて、 当該 D N Aを含有す る ブ ラ ス ミ ド ま たは フ ァ ー ジを検出 し、 こ の プ ラ ス ミ ド ま た は フ ァ ー ジか ら 当該 D N A を分離する。 標識プ ロ ー ブに は、 本発明に よ り 開示 さ れた、 本発明の ポ リ ペ プチ ドが有す る ァ ミ ノ 酸配列の全部 も し く は一部を コ 一 ドする よ う に 合成 し た、 D N A断片 も し く は R N A断片を放射能標識 し た も の が便利で あ る。 な お放射能標識は、 力 イ ネ 一 シ ョ ン法、 ニ ッ ク ト ラ ン ス レ ー シ ョ ン 法 あ る い は ラ ン ダ ム プ ラ イ ム ラ べ リ ン グ法等の方法を使用 して、 当該 D N A 断片 も し く は R N A断片を ³² P で標識す る のが一般的で め る。

上記の方法で D N A ラ イ ブ ラ リ ー よ り 分離 さ れた D N A を、 以下の方法で本発明 の D N A へ と変換す る こ と が で き る。 た と え ば、 そ の好 ま し い例 の 1 つ と して、 D N A ラ イ ブ ラ リ 一 よ り 分離 さ れた D N A を、 制限酵素を用 いて所望 の部位で消化 し、 D N A断片を得 る。 一方、 本 発明のポ リ べ プチ ド の N末端あ る い は C末端領域がコ一 ドす る塩基配列な ら びに終止コ ド ン、 制限酵素部位、 あ る いは翻訳開始 コ ド ン等を後に述べ る方法で化学合成 し、 適当な合.成 リ ン カ ー を付加 して、 先に得 られた D N A 断 片 と結合 さ せ、 プ ラ ス ミ ド あ る いは フ ァ ー ジ に所望の D N A と し て ク ロ ー ン化す る こ と がで き る。 塩基配列を化 学合成す る際に、 塩基配列 に任意の修正を加え る こ と も 可能であ る。

ま た、 他の好ま し い例 と して、 Polymerase Chain Rea ction (以下 P C R と略す） 法があ げ ら れる。 すな わち、 本発明の ポ リ べプチ ドの N末端、 C 末端領域お よ び中間 領域を コ ー ドす る 塩基配列 のォ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド、 も し く は、 必要に応 じ て、 それ ら に終止 コ ド ン、 制限酵素部 位、 あ る い-は翻訳開始コ ド ン等を加えた塩基配列を含む ォ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを化学合成する。 こ れ ら をプ ラ イ マ 一 と して、 前述の方法に よ り ラ イ ブ ラ リ ー よ り 分離さ れ た D N A に対 して P C R法を行い、 本発明の D N A を増 幅 さ せて得る こ と がで き る。 ブ ラ イ マ 一 と し て用 い る ォ リ ゴヌ ク レオ チ ド は、 塩基配列に、 任意の修正を加え た も ので も良い。 ま た、 こ れ ら プ ラ イ マ ーを利用 して、 直 接、 前述の D N A ラ イ ブ ラ リ 一 に対 して P C R法を行な い、 本発明の D N A を増殖 さ せた後、 分離 し て、 適当 な プラ ス ミ ドゃ フ ァ ー ジに ク ロ 一 ンィ匕 し て も良い。 なお、 P C R法 は文献や成書 ( PCR Protocol s, A Guide to me thods and applications, Michael A . I.' e t a 1 , Acad emic Press. (1990 ) ) を参考に して行 う こ と がで き る。

以上の方法の他に も、 Kramer. W 等の方法 （ Nucleic Acid Res.. ϋ, 9441-9465, (1984) ) お よ び ethods i n Enzymology, 154. 350 - 367, ( 1988 ) ) に準 じた Site— directed mutagenesis 法等、 公知方法を適宜利用 して得 る こ と がで き る。

一方、 化学的に合成す る には、 所望の D N Aを設計 し、 必要であ れば適度の断片に分割 した後、 それ ら に相当す る オ リ ゴマー を全 自動 D N A化学合成機 （例 えば 3 8 1 A型、 ア プ ラ イ ドバ イ オ シ ス テ ム ズ社製） を用 い て化学 合成する。 得 られた D N A オ リ ゴマ ーを、 必要があれば T 4 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド キ ナ ー ゼ に て D N A 5 ' 末端を リ ン酸化後、 ア ニー リ ン グす る o さ ら に、 必要があれば T 4 D N A リ ガ一ゼにて結合 した後適当なベ ク タ ー に ク 口 ー ン化す る こ とが可能であ る。

本発明によれば、 下記よ り選ばれる少な く と も 1 つ の 工程を行 う こ と を特徴とす る、 本発明のポ リ ペプチ ドの 製造方法が提供さ れる。

a ) 当該ポ リ ぺプチ ドを コ 一 ドする塩基配列を有する D N Aを得 る工程、

b ) 発現用ベ ク タ ー に当該 D N Aを組み入れて、 当該 D N Aを含む複製可能な組換え D N A を得る工程、

c ) 当該組換え D N A で宿主細胞を形質転換 さ せ て、 当 該ポ リ ぺ プチ ドを発現 し得 る形質転換体を得 る工程、 d ) 該形質転換体を培養 して、 当該ポ リ ペプチ ドを産生 せ しめ、 培養混合物か ら当該ポ リ ペ プチ ドを回収するェ 本発明のポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る塩基配列を有す る

D N A は、 前述の方法に よ り得る こ と がで き る。

ま た、 こ こ で使用する発現用べク 夕 一 と しては、 使用 す る宿主内で複製可能なベ ク タ 一であればいずれで も よ いが、 好ま し く は、 当該ポ リ ペプチ ドを宿主内で発現 さ せ るため に必要な プロ モー タ 一、 更に必要に応 じて S D 配列 （ も し く は任意の リ ボ ソ ー ム結合部位） およ び ぁ る いは シ グナ ノレぺ プチ ドを コ一 ドす る D N A を含有 し、 使用す る 宿主内で複製可能な ベ ク タ ーを選択する。 使用 す る プ ロ モー タ ー、 S D 配列 （ も し く は任意の リ ポ ゾ一 ム結合部位） およ び シ グ ナ ルぺ プチ ドを コ一 ドする D N A は、 使用す る宿主内で機能す るすべて の プ ロ モー タ 一、 S D配列 （ も し く は任意の リ ボ ゾー ム結合部位） およ び シ グナ ノレぺプチ ド を コ一 ドす る D N A が使用可能であ り、 こ れ ら は化学的に合成す る か、 あ る い は使用する宿主、 ウ ィ ル ス 、 プ ラ ス ミ ド、 フ ァ ー ジ等か ら入手する こ と 力 S 可能であ る。

得 ら れた組換え D N A を導入する 宿主細胞は、 C O S 細胞、 C H O 細胞、 酵母等に代表さ れる真核生物細胞で あ っ て も、 ま た、 大腸菌、 枯草菌等に代表 さ れる原核生 物細胞で あ っ て も良 く、 本発明のポ リ べプチ ドの発現に 適 した細胞を適宜選択 して使用す る こ と がで き る が、 好 ま し く は、 C 0 S 細胞、 C H 0 細胞がよ い。 ま た、 宿主 細胞と発現用ベ ク タ ー は、 互いに機能 し合い、 当該ポ リ ぺブチ ド を コ 一 ドす る D N A を発現 し得る組み合わせで 使用す る のが有用であ る。 例えば、 発現用ベ ク タ ー と 宿 主の組み合わせの好ま し い例 と して は、 C O S — 7 細胞 ま た は C H O 細胞 と、 シ ミ ア ン ウ ィ ル ス 4 0 ( S V 4 0 ) の初期の プロ モー タ ーを含有す る発現用ベ ク タ ー、 ；3 ァ ク チ ン の プ ロ モー タ ーを含有す る p H A P r — n e o ま たは S R a プ ロ モー 夕 一 を含有す る p C D L — S R a 2 9 6 由来の哺乳動物発現べ ク タ 一、 大腸菌 H B 1 0 1 株と ト リ プ ト フ ァ ンプロ モ ー夕 一、 ト リ プ ト フ ァ ン S D 配列を コ ー ドする D N A を含有する発現用べ ク タ 一の組 み合わせな どがあ げ られる。

発現用ベク タ ーで形質転換さ れた宿主は、 微生物あ る いは動物細胞を培養する の に用い ら れる一般的方法、 例 えば 「生物化学工学」 （合葉修一等著、 1 9 7 6 年、 東 京大学出版会） 、 「組織培養」 （中井準之助等編、 1 9 7 6 年、 朝倉書店） 等に記載さ れた方法に準 じて培養す る こ と ができ る。 形質転換 された宿主によ っ て生産さ れ る当該ポ リ ペプチ ドは、 培養混合物か ら単離、 精製 して 回収する こ どがで き る。 精製は、 多 く の文献や成害、 例 えば、 「生化学実験講座 1 タ ン パ ク 質 の化学」 （ 日本生 化学編、 東京化学同人、 1 9 7 6 年） 等に記載さ れた方 法を参考に して実施する こ とが可能であ り、 すなわち、 精製方法 と し て透析、 塩析、 ゲ ル ろ過、 酸沈殿、 イ オ ン 交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー、 ァ フ ィ 二 テ ィ 一 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ一、 高速ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー、 電気泳動等を適宜組 み合わせて行な う こ と がで き る。 好ま し く は、 本発明の ポ リ ペプチ ドを含む培養混合液を、 イ オ ン交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一、 ト ロ ン ビ ン を リ ガ ン ド と し た ァ フ ィ 二 テ ィ 一ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー お よ びゲル ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 の う ちか ら選ばれる少な く と も 1 つを用いて製造す る こ と がで き る。

すなわ ち、 本発明のポ リ ぺプチ ドを含む培養混合液を、 分画分子量 3 万の限外濾過膜等を用 いて脱塩濃縮する。 つ いで、 濃縮 した 養混合液を p H 0 〜 1 0、 好ま し く は ρ H 7 . 3 ± 0 2 に調整 した後に、 蛋白分解酵素を 不活性化するため 5 0 〜 7 0 °Cで 5 ~ 4 5 分間、 好ま し く は 6 0 ± 5 °C で 1 5 ± 5 分間処理 し、 p H 5 . 0 〜

7 . 5、 好ま し く は p H 6 . 5 ± 0 . 2 に コ ン デ イ シ ョ ニ ング し た陰ィ ォ ン交換樹脂カ ラ ム に通 して活性画分を 吸着させ る。 ついで、 p H 2〜 4 . 5、 好ま し く は p H 4 . 0 士 0 . 0 5 の緩衝液で活性画分を溶出する。 溶出 液は、 分画分子量 3 万の限外濾過膜で脱塩濃縮 した後、 p H 7 . 5 に調整 し 、 卜 口 ン ビ ンを リ ガ ン 卜' と した ァ フ ィ ニ テ ィ カ ラ ム に し、 0 • 0 5〜 0， 3 M N a C 1 好ま し く は 0 . 1 0 . 0 5 Μ Ν a C 1 を含む洗浄液 で洗浄後 0 . 9〜 2 • 0 M N a C 1 、 好ま し く は 1 . 0 ± 0 . 0 5 M N a C 1 を含む溶出液で活性画分を溶 出— s る。 溶出液を脱塩 1m ΓΗ した後、 再度 ト ロ ン ビ ン を リ ガ ン ド と したァ フ ィ カ ラ ム に通 し、 0 . 3 ~ 0 .

