WO1991005059A1 - Anticorps monoclonal reconnaissant une region pre-s1 de la grande proteine d'enveloppe du virus de l'hepatite b - Google Patents
Anticorps monoclonal reconnaissant une region pre-s1 de la grande proteine d'enveloppe du virus de l'hepatite b Download PDFInfo
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the invention relates to a monoclonal antibody recognizing an epitope located in the pre-S1 region of the large envelope protein of hepatitis B virus (HBV).
- the invention also relates to the applications of this monoclonal antibody, in particular for the in vitro diagnosis of the course of the disease in an individual suffering from chronic hepatitis B, as well as for the treatment of hepatitis B, and the vaccination against this disease.
- the HBV envelope contains three types of surface proteins (S proteins). Proteins S are the only viral components found in hepatitis B surface antigen particles (HBsAg particles) which are expressed in large quantities compared to the virus itself during infection. These HBsAg particles are in spherical or tubular form with a smaller diameter (22 nm) than the infectious HBV particles (42 nm).
- the "medium” protein S consisting of the above-mentioned sequence S and 55 N-terminal amino acids additional encoded by the pre-S2 region of HBV DNA (HACHIDA, A. et al (1984), Gastroenterology, 86, 910-918);
- the "large" protein S consisting of the sequences S, pre-S2 and of 108 (ad antigenic subtype) or 119 (ay antigenic subtype) additional N-terminal amino acids encoded by the pre-S1 region of the HBV DNA (HEERMANN, K. et al (1984), J. Virol., 52, 396-402; WONG, DT et al (1985) J. Virol., 55, 223-231).
- HBV infectious particles
- HBcAg virus core antigen
- the pre-S2 and pre-S1 regions of the S proteins play a role in the mechanisms of recognition and penetration of the virus into the hepatocytes of individuals infected with HBV.
- the HBV binding site to the hepatocyte receptor would be located between the amino acids located at positions 21 and 47 of the pre-S1 region (or sequence) (NEURATH, AR et al, (1986) CE11, 46, 429-436).
- the antibodies specifically recognizing this region, and more particularly the epitope responsible for the binding of l HBV on hepatocytes would probably be of great value in the field of hepatitis B control.
- the monoclonal antibodies known to date have not been found to have the properties desired for this purpose; note that the above-mentioned anti-pre-S (32-53) was obtained using the pre-S (32-53) sequence which does not induce an anti-HBV response in the serum of patients . Vaccination using such a sequence is therefore unlikely.
- a monoclonal antibody was more particularly described in the European patent application published on 07/05/1986 under the number 0 180 012 from GERLICH et al.
- This monoclonal antibody (MA18 / 7) specifically recognizes the pre-S sequence (38-121) of the pre-S1 region, but does not allow the identification of the specific virus binding site on hepatocytes.
- This MA18 / 7 ACM also has the drawback of giving rise to cross-immunological reactions with the sera of individuals not infected with HBV, which represents a major drawback for its use in in vitro diagnostic methods.
- the subject of the present invention is a monoclonal antibody having the advantage over known anti-pre-S1 antibodies, on the one hand, of being more specific of the amino acid sequence of the pre-S1 region involved in the mechanism. of fixing HBV on hepatocytes, and, on the other hand, not giving rise to cross-immunological reactions with the sera of individuals not infected with HBV.
- the invention also relates to a new method of detection and in vitro assay of the large pre-S1 protein which is more precise and informative than those developed using known antibodies, as well as the application of this method to in vitro diagnosis. evolution of chronic hepatitis B.
- the invention also relates to new pharmaceutical compositions for the treatment of hepatitis B and for vaccination against this disease.
- FIG. 1 is a schematic representation of the hepatitis B virus (HBV)
- FIG. 2a shows the results of a radioimmunoassay (RIA) of the S, pre-S2, and pre-S1 sequences in the HBsAg and HBV particles.
- FIG. 2b represents the polypeptide specificity of the monoclonal antibody of the invention determined by the immunoblotting technique,
- FIG. 3 shows the amino acid sequences of the pre-S (21-53), and pre-S (94-117) regions of the large surface proteins P39 and GP42, corresponding to 5 antigenic subtypes of HBV,
- FIG. 4 (a and b) represents the results of a radioimmunological assay involving pre-S1 peptides and viral antigens, carried out using the monoclonal antibody of the invention
- FIG. 5 represents the inhibitory effects of peptides specific for the pre-S1 region and of HBV particles with regard to the binding of the monoclonal antibody of the invention with the pre-S peptide (32-53) ( FIG. 5a), or with the HBV subtype ad (FIG. 5b),
- FIG. 6 represents the sensitivity of the monoclonal antibody of the invention for the detection of the pre-S1 region
- FIG. 7 represents the results of the digestion of the HBV particles with trypsin or V8 protease
- FIG. 8 shows a sucrose gradient of HBV particles (subtype ad), and the correlation between the detection of F35-25 epitopes and the presence of complete virions in the sera.
- FIG. 9 represents the detection of the pre-S1 sequence (32-53) in the purified HBV particles and according to the system of radioimmunoassay with double specificity of antibodies.
- FIG. 10 represents the quantitative analysis of the S antigens and of the pre-S antigens (pre-S1Ag and pre-S2Ag) in the sera of chronic carriers,
- FIG. 11 shows the clinical significance of the expression of the pre-S1 antigen (or the pre-S1 hepatocyte receptor) in patients with chronic hepatitis B.
- the invention relates to a monoclonal antibody (hereinafter designated by ACM F35-25) defined by the combination of the following properties:
- serum albumin-human (HSA) serum albumin-human
- polymerized human serum albumin pHSA
- immunoglobulins G, A and M are identical to immunoglobulins G, A and M;
- the monoclonal antibodies according to the invention preferably belong to the class of immunoglobulins G1 (IgG1).
- the above-mentioned monoclonal antibody can be obtained by a method comprising the fusion of myeloma cells and spleen cells taken from an animal immunized with HBV particles, according to the general technique of obtaining hybridomas, and the detection and recovery of those of hybridomas which secrete monoclonal antibodies having the properties defined above.
- the invention also relates to hybridomas capable of secreting the monoclonal antibodies defined above, in particular ACM F35.25.
- the invention more particularly relates to the hybridoma secreting ACM F35.25 and which has been deposited in the NATIONAL COLLECTION OF MICROORGANISM CULTURES (CNCM) of the INSTITUT PASTEUR in PARIS under the number 1-796 on August 5 1988.
- CNCM MICROORGANISM CULTURES
- the invention also relates to a method of in vitro detection of the possible presence of the large protein S (comprising the pre-S1 region) in a biological sample capable of containing said protein, this method comprising:
- Such an in vitro detection method can be carried out according to any technique per se known to those skilled in the art.
- This method includes for example the following steps:
- An original method of in vitro detection of the pre-S1 antigen according to the invention also comprises the following steps:
- ACM F35.25 or of any other antibody capable of forming an immunological complex with the complex obtained in the preceding step, optionally labeled, in particular in a radioactive or enzymatic manner, under conditions allowing the obtaining of an immunological complex formed between those of the S proteins contained in the sample and carrying the pre-S1 region (that is to say the large S proteins) and the ACM F35.25; - detection using appropriate reagents of the labeled ACM F35.25 which is involved in the above-mentioned immunological complex,
- the latter comprises the following steps:
- the invention relates more particularly to the in vitro detection method as described above in which the ACM F35.25 is replaced by any antibody capable of forming an immunological reaction with the complex formed between the polyclonal antibody fixed on the solid support and the S proteins contained in the biological sample, and in which the labeled anti-immunoglobulins are capable of form an immunological complex with the antibody replacing ACM F35.25.
- ACM F35.25 is replaced in particular by a monoclonal antibody capable of forming an immunological reaction with the pre-S1 region of the S proteins.
- the invention also relates to the application of the abovementioned in vitro detection method to the in vitro diagnosis of acute or chronic hepatitis B carried out using a biological sample, such as serum, taken from an individual susceptible to be infected with HBV.
- a biological sample such as serum
- the invention relates more particularly to a method of in vitro diagnosis of the evolution of chronic hepatitis B in an individual who is symptomatic or asymptomatic of the HBV S proteins.
- the above-mentioned in vitro diagnostic method is advantageously carried out by the implementation, in parallel with the in vitro detection method of the quantity of large protein S mentioned above, of a method of in vitro detection of the major protein S .
- This latter method is carried out according to the same steps as those described above for the detection of the large protein, and in which, on the one hand, ACM F35.25, is replaced by an antibody, of preferably monoclonal, capable of forming an immunological complex with protein S major, (or with one or the other of its glycosylated forms or both at the same time), and on the other hand, the anti-immunoglobulins recognizing the ACM F35.25 are replaced by anti-immunoglobulins capable of forming an immunological complex with the abovementioned ACM recognizing the major protein S.
- the principle of the above-mentioned large protein S detection method in vitro can also be applied to the detection of average protein S using, instead of ACM F35.25 and anti-immunoglobulins recognizing ACM F35.25, a monoclonal antibody capable of forming an immunological complex with the pre-S2 region of said average protein S (or with one or the other of its glycosylated forms or both at the same time), and anti- immunoglobulins capable of forming an immunological complex with the aforementioned monoclonal antibody recognizing the pre-S2 region.
- ACM F124 described in PETIT, MA et al (1987) previously cited.
- the method of the invention allows the detection, in a biological sample taken from an individual suffering from chronic hepatitis B, of the proportion of the large protein S relative to the average protein S on the one hand, and relative to the major protein S on the other hand.
- Such a method therefore makes it possible to follow, as a function of time, the variations in the proportions of the three proteins S relative to one another, and thus to judge the favorable or unfavorable evolution of the disease as a function of these variations.
- the in vitro diagnostic method of the invention is carried out using biological samples (taken from individuals), such as serum, or liver biospies. Since the expression of S proteins in lymphocytes takes place identical to that of these same proteins S in the hepatic cells, it is more advantageous, taking into account the delicate operation which constitutes a biopsy of the liver, to carry out the method of diagnosis of the invention starting from a sample of lymphocytes .
- the in vitro diagnostic method of the invention allows the therapeutic monitoring of patients suffering from hepatitis B and who are treated with pharmaceutical compositions comprising, in particular, interferon, or with antivirals, such as vidarabine .
- the invention also relates to the use of ACM F35.25 for the implementation, in parallel with the in vitro diagnostic method of the invention, of a method of in vitro detection of the cleavage products of the large protein. S resulting from the in vivo digestion of the latter by trypsin, or by enzymes having activities of the trypsin type and present in the organism of the individual from which the biological sample was taken.
- This detection method is carried out according to the immunoblotting technique (or Western blot) from a sample such as lymphocytes, and comprises the following steps: - gel electrophoresis in order to obtain a separation of the various antigenic constituents of the sample,
- ACM F35.25 optionally labeled, in particular radioactive or enzymatic, under conditions allowing the production of an immunological complex formed between ACM F35.25 and each of the cleavage products of the large protein S, including the two products derived from the trypsin cleavage of the pre-S1 region, and having the molecular weights of 13500 and 14500 respectively,
- Such a method makes it possible to quantify the proportion of large proteins possibly degraded in the body of an individual and thus to determine the degree of resistance to infection by HBV of this individual which is a function of the more or less quantity of products. of cleavage of the large protein S by the trypsin thus detected.
- kits or kits for the implementation of one of the methods of the invention described above.
- a kit according to the invention comprises:
- the subject of the invention is also the use of the monoclonal antibody F35.25 of the invention for the treatment of hepatitis B and more particularly for the prevention of phenomena of re-infection of the graft during liver transplant in individuals. with hepatitis B.
- the invention relates to pharmaceutical compositions for the treatments indicated above, and which comprise ACM F35.25 combined with a pharmaceutically acceptable vehicle.
- the chronic carrier state of HBsAg was considered to be a contraindication for a liver transplant, especially in the case of carriers positive for HBeAg (i.e. individuals who are carriers HBe antigen which is a nucleocapsid antigen).
- Short-term immunoprophylaxis with immunoglobulins specifically directed against major HBV S proteins (anti-HBs) has proven to be a failure (van Thiel DH et al (1984), Hepatology 4.79S-83S).
- the only anti-HBs immunoglobulins do not seem to be effective in preventing reinfection of the graft in the presence of complete virions circulating in the serum of these patients before transplantation.
- l BsAg is expressed in very large excess in the form of defective particles (22nm particles made up of the envelope of the virus but not of the nucleocapsid) non-infectious which are specifically neutralized by these antibodies.
- infectious viral particles are found in very small numbers, hence the need to use very high doses of anti-HBs immunoglobulins, which constitutes an expensive therapy for a very disappointing result.
- the complete virions responsible for reinfection selectively express the pre-S1 specificity, unlike the defective forms of HBsAg.
- ACM F35.25 By its anti-pre-S1 specificity, and more specifically by its specificity directed against the sites of recognition of HBV by hepatocytes, these sites being expressed on the surface of complete virions, ACM F35.25 proves particularly interesting to use for a short-term passive immunoprophylaxis protocol (for example 3 to 4 injections in a month) instead of or in combination with a long-term passive immunoprophylaxis (several years) with anti immunoglobulins -HBs, supplemented by active immunoprophylaxis by vaccination. Indeed, it has recently been shown that vaccination with Hevac-B (PASTEUR VACCINS), obtained from human sera, is capable of inducing the production of anti-pre-S1 antibodies.
- Hevac-B PASTEUR VACCINS
- the invention relates more particularly to pharmaceutical compositions comprising in combination with a pharmaceutical vehicle acceptable, a determined quantity of ACM F35.25 combined with anti-HBs immunoglobulins (in particular those obtained from blood donors who have seroconverted HBs / anti-HBs), and if necessary, with a vaccine against hepatitis B, in particular the above-mentioned Hevac-B, or also the anti-idiotype monoclonal antibody described below.
- a pharmaceutical vehicle acceptable a determined quantity of ACM F35.25 combined with anti-HBs immunoglobulins (in particular those obtained from blood donors who have seroconverted HBs / anti-HBs), and if necessary, with a vaccine against hepatitis B, in particular the above-mentioned Hevac-B, or also the anti-idiotype monoclonal antibody described below.
- the invention also relates to the anti-idiotype monoclonal antibody characterized in that it forms an immunological complex with the monoclonal antibody F35.25.
- the above-mentioned anti-idiotype monoclonal antibody is obtained by immunization of an animal using a moncoclonal antibody F35.25 according to the invention, followed by the recovery of those of the antibodies capable of forming an immunological complex with the monoclonal antibody F35.25.
- a subject of the invention is also compositions for vaccination against hepatitis B, characterized by the combination of the above-mentioned anti-idiotype monoclonal antibody with a pharmaceutically acceptable vehicle.
