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WO1990009430A1 - Biophotoreacteur a materiel photosynthetique immobilise - Google Patents

Biophotoreacteur a materiel photosynthetique immobilise Download PDF

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WO1990009430A1
WO1990009430A1 PCT/FR1990/000116 FR9000116W WO9009430A1 WO 1990009430 A1 WO1990009430 A1 WO 1990009430A1 FR 9000116 W FR9000116 W FR 9000116W WO 9009430 A1 WO9009430 A1 WO 9009430A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biophotoreactor
membrane
tank
sheath
biocatalyst
Prior art date
Application number
PCT/FR1990/000116
Other languages
English (en)
Inventor
Guy-Alain Junter
Michel Charles Raoul Labbe
Laurent Mignot
Pierre Adrien Augustin Guerout
Fernand Mary Eugène PAPORE
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Publication of WO1990009430A1 publication Critical patent/WO1990009430A1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/02—Photobioreactors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M31/00—Means for providing, directing, scattering or concentrating light
    • C12M31/10—Means for providing, directing, scattering or concentrating light by light emitting elements located inside the reactor, e.g. LED or OLED

Definitions

  • the present invention relates to a biophotoreactor with immobilized photo-synthetic material.
  • biophotoreactor is used here to designate an apparatus in which a “biophotoreaction” is carried out, a term which designates all of the processes generated by the metabolic activity of a material.
  • Usable photosynthetic material includes microorganisms (bacteria, cyanobacteria and microalgae), plant cells and organelles
  • Photosynthetic bacteria are purple (Rhcdaspiri l acea and Chroma tiacea) or green bacteria
  • Chl orobi aceae and Chl orofl exaceae which are phot ot rophic microorganisms that do not produce oxygen.
  • Rhodospi ri l l aceae Rhodopseudo- menas capsul a ta, Rhodospi ri l l um rubrum
  • Microalgae are eukaryotic photosynthetic microorganisms, with the exception of blue algae or cyanobacteria, prokaryotic cells close to bacteria. In addition to their potential value as a source of protein when grown in large quantities, microalgae are capable of excreting a wide range of secondary metabolites, including organic acids, acids amines, peptides and poiysaccharides. They combine the biotechnological advantages of microbial cells
  • Certain immobilized micro-algae can be used in the production of hydrocarbons
  • Ckl orel l a Scenedesmus (copper extraction); Scenedesmus obliquas, Ankistrodermus braunii, Chl amydomonas reinhardi i i, Anacyst i s ni dul ans (elimination of nitrates and / or nitrites); still others exhibit bioconversion activity; Nocardia (steroid modification):
  • Rhodot ⁇ rul a hydrolysis of menthol esters
  • Chl orel l a Anabaena (biotransformation of amino acids into ⁇ -ketonic acids).
  • Plant cells have significant capacities for bioproduction, particularly interesting in the fine chemicals industries (perfumery, cosmetology, food flavors, pharmacy). Most of the potentially interesting metabolites accumulate in the vacuole, and their recovery is by extraction from biomass. In the present case where the cells are
  • occi dent al is
  • beta-methyldigoxine Digi tal is lanat a
  • chloroplasts cellular organelles ensuring photosynthesis in higher plants
  • bacterial chromatophores
  • fragments of the intracellular membrane of photosynthetic bacteria are the two photobiochemical systems suitable for immobilization. These systems cannot carry out syntheses or bioconversions by themselves, but one can exploit their capacity to fix the gas.
  • the present invention therefore applies to biophotoreactors in which the biocatalysts are immobilized in a support, which, in the case where the biocatalysts multiply, allows such growth to take place.
  • the present invention applies to biophotoreactors in which the biocatalysts
  • microorganisms are arranged in a phase delimited by a membrane whose porosity is just sufficient to retain the biocatalysts, but which is permeable to all substrates or products consumed or excreted during
  • the main objective of the present invention is to propose biophotoreactors using biocatalysts immobilized in gels, the arrangement of which is
  • the present invention therefore relates to a biophotoreactor for the exploitation of an activity
  • biophotoreactor comprises at least one cavity intended to receive a lighting element isolated from the content of said tank, said cavity being delimited laterally by a transparent wall zone, around which is disposed a biocatalytic layer or membrane constituted by gel containing the biocatalyst , and thus being able to be lit from the inside, means being provided to ensure the maintenance of the (or) membrane (s)
  • the layer or membrane is particularly preferred.
  • biocatalytic generally having a thickness of the order of a millimeter or a few millimeters, is confined between an internal transparent wall surrounding the lighting element, and an external support structure, porous or perforated.
  • This structure must meet the following criteria:
  • biocatalyst consists of enzymes, cellular organelles (chloroplasts), or whole cells which do not proliferate or have a very long generation time inside the gel ("non-viable" microorganisms, for example permeable example, cells
  • the supporting structure has essentially a mechanical function, namely that of retaining the gel against the internal wall. It can be constituted by any structure, for example a lattice with large meshes, but capable of maintaining the gel, depending on the consistency and the viscosity thereof. It is thus possible to use trellises having a mesh width of 3 to 10 mm. It is also possible to use, in addition to or in place of the lattice, a microporous membrane, for example to protect the cells from contamination. Such a membrane can be flexible, semi-rigid or rigid, and it can be organic or mineral.
  • an external wall is chosen which is constituted by a microporous membrane, the porosity of which corresponds to the definition given. in patent application No. 2 597 498.
  • a mesh as defined above, between the gel and the microporous membrane, when the latter is flexible or semi -rigid.
  • microporous membrane it is also possible, in all cases, to use a rigid membrane such as obtained by ion bombardment (heavy ions) of transparent or non-transparent polymeric sheets.
  • the gel containing the biocatalyst is advantageously formed in si t u by pouring between the internal transparent wall and a closed temporary external structure.
  • a wire mesh intended to constitute or form part of the final supporting structure can be applied internally against the closed temporary structure.
  • the cavity (ies) of said biophotoreactor are cylindrical, the (or) biocatalytic membrane (s) in the form of cylindrical crowns, in the same way as the perforated or porous bearing structures;
  • the biophotoreactor comprises several cavities, arranged so that their axes are parallel; the cavities are formed in the bottom wall and / or in the cover of the tank of the biophotoreactor; the latter may be equipped with a cylinder surrounding the biocatalyst layer or membrane, located at a distance from the support structure of said layer or membrane, and arranged to allow a tangential laminar circulation of the medium around the latter.
  • biophotoreactors of the invention include all the equipment necessary for carrying out the reaction: pH, temperature probes, safety valves, fluid inlets and outlets, if necessary, air and gas inlets carbon dioxide, environmental agitation devices, etc.
  • the lighting elements can be of all kinds; in particular, they can be means of lighting by optical fibers.
  • An example of a fiber optic lighting element is constituted by a bar, consisting of a sheath having a multiplicity of orifices in each of which is fixed the end of an optical fiber housed in said sheath and connected, by its other end to a light generator, light points or light zones thus being formed on the outer wall of the sheath, distributing the light towards the photoreaction medium contained in the tank of the biophotoreactor.
  • the biocatalytic membrane surrounds the light bar at a distance that is chosen to ensure a sufficient supply of light energy; a uniformity of lighting of the biocatalytic membrane is thus obtained, without “overheating points” leading to premature local aging of said membrane
  • the sheath preferably has a cylindrical shape, which ensures regularity of lighting at the periphery of each light bar.
  • the fibers are gathered in a sheath before entering the sheath; and the latter is closed by a base by which said bar is fixed to a part of the shell of the tank, for example on the bottom wall or on the cover of said tank, the lighting elements being advantageously removable and removable.
  • the orifices of a bar receiving the ends of the optical fibers are arranged in a regular manner, in particular in staggered rows, also ensuring uniformity of lighting.
  • the orifices of a bar receiving the ends of the optical fibers are arranged in a regular manner, in particular in staggered rows, also ensuring uniformity of lighting.
  • the ends of the optical fibers are each introduced into a nipple with a frustoconical outlet, housed in an orifice in the sheath, so as to constitute light cones. It is therefore advantageous for the light cones to overlap so as to provide the most homogeneous illumination possible of the entire internal surface of the biocatalytic membrane, with a view to exploiting the photosynthetic activity carried out under the best conditions.