8 M N a C 1、 好ま し く は 0 . 7 土 0 . 1 M N a C 1 を含む洗浄液で洗浄後 0 • 9 ~ 2 0 M N a C 1、 好ま し く は 1 . 0 0 . 0 5 M N a C 1 を含む溶出液 で活性画分を溶出する。 溶出 した活性画分を脱塩濃縮 し た後、 ゲル濾過力 ム にて本発明のポ リ ぺ プ チ ド に相当 す る活性画分を分 分取すれば、 本発明のポ リ ぺ ブチ ド を純粋な形で得る と がで き る o ま た、 ァ フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム に て溶出 し た画分を脱塩濃縮後、 非還元状態の S D S - P A G E で分離 し、 本発明の ポ リ ぺブチ ドを純枠 な形で得 る こ と も で き る。 得 ら れた本発明の ポ リ べ プチ ド は、 6 0 ± 2 °Cで 1 0 時間処理をす る こ と に よ り ウ イ ル ス を不活化 し、 医薬品 と して適 し た状態にす る こ と が で き る。

上述 し た.精製過程で用 い る 陰 ィ ォ ン交換樹脂 と して は、 D E A E セ ル ロ ー ス、 D E A E セ フ ァ ロ ー ス、 D E A E セ ル ロ フ ア イ ンな どがあ り、 ト ロ ン ビ ンを リ ガン ド と し た ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム は、 セ ノレ ロ ー ス、 ァ ガ ロ ー ス、 デ キ ス ト ラ ンな どの担体に、 臭化 シ ア ン を用 いて ト ロ ン ビ ン を結合 さ せた後、 ジ ィ ソ プ ロ ピ ノレ フ ノレ オ ロ フ ォ ス フ エ ー ト （ D I P ) 、 フ エ 二 ノレ メ タ ン ス ル フ ォ ニ ル フ ロ リ ド な どで処理 し た も のを使用する。 ゲル濾過用 の樹脂 と し て は、 セ フ ァ ク リ ノレ S — 2 0 0、 セ フ ァ ク リ ノレ S — 3 0 0、 セ フ ア デ ッ ク ス G 1 5 0 な どを用いる こ とができ る。 上記の方法によ り、 本発明の ポ リ ぺ プチ ド を純粋な形 で得る こ と がで き る。 同様の方法に よ り、' 類似 し た性質 を持つ別物質を得 る こ と も で き る。

本発明のポ リ ベプチ ドの作用およ び性質を以下に示す。 (実験例 1 ) ト ロ ン ビ ン に対す る親和性 （抗 ト ロ ン ビ ン 作用）

a ) D I P — ト ロ ン ビ ン ァ ガ ロ ー ス を用 い る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー処理で、 実施例 3 で p K C R — T M— V a 1 由来の組換え ヒ ト 尿 ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン （以下 で u T M - V a 1 と略す） お よ び実施例 6 — （ 2 ) で作製 した組 換え ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン （以下 r u T M— A l a と略す） はほぼ 1 0 0 %吸着する。

b ) 牛 ト ロ ン ビ ン （ l U Zm L , 持田製薬社製） 1 0 0 L と r u T M — V a 1 または r u T M - A 1 a を含 む溶液 1 0 0 / L と を混和 し、 3 7 °Cで 3 0 分間加温 し た後、 ヒ ト- フ イ ブ リ ノ一ゲ ン （ 2 m g /m L、 SIGMA 製） 1 0 0 〃 L を加え、 コ アギュ ロ メ 一 夕 一 （ァ メ ノレ ング社 製） に て凝固時間を測定す る。

結果を第 1 表に示す。 1 衣

こ の結果に示される よ う に、 r u T M — V a l および r u T M— A l a は ト ロ ン ビ ン と結合 し、 そ の凝固活性を 著 し く 抑制する作用を有す る。

第 2 表に、 特開昭 6 2 - 1 6 9 7 2 8 号公報記載の ヒ ト 胎盤よ り精製 し た ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン様物質につ い て の凝固時間の測定結果を引用 して示す。 第 2 表

さ ら に、 同公報の記載に よ れば、 こ の ヒ ト胎盤 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン様物質は既存の ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン よ り

2 倍以上強力であ る と の記載があ り、 第 1 表 と第 2 表の 比較か ら、 r u T M - V a 1 およ び r u T M - A 1 a は 既存の ヒ ト ト ロ ン ポ モ ジ ュ リ ン よ り 強力な抗 ト ロ ン ビ ン 作用を有する と考え られる。

(実験例 2 ) プ ロ テ イ ン C 活性化能

ト 口 ン ビ ン共存下での プ ロ テ ィ ソ C の活性化能を合成 基質 B o c - L e u - S e r - T h r - A r g — M C A

(財団法人蛋白質研究奨励会ぺプチ ド研究所製） を用 い て測定す る。 すな わ ち、 0. 1 M ト リ ス塩酸緩衝液

( p H 7. 5 ) 6 に牛 ト ロ ン ビ ン （持田製薬製）

1 0 Uノ m L 溶液を 2 0 z L添加 し、 実施例 6 — （ 2 ) で作製 した r u T M — A 1 a および ヒ ト尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の C末端ァ ミ ノ 酸 1 0 個が欠失 した変異型の組換 ぇ ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン （以下 D E L 1 0 と略す） を含む溶液 （ 0. 1 〜 ； l O / g m L ) を添カロ し、 さ ら に、 ヒ ト プ ロ テ イ ン C ( ア メ リ カ ン ダ イ ァ グ ノ ス テ ィ カ 社製） の 5 0 0 g Z m L 溶液を 1 O / L添加 する。 3 7 。Cで 3 0 分間反応 した後、 反応液に ヒ ト ア ン チ ト ロ ン ビ ン （ ミ ド リ 十字製） 1 U Z m L と へパ リ ン (持田製薬製） 1 O U Z m L の等量混合液を 1 5 0 u L 添加 して渴和後、 さ ら に、 3 '7 °Cで 1 5 分間反応する。 ついで、 反応液に前記合成基質 0. 1 011^溶液を 2 5 0 L添加 して、 3 7 。Cで 1 0 分反応後に、 2 0 %酢酸溶 液 5 0 0 を添加 して反応を停止する。 そ の後、 反応 液を蛍光光度計 （ 日立製作所製） を用いて、 励起波長 3 8 0 n m、 発光波長 4 6 0 n mで蛍光強度を測定する。 ポ ジテ ィ ブコ ン ト ロ ー ル と して、 ヒ ト胎盤よ り参考例に 示 した方法で精製 した ヒ ト 胎盤 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ンを用 いた。 蛍光強度か ら プ ロ テ イ ン C活性化能を算出する と . r u T M - A 1 a および D E L 1 0 は第 3 表に示すご と く 、 ト ロ ン ビ ン共存下で ヒ ト胎盤 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン に 比べて著 しいプロ ティ ン C 活性化能を有する。 第 3 表

*1 ヒ ト胎盤 ト ロ ン ボ 乇 ジ ュ リ ン の活性を 1 とす る (実験例 3 ) 抗血液凝固活性

健常人 ク ェ ン酸添加乏血小板血漿 1 0 0 a L と、 r u

T - V a 1 ま た は r u T M— A l a を含む溶液 （ 1 0 〜 ： l 0 0 g /m L ) 1 0 〃 L を混和 し、 3 7 °Cで 2 分 間加温 し た後、 ヒ ト ト ロ ン ビ ン （ ミ ド リ 十字製、 ² Uノ m L ) 1 0 0 L を加え、 凝固時間を測定す る と、 r u T M— V a l およ び r u T M— A l a は強力な血液凝固 時間延長作用を示す。

(実験例 4 ) マ ウ ス にお け る急性毒性

5 匹の d d Y系雄性マ ウ ス を用いて、 r u T M — V a 1 ま たは r u T M — A l a を静脈内投与 し、 7 日後ま で の観察を行な う と、 薬効用量において著明な毒性や死亡 例は 1 例 も認め られなか っ た。

(実験例 5 ) 溶解性- r u T M - V a 1 およ び r u T M — A l a は、 室温に おいて少な く と も 3 0 m g / m L の濃度ま で蒸留水に溶 解 した。

ま た、 可溶性である r u T M は、 i n v i v o にお いて静脈内投与 した場合、 リ ン脂質 と の結合能を有す る 難溶性の胎盤 ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン に く らベてす ぐれた D I C改善作用を示す。

以上の説明及び実験か ら 明 らかな よ う に、 本発明の ポ リ ぺプチ ドは強力な ト ロ ン ビ ン結合能、 抗血液凝固作用 およ び血栓溶解作用を有 し、 さ ら に毒性 も低い こ とか ら、 例えば、 D I C、 各種血栓症、 末梢血管閉塞症、 心筋梗 塞、 脳梗塞、 一過性脳虚血発作、 妊娠中毒症、 肝不全、 腎不全な ど、 血液凝固亢進に係わる疾患の予防および治 療に有効であ る と予想される。

本発明のポ リ ぺ プチ ドは、 薬剤と して一般的に用い ら れる適当な.担体ま たは媒体、 例えば敏菌水や生理食塩水、 植物油、 無害性有機溶媒等、 さ ら に は必要に応 じて賦形 剤、 着色剤、 乳化剤、 懸濁剤、 安定化剤ま た は保存剤等 と適宜組合せて、 患者に効果的に投与する の に適 した医 薬用製剤、 好ま し く は注射剤に調製する こ と がで き る。 本発明の ポ リ ぺプチ ドを注射剤 と して用いる場合には、 —日 1 回ない し 6 回に分割 して、 一度にあ る いは持続的 に患者に投与される。 その一曰投与量は、 ゥ サギ肺 ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ンに換算した力価で表す と、 本発明のポ リ ペプチ ド 0 . 0 5 〜 5 0 0 m g力価、 好ま し く は 0 . 1 〜 1 O m g力価であ るが、 患者の年齢、 体重、 症状等に 応 じて適宜増減す る こ とが出来る。

さ ら に、 本発明のポ リ ペプチ ドは人工血管、 人工臓器、 力 テー テ ルな どの医用器材の表面に架橋剤な どを用いて 結合 ' 吸着させて使用する こ と がで き る。 こ れに よ り、 医用器材表面での血液凝固を防 ぐ こ と ができ る。 発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を も って、 本発明を一層具体的に説明す る が、 こ れら は実施の一例 と して示す も のであ り、 本発 明は こ れ ら によ り 何等限定 される も のではな い。 ま た、 以下の記載において用い る略号は当該分野に おけ る慣用 略号に基づ く ものである。

ま た、 遺伝子組換えに関わる技法 と して、 特に記載の ない限 り 「Maniatis, 丁. et al . olecular Cloning, C old Spring Harbor Laboratory. ( 1982) J 、 厂遺伝子操 作実験実用ハ ン ド ブ ッ ク 、 小林茂保 監訳 ジ ャ テ ッ ク 出 版 （ 1985 ) 」 等の窨物な ら びに試薬あ る いは器具に添付 のブロ ト コ ー ルを採用 して行っ た。 ま た、 使用 した制限 酵素につ いては特に記載のない限り、 宝酒造社製ま た は、 ニ ュ ー ィ ン グ ラ ン ド ノ ィ ォ ラ ブ社製 の も の.を用 い た。