- HBV particles were purified from the serum of an individual suffering from chronic hepatitis B (under the ad type) as described in PETIT et al (1985) Molec. Immunol., 22, 1279-1287, and were used as the immunogen.
- BALB / c mice were inoculated intraperitoneally with 100 ⁇ g of purified virus in the complete Freund's adjuvant, then a week later with 100 ⁇ g of virus in the incomplete Freund's adjuvant.
- the three immunized mice developed high titers of antibodies against HBsAg, which were detected by radioimmunoassay RIA.
- mice Two weeks later, the mice were inoculated with 50 ⁇ g of virus in a phosphate buffer. After five days, the injection was repeated, and three days later, their spleen was removed to achieve fusion with the myeloma X63 cells according to the procedure described by BUTTIN et al (1978), 81, 27-36.
- the supernatants of the hybridoma culture were selected for their presence of antibodies specific for HBV by indirect RIA using the purified immunizing virus as solid phase (PETIT et al (1987) J. Gen. Virol., 68, 2759-2767). 30% of the hybridoma clones produced antibodies against HBV.
- the monoclonal antibody specific for the pre-S1 region, F 35.25 was purified from the supernatant of a cell culture of hybridomas by precipitation with 50% (NH 4 ) 2 SO 4 saturated, and by filtration on SEPHADEX gel. G-200 (PHAMACIA - FRANCE), followed by ion exchange chromatography on DEAE-trisacryl M (IBF - FRANCE).
- the isotype was determined by immunodiffusion against rabbit antisera specific for mouse immunoglobulins M (IgM), IgG1, IgG2A, IgG2B and IgG3 (NORDIC IMMUNOLOGY - TILBURG-BERCHEM - LONDON)
- polypeptide specificity of ACM F 35.25 was determined by immunoblotting using preparations of untreated or digested viruses as antigens (PETIT et al (1986) and (1987) previously cited).
- the ratio of the amount of enzymes to the substrate was 1: 40-50 (by weight), and the protein concentration was 1 mg / ml.
- the reaction was stopped by adding a buffer containing 2% SDS and 5% 2-mercaptoethanol.
- the 22-nm HBsAg spherical particles were co-purified with HBV from an HBsAg serum positive, showing only pre-S2 reactivity (PETIT et al (1987) cited above), human albumin serum (0.22 mg / ml) and normal human serum diluted 1/500 were used in parallel as 'control antigens.
- Purified HBV was used at different concentrations ranging from 0.2 to 1 mg / ml. After electrophoresis using the buffer system described in LAEMMLI (1970) Nature, London, 227 ,, 680-685, protein bands were eluted electrophoretically and transferred to nitrocellulose membranes to be detected there as described in PETIT and al (1987) previously cited).
- the transfer strips were incubated either with the supernatants of hybridoma cells at a 1: 2 dilution in a blocking buffer (tris-NaCl containing bovine serum albumin and 50% bovine fetal serum) or with 10 ng / ml of purified monoclonal mouse IgG.
- a blocking buffer tris-NaCl containing bovine serum albumin and 50% bovine fetal serum
- ACM F 35.25 either to the virus in the native state or to synthetic peptides derived from the pre-S1 sequence of the large envelope protein HBV subtype adw2 (NEURATH et al (1986) previously cited ) was measured by RIA using an anti-mouse F (ab) ' 2 fragment radioactively labeled with iodine I 125 (sheep immunoglobulin, AMERSHAM - FRANCE).
- Polystyrene beads were coated with individual antigens diluted in TN buffer (0.01 M-tris-HCl, 0.14 M-NaCl, pH 7.2) at a concentration of 20 ⁇ g / ml. After two hours at. 37oC and overnight at 4oC, the antigen solutions were removed and the beads were saturated with 5% (w / v) serum albumin from beef in TN buffer for 6 hours at room temperature.
- the coated beads were then incubated with a 1: 2 dilution of hybridoma cell culture supernatant overnight at room temperature, washed several times with distilled water and incubated for one hour at 37 ° C with fragment F (ab ') 2 mouse anti-immunoglobulin labeled with iodine I 125 .
- the diluent used consisted of bovine serum albumin and 50% fetal bovine serum in TN buffer. Finally, the beads were washed and counted in a gamma counter.
- the supernatant was also tested by RIA using beads coated with recombinant HBsAg particles (product of the pre-S2 gene and of the S gene) described in MICHEL et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 7708-7712) of polymerized human albumin serum (pHSA) and polymerized beef albumin serum (pBSA).
- pHSA polymerized human albumin serum
- pBSA polymerized beef albumin serum
- the virus or free peptide samples (20 ⁇ g / ml) were first pre-incubated with the diluted monoclonal antibody, purified from the hybridoma culture fluid (corresponding to 0.2 ng of immunoglobulin from mouse / ml) for 1 hour at 37oC.
- the mixtures were transferred into wells coated either with a synthetic peptide from the pre-S1 region (5 ⁇ g) or with HBV particles (10 ⁇ g / ml) purified from human serum.
- the amount of monoclonal antibody bound to the solid phase was determined as described above.
- This RIA test was carried out in order to determine the presence of pre-S1 sequences in the HBV particles purified from HBsAg positive serum of chronic HBsAg carriers by the procedure previously described in PETIT et al (1985).
- This technique has also been used for the quantification of pre-S1 epitopes in relation to HBsAg activity.
- Polystyrene beads were coated with polyclonal rabbit IgG directed against HBsAg (PETIT et al (1986)) at a concentration of 20 ⁇ g / ml, and were then incubated with a series of viral preparations diluted 10 in 10 ( 10 ⁇ g to 1 ng / ml).
- the beads were washed with distilled water and incubated for four hours at 37oC with a 1: 2 dilution of the hybridoma culture.
- the binding of the monoclonal antibody F 35.25 specific for pre-S1 was then detected by incubation (1 hour at 37 ° C.) with the fragment F (ab ') 2 labeled with iodine I 125 of anti mouse immunoglobulins.
- the diluent used consisted of 5% of serum albumin from beef and 50% normal rabbit serum in TN buffer. Finally, the beads were washed and their radioactivity was determined. The results are expressed in cpm (counts per minute) of antibody labeled with iodine I 125 .
- the MA18 / 7 antibody specific for the pre-S1 region (HEERMANN et al (1984)), and the monoclonal antibodies directed against the epitopes specific for the S and pre-S2 regions (PETIT et al (1987)) were used in parallel in order to determine quantitative relationships between the three antigenic regions of the env protein.
- ACM F 35.25 belongs to the class of IgG1 antibodies.
- the polypeptide specificity of the monoclonal antibody F 35.25 was determined by its reactivity with respect to the three envelope components of viral particles purified from plasma of a chronic HBV carrier (under ad type).
- A spherical particle of HBsAg 22-ira having a pre-S2 reactivity, but having no detectable pre-S1 epitopes (30% of sucrose, FIG. 2a)
- B particles of HBV 42- nm positive with regard to DNA polymerase activity and HBV DNA, having a large quantity (> 1 ng / ml) of pre-S2 and pre-S1 epitopes (40% of sucrose, FIG. 2a).
- line B ACM F 35.25 binds only to the pre-S1, P39 and GP42 proteins, in the parts of purified HBV.
- CP42 has been more intensely revealed than P39.
- F 35.25 also reacts with a component of 66000; on the other hand, no reactivity was observed between ACM F35.25 and all the proteins originating from defective particles of HBsAg and pre-S2 positive (FIG. 2b, line A), as well as with human serum albumin ( HSA) or with normal human serum (NHS) without viral marker ( Figure 2b, lines C and D respectively).
- HSA human serum albumin
- NHS normal human serum
- Figure 2b lines C and D respectively.
- the control antigens were tested in parallel at a concentration similar to that of the HBV proteins (approximately 200 ⁇ g / ml).
- the antibody F 35.25 is specific for the pre-S1 region of the HBV env protein (the expression env protein is also used to denote the S proteins in general).
- its reactivity with the very large protein HBV (VL-) of 66000 confirms the presence of specific epitopes (s) of pre-S1 on this HBV HBsAg component of HBV (PETIT et al (1987)) , which is distinct from the HSA protein found in NHS.
- proline positions 32 and 94
- alanine positions 33 and 95
- the epitope recognized by F 35.25 is located on the pre-S1 sequence between pre-S (33) at the N-terminal level and pre-S (53) -selling-S (99) at the C-terminal level.
- the sensitivity of the pre-S2 domain for digestion by trypsin has been confirmed (STIBBE and GERLICH, (1983) Develop. Biol. Standard, 54, 33-43; HEERMANN et al (1984); PETIT et al ( 1987)) ( Figure 7, line 5 and Figure 7, line 8).
- F 35.25 After treatment with the V8 protease of the HBV protein, F 35.25 binds to a fragment of molecular weight 16500 (FIG.
- Protease V8 also generates two fragments with molecular weights of 15,000 and 29,000 reacting with F 35.25. This suggests: (i) a other possible cleavage by the protease in the pre-S2 domain, giving rise to a smaller fragment containing the pre-S1 sequences, and (ii) a cleavage at the GLU-338 residue in the S gene sequence.
- Figure 7, line 6 and Figure 7, line 9 illustrate the relative resistance of pre-S2 proteins (GP33 and GP36) to digestion by protease V8.
- HBV particles characterized by the presence of HBV DNA and of the major core protein, P22c, (detected by hybridization or Western Blot respectively ) were found in fractions 6-8 to 40-50% sucrose ( Figure 8). These positive HbsAg fractions were studied with regard to the presence of the specific pre-S1 epitope recognized by F 35.25.
- the amount of pre-S1 sequences in relation to HBsAg activity was determined to be of the order of 50%.
- DAS-RIA tests were also applied to assess the quantity of pre-S1 sequences in 7 purified HBV preparations (under ad or ay type).
- the HBV particles used for immunization were HBsAg under the ad type.
- ACM F 35.25 reacted significantly with HBV ad and HBV ay linked to grains coated with polyclonal anti-HBs ( Figure 9).
- ACM F35.25 seems to preferentially recognize the pre-S1 sequences of HBV under the ad type.
- the proportion of pre-S1 sequences in relation to HBsAg has been determined to be of the order of only 50% in HBV preparations of the ad type, and only 10 to 20% in HBV preparations of the ay type. . This difference can be attributed to the relative specificity of ACM F 35.25.
- ACM MA18 / 7 obtained by immunization with HBV particles of the ayw subtype reacts with particles of the adw subtype as well as those of the ayw subtype.
- ACM F35.25 could be attributed to a loss of the N-terminal end of the pre-S1 sequence of the HBV ay subtype under the effect of a tryspine-type enzyme. This could explain the greater instability of particles of the sub-type ay (such as RE, BAY, PEI.) Than those of the sub-type ad (such as LIS / 88 and LAM.).
- ACM F35.25 constitutes a good marker of the infectious nature of HBV since it is capable of forming an immunological complex, detectable in vitro, with the pre-S epitope (32-53) comprising glycine (35 ) involved in the ad subtype binding mechanism on hepatocytes.
- ACM MA18 / 7 does not recognize the region comprising glycine at position 35, since it is specific for the pre-S sequence (38-121), and is therefore not as good a marker of HBV infectivity. circulating than is ACM F35.25.
- the amount of large protein S is greater than that of average protein S, these two proteins S respectively representing approximately 35 to 40%, and 20% of proteins S contained in the sera of said individuals.
- the amount of large protein S is less than that of average protein S, these two proteins S respectively representing 25% and 50% of the proteins S present in the sera of said individuals.
- the amount of large protein S is approximately identical to that of average protein S, and represents for these two proteins approximately 25% of the amount of protein S present in the serum of said individuals.
- group II symptomatic carriers in which viral replication (HBV DNA) detectable or not in serum and possessing anti-HBe antibodies:
- pre-S antigens i.e. large S proteins, or even designated by pre-S1Ag, and medium proteins, or also designated by pre-S2Ag
- RIA radioimmunological techniques
- a group of 39 chronic HBsAg carriers was selected on the basis of a routine serological screening using the RIA test marketed by ABBOTT laboratories (CHICAGO, IL). Not all of these patients have antibodies to the hepatitis ⁇ virus. HBeAg and anti-HBe antibodies were determined with commercially available RIA kits (ABBOTT Laboratories). HBV DNA in the sera was measured by the hybridization technique described in SCOTTO J. et al, Hepatology (1983); 3: 279-284. This method detects 0.1 pg of HBV DNA. Biopsies of fresh frozen livers from certain patients have been studied by immunofluorescence (IF) for the detection of HBcAg. The IF method used has been described in detail in TREPO C.
- IF immunofluorescence
- CAH corresponds to chronic active hepatitis
- CPH corresponds to chronic persistent hepatitis and cirrhosis
- Group I consists of 11 patients (28.2%) with HBeAg (or HBe positive) and HBV DNA in their serum.
- Group II consists of 8 patients (20.5%) with anti-HBe antibodies (or anti-HBe positive) and persistent pathological activity in the liver and in which HBV DNA can to be detected or not.
- Group III consists of 20 patients (51.3%) who are carriers of HBsAg, whose liver function tests are normal, presenting anti-HBe antibodies but in which the replication of HBV in the serum is not detectable.
- HBsAg was determined using the monoclonal antibody F39.20 described above, specific for HBs (i.e. specific for major protein S).
- the pre-S antigens were detected using the pre-S2 specific monoclonal antibody F124, described above or using the pre-S1 specific monoclonal antibody, namely the monoclonal antibody F35.25 directed against receptor for hepatocytes of HBV.
- F39.20 and F124 were used as partially purified immunoglobulins G from ascites fluids at a concentration of 5 ⁇ g / ml.
- F35.25 was used at half the dilution of the hybridoma culture fluid. The binding of specific monoclonal antibodies was detected by incubation (1 hour at 37 ° C) with the F (ab ') 2 fragments of mouse anti-immunoglobulins labeled with 125 I (AMERSHAM FRANCE, Les Ulis).
- the diluent used above consists of 50% normal rabbit serum, 5% beef serum albumin in TN buffer. The beads were washed and the radioactivity measured in a gamma counter.
- results are expressed in cpm (counts per minute) of antibodies labeled with 125 I bound.
- the determination of the titers was carried out and the pre-S1Ag / HBsAg ratios as well as pre -S2Ag / HBsAg were calculated for a 10- or 10- 2 dilution 1 serum.
- the fractions were collected and assayed with the monoclonal antibody F39.20 specific for HBs, and the monoclonal antibody F35.25 specific for pre-S1 using the RIA PAb-MAb technique described above.
- the hepatocyte receptor for pre-S1 of HBV was detected in 17 of these patients (i.e. 89.5%): these epitopes F35.25 were detected in all HBeAg positive patients and 6 out of 8 (75%) anti-HBe positive cases. Only 2 (25%) of group II are negative for the pre-S1 antigen. It has been observed that one in two also negative for intrahepatic HBeAg.