  • Figure 1 is a partial schematic view, in longitudinal section, of a biocatalytic membrane and means for holding said membrane in a
  • FIG. 2 is a view, partially in elevation, partially in longitudinal axial section, of the lighting device for a biophotoreactor according to a first embodiment of the invention
  • Figures 3 and 4 are sectional views along
  • Figure 5 is an enlarged view of detail A of Figure 4.
  • FIG. 6 is a view in longitudinal axial section of a mechanical device used to manufacture a biocatalytic gel immobilizing microorganisms or cellular organelles;
  • Figure 7 is a top view of the device of Figure 6;
  • FIG. 8 is a view in longitudinal axial section of the biophotoreactor in the assembled state with the
  • Figure 10 is a schematic representation of the entire apparatus incorporating the
  • FIG. 11 represents curves obtained during the implementation of this photoproduction in
  • FIG. 12 is a schematic view from above of a biophotoreactor with biocatalytic phased elements in accordance with a second embodiment of
  • FIG. 13 is a schematic elevation view with a cutaway showing in axial longitudinal section, one of the biocatalytic elements of the reactor of FIG. 12.
  • 23 has designated a biocatalytic membrane constituted by a gel trapping cells or cellular organelles, and confined between a transparent wall 16 and a porous structure constituted by a lattice metal 17 applied against said membrane 23 and a microporous membrane 34.
  • the production and mounting of the membrane 23 in the tank of the biophotoreactor are described below.
  • FIGS. 8 and 9. constitutes an advantageous means for producing the lighting of the biophotoreactor; however, the invention is in no way limited to this particular mode of lighting.
  • the lighting device 1 uses a fiber optic system 2 (FIG. 5), making it possible to obtain a cold, explosion-proof light with adjustable intensity.
  • These fibers 2, individually sheathed, are grouped in a bundle in a stainless steel sheath, forming a flexible cable 3. At one of its ends (not limited to
  • the cable 3 is closed by a ferrule, also made of stainless steel, in which the corresponding ends of the optical fibers 2 are fixed and which can be adapted to a light generator as symbolized at 74 in FIG. 10.
  • the fibers 2 used in this example are FORT fibers type FEK 50, 0.1 mm in diameter.
  • the cable 3, the length of which is approximately 2.5 m, contains 360 optical fibers 2; and the light source is a 150-250 watt generator (halogen lamp), fitted with a filter
  • anti-caloric type KG1 from SCHOTT.
  • the fibers 2 are introduced axially into a cylindrical streamer 4 made of stainless steel, the cable 3 penetrating axially and ending in a base 5 in the form of disc, closing said sheath 4 at its lower part, the latter being arranged vertically, in its final mounting position in the biophotoreactor of FIG. 8.
  • the fibers 2 come out freely inside the sheath 4 and they are fixed individually to the wall thereof as described below.
  • the base 5 comprises a lower peripheral flange 6, comprising three holes 7 at 120 ° from one another, for attachment to the lower plate S of the biophotoreactor of FIG. 8.
  • the cylindrical sheath 4 is pierced substantially over its entire height, with the exclusion of its upper and lower edge zones, orifices 9 of small diameter, these orifices 9 being arranged in radial planes being equidistant from each other. of the others, so as to obtain a regular staggered overall distribution.
  • the sheath 4 has a height of 20cm and a diameter of 10cm, and it has 360 orifices 9 with a diameter of Imm, at the rate of 18 orifices offset radially by 20o on a circumference, a radial offset of 10o existing between two successive circumferences, which is illustrated by Figures 3 and 4.
  • Each of the optical fibers 2, which freely penetrates into the sheath 4, is inserted, by its free end, into the axial channel 10a.
  • a cylindrical fixing stud 10 made of plastic, forced into an orifice 9 inside the sheath 4.
  • Each stud 10 has, at one of its ends, a flange 10b. by which it abuts against the internal wall of the sleeve 4 ( Figure 5); in the mounting position, each stud 10 is flush with its end opposite the flange 10b, the external surface of the sleeve 4, but the axial channel 10a.
  • a device 11 consisting of a metal plate 12 in the form of a disc, with a diameter of 160mm in the example shown.
  • the plate 12 is surmounted by an axial rod 13 carrying a thread 14 in its end region, and it comprises, on its face carrying the rod 13, an annular peripheral groove 15, of U-section.
  • a wire mesh 17, with large meshes, of cylindrical shape and having an internal diameter equal to or slightly greater than the external diameter of the plate 12, is arranged coaxially with the glass cylinder. 16, by being fitted around said plate 12, by its annular base 17a. connected to the body of the trellis 17 by a slight
  • wire mesh 17 is externally covered with aluminum foil 18, which is pressed onto said mesh 17 by two rubber bands 19a, 19b. arranged, one immediately above
  • This device 11 for pouring the gel is completed by a metal plate 22 (made of steel for example), having the shape of an elongated strip, of length slightly greater than the diameter of the cylindrical device which has just been described, and having a central opening 22a. slightly larger in diameter than the rod 13.
  • This plate 22 is applied diametrically to the aforementioned cylindrical device, the rod 13 passing through the central opening 22a. and projecting, through its threaded end 14, from said plate 22.
  • a clamping screw 22b. maintains the latter under slight pressure so as to ensure
  • the tightness of the device 11 is sterilized by autoclaving, then placed in a sterile enclosure, thermostated at 40oC.
  • the agar suspension is poured manually into the space 21 of the device 11; the temperature of the thermostated enclosure is lowered to 30oC; gelling takes place in approximately 15 minutes, and in space 21, the biocatalytic membrane 23 is obtained, which has a thickness of approximately 3 mm.
  • the aluminum sheet 18 is removed; the biocatalytic membrane 23 thus formed and its support (namely the device 11 from which the sheet 13 has been removed and the strips 19a., 19b.) are then placed in a sterile container containing 5 liters of a nutritive medium adequate (Columbia broth mixture - Ormerod medium) and exposed to light (20 klx) for 43 hours. During the incubation, the nutritive medium is agitated by a strong current of argon, which also makes it possible to maintain
  • FIGS. 8 and 9 We will now refer to FIGS. 8 and 9 to describe a biophotoreactor 24 with microorganisms.
  • the biophotoreactor 24 is delimited by a lower plate 3 (already indicated with reference to FIG. 2), an upper plate 25, both in the form of a disc, and by a cylindrical lateral envelope 26, which is made of glass or any other material suitable, for example stainless steel. The latter is, in the mounting position, introduced by its edges respectively
  • the lower plate 8 has a central opening 30 delimited by a cylindrical wall in which is made a recess 31 intended to serve as a stop for the flange 6 of the lighting device 1, fixed on the plate 8 as described above.
  • the plate 8 has internally two concentric annular grooves 32 and 33, the groove internal 32, lined with a flat joint (not shown), located at a certain distance from the opening 30, receiving the aforementioned glass cylinder 16, and the external groove 33, deeper than the groove 32, receiving the trellis 17 by its base 17a., the biocatalytic membrane 23 of gel + immobilized microorganisms being trapped between the cylinder 16 and the lattice 17.
  • a microporous membrane 34 (Millipore membrane, Durapore type
  • hydrophilic with a porosity of 0.45 ⁇ m
  • the membrane 34 constitutes a microporous filter ensuring confinement, in the gel of the membrane 23, these
  • an internal cover 36 in the form of a disc, which comprises, in the same way as the plate 8, two concentric grooves respectively 37 and 38 receiving the upper edges respectively of the cylinder 16 and the trellis 17, which is. reinforced in this part.
  • the cover 36 protrudes, over its entire periphery, from the cylinder 15 and the elements which it carries, holes 39, four in number (FIG. 9), arranged 90 ° apart, crossing this peripheral zone of the cover 36.
  • the holes 39 are crossed by studs 40, the lower point of which is screwed into threaded housings 41 provided for this purpose in the lower plate S.
  • nuts 42 are screwed on.
  • the biophotoreactor 24 also contains a removable intermediate cylinder 44, coaxial with and external to the cylinder 15, said cylinder 44 resting, by its lower edge, in an annular groove 45 also formed in the lower plate 8.
  • the tank 29 being intended to receive nutrient medium, this cylinder 44 is intended to ensure a tangential laminar circulation of said medium around the membrane 34, in the zone in the form of a cylindrical crown 46 located between said cylinder 44 and said membrane 34.