なお、 実施例に開示する r u T M — A 1 a 高発現株 T M M - B 1 C は通商産業省工業技術院微生物工業技術研 究所に、 平成 3 年 6 月 2 5 曰よ り微ェ研条寄第 3 4 6 3 号 （ F E R M B P — 3 4 6 3 ) と して寄託されている。

実施例 1

ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N A の ク ロ ー ニ ン グ と発現プ ラ ス ミ ドの作製

( 1 ) ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N A の ク ロ 一 ニ ン グ

ヒ ト 尿よ り 精製単離さ れた ヒ ト尿 ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン の N末端ア ミ ノ 酸配列の一部であ る、

Gl u His Asp Cys Phe Ala

15

を基に、 第 1 図に示すオ リ ゴヌ ク レ オ チ ドを化学合成機 (既出） に て作製 した。 0 P C カ ラ ム （ ア プ ラ イ ド バ イ ォ シ ス テ ム社製） に て精製後、 T 4 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド キ ナ ー ゼ （宝酒造社製） 及び [ 7 — ³² P ] A T P ( ア マ シ ャ ム社製） を使用 し、 5 ' 末端標識 した。 次に こ の反応 液を Sephadex G- 25 ( フ ア ルマ シ ア社製） に ア プ ラ イ し、 標識オ リ コ：：ヌ ク レ オ チ ド を [ 7 — ^S2P ] A T P よ り 分離 し、 プ ロ ー ブ と し て以後の操作に使用 した。

ヒ ト 胎盤約 2 0 g を材料 と し て、 グァ ニ ジ ン チ オ シ ァ ネ ー ト 法 によ り 全 R N A を抽出 した。 得 られた R N A の う ち 1 O m g を使用 して、 オ リ ゴ d T セ ル ロ ー ス （ タ イ プ 7、 フ ア ル マ シ ア 社製） カ ラ ム に 2 回通す こ と に よ り 、 ポ リ A + R N A約 9 0 g を精製 し た。 次に こ のポ リ A ⁺ R N A を材料 と して c D N A の ク ロ 一ニ ン グを行っ た。 すなわち、 ポ リ A + R N A 2 0 〃 g よ り、 オ リ ゴ d T を プ ラ イ マ ー と し て、 Gubler と Hoi fman の方法 .（ Gubler.

U. and Hoffman, B. J . Gene. 11.263 ( 1983 ) ) に従 つ て、 2 本鑌 c D N A を作製 した （ c D N A合成 シ ス テ ム

( ア マ シ ャ ム社製） を使用） 。 c D N Aを E c o R I メ チ ラ ー ゼ に よ り メ チ ルイ匕 し た後、 E c o R I リ ン カ一を ラ イ ゲ一 シ ヨ ン し、 E c o R I にて切断後、 リ ン カ 一 お よ び約 5 0 0 b p 以下の D N A をゲ ル ろ過 （ B i o G e 1 A 5 0 m、 バ イ オ ラ ッ ド社製） に よ っ て除去 した。 こ の D N A を フ ァ ー ジベ ク タ 一 え g t 1 1 ( ア マ シ ャ ム社 製） へ ク ロ 一 ユ ン グ し、 揷入効率約 9 0 %、 独立ク ロ ー ン数約 2 X 1 0 ⁶ 個 の c D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作製 し た。 こ の え g t 1 1 ラ イ ブ ラ リ ー の フ ァ ー ジ を常法に従い、 大腸菌 Y 1 0 9 0 株を宿主 と し て、 9 c m シ ャ ー レあ た り 約 5 x 1 0 ³ ケ と な る 様 に プ ラ ー ク を生 じ さ せた。 こ の プラ ー ク を、 ナ イ ロ ン膜 （ H y b o n d — N, ア マ シ ャ ム社製〉 へ転写 さ せ、 膜を 1 . 5 M N a C l ノ 0. 5 M N a O H次いで 1 . 5 M N a C l Z 0. 5 M T r i s 一 H C 1 ( H 8. 0 ) の順序にて、 各溶液を含ま せた ろ紙上に 5 分間ずつ置 く こ と に よ り、 D N A を変性さ せ た。 次に 同膜を 0. 3 6 M N a C l Z 2 0 m M リ ン酸ナ ト リ ウ ム （ ρ Η 7. 4 ) / 2 m M E D T A ( p H 7. 4 ) にて洗浄 した後、 風乾さ せた。 紫外線照射に よ り、 膜上 に D N A を固定 さ せた後、 さ ら に同膜を 0. 1 % S D S / X 0 . 1 S S C 中 にて （ S S C : x l 濃度 1 5 0 m M N a C 1 / 1 5 m M ク ェ ン酸ナ ト リ ウ 厶 （ ρ Η 7. 0 )

) 6 5 。C , 1 時間洗浄 し た。 こ の D N A を固定 した膜 を、 X 6 S S C Z 5 O m M リ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ P H 6. 8 ) X I デ ン ハ ル ト 溶 液 Z 1 0 0 β g / m L 変 性サ ケ精子 D N A 中で、 6 5 。C, 6 〜 2 4 時間プ レハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン を行な い、 さ ら に同溶液 に先の 5 ' 末端標識オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを約 1 0 ⁶ c p m m L 添 加 した溶液にて 3 7 。Cで一晚ハ イ ブ リ ダイ ゼー シ ヨ ン し た。 ノ、 イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン後、 X 6 S S C にて 4 。C , 3 7 ^eC及び 4 2 ^eC にて各々 5 ~ 3 0 分間膜を洗浄後、 風 乾さ せ、 ォ 一 ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ーを行な っ た。

以上の操作を、 ブ ラ 一 ク 約 3 X 1 0 ⁶ 個 に対 し て行な い、 使用 し た プロ ー ブに陽性を示 し た 2 3 個 の ク ロ ー ン を分取 し た。 分取 したク ロ ー ン化フ ァ 一 ジにて再びブ ラ — ク を形成後、 前述のハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン操作を行 な い、 再び陽性を示 した ク ロー ン 9 個について、 フ ァ ー ジ D N A を採取 した。 制限酵素 E c o R I で消化 した結 果、 A g t l l 中 には、 約 0. Ί 〜 2. 5 k b の挿入 D N Aが認め られた。 こ の内最長を示 した 2. 5 k b D N A の制限酵素地図を第 2 図に示す。 こ の地図上、 E c o R I 及び P s t I を両端に もつ 2 種の断片を、 常法に従 い M l 3 フ ァ ー ジ m p l 8 あ る い は m p l 9 へサ ブ ク ロ 一 二 ン グ を行ない、 一本鎖フ ァ ー ジを調製後、 D N A シ — ク ェ ン サ ー （ 3 7 0 A , アプラ イ ドバイ ォ シ ス テ ム ズ 社製） に て塩基配列を決定 した。 そ の結果、 約 0. 4 k b の E c o R I / P s t I D N A断片の塩基配列か ら想 定される ア ミ ノ 酸配列に、 ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の N 末端配列に一致す る ものが認め られ、 本 c D N A が ヒ ト 尿 ト ロ ン ボモ ジュ リ ン の も のである事が確認された。 2. 5 k b D N A の他の領域に塩基配列を決定 した結果を第 3 図 （ a ) 〜第 3 図 （ m ) に示す。

( 2 ) 組換え ヒ ト 尿 ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン発現べク タ 一 の 作製

哺乳動物細胞発現用プ ラ ス ミ ド の作製 （第 4 図 （ a ) 〜第 4 図 （ b ) )

2. 5 k b の ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N A を E c o R I 消ィ匕 し、 ァ ガロ ー ス ゲル電気泳動後、 ゲ ル よ り 単離 し、 プ ラ ス ミ ド p U C 1 1 8 へ サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し た。 ブ ラ ス ミ ド D N A を調製 し、 E c o R I に て消化後、 T 4 D Ν Α ポ リ メ ラ ー ゼ （宝酒造社製） にて平滑末端と し た。 こ の末端に B a m H I リ ン カ一 （宝酒造社製） を ラ イ ゲ ー シ ヨ ン キ ッ ト （宝酒造社製） にて接続さ せ た後、 B a m H I お よ-び K p n I に て二重消化 し、 得 られた約 1， 5 k b の D N A断片を泳動後ゲルよ り単離 し た。

—方、 第 5 図 （ a ) に示 される ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン c D N A K p n l サ イ ト か ら ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン C末端ア ミ ノ 酸配列 （ Leu Ala Arg) を コ一 ド し、 直後に '終止コ ド ン および制限酵素 B a m H I サイ ト を含む 2 種 の リ ン カ一 D N A (各々 4 9 m e r お よ び 5 3 m e r の 組み合わせ） を前述の合成機 （既出） にて作製 した。 但 し、 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド の精製は逆相 H P L C ( C 8 力 ラ ム、 A Q U A P O R E R P — 3 0、 ア プ ラ イ ド ノ イ シ ス テ ム ズ社製） に て行 っ た 6 4 9 m e r の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を T 4 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド キ ナ 一 ゼ （既出） に て 5 ' 末端を リ ン酸化後、 5 3 m e r オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と ァ ニ ー リ ン グ さ せ た。

次に本 リ ン カ一を、 用意 した約 1 . 5 k b ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N A の B a m H I / K p n I 断片と ラ イ ゲ ー シ ョ ン し （既出） 、 続いて B a m H I に て消化後ァ ガ ロ ー ス電気泳動を行いゲ ル よ り 約 1. 6 k b D N A を単 離 した。 ま た一方で哺乳動物細胞発現用ベク タ ー p K C R ( 0' Hara, K, et. a 1. Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA 78 1527 (1981 )) を B a m H I に て消化後、 フ ォ ス フ ァ 夕 ーゼ （宝酒造社製） 処理を行な っ た直鎮状 D N Aを用 意 し、 こ れと 1. 6 k b D N Aを ラ イ ゲー シ ヨ ン （既出） し ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン動物細胞発現用プ ラ ス ミ ド、 p K C R - T M - A 1 a お よび p K C R— T M— V a 1 を作製 した ^

大腸菌発現用プ ラ ス ミ ド の作製 （第 6 図 （ a ) 〜第 6 図 （ b ) )

既出の プラ ス ミ ド p K C R — T M— A l a およ び p K C R - T M - V a 1 を B a m H I お よ び S m a I に て二 重消化 して各々 の生 じた 1. 3 k b D N A断片をァガ ロ ー ス ゲル電気泳動後単離 した。 一方、 第 5 図 （ b ) に示 す 6 9 m e r およ び 6 7 m e r か ら な る リ ン カ ーを前述 の様に D N A合成機にて作製 した。 こ の う ち 6 7 m e r の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド の み を ヌ ク レ オ チ ドヰ ナ ー ゼに て リ ン酸化を行な っ た後、 2 種を了 ニ ー リ ン グ し、 先の 1. 3 k b D N A と ラ イ ゲー シ ヨ ン し、 つ いで S m a I お よ び B a m H I にて二重消ィ匕 した。 ま た一方で、 ブラ ス ミ ド p M 4 5 0 ( Kanamori, T. et a 1 , Gene. 6_6. 295~ 30 0 , (1988) ) を B a m H I と N cl e I にて二重消化 し得 ら れた約 3. 2 k b D N A を ァガロ ー ス ゲル電気泳動後単 離 した。 こ の約 3. 2 k b D N A と、 前述の ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N A と リ ン カ 一 D N A の接続された D N A 2 種と を ラ イ ゲー シ ヨ ン し、 ヒ ト尿 ト ロ ン ポ モ ジユ リ ン 大腸菌発現用プラ ス ミ ド P M 4 5 0 — T M— A l a お よ び p M 4 5 0 - T M - V a 1 を作製 した。 実施例 2

ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N A の ク ロ ー ニ ン グ と 発現 プ ラ ス ミ ド の作製

( 1 ) 卜- ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N A の ク ロ ー ニ ン グ 実施例 1 一 （ 1 ) で得 られた ヒ ト胎盤由来のポ リ A ⁺ R N A 1 0 ;/ g よ り、 常法に従っ てオ リ ゴ d Tをブラ イ マ 一 と して逆転写酵素 （宝酒造社製） によ り 1 本鎖 c D N A を作製 した。

—方、 実施例 1 一 （ 1 ) で得 られた ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジュ リ ンを コ 一 ドする c D N A の塩基配列の一部に対応 し、 かつ 5 ' 端に制限酵素 S a i l , B a m H I , E c o R I , H i n d mま た は P s t I のいずれかの認識 部位を有する オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド 6 種 （第 7 図） を化学 合成機 （既出） に て作製 し た。 但 し、 S I , S 2 , S 3 , 及 び、 A 1 , A 2 , A 3 は そ れぞれ ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N A の +鎖及び一鎖の一部に対応する。 尚、 S 3 に は サ イ レ ン ト ミ ユ ー テ ー シ ョ ン に よ り 制限酵素 X h o I 認識部位を導入 した。 ま た、 A 3 は終止コ ド ン に 対応す る D N A配列を含む。 合成 したォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドは、 O P C カ ラ ム （既出） にて精製 した。

次に、 1 本鎖 c D N A を铸型 と し化学合成 した ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を プ ラ イ マ ー と し て P C Rを行い、 ヒ ト 尿 ト ロ ンボ乇 ジ ュ リ ン c D N A を 3 つ の部分に分割 して増 幅 した。 即ち、 1 本鎮 c D N A約 5 0 n g、 プ ラ イ マ 一 ( S I 及び A l ) 各 0. 8 g、 耐熱性 D N Aポ リ メ ラ ー ゼ ' 一 キ ン エ ルマ ー シ ー タ ス社製） 2. 5 ュ ニ ッ ト を含む 1 0 m M T r i s — H C 1 ( H = 8. 3 ) / 5 0 m M K C 1 / 1. 5 m M M g C 1 2/ 0. 0 1 % ゼ ラ チ ン か ら成る 反応液 1 0 0 n L をサー マ ルサ イ ク ラ 一 '一キ ン エ ル マ ー シー タ ス 社製） に セ ッ ト し、 ァ ニ 一 リ ン グ ： 5 5。C， 2 分， 栢補鎮合成 ： 7 2 。C， 3 分， 熱変性 ： 9 4。C， 1 分， サ イ ク ル数 ： 3 0 の条件下で P C R を行い、 フ エ ノ ー ル ' ク ロ 口 ホ ル ム処理、 エ タ ノ ー ル沈殺に よ る精製を経て増幅 し.た約 4 5 0 b p の大き さ を有す る D N A : フ ラ グ メ ン ト I を得た。 同様に、 ブ ラ イ マ一 と して S 2 及び A 2 ま た は S 3 及び A 3 を用いて P C R を行い、 約 6 5 0 b p の大き さ を有す る D N A : フ ラ グ メ ン ト Π, 約 3 5 0 b p の大 き さ を有する D N A ： フ ラ グ メ ン ト ΙΠを得た。 フ ラ グ メ ン ト I , Π， IIIは各 々 S a l l / B a m H I , H i n d Π / S a 1 I , P s t I Z B a m H I で制限酵素消化 し た後常法に従 っ て p U C 1 1 8 へサ ブ ク ロ ー ニ ン グ し、 p U C l 1 8 - F I， p U C 1 1 8 - F Π , p U C 1 1 8 — F HIを各々 作製 し た。

P C R に よ り増幅 して得た ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジユ リ ン c D N A の 3 つの D N A断片は以下の操作に従っ て連結 し、 シ グナ ルペプチ ド及び成熟蛋白全長を コ ー ド し、 か つ 3 ， 末端に終止 コ ド ン が付加 さ れた c D N Aを得た。 ま ず初め に、 P U C 1 1 8 — F I を制限酵素 H i n d ni 及び B a m H I で消ィ匕 し、 ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動に よ り 常法に従っ て約 4 5 0 b p の大き さ を有す る D N A を 分離 した。 こ の D N Aを更に制限酵素 D d e I で消化 し 精製 して、 5 ， 末端が H i n d IE切断面、 3 ， 末端が D d e l 切断面を有する D N A : F I を得た。 同様に p U C 1 1 8 — F Π カ> ら、 制限酵素 H i n d ΠΙ, S a 1 I 消 化、 分離、 制限酵素 D d e I 消化， 精製を経て、 5 ' 末 端が D d e I 切断面、 3 ' 末端が S a 1 I 切断面を有す る約 6 5 0 b p の大き さ の D N A : F it を、 ま た p U C 1 1 8 — F IEか ら、 制限酵素 X h o I 、 E c o R I 消化、 分離精製を経て、 5 ' 末端が X h o I 切断面、 3 ， 末端 が E c o R I 切断面を有す る約 3 5 0 b p の大き さ の D N A ： F DIを得た。 次に、 F I , F Π , F HI と p U C l 1 8 の H i n d DI / E c o R I 消化物と を常法に従っ て ラ イ ゲー シ ヨ ン さ せ、 所望 の c D N A を含む プラ ス ミ ド p U C — T Mを作製 した。 （構築過程を第 8 図に示す。 ） ま た、 c D N A部分を常法に従い M 1 3 7 7 ~^:' m p l 8 あ る いは m p 1 9 へサ ブク ロ ーエ ン グ し、 1 本鎖 D N A を調製後 D N A シー ク ェ ン サ 一 （既出） に て塩基配列 を決定 した結果、 本 c D N A力 ϊ ヒ ト 尿 ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ンを コ 一 ドす る c D N Aで あ る こ と が確認 さ れた。

塩基配列を決定 した結果を第 9 図 （ a ) 〜第 9 図 （ b ) に示す。

( 2 ) 組換え ヒ ト 尿 ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン発現べ ク タ 一 の 作製

実施例 2 — ( 1 ) で作製 した ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジユ リ ン c D N Aを含むプラ ス ミ ド p U C — T Mを制限酵素 S a 1 I 及び B a m H I で消化 し、 ァ ガロ ー ス ゲル電気泳 動によ り、 -常法に従っ て約 1. 4 k b長を有-する D. N A 断片を分離、 精製 した。 こ れを、 哺乳動物細胞発現べ ク 夕一 p H ^S A P r — 1 — n e o (P. Gunning e t a 1. Pr oc. Natl. Acid. Sci. USA, 81, 4831, ( 1987) ) の ク 口 — ニ ン グサイ ト S a 1 I 一 B a m H I 間に挿入 し、 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン発現べク タ 一 L K 4 4 4 一 T Mを構築 し た。 次に、 ジ ヒ ド ロ葉酸還元酵素 （以下 D H F R と略す） 遺伝子を含むプ ラ ス ミ ド p A d D 2 '6 S V ( A ) ( R. J.

Kaufman et al. , Mol. Cell. Biol. , 2, 1304, ( 1982) ) を制限酵素 B g 1 I 消化 し、 T 4 D N A ポ リ メ ラ 一 ゼ

(既出） にて平滑末端と した後、 制限酵素 E c o R I で 消化し、 ァガロ ー ス電気泳動によ り 常法に従って約 3 k b 長の D H F R遺伝子を含む D N A断片を分離、 精製 し た。 一方、 L K 4 4 4 一 T Mを制限酵素 A a t Π 消化 し、 T 4 D N A ポ リ メ ラ ーゼ （既出） で平滑末端 と した後、 制限酵素 E c o R I で消化 し、 ァガ ロ ー ス電気泳動に よ り常法に従っ て約 9 k b 長の D N A を分離、 精製 した。 これと、 先に調製 した D H F R遺伝子を含む D N A断片 と を常法に従っ て ラ イ ゲー シ ヨ ン さ せ、 L K 4 4 4 — T M— D H F R を構築 した。 （第 1 0 図 （ a ) 〜第 1 0 図

( b ) ) 次に、 p U C — T Mを制限酵素 5 3 1 1 及び £ 。 0 11 I で消ィ匕 し、 ァガロ ー ス電気泳動に よ り常法に従っ て約 1 . 4 k b長を有する D N A を分離、 精製 し た。 これを、 哺乳動物細胞発現ベ ク タ ー P C D L - S R α 2 9 6 ( Υ.

Takebe et al.， Mol . Cell . Biol. , 8. 466, ( 1988) ) の ク ロ 一ニ ングサイ ト P s t I 一 E c o R I 間に、 ィ匕学合 成機 （既出） にて作製 し O P C カ ラ ム （既出） にて精製 した P s t I - S a 1 I リ ン カ 一 （ 5 ， 一 T C G A T G C A — 3 ， ） と共に挿入 し、 ヒ ト尿 ト ロ ンボモ ジュ リ ン 発現べ ク タ 一 p C D S R a — T Mを構築 した。 次に、 こ れを制限酵素 S a 1 I 及び C 1 a I で消化 し、 T 4 D N A ポ リ メ ラ ーゼ （既出） にて平滑末端 と した後ァ ガロ ー ス電気泳動によ り、 常法に従っ て ヒ ト 尿 ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン c D N A を含む D N A断片を分離、 精製 した。 一方、 前述の L K 4 4 4 — T M— D H F R を制限酵素 E c o R I 及び N d e I で消ィ匕 し、 T 4 D N A ポ リ メ ラ ーゼ （既 出） で平滑末端と した後、 ァ ガロ ー ス電気泳動によ り 常 法に従っ て、 D H F R遺伝子を含む D N A を分離、 精製 した。 こ の D N A と、 先に調製 した ヒ ト尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン c D N Aを含む D N A断片と を常法に従っ て ラ ィ ゲ一 シ ョ ン させ、 p C D S R a — T M— D H F Rを作製 した。 （第 1 1 図 （ a ) 〜第 1 1 図 （ b ) ) 実施例 3

ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の発現 本実施例 1 に お いて作製 したブ ラ ス ミ ド p K C R — T M — A l a および p K C R — T M— V a l を各々、 C O S — 7 細胞 （ A T C C N o . C R L 1 6 5 1 ) に D E A E デ キ ス ト ラ ン 法 にて ト ラ ン ス フ エ ク シ ヨ ン し、 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ンを発現した。 すなわち、 セ ミ コ ン フ ル ェ ン ト の C O S — 7 細胞を準備 し Lauren ら の方法 （ Laur en. M. Proc. Natl. Acad. Sci . USA, I_8, 7575, (1981 ) ) に従い約 2 X 1 0 ⁵ 細胞あた り 約 1 g の D N Aを移入 した。 0. 0 1 %のアルブ ミ ンを含むダルベ ッ コ変法ィ ー グル培地 （以下 D — M E 培地 と略す） に て培養 3 日後、 培養上清を回収 し粗組換え ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン液 を得た。 同様に ト ラ ン ス フ ュ ク シ ョ ン を行な っ た培養上 清 1 0 L を分画分子量 3 万の限外濾過膜を使用 して脱塩 fe ¾S し o

p H を 7. 3 に調整 した後、 6 0 °Cで 1 5 分間処理 し た。 リ ン酸緩衝液で予め コ ンデ ィ シ ョ ユ ン グ しておいた D E A E セ ノレ ロ ー ス （ ヮ ッ ト マ ン社製） の 3 0 0 m L 力 ラ ム に培養上清を通過さ せ て活性画分を吸着させ、 コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グに使用 した もの と同 じ緩衝液 7 5 0 m L で洗浄 した後、 酢酸緩衝液 （ P H 4. 0 ) で活性画分を 溶出 した。