- hepatocyte receptor for pre-S1 HBV was not detected in 18 out of 20 (90%) of healthy HBsAg HBeAg positive carriers (group III).
- the pre-S2 antigen (epitope F124) was detected in all serum samples (19 out of 19, 100%) from HBsAg positive patients with chronic liver pathologies, (groups I and II), e: in 15 on 20 (75%) of HBsAg carriers presented anti-HBe antibodies (group III) (table I).
- HBeAg As indicated in table I, of the 19 patients positive for the hepatocyte receptor for pre-S1 of HBV, 13 (or 68.4%) have DNA of HBV circulating in the serum, 17 have HBeAg in the liver (89.5%), and 11 (57.9%) respond to HBeAg. Consequently, the expression of the HBV pre-S1 antigen in the sera of chronic HBsAg carriers can be significantly correlated (P ⁇ 0.001) with the two most direct markers of HBV replication ( HBV DNA in serum and hepatocyte expression of HBcAg) as well as with the HBeAg / anti-HBe system.
- the expression of the pre-S2Ag antigen seems to follow the continuous production of the HBsAg proteins, and does not show any significant correlation (P> 0.5) with HBV DNA, in serum, HBcAg in the liver and the HBe system.
- the titles in HBsAg and pre-S2Ag are 1:10 4 and 1:10 3 , respectively.
- the titles in pre-S2Ag are similar to the titles in HBsAg in 27 out of 34 patients (or 79.4%) positive in pre-S2Ag.
- 5 out of 20 patients react for HBsAg alone with titers of up to 1:10 5 (Figure 10C, serum H305).
- FIG. 11 Clinical importance of the expression of the hepatocyte receptor for pre-S1 during chronic HBV infection.
- Figure 11 are shown the relationships pre-S1Ag / HBsAg and pre-S2Ag / HBsAg calculated for dilution 10 -1 serum (see Figure 10) in three groups.
- group I 5 out of 11 patients (45%) have a lower pre-S2Ag / HBsAg ratio (35%) than the 6 remaining patients who have the same HBV serological profile including HBeAg and HBV DNA.
- the pre-S2 / HBsAg ratio was detected as being high (60%) and did not differ significantly in 27 out of 34 (or 79.4%) of pre-S2 positive patients belonging to in groups 1, 2 or 3. This result suggests that the pre-S2Ag / HBsAg ratio cannot be considered as a reliable indicator of the level of viral replication and therefore of the relative infectivity during chronic HBV infection.
- the pre-S1Ag / HBsAg ratios are higher (approximately 50%) in HBeAg positive group I patients with active viral replication than in anti-HBe positive group II patients (i.e. 20%) with activity pathological in the liver, but having a low level of replication of HBV in the serum.
- This report is negative in 13 out of 15 patients (89%) of healthy group III carriers, who are positive for HBsAg and pre-S2Ag but who do not show replication of HBV or liver pathology.
- the pre-S1Ag / HBsAg ratio seems to be well correlated with the replication of HBV.
- the in vitro detection method of the invention allows discrimination between the different groups of chronic HBV carriers and comparing the expression of three antigenic specificities (S, pre-S1 and pre-S2) with the same sensitivity.
- pre-S1Ag is a specific marker of the level of replication of HBV during chronic HBV infection.
- the amount of HBV DNA present in the serum may be too low to be detected by conventional hybridization technologies.
- pre-S2Ag is present in most (87.2%) of symptomatic and asymptomatic chronic HBsAg carriers.
- the pre-S2Ag / HBsAg ratio detected in healthy carriers (group III) is not significantly different from that of patients in groups I and II, and remains high (up to 60%) in the different stages of infection. chronic by HBV. This suggests the continued synthesis of pre-S2 proteins even in healthy HBsAg carriers.
- the legends of the figures mentioned in the detailed description above are as follows:
- FIG. 1 schematic representation of HBV; cell-virus structure, components, and interaction (s).
- R1 is the cellular receptor involved in the direct binding of HBV via the pre-S1 sequences;
- R2 is the cellular receptor for p (HSA) probably involved in the indirect binding of HBV and HBsAg via the pre-S2 sequences carrying the viral receptor for glutaraldehyde-pHSA.
- Figure 2a Figure 2a; radioimmunoassay of the S, pre-S2 and pre-S1 sequences in HBsAg particles (A) and in preparations of HBV purified from human serum (B), and used as antigenic probes in FIG. 2b.
- the beads coated with anti-HBs antibodies were brought into contact with decreasing concentrations of either HBsAg or HBV and the bound antigen was detected using the monoclonal antibody F39.20 specific for the S region (• - •) and the monoclonal antibody F124 specific for the pre-S2 region ( ⁇ ____ ⁇ ), and the monoclonal antibody MA18 / 7 specific for the pre-S1 region ( ⁇ ____ ⁇ ) (at a final concentration of 5 ⁇ g / ml).
- Figure 2b polypeptide specificity of the antibody F35.25 by the technique of immunoblotting (Western blot).
- A HBs / pre-S2Ag serum
- B HBs / pre-S2 / pre-S1Ag (HBV) serum
- C HSA (200 ⁇ g / ml)
- D NHS (diluted 1: 500).
- the binding of monoclonal antibodies in Figure 2a as in Figure 2b was determined with mouse anti-immunoglobulins, the F (ab ') 2 fragment labeled with I 125 ( 10 6 cpm per bead or per gel strip).
- FIG. 3 amino acid sequence (deduced from the DNA sequences of HBV) of the pre-S (21-53), and pre-S (94-117) regions of the large surface proteins P39 and GP42 , corresponding to 5 antigenic subtypes of HBV.
- the location of the epitope recognized by F35.25 is shown in the figure.
- the amino acid residues common to the 5 subtypes are indicated by small circles under each of these amino acids.
- the dipeptide framed PA is that probably required for the binding to the antibody F35.25; the boxed peptide sequence extending from amino acids 40 to 47 (NPDWDFNP), is conserved in all HBV subtypes inside the binding site of the antibody F35.25; T represents the trypsin cleavage sites accessible in the complete HBV particles.
- FIG. 4 radioimmunoassay (RIA) with double antibody, carried out with a hybridoma fluid diluted twice containing F35.25 ( X 10 ng / ml).
- a the peptides specific for the pre-S1 region 1-21, 12-32, 32-53, 53-73, 94-117 were used to coat the beads.
- F35.25 linked to the beads coated with synthetic peptide was detected with a mouse anti-immunoglobulin labeled with I 125 as described in FIG. 2.
- FIG. 4 radioimmunoassay
- the HBsAg particles containing the pre-S2 sequences obtained by recombination in recombinant CHO cells, the purified HBV, HSA, pBSA and pHSA particles were used to coat the beads under the same conditions as for Figure 4a.
- Each column represents two determinations.
- FIG. 5 inhibitory effect of peptides specific for the pre-S1 region and of purified HBV particles (at a final concentration of 20 ⁇ g / ml) on the binding of ACM F35.25 to wells coated with either pre- S (32-53) (Figure 5a) or with HBV ad subtype ( Figure 5b).
- the conditions of this experiment were described in the MATERIALS AND METHODS chapter using a hybridoma fluid diluted twice as in Figure 4.
- sensitivity of ACM F35.25 to detect the pre-S peptide (32-53) and the pre-S1 sequences in the purified HBV particles The wells coated either with the pre-S peptide (32-53) ( ⁇ ) (5 ⁇ g / ml) or with HBV ad subtype ( ⁇ ) (10 ⁇ g / ml) were brought into contact with decreasing concentrations of F35.25 purified from hybridoma cell supernatants.
- FIG. 7 effect of digestion by trypsin or V8 protease of purified HBV particles (subtype ad) on the binding of ACM F35.25 (a), of the monoclonal antibody F376 specific for the pre region -S2 (b) and of the antibody 6-16 A15 specific of the region S (c) to the env protein by immunoblotting technique.
- the processing of the antigen was carried out as described in the MATERIALS AND METHODS chapter. Lanes 1, 4, and 7 represent controls without enzymes; lines 2, 5 and 8 represent the products of digestion with trypsin; lines 3, 6 and 9 represent the protease digestion products V8.
- lines 1 to 3 were probed with the hybridoma supernatant diluted 1: 2, and lines 4 to 9 were probed with 5 ⁇ g / ml of monoclonal antibody purified from ascites liquid.
- the antibody binding to the transferred protein was detected with anti-mouse immunoglobulin labeled with I 125. the molecular weights of the peptides (x 10 3 ) are indicated on the left.
- sucrose gradient of HBV particles (subtype ad). 1 ml of material enriched in virus was sedimented in a linear sucrose gradient of 10 to 60% in TN buffer for 18 hours at 160,000 g and 4 oC. The fractions were collected and analyzed with ACM F39.20 ( ), or ACM F35.25
- FIG. 9 detection of the pre-S1 sequence (32-53) in the isolated HBV particles (subtype ad or av) using the radioimmunoassay system with double antibody specificity, with immunoglobulins anti-HBs on the solid side and the F35.25 antibody on the revealing side.
- the purified HBV particles were used at a concentration of I ⁇ g / ml.
- the binding of F35.25 was detected with mouse anti-immunoglobulin labeled with I 125 , fragment F (ab ') 2.
- HBsAg major protein S
- pre-S1 hepatocyte receptors - ⁇ - ⁇ -
- pre-S2 antigen -o-o-
- FIG. 10B and 10C Clinical significance of the expression of the pre-S1 hepatocyte receptor in patients with chronic hepatitis B.
- the pre-SlAg / HBsAg ratio (columns represented in black) and the pre-S2Ag / HBsAg ratio (columns represented in gray) were calculated for a 10 -2 dilution of the serum (cf. FIG. 10B and 10C) or 10- 3 (see Figure 10A).
- Group I HBeAg and HBV-DNA positive patients with chronic liver disease.
- Group II anti-HBe positive patients with chronic liver disease.
- Group III healthy anti-HBe positive carriers.
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Abstract
L'invention concerne un anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il forme un complexe immunologique avec un épitope compris entre les acides aminés situés aux positions 32 et 53 de la région pré-S1 de la grande protéine S d'enveloppe du virus de l'hépatite B (HBV). L'invention a également pour objet les applications de cet anticorps monoclonal, notamment pour le diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique chez un individu infecté par l'HBV, ainsi que pour le traitement et la vaccination contre cette maladie.
Description
ANTICORPS MONOCLONAL RECONNAISSANT UNE REGION PRE-S1 DE LA GRANDE PROTEINE D'ENVELOPPE DU VIRUS DE
L'HEPATITE B.
L'invention concerne un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope situé dans la région pré-S1 de la grande protéine d'enveloppe du virus de l'hépatite B (HBV). L'invention a également pour objet les applications de cet anticorps monoclonal, notamment pour le diagnostic in vitro de l'évolution de la maladie chez un individu atteint d'hépatite B chronique, ainsi que pour le traitement de l'hépatite B, et la vaccination contre cette maladie.
L'enveloppe de l'HBV contient trois types de protéines de surface (protéines S). Les protéines S sont les seuls composants viraux trouvés dans les particules antigéniques de surface de l'hépatite B (particules HBsAg) qui sont exprimées en grande quantité par rapport au virus lui-même lors d'une infection. Ces particules HBsAg se présentent sous forme sphérique ou tubulaire avec un diamètre plus faible (22 nm) que les particules d'HBV infectieuses (42 nm).
Ces trois protéines S sont les suivantes :
- la "petite" protéine S, ou protéine S majeure ou HBsAg constituée de la séquence (ou région) S de 226 acides aminés, (PETERSON, D.L. et al, (1977) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 1530-1534) ;
- la protéine S "moyenne" constituée de la séquence S sus-mentionnée et de 55 acides aminés N-terminaux
additionnels codés par la région pré-S2 de l'ADN de l'HBV (HACHIDA, A. et al (1984), Gastroenterology, 86, 910-918) ;
- la "grande" protéine S constituée des séquences S, pré-S2 et de 108 (sous-type antigénique ad) ou 119 (sous-type antigénique ay) acides aminés N-terminaux additionnels codés par la région pré-S1 de l'ADN de l'HBV (HEERMANN, K. et al (1984), J. Virol., 52, 396-402 ; WONG, D.T. et al (1985) J. Virol., 55, 223-231).
Ces trois protéines S existent sous différentes formes glycosylées :
- les protéines majeures P24 et GP27,
- les protéines moyennes GP33 et GP36,
- les grandes protéines P39 et GP42.
Les protéines moyennes et grandes ont été trouvées en plus forte concentration dans les particules infectieuses d'HBV (qui contiennent également l'antigène du core du virus, HBcAg) que dans les particules HBsAg sus-mentionnées (HEERMANN, K.H., et al précédemment cité, et TAKAHASHI, K. et al (1986) J. Immunol., 136 , 3467-3472).
Ces protéines jouent donc probablement un rôle dans l'assemblage ou le fonctionnement des particules HBV infectieuses.
Il est estimé que les régions pré-S2 et pré-S1 des protéines S jouent un rôle dans les mécanismes de reconnaissance et de pénétration du virus dans les hépatocytes des individus infectés par l'HBV. Ainsi le site de liaison d'HBV au récepteur des hépatocytes serait localisé entre les acides aminés situés aux
positions 21 et 47 de la région (ou séquence) pré-S1 (NEURATH, A.R. et al, (1986) CE11, 46, 429-436).
Ces auteurs ont également démontré que l'interaction entre HBV et les cellules de l'hépatome HepG2 est fortement inhibée par des anticorps dirigés contre un peptide s'étendant entre les résidus d'acides aminés aux positions 21 et 47 de la séquence pré-S1 (d'où la désignation "anticorps anti-pré-S (21-47)") ainsi que par des anticorps anti-pré-S (32-53).
Compte tenu du rôle vraisemblablement important de la région pré-S1 dans la mécanisme infectieux de l'HBV, et notamment dans la reconnaissance des récepteurs des hépatocytes, les anticorps reconnaissant spécifiquement cette région, et plus particulièrement l'épitope responsable de la fixation de l'HBV sur les hépatocytes, seraient probablement d'une grande valeur dans le domaine de la lutte contre l'hépatite B. Néanmoins, les anticorps monoclonaux connus à ce jour ne se sont pas avérés présenter les propriétés voulues à cet effet ; on notera que l'anti-pré-S (32-53) susmentionné, a été obtenu à l'aide de la séquence pré- S (32-53) qui n'induit pas de réponse anti-HBV dans les sérum de malades. La vaccination à l'aide d'une telle séquence s'avère par conséquent peu envisageable.
Afin de disposer d'anticorps plus spécifiques de la région pré-S1 que ne le sont les actuels anticorps polyclonaux sus-mentionnés, d'autres anticorps monoclonaux ont été préparés à partir de lymphocytes d'animaux immunisés avec des particules HBV (TAKAHASHI, K. et al (1986) précédemment cité), ou avec des peptides synthétiques tels que pré-S1 (1-11) et pré-
S (13-21) (OHNUMA, H, et al (1986) Gastroenterology, 90, 695-701). Ceux-ci n'ont pas été caractérisés en détail.