  • FIG. 8 partially represented the stud 40 on the right, to illustrate by arrows, the circulation of the nutrient medium.
  • the level of the liquid in the tank 29 is maintained at the height h (FIG. 3), that is to say, slightly below the upper edge of the cylinder 44.
  • the biophotoreactor 24 is also equipped, at the top, with a safety valve 49, a pH probe 50, and a plug 50a for introduction of fluids, sampling, etc., and, at the bottom, a temperature probe 51 and a heating resistor 52.
  • the biophotoreactor 24 is placed on a base 53, partially shown in FIG. 8.
  • biophotoreactor a traditional stirring device with blades or "air lift".
  • the mounting of the biophotoreactor 24 is carried out as follows:
  • the biocatalytic structure (cylinder 16 - membrane 23 - lattice 17) is released from. casting system of FIGS. 6 and 7, then hermetically fixed on the lower plate S of the biophotoreactor 24.
  • the membrane 34 previously prepared (cut to the desired dimensions:
  • a hydraulic assembly which includes four tanks 54, 55, 56, 57, with a capacity of 5 liters each, a circulation pump 58 at high flow (600 liters / hour) and variable speed (from 0, 1 to 99% maximum flow), and a control panel 59 supporting seven valves (54a,
  • thermoregulation system formed by the temperature probe 51 and the heating resistor 52, connected to a regulation box 64, with which can be associated a cooling coil (not shown) placed in the biophotoreactor 24: - a pH meter 65 connected to a glass electrode 65;
  • a gas flow measurement system and gas analysis constituted as follows: the gas produced in the photoreactor 24 is evacuated at the top by means of three Teflon tubes
  • a condenser 70 where it loses the water vapor it contains
  • a mass flow meter 71 calibrated for hydrogen, translates the gas flow (d) into an electrical signal, which is recorded over time (t) by the recorder 72; the gas is then analyzed in GPC in 73, then evacuated.
  • the reservoirs 54 and 55 containing nutritive medium, sterilized by autoclaving, are connected to the valves respectively 54a., 55a.
  • the connections are made at the inputs 47 and outlets 48 for the liquid.
  • the lighting device 1 connected to the
  • valves 54a., 55a. are closed.
  • the valves 60 and 61 are opened; under the action of pump 58, the medium circulates in direction (1) at medium speed (in closed circuit).
  • the bioreactor 24 is then deoxygenated by bubbling argon at 75 for 1 hour.
  • the installation is then ready to operate; degassing is stopped, the liquid is still flowing in direction (1) at medium speed, the light generator 74 operates at its maximum intensity (15 klx).
  • the nutrient medium supplied to microorganisms immobilized is a phosphate buffer containing malate (source of C) and or glutamate (source of N), the exact composition of which is as follows (after Hirayama et al, Agric. Biol. Chem. 1986, 50 .: 891-897):
  • the curve (1) of FIG. 11 represents the evolution of the volume of gas produced in the photoreactor 24.
  • This gas is a mixture of H 2 , CO 2 and Ar, in which the proportion of pure H 2 varies during the incubation time ( Figure 11, box).
  • the decontaminant is stored in the reservoir 56 ( Figure 10). After fixing the biocatalytic structure, it is introduced using the pump 53 into the bioreactor where it remains for about 1 minute. The system is then drained, then rinsed with sterile distilled water contained in the tank 57. If we now refer to FIGS. 12 and 13, we see that a large capacity biophotoreactor has been designated by 124.
  • the biophotoreactor 124 comprises a base 108, a cylindrical side wall 126,
  • the lighting devices 101 are arranged, with their sheaths 103 each guiding a bundle of optical fibers.
  • the biophotoreactor 124 includes stirring devices 176 regularly distributed between the
  • these agitation devices being chosen to be the best suited for the distribution of said structures inside the tank 129 and for the photosynthetic activity used: pulsed gas system (for example, air + CO 2 ) in the case of a metabolism without recovery of biogas, ensuring both agitation and supply of the medium with substrate (example: CO 2 ), and the evacuation of gases and / or calories possibly produced; agitation by blades, propellers or turbines (of which there are multiple configurations making it possible to direct the fluxes of nutritive medium), by circulation of medium, in anaerobic and in some cases aerobic.
  • pulsed gas system for example, air + CO 2
  • substrate example: CO 2
  • agitation by blades, propellers or turbines of which there are multiple configurations making it possible to direct the fluxes of nutritive medium
  • the biophotoreactor 124 includes all the necessary equipment: safety valve 149; pH 150 probes; temperature probes (platinum) 151; and heating resistors 152.
  • the sterilization process for reactor 124 and its cylindrical elements (before placing the gel) is chosen from the conventional techniques well known for industrial biophotoreactors: steam, ethylene oxide, before pouring the biocatalytic gel in situ.

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Abstract

Ce biophotoréacteur (24) pour l'exploitation d'une activité photosynthétique utilisant un biocatalyseur immobilisé dans un gel est caractérisé par le fait que sa cuve (29) comporte au moins une cavité destinée à recevoir un élément d'éclairage (1), avantageusement par fibres optiques, isolé du contenu de ladite cuve (29), ladite cavité étant délimitée latéralement par une zone de paroi transparente (16) autour de laquelle est disposée une couche ou membrane biocatalytique (23) constituée par du gel renfermant le biocatalyseur. La couche (23) est confinée entre la paroi transparente interne (16) et une structure porteuse externe, poreuse ou perforée, constituée par un treillis à larges mailles (17), et/ou une membrane microporeuse (34). L'agencement de biocatalyseur ainsi proposé permet d'obtenir une activité maximale du biocatalyseur.

Description

Biophotoréacteur à matériel photosynthétique immobilisé
La présente invention concerne un biophotoréacteur à matériel photo-synthétique immobilisé.
On désigne ici par "biophotoréacteur", un appareillage dans lequel est conduite une "biophotoréaction", terme qui désigne l'ensemble des processus engendrés par l'activité métabolique d'un matériel
photosynthétique (nécessitant de l'énergie lumineuse et appelé également biocatalyseur), et, notamment, des
synthèses, dégradations, conversions, et autres.
Le matériel photosynthétique utilisable comprend les microorganismes (bactéries, cyanobactéries et microalgues), les cellules végétales et les organites
cellulaires.
Les bactéries photosynthétiques sont les bactéries pourpres ( Rhcdaspiri l l acea et Chroma tiacea) ou vertes
( Chl orobi aceae et Chl orofl exaceae) , qui sont des microorganismes phot ot rophiques ne produisant pas d'oxygène.
L'activité qui est la plus étudiée est celle des bactéries, appartenant à la famille des Rhodospi ri l l aceae (Rhodopseudo- menas capsul a ta, Rhodospi ri l l um rubrum), qui est la
production d'hydrogène moléculaire (activité nit rogénasique à partir de lumière et de sources de carbone bon marché). Cependant, l'application qui peut être envisagée à aine échelle industrielle est la dépollution d'effluents ou d'eaux usées chargés en pollution organique. Dans ce domaine du traitement des eaux, certaines espèces
( Rhodσpseudσmonas sphaeroi des) sont capables de réduire les nitrates en azote atmosphérique.
Les micro-algues sont des microorganismes photosynthétiques eucaryotes, à l'exception des algues bleues ou cyanobactéries, cellules procaryotes proches des bactéries. Outre leur valeur potentielle comme source de protéines lorsqu'elles sont cultivées en grande quantité, les micro-algues sont capables d'excréter une large gamme de métabolite≈ secondaires, incluant acides organiques, acides aminés, peptides et poiysaccharides. Elles combinent les avantages biotechnologiques des cellules microbiennes
(culture simple, croissance relativement rapide, capacité d'excrétion des métabolites) et des cellules végétales (capacité d'élaboration de biomolécules complexes à prix réduit, c'est-à-dire à partir de substrats organiques simples et de lumière). Certaines micro-algues immobilisées sont utilisables dans la production d'hydrocarbures
( Botryococcus brauni i ) , d' exopolysaccharides sulfatés
(Porphyridi um cruent um), de glycérol (Dunaliella parva) ; d'autres sont applicables au traitement des eaux usées, par exemple, Sceπedesmus (élimination des ions ammonium et phosphate dans des effluents urbains secondaires) :
Ckl orel l a, Scenedesmus (extraction du cuivre) ; Scenedesmus obliquas, Ankistrodermus braunii, Chl amydomonas reinhardi i i, Anacyst i s ni dul ans (élimination des nitrates et/ou des nitrites) ; d'autres encore présentent, une activité de bioconversion ; Nocardia (modification de stéroïdes) :
Rhodot σrul a (hydrolyse d'esters de menthol) ; Chl orel l a, Anabaena (biotransformation d'acides aminés en acides α-cétoniques).