溶出液は、 分画分子量 3 万の限外濾過膜で濃縮 し、 2 M N a O Hで p H 7. 5 に調整 し、 0. 1 M N a C 1 I m Mベ ンザ ミ ジ ン塩酸塩およ び 0. 5 m M C a C I 2 を含む 0. 0 2 M ト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) で予め コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し た D I P - ト ロ ン ビ ン ー ァ ガロ ー ス の 2 . 5 m L カ ラ ムを通過 させて活性画分を吸 着させた。 次いで、 コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グに使用 した も の と 同 じ緩衝液 2 5 m L で洗浄 した後、 1 M N a C l I m M ベ ンザ ミ ジ ン塩酸塩およ び 0 . 5 m M E D T A を含む 0 . 0 2 M ト リ ス —塩酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) で 溶出 し、 こ の溶出液を コ ンディ シ ョ ニ ングに使用 した も の と同 じ緩衝液に対 して透析後、 再度前回 と 同様の条件 に コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し た D I P - ト ロ ン ビ ン一ァ ガ ロ ー ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で精製 した。

溶出液は、 分画分子量 3 万の限外濾過膜で濃縮 し、 あ らか じめ 0. 1 4 M N a C l を含む 0. 0 1 M リ ン 酸緩衝液 （ p H 7 . 0 ) で コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し て お い た セ フ ァ ク リ ノレ S — 3 0 0 ( フ ァ ノレ マ シ ア フ ァ イ ン ケ ミ カ ル社製） の 5 0 O m L カ ラ ム で ゲ ル濾過 し て、 目的 と する活性画分を回収 した。

以上の製造方法によ り p K C R — T M — A l a およ び p K C R - T M - V a 1 由来の上清よ り精製組換え ヒ ト 尿 ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ンを各々.約 0 . 5 m g を得た。 本精 製組換え型 ヒ ト尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン は両者 と も に非還 元 S D S 一 P A G E にて単一バ ン ドを示 した。 本品につ いて活性を調べた と こ ろ、 両者と も に高い活性が示さ れ 本発明ポ リ ペプチ ド 3 0 0 /z g を II. Hirs ら の方 法 ( Methods in Enzymol , 11, 199, ( 1967 ) ) に準 じ て 還元カ ル ボキ シ メ チ ル化 し た後、 脱塩 し、 気相ア ミ ノ 酸 配列自動分析装置 （ ア プ ラ イ ドバイ オ シ ス テ ム ズ社製、 4 7 0 A型） に よ り N末端ア ミ ノ 酸配列を、 ま た カ ル ボ キ.シぺ ブチ ダ一ゼ法 ( B iochem. Biophys. Acta. , 397. 443, (1975)) に よ り C末端 ァ ミ ノ 酸配列分析を行 っ た と こ ろ、 両者の N末端およ び C末端の ア ミ ノ 酸配列は 7 2 K の ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の も の と各々 一致 した。 すなわ ち p K C R — T M— A l a 由来の上清か ら得 ら れ た ボ リ ぺ プチ ドの ァ ミ ノ 酸配列は、

N末端 ： Ala Pro Ala Gl u Pro Gin

1 5

C末端 ： Leu Ala Arg

455

であ り、 p K C R — T M— V a 1 由来の上清 よ り 得 ら れ た ポ リ ぺ プチ ドの ア ミ ノ 酸配列 は、

- N末端 = Ala Pro Ala Gl u Pro Gin

1 5

C末端 ： Leu Val Arg

455

であ っ た。 実施例 4

ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の発現

本実施例 2 に お い て作製 した プ ラ ス ミ ド p C D S R ο: 一 T M— D H F R を以下に記載する よ う に C H 0細胞に エ レ ク ト 口 ポ レ ー シ ョ ン法 ( D. Zerbib et a 1. , Bi ochem. Biophys. Res. Comm. , 129, 611 (1985)を改変） ίこ て ト ラ ン ス フ エ ク シ ヨ ン し、 組換え ヒ ト 尿 ト ロ ン ボモ ジ ユ リ ン を 発 現させた。

すなわ ち-、 1 0 % ゥ シ胎児血清 （株式会社 曰本生物材 料セ ン タ ー ） 含有 H a m， s F 1 2 ( F l o w社製）

(以下、 培地ー① と略記） を用いて、 5 % C 0 2— 9 5 % 空気下、 3 7 。Cに て 2 日間培養 した C H O D X B 1 1 細胞（Urlaub. G. and Chas i n, L. A. ： Proc. Nat. Acad. Sci .11, 4216(1980))を ト リ プ シ ン一 E D T A処理によ り分散さ せ、 新鮮な培地—① 5 O m l に懸濁 さ せ た。 こ の細胞懸濁液 を低速冷却遠心機 （国産遠心機株式会社） を用いて、 1 0 0 0 r . p . m . 、 5 分間 遠心分離操作を行な っ た。 こ の操作後、 上清を除去 し、 細胞を あ らためて シュ 一 ク ロ ー ス含有 リ ン酸緩衝液 （ 5 4 0 m M シ ュ 一 ク ロ ー ス / 7. O m M リ ン酸水素ニ ナ ト リ ウ ム 1 2 水和物 Z 4. 2 m M塩ィ匕マ グ ネ シ ウ ム p H 7. 4 ) 5 0 m l に懸濁 し、 1 0 0 0 r . p . m . 、 5 分間の条件によ り遠心 分離操作を行な っ た。 上述の シ ュ 一 ク ロ ー ス 含有 リ ン酸 緩衝液に よ る懸濁、 およ び遠心分離の操作を さ ら に も う —回行な っ た後、 シ ュ 一 ク ロ ー ス含有 リ ン酸緩衝液にて、 1 X 1 0 ⁷細胞ノ m L の細胞懸濁液と し、電気移入装置 ジ ー ン パ ル サ 一 T M ( B 1 0 — R A D社） 専用キ ュ べ ッ ト に 0. 4 m L添加 した。 こ の キ ュ ベ ッ ト に さ ら に シ ュ 一ク ロ ー ス含有 リ ン酸緩衝液にて 5 0 u g Z m L に調 製 し た ブ ラ ス ミ ド p C D S R a — T M— D H F R を 0.

4 m L 添加 した。 次にキ ュ べ ッ ト を氷中に 1 5 分間静置 した後に ジー ン パ ル サ ー にて電気移入操作を行な っ た。 つ づい てキ ュ べ ッ ト を氷中に 1 0 分間静置後、 培地—① にて 1 1 0 ⁴細胞/ m L の細胞懸濁液と した。 こ の細 胞懸濁液 1 0 m L を直径 1 0 c m培養皿 に添加 し、 5 % (： 0 2— 9 5 %空気下、 3 7 ^eCに て培養 した。 培養開始 2 曰後、 培養皿中の培地を除去 し、 あ ら た に 1 0 %非働化 透析ゥ シ胎児血清 （既出） 含有 M E M α ( — ） （ リ ボ ヌ ク レ オ シ ド、 デォ キ シ リ ボ ヌ ク レ オ シ ド不含、 G I B C

0社） （以下、 培地ー② と略記） 1 0 m L を添加 し、 培 養を継続 した。 2 — 4 日毎に新鮮な培地ー②に交換 し な が ら培養 し、 培養開始後 1 6 日 目、 あ る いは 1 9 日 目 に、 1 0 0 - 2 0 0 個の細胞か ら構成さ れる単コ ロ ニ ーをべ ニ シ リ ン カ ッ プ法によ り 採取 した。 採取した細胞を 9 6 ゥ ュ ル マ ノレチ デ イ シ ュ （ A Z S N u n c 社） に移 し、 培地ー②を用いて培養した。 得 られた各ク ロ ー ンをそ の 増殖に合わせ、 順次培養容器をかえて培養 した。 なお こ の培養の過程にお いて、 培養細胞の一部を以下のよ う に 無血清培地中で培養 し、 得 られる培養上清の組換え型 ト 口 ン ボ モ ジ ュ リ ン量を測定 し、 各ク ロ ー ン の組換え型 ト ロ ンボ乇 ジユ リ ン産生能を評価 した。 すなわち、 培地一 ②を用いて 4. 2 X 1 0 ⁴細胞ノ m L に調製 した細胞懸濁 液 3 m L を直径 3 5 m m培養皿 に添力 [] し、 5 % C 0 2— 9

5 %空気下、 3 7 でにて 3 日間培養 した。 つ いで、 培養 液を除去 し、 P B S - T w e e n を用いて細胞を洗'净 し た後'、 さ ら に培地を 5 K I Uノ m L ア ブ口 チ ュ ン （ レ ノ、' ル ゾ ン、 持田製薬株式会社） 含有 M E M （ 一） 3 m L にか え て 5 % C 0 2- 9 5 %空気下、 3 7 ^eCに て 2 日間培 養 し、 得 ら.れた培養上清の生物活性が高い も のを、 組換 え ト ロ ン ボモ ジュ リ ンの高発現株と して選択 した。 ま た、 こ の よ う に し て選択された組換え ト 口 ン ボ モ ジ ュ リ ン 高 発現株を 2 0 n M メ ソ ト レ 牛 セ一 ト （ 日本 レ ダ リ 一社）

(以下、 M T X と略記） 含有の培地ー②に て 1 X 1 0 ⁴細 胞 Zm L に調製 し、 直径 1 0 c mの培養皿 に 1 O m L 添 加 し、 5 % じ 0 ₂— 9 5 %空気下、 3 7 。Cに て培養 した。 こ の培養によ り得 られる 2 0 n M M T X抵抗性細胞を べ ニ シ リ ン カ ッ プ法 に よ り ク ロ 一 ユ ン グ し、 各 ク ロ ー ン の 組換え ト ロ ンボモ ジユ リ ン産生能を評価 し、 組換え ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の高発現株を選択 し た。 得 ら れた高発現 株 T M M — B 1 C の発現量は 1. 3 a g / m L で あ っ た。 培養上清中に含ま れる組換え ト ロ ン ボ モ ジュ リ ン は実施 例 3 の方法で回収、 精製 し、 同 じ く 実施例 3 の方法で N 末端及び C末端の ア ミ ノ 酸配列を決定 した。 その結果、