Un anticorps monoclonal (ACM) a été plus particulièrement décrit dans la demande de brevet européen publiée le 07/05/1986 sous le numéro 0 180 012 de GERLICH et al. Cet anticorps monoclonal (MA18/7) reconnaît spécifiquement la séquence pré-S (38-121) de la région pré-S1, mais ne permet pas l'identification du site spécifique de liaison du virus sur les hépatocytes.
Cet ACM MA18/7 présente également l'inconvénient de donner lieu à des réaction immunologiques croisées avec les sérums d'individus non infectés par l'HBV, ce qui représente un inconvénient majeur pour son utilisation dans des procédés de diagnostic in vitro.
La présente invention a pour objet un anticorps monoclonal présentant l'avantage par rapport aux anticorps anti-pré-S1 connus, d'une part, d'être plus spécifiques de la séquence en acides aminés de la région pré-S1 impliquée dans le mécanisme de la fixation de l'HBV sur les hépatocytes, et, d'autre part, de ne pas donner lieu à des réactions immunologiques croisées avec les sérums d'individus non infectés par l'HBV.
L'invention concerne également une nouvelle méthode de détection, et de dosage in vitro de la grande protéine pré-S1 plus précise et informative que celles élaborées à l'aide des anticorps connus, ainsi que l'application de cette méthode au diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique.
L'invention a également pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques pour le traitement de l'hépatite B et pour la vaccination contre cette maladie.
Il sera fait référence dans la description qui suit aux dessins dans lesquels :
- la figure 1 est une représentation schématique du virus de l'hépatite B (HBV),
- la figure 2a représente les résultats d'un dosage radio-immunologique (RIA) des séquences S, pré-S2, et pré-S1 dans les particules HBsAg et l'HBV. La figure 2b représente la spécificité polypeptidique de l'anticorps monoclonal de l'invention déterminée par la technique des immuno-empreintes,
- la figure 3 représente les séquences d'acides aminés des régions pré-S(21-53), et pré-S(94-117) des grandes protéines de surface P39 et GP42, correspondant à 5 sous-types antigéniques de l'HBV,
- la figure 4 (a et b) représente les résultats d'un dosage radio-immunologique impliquant des peptides pré-S1 et des antigènes viraux, réalisé à l'aide e l'anticorps monoclonal de l'invention,
- la figure 5 représente les effets inhibiteurs des peptides spécifiques de la région pré-S1 et des particules HBV vis-à-vis de la liaison de l'anticorps monoclonal de l'invention avec le peptide pré-S (32-53) (figure 5a), ou avec l'HBV sous-type ad (figure 5b),
- la figure 6 représente la sensibilité de l'anticorps monoclonal de l'invention pour la détection de la région pré-S1,
- la figure 7 représente les résultats de la digestion des particules d'HBV par la trypsine ou la protéase V8,
- la figure 8 représente un gradient de sucrose des particules HBV (sous-type ad), et la corrélation entre la détection des épitopes F35-25 et la présence de virions complets dans les sérums.
- la figure 9 représente la détection de la séquence pré-S1 (32-53) dans les particules d'HBV purifiées et suivant le système du dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps.
- la figure 10 représente l'analyse quantitative des antigènes S et des antigènes pré-S (pré-S1Ag et pré- S2Ag) dans les sérums de porteurs chroniques,
- la figure 11 représente la signification clinique de l'expression de l'antigène pré-S1 (ou encore du récepteur hépatocytaire pré-S1) chez les patients atteints d'hépatite B chronique.
L'invention concerne un anticorps monoclonal (ciaprès désigné par ACM F35-25) défini par la combinaison des propriétés suivantes :
- il forme un complexe immunologique avec :
. un épitope compris entre les acides aminés situés aux positions 32 et 53 de la région pré-S1,
. la région pré-S1 de la grande protéine S d'enveloppe de l'HBV,
. les grandes protéines d'enveloppe de l'HBV, P39 et GP42,
. la très grande protéine d'enveloppe de l'HBV de 66 kd (kilodaltons),
. chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette
dernière avec la trypsine, dont les deux produits issus du clivage par la trypsine de la région pré-S1 de ladite grande protéine S et présentant respectivement les poids moléculaires de 13500 et 14500,
. chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la protéase V8 de S. aureus, et dont les poids moléculaires sont de 15000, 16500, et 29000, respectivement,
- il ne forme pas de complexe immunologique avec :
. les (glyco) protéines S moyennes d'enveloppe de l'HBV, GP33 et GP 36 ;
. les glycoprotéines S majeures d'enveloppe de l'HBV P24 et GP27 ;
. la sérum-albumine-humaine (HSA) ;
. la sérum-albumine humaine polymérisée (pHSA) ;
. les immunoglobulines G, A et M ;
. les divers constituants de sérums d'individus non infectés par l'HBV.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention appartiennent de préférence à la classe des immunoglobulines G1(IgG1).
L'anticorps monoclonal sus-mentionné peut être obtenu par un procédé comprenant la fusion de cellules myélomateuses et de cellules spléniques prélevées sur un animal immunisé avec des particules HBV, suivant la technique générale d'obtention des hybridomes, et la détection et la récupération de ceux des hybridomes qui sécrètent les anticorps monoclonaux possédant les propriétés définies ci-dessus.
L'invention vise également les hybridomes susceptibles de sécréter des anticorps monoclonaux cidessus définis, notamment ACM F35.25.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'hybridome sécrétant l'ACM F35.25 et qui a été déposé à la COLLECTION NATIONALE DES CULTURES DE MICROORGANISMES (C.N.C.M.) de l' INSTITUT PASTEUR à PARIS sous le numéro 1-796 le 5 août 1988.
L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de la présence éventuelle de la grande protéine S (comprenant la région pré-S1) dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite protéine, cette méthode comprenant :
- la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec l'ACM F35.25 dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pré-S1 de la grande protéine S et l'ACM F35.25 ;
- la détection du susdit complexe immunologique.
Une telle méthode de détection in vitro peut être réalisée suivant toute technique en soi connue de l'homme du métier.
Cette méthode comprend par exemple les étapes suivantes :
- fixation sur un support solide de l'ACM F35.25 ;
- addition de l'échantillon biologique sur le support sus-mentionné dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pré-S1 de la grande protéine et l'ACM F35.25. ;
- addition ensuite sur le support solide d'autres anticorps a leur tour susceptibles de former un complexe immunologique avec le complexe précédent, tel que l'ACM F35.25 ; ces anticorps sont marqués, notamment de manière radioactive, ou enzymatique ;
- détection à l'aide de réactifs appropriés des anticorps marqués sus-mentionnés engagés dans le susdit complexe immunologique.
Une méthode originale de détection in vitro de l'antigène pré-S1 selon l'invention comprend encore les étapes suivantes :
- fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux, susceptibles de former un complexe immunologique avec la région S des protéines S;
- addition de l'échantillon biologique sur le support sus-mentionné dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre les anticorps sus-mentionnés et la région S des protéines S contenues dans l'échantillon ;
- addition de l'ACM F35.25, ou de tout autre anticorps susceptible de former un complexe immunologique avec le complexe obtenu à l'étape précédente, éventuellement marqué, notamment de manière radioactive ou enzymatique, dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique formé entre celles des protéines S contenues dans l'échantillon et portant la région pré-S1 (c'est-à-dire les grandes protéines S) et l'ACM F35.25 ;
- détection à l'aide de réactifs appropriés de l'ACM F35.25 marqué et qui est engagé dans le susdit complexe immunologique,
- ou, si l'ACM F35.25, n'est pas marqué, détection du dernier complexe immunologique sus-mentionné à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées (obtenues chez un animal d'une espèce différente de celui utilisé pour l'obtention des anticorps fixés sur le support solide) susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM F35.25 engagé dans le dernier complexe immunologique obtenu lors de l'étape précédente.
Selon un mode de réalisation plus détaillé d'une méthode de détection in vitro préférée de l'invention, cette dernière comprend les étapes suivantes :
- fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux (obtenus par exemple par immunisation de lapins) susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S d'enveloppe de l'HBV;
- rinçage du support afin d'éliminer ceux des susdits anticorps non fixés sur le support ;
- addition sur le support de l'échantillon biologique, notamment du sérum, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre les anticorps polyclonaux sus-mentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans ledit sérum ;
- rinçage du support afin d'éliminer les différents constituants dudit sérum non reconnus par les anticorps sus-mentionnés ;
- addition sur le support des anticorps monoclonaux ACM F35.25 selon l'invention, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre lesdits anticorps mdnoclonaux et celles des protéines S engagées dans le complexe immunologique précédent et comprenant la région pré-S1 des çrandes protéines ;
- rinçage du support afin d'éliminer ceux des anticorps monoclonaux non engagés dans une réaction immunologique avec ladite région pré-S1 des grandes protéines S ; - addition sur le support d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM F35.25 (obtenues par immunisation d'une espèce animale identique à celle utilisée pour l'obtention de l'ACM F35.25, et différente de celle utilisée pour l'obtention des anticorps polyclonaux fixés sur le support solide ; ces anti-immunoglobulines peuvent être obtenues dans l'exemple présent par immunisation de souris) dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique final formé entre lesdites anti- immunoglobulines et l'ACM F35.25 engagé dans le complexe immunologique obtenu à l'étape précédente;
- détection de la quantité d'anti-immunoglobulines marquées engagées dans le complexe immunologique final sus-mentionné, cette quantité pouvant être corrélée à la quantité de protéines S portant la région pré-S1, ou encore grandes protéines S, présentes dans ledit sérum.
D'une manière plus générale, l'invention a plus particulièrement pour objet la méthode de détection in vitro telle que décrite ci-dessus dans laquelle l'ACM
F35.25 est remplacé par tout anticorps susceptible de former une réaction immunologique avec le complexe formé entre l'anticorps polyclonal fixé sur le support solide et les protéines S contenues dans l'échantillon biologique, et dans laquelle les anti-immunoglobulines marquées sont susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps remplaçant l'ACM F35.25. Dans une telle méthode de détection in vitro, l'ACM F35.25 est remplacé notamment par un anticorps monoclonal susceptible de former une réaction immunologique avec la région pré-S1 des protéines S.
L'invention concerne également l'application de la méthode de détection in vitro sus-mentionnée au diagnostic in vitro de l'hépatite B aiguë ou chronique réalisé à partir d'un échantillon biologique, tel que du sérum, prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par HBV.
L'invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique chez un individu porteur symptomatique ou asymptomatique des protéines S de l'HBV.
La méthode de diagnostic in vitro sus-mentionnée est avantageusement réalisée par la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de détection in vitro de la quantité de grande protéine S sus-mentionnée, d'une méthode de détection in vitro de la protéine S majeure. Cette dernière méthode est réalisée suivant les mêmes étapes que celles décrites ci-dessus pour la détection de la grande protéine, et dans lesquelles, d'une part, l'ACM F35.25, est remplacé par un anticorps, de
préférence monoclonal, susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, (ou avec l'une ou l'autre de ses formes glycosylées ou les deux à la fois), et d'autre part, les anti- immmunoglobulines reconnaissant l'ACM F35.25 sont remplacées par des anti-immunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM susmentionné reconnaissant la protéine S majeure.
Parmi les anticorps monoclonaux susceptibles de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, et que l'on peut utiliser dans la méthode sus-mentionnée, on citera notamment l'ACM F39.20 décrit dans PETIT, M.A. et al (1987) J. Gen. Virol., 68, 2759-2767.
La comparaison des quantités détectées de grande protéine S et de protéine S majeure dans, un même échantillon permet de connaître, a un temps donné, la proportion de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure présente dans ledit échantillon.
La mise en oeuvre répétée de la méthode susmentionnée permet de suivre l'éventuelle variation de cette proportion en fonction du temps.
La détection d'une diminution de cette proportion en fonction du temps chez un individu atteint d'hépatite B chronique, permet d'émettre l'hypothèse que la maladie évolue favorablement chez cet individu ; c'est-à-dire qu'elle évolue probablement vers un état de guérison totale ou partielle (pseudo-guérison), qui se caractérise par une disparition complète de la grande protéine S dans l'échantillon prélevé chez ledit individu.
Le principe de la méthode de détection in vitro de la grande protéine S sus-mentionnée peut également être appliqué a la détection de la protéine S moyenne en utilisant, au lieu de l'ACM F35.25 et des anti- immunoglobulines reconnaissant l'ACM F35.25, un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la région pré-S2 de ladite protéine S moyenne (ou avec l'une ou l'autre de ses formes glycosylées ou les deux à la fois), et des anti- immunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal, susmentionné reconnaissant la région pré-S2. A titre d'exemple de ce dernier type d'anticorps monoclonal, on citera l'ACM F124 décrit dans PETIT, M.A. et al (1987) précédemment cité.
Ainsi la méthode de l'invention permet la détection dans un échantillon biologique prélevé chez un individu atteint d'hépatite B chronique, de la proportion de la grande protéine S par rapport à la protéine S moyenne d'une part, et par rapport à la protéine S majeure d'autre part. Une telle méthode permet donc de suivre en fonction du temps les variations des proportions des trois protéines S les unes par rapport aux autres, et ainsi de juger de l'évolution favorable ou non de la maladie en fonction de ces variations.
La méthode de diagnostic in vitro de l'invention est réalisée à partir d'échantillons biologiques (prélevé chez des individus), tels que le sérum, ou des biospies du foie. Etant donné que l'expression des protéines S dans les lymphocytes se faisant de manière
identique à celle de ces mêmes protéines S dans les cellules hépatiques, il est plus avantageux, compte tenu de l'opération délicate que constitue une biopsie du foie, de réaliser la méthode de diagnostic de l'invention à partir d'un prélèvement de lymphocytes.
Avantageusement, la méthode de diagnostic in vitro de l'invention permet le suivi thérapeutique des patients atteints de l'hépatite B et qui sont traités avec des compositions pharmaceutiques comprenant, notamment, de l'interféron, ou avec des antiviraux, tels que la vidarabine.
La détection d'un diminution de la quantité de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure, et/ou la protéine S moyenne, chez un de ces patients, permet d'émettre l'hypothèse que la thérapeutique utilisée donne des résultats favorables, et que ce patient évolue vers la guérison.
L'invention concerne également l'utilisation de l'ACM F35.25 pour la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de diagnostic in vitro de l'invention, d'une méthode de détection in vitro des produits de clivage de la grande protéine S issus de la digestion in vivo de cette dernière par la trypsine, ou par des enzymes possédant des activités du type de la trypsine et présentes dans l'organisme de l'individu à partir duquel l'échantillon biologique a été prélevé.