Les cellules végétales possèdent d' importantes capacités de bioproduction, intéressant notamment les industries de la chimie fine (parfumerie, cosmétologie, arômes alimentaires, pharmacie). La plupart des métabolites potentiellement intéressants s'accumulent dans la vacuole, et leur récupération se fait par extraction à partir de la biomasse. Dans le cas présent où les cellules sont
immobilisées, l'excrétion des biomolécules est impérative. A ce propos, on peut citer l'excrétion de métabolites secondaires, comme la berbérine ( Thal i ctrum minus') , la shikonine, pigment rouge utilisé en pharmacie, cosmétologie et teinturerie (Li thospermum erythrorhizon), la capsaïcine (Capsi cum frut escens) , les monoterpênes ( Thuya
occi dent al is), la bêta-méthyldigoxine (Digi tal i s lanat a) . Parmi les organites cellulaires, les chloroplast es (organites cellulaires assurant la photosynthèse chez les végétaux supérieurs) et les chromâtophores bactériens
(fragments de la membrane intracellulaire des bactéries photosynthétiques) sont les deux systèmes photobiochimiques se prêtant à l'immobilisation. Ces systèmes ne peuvent effectuer, à eux seuls, des synthèses ou des bioconversions, mais on peut exploiter leur capacité à fixer le gaz
carbonique et à assurer la photolyse de l'eau, en vue de la production d'oxygène, ou d'hydrogène (en association avec des hydrogénases microbiennes) ; d'autres applications sont la conversion de l'énergie lumineuse en énergie chimique par photophosphorylation de l'ADP en ATP, utilisable à son tour au cours de bioréactions consommatrices d'ATP. Ainsi, ces organites cellulaires sont-ils souvent co-immobilisés avec d'autres biocatalyseurs.
La présente invention s'applique donc aux biophotoréacteurs dans lesquels les biocatalyseurs sont immobilisés dans un support, lequel, dans le cas où les biocatalyseurs se multiplient, permet à une telle croissance d'avoir lieu. De même, la présente invention s'applique aux biophotoréacteurs dans lesquels les biocatalyseurs
(microorganismes) sont disposés dans une phase délimitée par une membrane dont la porosité est juste suffisante pour retenir les biocatalyseurs, mais qui est perméable à tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant
l'activité desdits microorganismes. Un tel procédé pour la rétention et le maintien de l'activité de microorganismes dans des structures porteuses de ladite activité et les structures résultantes applicables notamment aux
bioréacteurs sont décrits dans la demande de brevet français nº 2 597 498.
La présente invention a pour objectif principal de proposer des biophotoréacteurs utilisant des biocatalyseurs immobilisés dans des gels, dont l'agencement est
particulièrement avantageux pour l'obtention d'une activité maximale du biocatalyseur, en particulier pour atteindre d'excellents rendements des bioréactions.
La présente invention a donc pour objet un biophotoréacteur pour l'exploitation d'une activité
photosynthétique, utilisant un biocatalyseur immobilisé dans un gel, caractérisé par le fait que la cuve du
biophotoréacteur comporte au moins une cavité destinée à recevoir un élément d'éclairage isolé du contenu de ladite cuve, ladite cavité étant délimitée latéralement par une zone de paroi transparente, autour de laquelle est disposée une couche ou membrane biocatalytique constituée par du gel renfermant le biocatalyseur, et étant ainsi apte à être éclairée de l'intérieur, des moyens étant prévus pour assurer le maintien de la (ou des) membrane(s)
biocatalytique(s).
Conformément à un mode de réalisation
particulièrement préféré, la couche ou membrane
biocatalytique, présentant généralement une épaisseur de l'ordre du millimètre ou de quelques millimètres, est confinée entre une paroi transparente interne entourant l'élément d' éclairage, et une structure porteuse externe, poreuse ou perforée. Cette structure doit répondre aux critères suivants :
(1) elle doit permettre d'obtenir une couronne homogène de gel ;
(2) elle doit maintenir le gel au contact du cylindre
interne sans limiter la diffusion des réactifs, substrats et produits intervenant dans la bioréaction ; et
(3) elle doit maintenir le biocatalyseur dans le gel.
Dans le cas où le biocatalyseur est constitué d'enzymes, d' organites cellulaires (chloroplastes), ou de cellules entières qui ne prolifèrent pas ou ont un temps de génération très long à l'intérieur du gel (microorganismes "non viables", par exemple perméabilisés, cellules
eucaryotes), une paroi externe remplissant les deux premières conditions sera suffisante pour satisfaire au troisième critère. Dans ce cas, la structure porteuse a essentiellement une fonction mécanique, à savoir celle de retenir le gel contre la paroi interne. Elle peut être constituée par une structure quelconque, par exemple un treillis à larges mailles, mais apte à maintenir le gel, selon la consistance et la viscosité de celui-ci. On peut ainsi utiliser des treillis ayant une largeur de maille de 3 à 10 mm. On peut également utiliser, en plus ou à la place du treillis, une membrane microporeuse, par exemple pour protéger les cellules de la contamination. Une telle membrane peut être souple, semi-rigide ou rigide, et elle peut être organique ou minérale.
Dans le cas où l'on utilise l'activité' biocatalytique de microorganismes capables de se reproduire rapidement à l'intérieur du gel (microorganismes viables), on choisit une paroi externe constituée par une membrane microporeuse, dont la porosité répond à la définition donnée dans la demande de brevet nº 2 597 498. Dans ce cas, il est évidemment possible d'utiliser un treillis tel qu'il a été défini ci-dessus, entre le gel et la membrane microporeuse, lorsque celle-ci est souple ou semi-rigide.
Comme membrane microporeuse, on peut du reste, dans tous les cas, utiliser une membrane rigide telle qu'obtenue par bombardement ionique (ions lourds) de feuilles polymériques transparentes ou non.
Conformément à la présente invention, le gel renfermant le biocatalyseur est avantageusement formé in si t u par coulée entre la paroi transparente interne et une structure externe provisoire fermée. Cependant, un treillis métallique destiné à constituer ou à faire partie de la structure porteuse finale peut être appliqué intérieurement contre la structure provisoire fermée.
Conformément à d'autres modes de réalisation du biophotoréacteur selon l'invention : la (ou les) cavité(s) dudit biophotoréacteur sont cylindriques, la (ou les) membrane(s) biocatalytique(s) se trouvant sous la forme de couronnes cylindriques, de la même façon à ce que les structures porteuses perforées ou poreuses ; le biophotoréacteur comporte plusieurs cavités, disposées de façon que leurs axes soient parallèles ; les cavités sont formées dans la paroi de fond et/ou dans le couvercle de la cuve du biophotoréacteur ; celui—ci peut être équipé d' un cylindre entourant la couche ou membrane de biocatalyseur, se trouvant à distance de la structure porteuse de ladite couche ou membrane, et agencé pour permettre une circulation laminaire tangentielle du milieu autour de cette dernière.
Par ailleurs, les biophotoréacteurs de l'invention comportent tout l'équipement nécessaire à la conduite de la réaction : sondes de pH, de température, vannes de sécurité, entrées et sorties de fluides, le cas échéant, entrées d'air et de gaz carbonique, dispositifs d'agitation du milieu, etc ...
Les éléments d'éclairage peuvent être de toutes sortes ; en particulier, ils peuvent être des moyens d'éclairage par fibres optiques.
Un exemple d'élément d' éclairage par fibres optiques est constitué par un barreau, consistant en un fourreau doté d'une multiplicité d'orifices dans chacun desquels est fixée l'extrémité d'une fibre optique logée dans ledit fourreau et reliée, par son autre extrémité à un générateur de lumière, des points lumineux ou des zones lumineuses étant ainsi formés sur la paroi extérieure du fourreau, distribuant la lumière en direction du milieu de photoréaction contenu dans la cuve du biophotoréacteur.