N末端 ： Ala Pro Ala Gl u Pro Gin

1 5

C末端 ： Leu Ala Arg

455

であ る こ とが確認 さ れた。 実施例 5

大腸菌での発現

.本実施例 1 にお いて作製 したブラ ス ミ ド p M 4 5 0 - T M— A 1 a あ る いは p M 4 5 0 - T - V a 1 にて形 質転換さ れた大腸菌 H B 1 0 1 株を 1 0 0 / g Z m L ァ ン ビ シ リ ン （以下、 A p と略記） 含有 L—培地 5 m L に て終夜培養 した。 こ の培養液を 5 0 倍容の 1 0 0 g Z m L A p お よび 5 0 g Zm L ト リ プ ト フ ァ ンを含む M 9 C A培地に 1 5 0 容植菌 し、 3 7。Cにて約 3 時間 培養 して対数増殖後期ま で増殖させた後、 終濃度が 1 0 z g Z ni L と な る よ う に 3 yS — イ ン ド ー ルァ ク リ ノレ酸

(和光純薬社製） を添加 し、 さ らに 3 〜 5 時間培養 し た。 培養菌体を遠心分離 （ M R — 1 5， ト ミ ー精ェ社製） に て回収 し、 1 回生理食塩水にて洗浄 し、 次いで沈殺に、 培養液の 1 1 0 容 の 2 % ド デ シ ル硫酸ナ ト リ ウ ム / 1 m M E D T A / l O m M T r i s — H C l ( H 7. 4 ) を加え菌体を分散後、 9 0 ^eC, 5 分間処理にて溶菌 させた。 1 5 , 0 0 0 r . p. m. , 1 0 分間遠心分離

(既出） し て不溶物を除去 し、 こ の上清を P B S に対 し て透析 し溶菌液検体と した。

得られた 2 種の溶菌液の抗 ヒ ト尿 ト ロ ン ボ モ ジユ リ ン 抗体と の反応性を調べた。 すなわち、 平底 9 6 穴マ イ ク 口 夕 イ タ一プ レ ー ト （ Immulon - 600、 Greiner社製） の各 ゥ - ル に、 0. 1 M炭酸ナ ト リ ウ ム緩衝液、 p H 9. 6 にて調整 した 1 0 z g / m L の抗 ヒ ト 尿 ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン抗体溶液 （尿か ら取得 した 7 2 K の ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン を家兎に感作 し て得た血清を硫安塩析後、 D E A E — セ フ ァ ロ ー ス カ ラ ム に て精製 した も の） を 1 0 0 L加え、 4 でで 1 6 時間静置 し た後、 0. 0 5 % T w e e n -- 2 0 ( Bio— Bad 製） を含む 1 O m M リ ン酸緩 衝液、 p H 7. 4 ( P B S — T w e e n ) に て 3 回洗浄 した。 純水にて 4 倍に希釈 した ブロ ッ ク エー ス （大日本 製薬製） 液を 3 0 0 L加え 3 7 。Cで 1 時間保温 し、 プ レ ー ト の未吸着部分をブ ロ ッ キ ン グ し た後、 P B S — T w e e n で 3 回洗浄 した。 溶菌溶液を 1 0 0 L 添加 し、 3 7 °Cで 1. 5 時間保温 した後、 P B S — T w e e n に て 3 回洗浄 し、 次 い で 1 0 〃 gノ m L の ピ オ チ ンィ匕 し た 抗 ヒ ト 尿 ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン抗体溶液を 1 0 0 L加え 3 7 。Cで 1 時間保温 した。 P B S — T w e e n で 3 回洗 浄 した後、 ホ ー ス ラ デ イ シ ュ パーォ キ シダ一 ゼ標識ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン （ Zymed lab. inc. 製） 溶液を 1 0 0 // L加えて 3 7 °Cで 1 時間保温 した。 P B S — T w e e n で 3 回洗浄 した後、 ク ェ ン酸— リ ン 酸緩衝液 p H 4. 0 で 1 回洗浄 し、 次いで 0. 0 0 3 %過酸化水素水を含む ク ェ ン酸 — リ ン酸緩衝液 p H 4. 0 に て l m g Z m L の 濃度に溶解 した発色液 （ A B T S ： ( 2.2' -azinobis (3- ethylbenzthiazol ine sulfonic ac i d) d iamraoni um sal t ) を 2 0 0 L 添加 した。 十分な吸光度が得 ら れる ま で反 応さ せ た後、 各ゥ ル に 2 1 m g / m L の フ ツ イ匕水素水 溶液を 5 加えて反応を停止さ せ、 マ イ ク ロ タ イ 夕 一ブレー ト リ ーダーを用いて波長 4 0 5 n m における 吸 光度を測定した。

そ の結果、 P M 4 5 0 — T M — 八 1 3 ぁ る ぃは 4 5 0 - T M - V a 1 を保有 した菌由来の溶菌液では発色 が認め られた力 s'、 これら と 同様の培養および調整を行 つ たプラ ス ミ ド p M 4 5 0 を保有する H B 1 0 1 株の溶菌 液では全 く 発色が認め られなか った。 実施例 6

デ リ 一 シ ョ ン ミ ユ ータ ン ト発現プ ラ ス ミ ド の作製と 発 現

( 1 ) デ リ ー シ ヨ ン ミ ュ ー タ ン ト発現ベ ク タ ー の作製 D E L 1 0 発現べ ク タ 一 は以下の ご と く 作製 した。 第 1 2 図 （ a ) に示 した l O m e r 及び 2 4 m e r か ら な る ォ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド （ D 5 — 1 6 U 及び D 5 — 2 4 L ) を化学合成機 （既出） にて作製 した後、 O P C 力 ラ ム （既出） にて精製 し、 常法に従っ てア ニー リ ン グ さ せて両端に K p η I 及び E c o R I の切断面を有する D N A断片を得た。 これと、 実施例 2 — （ 1 ) で作製 し た p U C — T Mの K p n I / E c o R I 消化物か ら得た約 4. 5 の D N A断片 と を常法に従って ラ イ ゲ一 シ ョ

• ン さ せ、 ヒ ト ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の シ グ ナ ル ぺ プ チ ド及 び D E L 1 0 を コ ー ド し、 3 ， 末端に終止コ ド ンが付加 された c D N Aを含むプ ラ ス ミ ド p U C — D E L 1 0 を 作製 した。 こ れを更に E c o R I / M 1 u I で消ィ匕 し、 ァ ガロ ー ス ゲ ル電気泳動に よ り 常法に従っ て約 6 5 0 b p の大き さ を有す る D N A 断片を分取 した後、 実施例 2 一 （ 2 ) で作製 し た p C D S R — T Mの E c o R l Z

M l u I 消化物よ り 同様に分取 した約 4. 5 k b の大 き さ を有す る- D N A断片と常法に従っ て ラ イ ゲー シ ョ ン さ せて p C D S R a — D E L 1 0 を作製 し た （第 1 3 図

( a ) 〜第 1 3 図 （ b 〉 ：） 。

—方、 ヒ ト 尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン の C末ア ミ ノ 酸 4 9 個が欠失 した変異型 の組換え ヒ ト尿 ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン

(以下 D E L 4 9 と略す） 発現べク タ 一 は以下の ごと く 作製 した。

第 1 2 図 （ b ) に示 した いずれも 1 4 m e r か らな る オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （ D 1 0 — 1 4 U及び D 1 0 - 1 4 L ) を化学合成機 （既出） に て作製 した後 O P C カ ラ ム

(既出） にて精製 し、 常法に従っ て ア ニー リ ン グさせて 両端に N h e I 及び E c o R I の切断面を有する D N A 断片を得た。 こ れ と実施例 1 — ( 2 ) で作製 した p C D S R a — T Mの E c o R I / e I 消化物よ り 調製 し た約 5 k b の D N A断片と を常法に従 っ て ラ イ ゲ一 シ ョ ン させ所望の c D N Aを含むプラ ス ミ ド p C D S R a — D E L 4 9 を作製 し た。 （第 1 3 図 （ a ) 〜第 1 3 図

( b ) )

( 2 ) 動物細胞での発現

実施例 2 — （ 2 ) において作製 し た p C D S R 一 T M と、 実施例 6 — ( 1 ) に お い て作製 した p C D S R ひ ー 0 £ 1^ 1 0 及び 〇 0 3 1 £ — 0 £ 1^ 4 9 を じ 0 3 I 細胞へ導入 し、 各々 r u T M— A l a、 D E L I 0 及び D E L 4 9 を発現させた。 即ち、 p C D S R a — T M ま たは p C D S R a — D E L 1 0 ま た は p C D S R a — D E L 4 9 -0. 5 / g を の T E に溶解 し、 0. 2 m g Z m L D E A E —デキ ス ト ラ ン及び 5 0 m M T r i s — H C l ( H 7. 4 ) を含む D — M E培地 7 0 0 /i L と混ぜ、 D N A — D E A E デキ ス ト ラ ン混合液を作製 した。 セ ミ コ ン フ ル ェ ン ト な状態に ま で直径 3. 5 c m プ レー ト に培養 した C O S I 細胞に D N A — D E A E — デキ ス ト ラ ン混合液を滴下し、 3 7 。C、 5 % C 0₂存在下 で培養 した。 4 時間後、 D N A — D E A E — デキ ス ト ラ ン混合液を除去 し、 1 % の ゥ シ胎児血清 （既出） を含む D— M E培地を添加した。 3 7 °C、 5 % C 02存在下にて 4 8 〜 9 6 時間培養後、 培養上清を回収 し実験例 2 の方 法に準 じてプロ テ ィ ン C活性化能を測定 して比較 した。 そ の結果、 D E L 4 9 には十分な生物活性が認め られな か っ たが、 r u T M— A 1 a 及び D E L 1 0 には生物活 性が認め られた。 結果を第 4 表に示す。

第 4 表

*1 : ヒ ト胎盤 ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン の活性を 1 と す る 次に本発明のポ リ べプチ ドを含有する製剤の実施例を 示す。 実施例一 7

r u T M - A 1 a 2 0. 0 m g

精製ゼ ラ チ ン 5 0. 0 m g

リ ン 酸ナ ト リ ウ ム 3 4. 8 m g

塩化ナ ト リ ウ ム 8 1 . 8 m g

マ ン ニ ト ー ノレ 2 5. 0 m g

上記成分を注射用蒸留水 1 0 m L に溶解 し、 無菌濾過 した後に 1. 0 m L ずつ無菌バイ ア ル に分注 し、 凍結乾 燥 して、 注射用製剤を調整 した。 実施例一 8