Cette méthode de détection est réalisée suivant la technique des immuno-empreintes (ou Western blot) à partir d'un échantillon tel que les lymphocytes, et comprend les étapes suivantes :
- électrophorèse sur gel afin d'obtenir un séparation des divers constituants antigéniques de l'échantillon,
- transfert de ces constituants ainsi séparés sur un support tel qu'une membrane de nitrocellulose,
- incubation avec l'ACM F35.25, éventuellement marqué, notamment de manière radioactive ou enzymatique, dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique formé entre l'ACM F35.25 et chacun des produits de clivage de la grande protéine S, dont les deux produits issus du clivage par la trypsine de la région pré-S1, et présentant respectivement les poids moléculaires de 13500 et 14500,
- détection à l'aide de réactifs appropriés de l'ACM F35.25 marqué engagé dans un complexe immunologique sus-mentionné avec un produit de poids moléculaire de 13500 ou 14500,
- ou, dans le cas où l'ACM F35.25 n'est pas marqué, détection à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM F35.25 engagé dans un complexe immunologique tel que défini ci-dessus.
Une telle méthode permet de quantifier la proportion de grandes protéines éventuellement dégradées dans l'organisme d'un individu et de déterminer ainsi le degré de résistance à l'infection par HBV de cet individu qui est fonction de la plus ou moins grande quantité de produits de clivage de la grande protéine S par la trypsine ainsi détectée.
L'invention a également pour objet des nécessaires ou kits, pour la mise en oeuvre d'une des méthodes de l'invention décrites ci-dessus.
A titre d'exemple, un kit selon l'invention comprend :
- une quantité déterminée d'anticorps polyclonaux fixés sur un support solide et susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S,
- une quantité déterminée de l'anticorps monoclonal F35.25.
- éventuellement une quantité déterminée d'un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure d'enveloppe de l'HBV,
- éventuellement un quantité déterminée d'un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S moyenne d'enveloppe de l'HBV,
- avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les anticorps susmentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique,
- avantageusement des réactifs marqués, notamment des immunoglobulines marquées, permettant la détection des complexes immunologiques dans lesquels sont engagés les anticorps monoclonaux sus-mentionnés.
L'invention a également pour objet l'utilisation de l'anticorps monoclonal F35.25 de l'invention pour le traitement de l'hépatite B et plus particulièrement pour la prévention des phénomènes de réinfection du greffon lors de greffe du foie chez les individus atteints de l'hépatite B.
A ce titre, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques pour les traitements indiqués ci- dessus, et qui comprennent l'ACM F35.25 associé avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La transplantation hépatique chez les patients, chez lesquels on peut détecter une réplication active du virus de l'Hépatite B, est associée à un risque élevé de réinfection du greffon (TORISU et al, 1971, Annals of Surgery, 174, 620-637). Jusqu'à présent, l'état porteur chronique de l'HBsAg était considéré comme une contre-indication pour une greffe de foie, surtout dans le cas de porteurs positifs pour l'HBeAg (c'est-à-dire d'individus porteurs de l'antigène HBe qui est un antigène de la nucléocapside). Une immunoprophylaxie à court-terme avec des immunoglobulines spécifiquement dirigées contre les protéines S majeures d'HBV (anti-HBs) s'est avéré être un échec (van Thiel DH et al (1984), Hepatology 4.79S-83S). Récemment, un protocole d'immunoprophylaxie passive à long-terme a été mis au point, utilisant des doses élevées d' immunoglobulines, associé à une immunoprophylaxie active par vaccination. Ce protocole apparaît plus efficace pour prévenir la réinfection, mais seulement dans le cas de greffés chez lesquels on ne peut détecter de réplication du virus HBV avant la transplantation, (Mûller R. et al, Viral Hepatitis and Liver Disease, pages 810-812 (1988) Alan R.Liss, Inc.)
Ainsi, les seules immunoglobulines anti-HBs ne semblent pas efficaces pour empêcher la réinfection du greffon en présence de virions complets circulant dans le sérum de ces malades avant la transplantation. En
effet, l
BsAg s'exprime en très larges excès sous forme de particules défectives (particules de 22nm constituées de l'enveloppe du virus mais pas de la nucléocapside) non infectieuses qui sont spécifiquement neutralisées par ces anticorps. Par contre, les particules virales infectieuses se trouvent proportionnellement en très petit nombre, d'où la nécessité d'utiliser des doses très élevées d'immunoglobulines anti-HBs, ce qui constitue une thérapie coûteuse pour un résultat très décevant. Or, les virions complets responsables de la réinfection expriment sélectivement la spécificité pré-S1, contrairement aux formes défectives d'HBsAg.
Par sa spécificité anti-pré-S1, et plus précisément par sa spécificité dirigée contre les sites de reconnaissance de l'HBV par les hépatocytes, ces sites étant exprimés à la surface des virions complets, l'ACM F35.25 s'avère particulièrement intéressant à exploiter en vue d'un protocole d' immunoprophylaxie passive à court-terme, (par exemple 3 à 4 injections en un mois) à la place ou en association avec une immunoprophylaxie passive à long terme (plusieurs années) avec des immunoglobulines anti-HBs, complété par une immunoprophylaxie active par vaccination. En effet, il a été récemment montré que la vaccination avec l'Hevac-B (PASTEUR VACCINS), obtenu à partir de sérums humains, était capable d'induire la production d'anticorps anti-pré-S1.
Ainsi, l'invention concerne plus particulièrement des ompositions pharmaceutiques comprenant en assocation avec un véhicule pharmaceutiquement
acceptable, une quantité déterminée d'ACM F35.25 associée avec des immunoglobulines anti-HBs, (notamment celles obtenues à partir de donneurs de sang ayant fait une séroconversion HBs/anti-HBs), et le cas échéant, avec un vaccin contre l'hépatite B, notamment l'Hevac-B sus-mentionné, ou encore l'anticorps monoclonal anti- idiotype décrit ci-dessous.
L'invention concerne également l'anticorps monoclonal anti-idiotype caractérisé en ce qu'il forme un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal F35.25.
L'anticorps monoclonal anti-idiotype sus-mentionné est obtenu par immunisation d'un animal à l'aide d'un anticorps moncoclonal F35.25 selon l'invention, suivi de la récupération de ceux des anticorps susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps moncoclonal F35.25.
L'invention a également pour objet des compositions pour la vaccination contre l'hépatite B caractérisées par l'association de l'anticorps monoclonal anti-idiotype sus-mentionné avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit de l'obtention et de la caractérisation de l'anticorps moncoclonal F35.25, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications.
I MATERIELS ET METHODES
1) Obtention de l'anticorps monoclonal F35.25
Les particules HBV ont été purifiées à partir du sérum d'un individu atteint d'hépatite B chronique (sous type ad) comme il a été décrit dans PETIT et al (1985) Molec. Immunol., 22, 1279-1287, et ont été utilisées comme immunogène. Des souris BALB/c ont été inoculées intrapéritonéalement avec 100 μg de virus purifié dans l'adjuvant complet de Freund, puis une semaine plus tard avec 100 μg de virus dans l'adjuvant incomplet de Freund. Les trois souris immunisées ont développé de hauts titres en anticorps contre HBsAg, et qui ont été détectés par dosage radioimmunologique RIA. Deux semaines plus tard, les souris ont été inoculées avec 50 μg de virus dans un tampon phosphate. Après cinq jours, l'injection a été répétée, et trois jours plus tard, leur rate ont été retirées pour réaliser une fusion avec les cellules du myélome X63 selon la procédure décrite par BUTTIN et al (1978), 81, 27-36.
Les surnageants de la culture d'hybridomes ont été sélectionnés pour leur présence en anticorps spécifique d'HBV par RIA indirect en utilisant le virus purifié immunisant en tant que phase solide (PETIT et al (1987)J. Gen. Virol., 68, 2759-2767). 30 % des clones de l'hybridome produit des anticorps contre HBV. Les hybrides donnant le plus fort signal (P/N>10) (P = positif, N = négatif) avec les particules HBV sur la phase solide ont été reclonés par dilution limitante, et leur spécificité polypeptidique a été déterminée par Western . Blot en utilisant des protéines virales dissociées en tant que sonde antigénique (PETIT et al (1986) Molec. Immunol, 27, 511-523).
Les clones sélectionnés ont ensuite été injectés à des souris BALB/c pour la production d'ascites.
L'anticorps monoclonal spécifique de la région pré-S1, F 35.25, a été purifié à partir du surnageant d'une culture cellulaire d'hybridomes par précipitation avec 50 % (NH4)2SO4 saturé, et par filtration sur gel SEPHADEX G-200 (PHAMACIA - FRANCE), suivi d'une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE-trisacryle M (IBF - FRANCE). L'isotype a été déterminé par immunodiffusion contre des antisérums de lapin spécifique pour les immunoglobulines M de souris (IgM), IgG1, IgG2A, IgG2B et IgG3 (NORDIC IMMUNOLOGY - TILBURG-BERCHEM - LONDON)
2) Test d'immunotransfert (technique de Western Blot)
La spécificité polypeptidique de l'ACM F 35.25 a été déterminée par immunotransfert en utilisant des préparations de virus non traités, ou digérés, en tant qu'antigènes (PETIT et al (1986) et (1987) précédemment cité).
La digestion par la protéase V8 de S.aureus (type XVII de chez SIGMA) et par la trypsine (type XII de chez SIGMA) a été réalisée dans du bicarbonate d'ammonium 0,1N, pH 7,8, a 37º C pendant trois heures.
Le rapport de la quantité d'enzymes au substrat était de 1:40-50 (par poids), et la concentration de protéine était de 1 mg/ml. La réaction a été arrêtée par addition d'un tampon contenant 2 % de SDS et 5 % de 2-mercaptoéthanol.
Les particules sphériques HBsAg de 22-nm ont été co-purifiées avec l'HBV provenant d'un sérum HBsAg
positif, montrant seulement une réactivité pré-S2 (PETIT et al (1987) précédemment cité), une sérum albumine humaine (0,22 mg/ml) et un sérum humain normal dilué au 1/500 ont été utilisés en parallèle en tant qu'antigènes de contrôle. L'HBV purifié a été utilisé à différentes concentrations allant de 0,2 à 1 mg/ml. Après électrophorèse utilisant le système de tampon décrit dans LAEMMLI (1970) Nature, London, 227,, 680-685, des bandes protéiniques ont été éluées électrophorétiquement et transférées sur des membranes de nitrocellulose pour y être détectées comme il a été décrit dans PETIT et al (1987) précédemment cité). Les bandes de transfert ont été incubées soit avec les surnageants de cellules d'hybridomes à une dilution de 1:2 dans un tampon bloquant (tris-NaCl contenant de l'albumine de sérum de boeuf et 50 % de sérum foetal de boeuf) ou avec 10 ng/ml d'IgG monoclonal purifié de souris.
3) Test radjoimunologique (RIA)
La liaison de l'ACM F 35.25 soit au virus à l'état natif, soit à des peptides synthétiques dérivant de la séquence pré-S1 de la grande protéine d'enveloppe HBV sous-type adw2 (NEURATH et al (1986) précédemment cité) a été mesurée par RIA en utilisant un fragment F(ab)'2 anti-souris marqué radioactivement avec de l'iode I125 (immunoglobuline de mouton, AMERSHAM - FRANCE). Des billes de polystyrène ont été enduites avec des antigènes individuels dilués dans un tampon TN (0,01 M-tris-HCl, 0,14 M-NaCl, pH 7,2) à une concentration de 20 μg/ml.
Après deux heures à. 37ºC et une nuit à 4ºC, les solutions d'antigène ont été retirées et les billes ont été saturées avec 5 % (en poids par volume) de sérum d'albumine de boeuf dans un tampon TN pendant 6 heures à 'température ambiante.
Les billes enduites ont alors été incubées avec une dilution au 1:2 de surnageant de culture de cellules d'hybridomes pendant une nuit à température ambiante, lavées plusieurs fois avec de l'eau distillée et incubées pendant une heure à 37ºC avec le fragment F(ab')2 anti-immunoglobuline de souris marqué avec de l'iode I125. Le diluant utilisé était constitué de sérum albumine de boeuf et de 50 % de sérum foetal de boeuf dans un tampon TN. Enfin, les billes ont été lavées et comptées dans un compteur gamma.
Le surnageant a également été testé par RIA en utilisant des billes enduites de particules HBsAg recombinantes (produit du gène pré-S2 et du gène S) décrit dans MICHEL et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81,, 7708-7712) de la sérum albumine humaine polymérisee (pHSA) et de la sérum albumine de boeuf polymérisé (pBSA).
Des expériences d'inhibition compétitive d'antigène ont été utilisées pour étudier l'effet inhibiteur du virus à l'état natif ou de l'antigène peptidique sur la liaison de l'anticorps F 35.25 au virus et aux peptides synthétiques. Les échantillons de virus ou de peptides libres (20 μg/ml) ont d'abord été pré-incubés avec l'anticorps monoclonal dilué, purifié à partir du fluide de culture d'hybridomes (correspondant à 0,2 ng d'immunoglobuline de souris/ml) pendant 1 heure à 37ºC.
Les mélanges ont été transfères dans des puits enduits soit avec un peptide synthétique de la région pré-S1 (5 μg) ou avec des particules HBV (10 μg/ml) purifiées à partir de sérum humain. La quantité d'anticorps monoclonal lié à la phase solide a été déterminée comme il a été décrit ci-dessus.
4) Test de RIA à double spécificité d'anticorps polyclonal-monoclonal (test PAS-RIA).
Ce test RIA a été réalisé afin de déterminer la présence de séquences pré-S1 dans les particules HBV purifiées à partir de sérum HBsAg positif de porteurs chroniques d'HBsAg par la procédure précédemment décrite dans PETIT et al (1985).
Cette technique a également été utilisée pour la quantification d'épitopes pré-S1 en relation avec l'activité HBsAg.
Des billes de polystyrène ont été enduites avec des IgG polyclonaux de lapin dirigés contre HBsAg (PETIT et al (1986)) à une concentration de 20 μg/ml, et ont été alors incubées avec une série de préparations virales diluées de 10 en 10 (10 μg à 1 ng/ml).
Après incubation pendant une nuit à température ambiante, les billes ont été lavées avec de l'eau distillée et incubées pendant quatre heures à 37ºC avec une dilution au 1:2 de la culture d'hybridomes.
La liaison de l'anticorps monoclonal F 35.25 spécifique de pré-S1 a alors été détectée par incubation (1 heure à 37ºC) avec le fragment F(ab')2 marqué à l'aide de l'iode I125 d'anti-immunoglobulines de souris. Le diluant utilisé était constitué de 5 % de
sérum albumine de boeuf et de 50 % de sérum normal de lapin dans un tampon TN. Enfin, les billes ont été lavées et leur radioactivité a été déterminée. Les résultats sont exprimés en cpm (coups par minute) d'anticorps marqué à l'iode I125.