Ainsi, la membrane biocatalytique entoure le barreau lumineux à une distance que l'on choisit pour assurer un apport suffisant en énergie lumineuse ; on obtient ainsi une homogénéité d'éclairage de la membrane biocatalytique, sans «points de surchauffe» conduisant à un vieillissement local prématuré de ladite membrane
biocatalytique. Dans le cas d' un tel barreau lumineux, le fourreau présente, de préférence une forme cylindrique, ce qui permet d'assurer une régularité de l'éclairage à la périphérie de chaque barreau lumineux.
Conformément à d'autres modes de réalisation d'un tel barreau : les fibres sont rassemblées dans une gaine avant de pénétrer dans le fourreau ; et celui-ci est fermé par une embase par laquelle ledit barreau se fixe sur une partie d'enveloppe de la cuve, par exemple sur la paroi de fond ou sur le couvercle de ladite cuve, les éléments d'éclairage étant avantageusement amovibles et démontables.
De préférence, les orifices d'un barreau recevant les extrémités des fibres optiques sont disposés de façon régulière, notamment en quinconce, assurant également une uniformité d'éclairage. En outre, dans un mode de
réalisation particulier, les extrémités des fibres optiques sont introduites chacune dans un téton à sortie tronconique, logé dans un orifice du fourreau, de manière à constituer des cônes lumineux. Il est alors intéressant que les cônes lumineux se recoupent de manière à assurer un éclairage le plus homogène possible de la totalité de la surface interne de la membrane biocatalytique, en vue d'une exploitation de l'activité photosynthétique réalisée dans les meilleures condit ions.
Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on décrira plus en détail ci-après, à titre indicatif et non limitatif, deux modes de réalisation de biophotoréacteurs selon l'invention représentés sur le dessin annexé.
Sur ce dessin ;
la figure 1 est une vue schématique partielle, en coupe longitudinale, d'une membrane biocatalytique et de moyens de maintien de ladite membrane dans un
biophotoréacteur de l'invention ;
- la figure 2 est une vue, partiellement en élévation, partiellement en coupe axiale longitudinale, du dispositif d'éclairage d'un biophotoréacteur conforme à un premier mode de réalisation de l'invention ;
les figures 3 et 4 sont des vues en coupe selon
respectivement III-III et IV-IV de la figure 2 ;
la figure 5 est une vue à échelle agrandie du détail A de la figure 4 ;
la figure 6 est une vue en coupe axiale longitudinale d'un dispositif mécanique utilisé pour fabriquer un gel biocatalytique immobilisant des microorganismes ou organites cellulaires ;
la figure 7 est une vue de dessus du dispositif de la figure 6 ;
la figure 8 est une vue en coupe axiale longitudinale du biophotoréacteur à l'état assemblé avec le
dispositif d'éclairage de la figure 2, selon VIII-VIII de la figure 9, laquelle est une vue en coupe
transversale dudit biophotoréacteur ;
la figure 10 est une représentation schématique de l'ensemble de l'appareillage incorporant le
biophotoréacteur de la figure 8, en vue d' une
photoproduct ion d'hydrogène ;
la figure 11 représente des courbes obtenues lors de la mise en oeuvre de cette photoproduction dans
1' appareillage de la figure 10 ;
la figure 12 est une vue schématique de dessus d'un biophotoréacteur à multiéléments biocatalytiques conforme à un second mode de réalisation de
l'invention, et comportant une pluralité de dispositifs d' éclairage du type de ceux représentés sur la
figure 2, en vue d' une application à l'échelle
industrielle; et
la figure 13 est une vue schématique en élévation avec un arrachement montrant en coupe longitudinale axiale, l'un des éléments biocatalyt iques du réacteur de la figure 12. Si l'on se réfère à la figure 1, on voit que l'on a désigné par 23 une membrane biocatalytique constituée par un gel emprisonnant des cellules ou organites cellulaires, et confinée entre une paroi transparente 16 et une structure poreuse constituée par un treillis métallique 17 appliqué contre ladite membrane 23 et une membrane microporeuse 34. La réalisation et le montage de la membrane 23 dans la cuve du biophotoréacteur sont décrits ci-après.
Si l' on se réfère maintenant aux figures 2 à 5, on voit que l'on a désigné par 1, dans son ensemble, un
dispositif d'éclairage pour le biophotoréacteur des
figures 8 et 9. Ce dispositif constitue un moyen avantageux pour réaliser l'éclairage du biophotoréacteur ; cependant, l'invention n'est en aucune manière limitée à ce mode d'éclairage particulier.
Le dispositif d'éclairage 1 utilise un système de fibres optiques 2 (figure 5), permettant d'obtenir une lumière froide, antidéflagrante et à intensité modulable. Ces fibres 2, gainées individuellement, sont regroupées en un faisceau dans une gaine en acier inoxydable, formant un câble souple 3. A l'une de ses extrémités (non
représentée), le câble 3 est fermé par un embout, également en acier inoxydable, dans lequel sont fixées les extrémités correspondantes des fibres optiques 2 et qui peut s' adapter sur un générateur de lumière tel que symbolisé en 74 sur la figure 10.
Les fibres 2 utilisées dans cet exemple sont des fibres FORT type FEK 50, de 0, 1 mm de diamètre. Le câble 3, dont la longueur est de 2, 5 m environ, renferme 360 fibres optiques 2 ; et la source lumineuse est un générateur de 150-250 watts (lampe halogène), muni d'un filtre
anticalorique (type KG1 de SCHOTT).
A l'extrémité du câble 3, opposée au générateur, les fibres 2 sont introduites axialement dans un fdurreau cylindrique 4 en acier inoxydable, le câble 3 pénétrant axialement et se terminant dans une embase 5 en forme de disque, fermant ledit fourreau 4 à sa partie inférieure, celui-ci étant disposé verticalement, dans sa position de montage final dans le biophotoréacteur de la figure 8. Les fibres 2 sortent librement à l'intérieur du fourreau 4 et elles sont fixées individuellement à la paroi de celui-ci comme cela est décrit ci-après. L'embase 5 comporte une bride périphérique inférieure 6, comportant trois trous 7 à 120º l'un de l'autre, en vue de la fixation sur le plateau inférieur S du biophotoréacteur de la figure 8.
Le fourreau cylindrique 4 est percé sensiblement sur toute sa hauteur, à l'exclusion de ses zones de bordure supérieure et inférieure, d'orifices 9 de petit diamètre, ces orifices 9 en étant disposés dans des plans radiaux se trouvant à égale distance les uns des autres, de façon à obtenir une distribution d'ensemble régulière en quinconce. Dans l'exemple représenté, le fourreau 4 présente une hauteur de 20cm et un diamètre de 10cm, et il comporte 360 orifices 9 d'un diamètre de Imm, à raison de 18 orifices décalés radialement de 20º sur une circonférence, un décalage radial de 10º existant entre deux circonférences successives, ce qui est illustré par les figures 3 et 4.
Chacune des fibres optiques 2, qui pénètre librement dans le fourreau 4, est insérée, par son extrémité libre, dans le canal axial 10a. d'un téton de fixation cylindrique 10, en matière plastique, introduit à force dans un orifice 9 à l'intérieur du fourreau 4. Chaque téton 10 comporte, à l'une de ses extrémités, une bride 10b. par laquelle il vient en butée contre la paroi interne du fourreau 4 (figure 5); en position de montage, chaque téton 10 affleure, par son extrémité opposée à la bride 10b, la surface externe du fourreau 4, mais le canal axial 10a.
s'ouvre vers l'extérieur suivant une paroi tronconique 10c, la fibre 2 associée aboutissant dans le fond de cette ouverture tronconique. Les différents cônes d'éclairage ainsi constitués se recoupent mutuellement pour assurer un éclairage continu et homogène à l'extérieur du fourreau 4, sur sensiblement toute la hauteur du gel biocatalytique 23 (décrit ci-après).