r u T M - A 1 a 4 0. 0 m g

ァ ノレブ ミ ン 2 0. 0 m g

リ ン 酸ナ ト リ ウ ム 3 4. 8 m g 塩化ナ ト リ ウ ム 8 1. 8 m g

マ ン ニ ト ー ノレ 2 5. 0 m g

上記の各成分を秤量し、 実施例一 7 と同様の方法にて 凍結乾燥製剤を調整 した。 実施例一 9

D E L 1 0 2 0. 0 m g

精製ゼ ラ チ ン 5 0. 0 m g

リ ン 酸ナ ト リ ウ ム 3 4. 8 m g

塩ィ匕ナ ト リ ウ ム 8 1. 8 m g

マ ン ニ ト ー ル 2 5. 0 m g

上記の各成分を秤量 し、 実施例一 7 と同様の方法にて 凍結乾燥製剤を調整 した。

(参考例）

ヒ ト胎盤 ト ロ ン ボモ ジ ュ リ ン の取得例

特開昭 6 0 - 1 9 9 8 1 9 号の方法に準 じ 、 ヒ ト胎盤 よ り、 ト ロ ンボモ ジ ュ リ ンを精製 した。 すなわち、 ヒ ト 胎盤 1 2 k g ( 3 0 個分） を、 0. 2 5 M シ ュ ― ク ロ 一 ス、 I m Mベ ンザ ミ ジ ン塩酸塩を含む 0. 0 2 M ト リ ス 塩酸緩衝液、 p H 7. 5 で洗浄 した後、 肉挽機にて破砕 し、 均質化 した。 均質化 し た懸濁液を 3 0 0 O r . p . m . で 4 0 分間遠心分離 し、 得 られた沈殺物を上記緩衝 液に懸濁 させ、 1 0 分間撹拌後、 再度遠心分離 して沈餒 物を分取 した。 以上の操作を、 1 回あた り 2 0 L の緩衝 液を用いて、 合計 3 回繰 り 返 し行い、 分取 した沈殺物を 0. 2 5 M シ ュ 一 ク ロー ス、 I m M ベ ンザ ミ ジ ン塩酸塩 および 0 . 5 % ( V / V ) ト リ ト ン X — 1 0 0 ( シグマ 社製） を含む 6 0 L の 0. 0 2 M ト リ ス塩酸緩衝液、 p H 7. 5 で抽出 した。 得 ら れた抽出液中の総タ ンパク 質 量は 4 6 . - 7 g であ っ た （ L o w r y 法によ る、 以下同 じ） 。 粗抽出液 6 0 L を、 0. 1 M N a C l、 0. 5 m M C a C 1 2 % 0. I m M ベ ン ザ ミ ジ ン塩酸塩お よ び 0 : 5 % ( V Z V ) ト リ ト ン X — 1 0 0 を含む 0. 0 2 M ト リ ス塩酸緩衝液、 p H 7. 5 で コ ンデ ィ シ ョ ニ ン グ した D I P — ト ロ ン ビ ンーァ ガロ ー ス カ ラ ム （ 4 0 X 1 6 c m ) に吸着 さ せ、 コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ に用いたの と 同 じ緩衝液 2 L で洗浄 し た。 次いで、 1 M N a C l 、 0. I m M E D T A、 I m M ベ ン ザ ミ ジ ン塩酸塩お よ び 0. 5 % ( V Z V ) ト リ ト ン X — 1 0 0 を含む 0. 0 2 M ト リ ス塩酸緩衝液、 p H 7. 5 で溶出 した。 溶出 量は 6 5 O m L であ り、 得 られた蛋白質量は 1 . 7 で あ った。 こ の溶出液を限外濾過器 （ ミ リ ポア社製、 3 万 c u t o f f ) を使用 して脱塩濃縮 し、 再度上記と 同 様に コ ン ディ シ ョ ニ ン グ し た同容の D I P — ト ロ ン ビ ン ーァガロ ー ス カ ラ ム に吸着 させた。 次いで、. 0. 4 M N a C l 、 0. 5 m M C a C 1 2 s 0. I m Mベ ンザ ミ ジ ン塩酸塩およ び 0. 5 % ト リ ト ン X — 1 0 0 を含む 1 5 0 m L の 0. 0 2 M ト リ ス塩酸緩衝液、 p H 7. 5 で洗浄 し た後、 0. I m M E D T A、 1 m Mベ ンザ ミ ジ ン塩酸塩および 0 . 5 % ト リ ト ン X — 1 0 0 を含む 0 . 0 2 M ト リ ス塩酸緩衝液、 p H 7. 5 に、 N a C 1 ( 0. 4 〜 1 M ) を加えた溶液を用 いて、 濃度勾配法に よ り溶出 し、 3 0 m L毎に分画 した。 目的 とする分画の 液量は合計で 1 2 9 O m L で、 蛋白質量は 6 8 m gであ つ た。 次いで、 こ の溶出液を限外濾過器 （ ミ リ ポア社製、 3 万 c u t o f f ) を使用 して脱塩濃縮 し、 予め 0. 0 5 % ト リ ト ン X — 1 0 0、 0. 1 M N a C l を含 む 0. 0 1 M リ ン酸緩衝液、 p H 7. 0 で コ ンディ シ ョ ニ ン グ した S — 3 0 0 ( フ ァ ノレ マ シ ア社製） カ ラ ム （ 2. 6 X 9 O c m ) でゲル濾過 し、 目 的 とする 画分を捕集 した。 取得 した ヒ ト胎盤 ト ロ ンポモ ジ ュ リ ンは蛋白質量 と して 3 . l m g であ っ た。

図面の簡単な説明

第 1 図は、 本発明で用い られる プ ロ ー ブ の塩基配列の 模式図である。

第 2 図は、 本発明ポ リ ペ プチ ドを コ ー ドす る D N A を 含有する 2 5 k b c D N A の制限酵素地図であ る。

第 3 図 （ a ) 〜第 3 図 （ m ) は、 本発明ポ リ ぺプチ ド を コ ー ドする D N A を含有する 2. 5 k b c D N A の 塩基配列 と ァ ミ ノ 酸配列 と を示す模式図であ る。

第 4 図 （ a ) 〜第 4 図 （ b ) は、 本発明の哺乳動物細 胞発現用 プ ラ ス ミ ド p K C R — T M — A l a およ び p K C R - T M - V a 1 の作製手順を示す図であ る。

第 5 図 （ a ) 〜第 5 図 （ b ) は、 本発明の プ ラ ス ミ ド 構築に使用 した才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドを示す図であ る。

第 6 図 （ a ) 〜第 6 図 （ b ) は、 本発明の大腸菌発現 用プ ラ ス ミ ド p M 4 5 0 — T M — A l a お よ び p M 4 5 0 - T M - V a 1 の作製手順を示す図であ る。

第 7 図は、 本発明のプ ラ ス ミ ド構築に使用 した オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドを示す図であ る。

第 8 図は、 本発明のポ リ ぺプチ を コ ー ドする D N A を含有す る プ ラ ス ミ ド p U C — T Mの作製手順を示す図 で あ る。

第 9 図 （ a ) 〜第 9 図 （ b ) は、 本発明の ポ リ ぺプチ ド r u T M— A l a を コ ー ドす る D N A の塩基配列を示 す図であ る。

第 1 0 図 （ a ) 〜第 1 0 図 （ b ) は、 本発明の喃乳動 物細胞発現用プ ラ ス ミ ド L K一 4 4 4 一 T M— D H F R の作製手順を示す図であ る。

第 1 1 図 （ a ) 〜第 1 1 図 （ b ) は、- 本発明の哺乳動 物細胞発現用プ ラ ス ミ ド p C D S R 一 T M— D H F R の作製手順を示す図であ る。

第 1 2 図は、 本発明のデ リ ー シ ヨ ン ミ ュ ー タ ン ト発現 ブ ラ ス ミ ド p C D S R a — D E L 1 0 お よ び p C D S R な 一 D E L 4 9 構築に使用 したォ リ ゴ ヌ ク レ 才 チ ドを示 す図であ る。

第 1 3 図 （ a ) 〜第 1 3 図 （ b ) は、 本発明の哺乳動 物細胞発現用プ ラ ス ミ ド p C D S R a — D E L 1 0 お よ び C D S R α - D E L 4 9 の作製手順を示す図である。

産業上の利用可能性

本発明のボ リ ペ プチ ド は、 ト ロ ン ビ ン と結合する こ と によ り、 ト ロ ン ビ ン の作用を打ち消 して血液凝固抑制お よ び血小板凝集抑制作用を発揮する と 同時に、 プロ テ ィ ン C を活性化 して血液凝固抑制作用、 血栓溶解作用を も 発現する ため、 血栓形成抑制、 血栓溶解、 抗 D I C な ど、 広範囲にわた る血液凝固亢進に係わ る疾患に対する治療 効果が期待さ れる。 特に、 プ ロ テ イ ン C活性化作用が優 れるため、 よ り副作用が軽減さ れる こ と が期待される。

ま た、 本発明の ポ リ ペプチ ドは、 初めて遺伝子工学で 産生された物質であ る。 従 っ て、 血液凝固亢進に係わ る 血栓症や D I C な どの疾患に対する治療薬あ る いは予防 薬と して医薬品に応用した際に、 よ り 強力な効果が期待 でき、 あ る いは、 よ り少量の投与で同程度の効果が期待 さ れる ため、 副作用発現の危険性がよ り少な く、 ま た、 よ り経済的に使用する こ と がで き る。 ま た、 現在では治 療が困難であ る疾患の治療が可能に な る な ど、 全 く 新 し い効果 も期待される。

ま た、 本発明の ポ リ ペプチ ドは、 胎盤 . 肺な どの組織 抽出 ヒ ト ト ロ ンボモ ジ ュ リ ン の可溶化に必要 と される 界 面活性剤を使用す る必要がな いため、 医薬品 と してよ り 安全に使用する こ と がで き る。

本発明のポ リ べ プチ ドは、 上記の よ う な医薬品 と し て の用途以外に、 人工血管、 人工臓器、 カ テ ー テ ルな ど の 医用器材の表面に架橋剤な どを用いて結合 · 吸着さ せて、 血液凝固を防 ぐ目的でも用いる こ と ができ る。

国際様式 I NTERNAT I ONAL FORM

BUDAPEST TREATY ON THE I NTERNAT I 0- NAL RECOGN ITI ON OF THE DEPOS IT OF MI CROORGANI SMS FOR THE PURPOSES OF

特許手続上の微生物の寄託の国際的承認 PATENT PROCEDURE '

に関するブダぺスト条約

RECEI PT i N THE CASE OF AN OR IG I NAL DEPOS I T

下記国際寄託当局によって規則 7. 1に従い

発行される i s s u ed pu r s uan t t o Ru l e 1. 1 by t he

I NTERNAT I ON Aし DEPOS I TARY AUTHOR I TY 原寄託についての受託証 i d en t i f i ed a t t he bo t t om o f t h i s a g e. 氏名 （名称） 持田製薬株式会社

代表者 持田 英

"S

あ て 名 〶 160

東京都新宿区四谷 1丁目 7番地

持田製薬株式会社内

1. 微生物の表示

(寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）

TMM-B 1 C 微ェ研条寄第 3463 号

( FE M BP - 3463 )

D. 科学的性 K及び分類学上の位 g

1櫊の微生物には、 次の事項を記載した文耆が添付されていた。

Ξ科学的性質

□ 分類学上の位置

ΙΠ. 受領及び受託

本 ^託当局は、 平成 3年 6 月 25 曰 （原寄託曰） に受領した 1攔の微生物を受託する。

IV. 国際寄 当局

通 商 産 業 省 工 業 技 術 院 微 生 物 工 業 技 術 研 究 所

名 称：

あて名： 3 0 5 )

305, JAPAN 平成 3年 （1991) 6月 25日

Claims

- 59 - 請求の範囲

1. 次式 ：

Xi Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Va 1 Glu

5 10

His Asp C s Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr

15 20 25

Phe Leu Asn Ala Ser Gin lie Cys Asp Gly Leu Arg

30 35

Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala 40 45 50

Asp Val lie Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly

55 60

Val Gl Arg Arg Arg Leu Trp lie Gly Leu Gin Leu

65 70

Pro Pro Gly C s Gl Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro

75 80 85

Leu Arg Gl Phe Gin Trp Val Thr G 1 y Asp Asn Asn

90 95

Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 100 105 110

Gly A 1 a Pro Leu Cys Gly Pro Leu C s Val Ala Val

115 120

Ser Ala Ala Glu Ala Thr Va 1 Pro Ser Glu Pro l ie

125 130 - 60 -

Trp G 1 u Gl u Gin Gin Cys Glu Yal L s Ala Asp G ly 135 140 145

Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg

150 155

Pro Leu Ala Val Glu Pro Gl Ala A 1 a A 1 a Ala Ala 160 165 170

Val Ser lie Thr Tyr G ly Thr Pro Phe Ala Ala Arg

175 180

G 1 Ala Asp Phe G 1 n Ala Leu Pro Val G ly Ser Ser

185 190

Ala Ala Val Ala Pro Leu Gl Leu Gin Leu Met Cys 195 200 205

Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gin Gly His Trp Ala

210 215

Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp' Asp C s Ser Val Glu 220 225 230