Dans les étapes finales de la purification de l'HBV, les aliquotes de chaque fraction de gradient entre 10 et 60 % de saccharose ont été sélectionnés par cette technique. Après quoi, les préparations virales ont été calibrées pour leur séquence pré-S1 avec l'anticorps F 35.25.
L'anticorps MA18/7 spécifique de la région de pré-S1 (HEERMANN et al (1984)), et les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes spécifiques des régions S et pré-S2 (PETIT et al (1987)) ont été utilisés en parallèle afin de déterminer des relations quantitatives entre les trois régions antigéniques de la protéine env.
II RESULTATS
1) Spécificité fine pré-S1 de l'anticorps monoclonal F 35.25.
Un test d'immunodiffusion contre une gamme d'antisérum mono spécifique a permis de déterminer que l'ACM F 35.25 appartient à la classe d'anticorps IgGl.
La spécificité polypeptidique de l'anticorps monoclonal F 35.25 a été déterminée par sa réactivité vis-à-vis des trois composants d'enveloppe des particules virales purifiées à partir de plasma d'un porteur chronique d'HBV (sous type ad).
Deux préparations obtenues à partir de l'étape finale de centrifugation dans un gradient de saccharose
ont été sélectionnées : A, particule sphérique de HBsAg 22-ira présentant une réactivité pré-S2, mais ne présentant pas d'épitopes pré-S1 détectable (30 % de saccharose, figure 2a), et B, particules d'HBV 42-nm positives en ce qui concerne l'activité DNA polymérase et l'ADN d'HBV, présentant une quantité importante (> 1 ng/ml) d'épitopes pré-S2 et pré-S1 (40 % de saccharose, figure 2a). Comme il est illustré dans la figure 2b, ligne B, l'ACM F 35.25 se lie seulement aux protéines pré-S1, P39 et GP42, dans les parties d'HBV purifiées. CP42 a été plus intensément révélé que P39. De plus, F 35.25 réagit également avec un composant de 66000 ; par contre, aucune réactivité n'a été observée entre l'ACM F35.25 et toutes les protéines provenant de particules défectives d'HBsAg et pré-S2 positives (figure 2b, ligne A), ainsi qu'avec la sérum albumine humaine (HSA) ou avec du sérum humain normal (NHS) sans marqueur viral (figure 2b, lignes C et D respectivement). Les antigènes de contrôle ont été testés en parallèle à une concentration similaire à celle des protéines HBV (environ 200 μg/ml). Ces résultats suggèrent que l'anticorps F 35.25 est spécifique pour la région pré- S1 de la protéine env d'HBV (l'expression protéine env est également utilisé pour désigner les protéines S d'une manière générale). De plus, sa réactivité avec la très grande protéine HBV(VL-) de 66000 confirme la présence d'épitopes (s) spécifique (s) de pré-S1 sur ce composant VL HBsAg d'HBV (PETIT et al (1987)), qui est distinct de la protéine HSA présent dans NHS.
La localisation précise de l'épitope reconnu par F 35.25 a été été étudiée par un test RIA impliquant
des peptides synthétiques spécifiques de pré-S1 au niveau de la phase solide. Des peptides correspondant à la région pré-S1 de la protéine env d'HBV sous type adw2 ont été sélectionnés, synthétisés et purifiés comme il l'a été décrit précédemment (NEURATH et al (1986)). Des analogues synthétiques de séquences pré- S(1-21), (12-32), (32-53), (53-73) et (94-11) ont été utilisées (voir figure 3) dans un test RIA à double anticorps. Comme il est indiqué dans la figure 4a, seulement le peptide pré-S (32-53) a été reconnu de manière efficace par F35.25 (P/N ≥ 70). Une faible réaction a également été observée avec le peptide synthétique pré-S (94-117).
On peut remarquer que ces deux peptides possèdent une région N-terminale commune : proline (positions 32 et 94) et alanine (positions 33 et 95) (voire figure 3). Le double RIA impliquant l'utilisation de puit enduit avec des particules HBsAg recombinant à partir de cellules CHO (MICHEL et al (1981)), avec des particules d'HBV purifiées à partir de sérum (sous type ad) ainsi qu'avec HSA, pBSA et pHSA, a également été développé et révèle une liaison significative de F 35.25 seulement aux virions complets (P/N = 13, figure 4b). Ceci démontre la stricte spécificité HBV de l'ACM F 35.25 dirigé contre la séquence pré-S1(32-53).
Les résultats de la liaison compétitive utilisant 20 μg/ml des antigènes suivants : peptide pré-S (32-53) et des particules d'HBV purifiées en tant qu'antigène pré-S1 natif, ont démontré : (i) que la région pré- S(32-53) contient l'épitope F 35.25, (ii) qu'un tel épitope est exprimé à la surface des virions. En effet,
la réaction de F 35.25 avec l'antigène natif F (HBV) est complètement inhibée par pré-S(32-53), mais pas par une autre séquence pré-S (1-21) (figure 5b). Réciproquement, les particules d'HBV utilisées en tant qu'inhibiteurs présentent également un puissant effet de suppression (> 70 %) de la liaison de F 35.25 à la séquence de pré-S(32-53) (figure 5a).
Afin de déterminer la sensibilité de F 35.25 pour détecter la séquence pré-S1, ce dernier anticorps se liant soit au peptide pré-S (32-53) ou au virus à l'état natif, des quantités décroissantes d'IgG purifiées spécifiques de souris (1 ng à 0,1 pg/ml) ont été utilisées dans la phase liquide du double RIA (figure 6). La limite de détection de HBV ainsi que celle de l'antigène peptidique a été trouvé comme étant du domaine du pg d'IgGl monoclonal, montrant que F 35.25 possède une affinité de liaison très forte. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'anticorps monoclonal purifié à partir de liquide d'ascites..
Enfin, ie manière à déterminer la topographie de l'épitope pre-S1 reconnu par F 35.25 dans la protéine env d'HBV, la réactivité de F 35.25 a été étudiée par immunotransfert après digestion protéolytique limitée des particules purifiées d'HBV (sous type ad). Le traitement par la trypsine ou la protéase V8 de l'antigène a été réalisé dans des conditions bien définies de temps d'incubation, de tampon, de pH et de rapport enzyme-substrat : 3 heures à 37ºc dans du bicarbonate d'ammonium 0,1 M, pH 7,8 à une concentration finale de 20 μg/ml d'enzymes pour 1 mg/ml d'antigènes, ces conditions étant différentes des
conditions utilisées dans les expériences précédemment citées (HEERMAN et al (1984); PETIT et al (1987)). Ainsi, les résultats du clivage protéolytique révèle des peptides qui réagissent avec F 35.25 (figure 7). Il est intéressant de noter que deux bandes protéiniques correspondant à des poids moléculaires de 13500 et 14500, résultant du clivage par la trypsine (figure 7), et réagissent fortement avec F 35.25, mais pas avec l'anticorps monoclonal F 376 spécifique de la région pré-S2 (figure 7; ligne 5), ni avec l'anticorps monoclonal 6-16A15 spécifique de la région S (COURROUCE et al (1983)) (figure 7, ligne 8). Ces produits tryptiques sont probablement générés à partir de P39 et GP42 par clivage de la séquence pré-S1 au niveau des résidus arginine en position 99 et/ou 103, et en position 113 (voir figure 3). Ainsi l'épitope reconnue par F 35.25 est localisé sur la séquence pré-S1 entre pré-S (33) au niveau N-terminal et pré-S (53) -pré-S (99) au niveau C-terminal. De plus, la sensibilité du domaine pré-S2 pour la digestion par la trypsine a été confirmée (STIBBE et GERLICH, (1983) Develop. Biol. Standard, 54, 33-43 ; HEERMANN et al (1984) ; PETIT et al (1987)) (figure 7, ligne 5 et figure 7, ligne 8). Après traitement par la protéase V8 de la protéine HBV, F 35.25 se lie à un fragment de poids moléculaire 16500 (figure 7, ligne 3) qui a été très probablement produit par clivage au niveau de l'acide glutamique en position 2 (GLU-176) du produit du gène S (HEERMANN et al, (1984)). La protéase V8 génère également deux fragments dont les poids moléculaires sont de 15000 et de 29000 réagissant avec F 35.25. Ceci suggère : (i) un
autre clivage possible par la protéase dans le domaine pré-S2, donnant lieu à un fragment plus petit contenant les séquences pré-S1, et (ii) un clivage au niveau du résidu GLU-338 dans la séquence du gène S.
Ce dernier site semble effectivement accessible dans la structure secondaire prédite de la protéine env d'HBV (NEURATH et al (1987) Microbiol. Sci., 4, 45-51). Finalement, la figure 7, ligne 6 et la figure 7, ligne 9 illustrent la relative résistance des protéines pré-S2 (GP33 et GP36) à la digestion par la protéase V8.
2) Détection de l'épitope F 35.25 dans les particules d'HBV à partir de sérum humain
Dans l'étape finale de fractionnement dans le gradient de saccharose (ou sucrose), les particules d'HBV caractérisées par la présence d'ADN d'HBV et de la protéine majeure du core, P22c, (détectée par hybridation ou Western Blot respectivement) ont été trouvées dans les fractions 6-8 à 40-50 % de saccharose (figure 8). Ces fractions HbsAg positives ont été étudiées pour ce qui concerne la présence de l'épitope spécifique de pré-S1 reconnue par F 35.25.
Le test DAS-RIA décrit précédemment dans le chapitre MATERIELS ET METHODES, a permis de détecter l'épitope F 35.25 chez les virions complets (figure 8, fractions 6-8, 40-50 % de saccharose). La quantité de séquences pré-S1 en relation avec l'activité HBsAg a été déterminée comme étant de l'ordre de 50 %.
II y a par conséquent une proche corrélation entre la présence de l'épitope reconnu par F35.25 et la
présence de l'ADN d'HBV et de la protéine P22c dans les virions complets.
Les tests DAS-RIA ont aussi été appliqués afin d'évaluer la quantité des séquences pré-S1 dans 7 préparations d'HBV purifiés (sous type ad ou ay). Les particules d'HBV utilisées pour l'immunisation étaient des HBsAg sous type ad. L'ACM F 35.25 a réagit de façon significative avec l'HBV ad et l'HBV ay liés aux grains enduits d'anti-HBs polyclonaux (figure 9). Cependant, l'ACM F35.25 semble reconnaître de façon préférée les séquences pré-S1 d'HBV sous type ad. La proportion des séquences pré-S1 en relation avec HBsAg a été déterminée comme étant de l'ordre de 50 % seulement dans les préparations d'HBV de sous type ad, et seulement de 10 à 20 % dans les préparations HBV de sous type ay. Cette différence peut être imputée à la spécificité ad relative de l'ACM F 35.25.
Par contre l'ACM MA18/7 obtenu par imunisation avec des particules HBV de sous-type ayw, réagit aussi bien avec les particules de sous-type adw que celles de sous-type ayw. L'unique acide aminé, compris à l'intérieur de la séquence pré-S1(32-38), et qui diffère suivant les sous-type ad et ay, est situé en position 35 ; cet acide aminé en position 35 correspond à la glycine dans le sous-type ad, et à l'arginine dans le sous-type ay. La substitution de la glycine en position 35 par l'arginine crée un site additionnel de clivage par la trypsine à l'intérieur de la séquence pré-S (21-47) impliquée dans la liaison aux récepteurs des hépatocytes. Par conséquent, la spécificité de sous-type relative de l'ACM F35.25 pourrait être
attribuée à une perte de l'extrémité N-terminale de la séquence pré-S1 de l'HBV de sous-type ay sous l'effet d'une enzyme de type de la tryspine. Ceci pourrait expliquer la plus grande instabilité des particules de sôus-type ay (teilles que RE, BAY, PEI.) que celles de sous-type ad (telles que LIS/88 et LAM.).
Ainsi l'ACM F35.25 constitue un bon marqueur du caractère infectieux de l'HBV puisqu'il est capable de former un complexe immunologique, détetable in vitro, avec l'épitope pré-S (32-53) comprenant la glycine (35) impliquée dans le mécanisme de fixation de sous-type ad sur les hépatocytes.
L'ACM MA18/7 ne reconnaît pas la région comprenant la glycine en position 35, puisqu'il est spécifique de la séquence pré-S (38-121), et n'est donc pas un aussi bon marqueur d'infectiosité des HBV circulants que ne l'est l'ACM F35.25.
La mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, de détection in vitro de la proportion de la grande protéine S par rapport aux protéines S moyennes et majeures à partir de sérums d'individus atteints d'hépatite B chronique, a donné les résultats suivants: 1) Chez un groupe d'individus porteurs chroniques symptomatiques, chez lesquels on peut détecter un réplication virale active (correspondant à la présence dans le sérum de ces individus d'ADN-polymérase, d'ADN d'HBV, et d'HBe qui est un antigène de la nucléocapside), il a été détecté par la méthode de l'invention que
- Chez 36 % des individus de ce groupe, la quantité de grande protéine S est supérieure à celle de
la protéine S moyenne, ces deux protéines S représentant respectivement environ 35 à 40 %, et 20 % des protéines S contenues dans les sérums desdits individus.
- Chez 45 % des individus de ce groupe, la quantité de grande protéine S est inférieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines S représentant respectivement 25 % et 50 % des protéines S présentes dans les sérums desdits individus.
- Chez 18 % des individus de ce groupe la quantité de grande protéine S est à peu près identique à celle de protéine S moyenne, et représente pour ces deux protéines environ 25 % de la quantité de protéine S présente dans les sérum desdits individus.
Parmi ce groupe d'individus, deux cas ont évolué vers la guérison. Il s'agit d'une part d'un individu ayant développé des anticorps anti-HBe, et d'autre part d'un individu ayant subi un traitement par l'interféron et chez lesquels on ne détecte plus, à l'aide de l'ACM F35 de grande protéine S, la quantité des protéines S à diminué de 60 %, et la quantité de protéine S moyenne détectée représente environ 55 % des protéines S présentes dans les sérums de ces deux individus.
2) Etude réalisée sur un groupe d'individus (désignés ci-après groupe II) porteurs symptomatiques chez lesquels la réplication virale (ADN d'HBV) détectable ou non dans le sérum et possédant des anticorps anti- HBe :
- chez 80 % de ces individus, la quantité de grande protéine S est nettement inférieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines représentant
respectivement 15 % et 40 % des protéines S contenues dans le sérum desdits individus,
- chez 20 % de ces individus, on ne détecte plus de grande protéine S, et la protéine S moyenne détectée représente environ 35 % des protéines S contenues dans le sérum de ces individus.