Si l'on se réfère maintenant aux figures 6 et 7, on voit que l'on a représenté un dispositif 11 constitué par un plateau métallique 12 en forme de disque, d'un diamètre de 160mm dans l'exemple représenté. Le plateau 12 est surmonté d'une tige axiale 13 portant un filetage 14 dans sa région d' extrémité, et il comporte, sur sa face portant la tige 13, une gorge périphérique annulaire 15, à section en U. Cette gorge 15, tapissée d' un joint plan 15a., reçoit un cylindre de verre 16 dont la hauteur est sensiblement égale à celle de la tige 13, à l'exception de sa partie
filetée 14.
Un treillis métallique 17, à larges mailles, de forme cylindrique et ayant un diamètre interne égal ou légèrement supérieur au diamètre externe du plateau 12, est disposé coaxialement au cylindre de verre. 16, en étant emboîté autour dudit plateau 12, par son embase annulaire 17a. raccordée au corps du treillis 17 par un léger
décrochement vers l'intérieur 17b, ainsi que le montre la figure 6. De plus, le treillis métallique 17 est recouvert extérieurement d'une feuille d'aluminium 18, laquelle est plaquée sur ledit treillis 17 par deux bandes de caoutchouc 19a, 19b. disposées, l'une immédiatement au-dessus de
l'embase 17a, et l'autre, au voisinage de la bordure libre de la feuille d'aluminium 13. Un joint torique d'étanchéite 20 est interposé entre la bordure externe du plateau 12 et l'embase 17a.. De la sorte, on a constitué, entre la paroi externe du cylindre de verre 16 et la paroi interne du treillis 17 dont les ouvertures sont obturées par la feuille d'aluminium 18, un espace cylindrique 21, dans lequel on pourra venir couler un gel biocatalytique afin de constituer une membrane biocatalytique comme cela est décrit ci-après.
Ce dispositif 11 de coulage du gel est complété par une plaque métallique 22 (en acier par exemple), ayant la forme d' une bande allongée, de longueur légèrement supérieure au diamètre du dispositif cylindrique qui vient d'être décrit, et présentant une ouverture centrale 22a. de diamètre légèrement supérieur à celui de la tige 13. Cette plaque 22 vient s'appliquer diamétralement sur le dispositif cylindrique précité, la tige 13 traversant l'ouverture centrale 22a. et dépassant, par son extrémité filetée 14, de ladite plaque 22. Une vis de serrage 22b. maintient cette dernière sous une légère pression de façon à assurer
l'étanchéité du dispositif 11. Celui-ci, une fois réalisé comme on vient de l'indiquer, est stérilisé par autoclavage, puis placé dans une enceinte stérile, thermostatee à 40ºC.
On décrira maintenant (1) la préparation d'un gel biocatalytique et (2) le coulage de ce gel dans l'espace 21: (1) On réalise une suspension d' agar (13g d' agar dans 700 ml d'eau) que l'on stérilise par autoclavage; la
solution obtenue est ensuite placée dans une enceinte stérile thermostatee, où elle refroidit jusqu'à 40ºC, puis inoculée par 100ml d'une culture dense de Rhodospi ri l l u m rubrum (obtenu par des techniques conventionnelles de culture des microorganismes photosynthétiques) ; on obtient ainsi une suspension à 2, 25% en poids d' agar.
(2) Après quelques minutes d'homogénéisation, la suspension d' agar est coulée manuellement dans l'espace 21 du dispositif 11; la température de l'enceinte thermostatee est abaissée à 30ºC; la gélification s'effectue en 15 minutes environ, et l'on obtient, dans l'espace 21, la membrane biocatalytique 23, laquelle présente une épaisseur de 3 mm environ.
Après gélification, la feuille d'aluminium 18 est retirée; la membrane biocatalytique 23 ainsi constituée et son support (à savoir le dispositif 11 duquel on a ôté la feuille 13 et les bandes 19a., 19b.) sont alors placés dans un récipient stérile contenant 5 litres d'un milieu nutritif adéquat (mélange bouillon Columbia - milieu Ormerod) et exposés à la lumière (20 klx) pendant 43 heures. Au cours de l'incubation, le milieu nutritif est agité par un fort courant d'argon, qui permet également de maintenir
l'anaérobiose. Cette étape, dite de "prêt raitement", permet une colonisation du gel par les microorganismes immobilisés. La membrane ainsi "dopée" est alors lavée à l'eau distillée stérile pendant 24 heures.
On se reportera maintenant aux figures 8 et 9 pour décrire un biophotoréacteur 24 à microorganismes
immobilisés, incorporant le dispositif d'éclairage 1 et la structure biocatalytique constituée par le cylindre de verre 16, la membrane biocatalytique 23 emprisonnant
Rhodospirillum rubrum et le treillis métallique 17.
Le biophotoréacteur 24 est délimité par un plateau inférieur 3 (déjà indiqué en référence avec la figure 2), un plateau supérieur 25, tous deux en forme de disque, et par une enveloppe latérale cylindrique 26, laquelle est en verre ou en tout autre matériau adéquat, par exemple l'acier inoxydable. Cette dernière se trouve, en position de montage, introduite par ses bordures respectivement
inférieure et supérieure dans des rainures annulaires 8a. et 25a, en regard l'une de l'autre, pratiquées à la périphérie des plateaux respectivement 3 et 25. Ces derniers sont maintenus par des goujons métalliques 27 , au nombre de six (figure 9), vissés dans le plateau 8 à l'extérieur de la rainure 8a, des écrous 28 maintenant sous une légère pression le plateau supérieur 25 et assurant l'étanchéité de la cuve 29 ainsi constituée du biophotoréacteur 24.
Le plateau inférieur 8 comporte une ouverture centrale 30 délimitée par une paroi cylindrique dans laquelle est pratiqué un décrochement 31 destiné à servir de butée à la bride 6 du dispositif d'éclairage 1, fixé sur le plateau 8 comme décrit précédemment.
Par ailleurs, le plateau 8 comporte intérieurement deux rainures annulaires concentriques 32 et 33, la rainure interne 32, tapissée d'un joint plan (non représenté), située à une certaine distance de l'ouverture 30, recevant le cylindre de verre 16 précité, et la rainure externe 33, plus profonde que la rainure 32, recevant le treillis 17 par sa base 17a., la membrane biocatalytique 23 de gel + microorganismes immobilisés étant emprisonnée entre le cylindre 16 et le treillis 17.
Dans l'exemple représenté, une membrane microporeuse 34 (membrane Millipore, type Durapore
hydrophile, de porosité 0, 45 μm) est placée autour du treillis 17, où elle est fixée par deux bandes de caoutchouc inférieure et supérieure, respectivement 35a. et 35b. La membrane 34 constitue un filtre microporeux assurant un confinement, dans le gel de la membrane 23, ces
nicroorganismes immobilisés, selon l'enseignement de la demande de brevet français nº 2 597 493.
La structure constituée par le cylindre de
verre 16 et l'ensemble des éléments qu'il porte
extérieurement, est fermée, à sa partie supérieure, par un couvercle interne 36 en forme de disque, qui comporte, de la même façon que le plateau 8, deux rainures concentriques respectivement 37 et 38 recevant les bordures supérieures respectivement du cylindre 16 et du treillis 17, lequel est. renforcé dans cette partie. Le couvercle 36 dépasse, sur toute sa périphérie, du cylindre 15 et des éléments qu'il porte, des trous 39, au nombre de quatre (figure 9), disposés à 90º l'un de l'autre, traversant cette zone périphérique du couvercle 36. Les trous 39 sont traversés par des goujons 40, dont la pointe inférieure est vissée dans des logements filetés 41 prévus à cet effet dans le plateau inférieur S. Sur la partie d'extrémité supérieure des goujons 40 qui dépasse du couvercle 36, sont vissés des écrous 42. On assure ainsi un maintien en place du cylindre de verre 16, pour définir intérieurement une cavité 43, qui est parfaitement isolée de la cuve 29, et dans laquelle est placé le dispositif d'éclairage 1. Le biophotoréacteur 24 renferme également un cylindre intermédiaire amovible 44, coaxial au cylindre 15 et extérieur à celui-ci, ledit cylindre 44 reposant, par sa bordure inférieure, dans une gorge annulaire 45 également pratiquée dans le plateau inférieur 8. La cuve 29 étant destinée à recevoir du milieu nutritif, ce cylindre 44 est destiné à assurer une circulation laminaire tangentielle dudit milieu autour de la membrane 34, dans la zone en forme de couronne cylindrique 46 située entre ledit cylindre 44 et ladite membrane 34. Sur la figure 8, on a représenté partiellement le goujon 40 de droite, pour illustrer par des flèches, la circulation du milieu nutritif.