Asn Gly Gl Cys Glu His Ala Cys Asn Ala lie Pro

235 240

Gly Ala Pro Arg C s Gin C s Pro Ala Gly Ala Ala

245 250

Leu Gin A 1 a Asp Gl Arg Ser C s Thr A 1 a Ser Ala 255 260 265

Thr Gin Ser C s Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys

270 275 - 61 -

Va 1 Pro Asn Pro Asp Gin Pro G ly Ser Tyr Ser Cys

280 285 290

Met Cys Gl u Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin

295 300

His Arg Cys G 1 u Asp V al Asp Asp C s I 1 e Leu G 1 u

305 310

Pro Ser Pro Cys Pro Gin Arg Cys Va 1 Asn Thr Gin 315 320 325

Gly Gly Phe G 1 u Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp

330 335 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val G lu Pro Val Asp Pro 340 345 350

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro

355 360

Leu Asn Gin Thr Ser T r Leu Cys Va 1 Cys A 1 a Glu

365 370

Gly Phe Ala Pro lie Pro His Glu Pro His Arg Cys 375 380 385

Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala C s Pro Ala Asp

390 395 C s Asp Pro Asn Thr Gin Al Ser C s Glu C s Pro 400 405 410

Glu Gly Tyr l ie Leu Asp Asp Gly Phe l ie Cys Thr

415 420 - 62 -

Asp lie Asp G 1 u C s G 1 u Asn G ly G 1 Phe C s Ser

425 430

Gly Val Cys His Asn Leu Pro G ly Thr Phe Gl u Cys 435 440 445

Yi - [式中； は下記式：

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly A 1 a Leu Ala Leu

- 15 - 10

Ala Gly Leu Gly Phe Pro Ala Pro A 1 a

-5 -1 1

で表さ れる配列、 ま たはそ の N末端か ら任意数 も し く は すべての ア ミ ノ 酸が欠失 し た配列を示 し、 Y は下記式 ： lie C s Gly Pro Asp Ser Ala Leu Z Arg His

450 455

[但 し、 1 は Val ま た は Ala]

で表さ れる配列ま たはそ の C末端か ら任意数 も し く はす ベてのァ ミ ノ 酸が欠失 した配列を示す ]

で表さ れる ア ミ ノ 酸配列を有 し、 遺伝子組換え手法に よ つ て得 ら れる、 当該配列中のァ ミ ノ 酸の少な く と も 1 つ が糖鎖を有 して も よ いこ と を特徵 と す る ポ リ べプチ ド。

2. X 1は下記式：

Ala Pro Ala

1

で表さ れる配列、 Yiは下記式 ： - 63 - lie C s G 1 y Pro Asp Ser A 1 a Leu Z Arg

450 455

[但 し、 Z は Val ま た は Ala]

で表さ れ る ァ ミ ノ 酸配列で、 当該配列中の ァ ミ ノ 酸の少 な く と も 1_ つが糖鎮を有 し て も よ い請求の範囲第 1 項記 载のポ リ ぺプチ ド。

3. X 1は下記式 ：

Ala Pro Ala で表さ れ る配列、 Y 1のすベての ア ミ ノ 酸が欠失 した ァ ミ ノ 酸配列で、 当該配列中 の ァ ミ ノ 酸の少な く と も 1 つ 力 ί 糖鎮を有 して も よ い請求の範囲第 1 項記載の ポ リ ぺプチ ト ' ο

4. 当該配列中の ア ミ ノ 酸の少な く と も 1 つ が糖鎮を有 し てい る 請求の範囲第 1 項な い し第 3 項記載のポ リ ぺ プ チ ド。

5. 当該配列中の ア ミ ノ 酸が糖鎖を有 して いない請求の 範囲第 1 項な い し第 3 項記載の ポ リ ぺ プチ ド。

6. 請求の範囲第 1 項な い し第 5 項記載の ポ リ べ プチ ド を コ ー ドする D N Ao - 64 -

7. 次式 ：

X₂ GAGCCGC AGCCGGGTGG CAGCCAGTGC GTCGAGCACG 100 ACTGCTTCGC GCTCTACCCG GGCCCCGCGA CCTTCCTCAA 140 TGCCAGTCAG ATCTGCGACG GACTGCGGGG CCACCTAATG 180

ACAGTGCGCT CCTCGGTGGC TGCCGATGTC ATTTCCTTGC 220

TACTGAACGG CGACGGCGGC GTTGGCCGCC GGCGCCTCTG 260

GATCGGCCTG CAGCTGCCAC CCGGCTGCGG CGACCCCAAG 300

CGCCTCGGGC CCCTGCGCGG CTTCCAGTGG GTTACGGGAG 340

ACAACAACAC CAGCTATAGC AGGTGGGCAC GGCTCGACCT 380

CAATGGGGCT CCCCTCTGCG GCCCGTTGTG CGTCGCTGTC 420

TCCGCTGCTG AGGCCACTGT GCCCAGCGAG CCGATCTGGG 460

AGGAGCAGCA GTGCGAAGTG AAGGCCGATG GCTTCCTCTG 500

CGAGTTCCAC TTCCCAGCCA CCTGCAGGCC ACTGGCTGTG 540

GAGCCCGGCG CCGCGGCTGC CGCCGTCTCG ATCACCTACG 580

GCACCCCGTT CGCGGCCCGC GGAGCGGACT TCCAGGCGCT 620

GCCGGTGGGC AGCTCCGCCG CGGTGGCTCC CCTCGGCTTA 660

CAGCTAATGT GCACCGCGCC GCCCGGAGCG GTCCAGGGGC 700

ACTGGGCCAG GGAGGCGCCG GGCGCTTGGG ACTGCAGCGT 740

GGAGAACGGC GGCTGCGAGC ACGCGTGCAA TGCGATCCCT 780

GGGGCTCCCC GCTGCCAGTG CCCAGCCGGC GCCGCCCTGC 820

AGGCAGACGG GCGCTCCTGC ACCGCATCCG CGACGCAGTC 860

CTGCAACGAC CTCTGCGAGC ACTTCTGCGT TCCCAACCCC 900

GACCAGCCGG GCTCCTACTC GTGCATGTGC GAGACCGGCT 940

ACCGGCTGGC GGCCGACCAA CACCGGTGCG AGGACGTGGA 980

TGACTGCATA CTGGAGCCCA GTCCGTGTCC GCAGCGCTGT 1020 - 65 -

GTCAACACAC AGGGTGGCTT CGAGTGCCAC TGCTACCCTA 1060 ACTACGACCT GGTGGACGGC GAGTGTGTSG AGCCCGTGGA 1100 CCCGTGCTTC AGAGCCAACT GCGAGTACCA GTGCCAGCCC 1140 CTGAACCAAA CTAGCTACCT CTGCGTCTGC GCCGAGGGCT 1180 TCGCGCCCAT TCCCCACGAG CCGCACAGGT GCCAGATGTT 1220 TTGCAACCAG ACTGCCTGTC CAGCCGACTG CGACCCCAAC 1260 ACCCAGGCTA GCTGTGAGTG CCCTGAAGGC TACATCCTGG 1300 ACGACGGTTT CATCTGCACG GACATCGACG AGTGCGAAAA 1340 CGGCGGCTTC TGCTCCGGGG TGTGCCACAA CCTCCCCGGT 1380 ACCTTCGAGT GC Y₂ 1392 [但 し、 式中 は G ま た は C. X 2は下記式：

ATGCTTGGGG TCCTGGTCCT TGGCGCGCTG GCCCTGGCCG 40 GCCTGGGGTT CCCCGCWCCC GCA 63

[但 し、 E は T ま たは A]

で表される配列、 ま たはそ の 5 ' 末端か ら 3 塩基単位で 任意数 も し く はすべての塩基が欠失 した配列を示 し、 Y₂ は下記式 ：

ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGYCCGC CAC 1425

[但 し、 X は Τ ま たは C]

で表される配列、 ま たはそ の 3 ' 末端か ら 3 塩基単位で 任意数 も し く はすべての塩基が欠失 した配列を示す] で表される塩基配列を有す る こ とを特徴とす る請求の範 囲第 6 項記載の D N A。

8. X 2は下記式： 66 一

GC CCCGCA 63

[但 し、 は T ま たは A〕

で表される配列、 Y2は下記式：

ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGICCGC 1422

[但 し、 は T ま たは C]

で表される塩基配列を有す る請求の範囲第 7 項記載の D N A o

9. X 2は下記式：

GCffCCCGCA 63

[但 し、 は T ま たは A ]

で表さ れる配列、 Y₂のすベての塩基が欠失 し た塩基配列 を有する 請求の範囲第 7 項記載の D N A。

1 0. 下記よ り選ばれる少な く と も 1 つ の工程を行 う こ と を特徴 とす る、 請求の範囲第 1 項な い し請求の範囲第 5 項記載のポ リ ベ プチ ドの生産方法。

a ) 当該ポ リ べプチ ドを コ 一 ドする塩基配列を有する D N Aを得 る工程、

b ) 発現用ベ ク タ ー に当該 D N Aを組み入れて、 当該 D

N Aを含む複製可能な組換え D N A を得る工程、

c ) 当該組換え D N A で宿主細胞を形質転換 させて、 当 該ポ リ べ プチ ドを発現 し得 る形質転換体を得 る工程、 d ) 当該形質転換体を培養 して、 当該ポ リ ペ プチ ドを産 生せ しめ、 培養混合物か ら当該ポ リ ぺプチ ド を回収す る - 67 - 工程。

1 1 . 宿主細胞が、 真核生物細胞であ る請求の範囲第 1 0 項記载のポ リ ぺプチ ドの生産方法。

1 2 . 宿主細胞が、 原核生物細胞である請求の範囲第 1 0 項記載のポ リ ベプチ ドの生産方法。

1 3 . 請求の範囲第 1 項記載のポ リ ペプチ ドを有効成分 と して含有する こ と を特徴 とする、 血液凝固亢進に係わ る疾患の予防及び治療剤。

1 4 . 請求の範囲第 2 項記載のポ リ ぺプチ ドを有効成分 と して含有する こ と を特徴 とする、 血液凝固亢進に係わ る疾患の予防及び治療剤。

1 5 . 請求の範囲第 3 項記載のポ リ ぺプチ ドを有効成分 と して含有する こ と を特徴 とする、 血液凝固亢進に係わ る疾患の予防及び治療剤。

1 6 . 請求の範囲第 4 項記載のポ リ ペプチ ドを有効成分 と して含有する こ と を特徴 とする、 血液凝固亢進に係わ る疾患の予防及び治療剤。

1 7 . 請求の範囲第 5 項記載の ポ リ べプチ ドを有効成分 - 68 - と して含有す る こ と を特徴 と す る、 血液凝固亢進に係わ る疾患の予防及び治療剤。