Il faut noter que dans ce même groupe d'individus, la technique d'amplification d'ADN (technique PCR) conduit à la détection chez 80 % d'entre eux d'ADN d'HBV (correspondant à une réplication virale à bas bruit), tandis que chez 20 % d'entre eux, on ne détecte plus d'ADN de l'HBV. Il semble donc exister une bonne corrélation des résultats obtenus entre ces deux méthodes, celle de l'invention étant plus avantageuse que celle d'amplification de l'ADN, compte tenu de la complexité de de mise en oeuvre de cette dernière.
3) Etude menée sur un groupe d' individus porteurs asymtornatiques (ou encore porteurs "sains") chez lesquels la réplication virale est nulle, et qui sont porteurs d'anticorps anti-HBe :
- chez 25 % des individus de ce groupe, aucune protéine S n'a été détectée,
- chez 18 % des individus de ce groupe, ne sont détectées que des protéines S majeures,
- chez 46 % des indvidus de ce groupe, on ne détecte pas de grande protéine S, et la quantité de protéine S moyenne détectée représente environ 50 % des protéines S présentes dans les sérums de ces individus.
Une étude plus détaillée de la signification clinique de l'expression des antigènes pré-S (c'est-à- dire des grandes protéines S, ou encore designées par
pré-S1Ag, et des protéines moyennes, ou encore désignés par pré-S2Ag) dans les sérums de porteurs chroniques d'HBsAg a été réalisée suivants des techniques radio- imunologiques (RIA) utilisant :
1º) des anticorps polyclonaux anti-HBs sur une phase solide utilisée pour capturer les particules d'HBsAg d'HBV par l'intermédiaire du composant majeur de l'enveloppe de l'HBV,
2 º ) des anticorps monoclonaux afin de détecter sélectivement soit l'activité HBsAg ou les épitopes associés pré-S2 ou pré-S1,
3º) des fragments F(ab') d'anti-immunoglobulines de souris marquées à I125.
a) MATERIELS ET METHODES
- patients et sérums
Un groupe de 39 porteurs chroniques d'HBsAg a été sélectionné sur la base d'un screening sérologique de routine utilisant le test RIA commercialisé par les laboratoires ABBOTT (CHICAGO, IL). Tous ces patients ne possèdent pas d'anticorps contre le virus de l'hépatite Δ. HBeAg et les anticorps anti-HBe ont été déterminés avec des kits RIA disponibles commercialement (Laboratoires ABBOTT). L'ADN d'HBV dans les sérums a été mesuré par la technique d'hybridation décrite dans SCOTTO J. et al, Hepatology (1983) ; 3:279-284. Cette méthode permet de détecter 0,1 pg d'ADN d'HBV. Des biopsies de foies frais congelés provenant de certains patients ont été étudiées par immunofluorescence (IF) pour la détection d'HBcAg. La méthode IF utilisée a été décrite en détail dans TREPO C. et al, Gastroenterology, (1976) ; 71 : 804-808. Le diagnostic
a été établi par les études cliniques, sérologiques et histologiques (CAH correspond à l'hépatite active chronique ; CPH correspond à l'hépatite chronique persistante et cirrhose).
Les 39 cas ont été divisés en trois groupes suivant les mêmes critères que ceux utilisés pour distinguer les trois groupes de l'expérience précédente:
1º) Le groupe I est constitué de 11 patients (28,2 %) présentant de l'HBeAg (ou encore HBe positifs) et de l'ADN d'HBV dans leur sérum.
2º) Le groupe II est constitué de 8 patients (20,5 %) possédant des anticorps anti-HBe (ou encore anti-HBe positifs) et une activité pathologique persistante au niveau du foie et chez lesquels de l'ADN d'HBV peut être détecté ou non.
3º) Le groupe III est constitué de 20 patients (51,3 %) qui sont des porteurs d'HBsAg, dont les tests du fonctionnement du foie sont normaux, présentant des anticorps anti-HBe mais chez lesquels la réplication d'HBV dans le sérum n'est pas détectable.
Des sérums humains normaux ne contenant pas d'HBV ont été utilisés comme contrôles négatifs.
8 patients ayant développé des anticorps anti-HBs après une infection aiguë par HBV ont également été testés en parallèle.
- Détection de HBsAg et des antigènes pré-S dans le sérum par RIA polyclonal-monoclonal (Pab-Mab)
Un test RIA a été développé pour la quantification précise des épitopes pré-S1 et pré-S2 associés à l'activité HBsAg dans le sérum. Des billes
de polystyrène (NORTHUMBRIA BIOLOGICALS, Northumbria; U.K.) ont été enduites avec des immunoglobulines polyclonales de lapin dirigées contre l'HBsAg sérique (PETIT et al , (1986)) à une concentration de 10 μg/ml, et' saturées avec 5 % (en poids par volume) d'albumine de sérum de boeuf dans le tampon TN (Tris-HCl 0,01 M, NaCl 0,14 M, pH 7.2). Des séries de dilutions de 10-1 à 10-10 des échantillons de sérums humains ont alors été ajoutées aux billes enduites d'anticorps anti-HBs. Après incubation pendant une nuit à température ambiante, les billes ont été lavées avec de l'eau distillée, et incubées pendant 4 heures à 37ºC avec des anticorps monoclonaux. HBsAg a été déterminé en utilisant l'anticorps monoclonal F39.20 décrit ci- dessus, spécifique d'HBs (c'est-à-dire spécifiques de la protéine S majeure). Les antigènes pré-S ont été détectés en utilisant l'anticorps monoclonal F124 spécifique de pré-S2, décrit ci-dessus ou en utilisant l'anticorps monoclonal spécifique de pré-S1, à savoir l'anticorps monoclonal F35.25 dirigé contre le récepteur pour les hépatocytes d'HBV. F39.20 et F124 ont été utilisés en tant qu'immunoglobulines G partiellement purifiées à partir de fluides ascitiques à une concentration de 5 μg/ml. F35.25 a été utilisé à une dilution au demi du fluide de culture de l'hybridome. La liaison des anticorps monoclonaux spécifiques a été détectée par incubation (1 heure à 37ºC) avec les fragments F(ab')2 d'anti- immunoglobulines de souris marqués avec 125I (AMERSHAM FRANCE, Les Ulis). Le diluant utilisé ci-dessus consiste en 50 % de sérum de lapin normal, 5 %
d'albumine de sérum de boeuf dans le tampon TN. Les billes ont été lavées et la radioactivité mesurée dans un compteur gamma.
Les résultats sont exprimés en cpm (coups par minute) d'anticorps marqués à 125I liés. De manière à déterminer les rapports quantitatifs entre les trois spécificités antigéniques (S, pré-S2 et pré-S1) de l'enveloppe HBV dans le sérum, la détermination des titres a été réalisée et les rapports pré-S1Ag/HBsAg ainsi que pré-S2Ag/HBsAg ont été calculés pour une dilution 10-1 ou 10-2 du sérum.
b) RESULTATS
- Corrélation entre la détection des épitopes de F35.25 et la présence de virions complets dans les sérums.
Le sérum d'un porteur chronique d'HBsAg (sous-type ad) contenant de l'HBeAg et de l'ADN d'HBV, après une première centrifugation à faible vitesse (50.000 x g pendant 4 heures) a été soumis à une série d'étapes d'ultracentrifugation terminée par une centrifugation dans un gradient linéaire de saccharose de 10 à 60 % pendant 18 heures à 200,000 x g. Les fractions ont été récupérées et dosées avec l'anticorps monoclonal F39.20 spécifique d'HBs, et l'anticorps monoclonal F35.25 spécifique de pré-S1 en utilisant la technique RIA PAb-MAb décrite ci-dessus.
Les virions complets caractérisés par détection simultanée de l'ADN d'HBV et de la protéine majeure du core (noyau), P22c, par hybridation et technique d'immuno-empreinte respectivement, ont été trouvés dans les fractions 6-8 correspondant aux bandes de
centrifugation à 40-50 % de saccharose. Les résultats démontrent que la détection de l'épitope spécifique de pré-S1 par l'anticorps monoclonal F35.25 est associée étroitement à la présence d'HBV infectieux dans le sérum. Toutes les fractions correspondant à des concentrations plus faibles en saccharose (< 30 %) ne contiennent pas le récepteur hépatocytaire de pré-S1 d'HBV.
- Détection du récepteur hépatocytaire de pré-S1 (épitope F35.25) et de l'antigène pré-S2 (épitope F124) chez les porteurs chronique d'HBsAg : corrélation avec la présence d'ADN HBV dans le sérum, d'HBcAg dans le foie et du système HBe.
13 sur les 19 patients (soit 68.4 %) comportant des particules HBsAg (ou encore HBsAg positif) avec des pathologies chroniques du foie, sont porteurs d'ADN d'HBV (ou ADN-HBV positif) : ces 13 patients représentent tous les cas HBeAg du groupe I, mais seulement 2 sur les 8 cas anti-HBe du groupe II (tableau I). A l'intérieur du dernier groupe II, 6 (soit 75 %) comportent toutefois de l'HBeAg intrahépatique.
Sur les 19 patients présentant une pathologie chronique du foie, le récepteur hépatocytaire de pré-S1 d'HBV (épitope F35.25) a été détecté chez 17 de ces patients (soit 89.5 %) : ces épitopes F35.25 ont été détectés chez tous les patients HBeAg positif et chez 6 sur 8 (75 %) des cas anti-HBe positif. Seulement 2 (25 %) du groupe II sont négatifs en ce qui concerne l'antigène pré-S1. Il a été observé que un sur ces deux
patients est également négatif pour ce qui concerne l'HBeAg intrahépatique.
Par contre, le récepteur hépatocytaire de pré-S1 d'HBV n'a pas été détecté chez 18 sur les 20 (90 %) des porteurs sains d'HBsAg anti-HBe positif (groupe III).
L'antigène pré-S2 (épitope F124) a été détecté dans tous les échantillons de sérum ( 19 sur 19, 100 %) provenant de patients HBsAg positif présentant des pathologies chroniques du foie, (groupes I et II), e: chez 15 sur 20 (75 %) des porteurs d'HBsAg présentai des anticorps anti-HBe (groupe III) (tableau I).
Tous les patients (8 sur 8) qui ont fait une séro-conversion anti-HBs après avoir fait une hépatite B aiguë ont été trouvés comme étant négatifs pour les antigènes pré-S1 et pré-S2 ainsi que les sérums humains normaux ne contenant pas de marqueur HBV dans le sérum.
Comme il est indiqué dans le tableau I, sur les 19 patients positifs pour le récepteur hépatocytaire de pré-S1 d'HBV, 13 (soit 68.4 %) présentent de l'ADN d'HBV circulant dans le sérum, 17 présentent de l'HBeAg dans le foie, (soit 89.5 %), et 11 (soit 57.9 %) réagissent à l'HBeAg. Par conséquent, l'expression de l'antigène pré-S1 d'HBV dans les sérums des porteurs chroniques d'HBsAg peut être corrélée de façon significative (P < 0.001) avec les deux marqueurs les plus directs de la réplication d'HBV (l'ADN d'HBV dans le sérum et l'expression hépatocytaire d'HBcAg) aussi bien qu'avec le système HBeAg/anti-HBe. Par opposition, l'expression de l'antigène pré-S2Ag semble suivre la production continuelle des protéines HBsAg, et ne présente pas de corrélation significative ( P > 0.5)
avec l'ADN d'HBV, dans le sérum, HBcAg dans le foie et le système HBe.
Les résultats présentés sur la figure 10 montrent que les titres en HBsAg et en pré-S1Ag dans les cas HBeAg positif (figure 10A, 1:108 et 1:106 respectivement) sont plus forts que parmi les cas anti-HBe positifs (figure 10B, 1:104 et 1:102 respectivement). On peut remarquer qu'à l'intérieur du groupe I, 5 patients sur 11 (soit 45%) (figure 10A, sérum 7616) présentent un relativement faible titre d'antigène pré-S2 (1:104), tandis que 6 (55%) présentent de hauts titres en pré-S2Ag qui vont jusqu'à 1:108 (figure 10A, sérum 7936). Parmi les groupes II et III (figure 10B, sérum 7106 et figure 10C, sérum H535), les titres en HBsAg et pré-S2Ag sont de 1:104 et 1:103, respectivement. Ainsi, les titres en pré-S2Ag sont similaires aux titres en HBsAg chez 27 sur 34 patients (soit 79.4%) positifs en pré-S2Ag. A l'intérieur du groupe III, 5 sur 20 patients (soit 25%) réagissent pour HBsAg seul avec des titres allant jusqu'à 1:105 (figure 10C, sérum H305) . Seulement 2 patients sur 20 (soit 10%) sont positifs pour les deux antigènes pré- S2Ag et pré-S1Ag, mais les titres sont faibles avec un maximum de 1:102 (figure 10C, sérum H39), tandis que le titre en HBsAg est de 1:105.
- Importance clinigue de l'expression du récepteur hépatocytaire de pré-S1 durant l'infection chronique par HBV.
Dans la figure 11, sont représentés les rapports pré-S1Ag/HBsAg et pré-S2Ag/HBsAg calculés pour une dilution 10-1 du sérum (cf. figure 10) chez les trois groupes. Dans le groupe I, 5 patients sur 11 (soit 45%) présentent un rapport pré-S2Ag/HBsAg plus faible (35%) que les 6 patients restant qui présentent le même profil sérologique HBV comportant HBeAg et l'ADN d'HBV. A l'exception de ce sous-groupe, le rapport pré- S2/HBsAg a été détecté comme étant haut (60%) et ne diffère pas de façon significative chez 27 sur 34 (soit 79.4%) de patients pré-S2 positif appartenant aux groupes 1, 2 ou 3. Ce résultat suggère que le rapport pré-S2Ag/HBsAg ne peut pas être considéré comme un indicateur fiable du niveau de la réplication virale et par conséquent de l'infectivité relative durant l'infection chronique par HBV.
En revanche, les rapports pré-S1Ag/HBsAg sont plus hauts (environ 50%) chez les patients HBeAg positif du groupe I avec une réplication virale active que chez les patients anti-HBe positif du groupe II (soit 20%) présentant une activité pathologique au niveau du foie, mais ayant un faible niveau de réplication d'HBV dans le sérum. Ce rapport est négatif chez 13 sur 15 patients (soit 89%) des porteurs sains du groupe III, qui sont positifs pour HBsAg et pré-S2Ag mais qui ne présentent pas de réplication d'HBV ni de pathologie du foie. Ainsi le rapport pré-S1Ag/HBsAg semble être bien corrélable avec la réplication d'HBV.
De manière avantageuse la méthode de détection in vitro de l'invention permet la discrimination entre les différents groupes de porteurs chroniques de l'HBV et
la comparaison de l'expression de trois spécificités antigéniques (S, pré-S1 et pré-S2) avec la même sensibilité.