Celui-ci entre dans le biophotoréacteur 24 par des aiguilles d'injection 47, au nombre de quatre, pénétrant, à travers le plateau inférieur 8, dans la zone précitée 45. Ainsi, le liquide entre à la partie basse de cette zone grâce aux aiguilles 47, il monte le long de la membrane microporeuse 34 selon la flèche indiquée, puis il retombe, également comme indiqué par l'autre flèche, autour du cylindre 44, où il est repris par les aiguilles de sortie 43, au nombre de deux, diamétralement opposées. En
fonctionnement, le niveau du liquide dans la cuve 29 est maintenu à la hauteur h (figure 3), à savoir, légèrement au- dessous de la bordure supérieure du cylindre 44.
Le biophotoréacteur 24 est également équipé, en partie haute, d'une vanne de sécurité 49, d'une sonde de pH 50, et d'un bouchon 50a pour introduction de fluides, prélèvement, etc., et, en partie basse, d'une sonde de température 51, et d'une résistance chauffante 52. Le biophotoréacteur 24 est disposé sur un socle 53, représenté partiellement sur la figure 8.
On peut également prévoir, dans le
biophotoréacteur, un dispositif d'agitation traditionnelle par pales ou "air lift". Le montage du biophotoréacteur 24 est effectué de la façon suivante :
Tous les éléments du biophotoréacteur 24, ainsi que les différents milieux, sont stérilisés par autoclavage; l'ensemble des opérations de montage s'effectue dans une enceinte stérile.
La structure biocatalytique (cylindre 16 - membrane 23 - treillis 17) est dégagée du. système de coulage des figures 6 et 7, puis fixée hermétiquement sur le plateau inférieur S du biophotoréacteur 24. La membrane 34, préalablement préparée (taillée aux dimensions voulues:
longueur 555mm, hauteur 255mm, selon l'exemple présentement décrit, soudée, puis autociavée) est alors placée autour du treillis 17, où elle est maintenue hermétiquement par les bandes de caoutchouc 35a, 35b_. Les goujons 40, le cylindre 44, le couvercle intérieur 36, les goujons 27, le cylindre externe 26 et le plateau supérieur 25 sont mis successivement en place. Après vérification de l'étanchéité du biophotoréacteur 24, celui-ci est sorti de l'enceinte stérile et incorporé dans l'ensemble schématisé sur la figure 10. Celui-ci comporte trois grandes parties :
- le biophotoréacteur 24 proprement dit, tel qu'il vient d' être décrit ;
- un ensemble hydraulique qui comprend quatre réservoirs 54, 55, 56, 57, d'une capacité de 5 litres chacun, une pompe de circulation 58 à fort débit (600 litres/heure) et vitesse variable (de 0, 1 à 99% du débit maximum), et un tableau de commande 59 supportant sept vannes (54a,
55a, 56a 57a et 60, 61,62). et un collecteur 63; et - un ensemble de régulation, contrôle et mesure
comprenant:
- un système de régulation thermique formé de la sonde de température 51 et de la résistance chauffante 52, reliées à un boîtier de régulation 64, auquel peut être associé un serpentin de refroidissement (non représenté) placé dans le biophotoréacteur 24: - un pH-mètre 65 relié à une électrode de verre 65;
- un système de mesure du débit gazeux et- d'analyse du gaz constitué de la façon suivante: le gaz produit dans le photoréacteur 24 est évacué à la partie supérieure grâce à trois tubes en Teflon
67, 68 et 69; il passe dans un condensateur 70 où il perd la vapeur d'eau qu'il contient; en sortie du condensateur 70, un débitmètre massique 71, étalonné pour l'hydrogène, traduit le débit gazeux (d) en signal électrique, qui est enregistré au cours du temps (t ) par l'enregistreur 72; le gaz est ensuite analysé en GPC en 73, puis évacué.
Pour la mise en oeuvre de l'installation de la figure 10, les réservoirs 54 et 55 contenant du milieu nutritif, stérilisés par autoclavage, sont connectés aux vannes respectivement 54a., 55a.. Les connexions sont effectuées au niveau des entrées 47 et des sorties 48 pour le liquide. Le dispositif d'éclairage 1, relié au
générateur de lumière 74. est mis en place, ainsi que la régulation thermique et la mesure du pH.
Lorsque le remplissage est effectué (10 litres de milieu nutritif), les vannes 54a., 55a. sont fermées. On ouvre les vannes 60 et 61; sous l'action de la pompe 58, le milieu circule dans le sens (1) à vitesse moyenne (en circuit fermé). Le bioréacteur 24 est alors désoxygéné par bullage d'argon en 75 pendant 1 heure.
L'installation est alors prête à fonctionner; le dégazage est stoppé, le liquide circule toujours dans le sens (1) à vitesse moyenne, le générateur de lumière 74 fonctionne à son maximum d'intensité (15 klx).
Cette installation a été utilisée pour suivre plusieurs cinétiques de phot oproduct ion d'hydrogène, correspondant à des conditions expérimentales différentes. Dans une expérience typique, qui n'est donnée ici qu'à titre d' exemple, le milieu nutritif fourni aux microorganismes immobilisés ( R. rubrum) est un tampon phosphate contenant du malate (source de C) et ou glutamate (source de N), dont la composition exacte est la suivante (d'après Hirayama et al, Agric. Biol. Chem. 1986,50.: 891-897):
K2HPO4 .............. 10, 5 g
KH2PO4 ............... 3, 5 g
Acide malique ...... 35, 0 g
Acide glut amique .. 4, 8 g
Eau distillée ...... 1 litre (pH ajusté à 7 par KOH)
La courbe (1) de la figure 11 représente l'évolution du volume de gaz produit dans le photoréacteur 24. Ce gaz est un mélange de H2, CO2 et Ar, dans lequel la proportion d' H2 pur varie au cours du temps d'incubation (figure 11, encadré). La courbe (2) de la figure 11
représente la cinétique de production d' H2 pur par la structure biocatalytique: on observe tout d'abord une période de latence de l'ordre de 40 heures, puis une
augmentation importante du volume de H2 produit pour
atteindre, en fin de manipulation, un "épuisement" du substrat (ralentissement de la production gazeuse observé à partir de 130 heures).
Pour réduire les contaminations parasites, on introduit, dans le protocole opératoire, une étape
préliminaire de lavage du biophotoréacteur 24, structure biocatalytique en place, par une solution décontaminante, sans effet rémanent, par exemple le tampon phtalate décrit par Trinel et Leclerc (Ann. Microbiol. Inst. Pasteur, 1977, 123: 419-423).
Le décontaminant est stocké dans le réservoir 56 (figure 10). Après fixation de la structure biocatalytique, on l'introduit à l'aide de la pompe 53 dans le bioréacteur où il séjourne pendant environ lmn. Le système est ensuite vidangé, puis rincé par de l'eau distillée stérile contenue dans le réservoir 57. Si l'on se réfère maintenant aux figures 12 et 13, on voit que l'on a désigné par 124 un biophotoréacteur de grande capacité. Le biophotoréacteur 124 comprend une embase 108, une paroi latérale cylindrique 126,
préfèrent iellement en acier, fixée à l'embase 108 et au plateau supérieur 125 par des boulons de serrage 177. Dans la cuve 129 ainsi délimitée, plongent des structures actives (au nombre de cinq dans l'exemple représenté) du même type que celle décrite ci-dessus et désignées par des chiffres de référence supérieurs de 100 à ceux utilisés précédemment, à savoir cylindre de verre 116 - membrane 123 de gel
emprisonnant les microorganismes - treillis 117 et membrane microporeuse 134. Ces structures sont fermées
intérieurement de manière étanche, par des plaques 136
(équivalentes au couvercle 35 du mode de réalisation
précédemment décrit), qui sont serrées contre lesdites structures au moyen de goujons 140 reliés, à une plaque supérieure 178 en appui périphérique contre le couvercle 125 et fixée par des boulons 179. Dans les espaces 143
délimités par les cylindres de verre 116 et les plaques internes 136, sont disposés les dispositifs d'éclairage 101, avec leurs gaines 103 guidant chacune un faisceau de fibres optiques.