Les résultats décrits ci-dessus montrent que la 'détection de pré-S1Ag dans le sérum par le système RIA PAb-MAb sus-mentionné est corrélable avec la présence d'HBcAg dans le foie, même lorsque l'ADN d'HBV et l'ADN polymérase ne sont pas détectables dans le sérum. Par conséquent pré-S1Ag est un marqueur spécifique du niveau de réplication d'HBV pendant l'infection chronique par HBV.
La découverte de la présence de pré-S1Ag dans le sérum et d'HBcAg dans le foie de malades atteints d'hépatite chronique présentant des anticorps anti-HBe (groupe II) suggère que:
- la réplication virale se fait dans le tissu,
- les virions complets continuent à être libérés dans le sérum
- la quantité d'ADN d'HBV présent dans le sérum peut être trop faible pour être détectée par les technologies classiques d'hybridation.
Par ailleurs, les résultats décrits ci-dessus montrent que le pré-S2Ag est présent chez la plupart (87,2%) de porteurs symptomatiques et asymptomatiques chroniques d'HBsAg. Le rapport pré-S2Ag/HBsAg détecté chez les porteurs sains (groupe III) n'est pas significativement différent de celui des patients des groupes I et II, et reste élevé (jusqu'à 60%) dans les différents stades de l'infection chronique par HBV. Ceci suggère la synthèse continue de protéines pré-S2 même chez les porteurs sains d'HBsAg.
Les légendes des figures mentionnées dans la description détaillée qui précède sont les suivantes :
- figure 1 : représentation schématique de l'HBV ; structure, composants, et interaction(s) cellule-virus. R1 est le récepteur cellulaire impliqué dans la liaison directe de l'HBV par l'intermédiaire des séquences pré-S1 ; R2 est le récepteur cellulaire pour la p(HSA) probablement impliqué dans la liaison indirecte de l'HBV et d'HBsAg par l'intermédiaire des séquences pré-S2 portant le récepteur viral pour la glutaraldehyde-pHSA.
- figure 2 : figure 2a ; dosage radio-immunologique des séquences S, pré-S2 et pré-S1 dans les particules HBsAg (A) et dans les préparations d'HBV purifié à partir de sérum humain (B), et utilisées comme sondes antigéniques dans la figure 2b. Les billes enduites d'anticorps anti-HBs ont été mises en présence avec des concentrations décroissantes soit d'HBsAg soit d'HBV et l'antigène lié a été détecté en utilisant l'anticorps monoclonal F39.20 spécifique de la région S (•—• ) et l'anticorps monoclonal F124 spécifique de la région pré-S2 ( ▲____▲ ), et l'anticorps monoclonal MA18/7 spécifique de la région pré-S1 (■____■ ) (à une concentration finale de 5 μg/ml). Figure 2b ; spécificité polypeptidique de l'anticorps F35.25 par la technique des immuno-empreintes (Western blot). A, sérum HBs/pré-S2Ag ; B, sérum HBs/pré-S2/pré-S1Ag (HBV); C, HSA (200 μg/ml) ; D, NHS (dilué au 1:500). La liaison des anticorps monoclonaux dans la figure 2a comme dans la figure 2b a été déterminée avec des
anti-immunoglobulines de souris, le fragment F(ab')2 marqué à I125 (
106 cpm par bille ou par bande de gel).
- figure 3 : séquence en acides aminés (déduites à partie des séquences d'ADN de l'HBV) des régions pré- S (21-53), et pré-S (94-117) des grandes protéines de surface P39 et GP42, correspondant à 5 sous-types antigéniques d'HBV. La localisation de l'épitope reconnu par F35.25 est indiquée sur la figure . Les résidus d'acides aminés communs aux 5 sous-types sont indiqués par des petits ronds sous chacun de ces acides aminés. Le dipeptide encadré PA est celui probablement requis pour la liaison à l'anticorps F35.25 ; la séquence peptidique encadrée s 'étendant des acides aminés 40 à 47 (NPDWDFNP) , est conservée chez tous les sous-types HBV à l'intérieur du site de liaison de l'anticorps F35.25 ; T représente les sites de clivage par la trypsine accessibles dans les particules HBV complètes.
- figure 4 : dosage radio-immunologique (RIA) à double anticorps, réalisé avec un fluide d'hybridome dilué deux fois contenant F35.25 (
X 10 ng/ml). a, les peptides spécifiques de la région pré-S1 1-21, 12-32, 32-53, 53-73, 94-117 ont été utilisés pour enduire des billes. F35.25 lié aux billes enduites de peptide synthétique a été détecté avec une anti-immunoglobuline de souris marquée avec I125 comme il l'a été décrit dans la figure 2. Figure 4b, les particules HBsAg contenant les séquences pré-S2 obtenues par recombinaison dans des cellules recombinantes CHO, les particules d'HBV purifiées, HSA, pBSA et pHSA ont été utilisées pour enduire des billes dans les mêmes conditions que pour
la figure 4a. Chaque colonne représente deux déterminations.
- figure 5 : effet inhibiteur des peptides spécifiques de la région pré-S1 et des particules d'HBV purifiées (à une concentration finale de 20 μg/ml) sur la liaison de l'ACM F35.25 aux puits enduits avec soit pré- S (32-53) (figure 5a) ou avec HBV sous-type ad (figure 5b). Les conditions de cette expérience ont été décrites dans le chapitre MATERIELS ET METHODES en utilisant un fluide d'hybridome dilué deux fois comme dans la figure 4.
- figure 6 : sensibilité de l'ACM F35.25 pour détecter le peptide pré-S (32-53) et les séquences pré-S1 dans les particules d'HBV purifiées. Les puits enduits soit avec le peptide pré-S (32-53) ( ● ) (5 μg/ml) ou avec HBV sous-type ad ( ▲ ) (10 μg/ml) ont été mis en présence avec des concentrations décroissantes de F35.25 purifié à partir de surnageants de cellules d'hybridome.
- figure 7 : effet de la digestion par la trypsine ou la protéase V8 des particules HBV purifiées (sous-type ad) sur la liaison de l'ACM F35.25 (a), de l'anticorps monoclonal F376 spécifique de la région pré-S2 (b) et de l'anticorps 6-16 A15 spécifique de la région S (c) à la protéine env par technique d' immuno-empreinte. Le traitement de l'antigène a été réalisé comme il l'a été décrit dans le chapitre MATERIELS ET METHODES. Les lignes 1, 4, et 7 représentent des contrôles sans enzyme ; les lignes 2, 5 et 8 représentent les produits de la digestion par la trypsine ; les lignes 3, 6 et 9 représentent les produits de digestion par la protéase
V8. les lignes 1 à 3 ont été sondées avec le surnageant d'hybridome dilué au 1:2, et les lignes 4 à 9 ont été sondées avec 5 μg/ml d'anticorps monoclonal purifié à partir de liquide d ' ascites . L' anticorps se liant aux protéines transférées a été détecté avec l'anti- immunoglobuline de souris marquée avec I125. les poids moléculaires des peptides ( x 10 3) sont indiquées sur la gauche.
- figure 8 : gradient de sucrose des particules HBV (sous-type ad). 1 ml de matériel enrichi en virus a été sédimenté dans un gradient linéaire de sucrose de 10 à 60 % dans un tampon TN pendant 18 heures à 160000 g et 4 ºC. Les fractions ont été récupérées et analysées avec l'ACM F39.20 (
), ou l'ACM F35.25
(
) par dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps utilisant une phase solide portant des anticorps polyclonaux de lapin anti-HBs. La concentration de sucrose (-
) a été testée par refraction. Les fractions 6-8 (40-50 % de sucrose) ont été testées pour leur teneur en ADN d'HBV par hybridation, et pour leur teneur en protéine majeure du core P22c, par immunotransfert (+).
- figure 9 : détection de la séquence pré-S1 (32-53) dans les particules d'HBV isolées (sous-type ad ou av) en utilisant le système de dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps, avec des immunoglobulines anti-HBs sur la face solide et l'anticorps F35.25 sur la face de révélation. Les particules d'HBV purifiées ont été utilisées à une concentration d'I μg/ml. La liaison de F35.25 a été
détectée avec l'anti-immunoglobuline de souris marquée avec I125, fragment F(ab')2.
- figure 10 : analyse quantitative des antigènes HBsAg et pré-S chez différents groupes de porteurs chroniques d'HBsAg.
HBsAg (protéine S majeure) (-•--•-) ; récepteurs hépatocytaire pré-S1 (-♤-♤-) ; antigène pré-S2 (-o-o-). Les tests ont été réalisés selon la méthode radioimmunologique PAb-MAb décrite ci-dessus.
- figure 11 : signification clinique de l'expression du récepteur hépatocytaire pré-S1 chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Le rapport pré- SlAg/HBsAg (colonnes représentées en noir) et le rapport pré-S2Ag/HBsAg (colonnes représentées en gris) ont été calculés pour une dilution 10-2 du sérum (cf. figure 10B et 10C) ou 10-3 (cf. figure 10A).
Groupe I: patients HBeAg et ADN-HBV positifs présentant une pathologie chronique du foie. Groupe II: patients anti-HBe positifs présentant une pathologie chronique du foie. Groupe III: porteurs sains anti-HBe positifs.
Variations du rapport pré-S1Ag/HBsAg (___) et du rapport pré-S2Ag/HBsAg (---) en fonction des différnnts stades virologiques de l'hépatite B chronique.
Claims
1. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est défini par la combinaison des propriétés suivantes:
- il forme un complexe immunologique avec :
. un épitope compris entre les acides aminés situés aux positions 32 et 53 de la région pré-S1,
. la région pré-S1 de la grande protéine d'enveloppe de l'HBV,
. les grandes protéines d'enveloppe de l'HBV, P39 et GP42,
. chacun des produits de clivage de la région pré-S1 de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la trypsine, et dont les poids moléculaires sont de 13500 et 14500 respectivement,
- il ne forme pas de complexe immunologique avec :
. les glycoprotéines moyennes d'enveloppe de l'HBV, GP33 et GP36,
. les (glyco) protéines majeures d'enveloppe de l'HBV, P24 et GP27,
. la sérum albumine humaine (HSA),
. la sérum-albumine humaine polymérisee (pHSA), . les immunoglobulines G, A, M,
. les divers constituants des sérums d'individus non infectés par l'HBV.
2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est défini par les propriétés suivantes :
- il appartient à la classe de IgGl ;
- il forme un complexe immunologique avec :
. la très grande protéine d'enveloppe de l'HBV de 66 kd (kilodaltons),
. chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la protéase V8 de S . aureus, et dont les poids moléculaires sont de 15000, 16500, et 29000 respectivement.
3. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome qui a été déposé à la C.N.C.M. sous le numéro 1-796 le 5 août 1988.
4. Hybridome caractérisé en ce qu'il secrète l'anticorps monoclonal selon la revendication 1.
5. Méthode pour obtenir et isoler des hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'elle comprend :
- la fusion de cellules spléniques d'un animal immunisé à l'aide des particules d'HBV, avec des cellules myélomateuses dans des conditions permettant la formation d'hybridomes ;
- la détection et la récupération de ceux des hybridomes sus-mentionnés qui sécrètent des anticorps monoclonaux possédant les propriétés de celui selon la revendication 1.
6. Méthode de détection in vitro de la présence éventuelle de la grande protéine S d'enveloppe d'HBV dans un échantillon biologique prélevé chez un individu infecté par HBV caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pré-S1 de la grande protéine S et ledit anticorps monoclonal ;
- la détection du susdit complexe immunologique.
7. Méthode selon la revendication 5, caractérisée eh ce qu'elle comprend plus particulièrement les étapes suivantes :
- fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux, susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S d'enveloppe de l'HBV;
- rinçage du support afin d'éliminer ceux des susdits anticorps non fixés sur le support ;
- addition sur le support de l'échantillon biologique, notamment du sérum, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre les anticorps polyclonaux sus-mentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans ledit sérum ;
- rinçage du support afin d'éliminer les différents constituants dudit sérum non reconnus par les anticorps sus-mentionnés ;
- addition sur le support des anticorps monoclonaux selon la reendication 1, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre lesdits anticorps monoclonaux et celles des protéines S engagées dans le complexe immunologique précédent et comprenant la région pré-S1;
- rinçage du support afin d'éliminer ceux des anticorps monoclonaux non engagés dans une réaction immunologique avec ladite région pré-S1 des grandes protéines S ; - addition sur le support d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former un complexe immunologique avec les susdits anticorps monoclonaux dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique final formé entre lesdites anti-immunoglobulines et les anticorps monoclonaux engagés dans le complexe immunologique obtenu à l'étape précédente.
- détection de la quantité d' anti-immunoglobulines marquées engagées dans le complexe immunologique final sus-mentionné, cette quantité pouvant être corrélée à la quantité de grandes protéines S présente dans ledit sérum.
8. Méthode de détection in vitro de la proportion de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure présente dans un échantillon biologique prélevé chez un individu atteint d'hépatite B, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en oeuvre de la méthode décrite dans la revendication 7,
- la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de la revendication 7, d'une méthode comprenant les mêmes étapes que celles décrites dans cette dernière, et dans lesquelles, d'une part l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 est remplacé par un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, et, d'autre part, les anti-immunoglobulines reconnaissant l'ACM de la revendication 1 sont remplacées par des anti- immunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM reconnaissant la protéine S majeure sus-mentionné ;
- la comparaison des quantités de grande protéine S et de protéine S majeure ainsi mesurées.
9. Application du procédé selon la revendication 8 au diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique chez des individus infectés par l'HBV.
10. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'un méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu' il comprend :
- une quantité déterminée d'anticorps polyclonaux fixés sur un support solide et susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S,
- une quantité déterminée de l'anticorps monoclonal selon la revendication 1,
- éventuellement une quantité déterminée d'un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure d'enveloppe de l'HBV,
- avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les anticorps susmentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique,
- avantageusement des réactifs marqués, notamment des immunoglobulines marquées, permettant la détection des complexes immunologiques dans lesquels sont engagés les anticorps monoclonaux squs-mentionnés.
11. Composition pharmaceutique pour le traitement de l'hépatite B, et plus particulièrement pour la prévention des phénomènes réinfection du greffon lors de greffe du foie chez les individus atteints d'hépatite B, caractérisée eh ce qu'elle comprend l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 en association avec un véhicule phariαaceutiquement acceptable.
12. Anticorps monoclonal anti-idiotype caractérisé en ce qu'il forme un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal selon la revendication 1.
13. Procédé d'obtention de l'anticorps monoclonal anti-idiotype selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on immunise un animal à l'aide d'un anticorps monoclonal selon la revendication 1 et que l'on récupère ceux des anticorps susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal selon la revendication 1.
14. Composition pour la vaccination contre l'hépatite B, caractérisée par l'association de l'anticorps monoclonal anti-idiotype selon la revendication 12 avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
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