Le biophotoréacteur 124 comporte des dispositifs d'agitation 176 régulièrement distribués entre les
structures actives précitées, ces dispositifs d'agitation étant choisis pour être les mieux adaptés à la distribution desdites structures à l'intérieur de la cuve 129 et à l'activité photosynthétique exploitée: système à gaz puisé (par exemple, air + CO2) dans le cas d'un métabolisme sans récupération de biogaz, assurant à la fois l'agitation et l'approvisionnement du milieu en substrat (exemple : CO2), et l'évacuation des gaz et/ou calories éventuellement produits ; agitation par pales, hélices ou turbines (dont il existe de multiples configurations permettant de diriger les flux de milieu nutritif), par circulation de milieu, en anaérobiose et dans certains cas d' aérobiose.
De même, le biophotoréacteur 124 comporte tous les équipements nécessaires: soupape de sécurité 149; sondes de pH 150; sondes de température (platine) 151; et résistances chauffantes 152.
Le processus de stérilisation du réacteur 124 et de ses éléments cylindriques (avant mise en place du gel) est choisi parmi les techniques classiques bien connues pour les biophotoréacteurs industriels: vapeur, oxyde d'éthylène, avant coulage in si t u du gel biocatalytique.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Biophotoréacteur pour l'exploitation d'une activité photosynthétique, utilisant un biocatalyseur immobilisé dans un gel, caractérisé par le fait que la cuve (29 ; 129) du biophotoréacteur (24 ; 124} comporte au moins une cavité destinée à recevoir un élément
d'éclairage (1 ; 101) isolé du contenu de ladite cuve (29 ; 129), ladite cavité étant délimitée latéralement par une zone de paroi transparente (16 ; 116) autour de laquelle est disposée une couche ou membrane biocatalytique (23 ; 123) constituée par du gel renfermant le biocatalyseur, et étant ainsi apte à être éclairée ce l'intérieur, des moyens étant prévus pour assurer le maintien de la (ou des) couche (s) ou membrane (s) biocatalyt ique (s) (23 ; 123).
2 - Biophotoréacteur selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la couche ou membrane
biocatalytique (23 ; 123) est confinée entre la paroi transparente interne (16 ; 116) et une structure porteuse externe, poreuse ou perforée.
3 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la paroi transparente interne (16 ; 116) est une paroi de verre.
4 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 2 et 3, caractérisé par le fait que la structure poreuse externe est constituée par un treillis à larges mailles ; ou un treillis à larges mailles (17 ; 117) et une membrane microporeuse (34 ; 134) ; ou une membrane microporeuse semi-rigide ou rigide.
5 - Biophotoréacteur selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le treillis (17 ; 117) présente une ouverture de maille de l'ordre de 3-10 mm.
5 - Biophotoréacteur selon la revendication 4, caractérisé par le fait que la membrane microporeuse (34 ; 134) est une membrane souple, semi-rigide ou rigide, organique ou minérale. 7 - Biophotoréacteur selon la revendication 4, dans lequel le biocatalyseur est constitué par des
microorganismes proliférants, caractérisé par le fait que la structure porteuse est constituée ou comprend une membrane microporeuse (34 ; 134) dont la porosité est juste
suffisante pour retenir les microorganismes, mais qui est perméable à tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdits microorganismes.
S - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 2 à 7, caractérisé par le fait que le gel renfermant le biocatalyseur est formé in situ par coulée entre la paroi transparente interne (16 ; 115) et une structure externe provisoire fermée (16).
9 - Biophotoréacteur selon la revendication 8, caractérisé par le fait qu'un treillis métallique (17 ; 117) destiné à constituer ou à faire partie de la structure poreuse finale est appliqué intérieurement contre la
structure provisoire fermée (13).
10 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que la (ou les) cavité (s) dudit biophotoréacteur (24 ; 124) sont cylindriques, la (ou les) membrane(s) (23 ; 123)
biocatalyt ique (s) se trouvant sous la forme de couronnes cylindriques, de la même façon que les structures porteuses perforées ou poreuses.
11 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 à 10, caractérisé par le fait qu'il comporte plusieurs cavités, disposées de façon que leurs axes soient parallèles.
12 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que les cavités sont formées dans la paroi de fond (S) et/ou dans le couvercle (125) de la cuve (29 ; 129). 13 - Bicphot oréîct eur selon l'une ces
revendications 1 à 12, caractérisé par le fait qu'il est équipé d'un cylindre (44 ; 144) entourant la couche ou membrane de biocatalyseur (23 ; 123), se trouvant à distance de la structure porteuse ce ladite couche ou membrane, et agencé pour permettre une circulation laminaire tangentielle du milieu autour de cette dernière.
14 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que .le fond de chaque cavité est délimité par une plaque (36 ; 136) rendue solidaire d' une paroi délimitant la cuve (29 ; 129) du réacteur, comme la paroi de fond (8) ou le
couvercle (125), recevant, d' une manière étanche, la paroi transparente interne (15 ; 115), elle-même reçue, d'une manière étanche, dans la zone de paroi opposée de la
cuve (29 ; 129), et assurant également le maintien d'une extrémité de la structure porteuse, elle-même maintenue, par son extrémitée opposée, contre ladite zone de paroi opposée de la cuve (29 ; 129).
15 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que la cuve (29 ; 129) est délimitée par une paroi de fond (8 ;
108), un couvercle (25 ; 125), et une paroi latérale (26 ; 125), celle-ci pouvant être reçue à ses extrémités, dans des rainures du fond (8) et du couvercle (25), des moyens étant prévus pour assurer le maintien étanche de l'ensemble.
16 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 à 15, caractérisé par le fait qu'il comporte l'équipement nécessaire à la conduite de la réaction : sondes de pH, de température, vannes de sécurité, entrées et sorties de fluides, le cas échéant, entrées d'air et de gaz carbonique, dispositifs d'agitation du milieu.
17 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 à 16, caractérisé par le fait que le biocatalyseur est constitué par des microorganismes incluant les bactéries, les cyanobact éries et les microalgues ; les cellules végétales et les organites cellulaires. 13 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 1 à 17, caractérisé par le fait que les éléments d'éclairage (1 ; 101) sont des éléments d'éclairage par fibres optiques.
19 - Biophotoréacteur selon la revendication 8, caractérisé par le fait qu'un élément d'éclairage (1 ; 101) se présente sous la forme d' un barreau consistant en un fourreau (4 ; 104) doté d'une multiplicité d'orifices (9) dans chacun desquels est fixée l'extrémité d'une fibre optique (2) logée dans ledit fourreau (4 ; 104) et reliée, par son autre extrémité à un générateur de lumière, des points lumineux ou des zones lumineuses étant ainsi formés sur la paroi extérieure du fourreau (4 : 104). adressant la lumière en direction du milieu de photoréaction contenu dans ia cuve (29 ; 129) du biophotoréacteur (24 ; 124).
20 - Biophotoréacteur selon la revendication 19, caractérisé par le fait que le fourreau (4 ; 104) présente une forme cylindrique.
21 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 19 et 20, caractérisé par le fait que les fibres (2) sont rassemblées dans une gaine avant de pénétrer dans le fourreau (4 ; 104).
22 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 19 à 21, caractérisé par le fait que le fourreau (4) est fermé par une embase (5 ; 105) par laquelle l'élément d'éclairage (1 ; 101) se fixe sur une partie d'enveloppe de la cuve (29 ; 129), comme la paroi de fond (8), ou le couvercle (125) de ladite cuve (29 ; 129).
23 - Biophotoréacteur selon l'une des
revendications 19 à 22, caractérisé par le fait que les orifices (9) du barreau recevant les extrémités des fibres optiques (2) sont disposés de façon régulière, notamment en quinconce. 24 - Biophotoréacteur selon l'une ces
revendications 19 à 23, caractérisé par le fait que les extrémités des fibres optiques (2) sont introduites chacune dans un téton (10) à sortie tronconique, logé dans un orifice (9) du fourreau (4) de manière à constituer des cônes lumineux, lesquels, de préférence, se recoupent de manière à assurer un éclairage le plus homogène possible de la totalité de la surface interne de la membrane
biocatalytique.
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